ARTUR OLIVEIRA CARVALHO

MICRORGANISMOS EFICIENTES (EM) - PROSPECÇÃO

PARA AUMENTO DA TAXA DE GERMINAÇÃO E

PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE TOMATE

SÃO PAULO

2023
 ARTUR OLIVEIRA CARVALHO

MICRORGANISMOS EFICIENTES (EM) - PROSPECÇÃO

PARA AUMENTO DA TAXA DE GERMINAÇÃO E

PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO DE TOMATE

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao curso de
Ciências Biológicas da
Universidade Nove de Julho
como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Bacharel em
Ciências Biológicas.

Orientador: Ricardo Harakava

SÃO PAULO

2023

2
Carvalho, Artur Oliveira
Microrganismos Eficientes (EM) - Prospecção para aumento da
taxa de germinação e promoção de crescimento de tomate. Artur
Oliveira Carvalho. São Paulo, 2023.
25 folhas; A4
Monografia - Trabalho de conclusão de curso; Microrganismos.
Curso de Ciências Biológicas. Diretoria da Saúde, Universidade
Nove de Julho;
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Harakava.
Palavras-chave: Agricultura, EM, Microrganismos Eficientes,
Agro Ecologia.

3
RESUMO

O objetivo do trabalho foi coletar microrganismos eficientes (effective microorganisms

‒ EM) da mata Atlântica, no Parque Estadual das Fontes do Ipiranga - Parque do
Estado, São Paulo - SP, no intuito de verificar se os microrganismos eficientes (EM)
são capazes de aumentar a germinação e promover o crescimento de plantas de
tomate, em condições de casa-de-vegetação, assim como identificar alguns dos
microrganismos capturados. A metodologia utilizada foi a proposta pelo Dr. Teruo Higa
(HIGA e PARR, 1994) com adaptações. Três armadilhas feitas com canos de PVC
foram montadas e utilizadas para capturar os EMs em três pontos distintos do parque.
Após 15 dias, as armadilhas foram retiradas e encaminhadas para o laboratório para
realização da fermentação líquida e obtenção das formulações empregadas nos
ensaios de germinação de sementes e de promoção de crescimento de tomateiros.
Os EMs não promoveram aumento significativo da taxa de germinação das sementes.
Até o 30º dia após a semeadura, a promoção de crescimento foi observada para
quatro tratamentos com EMs. O isolamento e identificação de microrganismos
presentes nas preparações de EMs e também daqueles que colonizaram as raízes,
mostrou a presença de grande número de espécies benéficas, como as do gênero
Trichoderma, mas também de potenciais fitopatógenos dos gêneros Cladosporium,
Alternaria e Fusarium.

Palavras-chave: Agricultura, EM, Microrganismos Eficientes, Agro Ecologia.

4
ABSTRACT

The objective of this work was to collect efficient microorganisms (effective

microorganisms ‒ EM) from the Atlantic Forest, in Parque Estadual das Fontes do
Ipiranga - Parque do Estado, São Paulo - SP, in order to verify if the efficient
microorganisms (EM) are able to increase germination and to promote the growth of
tomato plants, under greenhouse conditions, as well as to identify some of the captured
microorganisms. The methodology used was proposed by Dr. Teruo Higa (HIGA and
PARR, 1994) with adaptations. Three traps made with PVC pipes were set up and
used to capture the EMs at three different points in the park. After 15 days, the traps
were removed and sent to the laboratory to carry out the liquid fermentation and obtain
the formulations used in the seed germination and tomato growth promotion tests. The
EMs did not promote a significant increase in the germination rate of the seeds. Up to
the 30th day after sowing, growth promotion was observed for four treatments with
EMs. The isolation and identification of microorganisms present in the EM preparations
and also those that colonized the roots, showed the presence of a large number of
beneficial species, such as those of the genus Trichoderma, but also of potential
phytopathogens of the genera Cladosporium, Alternaria and Fusarium.

Keywords: Agriculture, MS, Efficient Microorganisms, Agro Ecology.

5
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 7
1.1 Microrganismos Eficientes 7
1.2 A cultura do tomate 7
1.3 Dependência do Brasil de fertilizantes e defensivos químicos e a alternativa
biológica 8
2. OBJETIVOS GERAIS 10
2.1 Objetivos específicos 10
3. MATERIAL E MÉTODOS 11
3.1 Captura de EMs 11
3.2 Ativação dos EMs 12
3.3 Efeitos dos EMs na germinação e no crescimento de tomateiros 13
3.3.1 Tratamentos 13
3.3.2 Efeito de EMs na emergência e promoção de crescimento 13
3.3.3 Finalização do ensaio de promoção de crescimento 14
3.3.4 Plaqueamento das raízes 14
3.4 Isolamento de bactérias e fungos presentes nos EMs 14
3.5 Extração de DNA, PCR e gel de eletroforese 14
3.6 Quantificação do DNA extraído 15
3.7 Precipitação de produtos de PCR com PEG 6000 15
3.8 Sequenciamento pelo método Sanger 16
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 17
4.1 Captura de EMs 17
4.2 Efeito dos EMs na germinação de sementes de tomate 17
4.3 Efeito dos EMs no crescimento de plantas de tomate - altura 18
4.4 Efeito dos EMs no crescimento de plantas de tomate - peso seco 19
4.5 Plaqueamento das raízes 20
4.6 Isolamento de bactérias e fungos presentes nos EMs 20
4.7 Amplificação da região ITS de fungos do gene ribossomal 16S de
bactérias 20
4.8 Sequenciamento método Sanger 20
5. REFERÊNCIAS 23

6
 1. INTRODUÇÃO

1.1 Microrganismos Eficientes

Com início na década de 70 pelo Dr. Teruo Higa, professor da Universidade de
Ryukyus (Japão), o estudo sobre os microrganismos eficientes (effective
microorganisms ‒ EM) trouxe benefícios à agricultura com seu objetivo de
melhoramento da utilização da matéria orgânica. Essa técnica propõe a utilização de
microrganismos naturalmente presentes em ambientes conservados, encarregados
de realizar a ciclagem de nutrientes, disponibilizando nutrientes da matéria orgânica
do solo para as plantas em ambientes produtivos. Esses microrganismos são
decompositores facultativos, fotossintetizantes, entre outros, que podem promover o
crescimento e desenvolvimento vegetal (HIGA e PARR, 1994). Nessa agricultura,
natural, visa-se utilizar princípios ecológicos (propriedades do solo, dos organismos
vivos, da energia solar e dos recursos hídricos), para melhorar a estrutura do solo.
Valoriza-se a utilização de compostos, cobertura morta, adubação verde,
microrganismos do solo, controle biológico de insetos e o controle biomecânico de
plantas espontâneas (ANDRADE, 2011).
No Brasil, a implantação de monoculturas em áreas extensas a partir de
meados do século XX, associada ao uso de defensivos e fertilizantes químicos em
larga escala têm levado à dependência da produção agrícola brasileira em relação a
esses insumos, muitos dos quais são importados. Os problemas ambientais e à
sociedade decorrentes do uso excessivo desses produtos levam à necessidade do
uso de novas metodologias mais sustentáveis (MEENA et al., 2017, HURTADO et al.,
2019 ).

1.2 A cultura do tomate

Disponível o ano todo, o tomate tem boa produtividade, dependendo da
localidade e sazonalidade das safras, e é cultivado em praticamente todo o território
nacional, tendo nas regiões Sudeste, Sul e Centro-Oeste sua maior produção. De
acordo com dados da FAO, o Brasil ocupa a 9° posição na produção de tomate em

7
nível mundial (2,5%), liderado pela China, Índia e Estados Unidos, que ocupam as
primeiras posições, respondendo por aproximadamente por 31%, 11% e 8%,
respectivamente (DOSSA; FUCHS, 2017). O tomate, apesar de ser fruto, é estudado
dentro do grupo das hortaliças. Acredita-se que o tomate seja a hortaliça que ocupa a
segunda posição mundial em área cultivada e a primeira em volume industrializado
(FILHO et al., 1994). A olericultura é uma das atividades que mais gera renda no
campo a cada hectare cultivado, gerando empregos desde o plantio até a
comercialização. Calcula-se que cada hectare gera entre três a seis empregos diretos
na frente da produção, logo empregando em torno de 10% da população nacional
(TREICHEL et al., 2016). Está presente na mesa não só dos brasileiros mas de todo
o mundo sob diversas formas, desde a mais simples salada até produtos
industrializados, como molhos e extratos. Contém importância alimentar e nutricional,
caracterizando-se pela alta concentração de licopeno, um poderoso antioxidante, que
ajuda a proteger o organismo contra os radicais livres e, até mesmo, o câncer. A
cultura do tomate é conhecida por utilizar grande volume de defensivos, haja vista a
variedade de pragas e doenças que atacam a plantação e podem acabar por
inviabilizar o cultivo pela redução da produtividade e da qualidade. (RUBIN et al.,
2016).

1.3 Dependência do Brasil de fertilizantes e defensivos químicos e a

alternativa biológica
O Brasil é um dos principais consumidores de fertilizantes químicos do mundo,
assim como de defensivos para reduzir perdas por pragas e doenças. Entretanto, não
figura como um dos principais produtores desses insumos, tornando-se assim
dependente do mercado internacional (FAO, 2019). Ao mesmo tempo, a utilização
desses insumos é acompanhada de inúmeras perdas por volatilização, imobilização
ou outros processos geoquímicos. Não bastasse isso, alguns dos processos de
produção desses insumos demandam alto gasto energético, bem como consumo de
combustível fóssil não renovável. (FAGERIA, 2014).
Buscando sustentabilidade na produção agrícola, a agroecologia tem
desenvolvido a utilização da biodiversidade natural e de processos biológicos para
suprir as necessidades nutricionais das culturas, proteger contra pragas e doenças e
obter redução dos processos erosivos que degradam os campos de produção
(ALTIERI, 2018).
8
 Este presente trabalho pretende disponibilizar informações, acerca da
utilização de microrganismos eficientes, para promoção de crescimento nos cultivos
agrícolas de tomate.

9
 2. OBJETIVOS GERAIS

Este projeto de iniciação científica tem como objetivo capturar Microrganismos

Eficientes de uma reserva de mata Atlântica, com localização no Parque Estadual das
Fontes do Ipiranga - Parque do Estado, São Paulo - SP, no intuito de verificar se estes
seriam capazes de aumentar a taxa de germinação de sementes e de promover o
crescimento de tomateiros. Almeja-se também identificar alguns dos microrganismos
capturados por meio desta técnica.

2.1 Objetivos específicos

1. Avaliar se os EMs influenciam na taxa de germinação de sementes de tomate;
2. Avaliar se os EMs promovem o crescimento de plantas de tomate;
3. Identificar alguns dos EMs mais frequentes por meio de sequenciamento
genético.

10
 3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Captura de EMs

As armadilhas foram produzidas utilizando-se segmentos de canos de PVC de
10 cm de diâmetro e 50 cm de comprimento (Figura 1) que foram desinfestadas por
imersão em solução de hipoclorito de sódio de 1% por 20 minutos. Os canos foram
retirados da solução e lavados em água corrente. Por fim, foi aspergido álcool 70% e
removido com papel descartável.

Figura 1. Canos de PVC utilizados como armadilhas para a captura de EMs. FONTE: Compilação do
autor.

Para cada armadilha, o substrato para captura de EMs consistiu de 210 g de

arroz branco em 210 mL de água MilliQ, autoclavados em sacos plásticos por 20
minutos à temperatura de 121°C.
O arroz autoclavado foi transferido para dentro das armadilhas com auxílio de
espátula, em capela de fluxo laminar. As extremidades foram cobertas com
compressas de gaze e presas com fita crepe, visando impedir ou reduzir a entrada de
insetos e outros animais.
Dentro da mata, a camada de serrapilheira foi afastada do solo e nesse espaço
a armadilha foi depositada horizontalmente, cobrindo-se de volta com a serapilheira
(Figura 2).
As armadilhas foram instaladas em 29/10/2021 e retiradas em 12/11/2021. São
necessários, em média, 7 dias para o crescimento dos microrganismos eficientes de
coloração mais clara e de 15 a 20 dias para os de coloração escura (BONFIM et al,
2011; ÁVILA, 2019).

11
 Os três pontos de coleta dentro do Parque Estadual das Fontes do Ipiranga -
Parque do Estado, São Paulo - SP, foram: Ponto 1 com o cano 1 (C1) - 23°38'22.7"S
46°37'24.0"W - 996G+4MV; Ponto 2 com o cano 2 (C2) - 23°38'23.8"S 46°37'21.7"W
- 996G+2WF e ponto 3 com o cano 3 (C3) - 23°38'32.2"S 46°37'26.4"W - 995G+39Q.

Figura 2. Modo de instalação da armadilha para captura de EMs junto à serrapilheira sob a mata.
FONTE: Compilação do autor.

3.2 Ativação dos EMs

Para a ativação dos EMs, foram utilizadas garrafas PETs de 2L desinfestadas
com solução de hipoclorito 1% por 30 minutos, enxaguadas com água MilliQ
autoclavada e lavadas com álcool 70%, retirando-se o excesso com papel descartável.
As garrafas foram preenchidas com solução de 12 g de açúcar mascavo comercial em
500 mL de água MilliQ. Esta solução não foi autoclavada.
O arroz colonizado pelos EMs foi retirado das armadilhas e espalhados em
bandejas para separação das porções colonizadas por microrganismos de colorações
claras (amarelo, laranja, vermelho, verde) das porções contendo microrganismos de
colorações escuras (cinza, marrom, preto)
Para cada ponto de coleta, foram utilizadas quatro garrafas para ativação dos
EMs, das quais três foram inoculadas com porções de arroz com microrganismos
claros e uma com microrganismos escuros.
As garrafas foram mantidas em sala sem incidência direta de luz solar. Os
gases produzidos durante a fermentação dentro das garrafas foram retirados
diariamente, afrouxando-se as tampas. A incubação foi realizada por 20 dias, quando
já não se observava a produção de gases. Os conteúdos das quatro garrafas de cada
localidade foram misturados para se obter uma mistura homogênea.

12
3.3 Efeitos dos EMs na germinação e no crescimento de tomateiros

3.3.1 Tratamentos
Os EMs foram empregados em duas diluições de 1:1000 (F1) e 1:5000 (F2) em
água MilliQ.
Preparou-se 9 tratamentos: T1 - solução de C1 (localidade 1) x 2 diluições (F1
e F2), T2 - solução de C2 x 2 diluições (F1 e F2), T3 - solução de C3 x 2 diluições (F1
e F2), T4 - controle água MilliQ, T5 – controle meio de cultura (arroz, açúcar e água
MilliQ) x 2 diluições (F1 e F2).

3.3.2 Efeito de EMs na emergência e promoção de crescimento

Foram utilizados sacos de plástico com 30cm de altura e 10cm de diâmetro
preenchidos com substrato comercial Biomix Folhas e Folhagens. Foram semeados 4
sementes por saco com profundidade de 0,5cm no substrato.
As sementes de tomate (Solanum lycopersicum) utilizadas foram da variedade
Super Marmande (Gaúcho/Maçã) (Isla Sementes), sem tratamento.
Os tratamentos com EMs e controles foram aplicados após a semeadura, por
meio de rega até o ponto de saturação do substrato. As plantas foram regadas
diariamente com água MilliQ.
O desbaste foi realizado quando 50% mais 1 unidade das sementes emergiram
(respeitando o prazo de aguardo e acompanhamento de 7-10 dias para germinação
como determina o fabricante). O critério para o desbaste foi a altura das plântulas (as
plântulas menores de cada saquinho foram eliminadas).
O número de sementes germinadas foi avaliado 10 dias após o plantio.
O efeito na promoção de crescimento foi avaliado aos 15, 30 e 92 dias,
medindo-se a altura das plantas.
Cada tratamento foi realizado com 20 repetições com 4 sementes em cada
saquinho. O experimento foi conduzido na cada de vegetação da ULRBMA. O
delineamento utilizado foi de blocos casualizados. As médias dos tratamentos foram
comparadas por teste de Tukey.

13
3.3.3 Finalização do ensaio de promoção de crescimento
Após 92 dias o ensaio foi finalizado no dia 10/05/2022. As amostras foram
levadas da casa de vegetação para o laboratório seguindo a seguinte ordem dos
tratamentos : T4, T5, T1, T2 e T3.
A abertura dos sacos plásticos foi realizada pela lateral com o auxílio de uma
tesoura previamente limpa com álcool 70% (procedimento realizado entre uma
amostra e outra), retirando-os para que pudesse cortar a parte aérea, na base do
caule onde emergiu-se do solo.
A parte aérea foi armazenada dentro de sacos pardos com 32cm de altura, 16
cm de largura e com 8 furos, desde a abertura até a base, para serem levadas a estufa
e secarem por 21 dias em temperatura constante de 55 graus Celsius. Foi adicionado
um saco vazio para que pudesse descontar o valor desse ao final sob os sacos que
contêm amostras.

3.3.4 Plaqueamento das raízes

Plaqueamento realizado em placas de Petri em meio BDA (batata, dextrose,
ágar) para ser realizado o isolamento dos organismos presentes. Os isolados obtidos
foram identificados por meio de sequenciamento do gene ribossomal 16S, no caso
das bactérias, e da região ITS (internal transcribed spacer), no caso dos fungos.

3.4 Isolamento de bactérias e fungos presentes nos EMs

O isolamento de bactérias foi realizado em placas de Petri com meio ágar
nutritivo e o de fungos em meio BDA (batata, dextrose, ágar). Os isolados obtidos
foram identificados por meio de sequenciamento do gene ribossomal 16S, no caso
das bactérias, e da região ITS (internal transcribed spacer), no caso dos fungos.

3.5 Extração de DNA, PCR e gel de eletroforese

A extração de DNA fúngico e bacteriano foi realizada através do método CTAB
(TRYPATHY et al., 2017) com adaptações. Foram adicionadas seis esferas de metal
dentro de microtubo (para o equipamento FastPrep) contendo 600 uL de tampão
CTAB (2%; 100mM tris.Cl, pH 8.0 - solução 2M; 20 mM EDTA, ph 8.0 - solução 0.5M;
1.4 M NaCl). Uma porção do micélio (aproximadamente 1 cm2) foi retirada do meio de
cultura e depositada dentro do tubo. Os tubos foram submetidos à agitação por três
vezes por 20 s com intervalos de trinta segundos, no equipamento FastPrep. Após

14
incubação sob agitação a 65°C por 30 min, foram adicionados 600 uL de clorofórmio-
álcool isoamílico (24:1) e agitado em vortex por alguns segundos. Após centrifugação
a 12.000 rpm por 10 min, 500 uL da fase aquosa foram transferidos para um microtubo
novo, adicionados de 300 uL de isopropanol e misturados por inversão. O DNA foi
sedimentado por centrifugação a 12.000 rpm por 10 min e lavado com 500 uL de
etanol 70%. O DNA foi submetido à centrifugação a vácuo por dez minutos a 30 °C e
ressuspendido com 50 uL de água MilliQ autoclavada. Finalizado esses processos o
DNA esteve pronto para a PCR ("Polimerase chain reaction") com primers para a
região ITS ("Internal transcribed spacer"), para os fungos, e com primers para o gene
ribossomal 16S, para as bactérias.
A região ITS foi amplificada utilizando os primers LR1 e SR6R (10 µM), 0,4 uL
cada, 10,0 uL de GoTaq Green Master Mix (Promega), 8.2 uL de água MilliQ
autoclavada e 1 uL de DNA, totalizando 20 uL.. Para o gene 16S, foram utilizados os
primers fD1 e rP1, com as mesmas condições.
A região ITS foi amplificada em termociclador programado para 94°C por 2 min
para desnaturação inicial, 40 ciclos de 10 s a 94°C para desnaturação - 30 s a 50°C
para anelamento - 40 s a 72°C para extensão e 5 min a 72°C para extensão final. Em
todos os experimentos foram usados tratamentos controle onde nenhum DNA foi
adicionado. Os tubos e materiais utilizados nas composições das soluções e no
manuseio foram autoclavados previamente.
Os produtos obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,0%
(1g de agarose, 100mL Tampão e 2 uL de brometo). Foram aplicados 2 uL dos
produtos de PCR e 4 uL do marcador Invitrogen 1 kb Plus DNA Ladder. Os fragmentos
de DNA resultantes foram registrados em fotodocumentador sob luz U.V.

3.6 Quantificação do DNA extraído

Os DNAs extraídos dos microrganismos foram quantificados em equipamento
Nanodrop 8000.

3.7 Precipitação de produtos de PCR com PEG 6000

Com os 18 uL restantes do produto de PCR após a eletroforese, foi realizado o
protocolo para purificação do DNA amplificado por precipitação com PEG 6000. Para
cada amostra, foram adicionados 7,56 uL de PEG 6000; 0,57 uL de EDTA 0,5M; 2,91
uL de NaCl 5M. Após misturar em vortex por alguns segundos e centrifugar por 10

15
minutos a 12000 rpm, o sobrenadante foi retirado com a pipeta e o pellet foi lavado
com 125 uL de etanol 70%. Após secagem, o DNA foi ressuspendido com 20 uL de
água MilliQ autoclavada.

3.8 Sequenciamento pelo método Sanger

A reação de sequenciamento foi realizada em placa de 96 poços de 200 µL,
onde foram aplicados 5 uL dos produtos de PCR purificados e 5 uL de mix (tampão
de diluição 1,8 uL; Big Dye 0,4 uL; primer (10 µM) 0,3 uL LR1 para fungos e FD1 para
bactérias e água MilliQ autoclavada 2,5 uL) (FIGUEIREDO, et al. 2003). O programa
constituiu de desnaturação inicial a 95°C por 1 min seguida de 25 ciclos de 95°C/5 s,
50°C/30 s, 60°C/4 min. Os produtos da reação de sequenciamento foram purificados
por precipitação com 40 uL de isopropanol 75%. Após mistura por inversão, a placa
foi centrifugada por 30 min a 4.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e a placa foi
centrifugada novamente por 30 segundos a 1.000 rpm, em posição invertida. Em
seguida, os pellets foram lavados com 80 uL de isopropanol 75%, e secados em estufa
por quinze minutos a 37°C.
Os pellets foram ressuspendidos com 10 L de formamida HiDi e desnaturados
por 2 min a 95°C.
O sequenciamento foi realizado em equipamento 3500 xL (Applied
Biosystems).

16
 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Captura de EMs

As armadilhas capturaram microrganismos que formaram colônias com
diversas colorações (amarela, laranja, vermelha, verde, cinza, marrom, preto) (Figura
3). Foram observadas diferenças visuais na composição das colônias das três
localidades, com maior proporção de colônias escuras na localidade 3 e menor na
localidade 2. Parte dessas colônias foram utilizadas para o isolamento dos
microrganismos em meio de cultura e parte para a ativação dos EMs por fermentação
líquida.

Figura 3. EMs capturados com armadilha de arroz autoclavado. Foram obtidas colônias com
diferentes colorações. FONTE: Compilação do autor.

4.2 Efeito dos EMs na germinação de sementes de tomate

Os dados climatológicos obtidos do CPTEC-INPE (www.cptec.inpe.br)
mostraram que durante a realização dos experimentos de germinação e crescimento
de tomateiros a temperatura diária variou de 16°C a 31°C e a umidade relativa entre
37% e 100%.
Utilizado o teste ” t de Student ” na comparação das médias. A avaliação da
germinação das sementes não mostrou efeito positivo significativo dos tratamentos
com EMs (Tabela 1), tanto na comparação com os tratamentos controle quanto na
comparação entre doses diferentes dos EMs.

17
Tabela 1. Número de sementes de tomates germinadas na presença ou não de EMs (microrganismos
eficientes).

*Tratamentos *Número de sementes germinadas

1 (T1F1) 3,65 a
3 (T2F1) 3,45 a
5 (T3F1) 3,40 ab
4 (T2F2) 3,35 ab
7 (T4) 3,30 abc
8 (T5F1) 3,25 abcd
2 (T1F2) 2,95 bcd
9 (T5F2) 2,85 cd
6 (T3F2) 2,80 d
(*)T1 – EMs local 1, T2 – EMs local 2, T3 – EMs local 2, T4 – controle água, T5 – controle meio de
cultura. F1 – diluição 1:1000, F2 – diluição 1:5000. (*) Médias seguidas de letras iguais, nas colunas,
não diferem significativamente pelo teste de T Student, a 5% de probabilidade: LSD = 0,4995, CV
24,83%. (*) Análise realizada no site AgroEstat Online disponível em: www.agroestat.com.br.
FONTE: Compilação do autor.

O efeito de EMs sobre a germinação de sementes de abobrinhas observado

por PUGAS et al (2013) onde a maiores concentrações resultaram em taxas maiores,
não foi reproduzido no presente estudo.

4.3 Efeito dos EMs no crescimento de plantas de tomate - altura

Na comparação com o tratamento T4 (controle água), foi observado efeito de

promoção de crescimento para os tratamentos T1F1 (15 dias) e T1F1, T2F1, T2F2,
T3F1 (30 dias). Aos 92 dias, muitas plantas haviam sido afetadas por um patógeno
não identificado, prejudicando a avaliação (Tabela 2).

Tabela 2. Média da altura (cm) das mudas de tomates inoculadas ou não com EMs após 15, 30 e 92
dias do plantio.

Tratamentos *Altura 15° dia (cm) *Altura 30° dia (cm) *Altura 92° dia (cm)

1 (T1F1) 3,61 a 8,07 a 15,65 d

2 (T1F2) 2,60 cd 6,15 ab 12,45 d

3 (T2F1) 3,17 ab 7,85 a 15,20 d

4 (T2F2) 3,23 ab 6,42 a 13,65 d

5 (T3F1) 3,28 ab 7,24 a 13,50 d

6 (T3F2) 2,45 d 6,24 ab 25,25 c

7 (T4) 2,97 bcd 4,32 bc 79,70 a

18
 Tratamentos *Altura 15° dia (cm) *Altura 30° dia (cm) *Altura 92° dia (cm)

8 (T5F1) 3,16 abc 3,73 c 58,75 b

9 (T5F2) 2,93 bcd 6,26 ab 14,30 d

C.V.(%) 29,93 50,37 52,84

LSD (5%) 5,69 19,67 9,10

T1 – EMs local 1, T2 – EMs local 2, T3 – EMs local 2, T4 – controle água, T5 – controle meio de
cultura. F1 – diluição 1:1000, F2 – diluição 1:5000. (*) Médias seguidas de letras iguais, nas colunas,
não diferem significativamente do teste t de Student. Análise realizada no site AgroEstat Online
disponível em: www.agroestat.com.br. FONTE: Compilação do autor.

4.4 Efeito dos EMs no crescimento de plantas de tomate - peso seco

A avaliação de peso seco foi realizada após 113 dias de crescimento, quando
grande número de plantas já havia sido afetada por patógeno desconhecido. Desta
forma, os dados obtidos não permitiram avaliar o efeito dos EMs adequadamente.
Tabela 3. Média do peso seco (g) das mudas de tomates inoculadas ou não com EMs após 113 dias
do plantio

Tratamentos Peso seco (g)

7 (T4) 3,03 a

8 (T5F1) 2,02 b

6 (T3F2) 0,70 c

3 (T2F1) 0,36 cd

2 (T1F2) 0,35 cd

4 (T2F2) 0,34 cd

5 (T3F1) 0,22 cd

1 (T1F1) 0,10 d

9 (T5F2) 0,04 d

C.V.(%) 17,58

LSD (5%) 0,58

(*)Médias seguidas de letras iguais, nas colunas, não diferem significativamente do teste t de
Student.(*) C.V. (%) termo abreviado de coeficiente de variação em porcentagem. (*) Análise
realizada no site AgroEstat Online disponível em: www.agroestat.com.br. FONTE: Compilação do
autor.

19
4.5 Plaqueamento das raízes
Onze microrganismos, fungos e bactérias foram isolados a partir da superfície
das raízes das plantas de tomateiro tratadas com EMs.

4.6 Isolamento de bactérias e fungos presentes nos EMs

Bactérias e fungos que formam colônias com diferentes características

morfológicas e de cores foram isolados em meio sólido. Trinta isolados foram
submetidos à identificação molecular.

4.7 Amplificação da região ITS de fungos do gene ribossomal 16S de bactérias

A região ITS dos fungos e o gene ribossomal 16S das bactérias foram
amplificados com sucesso para a maioria dos isolados obtidos.
Para alguns fungos, foi observada banda dupla, indicando possível
contaminação do isolado (Figura 4A). Para algumas bactérias, além da banda
correspondente ao produto da amplificação do gene 16S, foi observada também
banda de DNA de alto peso molecular, indicando excesso de DNA genômico utilizado
na reação (Figura 4B)

Figura 4. Eletroforese dos produtos de PCR amplificados para fungos (região ITS) e bactérias (gene
ribossomal 16S). A – PCR para a região ITS de fungos. B – PCR do gene ribossomal 16S de
bactérias.

4.8 Sequenciamento método Sanger

Os resultados obtidos dos sequenciamentos dos microrganismos dos
tratamentos com EM ‘s e dos microrganismos nas raízes (Tabela 4) demonstram a

20
variedade de espécies. Foi observado grande número de isolados do gênero
Trichoderma, o que demonstra a capacidade da técnica de EMs em capturar fungos
benéficos para as plantas. Nota-se que o microrganismo Trichoderma atroviride foi
encontrado tanto nos preparados de EMs como nas raízes das plantas de tomate
tratadas.
Tabela 4. Identificação molecular dos microrganismos obtidos pelo método de EMs e dos
microrganismos colonizadores de raízes.

Percentual de
Amostra Identidade Nome Código GenBank E value

Microrganismos Eficientes

1 99.63% Cladosporium subuliforme MH864124.1 0.0

Trichoderma dorothopsis
2 99.50% isolate MH624140.1 0.0

3 99.46% Alternaria angustiovoidea MH861939.1 0.0

4 98.91% Cladosporium angulosum LN834425.1 0.0

6 99.44% Cladosporium angustisporum MH863862.1 0.0

7 99.67% Trichoderma atroviride MH862505.1 0.0

8 99.67% Trichoderma simmonsii NR_137297.1 0.0

9 100.00% Alternaria alstroemeriae NR_163686.1 0.0

10 100.00% Trichoderma dorothopsis MH624140.1 0.0

11 79.67% Trichoderma arenarium MT217123.1 4,00E-36

12 99.14% Penicillium glandicola MH860946.1 0.0

13 92.65% Bjerkandera ecuadorensis NR_174062.1 0.0

15 94.05% Trichoderma atroviride MH862505.1 2,00E-156

16 96% Trichoderma atroviride AF456917.1 0.0

17 99.54% Penicillium fimorum MT558942.1 0.0

19 99.61% Marquandomyces marquandii MH854923.1 0.0

20 97.24% Acremonium sordidulum NR_159618.1 0.0

21 89.97% Trichoderma atroviride MH862505.1 0.0

23 96.84% Trichoderma gamsii NR_131317.1 0.0

26 100.00% Trichoderma atroviride AF456917.1 0.0

21
 28 97.02% Penicillium adametzii NR_103661.1 0.0

29 93.14% Bjerkandera ecuadorensis NR_174062.1 0.0

31 95.83% Paracremonium binnewijzendii NR_157491.1 2,00E-57

33 99.76% Aspergillus versicolor KU729039.1 0.0

34 99.83% Trichoderma dorothopsis MH624140.1 0.0

36 99.21% Penicillium crustosum MH862985.1 0.0

Percentual de
Amostra Identidade Nome Código GenBank E value

37 100.00% Penicillium fimorum MT558942.1 2,00E-70

38 91.46% Roseograndinia jilinensis NR_175195.1 0.0

39 93.24% Bjerkandera ecuadorensis NR_174062.1 0.0

2,00E-26
51 98.57% Paracremonium binnewijzendii NR_157491.1

MIcrorganismos nas raízes

A 97.95% Fusarium solani NR_163531.1 0.0

C 99.51% Trichoderma inhamatum MH861134.1 0.0

D 96.28% Trichoderma atroviride MH862505.1 1,00E-93

E 99.67% Trichoderma inhamatum MH861134.1 0.0

M 94.85% Scedosporium apiospermum MH863017.1 9,00E-115

P 99.03% Pseudomonas muyukensis CP077073.1 0.0

B 98.72% Pseudomonas mosselii CP081966.1 0.0

H 96.98% Stenotrophomonas geniculata MT672503.1 0.0

I 97.94% Stenotrophomonas maltophilia MN240936.1 0.0

K 97.23% Brucella pseudogrignonensis NR_042589.1 0.0

O 97.25% Clostridium diolis CP043998.1 0.0

FONTE: Compilação do autor.

22
 5. REFERÊNCIAS
ALTIERI, Miguel A. Agroecology: The science of sustainable agriculture. 2. ed. CRC
Press, 2018.
ÁVILA, Z. N. B. Efeitos da utilização de microrganismos eficientes (EM) sobre a
cultura de milho (Zea mays L.) variedade BRS Caimbé orgânico. 2019. Trabalho
de Conclusão de Curso. Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
BONFIM, P. G. FILIPE et AL. Caderno dos microrganismos Eficientes (EM);
Instruções práticas sobre uso ecológico e social do EM. Divulgação das Plantas
Medicinais, da Homeopatia e da Produção de Alimentos Orgânicos, ed. 2, p.32.
Viçosa-MG, 2011.
BONFIM, F. P. G.; HONÓRIO, I. C. G.; REIS, I. L.; PEREIRA, A. J.; SOUZA, D. B.
Caderno dos microrganismos eficientes (EM): instruções práticas sobre uso
ecológico e social do EM. Universidade Federal de Viçosa: Departamento de
Fitotecnia, 32p, 2011.
DOSSA, D.; FUCHS, F. Tomate: análise técnico-econômica e os principais
indicadores da produção nos mercados mundiais, brasileiro e paranaense.
Boletim Técnico 03 Tomate, ago. Curitiba. 2017.
FAGERIA, N. K. Yield and yield components and phosphorus use efficiency of lowland
rice genotypes. Journal of plant nutrition, v. 37, n. 7, p. 979-989, 2014.
FAO – Food and Agriculture Organization. Dados sobre alimentação e agricultura.
FAOSTAT. Disponível em: http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC/visualize. Acesso
em: 23 fev. 2022.
FIGUEIREDO, GRAZIELLA S., et al. Reação de sequenciamento de DNA e
purificação: protocolos otimizados. 2003.
FILHO, W. P DE C.; DONADELLI, A.; SUEYOSHI, M. DE L. S.; CAMARGO, A. M. M.
P. DE. Evolução da Produção de Tomate no Brasil. Revista de Economia Agrícola,
São Paulo, v. 41, tomo 1, p. 41-69, 1994.
GOMES, P. A. JOÃO et al. Uso de microrganismos eficientes como alternativa para
agricultura sustentável: um referencial teórico. Agroecologia: métodos e técnicas
para uma agricultura sustentável. v. 5, cap. 29, p.355. 2021.

23
HIGA, T.; PARR, J. F. Beneficial and effective microorganisms for a sustainable
agriculture and environment. Atami: International Nature Farming Research Center,
1994.
HURTADO, A. C.; DÍAZ, Y. P.; VICIEDO, D. O.; RODRÍGUEZ, E. Q.; CALZADA, K.
P.; NEDD, L. L. T.; HERNÁNDEZ, J. J. Effect of different application forms of efficient
microorganisms on the agricultural productive of two bean cultivars. Revista Facultad
Nacional de Agronomía Medellín, v. 72, n. 3, p. 8927-8935, 2019.
MEENA, V. S.; MEENA, S. K.; VERMA, J. P.; KUMAR, A.; AERON, A.; MISHRA, P.
K.; DOTANIYA, M. L. Plant beneficial rhizospheric microorganism (PBRM) strategies
to improve nutrients use efficiency: a review. Ecological Engineering, v. 107, p. 8-32,
2017.
PUGAS, ADEVAN DA S. et al. Efeito dos Microrganismos Eficientes na taxa
germinação e no crescimento da Abobrinha (Curcubita Pepo L.). Resumos do VIII
Congresso Brasileiro de Agroecologia. v. 8, n. 2. Porto Alegre/RS, 2013.
RUBIN, A., C. et al. Companhia Nacional de Abastecimento. Compêndio de
Estudos Conab / Companhia Nacional de Abastecimento. – v. 1 (2016- ). - Brasília:
Conab, 2016
TREICHEL, M et al. Anuário Brasileiro do Tomate 2016. Santa Cruz do Sul: Editora
GazetaSanta Cruz, p. 64. 2016.
TRIPATHY, S. K.; MAHARANA, M.; ITHAPE, D. M.; LENKA, D.; MISHRA, D.; PRUSTI,
A.; SWAIN, D.; MOHANTY, M. R.; RAJ, K. R. Exploring rapid and efficient protocol
for isolation of fungal DNA. International Journal of Current Microbiology and Applied
Sciences, v. 6, n. 3, p. 951-960, 2017.

24
_______________________________________

Artur Oliveira Carvalho

Bolsista

____________________________

Ricardo Harakava

Orientador

SÃO PAULO

2023

25