Artigo: Palavras-Chave

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Reestruturação do microbioma da rizosfera do pepino induzida

por Trichoderma e o efeito de uma comunidade
microbiana sintética entre reinos sobre
Doença da murcha de Fusarium e crescimento em pepino
Tong Liu ( ÿ liutongamy@sina.com )
Universidade de Hainan
Manman Zhang
Rui Wang
Raja Asad Ali Khan

Xin Zhan
Sen Ren
Haonan Jiang
Yinggu Wu
Fanxing Yang
Xiaoli Yu
Artigo
Palavras-chave:
Data de postagem: 27 de outubro de 2023
DOI: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3442164/v1
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Abstrato
Trichoderma asperellum O FJ035 foi introduzido na complexa comunidade microbiana do solo, que incluía patógenos,
presentes no solo de um sistema contínuo de plantio de pepino, para avaliar o impacto da
Tricoderma alteração sobre a composição da comunidade microbiana e crescimento e incidência de
Fusarium a doença da murcha Fusarium oxysporum SCCFo1. Os resultados indicaram que Trichoderma-
causada por alterações induzidas na comunidade microbiana do solo promoveu significativamente o crescimento e aumentou
a resistência a doenças. Além disso, TB11, uma comunidade microbiana sintética entre reinos que consiste em
Tricoderma e foram construídas 30 cepas de 11 gêneros bacterianos. Tratamento de inoculados com SCCFo1
plantas de pepino com TB11 resultaram em uma redução de 70,0% na doença da murcha de Fusarium e em um aumento de
64,59% no peso fresco da planta em comparação com plantas controle. A comunidade sintética TB11 foi então simplificada
para um consórcio TB5 composto Tricoderma e 6 cepas de 5 gêneros bacterianos. O uso de TB5
por benefícios semelhantes produzidos no controle da doença e uma promoção de crescimento ainda maior do que a
observada com TB11. Os táxons bacterianos em TB5 inibem diretamente o crescimento de SCCFo1, podem solubilizar os
nutrientes do solo, tornando-os mais disponíveis para plantas de pepino e FJ035, e aumentar a expressão de antioxidantes,
enzimas relacionadas à defesa e genes relacionados ao hormônio do crescimento em plantas de pepino. Estas descobertas
destacam o potencial da utilização de conjuntos microbianos sintéticos benéficos para apoiar sistemas de gestão
agrícola sustentável e diminuir a dependência da utilização de produtos químicos sintéticos, ao mesmo tempo que aumenta
a saúde e o rendimento das culturas.
Introdução
O microbioma da rizosfera que envolve as raízes das plantas é uma fonte de múltiplos benefícios para as plantas, incluindo
nutrição 1,2 ,aumento do crescimento 3,4 proteção contra doenças de plantas 5,6 . Uma compreensão profunda do
a microflora no microbioma da rizosfera e seu efeito na saúde das plantas são cruciais para melhorar a aptidão das
plantas. O microbioma da rizosfera desempenha um papel fundamental nos muitos processos que ocorrem no solo 7,8 e,
portanto, impacta o crescimento e a saúde das plantas 9,10 . Embora várias funções da rizosfera tenham sido relatadas,
são necessárias consideravelmente mais pesquisas para compreender completamente o potencial benéfico do
microbioma da rizosfera e como o microbioma pode ser manipulado de uma maneira que apoie o crescimento, a saúde
e o desenvolvimento das plantas hospedeiras.
A introdução de consórcios microbianos projetados na rizosfera é um tópico de pesquisa crescente devido ao potencial de
tal aplicação para aumentar a resistência a doenças e a tolerância ao estresse em plantas hospedeiras, apoiando o crescimento
sob condições adversas 11 . A engenharia do microbiomada rizosfera é definida como 12 e pode ser principalmente a
comunidade microbiana da rizosfera para apoiar a produção sustentável prontamente alcançada pela manipulação da
aplicação de micróbios probióticos benéficos ao solo 13 táxons microbianos devem possuir . O introduzido
propriedades funcionais que beneficiem as plantas hospedeiras, como a solubilização de minerais do solo, fixação de nitrogênio
e controle de processos de patógenos de plantas, a microflora 14. Além dos efeitos diretos no solo
introduzida pode impactar a composição do microbioma da rizosfera nativa de uma maneira que aumenta a funcionalidade
dos micróbios residentes 15,16 . Além disso, a construção,
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aplicação e avaliação de comunidades microbianas sintéticas (SynComs) é essencial para confirmar
funcionamento do microbioma e interações microbioma-planta 17,18 . Extração e cultivo de microorganismos
os táxons podem vincular a validade funcional aos dados da sequência do amplicon, aumentando assim o potencial preditivo 19,20 .
Fusarium murcha, causada pelo patógeno transmitido pelo solo

Fusarium
(FOC), oxysporum
é um f. sp. cucumerina
das doenças mais destrutivas do pepino em todo o mundo 21 . E perdas económicas globais tão elevadas como 70–
22 .
100% foram relatados A respeito disso, Fusarium foi relatado que a murcha é responsável por 50%
redução na biomassa vegetal 23–26 . A redução do FOC em solos utilizando fumigantes químicos tem sido
problemático e não é compatível com sistemas de produção orgânicos e sustentáveis. Portanto, há
uma necessidade essencial de desenvolver práticas alternativas de gestão que melhorem os efeitos biológicos e químicos
propriedades do solo e suprimem as populações FOC.
Tricoderma espécies são táxons fúngicos oportunistas de vida livre que são comumente isolados das raízes das plantas
e solo, e também são comumente usados como agentes de controle biológico contra diversas doenças de plantas.
Tricodermae
Estudos anteriores relataram que a colonização das raízes melhora o crescimento
desenvolvimento das raízes, aumenta a tolerância aos estresses abióticos e bióticos e melhora a absorção e
27 Tricoderma
utilização de nutrientes das plantas . O impacto benéfico de uma aplicação no solo de no rendimento e
resistência a doenças, ao mesmo tempo que modifica a composição do microbioma da rizosfera, foi relatada
em batata, milho e sorgo28 . No entanto, uma análise detalhada e abrangente de como a aplicação de
Tricoderma inoculante em um microambiente específico da rizosfera remodela a rizosfera
microbioma para melhorar o crescimento das plantas e a resistência a doenças não foi conduzido.
O presente estudo avaliou o efeito da aplicação de um sistema de cultivo no Tricoderma em um pepino contínuo
solo sobre a composição do microbioma da rizosfera e a ocorrência de, posteriormente, um reino cruzado. Fusarium murchar.
comunidade sintética bacteriano-fúngica foi construída e então

simplificado com base no papel funcional dos táxons bacterianos selecionados. O biocontrole e o crescimento das plantas
a capacidade de promoção da comunidade simplificada foi avaliada através da avaliação de sua capacidade antagônica e nutritiva
solubilização e indução de propriedades de resistência do hospedeiro.
Resultados
Eficácia de T. asperellum FJ035 contra CFW durante cultivo contínuo de pepino
Pepinos foram plantados continuamente durante onze ciclos de cultivo contínuo em vasos contendo solo
que foi inoculado com esporos de f. sp. F. oxysporum cucumerina SCCFo1 após o segundo plantio
(Fo2), resultando em aumento progressivo da murcha de Fusarium do pepino (CFW). Os solos em um tratamento
foram inoculados com T. asperellum FJ035 após o oitavo plantio (TF8). Como resultado, o índice da doença em
As plantas TF8 foram reduzidas em 68,28% em comparação com as plantas não tratadas (Fo8). Notavelmente, o efeito de biocontrole
persistiu mesmo no décimo primeiro plantio (TF11) em que houve redução de 58,86% no índice da doença.
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Figura 1 Sistema de cultivo contínuo do solo usado em uma estufa para cultivar pepinos cujos solos
foram inoculados com murcha
Fusarium
(CFW)oxysporum
em SCCFo1. R: A incidência do pepino Fusarium
o campo e uma cultura de F. oxysporum SCCFo1. B -C: Diagrama do desenho experimental utilizado no
sistema de cultivo contínuo para cultivo de pepino (B) e o índice de doença para CFW nos diferentes
grupos de tratamento (C). Os quatro grupos de tratamento foram tratamento com água estéril (T), Tricoderma FJ035
tratamento (Tr), tratamento SCCFo1 (Fo), tratamento SCCFo1 + FJ035 (TF). Números (1–11) seguindo o
5 6
nome do tratamento indicar o número do ciclo de plantio, SCCFo1 ~ 10 esporos /g solo, FJ035 ~ 10
esporos/g solo. Os dados representam as médias ± erro padrão (médias ± SE).
Efeito do microbioma da rizosfera no biocontrole

eficácia do FJ035
Um diagrama do desenho experimental do experimento de transferência de microbioma conduzido no contínuo
o cultivo de pepino é apresentado na Fig. 2A. Os resultados indicaram que a aplicação de FJ035 em vasos T. asperelo
inicialmente preenchidos com solo esterilizado (S-Tri) reduziu significativamente a doença CFW
índice, em relação ao controle (Fig. 2B). Notavelmente, a redução no índice CFW por FJ035 foi significativamente
maior (44,99%) em plantas de pepino cultivadas em solo inoculado com SCCFo1 corrigido com TF8 não esterilizado
solo da rizosfera (A-Tri) comparado ao solo corrigido com solo TF8 esterilizado (S-Tri). O aplicativo FJ035
também resultou em um peso fresco significativamente maior de plantas de pepino cultivadas em solo corrigido com
solo de rizosfera TF8 não esterilizado do que solo de rizosfera TF8 esterilizado. Esses resultados indicam que
a comunidade microbiana transferida melhorou a eficácia do FJ035 contra o CFW.
Efeito de T. asperellum FJ035 e F. oxysporum SCCFo1 na composição da rizosfera

microbioma sob cultivo contínuo
Os resultados obtidos no sistema de cultivo contínuo indicaram que o ciclo de cultivo impactou o
composição de OTUs bacterianas no solo. O número de OTUs bacterianas identificadas nas amostras de solo
aumentou com o aumento do número de ciclos de cultivo, atingindo um pico no sétimo ciclo de
cultivo, após o qual o número de OTUs se estabilizou. É importante ressaltar que a introdução de FJ035 e SCCFo1
não impactou o número de OTUs obtidas. Em relação aos fungos, o número de OTUs permaneceu constante com
sem diferenças significativas entre os ciclos de cultivo ou com a introdução de FJ035 e SCCFo1
(Figura 1A e B Complementar).
As diversidades alfa bacterianas e fúngicas foram significativamente diferentes nos diferentes tratamentos. O
O índice de bactérias Shannon e Chao1 aumentou na primeira (T1) e sétima safra (T7) e depois
diminuiu ligeiramente, em comparação com os mesmos índices no solo inicial, antes do cultivo do pepino (T0). O
Os índices de Shannon e Chao1 da comunidade bacteriana não foram afetados pela aplicação de SCCFo1 ou
FJ035. Comparado ao solo inicial (T0), os índices de Shannon e Chao1 da comunidade fúngica
diminuiu no primeiro ciclo de cultivo (T1) e depois aumentou em ciclos de cultivo sucessivos. Notavelmente, o
introdução de SCCFo1 (Fo7) no sétimo ciclo de cultivo resultou em redução significativa na
índice de Shannon, mas não afetou o índice Chao1 da comunidade fúngica. Amostras de solo da rizosfera em
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TF8 (inoculado com SCCFo1 e tratado com FJ035) apresentou redução significativa do índice Chao1
da comunidade fúngica, em relação às amostras T8 (nem inoculadas com SCCFo1 nem tratadas com FJ035)
(Fig. 2C).
PCoA (Análise de Coordenadas Principais) apresentou tendências semelhantes para fungos e bactérias. Rizosfera
as amostras de solo foram agrupadas em três grupos: solo inicial, não cultivado (T0), primeiro ciclo de cultivo (T1),
e todos os grupos de tratamento no sétimo e oitavo ciclos de plantio. Os três clusters foram explicados
74,68% e 49,46% da variação bacteriana e fúngica total, respectivamente. Esses resultados indicam que
o cultivo contínuo pode representar o principal fator que impacta as diferenças observadas na diversidade ÿ .
Contudo, as diferenças resultantes do cultivo contínuo pareceram diminuir após o sétimo
ciclo de plantio, potencialmente devido à introdução de FJ035 e SCCFo1. O PCoA de amostras de
o sétimo e oitavo plantio indicaram que o cultivo contínuo de pepino (no eixo PC1) e
os tratamentos FJ035 e SCCFo1 (no eixo PC2) representaram 24,22% e 11,55% de variação na
composição fúngica, respectivamente, com um total de 35,77% da variação explicada. Na análise PCoA
da comunidade bacteriana, cultivo contínuo (no eixo PC2) e tratamentos FJ035 e SCCFo1
(no eixo PC1) foram responsáveis por 19,56% e 21,88% da variação na composição bacteriana,
respectivamente, totalizando 41,44%. Esses dados indicam que as bactérias podem ser mais afetadas pela introdução
de FJ035 e SCCFo1 do que fungos (Fig. 2C).
Dados taxonômicos indicaram que Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria e

Gemmatimonadetes eram os filos bacterianos dominantes na rizosfera, representando 88,5-90,6% de
as sequências totais (Arquivo Suplementar 1a). Ascomycota, Basidiomycota e Chytridiomycota foram os
filos fúngicos dominantes (Arquivo Suplementar 1b). Os filos de fungos dominantes eram consistentes entre os
diferentes tratamentos, no entanto, sua abundância relativa exibiu variação significativa. Foi de interesse
determinar quais táxons microbianos foram atraídos pelas raízes das plantas durante a infecção por SCCFo1 e pelo
aplicação do agente de biocontrole FJ035. Portanto, analisamos os táxons microbianos presentes em três
grupos: (i) diferentes ciclos de cultivo contínuo no controle não tratado (T0, T1, T7 e T8), (ii) o grupo de tratamento inoculado com SCCFo1 (Fo7 e Fo8) e (iii) o grupo F.
oxysporum de tratamento inoculado com SCCFo1 (Fo7 e Fo8) e (iii) o grupo de tratamento inoculado com SCCFo1 T. asperellum FJ035
grupo de tratamento (Tr8 e TF8) (Fig. 2D e Fig. Complementar 2E). Resultados em nível de gênero indicados
que as amostras da rizosfera no grupo de tratamento controle (cultivo contínuo) exibiram aumento
abundância de etc. e uma abundância, diminuída
Stenotrophomonas Ensifer , ede Bauldia Streptomyces ,
Esfingomonas , Massília , etc. As amostras no grupo de tratamento Fo7 e Fo8 exibiram um aumento
abundância de Sinomonas , Aquisphaera, Bauldia , Gaiela , Hifomicróbio , etc. e uma diminuição
abundância de Acinetobacter , Microbactéria , MND1, Jatrofihabitanos , Termômonas , etc. Amostras em
o grupo de tratamento Tr8 e TF8 exibiu uma abundância aumentada de Streptomyces , Stenotrophomonas ,
Acidotérmico , Bauldia , Chthonomonas , etc. e uma abundância diminuída de Nordela , Singulisphaera ,
Hifomicróbio , etc. (Arquivo Suplementar 2a). Variações semelhantes entre os diferentes grupos de tratamento
foram observados no nível OTU (Arquivo Suplementar 2b). Por exemplo, as amostras no grupo de Tricoderma
tratamento tiveram contagens mais altas de OTU1148, OTU157, OTU1990, etc., enquanto as amostras no grupo SCCO1
o grupo de tratamento de inoculação teve contagens mais altas de OTU13277, OTU1016, OTU10167, OTU1030, etc.
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Eficácia de montagem e biocontrole de bactérias e

comunidades sintéticas combinadas de fungos/bactérias
Bactérias cultiváveis foram isoladas do solo da rizosfera do pepino para identificar membros da rizosfera
microbiota impactada pela aplicação de FJ035. Um total de 167 cepas bacterianas foram isoladas do
solo da rizosfera de amostras de solo da rizosfera T9, Fo9, Tr9 e TF9 utilizando oito meios de crescimento diferentes.
o número de isolados foi reduzido para 70 cepas bacterianas únicas após a remoção de cepas redundantes
com base na morfologia da colônia. Os isolados retidos foram então submetidos a análises adicionais. Resultados de
O sequenciamento e análise de 16SrRNA indicaram que as cepas isoladas compreendiam 41 espécies em 28 gêneros
(Tabela Suplementar 3). Streptomyces e Stenotrophomonas apresentou maior abundância no
Amostras de tratamento FJo35, Sinomonas e Criseobactéria apresentou maior abundância no
enquanto amostras de tratamento Acinetobacter exibiu uma abundância diminuída. Ensifer teve uma maior
SCCFo1 e abundância no controle, amostras de cultivo contínuo. Bacilo, Pseudomonas , Peanibacillus ,
Flavobactéria e Microbactéria Notavelmente, foram identificados como gêneros centrais (Fig. 2D).
As comunidades sintéticas bacterianas B4 e B11 e as comunidades bacterianas-fúngicas combinadas TB4 e TB11

comunidades sintéticas foram construídas conforme descrito nos Resultados Suplementares 2.1. O impacto de
essas comunidades sintéticas no crescimento das plantas e na resistência ao CFW foram avaliadas em experimentos em vasos.
Os resultados indicaram que, em geral, as plantas de pepino cultivadas em solo tratado com TB4 e TB11 sintéticos
comunidades exibiram a maior altura de planta, diâmetro de caule e peso fresco de planta, bem como o
menor valor de índice de doença. O valor desses parâmetros foi ainda maior do que o observado nas plantas
cultivado em solos tratados com B4 e B11. Notavelmente, o efeito benéfico do TB4 e TB11 foi significativamente
reduzido e comparável ao controle quando a forma inativa (STB4 e STB11: B4 e B11 inativos
misto vivo FJ035) dessas comunidades sintéticas foram aplicados (Fig. 3B e E). Resultados também indicaram
que a promoção do crescimento e o controle de doenças em plantas cultivadas em solos TB11 foram melhores do que as plantas cultivadas em
Solos TB4. Isto pode ser atribuído ao aumento da abundância de spp. eTricoderma
a diminuição
abundância de Fusarium oxysporum em solos TB11 em comparação com solos TB4 (Fig. 3F e G).
Simplificação de comunidades sintéticas bacterianos-fúngicas

e avaliação de sua eficácia de biocontrole contra CFW
As comunidades sintéticas iniciais foram ainda mais simplificadas para criar uma comunidade sintética entre reinos mais estável.
comunidade. Amostras de solo da rizosfera foram coletadas e analisadas 26 dias após serem inoculadas com
B11 e TB11. A análise de sequências completas de amplicon 16S revelou que o tratamento TB11
aumentou a abundância de 11 espécies de bactérias nos gêneros e Sinomonas, Ensifer , Pseudomonas ,
Pseudomonas comparado ao tratamento com B11. Streptomyces manteve-se num nível consistentemente baixo em ambos
Amostras tratadas com B11 e TB11 (Fig. 4A).
Sequências representativas de OTU do sequenciamento de amplicon de terceira geração de cinco gêneros bacterianos
e as sequências dos isolados inoculados foram utilizadas para construir árvores filogenéticas em R usando Muscle,
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Árvore de QI e software itol. Como resultado, sequências obtidas dos isolados bacterianos com os valores mais próximos
a relação das espécies com os dados de sequenciamento de amplicons dos cinco gêneros bacterianos foi obtida. Variedade
Descobriu-se que B1-3 e B1-1 estão mais intimamente relacionados comStreptomyces
OTU59, OTU226 e Sinomonas
respectivamente. A cepa B1-9 foi mais intimamente relacionada ao OTU19 e Ensifer

aos isolados B1-16, B1-20 e B1-
Pseudomonas
22 estavam mais intimamente relacionados com OTU50, sendo a estirpe B-22 a que mais se aproximava de OTU50.
Os isolados R2-1 e R2-3 não se agruparam com nenhuma das OTUs representativas. e Isolados B1-33 e B1-35
agrupado com as sequências representativas de OTU138,Paenibacillus
enquanto isola R2-6, R2-8 e B2-8
Paenibacillus
de não Paenibacillus
se agrupou com nenhuma das OTUs representativas. Com base na análise,
seis isolados de cinco gêneros foram misturados em volume igual (cerca de 10 8 células/L) para gerar o quinto
comunidade sintética simplificada B5 (doravante designada como comunidade simplificada B5). O simplificado
A comunidade sintética bacteriana-fúngica TB5 foi gerada pela mistura de volumes iguais de FJ035 T. asperellum
7
(cerca de 5×10 esporos /L) e a mistura bacteriana sintética B5 (Fig. 4A).
A análise dos dados do experimento com maconha indicou que a comunidade sintética TB5 teve maior benefício
impacto do que a comunidade sintética TB11 na promoção do crescimento das plantas, resultando em um impacto significativamente maior
aumento na massa fresca da planta e no diâmetro do caule. No entanto, ambos os grupos de tratamento TB5 e TB11
produziu um nível semelhante de eficácia no controle do CFW. Notavelmente, o tratamento FJ035 sozinho foi
significativamente menos eficaz tanto na supressão da doença como na promoção do crescimento em comparação com TB5 e
Tratamentos TB11 (Fig. 4B).
FJ035 promove a colonização das raízes do pepino pelas bactérias presentes no sintético simplificado
comunidade
Um sistema radicular dividido foi utilizado para investigar se o FJ035 promoveu a colonização de raízes de pepino pelo
gêneros bacterianos presentes na comunidade sintética simplificada (Fig. 5A). Resultados do experimento de raiz dividida
indicou que a inoculação FJ035 melhorou significativamente a colonização de raízes de pepino por
gêneros bacterianos presentes na comunidade bacteriana simplificada, em comparação com a colonização de raízes que
não foram inoculados (controle) com FJ035. A análise dos dados indicou que FJ035 aumentou o
colonização de 0,92%,
Streptomyces
2,96%, , Sinomonas , Ensifer , Pseudomonas e Paenibacillus
6,66%, 12,16% e 5,31%, respectivamente (fig. 5B).
Figura 5 Ensaio de raiz dividida para determinar o efeito do FJ035 na colonização de raízes de pepino pelo
gêneros bacterianos que compõem a comunidade sintética simplificada. A: Representação diagramática do
ensaio de raiz dividida em que um lado foi inoculado com a comunidade bacteriana sintética simplificada e
o outro lado foi inoculado com água estéril (CK) ou FJ035 (Tri). B: Número de amplicons dos cinco
gêneros de bactérias simplificadas obtidas de amostras da rizosfera de pepino no teste de raiz dividida (CK vs.
Tri). Os dados quantitativos representam as médias ± SE (n = 6). Diferentes letras minúsculas acima das barras
indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre os níveis de colonização pela bactéria indicada
gênero nos grupos de tratamento controle vs. FJ035 conforme determinado por ANOVA.
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Atividade antifúngica e competição de nutrientes das cepas bacterianas presentes no sintético simplificado
comunidade contra F. oxysporum SCCFo1
A atividade antifúngica das cepas bacterianas simplificadas contra FJ035 foi F. oxysporum SCCFo1 e T. asperelo
avaliada em meio TSB. Tanto as colônias físicas quanto o caldo de fermentação de seis bactérias
isolados presentes na comunidade sintética simplificada inibiram o crescimento de SCCFo1. A fermentação
caldo de sp. B1-33
Paenibacillus
foi especialmente inibitório causando uma redução de 70,95% no SCCFo1
crescimento, em relação ao controle. Entre as cepas bacterianas simplificadas testadas, apenas a B1-33 e B1-35
cepas de sp.Paenibacillus
inibiu o crescimento de FJ035 (Fig. 6A e B).
Ensaios de competição de nutrientes foram conduzidos entre os isolados bacterianos simplificados e F. oxysporum
T. em
SCCFo1 e FJ035 asperelo
meios deficientes em nutrientes, como fosfato insolúvel, potássio
feldspato e meio livre de nitrogênio. Nenhum dos caldos de fermentação das cepas bacterianas simplificadas
inibiu o crescimento de FJ035 quando cultivado nestes meios. Notavelmente, no entanto, as colônias físicas do
isolados de bactérias simplificadas promoveram o crescimento de FJ035 em condições pobres em nutrientes. O crescimento
de FJ035 aumentou 53,41% e 32,53%, em relação ao controle, quando FJ035 foi cultivado com sp. e sp., Ensifer
Pseudomonas
respectivamente, em meio de fosfato insolúvel. Em contrapartida, a fermentação
o caldo de todas as seis cepas bacterianas simplificadas exibiu níveis variados de inibição no crescimento de SCCFo1 F.
oxysporum (Figs. Complementares 2 e 3).
Solubilização de fósforo, produção de IAA e atividade de celulase em isolados bacterianos na forma simplificada
comunidade sintética bacteriana
Pseudomonas exibiu a maior atividade de solubilização de fosfato entre as seis cepas bacterianas
compondo a comunidade bacteriana sintética simplificada, 7.365 µg/L de teor de fósforo solúvel, enquanto
as cepas B1-33 e B1-35 apresentaramPaenibacillus
produção de IAA e celulase significativamente maiores
atividade do que as outras cepas (Figura 4A-E Complementar).
Com base nos dados da sequência do genoma, todas as seis bactérias simplificadas têm genes que codificam enzimas chave envolvidas
na produção de IAA, incluindo um gene que codifica a aldeído desidrogenase. sp. e Streptomyces
Pseudomonas sp. possuem uma triptofano 2-monooxigenase (Eu sou) gene e várias monoaminas
genes da oxidase, respectivamente. Os genes da nitrila hidratase estão presentes no genoma de Streptomyces sp. e
Ensifer sp. Além disso, sp. eStreptomyces Ensifer
sp., uma
sp. todos possuem Pseudomonas
codificação genética
que codifica ACC desaminase (1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminase,) e um gene acdS
que codifica
um gene regulador transcricional da família Lrp/AsnC, (acdR)
que . As seis cepas bacterianas também carregam uma mdc
codifica a quinoproteína glicose desidrogenase e serve como um biomarcador confiável para identificar
Pseudomonas
bactérias solubilizadoras de fosfato (PSB). sp. também possui o cluster genético completo
pqqABCDE responsável pela síntese do cofator glicose desidrogenase, embora possua uma Ensifer sp. apenas
porção do cluster de genes Todas as cepas bacterianas,

(pqqABDE) . sp.,
exceto Pseudomonas
possuem genes que codificam uma celulase. Genes que codificam três tipos de celulose sintetase também estão presentes
em Streptomyces sp. (Tabelas Suplementares 5 e 6).
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Efeito da comunidade bacteriana sintética simplificada na resistência a doenças e no gene relacionado ao crescimento
expressão em pepino
O nível relativo de expressão de genes de enzimas antioxidantes ( SOD , CAT e POD ), genes relacionados à defesa
(SA: eNPR-1, JÁ: LOX-1 e LOX2 , ETH: EIN2 EIN-3 ) e genes relacionados a hormônios vegetais (IAA:
GH3e
SAUR , CTK: ARR9 ) foram avaliados em raízes de pepino por RT-qPCR para avaliar o efeito do método simplificado
comunidade bacteriana sintética na indução de resistência a doenças e promoção do crescimento de plantas em

o nível molecular (Fig. 7A-K). Comparado com o controle, a inoculação de solos em que a planta de pepino
estavam crescendo com a comunidade sintética TB5 regulando significativamente o nível de expressão relativo de
todos os genes mencionados. Às 24 horas após a inoculação, os tratamentos TB5 e TB5-FO aumentaram respectivamente
SOD expressão 46,08 e 34,11 vezes, GATO expressão 12,98 e 17,92 vezes e 618,72 e GH3 expressão
399,02 vezes. Às 48 horas após a inoculação, os tratamentos TB5 e TB5-FO aumentaram respectivamente
a expressão
POD 0,11 e 0,24 vezes, e a expressão 241,90 ARR9
e 203,18 vezes.
Da mesma forma, o tratamento comunitário sintético simplificado TB5 aumentou o diâmetro do caule, a altura da planta
e massa fresca da planta em 5,95%, 72,79% e 97,84%, respectivamente, em relação ao controle (CK).
Da mesma forma o tratamento TB5-FO aumentou o diâmetro do caule a altura da planta e a massa fresca da planta em 754%
76,93% e 83,82%, respectivamente, em comparação ao tratamento Fo. Notavelmente, o tratamento TB5-FO
diminuiu significativamente o índice da doença em 71,55% (Fig. 7L).
Discussão
Os microrganismos são indicadores importantes da saúde do solo 29 . Mudanças significativas na estrutura microbiana e
composição pode afetar a capacidade de um solo de inibir patógenos de plantas e o desenvolvimento de doenças e
promover o crescimento das plantas 30,31 . No presente estudo, a análise do PCoA baseada na distância de Bray-Curtis revelou
que os táxons bacterianos respondem melhor ao cultivo contínuo de pepinos, potencialmente devido ao
adição consistente e persistente de carbono, nitrogênio e outros elementos ao solo associados a
o crescimento e gestão da produção de pepino. As bactérias são proficientes em utilizar rapidamente
recursos, acelerando a transformação e a ciclagem de materiais e degradando rapidamente vários produtos tóxicos
compostos, estabelecendo assim coletivamente um sistema simbiótico32 . No entanto, ciclos prolongados de
o cultivo contínuo resulta no acúmulo de exsudatos secretados semelhantes, levando a uma diminuição na
abundância de micróbios benéficos e uma redução na capacidade de manter um ambiente de solo saudável para
35
produção agrícola 33,34 . Em nosso estudo, a abundância de Streptomyces , Esfingomonas 36 e outros
bactérias benéficas diminuíram durante o cultivo contínuo de pepinos e um aumento progressivo na

ocorrência de CFW.
Um rápido aumento na abundância relativa Tricoderma foi observado quando asperellum T. FJ035 era
introduzida no sistema de cultivo contínuo, juntamente com uma diminuição significativa em (FigurasFusarium
Complementares 2C e D) e uma redução de 68,28% no CFW. O aumento de spp. também Tricoderma
inibiu até certo ponto outros fungos no solo e teve uma influência positiva na comunidade bacteriana.
Especificamente, a aplicação do FJ035 aumentou significativamente a abundância de Stenotrophomonas e
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Streptomices. Esses dois gêneros são comumente reconhecidos como rizobactérias promotoras do crescimento de plantas.
(PGPR) 37, e demonstrou controlar eficazmente algumas doenças comuns do pepino, como
Podridão da coroa de Phytophthora
38 , antracnose 39 , oídio40 e Fusarium murchará 37 . Estudos anteriores
relatou que a presença de Tricoderma spp. nos solos está intimamente relacionado com a ocorrência de outras
espécies41,42 . Embora as populações das espécies-chave sejam pequenas, elas desempenham um papel importante no solo
ecossistema43,44 . No entanto, não se sabe se estas espécies-chave de bactérias podem ser utilizadas como reserva que
pode interagir com Tricoderma spp. e contribuir para a proteção fitossanitária a longo prazo. Em nosso estudo, nós
desenvolveu uma comunidade bacteriana sintética para resolver esta questão.
A construção e utilização de comunidades microbianas sintetizadas sem triagem funcional pode não
proporcionam um impacto benéfico e às vezes pode ser prejudicial 45,46 . A investigação do
A relação entre os microrganismos da rizosfera e a saúde das culturas avançou agora para o uso de
tecnologia microbiana sintética que muitas vezes é combinada com análise de sequenciamento de alto rendimento para
identificar membros adequados para inclusão em comunidades sintéticas destinadas a controlar doenças de plantas 29,47 .
Por exemplo, Lebeis et al. 48 construíram uma comunidade microbiana sintética com base na análise de 16s
sequências de amplicon compostas por três cepas de sp. Xantomonas sp., Stenotrophomonas
e sp. Microbactéria
Esta comunidade melhorou sinergicamente a formação de biofilme e efetivamente
bactérias Arabidopsis míldio48 . No presente estudo, os resultados do sequenciamento de todos os isolados
cultiváveis prevenidas foram comparadas com dados de sequência de amplicon de solos da rizosfera obtidos de um
Sistema de cultivo contínuo em estufa para pepino. Um total de 8 cepas bacterianas de 4 gêneros foram
identificou cuja abundância aumentou após os solos serem tratados com FJ035, diminuiu após
T. asperellum
os solos foram tratados com SCCFo1 e aumentados nos solos controle durante o cultivo contínuo.
F. oxysporum
Outros resultados demonstraram que mitigou significativamente
Streptomyces , Acinetobacter
a murcha de Fusarium
, Stenotrophomonas do pepino
, Ensife
(CFW) causada por (Fig. 3G). Fusarium oxysporum
É importante ter em mente que a diversidade dos microrganismos do solo não é totalmente capturada pelo
sequenciamento de alto rendimento, que a maioria dos microrganismos do solo não pode ser cultivada e que as funções dos
nem todos os microrganismos que podem ser cultivados estão diretamente relacionados à resistência a doenças 49,50 . Portanto, nosso
estudo utilizou uma combinação dos resultados do sequenciamento de amplicon de alto rendimento obtidos de
solos de cultivo contínuo em estufa e os resultados de sequenciamento de alto rendimento de pepino
microrganismos centrais obtidos em análises laboratoriais anteriores para construir a comunidade sintética B11
(TB11). TB11 representa uma comunidade sintética que é eficaz na prevenção de doenças e contém o
Streptomyces , Stenotrophomonas , Acinetobacter , Ensife , Criseobactéria
principais táxons microbianos: ,
Sinomonas , Bacilo , Paenibacillus , Pseudomonas , Flavobactéria ,e Microbactéria . O alvo
a seleção de um gênero bacteriano para construir uma comunidade sintética melhorou muito a doença
eficácia de prevenção do conjunto microbiano. A comunidade sintética TB11 superou a TB4
comunidade sintética para melhorar o crescimento e o controle do CFW em pepinos cultivados continuamente.
O conceito de uma comunidade sintética entre reinos é uma ideia nova introduzida recentemente por Zhou et al. 51
e compreende uma comunidade que é um conjunto híbrido de fungos e bactérias. No entanto, apenas limitado
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estudos foram realizados sobre o uso de tais comunidades. A este respeito, descobrimos que a comunidade sintética entre
reinos que construímos melhorou o crescimento do pepino e melhorou a resistência ao CFW
do que qualquer comunidade sintética fúngica ou bacteriana múltipla. Estas descobertas estão de acordo com
estes resultados relatados por Zhou et al. 51 em que uma comunidade sintética construída entre reinos foi
Fusarium
mais eficaz na redução da murcha do tomate do que uma comunidade sintética fúngica ou bacteriana
sozinho.
Existem desafios consideráveis para garantir a estabilidade das comunidades sintéticas 52,53 . Deles
a funcionalidade só é realizada quando a comunidade sintética coloniza com sucesso as raízes das plantas 54,55 .
Portanto, era importante verificar quais membros da comunidade sintética TB11 eram compatíveis
com Tricoderma spp. e desempenhou um papel significativo nas interações que ocorrem com o hospedeiro do pepino
plantas e outros micróbios do solo. Analisamos sequências de amplicon de terceira geração completas de 16s
obtido de solo de rizosfera de pepino submetido aos tratamentos de solo TB11 e B11. Nossas análises
indicou que o tratamento TB11 (que inclui FJ035) aumentou significativamente a abundância relativa
de Pseudomonas, Sinomonas, Ensifer ,e Paenibacillus em comparação com o B11 (apenas o sintético bacteriano
apenas na comunidade) tratamento. Streptomyces exibiu uma abundância muito baixa tanto no B11 quanto no
Notavelmente, amostras TB11. Portanto, uma comunidade sintética simplificada B5 (TB5) foi construída a partir de seis bactérias
cepas de cinco gêneros. Solos em vasos com plantas de pepino tratados com esta comunidade TB5 simplificada
produziu resultados semelhantes aos do tratamento TB11, com todos os recursos de promoção de crescimento e resistência a doenças
efeitos retidos (Fig. 4B) Esses resultados estão de acordo com o estudo realizado por Li et al. 56 , Quem
construíram uma comunidade sintética simplificada (SCIII), composta por apenas quatro gêneros que estavam presentes no
Comunidade sintética SCI contendo um maior número de táxons. Notavelmente, SCIII manteve o original
efeito de prevenção de doenças da LME. É importante ressaltar que em nosso presente estudo, o reino cruzado TB5 simplificou
o tratamento comunitário foi melhor que o tratamento TB11 no aumento do diâmetro do caule e da altura da planta, enquanto
ainda preservando o mesmo nível de controle do CFW.
Todas as seis cepas utilizadas na comunidade sintética simplificada inibiram individualmente o crescimento micelial de F.
oxysporum SCCFo1 e teve pouco efeito no crescimento de T. asperellum FJ035 (Fig. 6). Enquanto o crescimento
de FJ035 foi reduzido quando cultivado sozinho em meio nutriente pouco solúvel, a inibição do crescimento foi
invertido quando Ensifer sp., Sinomonas sp., Pseudomonas sp., ou Paenibacillus sp. B1-33 foram introduzidos
em meio isento de fosfato e nitrogênio (Figura 2 suplementar). Isto pode ser devido ao volátil orgânico
compostos (VOCs) sintetizados e liberados pelas bactérias, que podem ter impactado beneficamente o
Pseudomonas
crescimento de FJ035. A este respeito, os COV produzidos por são aeruginosa
absorvidos por Aspergillus
57
fumigato resultando em maior crescimento micelial . Predição genômica e análise quantitativa
revelou que a maioria dos táxons bacterianos simplificados foram capazes de produzir IAA e solubilizar fosfato
(Fig. Complementar 4A e D). O IAA está envolvido em quase todos os aspectos do crescimento e desenvolvimento das plantas
58 . Estes incluem o IAM
e cinco vias principais de síntese de IAA em bactérias são atualmente reconhecidas
Via (indole-3-acetamida), via IPyA (indole-3-piruvato), TSO (triptofanside-chainoxidase)
via, via TAM (triptamina) e via IAN (indole-3-acetonitrila). Uma análise da chave
genes enzimáticos e cinco vias no genoma dos táxons bacterianos simplificados revelam que cada cepa
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possui pelo menos uma via de síntese de IAA. Streptomyces sp. descobriu-se que possuía potencialmente três
Vias de síntese de IAA (Tabela Suplementar 6). Ensaios quantitativos confirmaram que todos os procedimentos simplificados
os táxons bacterianos, excetoEnsifer
sp, tiveram uma capacidade significativa de produzir IAA.
As bactérias podem produzir ácido glucônico para converter o fósforo insolúvel em uma forma solúvel que pode ser absorvida
59
por plantas . Nosso estudo descobriu que os táxons bacterianos simplificados, especialmente Pseudomonas sp., possui um
sequência de codificação completa para um gene na via de síntese do ácido glucônico, potencialmente permitindo que estes
táxons bacterianos para metabolizar o fósforo insolúvel. Pseudomonas sp. exibiu o maior teor de fosfato
capacidade de solubilização em ensaios quantitativos (Figura 4E Complementar), o que poderia explicar o aumento
do crescimento do Pseudomonas sp. em um meio de fosfato insolúvel (Fig. Complementar 2B e
FJ035 em 3B). O efeito promotor de crescimento da comunidade bacteriana sintética simplificada no crescimento do pepino
pode ser coletivamente devido às propriedades promotoras de crescimento de cada uma das bactérias simplificadas individuais
taxa.
Estudos demonstraram que algumas bactérias benéficas da rizosfera podem ativar a síntese de JA, SA e ETH
caminhos nas plantas 51,56,60 , que por sua vez aumenta a atividade de SOD, CAT e POD e melhora a planta
resistência a doenças 61 . No presente estudo, o tratamento comunitário sintético TB5 não só aumentou o
expressão de enzimas antioxidantes e genes relacionados à defesa, mas também aumentou a transcrição de plantas
genes do hormônio do crescimento. O tratamento comunitário simplificado TB5 aumentou o diâmetro do caule,
altura e peso fresco das plantas de pepino, em comparação com o controle, e o tratamento TB5-Fo
aumentou o diâmetro do caule, a altura da planta e o peso fresco da planta e das plantas de pepino, ao mesmo tempo que
reduzindo o índice de doença CFW, em comparação com o tratamento Fo (Fig. 7L). O aprimoramento da doença
resistência e crescimento podem ser devidos ao aumento da capacidade das plantas de pepino tratadas com TB5 resistirem
infecção por patógenos, elimina radicais ativos de oxigênio e sintetiza hormônios de crescimento.
Alguns estudos relataram que mudanças no ambiente externo podem influenciar diretamente na síntese
e secreção de metabólitos radiculares, e que os microrganismos do solo respondem de maneira diferente a vários
metabólitos 62-64 . Por exemplo, . Pseudomonas fluorescentes Foi relatado que Pf0-1 exibe quimiotaxia
65
Atualmente,
aos compostos l-malato, succinato e fumarato é
secretados pelas raízes dos tomateiros
não se sabe quais exsudatos de raiz de pepino são alterados por Tricoderma spp., e quais compostos ou
classes de compostos responsáveis pelo recrutamento de grupos bacterianos específicos resultando em um
reestruturação dos microbiomas bacterianos e fúngicos na rizosfera do pepino. Portanto, adicional
estudos visando a identificação de exsudados de raiz de pepino podem fornecer informações valiosas sobre o papel
de plantas no processo de remodelação do microbioma bacteriano da rizosfera devido à modificação de
comunidades bacterianas pela introdução de fungos específicos, como Tricoderma sp.
O presente estudo demonstra o potencial significativo de manipulação de bactérias da rizosfera

comunidades, especialmente através da construção e aplicação de comunidades sintéticas em
Tricoderma
conjunto com spp. Esta abordagem demonstrou mitigar eficazmente a murcha do pepino (CFW), ao mesmo tempo que Fusarium
promove o crescimento das plantas (Fig. 8). O sintético entre reinos TB11
comunidade, compreendendo 11 gêneros bacterianos especificamente selecionados e T. asperelo FJ035, foi mostrado para
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aumentam significativamente a resistência a doenças, resultando em uma redução de 70,00% no índice de doenças CFW
e em um aumento substancial de 64,59% no peso fresco da planta. A simplificação da comunidade sintética para 6
isolados bacterianos em 5 gêneros e FJ035 para produzir a comunidade sintética TB5 entre reinos demonstrou a
capacidade de usar uma comunidade mais estreita que transmitiu um nível semelhante de resistência a doenças e
promoção de crescimento. Este estudo forneceu evidências sobre vários mecanismos presentes nos táxons da comunidade
bacteriana sintética simplificada que podem contribuir para seus efeitos benéficos no pepino. Estes incluíram o antagonismo
direto contra o SCCFo1, a capacidade de solubilizar os nutrientesFusarium
do solo, aoxysporum
estimulação da colonização radicular de
Tricoderma
micróbios benéficos e do crescimento, bem como o seu papel na indução da expressão genética relacionada com a resistência
a doenças das plantas e com o crescimento. Estas descobertas sublinham o potencial de aproveitar interacções microbianas
benéficas em apoio a sistemas de gestão agrícola sustentáveis, reduzindo a dependência de intervenções químicas e melhorando
ao mesmo tempo a saúde e o rendimento das culturas.
Métodos
Isolamento e identificação do fungo murcha Fusarium
O fungo patogênico (designado SCCFo1) responsável por causar a murcha de Fusarium do pepino (CFW) foi isolado das raízes
de plantas de pepino cultivadas em campo em um campo de cultivo contínuo de dez anos na província de Sichuan, China.
O SCCFo1 foi cultivado em meio de ágar batata dextrose (PDA) por 4 a 5 dias e então sua morfologia foi registrada com
base nos critérios da caracterização molecular do SCCFo1 foi realizada Fusarium manual de laboratório 66 .
amplificando e sequenciando fragmentos dos genes ITS1-4 e Tef1. Sequências de alta qualidade foram montadas usando
o software Snapgene V. 5.2.4 (www.snapgene.com) e as sequências resultantes foram submetidas à análise
BLAST usando o banco de dados NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sequências de referência com mais de 97% de
similaridade com sequências SCCFo1 foram recuperadas do NCBI/GenBank e usadas para construir uma árvore
filogenética. Como resultado, SCCFo1 foi identificado como f. sp.
Fusarium oxysporum cucumerina .
Preparo do solo e planejamento experimental de experimentos em

casa de vegetação
O solo utilizado neste estudo foi uma laterita franco-arenosa, obtida no condado de Chengmai, província de Hainan, China, e
não havia sido usada anteriormente para produção agrícola. O solo ficou exposto ao ambiente aberto por um ano e
depois passou por uma peneira de malha 100, após a qual foi misturado à matéria orgânica na proporção volumétrica de
7:3. A mistura de solo resultante foi então exposta ao ambiente aberto durante uma semana e depois utilizada nas experiências
em estufa. Dezesseis vasos (tamanho 60 x 40 x 16,5 cm) foram preenchidos cada um com 20 kg de solo. As sementes de
pepino foram esterilizadas superficialmente com etanol a 75% por 1 min, seguido de 5 rodadas de lavagem com água
estéril. As sementes foram colocadas em papel filtro úmido por 48 horas para induzir a germinação, após o que plântulas
uniformes e saudáveis foram transplantadas para vasos (20 plantas por vaso, plantadas uniformemente em uma grade 4 x 5).
As plantas foram então cultivadas durante 50 dias utilizando água padrão e
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regime de fertilizantes, após o qual a incidência da podridão da raiz do pepino foi avaliada como uma medida da saúde do solo.
A incidência da doença foi avaliada usando uma escala de classificação de 0 a 4, na qual 0 = sem sintomas da doença, 1 = um
pequeno número de lesões da doença na base do caule e da raiz principal do pepino e sem murcha evidente, 2 = um pequeno
número de lesões da doença na base do caule e da raiz principal, podridão ou necrose visível das raízes fibrosas e leves
sintomas de murcha, 3 = um grande número de lesões de doença na base da base do caule e da raiz principal, necrose
extensa das raízes fibrosas e sintomas óbvios de murcha e inibição significativa do crescimento, 4 = necrose de 75%
de 100% do sistema radicular e/ou a planta acima do solo está completamente murcha e morta 67,68
.
Após avaliação da capacidade de doença do solo preparado, foi estabelecido um sistema de cultivo contínuo em casa de
vegetação. As plantas de pepino foram cultivadas em um total de onze ciclos (onze colheitas) nos mesmos vasos, com
duração de 50 dias cada ciclo. Foram aplicados quatro tratamentos (W, Tr, Fo e TF) nos quais W = FJ035 (2 L de suspensão
de Trichoderma asperellum líquida de água de esporos de FJ035, Tr = aplicação no solo
7
(1 x 10 esporos/ml) por vaso) após a sétima colheita, Fo = Aplicação no solo de SCCFo1 (2 L de um líquido
5
suspensão de esporos SCCFo1 (1 x 10 esporos/ml) por vaso) após a primeira colheita, e TF = Aplicação no solo de
5
SCCFo1 (2 L de uma suspensão líquida de esporos SCCFo1 (1 x 10 esporos/ml) por vaso) após a primeira colheita
seguido de aplicação no solo de FJ035 (2 L de uma suspensão líquida de esporos FJ035 (1 x 10 vaso) após7 esporos/ml) por
a sétima colheita. O experimento compreendeu 4 repetições biológicas compreendendo quatro vasos (20 plantas/vaso) por
tratamento e o experimento foi repetido 4 vezes. A capacidade do FJ035 de controlar o CFW (SCCFo1) foi calculada como:
controle (%) = (doença índice do grupo controle - índice de doença do grupo de tratamento/índice de doença do grupo
controle) × 100. Uma representação diagramática deste sistema de cultivo é mostrada na Figura 1B.
Transferência do microbioma do solo TF8 para um novo solo
Um teste de transferência de microflora da rizosfera69,70 foi conduzido para determinar se os microrganismos da rizosfera
estabelecidos no experimento TF, no qual o solo em vasos usados continuamente para cultivar pepinos era
T. asperellum (FJ035) após a sétima colheita de pepino poderia aumentar a imunidade inoculada com
de pepino para Fusarium murchar. O solo preparado consistia em solo de fundo misturado com solo TF8. O
o solo de fundo foi esterilizado duas vezes a 121°C por 20 min e confirmado como estéril coletando uma amostra de solo
e conduzindo o plaqueamento de diluição em meio LB ágar. O solo da rizosfera TF8 foi utilizado para inocular o solo de fundo
e dois grupos foram preparados; solo TF8 não esterilizado e solo TF8 esterilizado. O solo TF8 esterilizado também foi
submetido a diluição em meio LB ágar para confirmar sua esterilidade. A terra de fundo foi utilizada para preencher vasos de
mudas (500 g/vaso) com diâmetro de 16 cm e altura de 12 cm. Mudas de pepino foram germinadas em papel filtro conforme
descrito anteriormente e 4 plantas foram transplantadas para cada vaso de solo de fundo. Quatro tratamentos foram
aplicados e designados como T1 (controle): foi aplicada apenas água esterilizada administrada, T2 (Fo): inoculado
apenas com SCCFo1, T3 (S-Tri): 5% (m/m) de solo TF8 esterilizado mais inoculação de SCCFo1 e FJ035 e T4 (A-Tri): 5% (m/
m) de solo TF8 não esterilizado mais inoculação de SCCFo1 e FJ035. O SCCFo1 (5 mL de uma suspensão líquida
de
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Esporos SCCFo1 (1 x 10 7 esporos/ml) por vaso) e FJ035(5 mL de uma suspensão líquida de esporos FJ035 (1 x
8 10 esporos/ml) por vaso) foram realizadas cinco dias após as mudas de pepino terem sido
A concentração de esporos de SCCFo1 foi de 1×10 esporos/g de solo. As 5 e a concentração de esporos de FJ035 foi transplantada.
6 1×10 plantas foram cultivadas durante 21 dias e então o peso fresco da planta foi registrado e o
O índice de doença CFW foi calculado.
Coleta de amostras de solo, extração de DNA e sequenciamento de

alto rendimento
A coleta de amostras de solo do experimento de cultivo contínuo nos diferentes tratamentos em diferentes momentos é
ilustrada na Figura 1B e na Tabela Suplementar 1. Resumidamente, três vasos foram selecionados aleatoriamente
de cada tratamento e o solo da rizosfera de pepino foi coletado de cada vaso usando um método de amostragem de
cinco pontos. Todas as amostras de solo coletadas foram divididas ao meio; metade foi utilizada para extração e
sequenciamento de DNA e a outra metade foi armazenada a -80°C para uso posterior. O
região hipervariável (V3-V4) do 16S rRNA bacteriano 71 foi amplificado usando pares de primers (F 5'-
ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' e R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'), enquanto o ITS2 fúngico foi 72 região
amplificado usando pares de primers (F 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', R 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Os

produtos amplificados por PCR foram então preparados e submetidos a sequenciamento de alto rendimento. Detalhes da
análise dos dados do amplicon são fornecidos em Métodos Suplementares.
Isolamento e identificação de bactérias cultiváveis da rizosfera do

pepino
A predição média usando o banco de dados de mídia conhecido (KOMODO)73 foi usada para as sequências de
gêneros bacterianos e OTUs que foram reguladas positivamente no tratamento FJO35, reguladas positivamente/reguladas
negativamente no tratamento SCCFo1, e aquelas que mostraram diferenças significativas durante o cultivo contínuo de
pepino. Isso foi feito para preparar meios que favorecessem seu isolamento de amostras de solo cultivadas. Os meios TSYE
(meio Tryptone Soya Yeast Extract Agar), NA (meio Nutrient Agar), BMB (meio Bacto Marine Broth), R2A (meio R2A
Agar), GYM (meio GYM Streptomyces), ISP2 (meio International Streptomyces Project No.2 ), TSB (meio Tryptone Soya
Broth) e LB (meio Luria Bertani) foram utilizados conforme descrito por Haiyambo et al. 74 . Bactérias que potencialmente
interagem com o solo da rizosfera das amostras T8, Fo8, Tr8 e TF8. O rDNA 16S Tricoderma estavam isolados do
de isolados bacterianos obtidos em cultura foi amplificado e sequenciado pela Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Pequim,
China. Sequências limpas e de alta qualidade foram submetidas a uma análise BLAST no site do NCBI (//
www.ncbi.nlm.nih.gov/).
A identificação dos isolados em nível de gênero foi baseada nos resultados da comparação de homologia (similaridade
máxima > 99,1%).
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Construção de comunidades sintéticas bacterianos-fúngicas

As cepas bacterianas foram obtidas a partir do cultivo de amostras de solo obtidas no experimento de cultivo contínuo e
combinando a identificação dos isolados com os resultados obtidos no Amplicon 16S
Sequenciamento feito em amostras de solo da rizosfera. Ao obter os mesmos táxons, uma árvore filogenética foi 75–78
construída utilizando as sequências 16SrDNA de todos os isolados bacterianos e as sequências de OTUs

diferencialmente abundantes nos diferentes tratamentos. Desta forma, foram obtidos isolados bacterianos correspondentes às
OTUs diferencialmente abundantes. Isso foi feito para obter isolados bacterianos para uso na construção da comunidade
sintética que correspondesse aos gêneros predominantes presentes nas amostras da rizosfera. Além disso, os gêneros dos
isolados bacterianos foram comparados aos táxons do microbioma central do pepino para identificar os isolados bacterianos
presentes no núcleo.
Suspensões dos gêneros bacterianos dominantes selecionados foram misturadas em volume igual (aproximadamente
8 células/L) para gerar a comunidade bacteriana sintética B4. Uma abordagem semelhante foi usada para construir 10
a comunidade sintética bacteriana B11 compreendendo uma mistura de gêneros bacterianos dominantes e centrais de pepino.
O passo final na construção das comunidades sintéticas foi a adição de uma suspensão de FJ035 (cerca de 5×10 resultando
nas comunidades sintéticas7 esporos /L) para o mesmo volume da comunidade sintética bacteriana B4 e B11,
TB4 e TB11. A eficácia do biocontrole destas comunidades sintéticas foi avaliada contra CFW em experimentos em
vasos.
Comunidades sintéticas bacterianas-fúngicas simplificadas

As bactérias foram identificadas dentro da comunidade sintética que foram reguladas positivamente com FJ035
em experimentos em vasos correspondentes. O solo dos vasos contendo mudas de pepino com sete dias de idade foi
tratado com B11 ou TB11. Cinco dias após o tratamento, as mudas de todos os tratamentos foram inoculadas com
SCCFo1. Cada tratamento foi composto por três vasos, contendo quatro plantas, e o experimento foi repetido cinco vezes.
Amostras de solo da rizosfera foram coletadas após 21 dias. Amostras de solo dos três vasos utilizados em cada tratamento
foram reunidas para obter uma única amostra. Todas as amostras de solo foram divididas ao meio; metade foi utilizada para
sequenciamento e a outra metade foi armazenada a -80°C até uso posterior. O DNA foi extraído e bibliotecas de 16SrRNA quase
completas foram preparadas seguindo o método de Pootakham et al. 79 . Resumidamente, o CTAB foi usado para extrair o DNA
do solo e o sequenciamento de amplicons 16SrRNA de comprimento quase completo usados 27F
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) / 1429R (GGTTACCTTGTTACGACTT) 56 foi realizado em uma plataforma PacBio

pela NovaSeq Technology Co., Ltd. Uma descrição detalhada dos métodos utilizados para obter as sequências quase completas
e sua análise são fornecidas nos Métodos Suplementares.
Seis isolados estreitamente relacionados em cinco gêneros bacterianos (designados como bactérias simplificadas) foram
gerar o B5 com base nos dados de sequenciamento completo de 16S rRNA e misturadosselecionados 8 células/L) para
(cerca de 10 comunidades sintéticas simplificadas bacterianas (designadas comunidade simplificada B5) . Posteriormente, o B5
comunidade foi misturada com o mesmo volume de FJ035 (aproximadamente 5 × 102 7 esporos /L) para gerar o
comunidade bacteriana-fúngica simplificada TB5.
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Efeito do FJ035 na capacidade dos gêneros bacterianos simplificados de colonizar a rizosfera do pepino
Cinco pares de primers foram projetados no site do NCBI que eram específicos para sequências genômicas presentes nos gêneros
simplificados de bactérias. Os fragmentos amplificados por PCR foram ligados a um vector T4 utilizando o kit pGM-T Cloning
(TIANGEN, China). As bactérias portadoras do vetor T4 foram cultivadas por 12 horas a 37°C em um agitador rotativo ajustado
a 180 rpm. Os plasmídeos foram extraídos, em seguida, 10 vezes de diluição gradiente foram realizadas por 7 vezes e
submetidos à detecção de q-PCR para formar a curva padrão.
80,81 Em ensaio de , as raízes das mudas de pepino com 3 semanas de idade foram divididas em duas partes. Uma parte
split-root foi inoculado com 11 ml da comunidade sintética simplificada B5. O outro lado foi inoculado com água estéril (grupo
controle) ou o mesmo volume de suspensão de esporos FJ035. A concentração final de 6 células/ml. Três dias após o tratamento,
moídas em nitrogênio líquido e submetidas à 0,2 g de raízes de pepino FJ035 no grupo de tratamento foram 1x10 foram
extração de DNA utilizando um kit comercial (TIANGEN, China).
Posteriormente, o q-PCR foi utilizado com primers específicos (Tabela Suplementar 2) para detectar a presença de DNA de
membros bacterianos da comunidade simplificada B5 que estavam presentes na rizosfera do pepino. A concentração
dos produtos de PCR resultantes foi traçada numa curva padrão, que foi então utilizada para estimar o número de cópias. Cada um
dos tratamentos amostrados foi replicado três vezes com seis mudas em cada um dos tratamentos replicados.
Controle de doenças por comunidades sintéticas

Comunidades sintéticas foram avaliadas quanto à sua capacidade de controle do CFW na Vivo em um experimento com maconha.
Mudas de pepino foram germinadas em papel filtro conforme descrito anteriormente, e 4 mudas foram transplantadas para
cada vaso (16 cm de diâmetro, 12 cm de altura) contendo 500g de solo esterilizado por vaso.
Cinco dias após a transferência das mudas, as raízes das plantas foram tratadas com 22 mL de água estéril (Controle), 11 mL
de água estéril + 11 mL de FJ035 (cerca de 5×10 11 mL de comunidades 7 esporos /L) (Tri), 11 mL de água estéril +
sintéticas B4/B11/B5 (B4, B11, B5) ou 22 mL de comunidades sintéticas STB4/STB11/TB4/TB11/TB5 (STB4, STB11,
TB4, TB11 e TB5).Cinco dias após a aplicação dos tratamentos, mudas de pepino em todas as os tratamentos foram inoculados
com suspensão de esporos SCCFo1
5 em uma concentração final de 1×10 esporos/g. As plantas foram então cultivadas durante 21 dias, após os quais foram
registados dados sobre altura da planta, diâmetro do caule, peso fresco da planta e índice de doença. A população de no
Tricoderma spp. e três Fusarium oxysporum solo também foi calculada. Cada tratamento foi repetido
vezes com três vasos (4 plantas por vaso)/tratamento.
Avaliação da atividade antifúngica, promoção do crescimento e efeitos de competição de nutrientes dos gêneros de bactérias
simplificadas,
O efeito inibitório dos gêneros de bactérias simplificadas contra SCCFo1 e FJ035 foi avaliado utilizando meio TSB (Tryptic Soy
Broth) em um teste de confrontação de colônias em placas ou culturas 82 . O teste utilizou bactérias
bacterianas líquidas resultantes da fermentação. A competição de nutrientes entre
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os gêneros de bactérias simplificados e SCCFo1/FJ035 foram avaliados usando meio contendo pouco solúvel
fosfato e feldspato potássico, e era isento de nitrogênio 83 , respectivamente. A capacidade de simplificação
gêneros bacterianos para solubilizar fosfato e produzir IAA e celulase também foram determinados. O
presença de genes codificadores com supostas funções de promoção de crescimento no genoma de seis simplificados
gêneros bacterianos também foram avaliados 84 .
Efeito da comunidade bacteriano-fúngica simplificada na expressão de resistência a doenças e genes relacionados ao

crescimento em pepino
Um experimento em vaso foi conduzido para determinar o efeito da comunidade bacteriano-fúngica simplificada sobre
a expressão de genes associados à resistência a doenças e ao crescimento do pepino. Mudas de pepino
foram germinados e transplantados conforme descrito anteriormente. Foram realizados quatro tratamentos com 22 mL de
água estéril (Controle), 11 mL de água estéril + 11 mL de SCCFo1 (Fo), 11 mL de água estéril + 11 mL de
TB5 (TB5), ou 11 mL de SCCFo1 + 11 mL de TB5 (TB5-FO), utilizando cinco vasos (4 plantas/vaso) por tratamento e
o experimento foi repetido três vezes. Cinco dias após a aplicação dos tratamentos SCCFo1
aplicado ao solo (5 mL de uma suspensão líquida de esporos de SCCFo1 (1 x 107 esporos/ml) por vaso) e este
foi designado como 0h. Raízes de pepino nos quatro tratamentos foram coletadas em múltiplos momentos: 0 h,
12h, 24h, 48h e 72h. Duas mudas foram amostradas do mesmo vaso em cada momento e agrupadas para
representam uma amostra. Um total de 60 amostras (4 tratamentos x 3 repetições x 5 pontos no tempo) foram coletadas.
O nível de expressão dos genes da enzima antioxidante do pepino (genes SOD , CAT e POD ) 85, relacionado com a defesa
NPR-1
enzimáticos (SA: e genes (IAA:, eJÁ: LOX-1
gene e LOX2 , ETH: EIN2
de referência) EIN-3 ) e relacionados ao hormônio de crescimento vegetal
GH3 SAUR , CTK: ARR9 ) 86 foram avaliados usando RT-qPCR com 18SrDNA servindo como
87 (Tabela Suplementar 2). As restantes plantas de pepino foram cultivadas num total de 21
dias após a inoculação com SCCFo1 e dados sobre severidade da doença, altura da planta, diâmetro do caule e planta fresca
peso foi avaliado.
análise estatística
As análises de bioinformática foram realizadas em R-4.0.3. Teste t de Welch ou Wilcoxon e Benjamini-Hochberg
FDR foram usados para determinar diferenças significativas na abundância taxonômica entre grupos no gênero
ou nível OTUs com STAMP v.2.0.0 88 e Metastats (http://cbcb.umd.edu/software/metastats). Linha

A Análise Discriminante (LDA) foi usada para identificar diferenças significativas em nível de gênero entre
diferentes tratamentos no sétimo e oitavo ciclo de plantio utilizando LefSe (Line Discriminant Analysis
(LDA) Tamanho do efeito)
89, e LDA> 4. A análise de variância unidirecional (ANOVA) foi realizada com SPSS
software v.24.0.
Declarações
Reconhecimentos
Página 19/36
Agradecemos ao Prof. Michael Wisniewski (Instituto Politécnico e Universidade Estadual da Virgínia, Blacksburg, VA,
EUA) pela leitura crítica do manuscrito. O financiamento para este estudo foi fornecido pelo National
Projeto do Fundo Juvenil da Natural Science Foundation (número de concessão: 32302438).
Contribuições do autor
TL, RW e MZ conceberam e desenharam o estudo. MZ, XZ, SR e HJ coletaram as amostras e

realizou a experimentação em estufa, trabalho de laboratório, análise de dados e visualização. MZ, XZ, HJ,
YW, FY e XY contribuíram para a extração de RNA e desempenho de Qpcr. MZ e RAAK escreveram o
manuscrito. TL e RW contribuíram substancialmente para revisões, supervisão e discussão.
Interesses competitivos
Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
Correspondências e solicitações de materiais devem ser endereçadas ao Prof. Tong Liu
Referências
1. Pantigoso, HA, Newberger, D. & Vivanco, JM O microbioma da rizosfera: planta-microbiana
interações para aquisição de recursos. em Diário de Microbiologia Aplicada vol. 133 2864–2876 Pré-impressão
https://doi.org/10.1111/jam.15686 (2022).
2. Korenblum, E., Massalha, H. & Aharoni, A. Interações planta-micróbio na rizosfera através de uma circular
economia metabólica. Plantar Célula vol. 34 3168–3182 Pré-impressão em https://doi.org/10.1093/plcell/koac163
(2022).
3. Lu, T. et al. Os microrganismos da rizosfera podem influenciar o momento da floração das plantas. Microbioma 6,
(2018).
4. Ajilogba, CF, Olanrewaju, OS & Babalola, OO O estágio de crescimento da planta impulsiona o tempo e
Dinâmica Espacial do Microbioma Bacteriano na Rizosfera de 13, (2022). Vigna subterrânea . Frente
Microbiol
5. Wei, Z. et al. Imunidade à rizosfera: Visando o subsolo para uma saúde vegetal sustentável
gerenciamento. Fronteiras de Ciências Agrárias e Engenharia vol. 7 317–328 Pré-impressão em

https://doi.org/10.15302/J-FASE-2020346 (2020).
6. Jiang, G. et al. Explorando transplantes de rizomicrobioma como uma ferramenta para proteção do microbioma vegetal
manipulação. Comunicações ISME 2, (2022).
7. Philippot, L., Raaijmakers, JM, Lemanceau, P. & Van Der Putten, WH Voltando às raízes: O
ecologia microbiana da rizosfera. https://doi.org/ Nature analisa microbiologia vol. 11 789–799 Pré-impressão em
10.1038/nrmicro3109 (2013).
8. Raaijmakers, JM & Mazzola, M. ECOLOGIA. Respostas imunológicas do solo. Ciência (1979) 352, 1391–
1392 (2016).
Página 20/36
9. Orozco-Mesquita, M. del C., Fadiji, AE, Babalola, OO, Glick, BR & Santoyo, G. Rhizobiome
engenharia: revelando interações complexas da rizosfera para melhorar o crescimento e a saúde das plantas.
Pesquisa Microbiológica vol. 263 Pré-impressão em https://doi.org/10.1016/j.micres.2022.127137 (2022).
10. Mahmud, K. et al. Manipulação do microbioma da rizosfera para produção agrícola sustentável. Atual
Plantar Biologia vol. 27 Pré-impressão em https://doi.org/10.1016/j.cpb.2021.100210 (2021).
11. Kumar, A. & Dubey, A. Microbioma da rizosfera: Engenharia de competitividade bacteriana para melhorar
produção agrícola. Diário de Pesquisa Avançada vol. 24 337–352 Pré-impressão em
https://doi.org/10.1016/j.jare.2020.04.014 (2020).
12. Ahkami, AH, Allen White, R., Handakumbura, PP e Jansson, C. Engenharia da rizosfera:
Aumentar a produtividade sustentável do ecossistema vegetal. Rizosfera vol. 3 233–243 Pré-impressão em
https://doi.org/10.1016/j.rhisph.2017.04.012 (2017).
13. Zuluaga, MYA et al. A inoculação com bactérias promotoras de crescimento de plantas altera a rizosfera
funcionamento das plantas de tomate. Aplicado Solo Ecologia

158, (2021).
14. Compant, S., Samad, A., Faist, H. & Sessitsch, A. Uma revisão sobre o microbioma vegetal: Ecologia,
funções e tendências emergentes na aplicação microbiana. Diário de Pesquisa Avançada vol. 19 29–
37 Pré-impressão em https://doi.org/10.1016/j.jare.2019.03.004 (2019).
W. remodelando et al. A aplicação de biofertilizantes induz a supressividade do solo contra 15. Xiong, Fusarium doença murcha
o microbioma do solo. Solo Biol Bioquímica 114, 238–247 (2017).
16. Hu, J. et al. A introdução de consórcios de bactérias probióticas promove o crescimento das plantas através de impactos no
microbioma residente da rizosfera. (2021). Processo do Real Sociedade B: Ciências Biológicas 288,
17. Mãe, KW et al. Coordenação da homeostase micróbio-hospedeiro por crosstalk com imunidade inata da planta.
Nat Plantas 7, 814–825 (2021).
18. Durán, P. et al. Interações microbianas entre reinos nas raízes promovem a sobrevivência da Arabidopsis. Célula 175,
973-983.e14 (2018).
19. Gordon, TR Revisão Anual de Fitopatologia Fusarium oxysporum ea Fusarium Murcha
Síndrome. (2017) doi:10.1146/annurev-phyto-080615.
20. Finkel, OM 587, et al. Um único gênero bacteriano mantém o crescimento das raízes em um microbioma complexo. Natureza
103–108 (2020).
21. Gao, X. et al. A resistência à murcha de Fusarium do pepino induzida pelo cultivo consorciado com aipo difere de
aquela induzida pelo genótipo do pepino e está relacionada a aleloquímicos contendo enxofre. 271, (2020). Ciência Hortic
22. Baum, C., El-Tohamy, W. & Gruda, N. Aumentando a produtividade e a qualidade do produto vegetal
Culturas utilizando fungos micorrízicos arbusculares: uma revisão. Scientia Horticulturae vol. 187 131–141 Pré-impressão
em https://doi.org/10.1016/j.scienta.2015.03.002 (2015).
23. Wang, F., Wang, X. & Song, N. Biochar e vermicomposto melhoram as propriedades do solo e o rendimento
e qualidade do pepino (anos Cucumis sativus L.) cultivado em solo de galpão de plástico continuamente cultivado para
diferentes. Agrícola Ambiente Ecossistêmico 315, (2021).
Página 21/36
24. Ali, A. et al. Diferentes sistemas de cultivo regulam as capacidades metabólicas e o potencial ecológico
funções alteradas pela estrutura do microbioma do solo no galpão de plástico com pepino monocultivado
rizosfera. 318, (2021).
Agrícola Ambiente Ecossistêmico
25. Tian, Y., Wang, Q., Zhang, W. & Gao, L. Reduzindo o risco ambiental de solos excessivamente fertilizados e
Caragana
melhorando o crescimento do pepino por meio microphylla
da aplicação do de palha em longo prazo
de composto
sistemas de cultivo contínuo. Ciência Total Ambiente 544, 251–261 (2016).
26. Zhao, Y. et al. A aplicação de Bacillus Megaterium altera a composição da comunidade microbiana do solo,
biodisponibilidade de fósforo e potássio no solo e crescimento de pepino no sistema de galpão de plástico

do Norte da China. 307, (2021).
Agrícola Ambiente Ecossistêmico
27. Woo, SL, Hermosa, R., Lorito, M. & Monte, E. Tricoderma : um polivalente, benéfico para as plantas
microrganismo para uma agricultura eco-sustentável. Nature analisa microbiologia vol. 21 312–326
Pré-impressão em https://doi.org/10.1038/s41579-022-00819-5 (2023).
28. Saravanakumar, K. et al. Efeito de Trichoderma harzianum no microbioma da rizosfera do milho e

biocontrole da podridão do caule de Fusarium.
Ciência Representante 7, (2017).
29. Yuan, X. et al. Desenvolvimento de supressividade do solo mediada por fungos contra a doença da murcha de Fusarium
via manipulação de resíduos vegetais. Microbioma 9, (2021).
de 30. Tao, et al. Interações aditivas com fungos impulsionam o biocontrole Fusarium doença murcha. Novo Fitólogo
C. 238, 1198–1214 (2023).
31.Li, Y. et al. Efeitos de diferentes anos de cultivo contínuo na comunidade bacteriana e na diversidade de
Solo de rizosfera de pepino em estufa solar. Atual Microbiol 78, 2380–2390 (2021).
32. Jiao, S., Yang, Y., Xu, Y., Zhang, J. & Lu, Y. Equilíbrio entre processos de assembleia comunitária
medeia a coexistência de espécies em microbiomas de solos agrícolas em todo o leste da China. 14, 202– Revista ISME
216 (2020).
33. Liu, Q. et al. Respostas das comunidades bacterianas e fúngicas do solo à monocultura de longo prazo de
videira. Aplicativo Microbiol Biotecnologia 105, 7035–7050 (2021).
34. Liu, X. & Zhang, Y. Explorando as comunidades de bactérias, fungos e oxidantes de amônia em
Aplicado Solo Ecologia
rizosfera de pepino com efeito de estufa doente com Fusarium. 161, (2021).
35. Kinkel, LL, Schlatter, DC, Bakker, MG & Arenz, BE Competição e co-evolução de Streptomyces em
relação à supressão de doenças de plantas. Res. Microbiol 163, 490–499 (2012).
36. Cheng, C., Wang, R., Sun, L., He, L. & Sheng, X. Resistente ao cádmio e arginina descarboxilase-sp. C40 diminui o
produzindo Cliangyou 513 Esfingomonas acúmulo de cádmio no arroz hospedeiro ( 275, (2021). Oryza
sativa endofítico). Quimosfera
37. Li, X. et al. Estaurosporina do endofítico Streptomyces sp. cepa CNS-42 atua como um potencial
agente de biocontrole e elicitor de crescimento em pepino. Antonio van Leeuwenhoek, Jornal Internacional de
Geral e Microbiologia Molecular 106, 515–525 (2014).
38. Islam, S., Akanda, AM, Prova, A., Islam, MT & Hossain, MM Isolamento e identificação de plantas
Rizobactérias promotoras de crescimento da rizosfera de pepino e seu efeito no crescimento das plantas
Promoção e Supressão de Doenças. Microbiol Frontal 6, (2016).
Página 22/36
39. Chai, CH, Hong, CF & Huang, JW Identificação e Caracterização de um Multifuncional

Agente de Biocontrole,Streptomyces griseorubiginosus LJS06, Contra Antracnose de Pepino. Frente
Microbiol 13, (2022).
Yang, M. contra et al. Wuyiencin produzido por 40. Streptomyces albulus CK-15 exibe atividades de biocontrole
o oídio do pepino. J. Aplicativo Microbiol 131, 2957–2970 (2021).
41. Zhang, F., Xu, X., Wang, G., Wu, B. & Xiao, Y. como Medicago sativa e respostas do microbioma do solo a
Tricoderma biofertilizante em solos alcalinos-salinos. Aplicado Solo Ecologia 153, (2020).
42. Macías-Rodríguez, L., Contreras-Cornejo, HA, Adame-Garnica, SG, del-Val, E. & Larsen, J. The
interações de Tricoderma em múltiplos níveis tróficos: comunicação entre reinos. vol. 240 Pré- Microbiológico
Pesquisar impressão em https://doi.org/10.1016/j.micres.2020.126552 (2020).
43. Risoli, S. al. Trichodermaet -Resistência induzida a Botrytis cinerea em espécies de Solanum: A Meta- 11, (2022).
Análise. Plantas
44. Pang, G. al. Trichodermaet -fertilizante orgânico enriquecido pode mitigar a degeneração do microbioma de
solo monocultivo para manter um melhor crescimento das plantas.Plantar Solo 416, 181–192 (2017).
45. Larkin, RP & Fravel, DR Eficácia de vários organismos de biocontrole fúngicos e bacterianos para controle
de Fusarium Murcha de tomate. Plantar Doença 82, 1022–1028 (1998).
46. De Boer, M., Van Der Sluis, I., Van Loon, LC & Bakker, PAHM Combinando fluorescente
Pseudomonas spp. cepas para aumentar a supressão da murcha de fusarium do rabanete. Jornal Europeu de
Plantar Patologia vol. 105 (1999).
47. Niu, B., Paulson, JN, Zheng, X. & Kolter, R. Comunidade bacteriana simplificada e representativa de
raízes de milho. Processo Nacional Acadêmico Ciência você S A 114, E2450–E2459 (2017).
48. Lebeis, SL et al. O ácido salicílico modula a colonização do microbioma radicular por bactérias específicas
taxa. Ciência (1979) 349, 860–864 (2015).
49. Xu, J. et al. A estrutura e função do microbioma global da rizosfera cítrica. Nat comum 9,
(2018).
50. Chang, J. o et al. A aquisição de recursos de nitrogênio, manganês, ferro e carbono são funções potenciais de
arroz selvagem Oryza rufipogon rizomicrobioma central. Microbioma 10, (2022).
51. Zhou, X. et al. A microbiota sintética entre reinos apoia a supressão do tomate de 13, (2022). Fusarium murchar
doença. Nat comum
52. Dawson, W., Hör, J., Egert, M., van Kleunen, M. & Peste, M. Um pequeno número de bactérias de baixa abundância
dominam as respostas específicas das espécies de plantas durante a colonização da rizosfera. Microbiol Frontal 8, (2017).
53. Veach, AM et al. Os microbiomas da rizosfera divergem entre Populus trichocarpa planta hospedeira
genótipos e quimiotipos, mas isso depende da origem do solo. Microbioma 7, (2019).
54. Izquierdo-García, LF, González-Almario, A., Cotes, AM e Moreno-Velandia, CA Trichoderma virens

Gl006 e Bacillus velezensis Bs006: uma interação compatível controlando a murcha do cabo Fusarium
groselha. Ciência Representante 10, (2020).
Página 23/36
Kumar, M. et al. Efeito sinérgico de 55. Pseudomonas putida e Bacillus amyloliquefaciens

melhora o estresse hídrico no grão de bico ( Cicer arietinum EU.). Plantar Sinal Comportar-se 11, (2016).
Z. ativando et al. Uma comunidade sintética simplificada resgata 56. Li, Astrágalo mongholicus da doença da podridão radicular
a resistência sistêmica induzida por plantas. Microbioma 9, (2021).
57. Briard, B., Heddergott, C. & Latgé, JP Compostos voláteis emitidos por pseudomonas aeruginosa
estimular o crescimento do patógeno fúngico aspergillus fumigatus. mBio 7, (2016).
58. Spaepen, S., Vanderleyden, J. & Remans, R. Ácido indol-3-acético na sinalização microbiana e microorganismo-planta. vol.
31 425–448 Pré-impressão em de Microbiologia FEMS
Avaliações
https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00072.x (2007).
59. Awais, M. da et al. Isolamento, caracterização e inter-relação de bactérias solubilizadoras de fosfato
rizosfera da cana-de-açúcar e do arroz. Biocatal Agrícola Biotecnologia 11, 312–321 (2017).
60. Gimenez-Ibanez, S., Chini, A. & Solano, R. Como os micróbios torcem a sinalização de jasmonato em torno de seus pequenos
dedos. Plantas 5, 323–329 (2016).
61. Mohammed, melhor amigo et al. Aprovação do método de biocontrole da murcha da batata causada por Ralstonia
solanacearum (Smith) utilizando Enterobacter cloacae PS14 e 30, (2020). Trichoderma asperellum T34. Egito J.
Biol Praga Ao controle
62. Badri, DV & Vivanco, JM Regulação e função de exsudados radiculares. Plantar Célula Meio Ambiente 32, 666-681
(2009).
63. Lombardi, N. et al. Exsudados radiculares de plantas estressadas estimulam e atraem Tricoderma fungos do solo.
Interações moleculares planta-micróbio 31, 982–994 (2018).
64. Stringlis, IA et al. A exsudação de cumarina dependente de MYB72 molda a montagem do microbioma radicular para
Processo Nacional Acadêmico Ciência você S A 115, E5213–E5222 (2018).
promove a saúde das plantas.
65. Oku, S., Komatsu, A., Nakashimada, Y., Tajima, T. & Kato, J. Identificação de pseudomonas
proteínas sensoriais de quimiotaxia fluorescens para malato, succinato e fumarato, e seu envolvimento
na colonização radicular. Ambiente de micróbios 29, 413–419 (2014).
66. Leslie, JF & Summerell, BA O manual de laboratório fusarium . (Pub Blackwell, 2006).
67. Zhou, HM f. sp. et al. Pesquisa sobre método de inoculação e herança de resistência a Fusarium
oxysporum cucumerinum em pepino. Acta Agric. Boreali-Sinica 186–190 (2010).
68. Liu, L., Kloepper, JW & Tuzun S. Indução de resistência sistêmica em Pepino contra Fusarium
murcha por rizobactérias promotoras de crescimento de plantas. Fitopatologia 695–698 (1995).
69. Pernilla Brinkman, E., Van der Putten, WH, Bakker, EJ & Verhoeven, KJF Feedback planta-solo:
Abordagens experimentais, análises estatísticas e interpretações ecológicas. 1063–1073 (2010). Diário de Ecologia 98,
70. van de Voorde, TFJ, van der Putten, WH & Bezemer, TM O método de inoculação do solo determina o
força das interações planta-solo. Solo Biol Bioquímica 55, 1–6 (2012).
71. Ali, A. et al. Substrato de alho induz o desenvolvimento do crescimento do pepino e diminui a murcha de fusarium
através da regulação da estrutura e diversidade da comunidade microbiana do solo em solo perturbado replantado. Interno
Página 24/36
J. Mol Ciência
21, 1–20 (2020).
72. Mesnage, R. e et al. Glifosato e suas formulações Roundup Bioflow e RangerPro alteram bactérias
composição da comunidade fúngica no microbioma do ceco de rato. Microbiol Frontal 13, (2022).
73. Oberhardt, MA pares et al. Aproveitando a paisagem dos meios de cultura microbiana para prever novos organismos-
de mídia. Nat comum 6, (2015).
74. Haiyambo, DH, Chimwamurombe, PM & Reinhold-Hurek, B. Isolamento e Triagem de

Bactérias da rizosfera de gramíneas na região de East Kavango, na Namíbia, para promoção do crescimento das plantas
Características. 71, 566–571
Atual Microbiol
(2015).
75. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree of Life (iTOL) v4: Atualizações recentes e novos desenvolvimentos. 47, (2019). Nucléico
Ácidos Res.
76. Chernomor, O., Von Haeseler, A. & Minh, BQ Terrace Aware Estrutura de dados para filogenômica
Inferência de Supermatrizes. Sistema Biol 65, 997–1008 (2016).
77. Nguyen, LT, Schmidt, HA, Von Haeseler, A. & Minh, BQ IQ-TREE: Um estocástico rápido e eficaz
algoritmo para estimar filogenias de máxima verossimilhança. Mol Biol Evol 32, 268–274 (2015).
78. Edgar, RC Conjuntos de alinhamento de alta precisão permitem avaliações imparciais de sequência
homologia e filogenia. (2022) doi:10.1101/2021.06.20.449169.
79. Pootakham, W. et al. Perfil de alta resolução de comunidades bacterianas associadas a corais usando full-
dados de sequência de rRNA de comprimento 16S do sistema de sequenciamento PacBio SMRT.

Ciência Representante 7, (2017).
80. Liu, Y. et al. Identificação de compostos secretados pelas raízes envolvidos na comunicação entre
pepino, o patógeno benéfico e transmitido ,

pelo solo 30, 53–62 (2017).
Bacillus amyloliquefaciens Fusarium
oxysporum . Interações moleculares planta-micróbio
81.Jin, X. et al. Biochar estimula as raízes do tomate a recrutar uma assembleia bacteriana contribuindo para
resistência a doenças contra a murcha de Fusarium. iMeta 1, (2022).
82. Zhan, X. et al. Controle da podridão pós-colheita do caule da manga por metabólitos antifúngicos de
Trichoderma pinnatum LS029-3. Ciência Hortic 310, (2023).
83. Choi, K., Khan, R. & Lee, SW Dissecção da microbiota vegetal e interações planta-microbioma.
Diário de Microbiologia vol. 59 281–291 Pré-impressão em https://doi.org/10.1007/s12275-021-0619-5
(2021).
84. Qu, Q. et al. Montagem do microbioma da rizosfera e seu impacto no crescimento das plantas. Diário de
Agrícola e Comida Química vol. 68 5024–5038 Pré-impressão em

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c00073 (2020).
85. Zhang, sistemas et al. A melatonina promove a germinação das sementes sob alta salinidade, regulando os antioxidantes
HJ, interação ABA e GA4 em pepino ((2014). Cucumis sativus EU.). J. Pineal Res. 57, 269-279
86.Tian, Y. et al. Mecanismos de promoção do crescimento do pepino pelo fungo endofítico
Chaetomium globosum Estirpe ND35. Diário de Fungos 8, (2022).
Página 25/36
87.Tang, L. et al. O FgEch1 mitocondrial é responsável pela conidiação e virulência total em 66, 361– Fusarium
graminearum . Atual Geneta 371 (2020).
88. Parks, DH, Tyson, GW, Hugenholtz, P. & Beiko, RG STAMP: Análise estatística de dados taxonômicos e
perfis funcionais. Bioinformática 30, 3123–3124 (2014).
89. Segata, N. et al. Descoberta e explicação de biomarcadores metagenômicos. Genoma Biol 12, (2011).
Figuras
Página 26/36
figura 1
Sistema de cultivo contínuo de solo usado em estufa para cultivo de pepino
cujos solos foram inoculados com Fusarium oxysporum SCCFo1. R: A incidência do pepino Fusarium
murcha (CFW) no campo e uma cultura F. oxysporum SCCFo1. B -C: Diagrama do desenho experimental
utilizada no sistema de cultivo contínuo para cultivo de pepino (B) e o índice de doença para CFW no
Página 27/36
diferentes grupos de tratamento (C). Os quatro grupos de tratamento foram tratamento com água Tricoderma
estéril (T), tratamento FJ035 (Tr), tratamento SCCFo1 (Fo), tratamento SCCFo1+FJ035 (TF). Números (1-11) a seguir
5 6
o nome do tratamento indica o número do ciclo de plantio, SCCFo1~ 10 esporos/g esporos/g solo, FJ035~ 10
solo. Os dados representam as médias ± erro padrão (médias ± SE).
Figura 2
Página 28/36
Dados obtidos no experimento de transferência de microbioma da rizosfera sobre o desempenho de mudas de pepino e
estrutura da comunidade microbiana do solo. A: Diagrama esquemático do experimento de transferência, no qual o
o inóculo do solo na rizosfera foi de 5% do volume total do solo. B: peso fresco da planta e índice de doença CFW
em vasos de pepinos cujos solos foram inoculados com água estéril (Controle), SCCFo1 (Fo),
SCCFo1+FJ035+ solo TF9 esterilizado (S-Tr), ou SCCFo1+FJ035+ solo TF9 não esterilizado (A-Tr). C: Diretor
gráfico de análise de coordenadas (PCoA) baseado na distância de Bray-Curtis e diversidade alfa de bactérias e fungos
estrutura da comunidade no solo da rizosfera do sistema de cultivo contínuo de pepino em estufa
cultivo. D: Algumas diferenças nos gêneros bacterianos identificados nos diferentes cultivos contínuos
grupos de tratamento. Os diferentes grupos de tratamento são designados como; controle – tratamento de água estéril (T),
T. asperelo Tratamento FJ035 (Tr), F. oxysporum Tratamento SCCFo1 (Fo) e tratamento SCCFo1 + FJ035
5
(TF). Os números após um tratamento indicam o número de ciclos de plantio (1-11), SCCFO1-10 esporos /g
solo e FJ035-10 6
esporos/g solo. Os dados quantitativos representam as médias ± EP (n = 12). Diferente
letras minúsculas acima das barras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre os grupos de tratamento, conforme
determinado por ANOVA.
Página 29/36
Figura 3
A construção de comunidades sintéticas bacteriano-fúngicas e avaliação da sua eficácia contra CFW.

A: Diagrama de fluxo da metodologia utilizada para construir o sintético bacteriano e bacteriano/fúngico
comunidades. BE: Efeito de diferentes tratamentos no crescimento e resistência a doenças CFW em pepino.
Altura da planta (B), diâmetro do caule (C), massa fresca da planta (D) e índice de doença CFW (E). FG: T.
asperelo Número de colônias nos diferentes solos (F) e o númeroFusarium
de oxysporum colônias no solo
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(G) de mudas de pepino com 33 dias de idade. H: fenótipo de plantas de pepino com 15 dias de idade crescendo em diferentes
tratamentos do solo. Mudas de pepino foram cultivadas em solos inoculados com água estéril (Controle), FJ035
(Tri), comunidade bacteriana sintética B4 (B4), TB4 (TB4), B11 (B11), TB11 (TB11), sintética inativada
comunidade bacteriana B4+FJ035 (STB4), ou comunidade bacteriana sintética inativada B11+FJ035 (STB11)
e então inoculados com esporos F. oxysporum 5
SCCFo1 (~10 esporos/g solo). Dados quantitativos
representando as médias ± SE (n =12). Diferentes letras minúsculas acima das barras indicam um valor significativo
diferença (p < 0,05) entre os grupos de tratamento conforme determinado pela ANOVA.
Página 31/36
Figura 4
Simplificação da comunidade sintética bacteriano-fúngica e seu impacto no crescimento do pepino e

resistência ao CFW. A: Diagrama de fluxo da metodologia utilizada para construir o sintético simplificado
comunidades. B: Impacto dos diferentes tratamentos na altura da planta, diâmetro do caule, massa fresca da planta e
o índice de doença CFW de mudas de pepino com 33 dias de idade. Mudas de pepino foram inoculadas com
T. asperellum
água estéril (Controle), FJ035 (Tri), comunidade sintética TB11 (TB11) ou simplificada
comunidade TB5 (TB5). Após a aplicação dos tratamentos de solo, os solos foram ainda inoculados com F.
5
oxysporum SCCFo1 (~10 esporos/g de solo). Os dados quantitativos representam as médias ± EP (n = 12). Diferente
letras minúsculas acima das barras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre os grupos de tratamento, conforme
determinado por ANOVA.
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Figura 5
Ensaio de raiz dividida para determinar o efeito de FJ035 na colonização de raízes de pepino pelos
gêneros bacterianos que compõem a comunidade sintética simplificada. A: Representação esquemática do
ensaio de raiz dividida em que um lado foi inoculado com a comunidade bacteriana sintética simplificada e
o outro lado foi inoculado com água estéril (CK) ou FJ035 (Tri). B: Número de amplicons dos cinco gêneros
de bactérias simplificadas obtidos de amostras de rizosfera de pepino no teste de raiz dividida (CK vs. Tri).
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Os dados quantitativos representam as médias ± SE (n = 6). Diferentes letras minúsculas acima das barras indicam
uma diferença significativa (p <0,05) entre os níveis de colonização pelo gênero bacteriano indicado nos grupos de
tratamento controle vs. FJ035, conforme determinado pela ANOVA.
Figura 6
Página 34/36
Atividade antifúngica das cepas bacterianas simplificadas contra Trichoderma asperellum FJ035 e Fusarium
oxysporum SCCFo1. AB: O efeito das colônias físicas de cepas bacterianas simplificadas (A) e
caldo de fermentação das cepas bacterianas simplificadas (B) sobre o crescimento de FJ035 e SCCFo1. C: Colônia
tamanho de FJ035 e SCCFo1 em placas de confronto utilizando as diferentes cepas de bactérias simplificadas e
um controle. Os dados quantitativos representam as médias ± SE (n = 3). Diferentes letras minúsculas acima das barras
indicam uma diferença significativa (p <0,05) conforme determinado por ANOVA entre o tamanho da colônia de FJ035 ou
SCCFo1 quando cultivado com cepas individuais das cepas bacterianas simplificadas em placas de confronto.
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Figura 7
Efeito da inoculação do solo com a comunidade bacteriana sintética simplificada TB5 na via de sinalização do pepino, no crescimento
da planta e na expressão gênica relacionada à resistência a doenças no pepino, bem como no crescimento e na resistência ao
CFW. AK: Expressão de genes de enzimas antioxidantes, genes de enzimas relacionadas à defesa e genes relacionados a
hormônios vegetais em raízes de pepino após inoculação de solos com água estéril (Controle), SCCFo1 (Fo), comunidade
bacteriana sintética simplificada TB5 (TB5) ou TB5+ SCCFo1 (TB5-FO). L: altura da planta, diâmetro do caule, massa fresca da
planta e índice de doença CFW em mudas de pepino com 33 dias de idade após inoculação dos solos com os respectivos tratamentos.
Os dados quantitativos representam as médias ± EP (n = 10).
Diferentes letras minúsculas acima das barras indicam uma diferença significativa (p < 0,05) entre os diferentes tratamentos conforme
determinado pela ANOVA.
Arquivos Suplementares
Esta é uma lista de arquivos suplementares associados a esta pré-impressão. Clique para fazer o download.
SupplementaryFile1abacteria.xlsx
SupplementaryFile1bfungi.xlsx
SupplementaryFile2a.xlsx
SupplementaryFile2b.xlsx
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Reestruturação do microbioma da rizosfera do pepino induzida

Raja Asad Ali Khan

Data de postagem: 27 de outubro de 2023

Declarações Adicionais: NÃO HÁ INTERESSES CONCORRENTES.

aplicação e avaliação de comunidades microbianas sintéticas (SynComs) é essencial para confirmar

funcionamento do microbioma e interações microbioma-planta 17,18 . Extração e cultivo de microorganismos

Fusarium murcha, causada pelo patógeno transmitido pelo solo

comunidade sintética bacteriano-fúngica foi construída e então

Eficácia de T. asperellum FJ035 contra CFW durante cultivo contínuo de pepino

Efeito do microbioma da rizosfera no biocontrole

Efeito de T. asperellum FJ035 e F. oxysporum SCCFo1 na composição da rizosfera

Dados taxonômicos indicaram que Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria e

Eficácia de montagem e biocontrole de bactérias e

As comunidades sintéticas bacterianas B4 e B11 e as comunidades bacterianas-fúngicas combinadas TB4 e TB11

Simplificação de comunidades sintéticas bacterianos-fúngicas

respectivamente. A cepa B1-9 foi mais intimamente relacionada ao OTU19 e Ensifer

6,66%, 12,16% e 5,31%, respectivamente (fig. 5B).

oxysporum (Figs. Complementares 2 e 3).

porção do cluster de genes Todas as cepas bacterianas,

comunidade bacteriana sintética na indução de resistência a doenças e promoção do crescimento de plantas em

bactérias benéficas diminuíram durante o cultivo contínuo de pepinos e um aumento progressivo na

O presente estudo demonstra o potencial significativo de manipulação de bactérias da rizosfera

Preparo do solo e planejamento experimental de experimentos em

Transferência do microbioma do solo TF8 para um novo solo

Coleta de amostras de solo, extração de DNA e sequenciamento de

ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' e R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'), enquanto o ITS2 fúngico foi 72 região

amplificado usando pares de primers (F 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', R 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Os

Isolamento e identificação de bactérias cultiváveis da rizosfera do

Construção de comunidades sintéticas bacterianos-fúngicas

construída utilizando as sequências 16SrDNA de todos os isolados bacterianos e as sequências de OTUs

Comunidades sintéticas bacterianas-fúngicas simplificadas

(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) / 1429R (GGTTACCTTGTTACGACTT) 56 foi realizado em uma plataforma PacBio

comunidade bacteriana-fúngica simplificada TB5.

Controle de doenças por comunidades sintéticas

Broth) em um teste de confrontação de colônias em placas ou culturas 82 . O teste utilizou bactérias

bacterianas líquidas resultantes da fermentação. A competição de nutrientes entre

Efeito da comunidade bacteriano-fúngica simplificada na expressão de resistência a doenças e genes relacionados ao

ou nível OTUs com STAMP v.2.0.0 88 e Metastats (http://cbcb.umd.edu/software/metastats). Linha

TL, RW e MZ conceberam e desenharam o estudo. MZ, XZ, SR e HJ coletaram as amostras e

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Correspondências e solicitações de materiais devem ser endereçadas ao Prof. Tong Liu

gerenciamento. Fronteiras de Ciências Agrárias e Engenharia vol. 7 317–328 Pré-impressão em

manipulação. Comunicações ISME 2, (2022).

funcionamento das plantas de tomate. Aplicado Solo Ecologia

37 Pré-impressão em https://doi.org/10.1016/j.jare.2019.03.004 (2019).

o microbioma do solo. Solo Biol Bioquímica 114, 238–247 (2017).

19. Gordon, TR Revisão Anual de Fitopatologia Fusarium oxysporum ea Fusarium Murcha

Síndrome. (2017) doi:10.1146/annurev-phyto-080615.

diferentes. Agrícola Ambiente Ecossistêmico 315, (2021).

sistemas de cultivo contínuo. Ciência Total Ambiente 544, 251–261 (2016).

biodisponibilidade de fósforo e potássio no solo e crescimento de pepino no sistema de galpão de plástico

Pré-impressão em https://doi.org/10.1038/s41579-022-00819-5 (2023).

28. Saravanakumar, K. et al. Efeito de Trichoderma harzianum no microbioma da rizosfera do milho e

via manipulação de resíduos vegetais. Microbioma 9, (2021).

C. 238, 1198–1214 (2023).

videira. Aplicativo Microbiol Biotecnologia 105, 7035–7050 (2021).

39. Chai, CH, Hong, CF & Huang, JW Identificação e Caracterização de um Multifuncional

doença. Nat comum

genótipos e quimiotipos, mas isso depende da origem do solo. Microbioma 7, (2019).

54. Izquierdo-García, LF, González-Almario, A., Cotes, AM e Moreno-Velandia, CA Trichoderma virens

Kumar, M. et al. Efeito sinérgico de 55. Pseudomonas putida e Bacillus amyloliquefaciens

a resistência sistêmica induzida por plantas. Microbioma 9, (2021).