Fotodermatologia, fotoimunologia e fotomedicina

ARTIGO ORIGINAL

Efeito inibidor do LED de 660 nm na síntese de melanina em

em vitro e na Vivo
Chang Taek Oh 1,2 *, Tae-Rin Kwon 1 *, Eun Ja Choi 1, Soon Re Kim 1, Joon Seok 1, Seog Kyun Mun 3,
Kwang Ho Yoo 4, Yeon Shik Choi 5, Sun Young Choi 1 e Beom Joon Kim 1,2

Departamento de Dermatologia,
RESUMO
1

Chung-Ang University College of Medicine,

Seul, Coréia.
2 Departamento de Medicina,
fundo
Doenças hiperpigmentares da pele, incluindo postin fl hiperpigmentação inflamatória, melasma,
Escola de Pós-Graduação, Chung-Ang

Universidade, Seul, Coréia. lentigos solares e condições como sardas são comuns. Os diodos emissores de luz (LEDs) são a
3 Departamento de última categoria de fototerapia não-térmica e não invasiva a ser considerada no tratamento de
Otorrinolaringologia, Chung-Ang distúrbios da pigmentação da pele.
University College of Medicine, Seul,
Coréia.
4 Departamento de Dermatologia,
Objetivo
Faculdade de Medicina, Universidade
O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do LED de 660 nm na inibição da
Católica Kwandong,
melanogênese. Nós investigamos se um LED de 660 nm afetou a síntese de melanina em em
Hospital Internacional de St. Mary, Incheon,
Coréia.
vitro e na Vivo modelos e exploramos os mecanismos envolvidos.
5 Convergência de TI médica

Centro de Pesquisa, Coréia

Instituto de Tecnologia Eletrônica, Métodos
Gyeonggi-do, Coreia.
O efeito inibitório do LED de 660 nm na síntese de melanina foi avaliado em células B16F10 e
camundongos sem pêlo possuindo melanina HRM-2 foram usados para avaliar os efeitos
Palavras-chave:
antimelanogênicos do LED de 660 nm.
Comprimento de onda de 660 nm; Célula B16F10;

HRM-2; diodo emissor de luz;

melanogênese Resultados

Curiosamente, o LED de 660 nm inibiu a atividade da tirosinase induzida por hormônio estimulador de
Correspondência:
alfa-melanócitos em células B16F10. Também descobrimos que o LED de 660 nm diminuiu a
Prof. Beom Joon Kim, MD, Ph.D. e Prof. Sun Young
expressão de MITF e tirosinase e induziu a ativação de ERK. Estes fi Os achados sugerem que os
Choi, MD, Ph.D., Departamento de
efeitos despigmentantes do LED de 660 nm resultam da regulação negativa de MITF e da expressão
Dermatologia, Chung-Ang de tirosinase devido ao aumento da atividade ERK. O LED de 660 nm reduziu a melanogênese
Hospital Universitário, 102 induzida por UVB na pele de HRM-2 por meio da regulação negativa da tirosinase e MITF.
Heukseokro, Dongjak-gu, Seul
156-755, Coreia.
Tel: +82 2 6299 1525 Fax: +82
2 811 1159
Conclusão
e-mails: beomjoon@unitel.co.kr
e sun02ya@naver.com Estes fi as descobertas sugerem que o LED de 660 nm é uma estratégia de despigmentação potencial.

Aceito para publicação:

21 de setembro de 2016 Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57

Conflitos de interesse:
Nenhum declarado.

* Esses autores igualmente

contribuíram como primeiros autores.

ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd doi: 10.1111 / 49
phpp.12276
Oh et al.
Os comprimentos de onda ultravioleta (UV) da luz solar são divididos em
três grupos: UVC (200 - 280 nm), UVB (280 -
320 nm), e UVA (320 - 400 nm) (1). UV é um importante fator ambiental
que afeta a melanogênese, a atividade essencial dos melanócitos na
pele humana. A exposição à luz ultravioleta pode resultar em
distúrbios hiperpigmentários, como melasma, lentigo e condições
como sardas (2). A melanina é sintetizada pelo melanócito na camada
basal da epiderme e é estimulada por vários fatores, incluindo o
hormônio alfa-melanócito estimulador ( uma- MSH), UV e agentes
elevadores de monofosfato de adenosina cíclico incluindo
isobutilmetilxantina, forscolina e glicirrizina (3 - 6). Existem três enzimas
melanogênicas principais, tirosinase, proteína relacionada à
tirosinase-1 (TRP-1) e proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2) (7).
A ativação ou regulação positiva de enzimas melanogênicas aumenta
a melanogênese e a pigmentação.
Nos últimos anos, a fototerapia tem sido usada para tratar uma ampla gama de
condições dermatológicas. A fototerapia permite a seleção de um comprimento de
onda adequado a partir de uma variedade de fontes de energia luminosa, oferecendo
um efeito personalizável fi-
terapia eficiente e valiosa para uma ampla gama de condições médicas
(8, 9). Com o reconhecimento do benefício potencial fi ts de
fotobioestimulação (10) e o desenvolvimento e re fi mentos de diodos
emissores de luz (LEDs), os lasers agora são usados para tratar várias
condições médicas (11). A fototerapia com dispositivos médicos de LED
tem sido estudada durante a última década, recentemente fornecendo
resultados de fotobiomodulação baseados em evidências (12). Uma série
de estudos clínicos forneceram evidências do efeito fi cácia da fototerapia
LED em condições dermatológicas usando uma variedade de
comprimentos de onda LED (13). O processo ideal de fototerapia deve
limitar o dano térmico ou fotodano. Os efeitos úteis da fototerapia LED
também foram relatados para aplicações como cicatrização de feridas,
anti-in fl ammação, fotorejuvenescimento, prevenção de queimaduras
solares, resolução da acne vulgar (14 - 17). Curiosamente, a luz LED de
660 nm foi relatada para reparar condições de pele induzidas por UV,
como em fl inflamação e fotoenvelhecimento, sugerindo que os
mecanismos de ação do LED de 660 nm e da radiação UV são diferentes
(18). Entretanto, o efeito inibitório do LED de 660 nm na melanogênese já
foi estabelecido na literatura (19).
Portanto, examinamos se o LED de 660 nm afetou a melanogênese.
A fim de entender o mecanismo e avaliar o benefício fi ts de fototerapia
LED de 660 nm, avaliamos uma- Melanogênese induzida por MSH em
células B16F10. Também avaliamos um na Vivo modelo de
hiperpigmentação induzida por UVB usando camundongos sem pêlo
possuindo melanina.
50
MATERIAIS E MÉTODOS
Fontes de luz e irradiação
O dispositivo LED usado (Korea Electronics Technology Institute, Gyeonggi-do,
Korea) produziu luz em um comprimento de onda de 660 nm. Para minimizar a
geração de calor, as matrizes de LED foram equipadas com sistemas elétricos
de resfriamento na parte traseira das lâmpadas dispostas. Todas as culturas de
células foram irradiadas com um LED de 660 nm (7,8 mJ / cm 2). Para evitar a
absorção pelo meio de cultura colorido, as células foram lavadas duas vezes
com solução salina tamponada com fosfato e irradiadas 5 cm do dispositivo de
LED (20).
Reagentes
uma- MSH, 3,4-di-hidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) e PD98059 foram
adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). O Cell
Counting Kit-8 (CCK-8) foi adquirido na Dojindo Molecular
Technologies, Inc. (Kumamoto, Japão). Dulbecco ' s modi fi ed Eagle ' meio
s (DMEM), tripsina - ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), DPBS
e penicilina / estreptomicina foram adquiridos a Welgene
Biopharmaceuticals (Daegu, Coréia). O soro fetal bovino (FBS) foi
adquirido da Life Technologies Co. (Gibco, Life Technologies, NY,
EUA).
Anticorpos speci fi c para fosfo-ERK1 / 2
(Thr202 / Tyr204, # 9101), ERK1 / 2 (# 9102), fosfo-p38 MAPK
(Thr180 / Tyr182, # 4511), p38 MAPK (# 9212), fosfo-JNK (Thr183 /
Tyr185, # 9251), JNK (# 9252), e b- actina (# 4967) foram
adquiridos na Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA).
Especificação de anticorpos fi c para tirosinase (M-19, sc-7834),
TRP-1 (H-90, sc-25543) e TRP-2 (H-150, sc-25544) foram
adquiridos de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA,
EUA). MITF Ab-1 (C5, MS-771-P0) foi adquirido da Thermo Scienti fi
c (Fremont, CA, EUA). Os anticorpos secundários para IgG
anti-cabra (PI-9500), IgG anti-rato (PI-2000) e IgG anti-coelho
(PI-1000) foram adquiridos na Vector Laboratories (Burlingame,
CA, EUA).
Cultura de células
As células B16F10 (CRL-6475) foram adquiridas da American Type
Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células foram cultivadas
em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina /
estreptomicina (Welgene, Daegu, Coreia) e incubadas a 37ºC ° C em
um umidi fi ed
atmosfera de 5% CO 2
Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57
ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd

Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade das células irradiadas foi estabelecida usando CCK-8,
conforme explicado pelo fabricante. As células foram irradiadas com LED
de 660 nm em diferentes valores de intensidade. Após 24 h, o meio
contendo células irradiadas foi substituído por meio contendo solução de
CCK-8 a 10%. As células foram então incubadas a 37 ° C por 30 min, e a
absorbância foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro
(VersaMax; Molecular Devices, CA, EUA).
Medição do teor de melanina
As células foram irradiadas com LED de 660 nm a 2,5 - 10 J / cm 2 e então
incubado em DMEM sem vermelho de fenol para FBS a 10% por 72 h.
A densidade óptica de cada meio sobrenadante foi medida a 405 nm
usando um espectrofotômetro.
Ensaio de atividade de tirosinase
A atividade da tirosinase em células B16F10 foi determinada usando um
método da literatura com ligeiros modi fi cátion (21). As células foram irradiadas
com LED de 660 nm a 2,5 - 10 J / cm 2
e então incubado em DMEM para FBS a 10% por 72 h. As células
foram lisadas em 150 eu 1 de tampão fosfato (0,1 M), pH 6,8, contendo
1% de Triton X-100. O extrato celular foi claro fi ed por centrifugação a
3000 g durante 10 min. Depois do quanti fi cátion do nível de proteína e
o ajuste da concentração usando tampão de lise, cada extrato (180 eu l)
foi adicionado a uma placa de 96 poços, e o
o ensaio enzimático foi iniciado pela adição de 20 eu eu de EU-
Solução DOPA em 37 ° C. A absorbância a 475 nm e
37 ° C foi lido a cada 10 minutos por pelo menos 30 minutos usando um
espectrofotômetro.
Análise de Western blot
Os extratos de proteína foram lisados usando tampão RIPA frio (50 mM
Tris - HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% NP40,
0,1% SDS, 0,5% DOC, 1 mM PMSF, 25 mM MgCl2 e coquetel de inibidor
de fosfatase). A quantidade de proteína nos extratos celulares foi quanti fi ed
usando um kit BCA Protein Assay. Quantidades iguais de proteína por
poço foram resolvidas em 10% SDS-PAGE e manchadas em membranas
de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA), que foram então bloqueadas com
5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo
0,5% de Tween-20 ( Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA). A membrana
foi sondada com especi fi c anticorpos e incubados com anticorpos
secundários conjugados com HRP. Os anticorpos foram detectados
usando
Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57
ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
Efeito de 660 nm na melanogênese
reagentes de quimioluminescência melhorada (Amersham Pharmacia,
Piscataway, UK).
Imunocitoquímica
As células eram fi xed com paraformaldeído 4% por 15 min em
temperatura ambiente. As células foram tratadas com
0,01% de Triton X-100 em PBS por 15 min em temperatura ambiente e então
bloqueado com 2% de albumina de soro bovino em PBS por 60 min em
temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas durante a noite com
anticorpos de tirosinase (ab180753, Abcam) a 4 ° C. As lâminas foram
incubadas com IgG de cabra anti-coelho conjugado com FITC (1: 1000,
NB730-F, Novus Biologicals, CO, EUA) e montadas usando DAPI (Golden
Bridge International, Inc., WA, EUA).
Hiperpigmentação induzida por UVB em HRM-2
Camundongos sem pêlos possuindo melanina HRM-2 machos de seis
semanas de idade (total = 24) foram obtidos da Hoshino Laboratory Animals
(Saitama, Japão) e alojados em uma sala com ar-condicionado mantida a
24 ° C 2°Ce
55% 15% de umidade com luz de 12 horas - ciclo escuro. Todos os
procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as
diretrizes do Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais da
Universidade Chung-Ang na Coréia (Número IACUC: 14-0054). Os
camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos ( n = 6 por
grupo. Os camundongos foram anestesiados com Zoletil 50 (50 mg / kg) e
xilazina (10 mg / kg). A pele dorsal de cada camundongo foi irradiada com
LED de 660 nm antes da exposição a UVB (BIO-SPECTRA; Vilber
Lourmat, França). O cronograma experimental é detalhado na Fig. 5a. A
cor de cada local da pele foi medida usando um espectrofotômetro (CR10;
Konica Minolta Sensing Inc., Osaka, Japão).
Análise histopatológica
Amostras de pele dorsal foram fi xed em 4% paraformaldeído,
embutido em paraf fi n, e dividido em 5- eu seções m. As seções de pele
foram coradas com H&E e Fontana - Masson para melanina. Seções
de pele adicionais foram coradas para marcadores
imuno-histoquímicos usando anticorpos monoclonais contra tirosinase
(1: 500, ab180753, Abcam), MITF (1: 200, NBP1-61363, Novus) e
Melan-A (1: 200, NBP1-30151, Novus )
Análise estatística
Todas as análises de dados foram realizadas pelo menos três vezes, e os resultados são
expressos como média desvio padrão.
51
Oh et al.

Os dados foram analisados por meio de ANOVA de uma via (software síntese. O conteúdo de melanina era significativo fi reduzido de forma
SPSS, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Valores de dose-dependente por irradiação LED de 660 nm em células B16F10 (Fig. 1b).
P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), e P < 0,001 (***) foram considerados signi fi visivelmente
Além disso, o LED de 660 nm na mesma dose também diminuiu a atividade da
diferente. tirosinase em células B16F10 (Fig. 1c).

RESULTADOS

Efeito do LED de 660 nm nos níveis de expressão de proteínas

Efeito do LED de 660 nm na melanogênese das células B16F10 relacionadas à melanogênese

Para determinar se o efeito da luz LED de 660 nm estava relacionado

Para investigar se o LED de 660 nm tem viabilidade celular nas células,
irradiamos uma faixa de LED de 0 - 20 J / cm 2 Conforme mostrado na Fig. 1a, o
tratamento com LED de 660 nm reduziu a viabilidade celular para menos de
20% ( P = 0,001929) a 15 J / cm 2 Para determinar se o LED de 660 nm inibiu a
síntese de melanina, medimos o conteúdo de melanina das células B16F10.
Usamos PTU como controle positivo nesses experimentos porque PTU tem
efeitos inibitórios conhecidos sobre a melanina
à melanogênese, avaliamos a expressão nos níveis de tirosinase,
TRP-1, TRP-2 e proteína MITF em um experimento de um dia 24 - 72 h
após as células serem irradiadas com LED de 660 nm a 10 J / cm 2 e
antes da estimulação na presença de uma- MSH (Fig. 2a).
Além disso, o efeito do LED de 660 nm no nível de expressão da
tirosinase foi avaliado por imunocitoquímica (Fig. 2b). Os
resultados mostraram que o nível de

Figura 1. Efeito do diodo emissor de luz (LED) de 660 nm na melanogênese das células B16F10. (a) A viabilidade celular foi então medida usando ensaios de CCK-8. Cada resultado
representa a média SD de experiências em triplicado. (b) e (c) As células foram irradiadas com 660 nm
LED em 2,5 - 10 J / cm 2 na presença de uma- hormônio estimulador de melanócitos ( uma- MSH: 1 eu M) por 72 h. 50 eu M feniltioureia (PTU) foi usado como controle positivo. O conteúdo de
melanina (b) e a atividade da tirosinase (c) foram medidos conforme descrito nos Materiais e Métodos. Cada resultado representa a média
SD de experiências em triplicado. ** P < 0,01, *** P < 0,005 em comparação com uma- Tratado com MSH

controles (bec).

52 Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57

ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd

Figura 2. Efeito do diodo emissor de luz de 660 nm na expressão de proteínas relacionadas à síntese de melanina. (a) Os lisados de células inteiras foram analisados por análise de Western blot
com anticorpos contra tirosinase, proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP-1), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP-2) e fator de transcrição associado à microftalmia (MITF ) Cargas de proteínas
iguais foram verificadas usando b- anticorpos actina. (b) A tirosinase foi avaliada por coloração de imuno fl uorescência usando anticorpos específicos para tirosinase (verde). Correspondente
4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) coloração nuclear (azul) e imagens mescladas são mostradas. A fluorescência foi detectada sob um microscópio de fl uorescência. Os espécimes foram fotografados
usando o software DP Controller ( 9 Aumento de 400).
A expressão da tirosinase nas células foi diminuída por LED de 660 nm após
72 h na presença de uma- MSH.
Efeito do LED de 660 nm na fosforilação ERK em células
B16F10
Para elucidar os mecanismos subjacentes ao efeito inibitório do LED de
660 nm na melanogênese, caracterizamos as mudanças nos sinais
relacionados à melanogênese usando a análise de Western blot em um
experimento de curso de tempo. Uma vez que foi relatado que a
fosforilação de ERK desencadeia a degradação de MITF, examinamos
se LED de 660 nm em fl ativação de ERK controlada. Como mostrado na
Fig. 3a, a fosforilação de ERK em células B16F10 foi induzida por LED
de 660 nm em 120 min após a irradiação. Porque a fosforilação de ERK
foi relatada para diminuir a síntese de melanina, podemos fi verificou se as
vias de sinalização ERK fosforiladas induzidas por LED de 660 nm
estavam envolvidas na síntese de melanina celular em células B16F10
irradiadas com LED de 660 nm por 30 min na presença ou ausência de
PD98059 (inibidor de ERK). Como mostrado na Fig. 3b, o conteúdo de
melanina em células B16F10 co-cultivadas com uma- MSH e PD98059
foram maiores do que aqueles em células cultivadas com
uma- MSH sozinho. Além disso, esses efeitos sinérgicos de
uma- MSH e PD98059 no conteúdo de melanina foram
compensados por irradiação LED de 660 nm. Avaliamos se
PD98059 inibe a fosforilação da via ERK em células B16F10 e
descobrimos que PD98059 bloqueia a fosforilação ERK (Fig. 3c).
Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57
ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
Efeito de 660 nm na melanogênese
Efeito do LED de 660 nm na melanogênese induzida
por UVB em HRM-2
Os efeitos do LED de 660 nm na melanogênese foram avaliados em
camundongos HRM-2. A cor dorsal da pele de camundongos HRM-2 foi
fotografada usando uma câmera digital (5200D; Canon Inc., Tóquio, Japão).
Esses resultados mostraram que o LED de 660 nm é eficaz na redução da
síntese de melanina em uma hiperpigmentação induzida por UVB (Fig. 4b). Os
camundongos foram irradiados com ou sem LED de 660 nm e a irradiação UVB
repetida levou à melanogênese. A cor das áreas dorsais da pele foi medida
usando um espectrofotômetro CR10. Observamos um aumento dependente da
dose em EU- valor de camundongos irradiados com LED de 660 nm em
comparação com o grupo irradiado com UVB. Total EU- as mudanças de valor
foram calculadas subtraindo fi primeiro dia EU- valores do último dia EU- valores.
Os grupos irradiados com LED de 660 nm mostraram um signi fi efeito de inibição
de escala em comparação ao grupo irradiado por UV (Fig. 4c).
Efeito do LED de 660 nm na análise histopatológica
induzida por UVB em HRM-2
Os tecidos dorsais corados com H&E foram obtidos após 17 dias, e o estado
da epiderme foi observado em microscopia óptica. O LED de 660 nm teve
efeitos inibitórios nas condições epidérmicas e dérmicas induzidas por UVB
(Fig. 5a) e signi fi espessura da epiderme diminuída visivelmente em
comparação com o grupo irradiado com UVB (Fig. 5b). Estes resultados
indicam que o LED de 660 nm protege os induzidos por UVB
53
Oh et al.

Fig. 3. Efeito do diodo emissor de luz (LED) de 660 nm na fosforilação ERK em células B16F10. (a) Análise de Western blot usando anticorpos contra fosfo-específico ERK (p-ERK), fosfo-específico
JNK (p-JNK) e fosfo-específico p38 (p-p38). A carga de proteína igual foi verificada usando b- actina, anticorpos ERK, JNK e p38 independentes de fosforilação. (b) As células foram pré-tratadas com
20 eu M de PD98059 por 30 min e depois irradiado com LED de 660 nm a 10 J / cm2 e cultivado por 72 h. 50 eu M feniltioureia (PTU) foi usado como controle positivo. O conteúdo de melanina foi
medido conforme descrito nos Materiais e Métodos. Cada resultado representa a média

SD de experiências em triplicado. *** P < 0,005 em comparação com o grupo com radiação LED de 660 nm. (c) Célula inteira
lisados foram preparados e submetidos à análise de Western blot usando anticorpos contra tirosinase e ERK fosfo-específico. Cargas de proteínas iguais foram verificadas usando b- anticorpos
actina.

hiperceratose. Para visualizar o conteúdo de melanina da camada basal da
epiderme, o tecido dorsal da pele foi corado com Fontana - Masson manchado
agentes químicos e biológicos foram desenvolvidos. Apenas alguns desses
e observado. Como mostrado na Fig. 5c, grupos de LED de 660 nm tiveram fi diminuição
da escala e dependente da dose em comparação com o grupo com radiação
UVB. Além disso, realizamos imunohistoquímica para con fi rm as alterações
de expressão na expressão da proteína do tecido dorsal da pele usando os
marcadores de melanogênese S100, Melan-A, tirosinase e anticorpos MITF.
Grupo com luz irradiada por LED de 660 nm demonstrou signi fi diminuição da
escala e dependente da dose na expressão da proteína em comparação com
o grupo irradiado com UVB.
lentigos senis e doenças da pele como sardas após exposição aos raios
ultravioleta (23). Um grande número de dispositivos médicos, lasers e
esforços demonstraram efeito terapêutico fi cácia e utilidade clínica,
principalmente devido a efeitos colaterais indesejados e citotoxicidade.
Portanto, é necessário compreender melhor o mecanismo fundamental por
trás da pigmentação e desenvolver dispositivos e agentes de tratamento
mais seguros e eficazes.
Examinamos se o LED de 660 nm representa um tratamento de
despigmentação eficaz. Nós con fi não demonstrou citotoxicidade em uma
faixa de intensidade de 2,5 a 10 J / cm 2

(Fig. 1a). Além disso, o conteúdo de melanina era significativo fi-

DISCUSSÃO
A melanogênese é o principal mecanismo protetor contra lesões
relacionadas ao sol na pele humana e é responsável pela cor da pele
(22). A síntese incomum de melanina em melanócitos é responsável
por doenças pigmentadas da pele, como hiperpigmentação,
melasma e
diminuiu significativamente em uma dose dependente com LED de 660 nm
de 5 a 10 J / cm 2 ( Fig. 1b). Esses resultados sugerem que o LED de 660 nm
inibe a síntese de melanina. Para uma melhor compreensão do efeito
inibitório do LED de 660 nm na tirosinase, con fi rmed que a tirosinase,
TPR-1, TPR-2 e expressão da proteína MITF foram diminuídas por LED de
660 nm de uma maneira dependente do dia (Fig. 2a) e

54 Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57

ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
 Efeito de 660 nm na melanogênese

Fig. 4. Efeito de diodos emissores de luz (LED) de 660 nm na hiperpigmentação induzida por UVB em HRM-2. (a) Projeto de cronograma experimental. Os camundongos HRM-2 foram irradiados
com luz LED de 660 nm (10 e 20 J / cm 2) e exposto a UVB (150 mJ / cm 2) nos horários indicados (seta). (b) Fotografias representativas que mostram os efeitos de iluminação da luz LED de 660 nm
na melanogênese induzida por UVB. Todas as fotos são do mesmo grupo. (c) Para análise estatística, mudança em EU- o valor de cada animal foi calculado como valores médios da pele dorsal de
camundongos HRM-2. o D EU- valor antes e 17 dias após a irradiação com LED de 660 nm e UVB foi medido usando um cromômetro CR-10. Grupos de seis animais foram usados neste
experimento. Cada resultado representa a média
SD de
D EU- valor. *** P < 0,005 em comparação com o grupo irradiado com UVB.

A despigmentação induzida por LED de 660 nm foi associada à
diminuição da atividade da tirosinase (Fig. 1c). Além disso, o efeito do
marcador de proteólise através da via do proteassoma dependente de
LED de 660 nm na expressão da tirosinase foi con fi rmed por imuno fl uorescência
(Fig. 2b). Esses resultados indicam que o LED de 660 nm inibe os níveis
de expressão da tirosinase, TRP-1, TRP-2 e MITF, que desempenham
papéis regulatórios na melanogênese na expressão translacional e
transcricional.
Para investigar o mecanismo subjacente ao efeito de
despigmentação do LED de 660 nm, as mudanças nas vias de
transdução relacionadas à melanogênese induzidas por LED de 660
nm foram con fi rmed por análise Western blot em um experimento
timecourse (Fig. 3a). Foi relatado que ERK é um signi fi regulador da
melanogênese porque o ERK fosforilado induz a fosforilação e
degradação do MITF e, portanto, reduz a síntese de melanina (24).
Estudos anteriores demonstraram que a ERK fosforilada está
relacionada à melanogênese induzida por cAMP (25). No entanto,
estudos anteriores também con fi rmed que mutantes constitutivos de
Ras e MEK suprimem tirosinase
transcrição (26). ERK fosforilado é conhecido por fosforilar o MITF na
serina 409. Além disso, o MITF fosforilado foi relatado como um
ubiquitina (27). Nós avaliamos um específico fi c inibidor ERK,
PD98059 e con fi verificou-se que a despigmentação induzida por LED
de 660 nm foi restaurada por tratamento com PD98059 (Fig. 3b).
Também mostramos que o LED de 660 nm fosforilou ERK e inibiu a
expressão da proteína tirosinase. Até onde sabemos, este é o fi primeira
demonstração da fosforilação de ERK por LED de 660 nm. Para
examinar a relação entre a fosforilação ERK e a regulação negativa
da tirosinase, pré-tratamos as células com PD98059 antes da
irradiação LED de 660 nm, reavaliamos o nível de expressão da
proteína ERK de fosforilação e
fi verificou que a fosforilação de ERK inibiu a melanogênese (Fig. 3c).
Os efeitos inibitórios do LED de 660 nm na melanogênese também
foram avaliados usando um modelo de camundongo HRM-2, que é o
modelo animal típico neste tipo de estudo.

Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57 55

ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
Oh et al.

Fig. 5. Efeito de diodos emissores de luz (LED) de 660 nm na histopatologia induzida por UVB em HRM-2. (a) Morfologia do tecido do tecido da pele induzida por UVB manchada com
hematoxilina - eosina (H&E). (b) A espessura epidérmica da pele dorsal foi medida sob um microscópio óptico. Cada resultado representa a média
SD da espessura da epiderme ( n = 6). *** P < 0,005 em comparação com a radiação UVB
grupo. (c) A melanina é tingida de preto com coloração de Fontana e Masson (FM). As seções coradas imunohistoquimicamente com anticorpos S100, Melan-A, tirosinase e MITF são mostradas.
Os cortes foram corados com diaminobenzidina (DAB) e contracoloração com hematoxilina para visualização dos núcleos. Os pontos marrons significam células coradas positivamente. As
imagens são exemplos representativos de cada grupo ( 9 Aumento de 400).

(28). Neste modelo, o LED de 660 nm mostrou um sinal fi Efeito inibidor de
escala na melanogênese induzida por UVB (Fig. 4b, c). Esses resultados
sugerem que o efeito despigmentante do LED de 660 nm na melanogênese
induzida por UVB atua na prevenção da síntese de melanina em
melanócitos ativos. Também avaliamos a pele dorsal de camundongos
HRM2 usando H&E e Fontana - Colorações de Masson para caracterizar a
condição da pele e o conteúdo de melanina. Conforme mostrado na Fig. 5,
podemos fi rmed que 660 nm LED signi fi-
diminuição da espessura da epiderme e redução do conteúdo de
melanina de maneira dose-dependente. Para melhor compreender o
mecanismo de despigmentação, investigamos os níveis de expressão
de S100, Melan-A, tirosinase e MITF usando um ensaio de
imunohistoquímica. Tirosinase e MITF regulam signi fi Não há efeitos
biológicos na pele, incluindo pigmentação, formação de dendritos e
proliferação de melanócitos. Além disso, S100 e Melan-A
demonstram estado de pigmentação na epiderme ou camada basal
da epiderme (29). O 660 nm
O LED diminuiu os níveis de proteína de S100, Melan-A, tirosinase e
MITF. Estes resultados demonstram o efeito inibitório do LED de 660
nm na hiperpigmentação induzida por UVB.
Em conclusão, o LED de 660 nm pode provar ser uma terapia útil para o
tratamento de pacientes com hiperpigmentação. No entanto, outros estudos,
incluindo estudos clínicos e ef fi avaliações de ciência e segurança, são
necessárias para con fi rm esses efeitos por causa de nossos resultados
realizados em células de melanoma B16F10 não humanas. Portanto, devemos
realizar um estudo sobre o mecanismo em humanos.
RECONHECIMENTOS
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Infraestrutura para Novas Indústrias
de Crescimento (10044186, Desenvolvimento de Tecnologia de Dispositivos de
Beleza Inteligentes e Estabelecimento de Centro de Apoio à Comercialização)
financiado pelo Ministério do Comércio, Indústria e Energia (MI, Coréia).

56 Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57

ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd

REFERÊNCIAS
1. Nole G, Johnson AW. Uma análise da exposição
cumulativa à radiação ultravioleta solar e do
benefício fi ts de proteção solar diária. Dermatol
Ther
2004; 17 ( Supl. 1): 57 - 62
2. Ouvindo VJ. Determinação das vias de síntese da
melanina. J Invest Dermatol
2011; 131: E8 - E11.
3. Chakraborty A, Slominski A, Ermak G, Hwang J,
Pawelek J. Ultraviolet B e hormônio estimulador
de melanócitos (MSH)
estimular a produção de mRNA para receptores alfa MSH
e peptídeos derivados de pró-opiomelanocortinder em
células de melanoma de camundongo e queratinócitos
transformados.
J Invest Dermatol 1995; 105: 655 - 659.
4. Chakraborty AK, Funasaka Y, Slominski A et al. Receptores
de luz ultravioleta e MSH.
Ann NY Acad Sci 1999; 885: 100 - 116
5. Kadekaro AL, Kanto H, Kavanagh R, Abdel-Malek Z.
Signi fi influência do receptor de melanocortina 1 na
regulação da pigmentação, proliferação e
sobrevivência de melanócitos humanos. Ann NY
Acad Sci
2003; 994: 359 - 365
6. Oh CT, Lee D, Koo K et al. Superóxido
dismutase 1 inibe o hormônio estimulador dos
melanócitos alfa e a melanogênese induzida por
ultravioleta na pele murina.
Ann Dermatol 2014; 26: 681 - 687.
7. Hirobe T. Papel de fatores derivados de
queratinócitos envolvidos na regulação da
proliferação e diferenciação de mamíferos
epidérmico melanócitos.
Pigment Cell Res 2005; 18: 2 - 12
8. Opel DR, Hagstrom E, Pace AK et al.
Díodos emissores de luz: uma breve revisão e
experiência clínica. J Clin Aesthet
Dermatol 2015; 8: 36 - 44
9. Lim HW, Silpa-archa N, Amadi U, Menter A, Van
Voorhees AS, Lebwohl
M. Fototerapia em dermatologia: um chamado à
ação. J Am Acad Dermatol 2015;
72: 1078 - 1080.
10. Nadur-Andrade N, Barbosa AM, Carlos FP, Lima
CJ, Cogo JC, Zamuner SR. Efeitos da
fotobioestimulação no edema e hemorragia
induzida pelo veneno de Bothrops moojeni. Lasers
Med Sci 2012;
27: 65 - 70
Photodermatol Photoimmunol Photomed 2017; 33: 49-57
ª 2016 John Wiley & Sons A / S. Publicado por John Wiley & Sons Ltd
11. Bucci J, Goldberg D. Passado, presente e futuro: lasers
vasculares / dispositivos de luz.
J Cosmet Laser Ther 2006; 8: 149 - 153
12. Wunsch A, Matuschka K. Um ensaio controlado para
determinar o efeito fi cácia do tratamento de luz vermelha
e infravermelha na satisfação do paciente, redução de fi novas 21. Kim JH, Baek SH, Kim DH et al.
linhas,
rugas, pele rugosidade, e haginina A e sua aplicação a na Vivo
aumento da densidade do colágeno intradérmico.
Photomed Laser Surg 2014; 32: 93 - 100
13. Tsibadze A, Chikvaidze E, Katsitadze A, Kvachadze
I, Tskhvediani N, Chikviladze
A. Luz visível e pele humana (revisão).
Georgian Med News 2015; 246: 46 - 53
14. de Vasconcelos Catao MH, Nonaka CF, de
Albuquerque RL Jr, Bento PM, de Oliveira Costa R.
Efeitos do laser vermelho, infravermelho, terapia
fotodinâmica e LED verde no processo de
cicatrização do terceiro grau
queimaduras: clínico e - 312.
estudo histológico em ratos. Lasers Med Sci
2015; 30: 421 - 428.
15. Kim CH, Cheong KA, Lee AY. Fototerapia de diodo
emissor de luz de 850 nm mais
Dose baixa tacrolimus (FK-506) Como
terapia de combinação no tratamento de atópico
induzido por dermatophagoides farinae
lesões cutâneas tipo dermatite em camundongos NC / Nga. J
Dermatol Sci 2013; 72: 142 - 148
16. Ko DY, Jeon SY, Kim KH, Song KH. Érbio fracionário:
terapia fotodinâmica assistida por laser YAG para
ceratoses actínicas faciais: um estudo prospectivo,
comparativo e randomizado. J Eur Acad Dermatol
Venereol 2014; 28: 1529 - 1539.
17. Lambrecht P, Vandeplas G, Van Slycke S, Smet PF,
Brusselaers N, Vermeersch H. Reação fototóxica
após cirurgia de paratireóide: relato de caso e
revisão da literatura. Acta Clin Belg 2012; 67: 438 - 441.
18. Barolet D, Roberge CJ, Auger FA, Boucher A, Germain L.
Regulação do metabolismo do colágeno da pele em
vitro usando uma fonte de luz LED pulsada de 660 nm:
correlação clínica com um estudo cego simples. J
Invest Dermatol 2009; 129: 2751 - 2759.
19. Barolet D, Boucher A. Fotoprevenção de LED:
resposta MED reduzida após múltiplas
exposições de LED. Lasers Surg Med 2008; 40: 106
- 112
Efeito de 660 nm na melanogênese
20. Babilas P, Kohl E, Maisch T et al. No
vitro e na Vivo comparação de duas fontes de
luz diferentes para terapia fotodinâmica tópica. Br
J Dermatol
2006; 154: 712 - 718.
Regulação negativa da síntese de melanina pela
modelo de iluminação. J Invest Dermatol
2008; 128: 1227 - 1235.
22. Riley PA. Melaninas e melanogênese.
Pathobiol Annu 1980; 10: 223 - 251.
23. Holzle E. Lesões pigmentadas como um sinal de
fotodano. Br J Dermatol 1992; 127
(Suplemento 41): 48 - 50
24. Wu M, Hemesath TJ, Takemoto CM
et al. O c-Kit desencadeia fosforilação dupla, que
acopla a ativação e a degradação do fator
melanócito essencial Mi. Genes Dev 2000; 14: 301
25. Englaro W, Rezzonico R, DurandClement M,
Lallemand D, Ortonne JP, Ballotti R. Via da
proteína quinase ativada por mitogênio e AP-1 são
ativados durante a melanogênese induzida por
cAMP em células de melanoma B-16. J Biol Chem 1995;
270: 24315 - 24320.
26. Kahn V. Efeito do ácido kójico na oxidação de
DL-DOPA, norepinefrina e dopamina pela
tirosinase de cogumelo.
Pigment Cell Res 1995; 8: 234 - 240
27. Xu W, Gong L, Haddad MM et al.
Regulação da microftalmia associada
Níveis de proteína do fator de transcrição MITF por
associação com a enzima conjugadora ubiquitina
hUBC9. Exp Cell Res 2000; 255: 135 - 143
28. Yun CY, You ST, Kim JH et al. p21-
a quinase 4 ativada regula criticamente a
melanogênese via ativação do CREB / MITF
e beta-catenina / MITF
caminhos. J Invest Dermatol 2015; 135:
1385 - 1394.
29. Viray H, Bradley WR, Schalper KA, Rimm
DL, Gould Rothberg ESTAR.
Distribuições marginais e conjuntas de S100,
HMB-45 e Melan-A em uma grande série de
melanomas cutâneos. Arch Pathol Lab Med 2013; 137:
1063 - 1073.
57