Análise do DNA circulante no cancro

O ctDNA fornecido pela biópsia líquida oferece uma alternativa promissora à biópsia
tumoral, pois fornece um acesso não invasivo e em "tempo real" ao genoma do câncer
e reflete a heterogeneidade do tumor. O ctDNA tem demonstrado crescente interesse
clínico para diagnóstico de câncer, prognóstico, monitoramento terapêutico e
rastreamento de evolução.

As biópsias tumorais representam o padrão para o diagnóstico de câncer e o principal método

para testes moleculares para orientar a seleção de terapias de precisão. Biópsias líquidas,
particularmente aquelas envolvendo células livres DNA (cfDNA) do plasma, estão emergindo
rapidamente como um importante e minimamente adjuvante invasivo para biópsias tumorais
padrão e, em alguns casos, até mesmo um potencial Abordagem alternativa. A biópsia líquida
está se tornando uma ferramenta valiosa para testes moleculares, para novos insights sobre a
heterogeneidade do tumor e para detecção e diagnóstico de câncer.

Planificação:
 Introdução
 Origem e deteção de ctDNA
 Métodos atuais de diagnóstico- biópsia tumoral
 Análise do CtDNA como método alternativo de diagnostico-
biópsia líquida
 Dificuldades na análise de ctDNA
 Conclusão

Embora a biópsia líquida tenha se referido com mais frequência à análise de cfDNA de
sangue periférico, este termo também abrange o isolamento e análise de material
derivado de tumor (por exemplo, DNA, RNA ou mesmo células intactas) de sangue ou
outros fluidos. Por exemplo, células tumorais intactas circulantes intravasam no
corrente sanguínea em baixa frequência (geralmente <10 células tumorais circulantes
por mililitro de sangue em pacientes com câncer metastático). Com tecnologia
especializada, circulando células tumorais podem ser detetadas e isoladas de um
fundo de células sanguíneas normais, facilitando a análise molecular e até mesmo a
implantação e crescimento dessas células em camundongos imunocomprometidos.1-3
Partículas subcelulares chamadas exossomos ou extracelulares vesículas envoltas por
membrana, também são liberadas por células tumorais na corrente sanguínea e
contêm proteínas e ácidos nucleicos específicos do tumor. Ácidos nucleicos livres de
células, incluindo RNA livre de células (que é menos estável que o DNA) e cfDNA
também são colocados em circulação

cfDNA:
O termo "cfDNA" refere-se ao DNA fragmentado encontrado no componente não
celular do sangue, conforme relatado pela primeira vez por Mandel e Metais em
1948.9 Pensa-se que O cfDNA é liberado na corrente sanguínea por apoptose ou
necrose, e o cfDNA é tipicamente encontrado como fragmentos de fita dupla de
aproximadamente 150 a 200 bases pares de comprimento, correspondendo ao DNA
associado ao nucleossomo. 10 Moléculas de cfDNA são rapidamente eliminados da
circulação, com meia-vida de uma hora ou menos.

https://sci-hub.hkvisa.net/10.1007/978-3-030-26439-0
https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-030-26439-0_10
https://sci-hub.hkvisa.net/10.1056/NEJMra1706174
https://medlineplus.gov/genetics/understanding/testing/
circulatingtumordna/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30380390/
https://academic.oup.com/clinchem/article/61/1/112/5611441?
login=false

Heterogeneidade tumoral:
No entanto, apesar de sua utilidade, existem desafios para a aquisição de biópsias de
tecidos, como biópsias cirúrgicas, e como eles são processados para análise posterior.
Biópsias cirúrgicas são inerentemente invasivos e, dependendo do estágio da doença e
a quantidade de tecido isolado, pode ser limitante quantidade para análise genômica.
A maioria dos tecidos tumorais são posteriormente preservados em formalina e
embebidos em parafina (FFPE) para interpretação patológica e coloração. No entanto,
esse processo reticula e fragmenta o DNA, comprometendo sua integridade estrutural
e apresenta desafios para sequenciamento e interrogação de alterações genômicas.
Por fim, o câncer é uma doença inerentemente heterogênea, onde diferentes áreas do
mesmo tumor ou metástases diferentes podem surgir de diferentes populações
subclonais, nomeadamente intra e heterogeneidade intertumoral, respectivamente.
Amostragem de um único site fornece apenas um único instantâneo espacial e
temporal e improvável que reflita a heterogeneidade dinâmica do tumor em pacientes.
Investigadores e cientistas ainda estão no início da compreensão da extensão total da
heterogeneidade tumoral. Este fenómeno pode explicar por que grupos de pacientes
respondem ao tratamento padrão de cancro, enquanto uma estratégia terapêutica
idêntica falha noutros pacientes diagnosticados com o mesmo tipo de cancro.
Capturar a heterogeneidade tumoral tornou-se cada vez mais importante para
identificar os pacientes mais propensos a beneficiar de terapias direcionadas e aqueles
que desenvolvem mecanismos de resistência após um certo período de tempo.

Trabalho:

Origem de ctDNA:
O ctDNA corresponde a restos apoptóticos e necróticos de genomas fragmentados de
células tumorais provenientes do tumor primário, metástases, exossomas ou mesmo
fragmentos de ADN libertados pelas células tumorais circulantes. Este ctDNA circula no
sangue periférico, sobretudo na forma de nucleossoma, assemelhando-se à cromatina
nuclear.
A discriminação entre ctDNA e o restante DNA circulante baseia-se na presença de
mutações somáticas características apenas de células cancerosas ou pré-cancerosas,
não presentes nas células normais do mesmo indivíduo. No ctDNA podem encontrar-
se diferentes alterações genéticas, como mutações pontuais, transposições,
amplificações e aneuploidias, bem como alterações do foro epigenético.

Cancro:
Cancro é a designação que engloba um grupo de mais de cem doenças diferentes,
que têm em comum um crescimento celular descontrolado e a disseminação de
células anormais. As células de cancro têm a capacidade de se espalharem pelo
organismo usando os sistemas circulatório e linfático, dando origem a metástases.
O processo de formação do cancro é chamado de carcinogénese ou oncogénese e,
em geral, acontece lentamente, podendo levar vários anos para que uma célula
cancerosa se prolifere e dê origem a um tumor visível. Os efeitos cumulativos de
diferentes agentes cancerígenos ou carcinógenos são os responsáveis pelo início,
promoção, progressão e inibição do tumor.
 A disseminação de células tumorais da lesão primária inclui a invasão de células nos
vasos sanguíneos e requer uma mudança fenotípica de diferenciação celular que
compreende motilidade aumentada e alterações do citoesqueleto. Essas alterações
permitem às células tumorais invadir as paredes dos pequenos vasos e entrar na
circulação sanguínea. Este processo representa um primeiro, mas essencial, passo de
disseminação de células tumorais e progressão metastática. Uma vez que tenham
entrado na corrente sanguínea, as células tumorais são capazes de viajar para órgãos
distantes, como a medula óssea. Após extravasamento em locais distantes, as células
tumorais podem formar diretamente metástases ou mudar para um estado latente
chamado célula tumoral dormência, que se acredita ser a base para o crescimento
metastático tardio.
Na doença oncológica, a libertação de ctDNA para a corrente sanguínea depende da
localização, tamanho e vascularização do tumor. A rápida proliferação celular e
crescimento tumoral condicionam o aparecimento de regiões isquémicas e,
consequentemente, necrose, promovendo a acumulação de ctDNA na corrente
sanguínea.

Uso do ctDNA:
O ctDNA fornecido pela biópsia líquida oferece uma alternativa promissora à biópsia
de tecido tumoral, pois fornece um acesso não invasivo e em "tempo real" ao genoma
do cancro. As alterações moleculares identificadas no ctDNA refletem a
heterogeneidade celular dentro do tumor e em todos os locais distantes do tumor e
tem demonstrado crescente utilidade clínica para diagnóstico e prognóstico,
monitoramento da resposta à terapia, acompanhamento da evolução clonal e
surgimento de resistência.
Na prática clínica rotineira, além de a biópsia tecidual ser considerada por muito
tempo como a fonte padrão-ouro para análise molecular do cancro, embora forneça
apenas uma instantâneo das assinaturas moleculares do tumor, a biópsia líquida tem
emergido progressivamente como um substituto minimamente invasivo e “em tempo
real” para conhecer o genoma do tumor. A biópsia líquida representa tudo fluidos
corporais acelulares que dão acesso a materiais derivados de tumores. O DNA
circulante do tumor (ctDNA) é encontrado na corrente sanguínea de pacientes com
cancro como parte do DNA livre de células (cfDNA), resultante da apoptose de células
tumorais, necrose ou secreção ativa. As alterações moleculares identificadas no ctDNA
refletem a heterogeneidade celular dentro do tumor e em todos os locais distantes do
tumor e têm já demonstrou utilidade clínica para diagnóstico e prognóstico,
tratamento tomada de decisão, monitoramento da resposta à terapia,
acompanhamento da evolução clonal e surgimento de resistência.
  Devido à heterogeneidade de um tumor e a amostra pobre em disponibilidade
significa que biópsias de tecidos são de pouco valor para a avaliação da
dinâmica tumoral nos estágios avançados da doença
 Períodos prolongados entre a amostragem e a aplicação clínica dos resultados,
bem como linhas adicionais de tratamento entre amostragem, pode resultar
numa composição genética alterada do tumor
 O DNA livre circulante pode ser extraído do sangue e as mutações específicas
do tumor podem ser avaliadas para fornecer uma paisagem genética das lesões
cancerosas no paciente
 O rastreamento de aberrações genéticas associadas ao tumor no sangue pode
ser usado para avaliar a presença de doença residual, recorrência, recidiva e
resistência
 Monitoramento do surgimento de aberrações genéticas associadas a tumores
no sangue pode ser usado para detetar o surgimento de células cancerosas
resistentes 5-10 meses antes dos métodos convencionais
 Implementar testes de DNA de tumor circulante na clínica, padronização de
técnicas, avaliação de reprodutibilidade e custo-benefício é necessária
https://sci-hub.hkvisa.net/10.1038/nrclinonc.2013.110

A biópsia de tecido tumoral é um procedimento cirúrgico que extrai uma amostra de

tecido para análise e diagnóstico. Esse procedimento é invasivo e em alguns casos não
pode ser realizado como rotina, seja pelo risco cirúrgico ao qual o paciente é exposto,
pela sensibilidade do tecido a ser analisado ou pela dificuldade de acesso a ele. Ela tem
uma repetibilidade limitada, um custo alto e a possibilidade de complicações pós
cirúrgicas. Como alternativa, um método novo para o diagnóstico de doenças como o
cancro, denominado de biópsia líquida, tem-se destacado entre os pesquisadores. A
biópsia líquida é um procedimento minimamente invasivo e utiliza fluidos corporais
para a realização das análises, sendo o sangue o material frequentemente utilizado. Ela
tem apresentado resultados promissores no diagnóstico do cancro, principalmente na
sua fase precoce. O diagnóstico precoce do cancro é de fundamental importância para
a cura e o tratamento da doença, reduzindo a mortalidade e aumentando a eficácia
dos tratamentos. Além de seu uso no diagnóstico, a biópsia líquida está a ser utilizada
para o acompanhamento de pacientes em tratamento do cancro devido à
possibilidade de repetição do procedimento com frequência maior do que no método
tradicional. Uma biópsia líquida, ou amostra de sangue, pode fornecer o panorama
genético de todas as lesões cancerígenas (primário e metástases), além de oferecer a
oportunidade de rastrear sistematicamente a evolução genómica.
O perfil genético dos tumores sólidos atualmente é obtido a partir de espécimes
cirúrgicos ou de biópsia. No entanto, este último procedimento nem sempre pode ser
realizado rotineiramente devido ao seu caráter invasivo. As informações adquiridas de
uma única biópsia fornecem uma imagem espacial instantânea e temporalmente
limitada de um tumor e podem não refletir a sua heterogeneidade. As células tumorais
libertam DNA livre circulante (cfDNA) no sangue, mas a maioria do DNA circulante
geralmente não é de origem cancerosa, e a deteção de alelos associados ao câncer no
sangue há muito é impossível de alcançar. Os avanços tecnológicos superaram essas
restrições, tornando possível identificar aberrações genéticas e epigenéticas. Uma
biópsia líquida, ou amostra de sangue, pode fornecer o panorama genético de todas as
lesões cancerígenas (primárias e metástases), além de oferecer a oportunidade de
rastrear sistematicamente a evolução genómica.

Heterogeneidade tumoral:
A heterogeneidade tumoral promove uma grande variabilidade fenotípica dentro de
um mesmo tumor. Assim, existe a possibilidade de ter populações de células com
diferentes características genéticas e subpopulações podem ter diferenças, por
exemplo, no potencial metastático e na resistência à quimioterapia. Assim, O DNA
tumoral circulante encontrado na biópsia líquida reflete, melhor do que a biópsia
tradicional ou os marcadores proteicos, a atividade das células neoplásicas e as
transformações pelas quais o cancro passa ao longo do tempo e do tratamento.
A análise de ctDNA permite um estudo em tempo real das alterações genéticas
ocorridas nas células tumorais, permitindo uma observação mais ampla de toda a
carga tumoral, e, consequentemente, uma melhor monitorização da evolução tumoral
e da sua resposta às terapêuticas instituídas. As biópsias líquidas permitem, assim,
uma caracterização molecular completa da massa tumoral, e constituem uma
oportunidade de estudo dos mecanismos responsáveis pela formação de metástases.
Investigadores e cientistas ainda estão no início da compreensão da extensão total
da heterogeneidade tumoral. Este fenómeno pode explicar por que grupos de
pacientes respondem ao tratamento padrão de cancro, enquanto uma estratégia
terapêutica idêntica falha noutros pacientes diagnosticados com o mesmo tipo de
cancro.
A instabilidade genómica, característica das células tumorais, promove uma
heterogeneidade celular e molecular entre tumores diferentes (heterogeneidade
intertumoral), mas também entre as células originárias de um mesmo tumor
(heterogeneidade intratumoral e metastática). Assim, o material obtido através de
uma biópsia tecidular não será representativo. Esta heterogeneidade tumoral pode-se
refletir em diferentes graus de diferenciação, proliferação, vascularização, inflamação
e/ou capacidade de invasão. Tudo isto tem, portanto, implicações no estudo de
resistência às terapêuticas instituídas e na deteção de biomarcadores terapêuticos
numa fase precoce.
A análise de ctDNA permite um estudo em tempo real das alterações genéticas
ocorridas nas células tumorais, permitindo uma observação mais ampla de toda a
carga tumoral, e, consequentemente, uma melhor monitorização da evolução tumoral
e da sua resposta às terapêuticas instituídas. As biópsias líquidas permitem, assim,
uma caracterização molecular completa da massa tumoral, e constituem uma
oportunidade de estudo dos mecanismos responsáveis pela formação de metástases.

Conclusão:
 Dentro das várias utilizações possíveis das BL em doentes oncológicos, a
monitorização destes e da sua resposta às terapêuticas instituídas é aquela que
se tem vindo a revelar mais promissora.
 Dada a sua curta semivida, o ctDNA permite uma monitorização mais apertada,
em tempo real, da dinâmica tumoral, e mais especificamente, da carga
mutacional. Estas suas características permitem a seleção de tratamentos
específicos para cada tipo de mutação e a deteção precoce de resistência à
terapia instituída.
 A análise de ctDNA é um campo em evolução com novos métodos a serem
desenvolvidos e otimizados para poder extrair e analisar com sucesso o ctDNA,
que tem vastas aplicações clínicas.