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GCAT
TACG
GCAT genes
Artigo
Suporte Morfológico e Genético para um Até então
Espécies de gatos malhados não descritos (gênero Leopardus; Felidae,
Carnivora) do sul dos Andes colombianos
Manuel Ruiz-García 1,*, Myreya Pinedo-Castro
Citação: Ruiz-García, M.;
Pinedo-Castro, M.; Shostell, JM
Suporte morfológico e genético para uma
espécie de gato malhado até então não
descrita (gênero Leopardus;
Felidae, Carnivora) do
Andes do sul da Colômbia. Genes
2023, 14, 1266. https://doi.org/10.3390/
genes14061266
Editores Acadêmicos: Miloš Macholán
e Manuel Vera Rodríguez
Recebido: 5 de abril de 2023
Revisado: 8 de junho de 2023
Aceito: 14 de junho de 2023
Publicado: 15 de junho de 2023
Direitos autorais: © 2023 dos autores.
Licenciado MDPI, Basileia, Suíça.
Este artigo é um artigo de acesso aberto
distribuído nos termos e
condições do Creative Commons
Licença de atribuição (CC BY) ( https://
creativecommons.org/licenses/by/
4,0/).
Genes 2023, 14, 1266. https://doi.org/10.3390/genes14061266
1 2
e Joseph Mark Shostell
1
Laboratório de Genética de Poblaciones Biologia Molecular Evolutiva, Departamento de Biologia,
Faculdade de Ciências, Pontifícia Universidade Javeriana, Cra 7A, No 43-82, Bogotá 110231, Colômbia;
mozpinedo@gmail.com
2
Departamento de Matemática, Ciência e Tecnologia, Universidade de Minnesota Crookston, 2900
University Ave., Crookston, MN 56716, EUA;
joseph.shostell@gmail.com * Correspondência: mruizgar@yahoo.es
Resumo: Em 1989, a pele de um pequeno gato malhado, proveniente do vulcão Galeras, no sul da
Colômbia (departamento de Nariño), foi doada ao Instituto Alexander von Humboldt (identificação, ID
5857) em Villa de Leyva (departamento de Boyacá, Colômbia). Embora originalmente classificado como
Leopardus tigrinus, a sua distinção merece uma nova designação taxonómica. A pele é distinta de todos
os holótipos conhecidos de L. tigrinus, bem como de outras espécies de Leopardus. Análise dos genomas
mitocondriais completos de 44 espécimes de felinos (incluindo 18 L. tigrinus e todas as espécies
atualmente conhecidas do gênero Leopardus), o gene mtND5 de 84 espécimes de felinos (incluindo 30 L.
tigrinus e todas as espécies do gênero Leopardus) , e seis microssatélites de DNA nuclear (113 espécimes
de felinos de todas as espécies atualmente conhecidas do gênero Leopardus) indicam que este espécime
não pertence a nenhum táxon Leopardus previamente reconhecido. O gene mtND5 sugere que esta nova
linhagem (o gato Nariño, como o chamamos) é um táxon irmão do Leopardus colocola. As análises de
microssatélites mitogenômicos e de DNA nuclear sugerem que esta nova linhagem é o táxon irmão de um
clado formado por L. tigrinus + centro-americano e transandino (Leopardus geoffroyi + Leopardus guigna).
A divisão temporal entre o ancestral desta nova espécie possível e o ancestral mais recente do Leopardus
foi datada de 1,2 a 1,9 milhões de anos atrás. Consideramos que esta nova linhagem única é uma espécie
nova e propomos o nome científico de Leopardus narinensis.
Palavras-chave: Colômbia; Leopardus narinensis; mitogenomas; Gato Nariño; novo gato selvagem neotropical; marcadores
nucleares
1. Introdução
Muitas novas espécies de mamíferos neotropicais foram descritas recentemente. Algumas dessas espécies
podem ser artefatos baseados em dados moleculares, etológicos, ecológicos e cariológicos insuficientes para
determinar o isolamento reprodutivo de outros táxons semelhantes, bem como aplicações tipológicas extremas do
Conceito de Espécie Filogenética (PSC) [1,2]. Este pode ser o caso das 12 supostas “novas espécies” de macacos-
prego gráceis (Cebus) [3], ou dos casos de Mazama bricenii [4], Nasuella meridensis [5], Odocoileus lasiotis [6,7],
Pecari maximus [ 8], Inia araguaiaensis [9] e Tapirus kabomani [10–12]. Por outro lado, há fortes evidências para
apoiar o reconhecimento de outras novas espécies de mamíferos nos Neotrópicos, por exemplo, Bradypus
pygmaeus [13], Bassarycion neblina [14], Mico humilis [15], Mico munduruku [16], Mico schneideri [17], Myotis
attenboroughi [18], Mindomys kutuku [19] e diferentes espécies de ciclopes (por exemplo, Cyclopes rufus, Cyclopes
thomasi, etc.) (Miranda et al., 2018) [20] para citar alguns .
Atualmente, 11 espécies de felinos são identificadas na América Latina. Oito deles formam
um grupo monofilético denominado linhagem jaguatirica [21–33]. A linhagem da jaguatirica inclui o
https://www.mdpi.com/journal/genes
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a jaguatirica (Leopardus pardalis), o margay (Leopardus wiedii), o gato andino (Leopardus

jacobita), o gato-dos-pampas ou colocolo (L. colocola; no entanto, ver [34]), o kodkod (L.
guigna), o gato de Geoffroy (L. geoffroyi), a oncilla ou tigrina (L. tigrinus), e a recentemente
diferenciada tigrina do sul (Leopardus guttulus—[30–32]).
A taxonomia da tigrina tem sido confusa há séculos. Schreber [35,36] usou pela primeira vez o nome científico
Felis tigrina e ilustrou esta espécie com uma placa chamada “Le Margay” [37]. Foi baseado em um espécime de
Caiena, Guiana Francesa. Assim, os biólogos há muito ficam confusos sobre o que é uma tigrina e o que é um
margay. Gray [38] descreveu uma suposta nova espécie, Felis pardinoides, com “Índia” como localidade-tipo, mas
posteriormente mudou a localidade-tipo para Bogotá, Colômbia [39]. No mesmo período, Felis guttula foi descrita, e
o sul do Brasil foi listado como localidade-tipo [40]. Táxons adicionais de tigrina foram descritos no início do século
20, incluindo Felis pardinoides oncilla (Costa Rica), Felis pardinoides andina (Equador), Felis carrikeri (Costa Rica),
Felis pardinoides emerita (Venezuela) e Felis emiliae (Estado do Ceará, Brasil). Allen [41] usou o gênero Margay
para a tigrina e definiu dois táxons adicionais de tigrina: Margay tigrina elenae (Departamento de Antioquia,
Colômbia) e Margay caucensis (Departamento de Cauca, Colômbia). A taxonomia tradicional usada até recentemente
foi proposta por Cabrera [42,43] e seguida por Wozencraft (em Wilson e Reeder [44]). Compreende quatro
subespécies: F. t. oncilla (incluindo F. p. oncilla e F. carrikeri), F. t. pardinoides (incluindo F. pardinoides, F. p. andina,
F. p. emerita, M. t. elenae e M. caucensis), F. t. tigrina (incluindo F. tigrina e F. emiliae) e F. t. guttula (incluindo F.
guttula). No entanto, a última subespécie foi recentemente reivindicada como uma nova espécie (L. guttula) com
base em dados genéticos [30–32]. A distribuição das demais subespécies de tigrina é a seguinte: L. t. oncilla habita
o Panamá, Costa Rica e ao norte até a Nicarágua. eu.t. pardinoides habita a região andina, incluindo oeste da
Venezuela, Colômbia, Equador, Peru, Bolívia e noroeste da Argentina. eu.t. tigrinus vive no leste da Venezuela, nas
Guianas e no nordeste do Brasil.

As características da pelagem e a morfometria de uma grande coleção de L. tigrinus

apoiam a existência de três morfogrupos [45]. O morfogrupo I contém espécimes da
América Central, bem como espécimes do norte, noroeste e oeste da América do Sul
(Costa Rica, Colômbia, Venezuela, Equador, Peru, Guiana, Suriname e noroeste da
Argentina). A cor dessas tigrinas é marrom e varia do marrom alaranjado ao marrom
amarelado. Esses espécimes apresentam subpêlo marrom-acinzentado, ventre branco
ou cinza claro e rosetas de tamanho médio que formam faixas oblíquas. As faixas estão
dispostas na direção escapulo-inguinal nas laterais do corpo. Seguindo Nascimento e
Feijó [45], este táxon é L. tigrinus em “senso stricto”. No entanto, existe uma grande
heterogeneidade genética mitocondrial entre as populações de tigrinas da América
Central e dos Andes que seriam incluídas neste morfogrupo (46). Assim, a morfologia
[45] e a genética mitocondrial não se alinham [46]. O Morfogrupo II contém exemplares
da região Nordeste e Centro do Brasil. Sua cor varia do marrom-amarelado claro ao
amarelo claro ou amarelo-claro acinzentado. Possuem pequenas rosetas que raramente
formam faixas oblíquas. As rosetas têm bordas pretas finas e descontínuas. Este
morfogrupo foi considerado uma espécie nova, Leopardus emiliae [45]. O morfogrupo III
contém exemplares do sul do Brasil, Paraguai e nordeste da Argentina e corresponde a
L. guttulus. Apresentam fundo marrom-amarelado escuro, mais claro nas laterais do
corpo. Possuem também ventre branco ou cinza claro e pequenas rosetas nas laterais
do corpo. Assim, com base neste estudo [45], o número de espécies de Leopardus deveria ser au
Durante um estudo molecular para resolver essas relações complexas entre diferentes
populações de L. tigrinus [46], encontramos uma pele de felino do departamento de Nariño,
no sul da Colômbia andina. Esta pele foi seca ao sol sem bronzeamento químico ou outra
preservação. Isto foi importante porque a qualidade do DNA obtido desta pele era alta.
Nenhuma outra parte do animal (crânio, ossos, etc.) estava disponível. Rapidamente
observamos que seu fenótipo difere das características morfológicas de outros táxons de
tigrina, bem como de outras espécies do gênero Leopardus (por exemplo, uma forte coloração averme
Embora a coloração avermelhada possa ser devida a uma mutação eritrística, decidimos
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analisar molecularmente a pele desta amostra. Portanto, usamos todo o mitogenoma e o gene
mitocondrial (mt) ND5 para comparar este espécime com todas as espécies de Leopardus
reconhecidas hoje. Além disso, seis microssatélites nucleares foram genotipados para este
espécime e outros 112 espécimes de felinos (incluindo todas as espécies do gênero Leopardus,
embora alguns táxons dentro de L. tigrinus e L. colocola não tenham sido incluídos nesta análise).
As comparações moleculares sugerem que esta pele de felino pode representar uma linhagem,
táxon ou mesmo espécie nova e anteriormente não detectada dentro do gênero Leopardus.

2. Materiais e métodos
2.1. Amostras
Da espécie desconhecida de felino, um espécime único de pele (sem crânio nem ossos foram
obtidos) estava disponível na coleção de mamíferos do Instituto von Humboldt (ID 5857) em Villa de
Leyva (Departamento de Boyaca; Colômbia). O espécime foi coletado em 1989 no vulcão Galeras,
departamento de Nariño, no sul da Colômbia. Doravante esta amostra será chamada de gato Nariño.

Após a extração do DNA desta pele (3 cm2 ), sequenciamos o mitogenoma completo para
compará-lo com um conjunto de dados de outros espécimes de Leopardus. Também sequenciamos o
gene mtND5 para compará-lo com um conjunto maior de dados de outros espécimes de Leopardus
(incluindo em ambos os casos todas as espécies reconhecidas do gênero Leopardus) e genotipamos
seis microssatélites nucleares , que também foram comparados com os perfis genéticos de todos os
Leopardus reconhecidos. espécies.
O primeiro conjunto de dados mitocondriais continha genomas mitocondriais completos.
Sequenciamos genomas mitocondriais completos de 32 espécimes. Além disso, também
recuperamos sequências completas do mitogenoma do GenBank (12 espécimes, para um total de
44 espécimes representando nove espécies; Tabela Suplementar S1). O segundo conjunto de
dados mitocondriais continha sequências do gene mtND5 de 84 espécimes e nove espécies (Tabela Suplem
Selecionamos o gene mtND5 porque o maior número de sequências está disponível para ele no
GenBank. Todos os mitogenomas recentemente sequenciados, incluindo o do gato Nariño, foram
submetidos ao GenBank (números de acesso: MG230196.1-MG230251.1).
Além disso, genotipamos um total de 113 espécimes de gatos selvagens (compreendendo
nove espécies mais o gato Nariño) em seis locos microssatélites. Essas amostras foram: (1) A
amostra do gato Nariño, (2) Duas amostras de L. geoffroyi da Bolívia e do Paraguai, (3) Uma
amostra de L. guigna do Chile, (4) Oito amostras de tigrina andina, L. t . pardinoides, seis da
Colômbia, uma da Venezuela e uma do Peru, (5) 13 amostras de L. wiedii, quatro da Colômbia,
quatro do Peru, duas da Guatemala, duas da Bolívia e uma da Venezuela, (6) 14 amostras de L.
pardalis, oito da Colômbia, três do Equador, uma do Brasil, uma do Peru e uma da Bolívia, (7) 20
amostras de L. jacobita, 12 do Peru e oito da Bolívia, (8) 39 amostras de L. colocola (13 L. c.
garleppi, 12 L. c. steinbachi, seis L. c. budini e oito L. c. cruscinus) do Peru, Bolívia e Argentina, (9)
Seis amostras de Felis catus da Espanha, (10) Nove amostras de Herpailurus yagouaroundi, duas
da Colômbia, duas do Peru, duas da Venezuela, uma da Guatemala, uma da Guiana Francesa e
uma do Brasil.
Também analisamos amostras de F. catus e H. yagouaroundi para marcadores mitocondriais e
nucleares porque essas espécies de gatos vivem no sul dos Andes colombianos e poderiam
potencialmente hibridizar com Leopardus t. pardinoides, L. wiedii, L. pardalis e L. colocola que habitam
esta área geográfica.

2.2. DNA mitocondrial

Extraímos e isolamos DNA de amostras de cabelo, pele e músculos usando o QIAamp DNA
Micro Kit (Qiagen, Inc.) para análise mitogenômica (um total de 16.756 pares de bases, pb, incluindo
o fragmento do gene mtND5, 315 pb de comprimento ). A extração de DNA das fibras musculares
seguiu o protocolo “Purificação de DNA de Tecidos”. Para algumas amostras de pele, procedimentos
otimizados de extração de DNA tiveram que ser empregados [47]. A amplificação de grandes
fragmentos de DNA mitocondrial antes do sequenciamento foi realizada por PCR de longo alcance,
o que minimiza a chance de amplificação de pseudogenes mitocondriais do núcleo nuclear
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genoma (numts) [48,49]. Foi utilizado um Kit PCR de Longo Alcance (Qiagen, Inc., Valencia, CA,
EUA), com volume de reação de 25 µL e mistura de reação composta por 2,5 µL de Tampão PCR de
Longo Alcance 10× , 500 µM de cada dNTP , 0,6 µM de cada primer, 1 unidade de enzima PCR de
longo alcance e 50–250 ng de DNA modelo. As reações de PCR foram realizadas em um termociclador
Perkin Elmer Geneamp PCR System 9600 e um Bio-Rad ICycler. As condições de ciclagem foram as
seguintes: 94 ÿC por 5 min, seguido por 45 ciclos de desnaturação a 94 ÿC por 30 s, depois
recozimento do primer a 50–57 ÿC (dependendo do conjunto de primers) por 30 s, e uma extensão
em 72 ÿC por 8 min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 93 ÿC por 30 s, recozimento a 45–52
ÿC (dependendo do conjunto de primers) por 30 s, e extensão a 72 ÿC por 5 min, com um extensão
final a 72 ÿC por 8 min. Quatro conjuntos de primers [46] foram usados para gerar amplicons
sobrepostos de 3.680 a 5.011 pb de comprimento, permitindo um teste de qualidade para circularidade
do genoma [48]. Ambas as cadeias de mtDNA foram sequenciadas diretamente usando BigDye
Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EUA). Os produtos de sequenciamento
foram analisados em um sistema ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA,
EUA). As sequências foram montadas e editadas usando o software Sequencher 4.7 (Gene Codes,
Corp., Ann Arbor, MI, EUA). Regiões sobrepostas foram examinadas quanto a irregularidades, como
mutações de frameshift e códons de parada prematuros. A falta de tais irregularidades indica uma ausência de s
Não observamos em nenhum caso nenhuma dessas irregularidades.
Os alinhamentos com todos os amplicons mitocondriais foram concatenados usando Gblocks 0,91
[50,51] sob uma abordagem relaxada. Os alinhamentos individuais foram concatenados usando o
software SequenceMatrix v1.7.6 [52] para criar um alinhamento mestre. Outros softwares (Clustal X
versão 2.0; [53] e plugin de alinhamento MUSCLE em Geneious R7.1; [54]) foram empregados para
corroborar os alinhamentos obtidos e os resultados foram sempre idênticos.

2.3. Microssatélites de DNA Nuclear

A distribuição alélica foi examinada em seis locos microssatélites (Fca08, Fca43, Fca45, Fca96, Fca126 e
Fca225). Embora os microssatélites não sejam os melhores marcadores moleculares para inferências filogenéticas,
os locos microssatélites aqui empregados mostraram um bom sinal filogenético em um estudo anterior [55]. Todos
os loci consistiam em repetições de dinucleotídeos (CA)n ou (GT)n.
As sequências de primers para esses microssatélites são relatadas em outro lugar ([56,57]; ver
Tabela Suplementar S2). Quando o DNA foi extraído da pele ou músculo, foi realizada uma reação
em cadeia da polimerase (PCR) em um volume de 25 µL. Neste caso, as misturas de reação de
PCR incluíram 2,5 µL de MgCl2 2,5 mM, 2,5 µL de um tampão 10×, 1 µL de dNTPs 1 mM, 10
pmol de cada primer, 14,5 µL de H2O, 2 µL de DNA (50–100 ng /µL) e uma unidade de Taq polimerase.
O DNA extraído do cabelo (resina Chelex a 10%; Walsh et al. 1991) foi preparado para PCR como volume de
reação de 50 µL, contendo o dobro da quantidade de todos os reagentes acima e 20 µL de DNA. As reações de
PCR foram realizadas em um termociclador Perkin Elmer Geneamp PCR System 9600 e um Bio-Rad ICycler. As
temperaturas de ciclagem para todos os loci foram as seguintes: 95 ÿC por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 95 ÿC, 2
min a 55 ÿC, 2 min a 72 ÿC e uma extensão final de 5 min a 72 ÿ C. Os produtos de amplificação foram mantidos
a 4 ÿC até serem utilizados. Eles foram separados por eletroforese em géis desnaturantes de poliacrilamida a 6%
e depois visualizados em uma câmera vertical sequenciadora Hoefer SQ3. Os alelos foram apreendidos por
comparação com um marcador de tamanho molecular (ÿ174 digerido com Hind III e Hinf I). Um marcador de peso
molecular foi carregado a cada quatro pistas. Realizamos as amplificações por PCR três vezes para garantir a
precisão dos genótipos obtidos. Em quase 96% dos casos, os genótipos observados foram os mesmos nas três
repetições. Assim, a amplificação preferencial do alelo teve efeitos mínimos nos nossos resultados.

2.4. Análises Estatísticas

2.4.1. Genes mitocondriais
Análises Filogenéticas e Estimativas de Divisão Temporal
Os softwares jModeltest v2.0 [58], Kakusan4 [59] e MEGA X 10.0.5 [60] foram aplicados para determinar o
melhor modelo de mutação evolutiva para as sequências analisadas para cada gene, para diferentes partições e
para mitogenomas completos. Todos os três programas oferecidos
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resultados idênticos. O critério de informação de Akaike (AIC) [61,62] foi utilizado para determinar
o melhor modelo evolutivo para as relações entre os felinos selvagens neotropicais estudados.
O modelo GTR + G (modelo General Time Reversible + ÿ variação de taxa distribuída entre locais, [63,64])
foi considerado o melhor modelo de substituição de nucleotídeos para os dois conjuntos de dados
empregados (mitogenomas completos e o gene mtND5).
Árvores filogenéticas foram construídas usando métodos de Máxima Verossimilhança (ML) e
Inferência Bayesiana (BI) para ambos os conjuntos de dados. As árvores ML foram construídas usando o
software RAxML v.7.2.6 [65]. Quinhentas réplicas de bootstrap usando GTR foram estimadas para suporte
topológico [65].
As árvores BI foram construídas no software BEAST v. 1.8.1 [66]. Quatro iterações
independentes foram executadas usando três partições de dados (posições de códon 1, 2 e 3) com
seis cadeias de Monte Carlo da Cadeia de Markov amostradas a cada 10.000 gerações por 40
milhões de gerações após um período de burn-in de 4 milhões de gerações. Verificamos a
convergência usando Tracer v1.6 [67]. Traçamos a probabilidade versus geração e estimamos o
tamanho efetivo da amostra (ESS > 200) de todos os parâmetros nas quatro análises independentes
para determinar a convergência e os resultados ideais. Os resultados de diferentes execuções
foram combinados usando os softwares LogCombiner v1.8.0 e TreeAnnotator v1.8.0 [68]. Um
modelo de especiação de nascimento-morte e um relógio molecular relaxado com uma taxa de
distribuição log-normal não correlacionada foram utilizados [69]. Os valores de probabilidade
posteriores fornecem uma avaliação do grau de suporte de cada nó na árvore. O software FigTree v. 1.4 prod
As árvores BI eram idênticas às árvores ML no que diz respeito às relações filogenéticas do gato Nariño
com outros táxons de Leopardus. Além disso, o programa BEAST v1.8.1 foi executado para estimar o
tempo até o ancestral comum mais recente (TMRCA) para diferentes nós das árvores de BI. Calibramos
a árvore datada definindo a diversificação dentro do Leopardus para 3,05 ± 1,1 milhão de anos atrás (My)
(intervalo de confiança de 97,5%: 0,89–5,21 My). Este valor é a média aritmética de dois valores temporais
anteriores para a diversificação do atual gênero Leopardus [29,33]. Embora os anteriores sejam
idealmente utilizados em árvores filogenéticas construídas com informações fósseis, o registro fóssil da
linhagem Leopardus é fragmentado e escasso.
No entanto, os fósseis que foram estudados não estão em conflito com os dados moleculares que usamos
[71].
A árvore datada por BI pertence a uma das duas abordagens diferentes para inferir tempos de
divergência [72]. A primeira abordagem é baseada em filogenias de DNA calibradas por fósseis. A
segunda , a abordagem dos “relógios moleculares emprestados”, utiliza taxas de substituição direta de
nucleotídeos inferidas de outros táxons. Para esta segunda abordagem, utilizamos uma rede de junção
mediana (MJN) com a ajuda do software Network 4.6.10 da Fluxus Technology Ltd. A estatística ÿ foi
estimada e transformada em anos de divergência entre os haplótipos estudados [74]. Para determinar as
divisões temporais, estimamos a taxa de mutação por sequência e por milhão de anos. Para o gene
mtND5, utilizamos uma taxa de mutação de 1,22% por My por posição, o que equivale a uma mutação a
cada 260.213 anos [26,75]. Para todo o mitogenoma, usamos uma taxa média de mutação de 1,15% por
My por posição, o que equivale a uma mutação a cada 5.500 anos. Essa taxa média de mutação foi
obtida a partir de vários genes mt estudados em felídeos (ND5, ATP-8, ATP-6, 16S rRNA, 12S rRNA, Cyt-
b e COI) [75,76]. As redes são mais apropriadas para filogenias intraespecíficas do que algoritmos de
árvore porque permitem explicitamente a coexistência de haplótipos ancestrais e descendentes, enquanto
as árvores tratam todas as sequências como táxons terminais [77].

Distâncias Genéticas

Usamos a distância genética Kimura 2P [78] para determinar a porcentagem de diferenças genéticas
entre o gato Nariño e todos os táxons Leopardus analisados, bem como com F. catus e H. yagouaroundi.
Comparamos essas distâncias genéticas porque valores superiores a 6–11% são típicos para espécies
distintas [79–81]. Empregamos essa distância genética porque a distância genética Kimura 2P é uma
medida padrão para tarefas de código de barras [82,83]. Para esta tarefa, empregamos os dados de
mitogenomas inteiros e dos genes mtND5 e mtCyt-b.
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2.4.2. Relações genéticas de microssatélites

de DNA nuclear entre espécies de felinos neotropicais Para o conjunto

de dados de microssatélites, conduzimos três análises. (1) No primeiro selecionamos vários exemplares para
cada uma das espécies estudadas incluindo o gato Nariño.
Esta análise envolveu a criação de uma árvore com o método de variância mínima de Ward [84]. Foi baseado na
distância euclidiana quadrada. Nesta análise foram utilizados 37 exemplares (o gato Nariño, um L. geoffroyi, um L.
guigna, quatro L. jacobita, cinco L. tigrinus pardinoides, cinco L. pardalis, cinco L. wiedii, quatro L. c. cruscinus ,
quatro L. c. garleppi, três L. c. budini e quatro L. c. (2) Utilizando os 113 espécimes de felinos analisados por
microssatélites, nós os analisamos por espécie (não como indivíduos como na análise anterior). Construímos uma
árvore com o procedimento de junção de vizinhos não ponderado (UUNJ) e com a distância euclidiana [85]. (3)
Além disso, uma segunda análise por espécie que realizamos foi uma Análise de Coordenadas Principais (PCoA)
usando o procedimento de Gower [86]. Para isso, utilizamos uma matriz de distância genética ÿµ2 entre as espécies
analisadas [87]. Uma árvore geradora mínima (MST) foi sobreposta ao PCoA [88,89].

3. Resultados

3.1. Descrição da Pele do Gato Nariño

A pele do gato Nariño (provavelmente fêmea) possui características interessantes. De uma
perspectiva global, este exemplar pertence ao morfotipo I da tigrina [45]. Possui rosetas em cadeias
oblíquas, mas essas rosetas têm bordas difusas. A coloração do fundo é laranja-amarronzada, mas
a crista dorsal é laranja-acastanhada mais escura. A cauda é relativamente curta e completamente
anelada, apresentando sete anéis completos e uma ponta preta. No entanto, esta pele também
possui características de diagnóstico únicas. Sua coloração de fundo é mais avermelhada do que
em outros fenótipos de L. tigrinus. A maioria das rosetas é delimitada por bordas pretas, mas o
interior das rosetas apresenta uma cor avermelhada muito mais intensa do que outros espécimes de L. tigrinu
Em comparação com outros exemplares de L. tigrinus examinados pelos autores, o topo da cabeça do gato Nariño
e sua crista dorsal são muito mais escuros. Sua pelagem é mais densa e lanosa. A cabeça é mais redonda e larga
e o rosto é mais achatado. O corpo é curto e relativamente mais robusto do que em outros táxons de L. tigrinus. As
medições da pele foram as seguintes; o comprimento total do corpo (incluindo a cabeça) é de 458 mm, cabeça = 69
mm, comprimento da pata traseira esquerda = 156 mm, largura da pata traseira esquerda = 19 mm, comprimento
da pata dianteira esquerda = 109 mm, largura da pata dianteira esquerda = 22 e cauda = 280 mm.

A pele do gato Nariño pode ser vista de diferentes perspectivas na Figura 1A-C.
A Figura 1D mostra o gato Nariño (direita) ao lado de um exemplar de L. tigrinus do Departamento
de Caquetá (Colômbia) (esquerda). A diferença na coloração e nas marcações entre os dois é
aparente. A Figura 1E,F mostra um indivíduo amostrado na Costa Rica, que tem a mesma aparência
do holótipo de L. t. oncilla (F. p. oncilla; localidade tipo: Volcán de Irazu, Costa Rica), e um exemplar
amostrado em Intag (Província de Imbabura, Equador). Ambos os indivíduos eram morfologicamente
semelhantes e tinham haplótipos mitocondriais intimamente relacionados. A Figura 1G inclui uma
pele da Venezuela muito semelhante ao holótipo de F. p. emerita (localidade tipo: Mérida,
Venezuela); A Figura 1H,I mostra a pele do holótipo de M. caucensis (localidade-tipo: Las Pavas,
Departamento de Cauca, Colômbia), que é o morfotipo semelhante à tigrina encontrado
geograficamente mais próximo de onde o gato Nariño foi descoberto, e a Figura 1J mostra um pele
muito semelhante ao holótipo de M. t. elenae (localidade tipo: Santa Elena, Antioquia, Colômbia).
No entanto, nenhum destes exemplares se parece muito com o gato Nariño.
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Genes 2023, 14, x PARA REVISÃO POR PARES 7

A Figura 1J mostra uma pele muito semelhante ao holótipo de M. t. elenae (localidade tipo: S Elena, Antioquia,
7 de 21
Genes 2023, 14, 1266
Colômbia). No entanto, nenhum desses exemplares se parece muito com o gato Nariño.

Figura
Figura 1. O gato 1. O encontrado
Nariño gato Nariño encontrado no vulcãonoGaleras,
no vulcão Galeras, no departamento
departamento de Nariño,denoNariño,
sul nos
Andes sul-colombianos e aspecto de outros exemplares de outras tigrinas de diferentes
Andes Colombianos e aspecto de outros exemplares de outras tigrinas de diferentes regiões do
regiões dos trópicos. (A – C) Diferentes visões da nova espécie Leopardus narinensis, Ruiz-Ga
Neotrópicos. (A–C) Diferentes visões da nova espécie Leopardus narinensis, Ruiz-García, 2018. A sua
morfologia e o seu ADN de microssatélites mitocondriais e nucleares não coincidem com os de nenhum outro conhecido.
espécies do gênero Leopardus na América Latina. (Fotos Manuel Ruiz García). (D) Comparação de
o gato Nariño (à direita) com um indivíduo de tigrina (do Departamento de Caquetá na Colômbia) com
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Genes 2023, 14, 1266 8 de 21

uma distribuição maior no norte dos Andes e com haplótipos mitocondriais semelhantes aos de
margays e jaguatiricas (esquerda) (Foto Manuel Ruiz-García). Tigrinas centro-americanas e
transandinas: (E) Uma das tigrinas amostradas na Costa Rica (Foto José González-Maya), e (F) Uma
tigrina analisada em Intag (Província de Imbabura, Equador) que tinha um fenótipo muito semelhante
ao Tigrinas da Costa Rica que foram analisadas e mostradas na foto anterior. Ambas as tigrinas
foram confirmadas molecularmente como táxons ou linhagens de tigrina bem definidas. (Foto Manuel
Ruiz García). (G) Foto de uma pele de tigrina da Venezuela muito semelhante ao holótipo de Felis
pardinoides emerita Thomas, 1914 (localidade-tipo: Mérida, Venezuela). (Foto Anderson Feijó). (H,I)
Fotos mostrando o holótipo de M. caucensis Allen, 1915 (localidade tipo: Las Pavas, Departamento
de Cauca, Colômbia). (Foto Anderson Feijó). (J) Foto de uma pele muito semelhante ao holótipo de
M. tigrina elenae Allen, 1915 (localidade-tipo: Santa Elena, Antioquia, Colômbia). (Foto Manuel Ruiz
García). (K,L) Fotos de duas tigrinas amostradas na província de Azuay (Equador) onde o holótipo
de F. p. andina Thomas, 1903 (localidade-tipo: Jima, província de Azuay, no sul do Equador) foi
originalmente descoberta. (Foto Juan Carlos Sánchez e Foto Jorge Brito, respectivamente). Fotos de
L. colocola do Equador com morfologia diferenciada (além de DNA mitocondrial diferenciado e alelos
de microssatélites nucleares) de uma área geográfica próxima de onde o gato Nariño foi descoberto:
(M) Espécime de L. colocola morto em San Lorenzo, na província de Imbabura, norte do Equador
(Foto Diego Tirira), e (N) Exemplar de L. colocola de Macará, sul do Equador (Foto Diego Tirira). As
morfologias destes dois espécimes (M,N) diferem daquelas da nova espécie proposta, L. narinensis.

Outro holótipo de tigrina é F. p. andina (localidade tipo: Jima, província de Azuay, no sul do Equador). Temos
fotografias de animais atualmente amostrados na mesma província equatoriana (província de Azuay) onde andina foi
definida. A Figura 1K,L mostra o aspecto de dois exemplares desta região do Equador, e eles não são semelhantes ao
do gato Nariño.

Não obtivemos fotografias do holótipo de F. carrikeri (localidade tipo: Pozo Azul,

Costa Rica). No entanto, F. carrikeri foi sinonimizado com F. p. oncilla e, portanto, suas
pelagens devem ser semelhantes entre si e diferentes da do gato Nariño.
Outra espécie de gato Leopardus (L. c. thomasi) habita o sul dos Andes colombianos,
perto da fronteira norte do Equador, onde o gato Nariño foi coletado. Seu morfotipo também
é avermelhado e “a priori” semelhante ao do gato Nariño. A Figura 1M,N mostra dois
exemplares de duas áreas diferentes do Equador. No entanto, a morfologia do gato Nariño é
distintamente diferente daquela de L. colocola thomasi.
Os outros felinos pequenos que vivem no sul da Colômbia (L. wiedii, L. pardalis, H. yagouaroundi,
e F. catus) têm fenótipos distintamente diferentes do gato Nariño.

3.2. Análise mitocondrial

3.2.1. Análises Filogenéticas de Mitogenomas
As árvores ML/BI construídas a partir dos mitogenomas completos mostram que o gato
Nariño é o táxon irmão de um clado composto por tigrinas centro-americanas e transandinas
mais L. guigna e L. geoffroyi (árvore ML: bootstrap 81%; árvore BI: posterior probabilidade = 1)
(Figura 2).
O procedimento MJN detectou os mesmos haplogrupos da análise da árvore ML.
Detectamos um haplogrupo com L. guttulus do sul do Brasil e nordeste da Argentina.
Os haplogrupos de L. guigna e L. geoffroyi estavam mais relacionados ao haplótipo L. tigrinus
da América Central do que ao haplótipo transandino equatoriano de L. tigrinus. Os dois
últimos haplótipos foram separados por vários haplótipos não detectados ou extintos. O gato
Nariño estava mais intimamente relacionado, embora diferenciado, de alguns desses
haplótipos não detectados ou extintos entre o L. tigrinus da América Central e o transandino.
Outro haplogrupo inclui jaguatiricas e margays misturados com alguns L. tigrinus dos Andes
do norte. Os haplogrupos restantes foram L. jacobita, L. c. braccatus (com tigrinas hibridizadas
do nordeste do Brasil) e as tigrinas do norte andino colombiano e equatoriano sem sinais de
hibridização com jaguatiricas e margays, respectivamente.
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Genes 2023, 14, x PARA REVISÃO POR PARES 9 de 21

Genes 2023, 14, 1266 9 de 21

Figura 2. Máxima
Figura verossimilhança
2. Máxima e árvores
verossimilhança de inferência
e árvores bayesiana
de inferência de 44de
bayesiana espécimes de felinos,
44 espécimes incluindo
de felinos, 18 ti-18
incluindo
espécimes de morfotipo semelhante a tigrina-grina analisados para todos os seus mitogenomas. Seis amostras
morfotipos semelhantes a clados diferentes analisadas para todos os seus mitogenomas. Seis clados diferentes de
incluem tigrina,
o gato incluindo
Nariño; espécimes
espécimes semelhantes
semelhantes: a tigrina:
L. emiliae comL.mtDNA
emiliaedecom mtDNA de
Leopardus Leopardus
colocola colocola
braccatus; braccatus;
o gato Nariño; L. guttulus;
L. guttulus; a tigrina centro-americana e transandina; a tigrina andina; e a andina, a tigrina centro-americana e
transandina; a tigrina andina; e a tigrina andina com
tigrina com mtDNA intimamente relacionado ao de margays e jaguatiricas. As sequências de mtDNA de outras
espécies estão intimamente relacionadas com as de margays e jaguatiricas. As sequências de outras espécies de Leopardus
de Leopardus foram incluídos. Sequências de F. catus e H. yagouaroundi, duas espécies também foram incluídas.
Também foram incluídas sequências de F. catus e H. yagouaroundi, duas espécies que
incluídos que também vivem na mesma área geográfica onde o gato Nariño foi amostrado. Os primeiros também
vivemnos
o número na nós
mesma área
indica geográfica
suporte onde o (%)
de bootstrap gato(árvore
Nariño ML);
foi amostrado.
o segundoOnúmero
primeiro número
nos no suporte de bootstrap
nós indica
indica(%) (árvore ML);posterior
probabilidade o segundo número
(árvore BI).nos nós indica posterior
probabilidade (árvore BI).
O procedimento MJN detectou os mesmos haplogrupos da análise da árvore
Com baseum
ML. Detectamos na haplogrupo
árvore BI datada
comde
L. mitogenomas completos,
guttulus do sul do Brasilaedivisão temporal
nordeste da entre os
Ancestral do gato Nariño e o táxon mais próximo (ancestral da América Central e transandina
Argentina. Os haplogrupos de L. guigna e L. geoffroyi, estavam mais relacionados ao Centro
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Genes 2023, 14, 1266 10 de 21

L. tigrinus + [L. guigna + L. geoffroyi]) foi de 1,09 ± 0,02 My. A mesma divisão do MJN
procedimento foi de 1,33 ± 0,01 My. A média dessas estimativas gira em torno de 1,2 My, coincidindo
com o início do período glacial pré-Pastoniano (1,3–0,8 Ma), e o Ensenadan
Fauna de mamíferos da América do Sul (1,2–0,4 Ma).

3.2.2. Análise de Distância Genética com Mitogenomos

As menores distâncias genéticas Kimura 2P entre o gato Nariño e outros Leopardus
os táxons foram as tigrinas centro-americanas e transandinas (5,6%) e L. geoffroyi (5,8%)
(Tabela 1). Esses valores foram superiores a outras distâncias genéticas encontradas entre
espécies bem reconhecidas, como L. guigna e L. geoffroyi (2,0%), L. pardalis e L. wiedii (4,4%),
L. geoffroyi e L. tigrinus da América Central e transandina (5,0%), ou L. guigna e
L. tigrinus centro-americano e transandino (5,3%).

Tabela 1. Distâncias genéticas Kimura 2P para mitogenomas inteiros entre as diferentes espécies do
Gênero Leopardus, incluindo o gato Nariño, e diferentes subespécies de L. colocola. Abaixo do principal
diagonal, os valores de distância genética estão em porcentagens (%). Acima da diagonal principal, erros padrão
em porcentagens. 1 = Tigrina andina, L. tigrinus, introgredida por margaís e jaguatiricas; 2 = Andino
tigrina; L. tigrinus, não introgredido por margays e jaguatiricas; 3 = L. guttulus; 4 = Centro-Americano
e tigrina transandina; 5 = L. emiliae; 6 = L.c. braccato; 7 = L. guigna; 8 = L. wiedii; 9 = L. pardalis;
10 = L. geoffroyi; 11 = L. jacobita; 12 = gato Nariño (L. narinensis); 13 = F. catus; 14 = H. yagouaroundi.

Gato
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
taxa

1 - 0,9 1.2 0,8 0,9 0,9 0,8 0,4 0,3 0,8 0,7 0,7 1,5 1.6

2 10.6 - 1.4 1.2 1.3 1.3 1.3 1,0 1,0 1.3 1.2 1.1 1,8 2,0

3 15,0 16,9 - 1.1 1.3 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 2.1 2.1

4 7.3 13.2 13.3 - 0,9 0,9 0,7 0,7 0,9 0,7 0,8 0,7 1,5 1.7

5 6.4 13.6 16.3 6,9 - 0,0 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 0,9 1.7 1,9

6 6.4 13.6 16.3 6,9 0,0 - 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 0,9 1.7 1,9

7 6.8 14,7 15,8 5.3 7.2 7.2 - 0,8 0,9 0,5 0,9 0,9 1.7 1,9

8 3.3 11.9 15.2 7.2 7.7 7.7 7.2 - 0,5 0,8 0,8 0,7 1.6 1.6

9 2.8 10.6 15.4 8,0 6,9 6,9 7,5 4.4 - 0,9 0,8 0,7 1,5 1.7

10 6.8 14.3 15,0 5,0 6,5 6,5 2,0 7.2 7.3 - 0,8 0,8 1,5 1,8

11 5.7 12,8 15.3 7.7 6,9 6,9 6,9 6.4 6.3 6.7 - 0,9 1.6 1,9

12 6.7 13.4 14.4 5.6 6.1 6.1 6.1 7,0 7.6 5.8 7,0 - 1.6 1.7

13 20,8 27.1 29.2 22.3 21.7 21.7 23.1 22.4 21.7 22.4 21.6 21.1 - 1.1

14 25,6 32,8 32,4 24,9 25,9 25,9 26,8 25.2 26,6 26.1 26.3 25.1 10.9 -

3.2.3. Análises Filogenéticas no Gene mtND5

As árvores ML/BI com apenas os dados do gene mtND5 mostraram que o gato Nariño é irmão
táxon de L. colocola, incluindo todas as subespécies reconhecidas desta espécie (87%/0,92).
No entanto, a árvore mtND5 é menos informativa do que a árvore ML anterior e, para resumir, é
não mostrado.
Para o procedimento MJN, detectamos um haplogrupo para alguns indivíduos de L. tigrinus
da Colômbia e do Equador. Também detectamos um haplogrupo encontrado em muitos países colombianos
e o venezuelano L. tigrinus misturado com margays e jaguatiricas. Outro haplogrupo foi aquele
de L. guttulus do sul do Brasil e nordeste da Argentina. Este último haplogrupo também
incluiu indivíduos de tigrina do Brasil central, que não foram misturados com L. colocola.
Outro haplogrupo continha sub-haplogrupos correlacionados com diferentes morfologias
subespécie de L. colocola (braccatus, colocola, wolffshoni, garleppi, pajeros, budini) como ocorreu em
a árvore de ML. Isto apoia o ponto de vista de que todas estas subespécies compreendem uma única
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Genes 2023, 14, 1266 11 de 21

espécies. Várias tigrinas do norte do Brasil (L. t. tigrinus ou L. emiliae [45]) ocorreram
dentro deste haplogrupo de L. colocola porque apresentaram introgressão com o
mtDNA de L. c. braccato. O haplótipo do espécime Nariño foi diferenciado dos
demais táxons. Foi colocado entre o haplogrupo de L. colocola e o do L. tigrinus
centro-americano e transandino.
A árvore BI datada, para os dados do gene mtND5, mostrou que a divisão temporal
entre o ancestral do gato Nariño do táxon mais relacionado (o ancestral de L. colocola)
foi de 1,94 ± 0,10 My. O procedimento MJN detectou que a divisão ocorreu em 1,82 ±
0,22 My. Assim, ambas as estimativas temporais foram semelhantes e sugerem que a
divisão ocorreu por volta de 1,9 Ma, coincidindo com o início da era calabresa do
Pleistoceno. Este valor foi um pouco superior ao encontrado em toda a análise mitogenômica.

3.2.4. Análise de distância genética nos genes mtND5 e mtCyt-b

No gene mtND5, a menor distância genética Kimura 2P entre o gato Nariño e outros
táxons de Leopardus ocorreu com L. tigrinus, que possui DNA mitocondrial de L. c.
braccatus (5,5%). Distâncias genéticas curtas semelhantes foram observadas entre o gato
Nariño e todos os táxons de L. colocola (5,6–6,3%), bem como com o L. tigrinus centro-
americano e transandino (6,7%). Esses valores foram superiores ou semelhantes a outras
distâncias genéticas encontradas entre espécies bem reconhecidas, como L. guigna e L.
geoffroyi (2,4%), bem como L. pardalis e L. wiedii (5,0%). Outros pares com distâncias
genéticas semelhantes incluem L. geoffroyi e L. tigrinus da América Central e transandina
(6,4%), ou L. guigna e a tigrina da América Central e transandina (6,5%). As menores
distâncias genéticas no gene mtND5 ocorreram entre todos os táxons de L. colocola (1,2–
2,9%). No gene mtCyt-b, as menores distâncias genéticas Kimura 2P entre o gato Nariño
ocorreram com as tigrinas centro-americanas e transandinas (2,8%) e com L. geoffroyi
(3,0%). Outras pequenas distâncias genéticas Kimura 2P foram com L. colocola (3,2%) e
com as tigrinas andinas colombianas sem hibridização com margays e jaguatiricas (3,3%).
No entanto, estes valores foram superiores a outras distâncias genéticas encontradas
entre espécies bem reconhecidas, como L. pardalis e L. wiedii (0,3%), L. wiedii e L. jacobita
(2,3%), L. geoffroyi e L. guigna (0,8%), a tigrina centro-americana e transandina e L.
colocola (2,0%), e a tigrina andina colombiana sem hibridização com margays e jaguatiricas
e L. colocola (2,1%). Todas as distâncias genéticas Kimura 2P no mtCyt-b entre o gato
Nariño e todos os outros táxons de Leopardus analisados foram superiores a 2,5%, valor
considerado suficiente para diferenciar entre espécies de mamíferos [90]
3.3. Microssatélites

A árvore Ward (Figura 3) mostrou que o gato Nariño estava intimamente relacionado com L.
geoffroyi e L. guigna. Nesta árvore, detectamos três grandes aglomerados. Um deles era composto
por indivíduos de L. pardalis, L. wiedii, L. t. pardinoides e L. jacobita. O segundo foi composto por
indivíduos de todas as subespécies de L. colocola, e o terceiro por L. guigna, L. geoffroyi e o gato
Nariño. A árvore UUWNJ com distâncias euclidianas (Figura 4) também relacionou o gato Nariño com
L. geoffroyi e L. guigna, bem como a análise do mitogenoma. Este achado também foi apoiado pelo
PCoA com o MST sobreposto utilizando a distância genética ÿµ2 (Figura 5).

Portanto, todas as análises moleculares, utilizando marcadores mitocondriais e nucleares,

forneceram resultados relativamente semelhantes, sugerindo que o gato Nariño é um táxon ou espécie
de gato novo e anteriormente não detectado dentro do gênero Leopardus.
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, PEER
Genes Genes2023 2023, 14, 14, x PARA
1266 REVISÃO POR 12 de 21 12 de 21

Figura 3. Árvore de Ward de distâncias euclidianas quadradas entre 37 espécimes, selecionados entre os 113
espécimes, usando dados de seis espécimes nucleares. Microssatélites de DNA. Esses
imens estudados do gênero Leopardus, utilizando dados de seis microssatélites de DNA nuclear. Esses 37 37
exemplares eram o gato Nariño, 15 L. colocola (dois budini, três steinbachi, dois budini, quatro garleppi,
os exemplares foram o gato Nariño, 15 L. colocola (dois budini, três steinbachi, dois budini, quatro garleppi e
quatro cruscinus),
e quatro cruscinus), cinco
cinco L.
L. wiedii,
wiedii, cinco
cinco L.
L. pardalis,
pardalis, cinco
cinco L.
L. t.
t. pardinoides,
pardinoides, quatro
quatro L.
L. jacobita,
jacobita, um
um L.
L. guigna
guigna,e
um L. geoffroyi. Os números nos nós indicam suporte de bootstrap
e um L. geoffroyi. Os números nos nós indicam suporte de bootstrap (%). (%).
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Genes 2023, 14, 1266 Genes 2023, 14, x PARA REVISÃO POR PARES 13 de 21 13 de 21

Figura 4. Árvore Figura

do procedimento de junção dedevizinhos
4. Árvore do procedimento junção denão ponderado
vizinhos não enraizado
não ponderado (UUNJ)
(UUNJ) com comeuclidianas
distâncias euclidianode
distâncias de seismicrossatélites
seis microssatélites de de
DNA nuclear.
DNA As espécies
nuclear. de Leopardus
As espécies analisadas foram
de Leopardus o gato Nariño,
analisadas foramL. tigrinus
o Nariño
14 de 21
Genes 2023, 14, x PARA REVISÃO POR PARES
pardinoides, L. wiedii, L. pardalis, L. jacobita, L. guigna, L. geoffroyi e L. colocola (cruscicat , L. tigrinus
pardinoides, L. . wiedii, L. pardalis, L. jacobita, L. guigna, L. geoffroyi e L. colocola (cruscinus,
nus, budini, steinbachi e garleppi). Os números nos nós indicam suporte de bootstrap (%). budini,
steinbachi e garleppi). Os números nos nós indicam suporte de bootstrap (%).

Figura
Figura 5. Análise de5.Coordenadas
Análise de Coordenadas Principais
Principais (PCoA), com(PCoA), com procedimento
procedimento de Gower de Gowers,
e com e com a
a genética matriz de
ÿµ2
distância genética ÿµ2 entre oito espécies do gênero Leopardus , incluindo o
matriz de distância entre oito espécies do gênero Leopardus, incluindo o gato Nariño, F. catus, egato Nariño, F. catus, e
H. yagouaroundi. Uma árvore geradora mínima (MST) foi sobreposta ao PCoA. A espécie de H.
yagouaroundi. Uma árvore geradora mínima (MST) foi sobreposta ao PCoA. A espécie de
Leopardus analisados foram o gato Nariño, L. t. pardinoides, L. wiedii, L. pardalis, L. jacobita, L. guigna, L.
Leopardus analisados
geoffroyi e L.foram o gato
colocola Nariño,
(cruscinus, L. t. steinbachi
budini, pardinoides, L. wiedii, L. pardalis, L. jacobita, L. guigna,
e garleppi).
L. geoffroyi e L. colocola (cruscinus, budini, steinbachi e garleppi).
Portanto, todas as análises moleculares, utilizando marcadores mitocondriais e nucleares,
forneceram resultados relativamente semelhantes, sugerindo que o gato Nariño é um táxon ou espécie
de gato novo e anteriormente não detectado dentro do gênero Leopardus .

4. Discussão
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Genes 2023, 14, 1266 14 de 21

4. Discussão

Todas as análises realizadas (mitogenomas, mtND5, microssatélites de DNA nuclear, bem como
bem como algumas características da pelagem) mostram claramente o gato Nariño como um novo táxon ou espécie.

4.1. Algumas percepções taxonômicas da Tigrina

Nascimento e Feijó [45] não diferenciaram L. t. tigrinus, L. t. pardinoides e L. t. oncilla
morfologicamente. Esses autores concluíram que todas as tigrinas da América Central, norte da
América do Sul (Venezuela, Guianas, norte do Brasil), noroeste e oeste da América do Sul (Colômbia,
Equador, Peru, Bolívia e noroeste da Argentina) pertenciam a um único táxon, L. t . tigre; isso se
correlacionou com seu morfotipo I. Em contraste, um trabalho de genética molecular [46] e este
artigo indicam que existem pelo menos quatro linhagens mitocondriais de tigrina distintas ocorrendo
na América Central, noroeste e sudoeste da América do Sul. Uma linhagem distinta é a tigrina centro-
americana e transandina colombiana e equatoriana. A segunda linhagem está presente na tigrina
andina com o mtDNA desta linhagem diferenciado daquele dos margays e jaguatiricas.

A terceira linhagem também está dentro da tigrina andina, mas esta linhagem possui mtDNA muito semelhante
aos de margays e jaguatiricas. Essa semelhança pode ser produto da hibridização entre essas espécies ou da
antiga introgressão dos ancestrais das margaias e jaguatiricas dentro da tigrina. A quarta linhagem é o gato Nariño.
Portanto, o morfotipo I [45] é composto por quatro linhagens moleculares significativamente diferentes, e essas
diferentes linhagens poderiam representar três ou quatro espécies diferentes, pelo menos, se empregassemos o
PSC [1,91]. De forma idêntica, Kitchener et al. [92] concluíram (excluindo L. guttulus de L. tigrinus), levando em
consideração os resultados de Li et al. [33], a existência de duas subespécies de L. tigrinus na região Neotropical:
L. t. oncilla na América Central e L. t. tigrinus na América do Sul. Nossos resultados mostram que estes estudos
não representam adequadamente o número real de táxons ou espécies dentro do complexo tigrina. Contrariamente,
trabalhos antigos [93] concordam muito bem com os nossos novos resultados moleculares, alegando a existência
de pelo menos três ou quatro espécies diferentes de tigrina na América Central e no noroeste da América do Sul.

Além disso, o trabalho morfológico recente detectou pelagens altamente semelhantes entre algumas tigrinas
e o gato-maracajá [45]. Houve quatro casos de similaridade de pelagem entre estas duas espécies na Venezuela,
Guiana, El Tambo, no Departamento de Cauca (Colômbia), e Las Pavas, Departamento de Valle del Cauca
(Colômbia). Esta semelhança de pelagem pode estar relacionada à hibridização entre algumas tigrinas e margays
que foram detectadas anteriormente [46] e neste estudo.

Outro achado relevante deste trabalho é que todos os espécimes analisados de L. colocola representam
uma única espécie, embora seus fenótipos sejam heterogêneos. Assim, nossos resultados não apoiam L. colocola
compreendendo três espécies diferenciadas (L. colocola, Leopardus pajeros, L. braccatus) [34].

No entanto, a descoberta mais surpreendente do presente estudo pode ser que o gato Nariño
tem uma clara diferenciação molecular de todos os outros táxons conhecidos do género Leopardus,
bem como algumas características de pelagem que o distinguem de todos os táxons tigrina descritos
anteriormente; portanto, o gato Nariño precisa ser descrito como uma nova espécie ou táxon dentro
do gênero Leopardus.

4.2. O gato Nariño

Do ponto de vista morfológico, nenhum dos holótipos das formas definidas de tigrina em toda
a América Central e noroeste da América do Sul (F. pardinoides, F. p. oncilla, F. carrikeri, F. p.
emerita, F. p. andina, M . t. elenae e M. caucensis) se assemelham muito ao gato Nariño. Algumas
características da pele do gato Nariño, por exemplo, rosetas (com bordas claramente pretas, mas
intensamente avermelhadas por dentro), são semelhantes àquelas que observamos em indivíduos
da forma andina (Azuay, Equador). Porém, para todas as demais características da pelagem, o gato
Nariño se diferenciou do andina. Os outros pequenos gatos malhados no sul dos Andes colombianos
e no norte dos Andes equatorianos são o margay, a jaguatirica e o gato colocolo. A pelagem do gato-
maracajá e da jaguatirica é diferenciada daquela do
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Genes 2023, 14, 1266 15 de 21

Gato Narinho. A comparação entre o colocolo e o gato Nariño é interessante porque existem semelhanças em
alguns caracteres morfológicos. Ambos os táxons têm corpos mais arredondados e atarracados do que os tigrinas.
Além disso, sua pelagem é mais vermelha e suas cabeças são mais largas e arredondadas em comparação às
das tigrinas. Porém, alguns traços característicos do colocolo não ocorrem no gato Nariño. Por exemplo, o gato
colocolo possui rosetas completamente vermelhas, inclusive suas bordas. Há também uma faixa transversal preta-
acastanhada na parte superior do peito, e o gato colocolo também apresenta duas a quatro listras pretas
contrastantes na parte superior das patas dianteiras. Estas características estão ausentes no gato Nariño. Na
verdade, um especialista em morfologia de L. colocola (Dra. Rosa García-Perea, Museu Nacional de Ciências
Naturais, Madrid, Espanha) comentou: “ . . . Este indivíduo raro não é uma L. colocola. Deveria ser uma dessas
estranhas tigrinas, que aparecem de vez em quando. . .
”

A análise mitogenômica mostrou que o gato Nariño é o táxon irmão do clado formado pelas
tigrinas centro-americanas e transandinas + L. geoffroyi/L. guigna. Com base na análise de
microssatélites de DNA nuclear, o gato Nariño é o táxon irmão do clado composto por L. geoffroyi +
L. guigna (as tigrinas centro-americanas e transandinas não foram analisadas para microssatélites).
Portanto, tanto os dados mitogenômicos quanto os dados de microssatélites nucleares ofereceram
resultados idênticos em relação às relações do gato Nariño com dois pequenos gatos malhados (L.
geoffroyi e L. guigna). Esses dois pequenos gatos malhados são morfologicamente diferentes e estão
distribuídos a mais de 3.500 km de distância do sul dos Andes colombianos, onde ocorre a localidade-
tipo do gato Nariño. Portanto, o gato Nariño pode ser uma subespécie de L. oncilla (este último táxon
elevado à categoria de espécie), ou é uma nova espécie irmã das tigrinas centro-americanas e
transandinas (L. oncilla + (L. geoffroyi /L. guigna)).
Além disso, o gato Nariño não é uma forma de híbrido de espécies de gatos conhecidas (das
linhagens tigrina, margay, jaguatirica, colocolo, jaguarundi ou gato doméstico) daquela área da Colômbia.
Seu mtDNA difere de todas as espécies de gatos conhecidas. Se o gato Nariño era um híbrido, a
linhagem feminina deste exemplar de gato Nariño é sem dúvida uma espécie diferente, até agora não
reconhecida pela comunidade científica.
Como o gato Nariño tem um padrão de pelagem diferente daqueles de outras formas de tigrina
e outras espécies de Leopardus, e porque o gato Nariño é geneticamente (genes nucleares e
mitocondriais) distinto de outros táxons de Leopardus, sugerimos o gato Nariño como uma nova
espécie :
Leopardus narinensis sp. novembro. Ruiz-García 2018. URN: LSID: ZOOBANK.ORG: ACT:
037B9EF0-8AEF-4717-8C5A-56D9E293C6DF.
Etimologia: O nome específico refere-se ao departamento de Nariño, no sul da Colômbia, onde
este espécime foi obtido. Propomos o nome comum de gato Nariño ou Galeras (pela sua origem) ou
tigrina vermelha (porque a sua pelagem é maioritariamente avermelhada). Se a distribuição geográfica
deste novo táxon for maior do que se acredita atualmente, tigrina vermelha seria o nome comum
preferido.
Holótipo: A pele do holótipo está no Instituto von Humboldt (ID 5857) (Figura 1).
Localidade tipo: O espécime foi coletado em 1989 no Vulcão Galeras, Nariño
Departamento (Colômbia) (1ÿ1343,8” N; ÿ77ÿ2133” W), 3100 m acima do nível do mar (masl).
Diagnóstico morfológico: Sua cor de fundo é mais avermelhada que em outros fenótipos de L.
tigrinus. A maioria das rosetas é delimitada por bordas pretas, mas o interior das rosetas apresenta
uma cor avermelhada muito mais intensa do que outros espécimes de L. tigrinus. Em comparação
com outros táxons de L. tigrinus, o topo da cabeça do gato Nariño e sua crista dorsal são muito mais escuros.
Sua pelagem é mais densa e lanosa. A cabeça é mais redonda e larga. O corpo é relativamente mais
robusto do que em outros táxons de L. tigrinus.
Diagnóstico molecular: Foram observados caracteres diagnósticos em nível de espécie para o
gato Nariño nos dois genes mitocondriais para os quais existem mais sequências em gatos
neotropicais (mtATP8 e mtND5) e produziram as seguintes sete sinapomorfias: No gene ATP8 (três
sinapomorfias) no posições de nucleotídeos 8530 (T), 8594 (A) e 8597 (T).
No gene ND5 (quatro sinapomorfias) nas posições de nucleotídeos 12.506 (A), 12.715
(A), 12.737 (A) e 12.749 (A). Essas sete sinapomorfias diferenciaram esses dois genes mt
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do gato Nariño daquelas de todas as outras espécies do gênero Leopardus e do gato

doméstico e do jaguarundi.
Outra questão importante é quando o ramo do gato Nariño divergiu de outras linhagens
Leopardus. Nossas divisões de divergência temporal concordam com estimativas realizadas
por outros autores para Leopardus. Nossa estimativa inicial de diversificação temporal em
Leopardus (3,91 a 3,02 Ma) foi muito semelhante à estimada por Li et al. [33], 3,97–3,14 My,
e por Johnson et al. [29], 2,91 Meu. Portanto, a diversificação inicial no gênero Leopardus
ocorreu durante o Plioceno (eras Zanclean-Piacenziana). O clima frio e seco durante o
Plioceno coincidiu com o início dos ciclos glaciais de alta latitude. Além disso, este período do
Plioceno concorda muito bem com a última fase de elevação dos Andes [94] (ver, por exemplo,
a ascensão dos “tablazos” de Piura, Peru) e a elevada atividade vulcânica nos Andes que
levou à substituição de florestas tropicais com ambientes de estepe e pastagens.
A divisão temporal do ancestral do gato Nariño dos ancestrais de outros táxons de
Leopardus ocorreu em aproximadamente 1,3–1,0 Ma, de acordo com a análise de todo o
mitogenoma. Este possível cenário de diferenciação do ancestral do gato Nariño pode ter sido
iniciado pelo período glacial pré-Pastoniano (1,3–0,8 Ma; dentro da era calabresa), que teve o
pico glacial mais alto do primeiro período glacial Quaternário (Günz) . Este período glacial foi
extremamente seco e houve um grande grau de fragmentação florestal. As florestas andinas
foram transformadas em savanas abertas, frias e secas ('paramo'), que poderiam ter
populações potencialmente isoladas de diferentes espécies. O gato Nariño foi amostrado em uma área
Foi demonstrado que a temperatura média nos Andes colombianos era 4 ÿC mais baixa do
que hoje [95]. A 2500 msnm, a temperatura era 10 ÿC mais baixa do que é atualmente e, além
disso, a precipitação foi inferior ao nível relatado para hoje [95]. A área onde o gato Nariño foi
amostrado corresponde à província Biogeográfica do Norte dos Andes, em uma zona
montanhosa de endemismo denominada “Nudo de los Pastos” caracterizada por um clima frio
ou muito frio de origem geomorfológica vulcânica [96]. Este também foi um momento de
diferenciação para muitos carnívoros, como foi previamente determinado para o gato colocolo
e as raposas do gênero Lycalopex [97,98]. Por volta de 1,3 Ma, a fauna de Buenos Aires se
transformou em uma típica fauna semiárida patagônica, representada pelo guanaco,
Lestodelphys e Lyncodon. Portanto, o clima era consideravelmente mais frio e seco do que
hoje e pode ter influenciado o processo de especiação do gato Nariño.
Este novo táxon está ausente nos museus latino-americanos que revisamos (na Colômbia,
Equador, Peru, Bolívia, Chile, Argentina, Paraguai e Uruguai). Na natureza, este táxon não foi
registrado. Armadilhas fotográficas (desde 2018 até agora) no sul da Colômbia e no norte do
Equador ainda não registraram o animal. Este novo táxon pode estar quase extinto ou
totalmente extinto. Doravante, o espécime que analisamos deverá ser um dos últimos
exemplares vivos deste táxon.
As etapas a seguir são necessárias para validar a existência deste novo pequeno gato
malhado na região Neotropical. Primeiro, confirme que o táxon não está extinto e que ainda
existem indivíduos vivos. Em segundo lugar, localize peles e crânios adicionais semelhantes
ao gato Nariño em coleções ou museus. A publicação deste novo táxon poderá criar
consciência para ajudar na descoberta de novos exemplares para testar a hipótese aqui
levantada. Terceiro, o sequenciamento de geração de corante Illumina, o pirosequenciamento
454 Life Sciences, Pac-Bio ou Oxford Nanopore podem determinar as características do
genoma nuclear do gato Nariño e de todos os táxons tigrina. Estas análises ajudar-nos-iam a
determinar o grau de hibridização destes pequenos gatos malhados entre si, bem como o grau
de hibridização com outras espécies morfologicamente diferenciadas e bem reconhecidas do género Le
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Materiais Suplementares: As seguintes informações de apoio podem ser baixadas em: https://
www.mdpi.com/article/10.3390/genes14061266/s1 , Tabela S1: Espécimes semelhantes a Tigrina e
outros indivíduos Leopardus analisados para dois conjuntos de dados mitocondriais diferentes (1-
mtND5; 2-mitogenomas, incluindo o gene mtCyt-b). mt = mitocondrial. PUJ = Coleção de mamíferos
do Laboratório de Genética Molecular de Populações e Biologia Evolutiva da Pontifícia Universidade
Javeriana (Bogotá, Colômbia). IvH = Coleção de mamíferos do Instituto von Humboldt (Villa de Leyva,
Colômbia). Tabela S2: Primers mitocondriais e microssatélites empregados neste trabalho. (A) Primers
mitocondriais de amplificação de longo alcance utilizados. (B) Primers de microssatélites nucleares utilizados.
Contribuições dos autores: MR-G. elaborou a pesquisa, obteve todas as amostras do estudo e realizou procedimentos
laboratoriais com microssatélites de DNA. MR-G. e JMS supervisionou as análises moleculares. MP-C. realizaram procedimentos
laboratoriais com mtDNA. MR-G. realizou as análises estatísticas e escreveu o manuscrito com contribuições de JMS e MR-G.
enviou sequências ao GenBank. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pela Pontificia Universidad Javeriana (http://www.javeriana.edu.co/ acessado em 7
de novembro de 2021), número de concessão ID PROY 003915.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Não aplicável.

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido: Não aplicável.

Declaração de disponibilidade de dados: Os conjuntos de dados gerados e analisados durante o presente estudo estão
disponíveis ao autor correspondente mediante solicitação razoável nos e-mails mruizgar@yahoo.es e mruiz@javeriana.edu.co, e
nos arquivos de dados suplementares , que estão disponíveis na versão online deste artigo. Os números de acesso do GenBank
do gato Nariño e dos demais espécimes de Leopardus aqui analisados vão de MG230196.1 a MG230251.1.

Agradecimentos: A permissão para realizar trabalho de campo e coleta de amostras foi obtida do
Instituto von Humboldt (Colômbia) e dos Ministérios do Meio Ambiente do Equador, Bolívia, Peru e
Costa Rica. Não foi necessária qualquer revisão do comité de ética, uma vez que o nosso trabalho de
investigação não envolveu qualquer manipulação direta ou perturbação de animais vivos e, em vez
disso, baseou-se em amostras de peles de museus e animais atropelados. Por isso, muito obrigado a
estas instituições, mas especialmente ao Instituto von Humboldt (Villa de Leyva; Janeth Muñoz,
Fernando Botero, Claudia Alejandra Medina e Andrés Cuervo). Além disso, agradecemos à Direção
Geral de Biodiversidade e à CITES da Bolívia. Expressamos nossa gratidão ao PRODUCE, à Dirección
Nacional de Extracción e ao Procesamiento Pesquero, e ao Instituto Nacional de Recursos Naturais
(INRENA) do Peru por seu papel na facilitação da obtenção das licenças de coleta. Agradecimentos
especiais vão para a Colección Boliviana de Fauna (Julieta Vargas) em La Paz (Bolívia), bem como
para o Ministerio del Ambiente em Santo Domingo de Tsáchilas (Equador) e para o Instituto Nacional
de Biodiversidad del Ecuador (INABIO; Quito, Equador). Agradecemos também a Virginia Hayssen,
Zoe Baker e Emily Blackwell pelas suas observações e correções de um rascunho deste manuscrito.
Além disso, agradecemos a Luis Pacheco (Bolívia), Armando Castellanos (Equador) e Nicolás Lichilín
(Colômbia) que ajudaram o primeiro autor a provar algumas tigrinas na Bolívia, Equador e Argentina,
respectivamente. Agradecemos às seguintes pessoas pela ajuda na obtenção de fotos de diferentes
morfotipos de tigrina e Leopardus colocola: José González-Maya (Colômbia), Anderson Feijó (Brasil),
Juan Carlos Sánchez (Equador), Jorge Brito (Equador), Diego Tirira (Equador ) e Miguel Pinto
(Equador). Agradecemos também ao Gabinete do Vice-Reitor da Universidade de Minnesota Crookston
que nos permitiu dedicar mais tempo para colaborar com a Pontifícia Universidade Javeriana de
Bogotá (Colômbia) na filogenética e nas análises filogeográficas da fauna neotropical.
Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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