A hipoxia interrompe modulação gene ao longo do cérebro hipófise-gônadas eixo (BPG) de

fígados

Abstrato

Hipóxia altera as concentrações de hormônios sexuais que levam ao comprometimento reprodutivo

em peixes, no entanto os mecanismos subjacentes a esses efeitos são ainda desconhecidas. Usando
peixe-zebra (Danio rerio), este estudo é o primeiro a demonstrar que a hipóxia provoca a
desregulação endócrina, agindo simultaneamente em vários alvos ao longo do eixo (BPG) de fígado
e cérebro hipofisário-gonadal em peixes. Alterações na expressão de genes-chave associadas com as
vias endócrinas reprodutivas no cérebro (sGnRH), hipófise (FSHp e LHp), gônadas (FSH-R, LH-R,
HMGR, Estrela, CYP19A, CYP11A, CYP11β e 20β-HSD) e fígado foram correlacionados com
reduções significativas de estradiol nas mulheres ea testosterona nos homens. Hipóxia também
induziu alterações específicas do tecido específico do sexo e da expressão de estrogénio,
androgénio, receptores de progestina e de membrana ao longo do eixo BPG, sugerindo interrupção
da realimentação e de sincronização de sinais hormonais. Além disso, a regulação positiva induzida
por hipóxia hepática de globulina de ligação do hormônio sexual sugere um aumento no transporte
de hormônios e redução da biodisponibilidade de sangue, enquanto a regulação alta de CYP3A65
hepática e CYP1A em mulheres sugere um aumento na biotransformação de estrogênio e
desembaraço. Dado que a regulação dos hormônios reprodutivos e do eixo BPG de fígados são
altamente conservadas, este estudo fornece novos insights sobre o sistema endócrino induzido por
hipoxia interromper mecanismos e deficiência reprodutiva em outros vertebrados.

Palavras-chave
Hipóxia; reprodução; desregulação endócrina; eixo BPG-hepáticas

1. Introdução
A hipoxia (<2,8 mg L-1 O2) causada por atividades antrópicas é agora considerado um dos
problemas mais prementes dos ecossistemas aquáticos. Mais de 400 "zonas mortas" foram
identificados em todo o mundo cobrindo uma área total de> 245.000 km2, com o problema
susceptíveis de agravar no futuro (Diaz, 2001, Diaz e Rosenberg, 1995, Diaz e Rosenberg, 2008 e
Wu, 2002). A grande ocorrência de hipóxia levou a população mundial diminui, as principais
mudanças na composição de espécies de peixes e extinção de espécies sensíveis em ambos os
ecossistemas marinhos e de água doce (Alexander et al., 2000 Diaz e Rosenberg, 2008 e Wanink et
al, 2001. ). Esses efeitos observados não só pode ser devido a mortalidade aguda resultante da
depleção de oxigênio, mas também devido ao comprometimento reprodutivo decorrentes da
exposição crônica à hipóxia. Estudos anteriores demonstraram que a hipoxia perturba as hormonas
sexuais, subsequentemente levando a disfunções reprodutivas em várias espécies de peixes (Landry
et al. De 2007, de Thomas et al. De 2006, de Thomas et al., 2007 e Wu et al., 2003). No entanto, os
mecanismos moleculares específicos subjacentes a esses efeitos são ainda desconhecidas.

Reprodução de peixes está intrinsecamente regulado pelo cérebro-pituitária-gonadal (BPG) eixo

(Kime, 1998). Secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) do cérebro
estimula a liberação de duas gonadotrofinas (GtHs) - hormônio folículo-estimulante (FSH) eo
hormônio luteinizante (LH) pela hipófise. GtHs são transportadas via circulação geral para as
gônadas, onde eles se ligam à membrana receptores (GTH-R) para induzir a produção de hormônios
esteróides sexuais que modulam vários eventos reprodutivos, como a produção de gametas e
desenvolvimento gonadal (Ankley e Johnson, 2004 e Jalabert et ai., 2000). Nos peixes, os
hormônios sexuais são produzidos principalmente em teca e células da granulosa no ovário e no
Leydig ou células intersticiais do testículo (Thomas, 2008a). Eles são derivados do colesterol
através de diversos passos, catalisada principalmente por enzimas do citocromo P450 (CYPs),
incluindo CYP11A (enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol), CYP19 (aromatase) e
CYP11β (11β-hidroxilase) e desidrogenases hidroxiesteróides (HSDs), incluindo 3β -HSD e 20β-
HSD (Young et al., 2005). Além disso, a 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductase (HMGR) e
proteína reguladora aguda esteroidogênica (estrela) desempenham papéis importantes na regulação
da disponibilidade de colesterol para a esteroidogénese. HMGR é uma enzima que limita a taxa de
síntese de colesterol em células esteroidogénicas, enquanto a estrela proporciona colesterol do
exterior para o interior da membrana mitocondrial onde começa a esteroidogénese (Bauer et al. De
2000, Goldstein e Brown, 1990 e Stocco, 2001). Perturbação de qualquer um dos processos
anteriores, ao longo do eixo BPG pode resultar em insuficiência reprodutiva.

Há pouca informação disponível sobre os efeitos da hipóxia sobre a modulação do eixo BPG em
peixes. Um mecanismo de diminuição da capacidade de resposta da hipófise foi sugerido; exposição
hipóxica de corvina Atlântico (Micropogonias undulatus) causou diminuição da secreção de LH em
correlação com a diminuição da expressão de mRNA GnRH (Thomas et al, 2007.). Da mesma
forma, carpa fêmea (Cyprinus carpio) expostas a hipóxia crônica reduziu significativamente os
níveis de LH no soro (Wang et al., 2008). Ao nível das gônadas, a hipóxia provoca baixa regulação
dos receptores de FSH (FSH-R) no peixe-zebra fêmea (Danio rerio) (Martinovic et al., 2009).
Nosso grupo tem observado anteriormente que a hipóxia afeta esteroidogênese em zebrafish juvenil
suprimindo CYP11A, 3β-HSD e expressão do gene CYP19 durante a diferenciação sexual (Shang
et al., 2006). Os efeitos de hipoxia na expressão destes genes esteroidogênicas e outros alvos
potenciais ao longo do eixo BPG em peixes durante a fase de reprodução ainda que ser
determinada. Embora não haja evidência dispersa sugerindo hipóxia pode causar perturbações em
vários níveis do eixo BPG, uma correlação nunca foi feito, e nenhum estudo tentou vincular hipóxia
induzida por mudanças na expressão de genes-chave ao longo do eixo do BPG a alterações no
hormônio sexual níveis.

Receptores hormonais ao longo do eixo-BPG fígado poderiam ser potenciais alvos, através do qual
a hipóxia interrompe a função endócrino reprodutivo em peixes. O estrogênio (ER), andrógeno
(AR) e progesterona (PR) receptores, mediar as ações dos hormônios sexuais em vários tecidos
reprodutivos para manter a homeostase. Rompimento de receptores tem sido identificada como um
dos principais mecanismos de ação dos desreguladores endócrinos (EDC) em peixes (Goksøyr de
2006 e Rotchell e Ostrander, 2003). Embora os efeitos de hipóxia no RAs em peixes são
virtualmente desconhecidos, diminui induzida por hipoxia em ERa testicular (também referida
como ESR1) e ERβ1 ovário (também referida como esr2b) foram observadas em peixes-zebra
adultos, ao passo que diminui em α receptor de progestina de membrana ( mPRα) no ovócito e
espermatozóide membranas plasmáticas também têm sido observadas em corvina Atlântico
(Martinovic et al., 2009 e Thomas e Rahman, 2009). Além disso, na fêmea hipoxia Grasnador
Atlântico reduz ERa hepático e plasmático vitelogenina (Vtg) concentrações (Thomas et al. De
2006 e Thomas et al., 2007). Desde vitelogênese controla o crescimento normal do oócito em todas
as fêmeas oviparous, seria interessante determinar se a resposta hipóxica dos receptores de
hormonas sexuais fígado se correlacionam com alterações na expressão de genes-alvo e de
estrogénio (Vtg1 Vtg2) (Arukwe e Goksøyr, 2003).

Transportes e metabolismo também são de importância vital na manutenção da homeostase de

hormônios sexuais, que estão vinculados e transportados pela globulina de ligação do hormônio
sexual (SHBG), uma glicoproteína de plasma no sangue de vertebrados (Miguel-Queralt et al., 2004
e Okunaga et ai., 2003). SHBG controla a eficácia dos hormônios sexuais, protegendo os esteróides
de rápida depuração metabólica, modulando a disponibilidade de esteróides e de acesso aos tecidos
alvo (Miguel-Queralt e Hammond, 2008 e Scott et al., 2005). Factores que afectam a SHBG poderia
influenciar adversamente a biodisponibilidade de hormonas e, consequentemente, o desempenho
reprodutivo. Nos peixes, as famílias CYP3A e CYP1A desempenham papéis importantes no
metabolismo de esteróides sexuais endógenos, bem como desintoxicar drogas e produtos químicos
ambientais (Arukwe et al., 1997, a Buhler e Wang-Buhler, 1998, Miranda et al., 1998, Sturm et ai.
de 2001 e Tseng et al., 2005). Os efeitos da hipóxia na expressão e atividade de CYP1A e CYP3A
gene têm sido documentados, porém como isso se relaciona com os níveis de esteróides sexuais em
peixes hipóxica in vivo permanece sem resposta (Fradette e Du Souich de 2004 e Fradette et al.,
2007).

Este estudo tem como objetivo desvendar os mecanismos moleculares subjacentes induzida por
hipóxia desregulação endócrina, monitorando as mudanças na expressão de genes-chave ao longo
do eixo do BPG-hepáticas, e correlacionar estas alterações alterações nas concentrações de
hormônios sexuais. Um modelo de zebrafish bem estabelecido para avaliar os efeitos das CDAs em
reprodução foi utilizada (Ankley e Johnson, 2004). Regulação hormonal ao longo do eixo BPG é
altamente conservada, assim, os resultados deste estudo poderiam lançar luz sobre os efeitos da
hipoxia em vertebrados superiores.

2. Materiais e métodos
2.1. Manutenção Zebrafish
Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética e segurança dos animais, da Universidade
da Cidade de Hong Kong. De tipo selvagem de peixe-zebra de 3 meses de idade foram obtidos a
partir de um fornecedor comercial e mantidos em água totalmente arejada durante 1 semana (28 ± 1
° C, 14 h light/10 h ciclo escuro) antes da experimentação. Os peixes foram alimentados com
recém-nascidos (<24 h após a eclosão) cistos de Artemia salina de camarão (Lucky Brand, UT,
EUA) duas vezes ao dia. Normoxic (6,4 ± 0,2 mg de O2 L-1) e os sistemas de hipóxia (0,6 ± 0,2 mg
L-1 O2) foram criados de acordo com métodos descritos em Wu et al. (2003). 10 gaiolas líquidas
foram suspensos em cada um dos sistemas. Cem peixes de ambos os sexos foram divididos
aleatoriamente em cada gaiola líquida em números iguais (ou seja, 10 por gaiola líquido) e expostos
a normóxia ou hipóxia por 21 dias.

2.2. Extracção de ARN e a transcrição reversa

Foram amostrados seis peixes de cada gaiola replicar (n = 60) de normóxicas e grupos de hipóxia.
Cérebro, pituitária, gonadal e os fígados foram dissecados individualmente, colocadas em 500 mL
de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e armazenou-se a -80 ° C até posterior processamento.
8-16 amostras de tecidos foram escolhidos aleatoriamente a partir de peixes individuais de cada
grupo para a análise de expressão gênica. Os tecidos foram homogeneizados com um motor sem
fios e estéril sedimento pilão (Sigma). As amostras foram realizadas a um volume final de 1 ml com
Trizol e o ARN total foi extraído e tratado com RQ1 RNase livre de DNase (Promega). ADNc de
primeira cadeia foi sintetizado usando 1 ug de RNA total, 1,25 ul de dNTP (10 mM), 3 ul de
iniciador aleatório (40 ng / mL), 1 ul RNaseOUT (40 L; Invitrogen), 1 ul de H-MLVRT (H) (200
U / mL; Promega) num volume total de 25 ul de um tampão de reacção da transcriptase × M-MLV
reversa a 42 ° C durante 50 min. A reacção foi terminada a 70 ° C durante 15 min.

2.3. PCR em tempo real quantificação

PCR em Tempo Real foi realizado no Sistema Real-Time PCR ABI 7300 (Applied Biosystems, CA,
EUA) utilizando o método de detecção com base em corantes SYBR Green. As reacções de PCR
para genes alvo e 18S rRNA de referência foram realizadas em triplicado. A média de expressão
normalizada (MNE) e relativa fold-mudança na expressão do gene alvo foram calculados (Simon,
2003). Primers para FSH-R, LH-R, HMGR, ESR1, mPRα, mPRβ, CYP3A65 e Vtg1 foram
projetados usando o programa Primer3, enquanto todos os outros foram sintetizados de acordo com
seqüências previamente identificados (Heiden et al., 2008, Hoffmann e Oris, 2006, Hossain et al. de
2008, e Van Der Tantes Kraak, 2006, Palevitch et al. de 2007, Shang et al. de 2006, Tingaud-
Sequeira et al. de 2004, Wang et al. de 2005 e Wang e Orban , 2007). As sequências dos iniciadores
dos genes-alvo estão listados na Informação de apoio (Tabelas S1-S2).

2.4. Ensaio hormônio sexual

O sangue foi coletado da veia caudal de cada peixe indivíduo usando uma ponta de micro-pipeta
heparinizado e purificado por extração com éter. 1-2 mL de sangue foi diluída para 500 ul com água
Milli-Q, éter etílico (2,5 ml) foi adicionado e a mistura agitada em vórtice durante 2 minutos, e
centrifugada (2000 rpm, à temperatura ambiente) durante 5 min. A camada de éter foi transferida
para um tubo de vidro limpo, e o processo foi repetido duas vezes antes de o éter foi evaporado
usando uma corrente suave de azoto seco. E2 e T foram analisadas utilizando o ensaio
imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) (Cayman Chemical Ann Arbor, MI, EUA). Os extractos
foram reconstituídos em 100 mL de tampão EIA seguindo as instruções do fabricante. Todas as
amostras foram analisadas em duplicado.

2.5. Estatística
Foram utilizados os testes de Kolmogorov-Smirnov e teste de Levene Mediana para testar
normalidade e igualdade de variância dos dados, respectivamente. Os dados foram log-
transformados antes da análise estatística para alcançar a normalidade e homogeneidade de
variância. Um t-ensaio foi utilizado para testar a hipótese nula de que não existe diferença
significativa entre a média de cada um dos parâmetros medidos no grupo hipóxica e a normóxia
grupo. As correlações entre a expressão de vários genes estudados e E2 e T no mesmo peixe (n = 8-
16) foram analisados utilizando o teste de correlação de Pearson para testar a hipótese de que estes
parâmetros variou juntos. O nível de significância de todos os testes foi de p <0,05. Todas as
análises foram realizadas utilizando SigmaStat 3.0.1 (SYSTAT Software Inc.).

3. Resultados
3.1. Níveis hormonais de sangue
E2 foi significativamente reduzida (-32,1%, p <0,05) nas fêmeas hipóxicas, mas não nos machos
(Fig. 1). Em contraste, os níveis de T foram reduzidos significativamente nos homens hipóxicas (-
56,9%, p <0,05), mas não nas mulheres.

3.2 . sGnRH , GtHs , GTH- Rs e genes esteroidogênicas

As alterações na expressão de vários genes-chave ao longo do eixo BPG de peixe-
zebra fêmea são mostrados na fig. 2A . As fêmeas expostas à hipoxia mostraram
uma redução significativa nos níveis de mRNA de sGnRH no cérebro ( -39,4 % , p <
0,05 ) . Reduções significativas na hipófise FSHp ( -71,5 %, p < 0,001) e LHp ( -60,9
%, p < 0,001) também foram evidentes nas fêmeas hipóxicas . Em ovários , a
expressão de FSH - R e HMGR upregulated consideravelmente ( FSH - R : 91,4 % ;
HMGR : 150,7 %, p < 0,01 ) , enquanto que a expressão de CYP19A foi regulada
negativamente ( -53,0 % , p < 0,05 ) . Nenhuma mudança significativa na expressão
de LH -R , estrela, CYP11A , 3β -HSD e 20 βHSD mRNA foi encontrada nos ovários
de fêmeas de hipóxia . Ao contrário do sexo feminino , sGnRH no cérebro masculino
não foi afetado pela hipóxia (Fig. 2B). No pituitária , só foi inibida LHp ( -66,8 % , p <
0,001 ) . Nos testes , com exceção da 3β -HSD , todos os genes esteroidogênicas
medidos foram reprimidos de forma significativa pela hipóxia (Star : -31,7 %;
CYP11A : -39,8 %; CYP11β : -25,7 %; 20 βHSD : -27,6 %, p < 0,05 ) . Testicular
HMGR ( -26,0 % , p < 0,05 ) e LH - R ( -34,6 % , p < 0,05 ) foram reprimidos por
hipoxia enquanto nenhuma alteração foi detectada na expressão de FSH - R .

3.3. Correlações entre a expressão do gene de sGnRH, GtHs, GTH-Rs e genes

esteroidogênicas
As inter-relações entre as alterações induzidas por hipoxia em expressão de genes
distribuídos ao longo do eixo BPG em peixes-zebra fêmea estão apresentados na Tabela
S3. Cérebro sGnRH mRNA foi correlacionada positivamente com ambos pituitária FSHp (r
= 0,546, p <0,05) e LHp (r = 0,541, p <0,05). Pituitária FSHp foi positivamente
correlacionada com ambos LHp pituitária (r = 0,617, p <0,01) e de ovário CYP19A (r =
0,607, p <0,05). Em contraste, de ovário de FSH-R foi negativamente correlacionado com
FSHp pituitária (r = -0,800, p <0,01), LHp (r = -0,732, p <0,05) e de ovário CYP19A (r = -
0,889, p <0,01). Da mesma forma, HMGR ovário foi negativamente correlacionada com
FSHp pituitária (r = -0,606, p <0,01) e LHp (r = -0,536, p <0,05). Desde sGnRH cérebro
não foi significativamente afetada pela hipóxia em peixes machos, apenas as correlações
entre as mudanças de expressão gênica na hipófise e os níveis testiculares foram
analisados (Tabela S4). LHp pituitária foi positivamente correlacionada com a de testículo
de LH-R (r = 0,666, p <0,05) e CYP11A (R = 0,830, p <0,01). Nos testículos, HMGR foi
positivamente correlacionada com LH-R (r = 0,518, p <0,05), Estrela (r = 0,664, p <0,01),
20β-HSD (r = 0,645, p <0,01) e CYP11β (r = 0,703, p <0,01). Star foi positivamente
correlacionada com a LH-R (r = 0,628, p <0,05) e CYP11β (r = 0,658, p <0,05). Além
disso, foi encontrada uma correlação positiva entre CYP11β e 20 βHSD (r = 0,549, p
<0,05).

3.6 . As correlações entre a expressão gênica dos receptores de hormônios sexuais e

GtHs na hipófise
A relação entre os receptores de hormonas sexuais e as duas formas de GtHβ na hipófise
de ambos peixe-zebra macho e fêmea sobre a hipóxia está tabelada na Tabela S6 . Nas
fêmeas , FSHp e LHp foram positivamente correlacionados com ESR1 ( FSHp : r = 0,638 ,
p <0,01; LHp : r = 0,818 , p <0,001), esr2a ( FSHp : r = 0,682 , p <0,01; LHp : r = 0,516 , p
< 0,05 ) e esr2b ( FSHp : r = 0,526 , p < 0,05 ; LHp : r = 0,881 , p < 0,001 ) . mPRβ foi
positivamente correlacionada com a FSHp ( r = 0,465 , p < 0,05 ) , mas não LHp . Nos
machos , LHp foi positivamente correlacionada com ESR1 ( r = 0,621 , p < 0,01 ) , esr2a
( r = 0,709 , p < 0,001 ) , esr2b ( r = 0,682 , p < 0,001 ) e mPRβ ( r = 0,640 , p < 0,01 ) .

3.7 . A expressão dos genes de receptores de esteróides no fígado feminino

A sobre-regulação da expressão de ESR1 ( 31,6 % , p < 0,05 ) e esr2a ( 85,9 % , p <
0,001 ) foi detectado no fígado de fêmeas hipóxicas (Figura 4) . Em contraste , esr2b foi
regulada negativamente ( -47,4 % , p < 0,05 ) . A regulação baixa marcada em ambos
Vtg1 ( -91,6 % , p < 0,001 ) e Vtg2 ( -97,2 % , p < 0,001 ) , também foi observado .

3.8. A expressão dos genes envolvidos no transporte e metabolismo da hormona sexual

no fígado
Hipóxia conduziu a uma indução significativa de SHBG (139,0%, p <0,001), CYP3A65
(102,7%, p <0,01) e CYP1A (132,6%, p <0,05) mRNAs nos fígados fêmea (Fig. 5A). Nos
machos expostos a hipoxia, os níveis de mRNA de SHBG foram moderadamente
aumentado (63,9%, p <0,001), enquanto que os níveis de mRNA CYP3A65 e CYP1A
não foram alteradas de forma significativa (Fig. 5B).

3.9. As correlações entre a expressão do gene no fígado feminino

As correlações entre a expressão de genes que codificam receptores de hormonas
sexuais, de transporte e de enzimas metabolizadoras, bem como genes-alvo e de
estrogénio (Vtg1 Vtg2), no fígado fêmea foram resumidos na Tabela S7. Foram
encontradas correlações positivas significativas entre os genes que foram upregulated por
hipóxia - ESR1 e esr2a (r = 0,545, p <0,05), SHBG (ESR1: r = 0,557, p <0,05; esr2a: r =
0,802, p <0,001), CYP3A65 (ESR1: r = 0,739, p <0,001; esr2a: r = 0,787, p <0,001;
CYP1A: r = 0,705, p <0,001) e CYP1A (ESR1: r = 0,521, p <0,05; esr2a: r = 0,778 , p
<0,001) -, bem como aqueles que foram reprimidos por hipoxia - esr2b (Vtg1: r = 0,559, p
<0,05; Vtg2: r = 0,495, p <0,05), e Vtg1 Vtg2 (r = 0,952, p <0,001 ). Ambos os genes e
esr2b VTG foram correlacionados negativamente com todos os outros genes
4. Discussão
Estudos anteriores demonstraram que a hipóxia perturba os níveis de hormônio sexual
em muitas espécies de peixes, causando prejuízos reprodutivos (Landry e col., 2007,
Thomas et al., 2007 e Wu et al., 2003). Este é o primeiro estudo exaustivo para mostrar
que a hipóxia pode alterar simultaneamente a expressão de genes-chave reguladoras em
vários níveis da hormona ao longo do eixo BPG no peixe-zebra. Descobrimos ainda que a
hipóxia provoca mudanças de sexo e de tecidos específicos na expressão gênica dos
receptores de hormônios sexuais ao longo do eixo BPG e fígado, e upregulates genes
envolvidos no transporte de hormônios sexuais e do metabolismo no fígado. Estes
resultados sugerem possíveis mecanismos e caminhos para o rompimento observado
hormônio sexual e reprodutiva, portanto, prejuízo causado por hipóxia em peixes.

4.1. Hormônios sexuais Sangue

Concentrações de hormônios sexuais servem como bons indicadores do estado gonadal
dos peixes (Kime, 1999). Hipóxia causou supressão dos níveis de E2 sanguíneos
associados com o desenvolvimento de ovário prejudicada e oogênese em muitas
espécies de peixes, incluindo a carpa, corvina Atlântico, Pacu (Piaractus brachypomus) e
Golfo killifish (Fundulus grandis) (Dabrowski et al., 2003, Landry et al., 2007, Thomas et
al. de 2006, de Thomas et al., 2007 e Wu et al., 2003). Do mesmo modo, os efeitos
inibitórios de hipoxia em níveis sanguíneos T e espermatogénese auditivos foram
observados no carpa, Grasnador Atlântico e Pacu (Dabrowski et al. De 2003, de Thomas
et al., 2007 e Wu et al., 2003). Neste estudo, foi observada a redução E2 sangue e os
níveis de T no peixe-zebra feminino e masculino, respectivamente, indicando que as
funções ovarianas e testiculares em peixe-zebra poderia ser prejudicado similarmente
seguinte hipóxia.

4.2. Genes reguladores da hormona ao longo do eixo BPG

A expressão diferencial de genes reguladores-chave ao longo do eixo do BPG foi
identificado em zebrafish hipóxica. Fig. 6 resume a relação entre as alterações na
expressão de vários genes ao longo do eixo BPG e os níveis correspondentes de
hormonas sexuais circulantes. Nossos resultados mostram que a hipóxia reduziu
significativamente sGnRH nas mulheres apenas, o que é consistente com um estudo
anterior, utilizando zebrafish (Steven et al., 2003). GnRH inicia a cascata hormonal
reprodutivo ao longo do eixo BPG e é, portanto, um regulador mestre de reprodução de
vertebrados (Lethimonier et al., 2004). A hipóxia também reduziu drasticamente a
manifestação de GtHβ na hipófise feminina do sexo feminino (FSHp e LHp) e masculino
(LHp) peixe-zebra, com correlações positivas entre o cérebro ea hipófise sGnRH FSHp e
LHp nas fêmeas. Desde GtHβ em peixes é regulada por GnRH, os nossos dados
sugerem que a hipóxia pode actuar no hipotálamo para diminuir a produção ou a secreção
de GnRH, em vez da modulação da secreção de FSH e LH a partir gonadotrofos na
hipófise (Melamed et al., 1998) . GtHs estimular as funções do ovário e de testículo por
ligação aos seus receptores ligados à membrana cognato nas células somáticas de
gónadas (Kumar e Trant, 2001). Curiosamente, os nossos resultados mostram que a
hipoxia upregulated ovário de FSH-R. Esta correlação negativa com a pituitária FSHp e
LHp podem refletir um ajuste para compensar níveis mais baixos de GtHβ. Testicular LH-
R regulação baixa foi concomitante com LHp reduzida da hipófise. Prevê-se que estas
alterações poderiam inibir a via de sinalização LH, contribuindo assim para a diminuição
das funções reprodutivas em peixes hipóxica masculino.

Enzimas esteroidogénicas são principalmente regulada ao nível da transcrição sob o

controlo da glândula pituitária, e a sua perturbação pode afectar a produção de hormonas
sexuais (Omura e Morohashi, 1995). Evidências crescentes mostram que os genes que
regulam a esteroidogênese são locais-alvo importantes para várias CDAs (Sanderson,
2006 e Thibaut e Porte, 2004). Os nossos dados mostraram que a hipoxia suprimida
selectivamente certos genes que regulam a esteroidogénese, indicando uma resposta
específica do gene de hipoxia, em vez de uma regulação negativa do metabolismo em
geral. A regulação negativa significativa de CYP19A ovário, que codifica aromatase para
converter em T E2, é uma explicação provável para o E2 reduzida observada nas fêmeas.
Curiosamente, a hipóxia teve um maior efeito marcado na esteroidogênese testicular,
causando regulação baixa significativa de todos os genes, exceto 3 尾-HSD. O colesterol
é o precursor comum para todas as hormonas esteróides sexuais. STAR, que é regulada
por GtH em peixes, regula a importação de colesterol na membrana mitocondrial interna e
é, portanto, o passo determinante da velocidade para iniciar steroidgenesis (Bauer et al.,
2000 e Stocco, 2001). A correlação positiva entre os níveis de estrela e T circulantes
sugere que a inibição da esteroidogênese testicular pode ser iniciado através do bloqueio
da transcrição de estrela, enquanto expressão CYP11A downregulated também pode
contribuir para as concentrações de T reduzidos. Em peixes machos, LH é pensado para
jogar um papel fundamental na regulação e apoiar a produção de esteróides das células
de Leydig (Schulz et al., 2001). As fortes correlações positivas entre estrela e LH-R e
CYP11A e LH 尾 , indicam que a via de sinalização LH podem ser interrompidos pela
hipóxia. Da mesma forma, a redução CYP19A em mulheres pode estar relacionada com a
redução observada de FSH 尾. Supressão de genes esteroidogênicas pode, portanto, ser
uma conseqüência do limitado GtH pituitária 尾 ou resultado da inibição direta dos
próprios genes esteroidogênicas. Interessantemente, a resposta hipóxica do HMGR
(enzima que limita a taxa de síntese de colesterol) foi expressão diferente no sexo
masculino e feminino. HMGR ovário foi regulada de forma significativa, enquanto HMGR
testicular foi downregulated. PORQUE? A hipoxia foi reportado para inibir a síntese do
colesterol in vitro em células de mamíferos, enquanto que os estudos in vitro de
mamífero têm mostrado que a hipoxia estimula a degradação da HMGR (Nguyen et
al. De 2007 e Pallottini et al., 2008). A redução prevista na síntese local de colesterol
pode fornecer uma explicação para as correlações positivas identificadas entre a
expressão de genes e HMGR esteroidogênicas níveis de t em peixe-zebra macho
(Estrela, 20 尾-HSD e CYP11 尾) e. Nas fêmeas, a resposta hipóxica de HMGR poderia
voltar a ser uma resposta compensatória de ovários a níveis mais baixos de GtH 尾 e E2
sangue. Outro mecanismo potencial de hipóxia pode envolver a regulação baixa de 20 尾-
HSD. Esta é uma enzima importante envolvida na 伪 17, 20 尾-di-hidroxi-4-pregnen-3-ona
(DHP) síntese, uma hormona responsável pelo desencadeamento da maturação dos
gâmetas (Senthilkumaran et al. De 2004 e Weltzien et al., 2004). Desconhece-se se a
hipoxia poderia reduzir os níveis de DHP em sangue, no entanto este pode explicar as
observações anteriores de redução da desova sucesso e a produção de gâmetas
(Thomas et al., 2007 e Wu et al., 2003). Mais estudos são necessários para testar essa
hipótese. Aqui nós mostramos que a hipóxia interfere com a síntese de hormônios
sexuais, atuando em vários níveis do eixo BPG, com genes alvo e possíveis vias
moleculares que são específicas do gênero. As fêmeas parecem ser mais sensível à
hipoxia do que os homens nos níveis brainand pituitária, enquanto os machos são mais
sensíveis ao nível gonadal como exemplificado pela regulação baixa de seis dos oito
genes-chave que controlam a esteroidogênese.

4.3. Receptores hormonais de sexo ao longo do eixo BPG-hepáticas

Os esteróides sexuais são conhecidos para regular indirectamente GtHs pituitárias
através modulando GnRHs cerebrais (Blazquez et al., 1998 e Yaron et al., 2003). Estudos
anteriores em modelos diferentes de peixes têm mostrado que essa modulação pode, em
alguma parte ser mediado por receptores de hormônios sexuais, expressa nas principais
áreas neuroendócrinos (Gorelick et al., 2008, Hanna e Zhu, 2009, Muriach et al., 2008a e
Muriach et al., 2008b). Neste estudo, a hipóxia causada regulação positiva de ESR1
cérebro, AR e mPRα nos machos, enquanto que não foram observadas alterações
no cérebro feminino. Isto sugere que no cérebro masculino, a regulação positiva dos
receptores podem neutralizar os efeitos de supressão de hipóxia na sGnRH. Na hipófise,
todos os três subtipos de ERs (ESR1, esr2a, esr2b) e mPRß foram reprimidos por hipóxia
em ambos os sexos. Receptores hormonais de sexo no complexo cérebro-pituitária estão
envolvidos na regulação por feedback de hormônios sexuais. Assim, as alterações
observadas sugerem que a hipóxia pode interromper a sincronização ao longo do eixo
BPG. As correlações positivas significativas entre os receptores da hipófise (ESR1, esr2a,
esr2b e mPRß) e GtHß pituitária em ambos os sexos oferecem mais provas para esta
postulação. A resposta hipóxica de genes de receptores de hormônios sexuais nas
gônadas foi sexo-específicos. Estrógenos e andrógenos gonadais são fundamentais na
regulação das funções do ovário e testículo. Supressão de ESR1 ovário sugere que a
resposta de folículos para sinalização de estrogénio pode ser atenuada por hipoxia, o que
pode contribuir para o desenvolvimento do ovário prejudicada. Em testes, esr2a, esr2b e
mPRα todos foram reprimidos. Aumentar a evidência mostrou que o estrogênio endógeno
é vital para a espermatogênese, assim este processo pode ser afetado quando hipóxia
provoca perturbações na sinalização estrogênio via supressão dos receptores gonadais
(Amer et al., 2001 e Miura et al., 1999). Testicular mPRα, intermediário na estimulação
progestina de hipermotilidade esperma em peixes, também foi downregulated pela hipóxia
(Thomas, 2008b). Isto foi consistente com os relatórios anteriores de diminuição mPRα
em membranas plasmáticas de esperma de corvina Atlântico expostos à hipoxia, e,
portanto, fornece um mecanismo plausível subjacente diminuição da motilidade
espermática em peixes hipóxico como descrito anteriormente por nosso grupo (Wu et al,
2003;. Thomas e Rahman , 2009). No fígado fêmea, a hipóxia elimina vitelogeninas (Vtg1
e Vtg2), fornecendo uma explicação molecular para a deposição de gema reduziu em
ovos e desenvolvimento ovariano prejudicada de peixes hipóxica observado em nossos
estudos anteriores. FSH é conhecido por regular vitelogênese, assim, a redução
observada em transcrições FSHp pituitária sugere que a hipóxia pode também prejudicar
a vitelogênese visando pituitário FSH (Jalabert, 2005). Além disso, esr2b hepática foi
positivamente correlacionada tanto Vtgs e E2 sangue, e indicando regulação baixa de
esr2b também podem contribuir para a vitelogênese inibido.

4.4. Sexo hormônio transporte e metabolismo

O fígado é um local central para regular o transporte de hormônios sexuais e do
metabolismo. Neste estudo, a SHBG hepática foi regulada positivamente em ambos os
sexos, em resposta a hipoxia. O aumento da SHBG no sangue pode causar aumento de
ligação aos hormônios sexuais, reduzindo a fração livre de E2 e T em peixes hipóxica. Isto
sugere um novo mecanismo para diminuições na E2 sangue nas fêmeas e nos machos T.
Além disso, a hipóxia regulada expressão hepática de CYP3A65 e CYP1A em peixes-
zebra fêmea, que pode aumentar E2 biotransformação e desembaraço, o que representa
mais um novo mecanismo para redução E2 sangue nas fêmeas de hipóxia. A correlação
negativa entre a expressão dos genes que codificam enzimas metabolizadoras de
esteróides sexuais (CYP3A e CYP1A) e Vtgs (Vtg1 e Vtg2), indica que o fígado fêmea
distribui mais E2 para a depuração e, portanto, menos E2 torna-se disponível para a
produção Vtg sob condições hipóxicas. Dada produção Vtg é exigente em termos
energéticos, parece que os peixes fêmeas poderia tentar economizar energia para a
sobrevivência, reduzindo a produção Vtg.
No geral, este estudo propõe mecanismos possíveis para induzida por hipóxia
desregulação endócrina em peixes. Embora o presente estudo mostrou que a hipoxia
afecta alvos múltiplos ao longo do eixo BPG a nível transcricional, estudos adicionais
devem ser realizados para revelar se ou não a expressão de ARNm pode ser traduzido
em alterações na respectiva proteína. É difícil determinar se a reprodução prejudicada é
um resultado dos efeitos combinados da perturbação simultânea de múltiplos níveis BPG
ou um resultado da interacção de feedback dentro do eixo BPG. Pesquisas anteriores
mostraram hipóxia afeta a fertilidade masculina em humanos, levando a diminuir a
contagem de esperma, mobilidade do esperma e testosterona (Verratti et al., 2008).
Desde regulação hormonal ao longo do eixo BPG é altamente conservada entre os
vertebrados, este estudo pode fornecer informação importante sobre os mecanismos
moleculares da deficiência reprodutiva induzida por hipóxia em vertebrados superiores.