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Journal of Cancer 2022, vol. 13 3404

Ivyspring
Editora internacional
Jornal do Câncer
2022; 13(13): 3404-3414. doi: 10.7150/jca.76516
Trabalho de pesquisa

Detecção precoce de mutações somáticas do câncer colorretal

usando biópsias líquidas de cfDNA em um modelo de carcinogênese
murina
Héctor Martínez-Gregorio1,2, Clara Estela Díaz-Velásquez1,2, Mario Esaú Romero-Piña3, Miguel Ruiz De La
Cruz1,2,4, Norma Laura Delgado-Buenrostro2, Aldo De La Cruz-Montoya1,2, Yolanda Irasema Chirino2, Luis
Ignacio Terrazas1,2, Luis Alberto Medina3,5, Felipe Vaca-Paniagua1,2,6ÿ
1. Laboratorio Nacional en Salud, Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en Enfermedades Crónico-Degenerativas, Facultad de Estudios Superiores Iztacala,
Tlalnepantla 54090, México.
2. Unidad de Biomedicina, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, Tlalnepantla 54090, México.
3. Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer INCan-UNAM, Instituto Nacional de Cancerologia, Ciudad de México 14080, México.
4. Avenida Instituto Politécnico Nacional # 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, Delegación Gustavo A. Madero, CP Departamento de Infectómica y Patogénesis
Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Cidade do México 07360, México
5. Instituto de Física, Universidad Nacional Autónoma de México, Ciudad de México 04510, México.
6. Subdireção de Investigação Básica, Instituto Nacional de Cancerologia, Ciudad de México 14080, México.

ÿ Autor para correspondência: felipe.vaca@iztacala.unam.mx; Tel.: +52-55-5623-1333 (ramal 39788).

© O(s) autor(es). Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Consulte http://ivyspring.com/terms para obter os termos e condições completos.

Recebido: 2022.06.25; Aceito: 2022.08.29; Publicado: 2022.09.25

Abstrato
O câncer colorretal (CCR) é um dos cinco principais cânceres em incidência e mortalidade em todo o mundo. A
detecção precoce dessa neoplasia por meio da análise do DNA livre circulante (cfDNA), que carrega alterações
genéticas tumorais, como uma biópsia líquida, pode ter um grande impacto no aprimoramento da detecção precoce
e na redução da taxa de mortalidade. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a viabilidade do uso do cfDNA como
uma biópsia líquida para a detecção precoce do CRC. Para tanto, implementamos um modelo de carcinogênese
murina induzida por azoximetano e sulfato de sódio dextrano para detectar mutações somáticas oncogênicas em Ctnnb1
e Kras durante o desenvolvimento do CRC. Para aumentar a sensibilidade na detecção, E-ice-COLD-PCR foi utilizado
para enriquecer seletivamente os alelos mutantes, seguido de sequenciamento massivamente paralelo. Mutações
somáticas condutoras foram detectadas em Ctnnb1 e Kras nas biópsias líquidas de estágios iniciais de
desenvolvimento do tumor, correspondendo à formação de focos de criptas aberrantes, as primeiras alterações
histológicas que podem ser identificadas ao longo da formação do CCR. A concentração de cfDNA foi aumentada ao
longo do processo carcinogênico. Policlonalidade em Ctnnb1 foi encontrada em amostras de tumor e cfDNA neste
modelo. Por outro lado, o uso do cfDNA como teste não invasivo resultou em detecção precoce superior em
comparação com a imagem microPET/CT. Como prova de princípio, este estudo mostra o grande potencial de uso
da PCR alélica específica para a detecção e enriquecimento de alelos patogênicos presentes em amostras de cfDNA,
como um teste para detecção precoce não invasiva de CCR. Este trabalho fornece evidências científicas para
estabelecer bases metodológicas que permitam a detecção precoce de mutações no cfDNA obtido do plasma de CRC em humanos.

Palavras-chave: modelo AOM/DSS; cfDNA; biópsia líquida; detecção precoce; biomarcadores; câncer colorretal;
policlonalidade.

Introdução
O câncer colorretal (CCR) está entre os cinco tipos de
câncer com maior incidência e mortalidade em todo o mundo
[1]. A evolução do CCR de focos criptográficos aberrantes
(FCA) para carcinoma in situ pode levar décadas e é
assintomática, tornando a detecção precoce e o sucesso
terapêutico desafiadores. A detecção do CCR depende da
colonoscopia, análise histopatológica,
imagiologia e avaliação de marcadores tumorais séricos, no
entanto, essas estratégias ainda não satisfazem totalmente as
necessidades clínicas devido à sua falta de sensibilidade e
especificidade para detectar tumores colorretais precoces [2-4].
Na clínica, o uso de biópsias tumorais é o padrão ouro
para o diagnóstico e análise molecular.
No entanto, a maioria dos pacientes é biopsiada localmente

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estágios avançados e biópsias de tecido podem não refletir
a heterogeneidade intratumoral presente no tumor. Por
outro lado, o uso de biópsias líquidas, como cfDNA no
plasma sanguíneo, é uma abordagem recente que pode
permitir a detecção precoce e capturar um perfil molecular
mais abrangente do CCR de maneira minimamente invasiva.
O uso de cfDNA para a detecção precoce de CRC tem sido
sugerido, no entanto, essas malignidades são frequentemente
detectadas em estágios avançados, o que limita seu uso.
Por esse motivo, vários relatórios descrevem o uso potencial
de cfDNA no gerenciamento de CRC como um marcador
de recorrência pós-operatória de tumor [5–7] e para avaliar
a carga tumoral em pacientes metastáticos [8,9] devido à
falta geral de acesso a amostras humanas nos estágios
iniciais do desenvolvimento do CRC.
Consequentemente, o objetivo deste trabalho foi a
identificação de mutações somáticas associadas aos
estágios iniciais do desenvolvimento do CRC usando cfDNA
em um modelo in vivo bem estabelecido de carcinogênese
induzida. Primeiro, definimos o modelo in vivo de CRC para
recapitular todo o processo biológico que ocorre
durante o desenvolvimento do CRC. Em segundo lugar,
implementamos uma metodologia de PCR específica de
alelo para enriquecer seletivamente e identificar alelos
mutantes conhecidos associados ao estágio inicial de
desenvolvimento do CRC, juntamente com sequenciamento
paralelo massivo de cfDNA. Em terceiro lugar, o uso da
imagem microPET/CT nos permitiu avaliar o desenvolvimento
do tumor e ter uma visão mais próxima do cenário clínico.
Com essas estratégias, conseguimos detectar mutações
somáticas motrizes no cfDNA em focos de criptas
aberrantes, as primeiras alterações histológicas que podem
ser identificadas ao longo da formação do CRC. O uso do
cfDNA como um teste não invasivo resultou em detecção
precoce superior em comparação com a imagem microPET/
CT. Além disso, a policlonalidade de Ctnnb1 foi um achado
interessante não observado anteriormente neste modelo.
Como prova de princípio, os resultados deste trabalho
fornecem evidências no sentido de estabelecer bases
metodológicas que permitam a detecção precoce de
alterações somáticas no plasma associadas ao CCR em
humanos.

Figura 1. Desenho experimental e o modelo de carcinogênese murina induzida por azoximetano e dextrano sulfato de sódio (AOM/DSS) para a detecção de
mutações de condução somática em estágios iniciais e sondas bloqueadoras usadas em E-ice-COLD-PCR para enriquecer alelos mutantes. (A) A imagem mostra
a indução do CRC, bem como os exames moleculares e de imagem utilizados neste estudo. Amostragem de sangue e microPET/CT foram definidos de acordo com o
desenvolvimento do câncer neste modelo AOM/DSS. (B) Sondas bloqueadoras usadas para enriquecer seletivamente alelos mutantes em Ctnnb1 e Kras.

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Doze horas antes de tomar microPET/CT, camundongos

Materiais e métodos receberam alimentação com meio de contraste iodixanol 270
indução de CRC (Visipaque) e água ad libitum. Em seguida, 7,4 – 9,25 MBq
(200-250 ÿCi) de 18FDG foram administrados por via
Neste estudo, utilizamos 31 camundongos BALB/c
intravenosa ao grupo AOMDSS. Após 20 min de biodistribuição
machos, com cinco a seis semanas de idade, adquiridos
de 18FDG, os camundongos foram colocados no microPET/
dos Laboratórios Harlan (México) e mantidos em ambiente
CT sob anestesia inalatória (oxigênio a 800 mmHg e isoflurano
livre de patógenos na Facultad de Estudios Superiores
1,5%). Os exames MicroPET/CT foram realizados em um
Iztacala (FES-I). , Universidad Nacional Autónoma de México
equipamento Albira ARS microPET/SPECT/CT (Bruker,
(UNAM) biotérios. Os camundongos foram alojados em
Espanha) usando um protocolo de emissão de corpo inteiro
gaiolas plásticas com comida e água ad libitum e distribuídos
com 10 min para PET e 600 projeções (tensão do tubo 35 kV
em 2 grupos: grupo controle (4 camundongos) e grupo AOM/
e 0,2 mA) para exames de TC. As imagens PET foram
DSS (27 camundongos). Camundongos do grupo AOM/DSS
reconstruídas com o software de reconstrução da Albira com
receberam uma injeção intraperitoneal (ip) de azoximetano base na rotina de maximização da expectativa de subconjuntos
(AOM) (Sigma-Aldrich Cat. A5486) dosado a 12,5 mg/kg de
ordenados (OSEM) (três iterações). O valor da glicólise total
peso corporal no dia 1; o grupo de controle recebeu uma
da lesão (TLG) foi calculado a partir das imagens usando o
injeção ip de solução salina.
software PMOD (PMOD-Technologies LLC, Zurique), um
Sete dias depois, 2% de sulfato de dextrano sódico (DSS)
valor quantitativo que mede a concentração de 18FDG
(MP Biomedicals Cat. 160110) foi fornecido em água potável
presente em um tecido metabolicamente ativo (ou seja, o
ad libitum por 7 dias, seguido de água sozinha pelos próximos
valor de captação padrão: SUV) . O TLG é útil para comparar
14 dias, para repetir dois ciclos adicionais de DSS no grupo
o SUV entre diferentes tumores ou no mesmo tumor em
AOM/DSS (Figura 1A) [10,11]. Todo o protocolo durou 70
momentos diferentes.
dias e ao final do experimento, os camundongos foram
sacrificados e os tumores colorretais foram excisados e
armazenados a -80°C. Projeto de primer e sondas de bloco
Todos os procedimentos experimentais estavam estritamente
Projetamos dois conjuntos de primers compatíveis com
de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e
E-ice-COLD-PCR (amplificação de CO de enriquecimento
Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de
aprimorado e completo em temperatura de desnaturação
Saúde (EUA) e este protocolo foi aprovado pelo Comitê de
mais baixa Reação em cadeia da polimerase) e PCR de
Ética em Experimentação Animal da Facultad de Estudios
ponto final para amplificar as regiões mutantes do exon
Superiores Iztacala (CE/FESI/042017/1168).
Ctnnb1 de camundongos 3, códon 32, 33, 34, 37 e 41; e
éxon 2 de Kras , códon 12 (Tabela S1).
Extração e quantificação de DNA Duas sondas bloqueadoras (BPs) para Ctnnb1 e Kras
foram projetados e utilizados em E-ice-COLD-PCR para a
Amostras de sangue foram coletadas durante os dias enriquecimento de alelos mutantes no modelo de AOM/DSS,
1, 21, 28, 35, 42, 49, 56 e 70 para ambos os grupos. Amostras
conforme descrito anteriormente [14,15]; Figura 1B e Tabela
de sangue foram coletadas através de uma incisão na cauda S2. Os BPs foram direcionados para os alelos do tipo
dos camundongos e coletadas por gotejamento em um tubo
selvagem, com uma sobreposição de 5 bases com os primers
microtainer com EDTA (BD Microtainer Cat. 365974). A
diretos de Ctnnb1 e Kras, e a extremidade 3' tinha um grupo
extração de cfDNA foi realizada com 63 – 200 ÿL de plasma
fosforilado. Para maximizar o Tm entre o alelo do tipo
com o Mini kit Plasma/Serum Cell-Free Circulating DNA
selvagem e o mutante, os BPs continham ácidos nucleicos
Purification (Norgen Biotek Corp, Cat. 55100) de acordo com
bloqueados (LNAs) no local onde esperamos encontrar as
as recomendações do fabricante.
mutações, fazendo com que o alelo mutante desnaturasse
O DNA das amostras de tumor foi extraído com o kit DNeasy
preferencialmente a uma temperatura mais baixa do que o
Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguindo as
alelo do tipo selvagem.
instruções do fabricante.
O DNA extraído de ambos os recursos biológicos foi Endpoint PCR e E-ice-COLD-PCR
quantificado por fluorometria (Qubit, Life Technologies) e
Amplificamos Ctnnb1 e Kras nas amostras tumorais e
armazenado a -20°C até o uso.
o cfDNA usando E-ice-COLD-PCR e endpoint PCR. O E-ice-
Atividade metabólica do tumor e análise de imagem COLD-PCR utilizou uma temperatura crítica (Tc), definida
como a temperatura na qual o alelo mutante que está ligado
O acompanhamento do tumor foi feito com microPET/ ao PB é
CT usando 2-[18F]-fluoro-2-desoxi-D glicose (18FDG), que
preferencialmente desnaturado, pois hibrida imperfeitamente
avalia a atividade glicolítica das células tumorais, que é maior
com as sondas e sua temperatura de fusão (Tm) é menor
do que em células normais, [12,13 ] nos dias 1, 21, 28, 35,
que o alelo selvagem. Tc
42, 49 e 70.

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foi definido por análise de fusão de alta resolução Análise estatística

(HRMA). Para a determinação do Tc de Ctnnb1
e Kras, foram utilizados três templates diferentes: alelo
selvagem, alelo mutante e uma mistura equimolar de
ambos, que foram amplificados por PCR de ponto final
usando 1 ng dessas moléculas com o kit HRM Fast
PCR (KAPA cat. KK420). Os produtos obtidos da PCR
foram quantificados e misturados com o BP em uma
molaridade de 1:1 (produto de PCR: BP), e analisados
por HRMA (0,3 °C por aquisição, 2 seg antes de cada
aquisição), de 75-90° C. Uma vez que o Tc foi
determinado para Ctnnb1 e Kras, usamos o cfDNA
para realizar o E-ice-COLD-PCR com 50 nm do BP
com base em estudos anteriores [14,15].
Sequenciamento Sanger e Sequenciamento
Massivamente Paralelo
Para detectar mutações nas amostras tumorais,
realizamos o sequenciamento Sanger no Applied
Biosystems 3500xL Genetic Analyzer. As bibliotecas
foram preparadas no Laboratório Nacional en Salud:
Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en
Enfermedades Crónico-Degenerativas, FESI, UNAM
(Figura S1) para detectar mutações nas amostras
tumorais e cfDNA, e sequenciadas na plataforma
MiSeq (Illumina). Os arquivos Fastq foram alinhados
com o genoma de referência do mouse mm10 com a
plataforma de bioinformática da galáxia (https://
usegalaxy.org) usando bwa-mem [16]. Mutações
somáticas foram detectadas com Mutect2 [17] e visualizadas em IGV [18].
A avaliação de diferenças significativas foi
realizada por uma análise de variância (ANOVA) de
uma via, seguida pelos testes de comparação múltipla
de Tukey ou por testes t bicaudais não pareados com
GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, EUA). Uma relação
linear entre concentração de cfDNA e dias foi avaliada
por gráfico de dispersão e análise de regressão linear
com coeficiente de correlação R.
Resultados
Desenvolvimento tumoral no modelo AOM/DSS
Para realizar uma detecção aprimorada em
mutações de condução precoce no CRC,
implementamos o modelo AOM/DSS em nosso laboratório (Figura 1A
Durante o processo carcinogênico, o grupo OMA/DSS
apresentou piloereção, diarreia, sangramento e
protrusão anal, bem como perda de peso corporal
após cada ciclo de DSS em relação ao grupo controle
(Figura 2A).
Ao final do tratamento (dia 70), os camundongos
foram sacrificados para avaliação macroscópica do
cólon e excisão do tumor. O grupo AOM/DSS
desenvolveu tumores colorretais médios e distais, com
uma média de 9,8 ± 4,1 tumores por camundongo (Figura 2B, S2).
Ao longo da duração do tratamento, o cfDNA plasmático
foi extraído de 3 camundongos do grupo AOM/DSS
em cada amostragem. Um aumento na concentração
plasmática de cfDNA foi observado neste grupo
durante o processo carcinogênico (Figura 2C).

Figura 2. Alterações fisiológicas e desenvolvimento do tumor no modelo AOM/DSS. (A) Peso dos camundongos dos grupos AOM/DSS e controle durante o
desenvolvimento do CRC. (B) Número de tumores desenvolvidos no grupo AOM/DSS (n = 22 camundongos) e no grupo controle (n = 4 camundongos). (C) Concentração de
cfDNA durante a progressão do tumor. A concentração de cfDNA foi medida em triplicado. A correlação entre a concentração de cfDNA e os dias foi avaliada por análise de
regressão linear. As diferenças no número de tumores no grupo AOM/DSS e no grupo controle são apresentadas como média ± DP analisadas por testes t bicaudais não pareados (*p < 0,05).

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Figura 3. Detecção de microadenomas com microPET/CT. (A) Valores de glicólise total da lesão (TLG) em dias específicos de crescimento tumoral calculados a partir das
imagens. (B) Imagens microPET/CT representativas do mesmo animal em dias específicos. Setas amarelas e brancas mostram a captação de 18FDG no cólon e na gordura
marrom, respectivamente. A tomada de MicroPET/CT foi realizada em triplicado. Os dados são apresentados como média ± SEM analisados por uma ANOVA de uma via seguida
pelo teste de comparação múltipla de Tukey (*** p < 0,001).

Figura 4. Distribuição alélica de Ctnnb1 em amostras tumorais. Oncoprint retrata mutações encontradas em Ctnnb1 em 20 amostras de tumor analisadas de 20 camundongos
do grupo AOM/DSS no dia 70 que corresponde ao desenvolvimento de câncer colorretal neste modelo. Os códigos de cores mostram diferentes alelos mutados em Ctnnb1.
As alterações são mostradas no nível de proteína e cDNA.

amostras nos códons 32, 33, 34, 37 e 41; em Kras não

Detecção de microadenomas com microPET/
CT
O crescimento do tumor durante o processo
carcinogênico foi acompanhado com imagens microPET/CT
usando 18FDG como sonda molecular. A atividade
metabólica do tumor foi determinada em termos de Glicólise
Total da Lesão (TLG), em unidades de valor padrão de
captação (SUV), no cólon no dia 36 no grupo AOM/DSS,
estágio que corresponde à formação de microadenomas
neste modelo (Figura 3A). As imagens microPET/CT do
mesmo camundongo em momentos diferentes (Figura 3B)
ilustram o crescimento do tumor no cólon.
Tumores colorretais exibem policlonalidade em
Ctnnb1
enriquecimento mutante de Ctnnb1 e Kras foi fixada em
Para analisar o genótipo do tumor em Ctnnb1 e Kras, 83,4°C e 80,8°C, respectivamente.
PCR de endpoint e sequenciamento de Sanger foram feitos
em 20 amostras de tumor de 20 camundongos do grupo
AOM/DSS. Mutações em Ctnnb1 foram detectadas em todos os
foram detectados (Figura 4). Além disso, mais de duas
mutações diferentes em Ctnnb1 foram encontradas em 14
das 20 amostras de tumor (70%) mostrando policlonalidade
neste modelo.
Sondas bloqueadoras maximizam Tm do alelo
selvagem e mutante
Para aumentar a desnaturalização seletiva e
enriquecimento de alelos mutantes por E-ice-COLD-PCR, o
Tc de cada um dos BPs foi determinado por HRMA. Tc
foi definido como 84,4°C para o alelo selvagem Ctnnb1 BP
e 83,4°C para o alelo mutante BP, com Tm de 1,0°C entre
os dois alelos (Figura 5A,B). A Tc para o alelo selvagem BP
de Kras foi de 81,5°C e para o alelo mutante BP foi de
80,8°C, com Tm de 0,7°C (Figura 5C,D). Assim, a Tc para

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Figura 5. Determinação da Tc para E-ice-COLD-PCR. (A) HRMA para Ctnnb1 usando o alelo de tipo selvagem, alelo mutante e uma mistura equimolar de ambos. (B)
Análise estatística de HRMA para Ctnnb1. (C) HRMA para Kras usando o alelo de tipo selvagem, alelo mutante e uma mistura equimolar de ambos. (D) Análise estatística
de HRMA para Kras. O experimento foi realizado com três repetições. As barras são apresentadas como a média ± DP analisada por uma ANOVA de uma via seguida
pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p < 0,05 e ***p < 0,001.

Figura 6. Análise de mutações Ctnnb1 e enriquecimento de vezes em 5 amostras de tumor com E-ice-COLD-PCR e PCR de ponto final. (A) Mutações detectadas
em Ctnnb1. As alterações são mostradas no nível de proteína e cDNA. (B) Enriquecimento dobrado em diferentes códons de Ctnnb1. Enriquecimento dobrado = fração
alélica E-ice-COLD-PCR / PCR de ponto final da fração alélica.

Figura 7. Análise das mutações Ctnnb1 e Kras no cfDNA durante o desenvolvimento do CRC. O oncoprint mostra mutações detectadas em Ctnnb1 e Kras
com E-ice-COLD-PCR e PCR de endpoint, detecção de tumor com microPET/CT e enriquecimento de Ctnnb1 no códon 32 e Kras no códon 12.

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as mesmas mutações em Ctnnb1 com E-ice-COLD-PCR e

E-ice-COLD-PCR mostrou níveis variáveis de
enriquecimento em amostras de tumor e cfDNA
Antes da análise do cfDNA, avaliamos a sensibilidade
do E-ice-COLD-PCR e PCR de endpoint seguido de
sequenciamento de próxima geração (NGS) para detectar
mutações em Ctnnb1 e Kras em 5 amostras de tumor
(camundongos: M1, M3 M8, M10 e M16 ) previamente
analisados com sequenciamento de Sanger. Realizamos
sequenciamento profundo com uma profundidade média de
31.310X (±8.924) para caracterizar os alelos de hotspot Kras
e Ctnnb1 nas amostras tumorais (Figura S3). nós detectamos
PCR de ponto final (Tabela S3, S5; Figura S4); Kras
as mutações não foram detectadas por nenhuma das
abordagens (Figura 6A). Encontramos diferentes níveis de
enriquecimento com as duas técnicas de PCR, mutações em
Ctnnb1 nos códons 32 e 41 foram preferencialmente
enriquecidas em comparação com os códons 33, 34 e 37
(Figura 6B e Tabela S3). Em contraste com o Sequenciamento de Sanger, o e
A PCR com NGS detectou 5 mutações adicionais em 3
camundongos: M1 (códon 34), M3 (códon 33 e 34) e M16
(códon 33 e 37) (Figura 4 e 6A).

Figura 8. Resumo dos pontos-chave para detecção precoce de CRC usando cfDNA. No topo, o desenvolvimento do câncer de cólon e o uso de biópsia líquida para
detecção de tumores no modelo AOM/DSS. Na parte inferior, as técnicas moleculares e de imagem, bem como sua sensibilidade para detectar o CCR.

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Para detectar mutações no cfDNA do grupo AOM/DSS,
usamos as mesmas estratégias das amostras tumorais. A
profundidade de sequenciamento do cfDNA foi de 159.509X
(±43.030) (Figura S3). O E-ice-COLD-PCR detectou 49
mutações em ambos os genes, enquanto o endpoint PCR
detectou 29 mutações ao longo da progressão do
desenvolvimento carcinogênico (Figura 7; Tabelas S4, S6).
Mutações em Ctnnb1 foram detectadas nos códons 32, 33, 34,
37 e 41 com E-ice-COLD-PCR; PCR de ponto final detectou
mutações nos códons 33, 34 e 41. Ambas as técnicas de PCR
detectaram mutações em Kras no códon 12.
E-ice-COLD-PCR revelou mutações em Ctnnb1 e Kras em
todas as amostras de cfDNA analisadas (3/3), e endpoint PCR
em 2 amostras (2/3) no dia 22, o que corresponde à formação
de ACF, pequeno precursor lesões para o desenvolvimento do
CCR, o que corresponde a uma detecção precoce. Identificamos
diferentes níveis de enriquecimento, por exemplo Ctnnb1 no
códon 34 foi preferencialmente enriquecido 2 a 4 vezes no
ACF, mas não em estágio avançado (Figura 7 e Tabela S4).
Já o Kras foi enriquecido em quase todas as etapas do CRC.
Não foi possível comparar os níveis de enriquecimento de
Ctnnb1 e Kras
em alguns camundongos porque foram detectados apenas
com E-ice-COLD-PCR. Além disso, identificamos policlonalidade
em Ctnnb1 com E-ice-COLD-PCR em camundongo M7 (dia
28), camundongo M10 (dia 35); camundongos M19, M20 e
M21 (dia 56); e com PCR de ponto final em camundongo M21
(dia 56).
Discussão
O câncer é uma das principais causas de morte no
mundo. Em 2020, a OMS relatou 935.173 mortes por CCR,
tornando-se a segunda principal causa de morte por câncer no
mundo [1]. Devido ao seu curso assintomático, a detecção
tardia é um fator importante que contribui para a mortalidade
do CCR. Durante décadas, o manejo do paciente com CCR
baseou-se na colonoscopia, análise histopatológica e molecular
dos tecidos tumorais, tomografia computadorizada, ressonância
magnética e avaliação de antígenos carcinoembrionários ou
de carboidratos no soro. Apesar de sua importância crítica,
essas estratégias ainda não satisfazem totalmente as
necessidades clínicas devido à falta de sensibilidade e/ou
especificidade para detectar tumores colorretais precoces [2–
4]. Em contraste, o uso de biópsias líquidas, como cfDNA,
ganhou interesse devido à sua viabilidade para detectar
mutações específicas do tumor. No entanto, existem algumas
limitações para o uso de cfDNA para detecção precoce de
CRC: i) devido à ausência de amostras em estágios iniciais de
desenvolvimento de CRC, vários relatórios usaram biópsias
líquidas para gerenciamento de CRC como um marcador de
recorrência pós-operatória do tumor [5 –7] e avaliar a carga
tumoral em pacientes metastáticos [8,9]; ii) a fração alélica
tumoral do cfDNA em estágios iniciais é
3411
baixo e requer abordagens moleculares especializadas, como
BEAMing, PCR digital e TAM-Seq [19,20].
Para resolver este problema, o objetivo deste trabalho foi
detectar mutações somáticas associadas ao estágio inicial de
desenvolvimento do CRC usando cfDNA em um estudo in vivo
modelo de carcinogênese induzida e pela implementação de
uma nova abordagem molecular para identificar mutações
tumorais com baixas frações alélicas.
Um modelo bem estabelecido de carcinogênese induzida
quimicamente em camundongos foi usado para recriar todo o
processo patogênico de desenvolvimento do CCR [21,22],
desde seu início até o estágio localmente avançado, como
observado em humanos. Com essa abordagem, foi possível
avaliar as alterações moleculares no estágio inicial de
desenvolvimento do CRC, uma vez que mutações hotspot bem
conhecidas são geradas em Ctnnb1 e Kras
(Figura 8). Antes de avaliar as alterações genéticas, foram
analisadas as alterações fisiológicas. O grupo AOM/DSS
apresentou piloereção, diarreia, sangramento e protrusão anal,
bem como perda de peso corporal após cada ciclo de DSS em
comparação com o grupo controle.
Esses eventos são devidos ao dano das células epiteliais
colônicas e à inflamação causada pelo DSS [23-25]. Por outro
lado, o grupo OMA/DSS desenvolveu tumores colônicos
conforme descrito anteriormente [10,22]. A maioria dos tumores
estava localizada no cólon médio e distal, como é comumente
observado no CCR humano [26]. Vários estudos mostraram
uma correlação entre os níveis de cfDNA e a carga tumoral
[27,28] e inflamação crônica [29,30]. Observamos um aumento
na concentração plasmática de cfDNA ao longo do
desenvolvimento do tumor. Assim, conforme relatado em
humanos, o tamanho do tumor e a inflamação crônica induzida
neste modelo de CRC influenciaram os níveis plasmáticos de
cfDNA.
As imagens de radiologia são usadas na clínica para
diagnóstico preciso e estadiamento do CRC para tomar
decisões terapêuticas ideais para os pacientes. Aqui, usamos
imagens de microPET/CT para rastrear a progressão do
crescimento do tumor em camundongos em um ambiente clinicamente relevan
Esta estratégia detectou o tumor no dia 35 no grupo AOM/DSS.
O ponto temporal deste modelo corresponde à transição de
microadenomas para adenomas, que são eventos iniciais no
desenvolvimento do CCR [21,22]. A resolução espacial do
microPET/CT é de 1,5 mm; portanto, lesões menores não são
detectáveis com esta técnica. A alteração histopatológica inicial
do CCR é o ACF, que tem menos de 1 mm de tamanho;
consequentemente, o microPET/CT não conseguiu detectar
essas lesões antes do dia 35. Além disso, nos dias 1, 35 e 42,
observou-se captação de 18FDG na gordura marrom porque o
microPET/CT foi obtido em uma sala climatizada. Em condições
de baixa temperatura, a gordura marrom é ativada para
termogênese e não representa um processo carcinogênico
como observado neste estudo. Nos dias 49 e 70 de
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Journal of Cancer 2022, vol. 13
Nas imagens de microPET/CT, não foi observada captação
de 18FDG na gordura marrom por estar concentrada na
massa tumoral já estabelecida.
Antes da análise do cfDNA, avaliamos as mutações
com endpoint PCR e sequenciamento de Sanger nas
amostras tumorais do grupo AOM/DSS.
Mutações em Ctnnb1 foram encontradas em todos os camundongos como
relatado anteriormente [31,32]. Mais de dois diferentes
mutações em Ctnnb1 foram encontradas em 14 das 20
amostras tumorais, sugerindo fortemente policlonalidade
neste modelo, no qual múltiplos subclones contendo
diferentes alelos mutantes coexistem no tumor. Este
fenômeno foi detectado no CRC humano, especialmente
na polipose adenomatosa familiar [33,34].
Esta é a primeira vez que este fenômeno é relatado no
modelo AOM/DSS.
Para detectar mutações somáticas associadas ao
desenvolvimento do CRC, implementamos uma abordagem
molecular para enriquecer e detectar alelos mutantes,
denominados E-ice-COLD-PCR, na fase inicial do
desenvolvimento do CRC com cfDNA. E-ice-COLD-PCR
tem sido usado para detectar mutações somáticas em
BRAF em tecido fresco congelado, FFPE e amostras de
plasma de pacientes com melanoma [15]; mutações em
KRAS em tecidos frescos congelados de pacientes com CRC [14]; e mutações nodo
no cfDNA de pacientes com CRC metastático [35], mas
não foi avaliado no estágio inicial do desenvolvimento do cada mutação específica. Em contraste, o uso de um BP
CCR. Para estabelecer nossa metodologia de detecção
precoce, primeiro avaliamos as mutações em amostras de
tumor usando E-ice-COLD-PCR e PCR de ponto final,
juntamente com sequenciamento massivamente paralelo.
Detectamos as mesmas mutações em ambas as técnicas
de PCR e os níveis de enriquecimento foram diferentes em Ctnnb1.
Mutações em Ctnnb1 nos códons 32 e 41 tiveram maior
fração alélica e enriquecimento com E-ice-COLD-PCR
do que com endpoint PCR (Figura 6; Tabela S3 e S5).
Não detectamos enriquecimento em Ctnnb1 nos códons
33, 34 e 37.
Para detectar as mutações Ctnnb1 e Kras no cfDNA,
empregamos a mesma estratégia experimental na amostra
de plasma. Um dos grandes desafios em
utilizando cfDNA é sua fração alélica mutante baixa, que é
inferior a 0,1% nos estágios iniciais do câncer.
Portanto, usamos a técnica E-ice-COLD-PCR para
enriquecer alelos mutantes com frequência de até 0,01%
[14,15]. Nesse sentido, o uso do E-ice-COLD-PCR não foi
desafiador nas amostras tumorais, mas foi fundamental no
cfDNA, pois detectou 49 mutações em comparação com o
endpoint PCR, que detectou apenas 29 mutações no cfDNA
do AOM/DSS grupo (Figura 7; Tabela S4 e S6). Na fase
mais precoce do desenvolvimento do CRC, a formação de
ACF (dia 22), que só é identificável a nível histológico,
detectámos mutações em Ctnnb1 e Kras em todos os
ratinhos analisados (3/3) com E-ice-COLD- PCR, e em dois
camundongos (2/3) com
3412
PCR de ponto final. Em comparação com microPET/CT,
que revelou o estabelecimento de microadenoma até
dia 35, a análise mutacional do cfDNA permitiu a detecção
mais precoce, até 10 dias antes. Este período corresponde
a cerca de 5-10 anos em pacientes humanos, o que
representa uma vantagem real na detecção desta doença
[36]. A descoberta de mais mutações no estágio de
formação de ACF com o uso de E-ice-COLD-PCR em
comparação com PCR de endpoint foi um resultado
importante. Isso poderia favorecer o uso do E-ice-COLD-
PCR para a detecção precoce do CRC. Por outro lado, a
análise do cfDNA foi capaz de capturar a policlonalidade
em diferentes etapas da formação do CRC, o que poderia
permitir o uso potencial da biópsia líquida para capturar a
heterogeneidade intratumoral no CRC.
Neste estudo, duas sondas bloqueadoras com LNA
foram projetadas para E-ice-COLD-PCR: uma para
enriquecer a mutação em Ctnnb1 nos códons 32, 33, 34,
37 e 41, e uma para Kras no códon 12. Nós raciocinamos
que isso A estratégia aumentaria o enriquecimento de
todas as cinco mutações de hotspot em Ctnnb1 com uma única sonda.
No entanto, a adição de LNAs diminuiu o enriquecimento
de algumas mutações independentemente do estágio de
desenvolvimento KRAS
tumor. Essa desvantagem pode ser
resolvida projetando sondas específicas com LNAs para
para detectar mutações em Kras usando cfDNA foi
favorável, pois detectou 5 mutações a mais do que a PCR
de endpoint. Enriquecimento em Kras foi observado em
diferentes etapas do desenvolvimento do tumor.
Na prática clínica, o uso de DNA tumoral obtido de
biópsias teciduais é considerado o padrão ouro para
genotipagem e diagnóstico direcionado.
No entanto, essas práticas estão sempre associadas a
complicações decorrentes de procedimentos cirúrgicos e,
em alguns pacientes, a amostra tumoral é inacessível.
Outro problema com o uso de biópsias é o tamanho limitado
dos tecidos, que não capta toda a heterogeneidade clonal
presente no tumor, resultando em resultados falsos
negativos, genotipagem incompleta e, finalmente, na
seleção de terapias ineficazes. Por outro lado, a análise do
cfDNA na forma de biópsia líquida não invasiva, capta
melhor a heterogeneidade subclonal e fornece a mesma
informação molecular presente na amostra do tumor, sendo
uma amostra fácil de obter na medicina
consultas.
Como prova de princípio, este trabalho demonstra
que a estratégia de enriquecimento seletivo de alelos
mutantes por E-ice-COLD-PCR acoplada ao sequenciamento
massivo paralelo pode ser usada para melhorar a detecção
de CCR por meio de biópsias líquidas, mesmo nos estágios
iniciais da neoplasia , enquanto técnicas convencionais,
como imagens avançadas, não permitem
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Journal of Cancer 2022, vol. 13
a detecção da doença. No entanto, reconhecemos que nosso
estudo é limitado por: i) o pequeno número amostral de
camundongos avaliados em cada estágio da progressão da
doença, o que impediu uma análise mais detalhada, bem
como a ausência de uma avaliação rigorosa da sensibilidade
e especificidade de o método; ii) não pudemos validar nossas
descobertas com outros métodos moleculares externos, como
PCR digital ou BEAMing; e iii) nossa incapacidade de validar
nosso desenho molecular em uma coorte independente com
camundongos ou humanos. No entanto, na ausência de
outros métodos moleculares, usamos o microPET/CT para
validar nossos achados moleculares e ter um contexto
biológico análogo a um cenário clínico para humanos.
Os primers e BPs foram projetados especificamente para os
alelos do camundongo. No entanto, a robustez deste método
pode ser transferida para a clínica com um design direcionado
para alelos humanos associados ao CCR.
Conclusão
Neste trabalho, demonstramos a viabilidade de usar
cfDNA como uma biópsia líquida para detecção de mutação
em cfDNA como uma técnica não invasiva nos estágios
iniciais do CRC em um modelo murino por PCR alelo-
específico. A PCR alelo-específica associada ao
sequenciamento massivo permitiu a detecção precoce do
CRC em comparação com os exames de imagem PET/CT,
que demonstraram a prova do princípio. Os resultados deste
trabalho fornecem evidências científicas para o estabelecimento
de bases metodológicas que permitam a detecção precoce
do CCR em humanos por meio da análise molecular por biópsia líquida.
Material suplementar
Figuras e tabelas suplementares.
https://www.jcancer.org/v13p3404s1.pdf
Abreviaturas
CCR: câncer colorretal; cfDNA: DNA livre circulante; E-
ice-COLD-PCR: Amplificação de CO de Enriquecimento
Completo e Aprimorado em Temperatura de Desnaturação
Mais Baixa Reação em Cadeia da Polimerase; microPET/CT:
microtomografia por emissão de pósitrons/tomografia
computadorizada; ACF: focos de criptas aberrantes; AOM:
azoximetano; DSS: sulfato de dextrano sódico; 18FDG: 2-
[18F]-fluoro-2-desoxi-D-glucosa; TLG: glicólise total da lesão;
BP: Sonda bloqueadora; LNA: ácido nucleico bloqueado; Tm:
temperatura de fusão; Tc: temperatura crítica; NGS:
sequenciamento de próxima geração; HRMA: análise de
fusão de alta resolução.
Agradecimentos
Héctor Martínez Gregorio é aluno do Posgrado em
Ciências Biológicas da Universidad Nacional Autónoma de
México (UNAM) e é bolsista do CONACyT.
3413
Financiamento
Este estudo foi financiado por doações de UNAM PAPIIT
IN219217, CONACyT Fondo Setorial 272573, Fondo SEP
CONACyT 285879, CONACYT National Laboratories 2021
projeto 315817 e recursos institucionais fornecidos pelo
Instituto Nacional de Cancerologia, México.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Todos os procedimentos experimentais seguiram
rigorosamente as recomendações do Guia para o Cuidado e
Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de
Saúde (EUA) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da (UNAM): (CE /FESI/042017/1168).
FES-I
Contribuições do autor
Conceituação: HMG e FVP.
Metodologia: HMG, CDV e MERP. Validação: HMG. Análise
formal: HMG e FVP. Investigação: HMG e FVP. Recursos:
LIT e VPF. Curadoria de dados: HMG. Redação-rascunho
original: HMG e FVP. Redação-revisão e edição: HMG,
AdlCM, NLDB, YIC, LIT, LAM e FVP. Visualização: HMG,
FVP e MRdlC. Supervisão: CDV e FVP. Administração do
projeto: FVP. Aquisição de financiamento: FVP. Todos os
autores leram e concordaram com a versão publicada do
manuscrito.
Interesses competitivos
Os autores declararam que nenhuma competição
existe interesse.
Referências
1. Sung H, et al. Estatísticas globais de câncer 2020: estimativas GLOBOCAN de incidência
e mortalidade em todo o mundo para 36 tipos de câncer em 185 países. CA
Câncer J Clin. 2021; 71: 209–249.
2. Levin B, e outros. Triagem e Vigilância para a Detecção Precoce de Câncer Colorretal e
Pólipos Adenomatosos, 2008: Uma Diretriz Conjunta da American Cancer Society, da
Força-Tarefa Multissociedade dos EUA sobre Câncer Colorretal e da
Colégio Americano de Radiologia. CA Câncer J Clin. 2008: 58; 130–160.
3. Lieberman DA. Prática clínica. Rastreamento do Câncer Colorretal. N Engl J
Med. 2009; 361: 1179–1187.
4. Toque WB. Adenomas Colorretais. N Engl J Med. 2016; 374: 1065–1075.
5. Lecomte T, et al. Detecção de DNA Associado a Tumores de Circulação Livre no Plasma
de Pacientes com Câncer Colorretal e sua Associação com o Prognóstico. Int J
Câncer. 2002; 100: 542–548.
6. Ryan BM, et al. Estudo Prospectivo do Mutante KRAS2 Circulante no Soro de Pacientes
com Neoplasia Colorretal: Forte Indicador Prognóstico no Acompanhamento Pós-
operatório. Intestino. 2003; 52: 101–108.
7. Tie J, et al. Análise de DNA de tumor circulante detecta doença residual mínima e prevê
recorrência em pacientes com câncer de cólon em estágio II. Sci Transl Med. 2016;
8: 346ra92.
8. El Messaoudi S, et al. DNA circulante como uma forte ferramenta de prognóstico
multimarcador para tratamento de pacientes com câncer colorretal metastático. Clin
Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 2016; 22: 3067–3077.
9. Lefebure B, et al. Valor prognóstico do DNA mutante circulante no câncer colorretal
metastático irressecável. Ana Cirurg. 2010; 251: 275–280.
10. León-Cabrera S, et al. Infecção helmíntica extraintestinal reduz o desenvolvimento de
tumorigênese associada à colite. Int J Biol Sci. 2014; 10: 948–
956.
11. Neufert C, Becker C, Neurath MF. Um modelo de camundongo induzível de
carcinogênese de cólon para análise de progressão tumoral esporádica e induzida
por inflamação. Nat Protoc. 2007; 2: 1998–2004.
https://www.jcancer.org
Machine Translated by Google

Journal of Cancer 2022, vol. 13 3414

12. Chowdhury FU, et al. [18F]FDG PET/CT Imagem de câncer colorretal: A

Revisão Pictórica. Pós-graduação Med J. 2010; 86: 174–182.
13. Gambhir SS. Imagem Molecular do Câncer com Tomografia por Emissão de Pósitrons. Nat
Rev Cancer. 2002; 2: 683–693.
14. Como Kit A, et al. Detecção Sensível de Mutações de KRAS Usando Enriquecimento de
Mutação de Gelo-COLD-PCR Aprimorado e Identificação de Sequência Direta. Hum Mutat.
2013; 34: 1568–1580.
15. How-Kit A, et al. Detecção ultrassensível e identificação de mutações BRAF V600 em amostras
frescas congeladas, FFPE e plasma de pacientes com melanoma por E-Ice-COLD-PCR.
Anal Bioanal Chem. 2014; 406: 5513–5520.
16. Li H, Durbin R. Alinhamento rápido e preciso de leitura curta com transformação de Burrows
Wheeler. Bioinforma. Oxf Engl. 2009; 25: 1754–1760.
17. Cibulskis K, et al. Detecção sensível de mutações pontuais somáticas em amostras de câncer
impuro e heterogêneo. Nat Biotechnol. 2013; 31: 213–219.
18. Robinson JT, e outros. Visualizador Integrativo de Genômica. Nat Biotechnol. 2011; 29: 24–
26.
19. Cai X, et al. Acessando informações genéticas com biópsias líquidas. Tendências Genet. TIG.
2015; 31: 564–575.
20. Diaz LA, Bardelli A. Biópsias Líquidas: Genotipagem de DNA de Tumor Circulante. J
Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. 2014; 32: 579–586.
21. De Robertis M, et al. O modelo murino AOM/DSS para o estudo da carcinogênese do cólon:
das vias aos estudos de diagnóstico e terapia. J Carcinog. 2011; 10: 9.

22. Tanaka T, e outros. Um novo modelo de carcinogênese de cólon de camundongo relacionado

à inflamação induzida por azoximetano e sulfato de sódio de dextrana. Câncer Ciência.
2003; 94: 965–973.
23. Marrero JA, et al. A colite murina induzida por sulfato de dextrana e sódio ativa o NF-KappaB
e aumenta a expressão do receptor de galanina-1. Am J Physiol Gastrointestinal Fígado
Physiol. 2000; 278: G797-804.
24. Ni J, Chen SF, Hollander D. Effects of Dextran Sulphate Sodium on Intestinal Epithelial Cells
and Intestinal Lymphocytes. Intestino. 1996; 39: 234–241.
25. Perše M, Cerar A. Dextrano Sulfato de Sódio Colite Mouse Modelo: Armadilhas e Truques. J
Biomed. Biotecnologia. 2012; 2012: 718617.
26. Vogelstein B, et al. Alterações Genéticas Durante o Desenvolvimento de Tumores Colorretais.
N Engl J Med. 1988; 319: 525–532.
27. Bettegowda C, et al. Detecção de DNA tumoral circulante em malignidades humanas em
estágio inicial e tardio. Sci Transl Med. 2014; 6: 224ra24.
28. Diehl F, e outros. Detecção e Quantificação de Mutações no Plasma de Pacientes com
Tumores Colorretais. Proc Natl Acad Sci US A. 2005; 102: 16368–
16373.
29. Heitzer E, e outros. Células Tumorais Circulantes e DNA como Biópsias Líquidas. Genoma
Med. 2013; 5: 73.
30. Schwarzenbach H, Hoon DSB, Pantel K. Ácidos nucléicos livres de células como biomarcadores em
pacientes com câncer. Nat Rev Cancer. 2011; 11: 426–437.
31. Takahashi M, e outros. Expressão alterada de beta-catenina, óxido nítrico sintase induzível e
ciclooxigenase-2 na carcinogênese de cólon de rato induzida por azoximetano. Carcinogênese.
2000; 21: 1319–1327.
32. Takahashi M, et al. Mutações freqüentes do gene da beta-catenina em tumores de cólon de
camundongos induzidos por azoximetano. Carcinogênese. 2000; 21: 1117–
1120.
33. Thirlwell C, et al. Avaliação de clonalidade e ordenação clonal de criptas neoplásicas individuais
mostra policlonalidade de adenomas colorretais.
Gastroenterologia. 2010; 138: 1441–1454, 1454.e1-7.
34. Gausachs M, et al. A heterogeneidade mutacional em APC e KRAS surge no nível da cripta e
leva à policlonalidade na tumorigênese colorretal inicial.
Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 2017; 23: 5936–5947.
35. Sefrioui D, et al. Comparação da quantificação de mutações KRAS por PCR digital e E-Ice-
COLD-PCR em DNA livre de células circulantes de pacientes com câncer colorretal
metastático. Clin Chim Acta Int J Clin Chem. 2017;
465: 1–4.
36. Jones S, e outros. O sequenciamento comparativo de lesões fornece informações sobre a
evolução do tumor. Proc Natl Acad Sci US A. 2008; 105: 4283–4288.

https://www.jcancer.org