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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

Campus Regional de Umuarama

José Henrique Siqueiras Leal

BIOTECNOLOGIA APLICADO AO MELHORAMENTO DE PLANTAS

MARCADORES MOLECULARES

Umuarama/PR

2023
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José Henrique Siqueiras Leal

MARCADORES MOLECULARES

Relatório, apresentado a Universidade Estadual

de Maringá, como parte das exigências para a
obtenção de nota da disciplina de Biotecnologia
Aplicada ao Melhoramento de plantas.

Prof. Dra. Juliana Parisotto Poletine

Umuarama - PR

2023
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INTRODUÇÃO

Inicialmente, as pesquisas genéticas usavam marcadores morfológicos resultantes de

mutações simples em genes específicos, o que causava mudanças visíveis nas

características dos organismos, tornando fáceis de identificar. O reduzido número de

marcadores fenotípicos disponíveis em todo mercado mundial, limitaram a sua utilização

(Guimarães e Moreira, 1999).

Marcadores moleculares atuam como identificadores únicos que permitem a distinção

entre indivíduos. Quando aplicados em programas de melhoramento genético de plantas,

eles desempenham um papel crucial, acelerando o desenvolvimento de plantas com

características vantajosas para a agricultura de forma eficaz e rápida. Utilizar essas técnicas

para acelerar e supervisionar os programas de melhoramento genético resulta em

progressos significativos na criação de variedades aprimoradas, sendo assim, o uso dessas

técnicas leva a avanços notáveis no desenvolvimento de plantas com boas características

(Lanza e Guimarães, 2000).

A variação nas características entre os indivíduos de uma mesma espécie é

fundamental para a evolução e sobrevivência. Em relação às plantas, características como

resistência ao clima, produtividade e resistência a doenças desempenham um papel crucial

na disponibilidade e na qualidade dos alimentos, bem como na forma como são produzidos.

Na transferência de alelos de resistência, os marcadores moleculares de DNA podem

desempenhar um papel valioso. Quando esses marcadores estão intimamente relacionados

aos alelos de resistência, eles podem ser usados para auxiliar na seleção de forma mais

eficaz, um processo conhecido como seleção assistida por marcadores. Isso facilita a

identificação e transferência de genes de resistência desejados em programas de

melhoramento genético (Marin et al., 2005).

Ao longo da história, muitas plantas com traços desejáveis foram selecionadas

preferencialmente, eliminando aquelas com crescimento lento, baixa produtividade ou

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fragilidade, o que contribuiu para o desenvolvimento da agricultura e a melhoria da qualidade

dos alimentos.

Visto que para uma melhor produtividade final, por ter uma enorme importância para

a agricultura, para o melhoramento genético, para o aumento de produtividade, para controle

de algumas doenças, teremos como objetivo principal do trabalho, abordar a importância dos

marcadores moleculares para a agricultura, suas aplicações e quais são os diferentes tipos

de marcadores moleculares nos quais são mais usuais.

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DESENVOLVIMENTO

Os organismos geneticamente modificados (OGMs), são organismos que tiveram

alguma alteração/modificação em seu material genético, essa pratica de modificar o genoma

de plantas e animais pode parecer algo moderno, mas na verdade, temos praticado essa

modificação há milhares de anos. No início, isso era feito por meio de cruzamentos entre

seres vivos que tinham características desejáveis para a alimentação. A domesticação de

grãos, plantas frutíferas e animais como ovelhas, cabras, cães e gatos tem sido uma parte

fundamental do desenvolvimento das civilizações ao longo da história.

Uma das principais aplicações dos Organismos Geneticamente Modificados (OGM) é

combater a fome global, pois essas tecnologias oferecem vantagens significativas na

produção agrícola. Ao acelerar o aprimoramento genético de plantas, é possível obter

variedades de culturas como milho, soja, cana-de-açúcar e trigo que se adaptam melhor e

são mais produtivas. Essa aceleração no aprimoramento genético não apenas aumenta a

produtividade, mas também torna mais fácil e reduz os custos, incluindo o uso de

combustíveis em máquinas agrícolas. Tudo isso ocorre sem a necessidade de expandir

significativamente a área de cultivo, resultando em uma maior disponibilidade de alimentos

e em preços mais baixos. Os alimentos geneticamente modificados, frequentemente alvo de

críticas em nações mais desenvolvidas, representam uma potencial solução para combater

a fome em nações mais carentes (Barata e Garcia, 2001).

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Marcadores moleculares são partes de DNA que estão relacionadas a uma

característica específica que está sendo investigada. Eles indicam se o gene alvo está

presente ou ausente na planta que está sendo estudada. Essa conexão é genética, o que

significa que o marcador e o gene estão localizados no genoma de forma que são

transmitidos principalmente juntos para as gerações futuras por meio dos gametas, ou seja

marcador molecular está intimamente ligado ao gene de interesse, sendo transmitidos juntos

em cerca de 99% das vezes, quanto mais forte for essa ligação, melhor é o marcador,

idealmente, o marcador molecular perfeito seria diretamente derivado da informação contida

no próprio gene que está sendo estudado. A compreensão de características hereditárias e

a capacidade de prever comportamentos com base no material genético são vantajosas em

diversas áreas e disciplinas. Os marcadores genéticos desempenham um papel crucial em

programas de melhoramento genético de plantas e animais, permitindo a seleção de

características desejadas e o desenvolvimento de variedades superiores. Em resumo, os

marcadores genéticos desempenham um papel multifacetado em uma ampla gama de

aplicações, abrangendo desde a melhoria de cultivos e criação de animais até a medicina, a

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segurança alimentar e o controle de qualidade.

Os marcadores moleculares representam o terceiro grupo de marcadores, eles

surgiram por conta de precisar ser detectado o polimorfismo genético diretamente do DNA.

Um marcador molecular é uma característica molecular que provém da atividade de um gene

ou de uma parte específica do DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998). O avanço das técnicas

moleculares, juntamente com o progresso em bioinformática e genética quantitativa, tem

levado a avanços notáveis. A aplicação dessas técnicas para acelerar e supervisionar os

programas de melhoramento genético resultou em desenvolvimento significativo de

variedades aprimoradas. Em resumo, a combinação dessas áreas está impulsionando o

progresso no melhoramento genético de plantas. Os marcadores moleculares superam os

marcadores morfológicos em várias maneiras, uma vez que fornecem um número

praticamente infinito de variações genéticas distribuídas de forma aleatória em todo o

genoma. Além disso, eles não são afetados por influências ambientais ou pelo estágio

fisiológico da planta, o que permite a identificação precisa dos genótipos desde as fases

iniciais de desenvolvimento. Isso torna os marcadores moleculares uma ferramenta valiosa

para a pesquisa genética e o melhoramento de plantas e animais (Lanza et al., 2000).

Os marcadores moleculares têm diversas aplicações, podendo ser utilizados em

diversas etapas dos programas, eles podem ser utilizados para: Caracterização de

germoplasma; Estudos de diversidade e pureza genética; Teste de paternidade e seleção de

genitores; Seleção de resistência a patógenos; Associação com características quantitativas;

Seleção assistida. Sendo essenciais na identificação de cultivares e na proteção dos direitos

dos melhoristas, garantindo que as variedades desenvolvidas sejam reconhecidas e

protegidas legalmente. Eles também desempenham um papel crucial na avaliação da pureza

genética de sementes, garantindo que os agricultores recebam sementes de alta qualidade.

os marcadores moleculares são fundamentais para o mapeamento genético, permitindo a

identificação da localização de genes no genoma, bem como para a expansão do

conhecimento sobre a organização genômica de diversas espécies. Em resumo, os

marcadores moleculares desempenham um papel multifuncional em áreas que vão desde o

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melhoramento genético e agricultura até a pesquisa científica e a proteção dos direitos de

propriedade intelectual.

Caracterização de germoplasma: A caracterização de germoplasma envolve a

medição e o registro de características herdáveis das plantas que devem ser consistentes e
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uniformemente expressas em diversos ambientes. Esse processo ajuda a identificar e

separar geneticamente os acessos de uma coleção. Os métodos moleculares de

caracterização de germoplasma, conhecidos como marcadores moleculares, revelam as

diferenças nas sequências de DNA entre indivíduos distintos, abrangendo regiões genéticas

expressas e não expressas. Com os avanços na biotecnologia, ferramentas como os

marcadores moleculares do DNA estão sendo usadas na pesquisa agropecuária. Eles

ajudam a caracterizar o germoplasma, ampliando a análise da variabilidade genética dos

acessos (Faleiro et al., 2008).

Estudos de diversidade e pureza genética: Os métodos que medem a similaridade

genética usando marcadores moleculares e coeficiente de parentesco têm abordagens

distintas. Eles se baseiam em tipos de informações diferentes e, como resultado, têm

potencial para erros distintos. É importante examinar a relação entre esses métodos de

análise de divergência e comparar suas vantagens e desvantagens. Somente assim

podemos determinar quais métodos fornecem estimativas mais precisas de similaridade

genética.

Teste de paternidade e seleção de genitores: avanço das Sequências de Repetição

em Tandem (STRs) tem trazido uma revolução para as análises forenses e se tornou o

marcador de DNA padrão em casos de teste de paternidade e exames de DNA.

Microssatélites, que são repetições curtas e repetitivas de sequências de tetranucleotídeos,

normalmente consistindo de 2 a 6 pares de bases que se repetem de 3 a 100 vezes em uma

região do DNA. A variabilidade é determinada pela quantidade de repetições observadas, e

como essas sequências não codificam proteínas, são consideradas neutras em termos de

seleção genética.

Seleção de resistência a patógenos: Os marcadores moleculares que carregam genes

de resistência estão intimamente ligados a genes específicos das plantas e com isso, eles

irão carregar os genes de resistência desejáveis até as plantas desejáveis, com isso fazendo

com que a planta que está por vir, seja resistência a tal patógeno desejado. Recomenda-se

que, ao realizar cruzamentos entre plantas suscetíveis e resistentes no programa de

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melhoramento, a seleção assistida seja aplicada já na primeira geração, isso é importante

porque a presença de marcadores ligados tanto aos loci de suscetibilidade quanto de

resistência destaca a importância e o valor da utilização desses marcadores (Cardoso et al,

2014).

Associação com características quantitativas: Apesar de muitos estudos terem sido

conduzidos para identificar e mapear Loci de Características Quantitativas (QTLs) com a

ajuda de marcadores moleculares, há poucos casos de variedades comerciais criadas

usando esses marcadores para a seleção de QTLs. Existem outros fatores a serem

considerados, como a consistência da ligação entre o marcador molecular e o Locus de

Características Quantitativas (QTL), a influência da interação entre o QTL e o ambiente, bem

como a necessidade de selecionar simultaneamente várias características que

frequentemente estão interligadas.

Seleção assistida: Quando os marcadores moleculares estão intimamente

relacionados a alelos de resistência, podem ser empregados na seleção assistida por

marcadores (S.A.M.). Um exemplo prático dessa aplicação ocorre durante o processo de

combinação de múltiplos alelos de resistência, conhecido como piramidação. Porem existem

desafios significativos no uso da seleção assistida por marcadores (SAM), incluindo os

custos elevados, a variabilidade na eficácia dos marcadores e o risco de redução de outras

características. No entanto, alguns especialistas acreditam que, apesar desses desafios, a

SAM tem o potencial de gerar ganhos genéticos mais altos no melhoramento, em

comparação com os métodos.

No método AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), duas enzimas de

restrição são usadas, uma que corta o DNA raramente e outra que corta com frequência. O

DNA é clivado em fragmentos, e cada fragmento é ligado a adaptadores com sequências

conhecidas. Em seguida, esses fragmentos passam por uma amplificação seletiva. Nessa

etapa, os fragmentos são submetidos a uma reação de PCR com dois primers diferentes.

Um primer consiste na sequência do adaptador da enzima de corte raro, com a adição de

um ou mais nucleotídeos aleatórios na extremidade 3', enquanto o outro primer é baseado

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na sequência do adaptador da enzima de corte frequente, seguido por nucleotídeos

arbitrários. Os produtos da amplificação resultam em uma variedade de fragmentos de DNA.

Esses fragmentos são então separados por eletroforese em um gel de poliacrilamida

desnaturante. O polimorfismo genético é identificado pela presença ou ausência de

determinadas bandas nesse gel, o que fornece informações valiosas sobre as diferenças nas

sequências de DNA entre as amostras analisadas. Eles podem ser usados em estudos

filogenéticos, discriminação de variedade, diagnósticos de doenças, análise de pedigree,

construção de mapas de ligação e clonagem de genes de interesse. Podem ter como

vantagens: A análise simultânea de múltiplas regiões do genoma oferece alta precisão e é

altamente consistente. Graças à riqueza de informações que proporcionam, esses

marcadores permitem a identificação de variações genéticas entre indivíduos, populações e

espécies de forma eficaz. E desvantagens: A dificuldade de distinguir diferentes variantes

alélicas em uma região genética específica leva à utilização de marcadores dominantes, nos

quais não se consegue discernir entre as diferentes variantes, simplificando assim a análise

genética.

A técnica de Amplificação Aleatória de Polimorfismos de DNA (RAPD) envolve a

amplificação de DNA genômico por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR),

usando um iniciador curto e aleatório de cerca de 10 nucleotídeos. Durante a PCR, a

amplificação ocorre quando dois locais de ligação do iniciador são semelhantes e

direcionados de maneira oposta. Isso leva à amplificação de fragmentos de DNA aleatórios

no genoma, sem a necessidade de conhecer a sequência de DNA prévia. Para visualizar os

resultados, a PCR é separada em gel de agarose corado com brometo de etídio. O

polimorfismo, que é a variação na sequência de DNA, é evidenciado nos locais de ligação

do iniciador ou entre eles. Através da eletroforese, podemos confirmar a presença ou

ausência de bandas específicas, o que indica variações genéticas. Importante ressaltar que

o RAPD é um marcador dominante, ou seja, não permite diferenciar indivíduos homozigotos

(com duas cópias iguais do gene) de heterozigotos (com duas cópias diferentes do gene).

Essas variações reveladas pelo RAPD podem ser resultado de mutações, inserções ou
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deleções nos locais de ligação do iniciador, e isso proporciona informações valiosas sobre a

diversidade genética e as diferenças entre os organismos analisados. Eles podem ser

usados para determinação da diversidade e estrutura genética, estabelecimento de relações

filogenéticas e diferenciação de espécies próximas. Tendo suas vantagens como: Não

precisar a criação de primers específicos nem o sequenciamento prévio do DNA. Além disso,

ela pode ser realizada com pequenas quantidades de DNA e é capaz de mapear regiões de

DNA repetitivas. Isso a torna uma ferramenta versátil para identificar variações genéticas

sem a necessidade de preparação complexa ou custos elevados. E as desvantagens:

fornece pouca informação genética em cada loco examinado e tem uma baixa consistência

ou reprodutibilidade em suas análises, isso significa que pode ser menos confiável para

fornecer dados detalhados sobre a diversidade genética e as variações entre amostras.

Os microssatélites, também conhecidos como SSRs (Sequências de Repetição em

Tandem Simples), são pequenas repetições de um a seis nucleotídeos que ocorrem

consecutivamente no genoma, e são encontrados em abundância. Além disso, eles também

podem ser encontrados nos cloroplastos e mitocôndrias. Os SSRs são as repetições mais

curtas em um locus, mas apresentam um alto nível de variação genética. Essa alta

variabilidade ocorre devido à presença de diferentes números de repetições nas regiões dos

microssatélites, e essa variação pode ser facilmente detectada por meio da técnica de PCR.

A ocorrência de SSRs pode ser resultado de vários processos, como o deslizamento do DNA

de fita simples, recombinação do DNA de fita dupla, movimentação de elementos móveis e

incompatibilidades genéticas. É importante mencionar que as sequências que cercam os

microssatélites são frequentemente conservadas, e essas sequências são usadas no

desenvolvimento de primers para amplificar os SSRs, tornando-os valiosos para estudos de

diversidade genética e mapeamento genético. Podendo ser usado em diversas aplicações

no melhoramento de plantas, como caracterização da estrutura e diversidade

genética, seleção assistida por marcadores (SAM), mapeamento e estudos genéticos. Suas

vantagens são: Os microssatélites são marcadores genéticos codominantes, o que significa

que ambos os alelos de um indivíduo podem ser identificados. Eles também têm uma alta
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reprodutibilidade, o que significa que os resultados das análises são consistentes e

confiáveis. Além disso, esses marcadores são encontrados em grande quantidade no

genoma, tornando-os amplamente disponíveis para análises genéticas. E suas

desvantagens: Criação de marcadores genéticos que são exclusivos para uma espécie

específica, permitindo a identificação precisa dessa espécie com base em características

genéticas distintas.

Os SNPs (Polimorfismos de Nucleotídeo Único) baseiam-se na detecção de variações

genéticas resultantes da mudança de uma única base no genoma. Geralmente, essas

variações são bi-alélicas, ou seja, existem duas versões do gene, e são amplamente

distribuídas no genoma, ocorrendo em regiões expressas e não expressas. Diversas

estratégias são empregadas para identificar SNPs. Atualmente, o sequenciamento em larga

escala do genoma de diferentes organismos possibilitou a identificação de SNPs por meio

da análise de milhares de sequências geradas. Independente da técnica de identificação, o

uso de ferramentas de bioinformática é crucial para auxiliar nesse processo. Além disso, é

essencial realizar a validação experimental desses polimorfismos, o que pode ser feito por

meio de várias técnicas, como microarranjos, DHPLC, espectroscopia de massa, PCR em

tempo real, sequenciamento de única base, entre outras. Recentes métodos de genotipagem

de alto rendimento, como NGS (Sequenciamento de Nova Geração), GBS (Genotyping by

Sequencing) e PCR alelo-específico, tornaram os SNPs os marcadores mais atraentes para

a genotipagem devido à sua abundância, precisão e eficiência na detecção de variações

genéticas. Podem ser usados em análise de genes, a identificação de bases genéticas de

doenças, a seleção assistida por marcadores, estudos de GWAS (Associação de Genoma

Ampla), a identificação de plantas haploides/diploides, a genotipagem de variedades de

plantas, a facilitação das etapas de retrocruzamento para genes de interesse, o mapeamento

genético e a identificação de Loci de Características Quantitativas (QTLs). Em suma, os

SNPs são uma ferramenta versátil e poderosa em genética e pesquisa biológica. Tendo suas

vantagens: Possibilitam a genotipagem de milhares de loci (locais genéticos) de uma só vez

e apresentam uma natureza codominante, o que significa que ambos os alelos de um

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indivíduo podem ser distinguidos. Isso os torna uma ferramenta eficiente e precisa para a

análise genética em larga escala. E as suas desvantagens: Não possuem múltiplos alelos, o

que limita sua utilidade em estudos de diversidade genética em nível de população. Além

disso, o desenvolvimento de marcadores de SNPs pode ser dispendioso.

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CONCLUSÃO

Os marcadores moleculares são importantíssimos na investigação genética e

biotecnologia, desempenhando um papel fundamental em várias aplicações e abrangendo

diversos tipos. Sua relevância se destaca ao impulsionar avanços em áreas variadas, desde

o aprimoramento genético de plantas e animais até a medicina, conservação da

biodiversidade, agricultura, garantia de segurança alimentar e pesquisa científica. Essas

ferramentas desempenham um papel importante na aceleração do progresso em todo o

mundo.
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