Faculdade de Ciências

Departamento de Ciências Biológicas

Licenciatura em Biologia Aplicada
Biotecnologia Animal
Produção de frangos de corte (Gallus gallus domesticus) resistentes a altas
temperaturas pela inoculação do gene hsp70 extraído do Bacillus cereaus.

Discentes: Docentes: Docentes:

Saido Francisco Prof. Dr. José Sumbana
Domingas Mandala Mestre Arsénio Muchongo

Lavomó Simango
Monitora:
Olivia dos Santos
Paula Chilengue

Maputo, abril de 2024

Índice
1. Introdução................................................................................................................ 3
2. Problematização e Justificativa.................................................................................4
2.1. Problematização................................................................................................4
2.2. Justificativa....................................................................................................... 4
3. Objectivos................................................................................................................ 5
3.1. Objectivo geral..................................................................................................5
3.2. Objectivos específicos.......................................................................................5
3.3. Formulação de hipóteses.......................................................................................5
Referencias Bibliográficas...............................................................................................7
 1. Introdução
Em Moçambique, cerca de 80% da população esta engajada em actividades agrícolas,
sendo a criação de frango uma actividade complementar. A avicultura é um dos
segmentos da pecuária que mais contribui para cobrir o défice de proteina, para a
promoção da segurança alimentar, na geração de rendimento e de emprego, e do
crescimento económico do país (Oppewa et al., 2016).

Os efeitos de temperatura e da humidade nas aves, na maioria do leste e sudeste de

africa, a principal preocupação ambiental é manter temperaturas amenas face a altas
temperaturas. Moçambique esta localizado na região do clima tropical, e no verão as
máximas diárias chegam a atingir 38 a 40 graus. Sob estás condições climáticas maior
dever ser o cuidado com o stress por calor, necessitando de mecanismos de produção,
como pavilhões condicionados (Gussule,2018).

O efeito de exposição a altas temperaturas nos frangos de corte tem sido relatado como
resultado na redução da taxa de crescimento, consumo da ração e qualidade de carne.
Independentemente do nível energético utilizado na ração, a alta temperatura reduz o
desempenho das aves, com queda de 16% no ganho de peso e piora a 19% na conversão
alimentar (Vercese, 2014)

Na província de Maputo, a presidente dos avicultores, lamenta a morte de mais de 15

mil frangos face ao calor intenso, e os criadores têm estado a implementar uma série de
medidas para atenuar os efeitos de calor, que não tem estado a surtir efeito desejado.
Aliando a isso está a falta de aviários aclimatizados, falta de experiência dos avicultores
face a situação factores que tem estado a ditar a alta mortalidade de frangos (Rádio
Moçambique, 2022).

Os organismos termófilos são seres cuja temperatura ótima varia de 40 graus a 70 graus
centigrados com tolerância máxima de 90 graus, temperaturas como essas são
encontradas em águas termais. Alguns termófilos obtêm a energia de oxidação de
enxofre e são bactérias quimiossintecticas. Mas em geral são todos considerados
extremófilos e resilientes. Estes organismos não são capazes de crescer em temperaturas
abaixo de 45 graus (Pilling, 2016).

Com exposto acima, este trabalho tem como objectivo a produção de frangos (Gallus
gallus domesticus) de corte resistente a altas temperaturas pela inoculação do gene
hsp70 extraído da bactéria Bacillus cereaus.
 2. Problematização e Justificativa
2.1. Problematização
Por serem animais sensíveis a elevadas temperaturas as aves sofrem inúmeras perdas
não só produtivas, mas também económicas, principalmente na fase final de sua
produção, em consequência do estresse térmico afectando na redução dos índices
zootécnicos e no aumento da mortalidade. O aumento da temperatura do ambiente leva
à diminuição da capacidade da ave em dissipar calor e consequente desequilíbrio ácido
base (Silva et al.,2015).

Frangos de corte quando expostos a temperatura ambiental acima de a 25 graus,

apresentam temperaturas da cloaca e da pele significativamente aumentadas, o que
sugere redução na capacidade de perder calor, e quando expostos a temperaturas agudas
extremas, entram em quadro de hipertermia elevando a taxa de mortalidade de produção
(Lopes et al., 2015).

A capacidade das aves em suportar o calor é inversamente proporcional ao teor de

umidade. Quanto maior esta, a ave terá mais dificuldade em remover calor interno pelas
vias aéreas, levando a um aumento das frequências respiratórias. O processo que a ave
realiza para manter sua homeotermia promove alterações fisiológicas que podem
comprometer seu desempenho.

O estresse por calor é responsável por grandes perdas no rendimento e lotes de frangos,
gerando um aumento de mortalidade e piora na conversão alimentar, além de
diminuição do peso corporal, principalmente quando as condições estressantes ocorrem
na fase final, próximo ao abate (Gomes et al., 2012).

Com o exposto acima, surge a seguinte pergunta de pesquisa: Qual é a o impacto da

produção de frangos resistentes a altas temperaturas pela inoculação do gene
hsp70?

2.2. Justificativa
Ambientes com condições críticas de humidade temperatura apresentam uma
diversidade única e quase exclusiva de comunidades de microrganismos extremófilos.
Tais organismos apresentam muitas adaptações em sua fisiologia, entre elas a produção
de moléculas estáveis a mudanças drásticas de temperatura e PH (Rosa, 2021).
As bactérias extremófilas são conhecidas pela capacidade de sobreviver em condições
inóspitas para a maioria dos seres vivos. São exemplos marcantes bactérias resistentes a
baixas temperaturas, encontradas em regiões glaciais ou resistentes as altas temperaturas
e acidez acentuada, como as de zonza com actividade vulcânica ou fontes termais (Da
Silva, 2022).

Dentro do domínio Bacteria, o género Thermus ficou reconhecido como principal

produtor de enzimas termorresistentes com utilização laboratorial, como a Taq DNA
polimerase usada nas reacções de PCR, mas o género de bactérias mais conhecido,
comumente encontrado em fontes termais e com inúmeras aplicações biotecnológicas é
o género Bacillus (Rocha, 2010).

Com vista a responde as necessidades dos avicultores com frangos resistentes a altas
temperaturas como forma de colmatar as recentes perdas que se tem sentido face as altas
temperaturas registadas em Moçambique, surge a ideia de produzir frangos resistentes a
altas temperaturas pela inoculação do gene hsp70 extraído da bacteria Bacillus cereaus.
 3. Objectivos
3.1. Objectivo geral
 Avaliar a produção de frangos resistentes altas temperaturas com base na
inoculação do gene hsp70.

3.2. Objectivos específicos

 Descrever o impacto da expressão do gene hsp70 na resistência ao estresse
térmico em frangos de corte.
 Analisar os efeitos da inoculação do gene hsp70 no desempenho produtivo dos
frangos submetidos a altas temperaturas.
 Comparar a resistência a altas temperaturas entre os frangos transgénicos (gene
hsp70) e não transgénicos.

3.3. Formulação de hipóteses

H1: A expressão do gene hsp70 influência a resistência ao estresse térmico dos frangos
de corte.

H0: A expressão do gene hsp70 não influência a resistência ao estresse térmico dos
frangos de corte.

H1: Há diferenças significativas no desempenho produtivo dos frangos inoculados o

gene hsp70 submetidos a altas temperaturas.

H0: Não há diferenças significativas no desempenho produtivo dos frangos inoculados o

gene hsp70 submetidos a altas temperaturas.

H1: Existe uma diferença significativa na resistência à altas temperaturas entre os

frangos transgénicos e os frangos não transgénicos.

H0: Não há diferença significativa na resistência à altas temperaturas entre os frangos

transgénicos e os frangos não transgénicos.
4. Metodologia
4.1. Materiais e Procedimento

4.1.2. Cultivo de células derivadas do fibroblasto dos embriões de frango de corte

Serão incubados 10 ovos do frango de corte a uma temperatura de 38°C, humidade 50%
a 60%, e uma boa ventilação durante 12 dias para permitir o desenvolvimento
embrionário. Terminado esse período os ovos serão higienizados e os embriões serão
retirados cuidadosamente dos ovos, os tecidos que contem fibroblasto (pele e músculos)
serão dissociados e triturados para libertar as células (Moraes et al., 2012).

As células isoladas serão cultivadas em meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified

Eagle Medium) suplementado com soro fetal bovino (FBS) a uma concentração de 10%
a 15% e adicionadas penicilina e estreptomicina para prevenir contaminações. Serão
incubadas com condições controladas de temperatura (37 graus Celsius), humidade, e
concentração de dióxido de carbono (5%) (Moraes et al., 2012).

4.1.3. Obtenção do gene HSP70 da Bacilus cereus

Iniciamente será cultivada a amostra de Bacilus cereus obtida no laboratório em um
meio de cultura LB (Luria-Bertani) e incubada a uma temperatura de 37°C durante 4h.
Após o crescimento das células, serão colhidas e o seu DNA será extraido usando o
Omega Bio-tek E.Z.N.A. Bacterial DNA Kit (Rocha, 2022).

O DNA isolado será amplificado usando primers

(TACTTTCTTGCAACCGAAACCGTCTAAACAACGAC) que correspondem as
sequências de gene HSP70
(ATGAAAGAACGTTGGCTTTGGCGAGATTTGTTGCTG) da Bacilus cereus em
uma reação em Cadeia Polimerase. A qualificação e quantificação do produto da PCR
será feita através a eletroforese em gel, em seguida purificada através da coluna de sílica
para a remoção de qualquer possível contaminante e por fim será efectuado o
sequenciamento do gene (Rocha, 2010).
4.1.4. Construção do ADN recombinante
O plasmídeo bacteriano pUC19 será usado como vector de clonagem. O plasmídeo
assim como o gene HSP70 serão digeridas pelas enzimas de restrição EcoRI produzindo
extremidades coesivas compatíveis que permitira a união do plasmídeo ao gene HSP70
através da enzima ligase formando o ADN recombinante (Cordeiro, 2003).

4.1.5. Testagem da integração do gene HSP70

O DNA recombinante será introduzido nas células do fibroblasto do frango de corte
para o processo de transformação através da técnica eletroporação e as células
transformadas serão cultivadas e submetidas a três temperaturas: 38°C, 40°C e 42°C
durante 2h, 4h, 6h (Moraes et al., 2012).

Será isolada e amplificada o genoma das células sobrevivente através da PCR e será
usada a análise Southern Blot para verificar o nível de expressão da proteína do gene
hsp70, o genoma será sequenciado para o conhecimento da posição do gene pelo
método de sequenciamento de Sanger (Moraes et al., 2012).

As células transformadas serão introduzidas em 20 embriões de frango através da

microinjeção directamente no blastoderma, e incubados a 37°C, humidade 50%, com
uma boa ventilação para fornecer oxigénio e remover o dióxido de carbono, os ovos
serão virados três vezes ao dia durante 21 dias, tempo suficiente para eclosão. (Peixoto
et al, 2011).

Após a eclosão serão criados, mantidos e monitorados em condições controladas

durante 6 semanas e serão submetidos a testes envolvendo temperatura: 38°C, 40°C e
42°C durante 2h, 4h e 6h, e comparada a um grupo de controle (frangos de cortes que
não transgénicos), serão avaliados possíveis alterações fenotípicas, comportamentais e a
estabilidade da característica transgénica ao longo das gerações durante o crescimento
(Peixoto et al, 2011).
5. Cronograma de Actividades
Tabela 1: As actividades terão a duração de 11 meses

Maio - Janeiro Fevereiro Março Abril

Dezembro
Revisão
Bibliográfica
Cultivo de
células do
embrião
Cultivo de
bactérias
Testagem
nas células
do embrião
Testagem no
frango
Analise dos
resultados
Entrega do
relatório
6. Resultados Esperados
Espera-se o crescimento das células transformadas quanto submetidas a todos os
tratamentos mencionados na metodologia e que expressem a proteína do gene hsp70 na
banda com 70KDa, que equivale ao seu peso molecular.

É esperado que as células transgénicas inseridas nos embriões do frango de corte confira
a resistência a temperaturas até 42°C durante 6h, e que o gene não iniba a expressão de
outos genes presentes no genoma do frango de corte.

Tambem espera-se que gene seja estável e passe para outras gerações, não interfira na
producao normal do frango de corte e que não haja variações comportamentais e
morfológicas
 6. Referencias Bibliográficas
Oppewal, J. et al., (2016). Estudo Sectorial: Cadeia de valor de frango em Moçambique.
IGC. Maputo.

Gussule, M.G.M. (2018). Avaliação do comportamento térmico de pavilhões de

produção de frangos em Moçambique. Évora.

Vercese, F. (2014). Efeito da temperatura ambiente e da idade do frango de corte sobre

o valor energético de alimentos alternativos. São Paulo.

Rádio Moçambique, (2022). Morte de frangos face ao calor intenso. Maputo.

Lopes, J. et al., (2015). Estresse por calor em frangos de corte. Nutri-Time. Brasil.

Gomes, A. et al., (2012). Estresse por calor na produção de frangos de corte. PUBVET.
UFU. Brasil.

Silva, et al., (2015). Análise do efeito do estresse térmico sobre produção, fisiologia e
dieta das aves. UFCG. Brasil

Da Silva, E. G. (2022). Diversidade de genes de resistências em bactérias de ambientes

extremos. UFRP. Recife

Rocha, T. B. (2010). Isolamento, identificação e caracterização enzimática de uma

bactéria de fonte termal do Cerrado. UB. Brasília

Cordeiro, M. C. (2003). Engenharia Genética: conceitos básicos e aplicações. Embrapa,

ISSN 1517-5111.

Moraes, V. E., et al (2012). A genética dos frangos e suínos: importância estratégica

para seu desenvolvimento para o Brazil. BNDES Setorial, n. 37, p. 119-157.

Peixoto, J. et al (2011). Populacao referencia para validação e descoberta de genes em

frango de corte. UFRA, e CD-ROM, Belém.