Luz de Diodo Emissor de Luz Azul Múltipla de Baixa Energia A Irradiação Promove A Síntese de Melanina e Induz Danos Ao DNA em Células de Melanoma B16F10 - PLOS UM

2/19/24, 8:36 PM Luz de diodo emissor de luz azul múltipla de baixa energia A irradiação promove a síntese de melanina e induz
ina e induz danos ao DN…
A irradiação de luz azul múltipla de diodo emissor de luz de

baixa energia promove a síntese de melanina e induz danos
ao DNA em células de melanoma B16F10
Siqi Zhou, Ryusuke Yamada, Kazuichi Sakamoto
Publicado: 2 de fevereiro de 2023 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0281062
Abstrato
A luz visível está presente em todas as nossas vidas. O uso generalizado de computadores e smartphones aumentou o tempo
diário gasto em frente às telas. Que efeito essa luz visível tem sobre nós? Estudos recentes demonstraram que a irradiação de luz
azul de comprimento de onda curto (400-450nm), semelhante à UV, inibe a proliferação e diferenciação celular, induz o estresse
oxidativo intracelular, promove a apoptose celular e causa alguns outros efeitos negativos. No entanto, é incomum que
enfrentemos diretamente luz azul de alta energia e comprimento de onda tão curto na vida diária. Portanto, os efeitos da luz azul
com maior comprimento de onda (470 nm), menor energia (1, 2 J/cm 2 ) e múltiplas vezes (uso diário simulado) exposição nas
células foram estudados neste experimento. Em nossos resultados, a luz azul múltipla de baixa densidade de energia inibiu a
proliferação celular e a capacidade metastática com uma fototoxicidade fraca. A luz azul também promoveu espécies reativas de
oxigênio intracelulares e causou danos ao DNA. Além disso, a síntese de melanina também foi promovida pela exposição múltipla
à luz azul de baixa densidade de energia. Juntos, esses resultados indicam que a exposição múltipla à luz azul com comprimento
de onda mais longo e baixa densidade de energia ainda é prejudicial às nossas células. Além disso, a exposição prolongada às
telas provavelmente induz a pele opaca através da indução da síntese de melanina. Esses resultados mencionados ainda nos
deveriam prestar mais atenção ao controle do uso diário de dispositivos digitais.
Citação: Zhou S, Yamada R, Sakamoto K (2023) Luz de diodo emissor de luz azul múltipla de baixa energia A irradiação
promove a síntese de melanina e induz danos ao DNA em células de melanoma B16F10. PLoS UM 18(2): e0281062.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0281062
Editor: Yi Cao, Universidade Xiangtan, CHINA
Recebido: 7 de outubro de 2022; Aceito: 16 de janeiro de 2023; Publicado: 2 de fevereiro de 2023
Direitos autorais: © 2023 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição
Creative Commons , que permite uso, distribuição e reprodução irrestrita em qualquer meio, desde que o autor original e a
fonte sejam creditados.
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Financiamento: O(s) autor(es) não recebeu(m) financiamento específico para este trabalho.
Interesses conflitantes: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
Com o desenvolvimento da tecnologia, temos que estar expostos a mais luz em nossa vida diária. Especialmente o uso
prolongado de televisão, computadores e smartphones prolonga ainda mais o tempo e aumenta a frequência de nossa exposição
à luz. Uma pesquisa recente baseada na web indicou que aproximadamente 93,8% dos entrevistados relataram que as horas de
uso de dispositivos digitais aumentaram sob a influência do COVID [ 1 ]. Em particular, a população estudantil viu um aumento de
5,18 ± 2,89 horas por dia de tempo diante da tela devido ao e-learning [ 2 ]. É bem sabido que a luz ultravioleta (UV) do sol pode
causar danos às células e até mesmo ao DNA [ 3 ]. Portanto, é importante investigar o efeito da luz da tela de LED (há um pico de
intensidade de luz na faixa de 400–500 nm do espectro da tela) em nossos corpos e células.
Pesquisas recentes mostraram que a luz vermelha com comprimentos de onda de 600 nm a 760 nm pode afetar uma ampla gama
de atividades em células e tecidos [ 4 ]. Por exemplo, tem efeitos protetores sobre os fibroblastos epidérmicos humanos [ 5 ] e
previne danos induzidos por UV em um modelo de camundongo nu [ 6 ]. E a exposição à luz vermelha não causa estresse
oxidativo e danos ao DNA [ 7 , 8 ]. Outros estudos mostraram que a luz vermelha promove a proliferação e diferenciação de
células-tronco mesenquimais humanas ou de rato [ 9 , 10 ]. No entanto, pesquisas sobre luz azul com comprimento de onda de
400 nm a 495 nm mostraram efeitos negativos para as células. Por exemplo, a luz azul de alta energia de 415–455 nm afeta as
células da retina, causando catarata do olho seco e degeneração macular relacionada à idade [ 11 ]. A luz azul também inibe a
proliferação e diferenciação e induz a apoptose em células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea [ 12 ]. A luz azul de
comprimento de onda curto é tóxica para os queratinócitos da pele e até mesmo ondas não tóxicas inibem a proliferação [ 13 ] e
induzem estresse oxidativo na pele viva [ 7 ]. A luz azul também afeta negativamente a vida útil dos nematóides [ 14 ]. No entanto,
na maioria desses estudos, é utilizado comprimento de onda mais curto (400-450 nm) e luz azul de maior energia, o que é
incomum para simular a situação em nossa vida diária. Portanto, nos perguntamos como o comprimento de onda mais longo (470
nm), a menor densidade de energia e a exposição múltipla à luz azul afetam a função fisiológica das células.
O estresse oxidativo está associado a muitas respostas celulares, uma das quais é o dano ao DNA nas células [ 15 ]. A exposição
aos raios UV pode causar quebras de DNA de fita simples ou mesmo de fita dupla [ 3 ], e a exposição aos raios UV também pode
levar a um aumento no estresse oxidativo intracelular [ 16 ]. Tendo em vista que a luz azul de alta energia pode causar danos
celulares em estudos anteriores, acreditamos que é necessário explorar se a luz azul com maior comprimento de onda e menor
densidade de energia pode levar ao aumento de espécies reativas de oxigênio nas células e no DNA. dano. Muitos estudos
mostraram que a luz vermelha pode promover o movimento e a proliferação de células [ 9 , 10 , 17 ]. No entanto, em comparação
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0281062 1/8
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com os efeitos negativos da luz azul nas células em outros estudos, um estudo recente mostrou que a luz azul de 470 nm também
pode promover o efeito de cicatrização de feridas em modelo de rato [ 17 ]. Portanto, queríamos verificar o efeito da luz azul com
maior comprimento de onda e menor densidade de energia na capacidade de migração celular.
A melanina é um pigmento natural sintetizado pelos melanócitos [ 18 ]. A exposição da pele à luz solar ou à irradiação UV faz com
que os melanócitos na epiderme sintetizem melanina para prevenir danos causados pela irradiação UV [ 19 ]. A síntese de
melanina é regulada principalmente pela enzima tirosinase limitante da taxa [ 20 ]. A tirosinase e as proteínas relacionadas à
tirosina (TRP-1, TRP-2) catalisam a tirosina para sintetizar melanina no melanossoma dos melanócitos [ 21 ]. A expressão do gene
da tirosinase é regulada pelo fator de transcrição do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) [ 22 ]. Anteriormente,
descobriu-se que a luz azul de alta energia de ondas curtas era capaz de promover a síntese de melanina nos melanócitos através
da regulação positiva da tirosinase e do MITF [ 23 , 24 ]. Portanto, também estamos interessados em saber como o maior
comprimento de onda e a menor densidade de energia regulam a síntese de melanina.
Neste estudo, investigamos como a exposição a múltiplos comprimentos de onda mais longos e baixa densidade de energia
afetam o efeito fisiológico (fototoxicidade, proliferação, migração, geração de ROS, danos ao DNA e síntese de melanina) em
células de melanoma B16F10.
Materiais e métodos
Cultura celular e celular
As linhas celulares de melanoma B16F10 foram obtidas do Instituto RIKEN, Banco de Células de Pesquisa Física e Química
(Tsukuba, Japão). O meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Células de melanoma B16F10 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, EUA).
Após uma cultura primária a partir de estoques congelados em placas de 10 cm, as células foram semeadas em densidades de
1,0 x 10 5 células/poço em placa de 60 mm, 3,0 x 10 3 células/poço em placas de 24 poços, ou 1,0 x 10 3 células/poço em placas
de 96 poços. As células foram deixadas fixar-se ao fundo das placas durante 24 horas antes das experiências subsequentes.
Irradiação de luz
A luz LED azul (pico em 470nm, DC24V, 1,13A, máx. 27,2W) usada neste experimento é um produto da AITECSYSTEM CO., LTD.
(Japão). A irradiação com luz azul foi realizada numa incubadora separada utilizando as mesmas condições de uma incubadora
normal: 37°C, 5% de CO2 . LEDs azuis foram irradiados a uma distância de 5 cm dos pratos ou pratos. A intensidade da luz azul
(1.000 lux, 0,27 mW/cm 2 ) foi medida por um medidor de energia através da tampa transparente de uma placa por 0, 1 e 2 h (0, 1
e 2 J/cm 2 ). Para o experimento de 3 dias, as células foram expostas à luz azul por 0, 1 e 2 horas por dia e depois retornaram à
incubadora (escuro). Após a irradiação do dia 3, as células foram devolvidas à incubadora escura durante 24 horas antes dos
ensaios subsequentes. HBSS (Wako, Japão) sem vermelho de fenol foi utilizado no lugar do meio durante o tratamento com luz
azul para prevenir efeitos estimulantes nas células. Após irradiação com luz azul, o HBSS foi substituído por meio RPMI-1640
fresco e colocado de volta na incubadora escura. O grupo não leve foi alterado para HBSS ou atualizado para médio junto com os
grupos de irradiação, mas a placa foi mantida em incubadora escura.
Ensaio MTT
As células foram cultivadas em placas de 24 poços com uma densidade de 3,0 x 103 células /poço e tratadas com luz azul durante
0, 1 e 2 horas por dia durante um total de 3 dias. A atividade enzimática foi medida diariamente após 24 horas de irradiação. Após
a irradiação, as células foram deixadas em repouso no escuro por 24 h, depois o meio foi substituído por meio fresco contendo
500 μg/ml de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 difenil tetrazólio ) reagente e as células foram incubadas a 37°C por
mais 4 h. Foi adicionado isopropanol com solução de HCl 0,04 M e as placas foram mantidas a 25°C por 5 min. A solução colorida
foi transferida para uma placa de ensaio de 96 poços e a absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de microplacas Tecan
(Kawasaki, Japão) (isopropanol com solução de HCl 0,04 M foi usado como branco).
Ensaio de azul tripano e ensaio de proliferação
As células foram cultivadas em placas de 24 poços com uma densidade de 3,0 x 103 células /poço. A taxa de sobrevivência celular
foi medida 24 horas após a irradiação com luz azul. As células foram coletadas com tripsina, centrifugadas a 800 xg e o sedimento
celular foi ressuspenso em 100 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dez μL da suspensão e 10 μL de azul de
tripano 0,4% (Sigma, EUA) foram misturados por um minuto, e o número de células vivas e totais foi contado usando um contador
de células (Logos Biosystems, Coréia). O número de células vivas foi utilizado como o número de células para a curva de
crescimento.
Detecção de apoptose
As células foram preparadas numa placa de 96 poços de fundo plano transparente Nunc de parede preta (Thermo Fisher
Scientific, EUA) com uma densidade de 1,0 x 103 células /poço. O kit de ensaio de Apoptose/Necrose (Abcam, Inglaterra) foi
utilizado para medir células que foram tratadas com luz azul (0, 1 ou 2 horas por dia) durante 3 dias. A fluorescência verde (Ex/Em
= 490/525 nm) para células em apotose e a azul (Ex/Em = 405/450 nm) para células vivas foram coradas após a irradiação do dia
3, 24 horas. Fotos das células foram tiradas por um microscópio de fluorescência (Keyence, Japão).
Cicatrização de feridas
1,0 x 105 células foram semeadas em placas de 6 cm até confluentes. As células foram arranhadas com uma ponta amarela em
forma de cruz e a luz azul foi imediatamente irradiada: a área da cruz imediatamente após o arranhão (0 h) foi designada S1
(rotulada pela linha amarela), e a área da cruz após 18 h foi S2 (marcado pela linha amarela). A migração de células foi medida
como S1 –S2.
Danos no DNA
As células foram semeadas a 3,0 x 10 3 células/ml em lâminas de câmara e irradiadas com luz azul durante 0, 1 e 2 horas.
Imediatamente após a irradiação, os danos no DNA foram medidos usando o kit de detecção de danos no DNA – γH2AX – green
(DOJINDO, Japão). As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência (Keyence, Japão) em Ex/Em = 494/518 nm. O
nível de fluorescência foi analisado pelo Image J.
Geração de ROS
As células foram preparadas numa placa de 96 poços de fundo plano transparente Nunc de parede preta (Thermo Fisher, EUA)
com uma densidade de 1,0 x 103 células /poço. Espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) foram medidas imediatamente
após a irradiação com um kit de ensaio de ROS celular DCFDA / H2DCFDA (Abcam, Inglaterra). Fotos fluorescentes foram tiradas
com um microscópio de fluorescência Keyence (Japão) em Ex/Em = 485/535 nm. Os sinais fluorescentes também foram medidos
utilizando um leitor de microplacas de fluorescência BioTek (Tóquio, Japão).
Ensaio de conteúdo de melanina
As células para o teor de melanina foram preparadas numa placa de 6 poços com uma densidade de 5,0 x 104 células /poço e
tratadas com luz azul durante 3 dias. Após a irradiação do dia 3, as células foram devolvidas à incubadora escura durante 24
horas e depois recolhidas com tripsina, centrifugadas a 800 xg e o sedimento celular foi dissolvido em NaOH 1M. A amostra foi
incubada a 80°C durante 1 h num bloco de calor para dissolver a melanina. A absorvância da solução de melanina foi medida
utilizando um leitor de microplacas BioTek. Os resultados foram normalizados de acordo com os níveis de proteína total medidos
utilizando um kit de ensaio de proteína Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific, EUA).
PCR em tempo real
As células foram preparadas em placas de 6 cm com uma densidade de 1,0 x 105 células /placa e o ARNm (imediatamente e 3
horas após a irradiação com luz azul) foi extraído utilizando RNA iso Plus (Takara Bio, Japão). O kit de reagentes PrimeScript TM
RT com gDNA Eraser (Takara Bio, Japão) foi utilizado para transcrição reversa para cDNA. A PCR quantitativa foi realizada com a
mistura qPCR THUNDERBIRD ® SYBR ® (Toyobo, Japão) e os ensaios foram realizados utilizando Thermal Cycler Dice ® Real
Time System Lite (Takara Bio).
A amplificação dos mRNAs alvo foi realizada utilizando primers específicos (5′-3′): mitf (direto: GTGAGATCCAGAGTTGTCGT ,
reverso: AGTACAGGAGCTGGAG ATG ); tirosinase (direto: TGACTCTTGGAGGTAGCTGT , reverso: AACAA TGTCCCAAGTACAGG ); trp-1
(adiante: AATGACAAATTGAGGGTGAG , reverso: GGCCTCTGAGGTTCTTTAAT ); trp-2 (avançado: AGGAGTGAGGCCAAGTT ATGA ,
reverso: ATGAGAAACTGCCAACCTTA ). gapdh (adiante: TGCCGTTGAA TTTGCCGTGAGT , reverso: TGGTGAAGGTCGGTGTGAACGG ) foi
usado como referência interna para normalização.
Análise estatística
Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os resultados são expressos como média ± DP. ANOVA foi
realizada post hoc para comparar os dados entre os grupos usando o SPSS Statistics. A significância estatística foi estabelecida
em um valor de p < 0,05.
Resultados
Múltiplas irradiações de luz azul com densidade de baixa energia inibiram a proliferação celular sem causar apoptose
O ensaio MTT mostrou que o comprimento de onda mais longo e a irradiação de luz azul com baixa densidade de energia
reduziram significativamente a atividade enzimática celular ( Fig. 1A ), mesmo apenas após a irradiação o resultado do MTT
também foi diminuído. Como o resultado do ensaio MTT depende do número de células e também da atividade enzimática,
também utilizamos o azul de tripano e a proliferação celular para investigar melhor a fototoxicidade da luz azul. Curiosamente, a
taxa de sobrevivência celular não se alterou significativamente devido à irradiação de luz azul no ensaio de azul tripano ( Fig. 1B ).
Enquanto a irradiação com luz azul reduziu significativamente a proliferação celular ( Fig. 1C ). Esses resultados nos deram a ideia
de que a luz azul de baixa densidade de energia não matava as células diretamente, mas inibia a proliferação celular. Além disso,
para certificar a fototoxicidade da luz azul, também medimos a apoptose celular. O número de células apoptóticas não aumentou
significativamente, indicando que a luz azul não leva à apoptose ( Fig. 1D e 1E ).
Fig 1. Efeito da luz azul na viabilidade de células de melanoma B16F10.

As células foram tratadas com luz azul (0, 1 e 2 h/dia) durante 3 dias. A. Viabilidade celular medida por ensaios MTT todos
os dias. B. Taxa de sobrevivência celular medida por ensaios de azul de tripano todos os dias. C. As células foram irradiadas
uma vez, devolvidas à incubadora escura e o número de células foi contado pelo contador de células todos os dias
seguintes. D. As células foram imediatamente coradas com apopxina verde (apoptose) e CytoCalcein Violet 450 (célula viva)
após a última irradiação, e as imagens foram tiradas com um microscópio fluorescente. Barra de escala, 500 μm. E. Os
valores de fluorescência para o verde foram analisados pela imagem J. NL: tratamento sem luz; BL: irradiação de luz azul;
B1h, B2h: irradiação de luz azul 1, 2 horas. Os resultados são apresentados como média ± DP; n ≥ 3; *p < 0,05, ***p < 0,001
vs.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0281062.g001
A luz azul de baixa densidade de energia inibiu a migração celular
Os melanócitos de camundongo B16F10 têm a capacidade de metastatizar. Em nosso estudo, o ensaio de cicatrização de feridas
foi utilizado para avaliar os efeitos da luz azul na migração de células de melanoma in vitro . A linha amarela foi usada para rotular
a área cruzada sem células. Descobrimos que as mudanças de área da área cruzada sem células dentro de 18 horas diminuíram
significativamente devido à irradiação de luz azul de 1 e 2 horas ( Fig. 2 ), o que significa que a exposição à luz azul de baixa
densidade de energia e comprimento de onda mais longo inibiu a célula de melanoma B16F10 migração.
Fig 2. Efeito da luz azul na migração de células de melanoma B16F10.

As células foram irradiadas com luz azul durante 0, 1 ou 2 h após a preparação das lacunas utilizando pontas de pipeta.
Linhas amarelas marcaram a área sem células. As imagens das 0h e 18h foram tiradas e a mudança de área do cross gap
foi analisada pela imagem J. Os gráficos de barras mostram a mudança da área entre 0h e 18h. NL: tratamento sem luz, BL:
irradiação com luz azul. Os resultados são apresentados como média ± DP; n ≥ 3; **p < 0,01, ***p < 0,001 vs.
Geração de ROS induzida por luz azul de baixa densidade de energia e danos ao DNA
A irradiação UV pode levar ao aumento de ERO dentro das células, portanto, nos perguntamos se a luz azul de baixa densidade
de energia com comprimento de onda mais longo, cujo comprimento de onda próximo ao UV, também tem um efeito semelhante
nas ERO intracelulares. Após irradiação com luz azul 0, 1, 2h, medimos imediatamente as ERO intracelulares pela coloração com
DCFDA. É claro que a fluorescência verde foi aumentada nos grupos de exposição à luz azul ( Fig 3A ), os resultados pelo leitor
de microplacas também estão de acordo com o microscópio que a luz azul aumentou significativamente a fluorescência nas
células ( Fig 3B ). Estes resultados sugeriram que a luz azul de baixa densidade de energia, semelhante à luz UV, aumentou as
ERO intracelulares após a irradiação.
Fig 3. Geração de ROS induzida por luz azul e danos ao DNA em células de melanoma B16F10.
Após a irradiação, as células foram imediatamente analisadas utilizando o kit DCF-DA ( A, B ) ou dano ao DNA ( C,D ), as
fotos foram tiradas em microscópio fluorescente. A fluorescência do DCF-DA foi medida pelo leitor de microplacas (B). As
imagens de danos ao DNA foram analisadas pela Image J. A, B. Geração de ERO induzida por luz azul em células de
melanoma B16F10. C, D. Danos no DNA induzidos por luz azul em células de melanoma B16F10. O comprimento da barra
de escala em A e C é 100 μm e 500 μm, respectivamente. O campo claro da célula após a irradiação de luz azul foi
mostrado nas Figuras S3 e S4 no arquivo S1 . NL: tratamento sem luz, BL: irradiação com luz azul. Os resultados em B e D
são apresentados como média ± DP; n ≥ 3; **p < 0,01, ***p < 0,001 vs.
Em seguida, também medimos o dano ao DNA, porque as ROS geradas após a irradiação UV das células podem danificar o DNA.
Portanto, também queríamos investigar o efeito da luz azul no DNA. Após o mesmo tempo de exposição com o ensaio de geração
de ROS, coletamos as células e medimos o dano ao DNA com o kit “DNA Damage Detection Kit — γH2AX — GREEN”. H2AX
fosforilado (γH2AX) é um marcador de dano ao DNA. Neste experimento, γH2AX é rotulado e apresenta fluorescência verde.
Descobrimos que a fluorescência de γH2AX foi significativamente aumentada pela exposição à luz azul ( Fig. 3C e 3D ), o que
sugeriu que a luz azul de baixa densidade de energia também causou danos ao DNA intracelular, que aumentaram com o tempo
de irradiação.
A irradiação múltipla de luz azul com densidade de baixa energia promoveu a síntese de melanina através da regulação positiva da tirosinase
Em estudos anteriores, foi demonstrado que a luz azul de comprimento de onda curto (410–440 nm) e de alta energia (>20 J/cm 2
) promove a síntese de melanina. Então, queríamos saber se comprimentos de onda mais longos (470 nm), energia mais baixa (1–
2 J/cm 2 ) e exposições múltiplas (3 vezes) à luz azul teriam o mesmo resultado. Em nossos resultados, irradiações múltiplas de
baixa densidade de energia também promoveram ligeiramente (cerca de 1,2 a 1,3 vezes), mas promoveram significativamente a
síntese de melanina ( Fig. 4A ).
Fig 4. Melanogênese melhorada pela luz azul em células de melanoma B16F10.

As células foram tratadas com luz azul (0, 1 e 2 h/dia) durante 3 dias, e as células do dia 3 foram coletadas. A. O teor de
melanina aumentou pela irradiação de luz azul. BD. Quantidade de mRNA determinada imediatamente após a irradiação (0
h) por PCR em tempo real. EH. Quantidade de mRNA 3 h após irradiação por PCR em tempo real. NL: tratamento sem luz,
BL: irradiação com luz azul, tyr: tirosinase. Os resultados são apresentados como média ± DP; n ≥ 3; *p < 0,05, **p < 0,01,
***p < 0,001 vs.
Além disso, examinamos a expressão gênica de fatores que regulam a síntese de melanina. Não houve aumento significativo na
expressão de genes relacionados à síntese de melanina em células que foram imediatamente recuperadas após exposição à luz
azul ( Fig. 4B e 4D ), exceto para o fator de transcrição mitf ( Fig. 4C ). No entanto, após 3 horas de exposição à luz azul, a
expressão de TYR , TRP-1 , TRP-2 e mitf foi significativamente regulada positivamente ( Fig. 4E-4H ). Portanto, concluímos que a
exposição múltipla à luz azul com baixa densidade de energia também aumentou a síntese de melanina.
Discussão
Este estudo avaliou a capacidade da luz visível LED azul de regular os efeitos fisiológicos das células sintetizadoras de melanina.
A luz azul pode penetrar profundamente nas camadas da pele e afetar as células, uma vez que tem um comprimento de onda
mais longo e menor energia em comparação com a luz UV [ 25 ]. Portanto, precisamos começar a prestar atenção ao impacto da
iluminação diária sobre nós mesmos, incluindo a luz encontrada nos telefones celulares ou nas telas dos computadores.
Estudos anteriores sugeriram que a exposição à luz visível azul apresentava efeitos negativos nas células. É relatado que a luz
azul inibe a proliferação celular e aumenta a geração de ROS em células-tronco da medula óssea (BMSCs) [ 12 ], fibroblastos [ 26
], HaCaTs (queratinócitos humanos) [ 27 ], células do epitélio pigmentar da retina [ 28 ] e células U937 [ 29 ]. No entanto, é difícil
resumir o efeito da luz azul na indução da apoptose a partir destes estudos.
Diferentes comprimentos de onda de luz azul foram usados em estudos anteriores. Comprimentos de onda mais curtos de luz
azul, como 412–426 nm, apresentaram toxicidade mais forte [ 13 , 26 , 28 ], enquanto a luz azul de 453 nm e 470 nm apresentou
menor toxicidade e efeitos inibitórios na proliferação e função celular [ 12 , 13 , 29 ]. A maioria dos experimentos envolvendo
células envolveu apenas uma aplicação de luz azul [ 9 – 12 , 25 – 29 ], o que permitiu uma melhor compreensão do efeito
regulador da luz azul nas células. No entanto, não simula condições do mundo real utilizando computadores ou telemóveis.
Portanto, usamos luz azul de comprimento de onda mais longo (470 nm), energia mais baixa (1–2 J/cm 2 ) (aproximadamente o
lux de telas de telefones celulares e telas de computador) e realizamos múltiplas exposições neste estudo.
Inicialmente, descobrimos que a irradiação de luz azul diminuiu a atividade enzimática celular pelo ensaio MTT, mas não afetou a
taxa de sobrevivência celular pelo ensaio azul tripano. Como os resultados do MTT foram baseados tanto no número de células
quanto na atividade enzimática, também foi encontrado um número diminuído de células. Foi difícil determinar se a diminuição do
MTT foi devida a uma diminuição no número de células ou a uma diminuição na atividade enzimática celular. Portanto, realizamos
ainda ensaios de azul de tripano e proliferação celular. Irradiações múltiplas e intermitentes não afetaram a taxa de sobrevivência
celular, mas reduziram significativamente a proliferação celular. Estes resultados indicaram que a diminuição da atividade
enzimática pela luz azul se deve à redução da proliferação celular e não à citotoxicidade. Também detectamos o nível de ciclina
após a exposição à luz (S1 Fig no arquivo S1 ), a diminuição do mRNA da ciclina também sustenta que o ciclo celular foi
interrompido pela luz azul. No entanto, múltiplas irradiações de baixa potência não aumentaram a apoptose em comparação com
outras irradiações únicas de alta potência no mesmo comprimento de onda de 470 nm [ 12 ]. A fim de confirmar ainda que a luz
azul não causou apoptose, a expressão de caspase-3 e o conteúdo de caspase-3 clivada também foram detectados (S2 Fig no
arquivo S1 ). Embora o nível de expressão da caspase-3 tenha aumentado, não houve banda na posição da caspase-3 clivada, o
que indicou que não ocorreu apoptose. A irradiação de luz azul com comprimento de onda mais longo e menor energia inibiu a
proliferação celular sem induzir apoptose, o que é um fenômeno interessante. Para o tratamento do câncer, significa que é
possível inibir o crescimento do câncer sem matar as células. Embora ainda sejam necessários mais experimentos para verificar
esta conjectura.
Descobrimos que uma única irradiação de luz azul de baixa densidade energética aumentou os níveis de ERO nas células de
melanoma. A luz UV geralmente promove a geração intracelular de ROS e induz danos ao DNA [ 3 , 16 ]. O aumento das ERO
está frequentemente ligado a danos no DNA [ 15 ]. Danos no DNA promovem a geração de ROS através da via H2A.X-Nox1/Rac1
[ 30 ]. Em nossos resultados, tanto a geração de ERO quanto os danos ao DNA foram regulados positivamente pela exposição à
luz azul, o que sugeriu que, embora a luz azul de baixa densidade de energia não induzisse a apoptose, ela também induzia o
estresse oxidativo e os danos ao DNA. As ROS regulam muitas atividades intracelulares, enquanto o excesso de ROS induz
danos intracelulares, incluindo danos ao DNA [ 15 ]. O dano ao DNA causado por ROS é dividido em quebra de fita simples (SSB)
e quebra de fita dupla (DSB) [ 31 ]. Danos ao DNA também causam parada do ciclo celular e reparo do DNA [ 15 ]. A quebra grave
da fita dupla de danos ao DNA leva diretamente à apoptose celular [ 32 ]. Estes resultados ajudam-nos a compreender porque é
que a luz azul causa danos no ADN e reduz a proliferação celular sem causar apoptose. Achamos que a razão é a luz azul com
densidade de energia relativamente baixa usada em nossos experimentos, a energia não é forte o suficiente para causar danos
fatais às células. Esses resultados também nos lembram que precisamos prestar mais atenção ao uso diário dos dispositivos
digitais. Embora não haja danos graves, a exposição contínua a longo prazo também levará a um aumento do stress oxidativo e a
uma diminuição da proliferação de células da pele. Como detectamos danos em ROS e DNA no mesmo momento após a
exposição à luz neste experimento, ainda é difícil determinar se o dano ao DNA é causado diretamente pela irradiação ou pelas
ROS geradas após a exposição à luz. Este ponto precisa ser verificado por mais experimentos no futuro.
É relatado que o ROS promove a migração celular [ 33 ]; no entanto, nossos resultados descobriram que a luz azul inibiu a
migração celular, o que se correlacionou com um estudo anterior [ 26 ]. As ROS também desempenham um papel importante nas
células, o aumento apropriado de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) promoverá a condução do sinal intracelular e, assim,
promoverá a migração celular [ 33 , 34 ]. No entanto, a produção excessiva de ROS produzirá toxicidade correspondente [ 35 ].
Assim, pensamos que o tipo de ERO regulado positivamente pela luz azul não foi o H 2 O 2 , e o nível de aumento também foi
superior ao necessário. Por esta razão, o aumento das ERO e o dano ao DNA pela irradiação da luz azul, causaram a parada do
ciclo celular, regulando ainda mais negativamente a capacidade de migração celular. Porém, ainda é necessário identificar o tipo
de produção de ERO induzida pela irradiação de luz azul (o H 2 O 2 promove a migração celular). Portanto, mais estudos são
necessários para investigar como a luz azul inibe a migração celular e determinar a relação entre a geração de ERO induzida pela
luz azul e a migração inibida.
A luz azul promove a síntese de melanina a 450 nm e 60 J/cm 2 [ 23 ], ou 415 nm e 50 J/cm 2 [ 24 ]. Nossos experimentos
verificaram o aumento nos níveis de melanina sob irradiações múltiplas de luz azul de comprimento de onda mais longo e baixa
densidade de energia (470 nm, 1 ou 2 J/cm 2 , 3 aplicações). O mRNA de mitf aumentou imediatamente após a irradiação com luz
azul, enquanto os fatores relacionados à síntese de melanina tirosinase , trp-1 e trp-2 aumentaram gradualmente e começaram a
aparecer 3 horas após a irradiação. Detectamos também os níveis proteicos de tirosinase, MITF, TRP-1 e TRP-2. Infelizmente,
embora tenhamos testado as amostras após 0, 3, 12, 24 e três vezes de irradiação, ainda não foi possível obter uma alteração
estável no teor de proteína. Suspeitamos que isto se deva à interrupção da função de síntese de proteínas celulares devido a
danos no DNA. Assim, é necessário realizar mais pesquisas para investigar o mecanismo e o alvo da luz azul que regula a síntese
de melanina.
Os danos intracelulares às ERO e ao DNA ocorreram imediatamente após a irradiação com luz azul, e não houve alteração
significativa após três dias de irradiação em nosso estudo anterior. Isto provou que a luz azul de baixa densidade de energia é
prejudicial às células. A principal função da melanina é absorver UV, inibindo assim o dano intracelular causado pela estimulação
UV [ 36–38 ] . A melanina intracelular aumentou significativamente após 3 dias de exposição à luz azul. Portanto, levantamos a
hipótese de que os níveis de ERO e os danos ao DNA não mudaram significativamente após 3 dias devido ao aumento da
melanina. No entanto, mais experiências são necessárias para determinar se a melanina tem um efeito protetor contra os danos
induzidos pela luz azul.
Por último, mas não menos importante, diferentes comprimentos de onda da luz visível têm diferentes penetrações na pele, e
também há uma grande diferença entre as células de uma placa e do corpo. Além disso, o ensaio de cicatrização de feridas em
ratos sugeriu anteriormente que tanto a irradiação de luz vermelha quanto a azul promoveram a cicatrização de feridas [ 18 ], o
que foi diferente de nossos resultados sobre migração. Para investigar a função da luz azul na pele viva e verificar a profundidade
com impacto da luz azul, é mais rigoroso in vivo . experimentos ainda são necessários.
Conclusões
A exposição múltipla à luz azul de comprimento de onda maior (470 nm) e baixa densidade de energia (1 ou 2 J/m 2 ) não induziu
apoptose celular, mas ainda inibiu a proliferação celular. Este efeito foi induzido pelo aumento da geração de ROS e danos ao
DNA. Mas ainda é necessário investigar o mecanismo como a luz azul induziu o dano ao DNA e a geração de ERO. A exposição
múltipla à luz azul com comprimento de onda mais longo e baixa densidade de energia também pode promover a síntese de
melanina. Estes resultados lembram-nos que mesmo a luz azul de baixa densidade energética tem uma fototoxicidade fraca, a
exposição repetida também causará danos celulares e regulará a função celular. É melhor prestar mais atenção ao tempo e
frequência de uso diário do dispositivo digital para nos proteger dos danos da luz azul.
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Luz de Diodo Emissor de Luz Azul Múltipla de Baixa Energia A Irradiação Promove A Síntese de Melanina e Induz Danos Ao DNA em Células de Melanoma B16F10 - PLOS UM

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Luz de Diodo Emissor de Luz Azul Múltipla de Baixa Energia A Irradiação Promove A Síntese de Melanina e Induz Danos Ao DNA em Células de Melanoma B16F10 - PLOS UM

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2/19/24, 8:36 PM Luz de diodo emissor de luz azul múltipla de baixa energia A irradiação promove a síntese de melanina e induz

ina e induz danos ao DN…

A irradiação de luz azul múltipla de diodo emissor de luz de

Publicado: 2 de fevereiro de 2023 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0281062

Editor: Yi Cao, Universidade Xiangtan, CHINA

Recebido: 7 de outubro de 2022; Aceito: 16 de janeiro de 2023; Publicado: 2 de fevereiro de 2023

Interesses conflitantes: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Ensaio de azul tripano e ensaio de proliferação

Ensaio de conteúdo de melanina

PCR em tempo real

Fig 1. Efeito da luz azul na viabilidade de células de melanoma B16F10.

A luz azul de baixa densidade de energia inibiu a migração celular

Fig 2. Efeito da luz azul na migração de células de melanoma B16F10.

Fig 4. Melanogênese melhorada pela luz azul em células de melanoma B16F10.

Imagens brutas S1.

Ver artigo PubMed/NCBI Google Scholar

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