Pirogênios e endotoxinas

Pirogênios: Qualquer substância capaz de induzir elevações de temperatura, em resposta a injeção ou infecção,
em animais e humanos.

Pirogênios exógenos: Pirogênios endógenos:

Produtos externos ao organismo que produzem Mediadores endógenos que produzem febre como
febre ao entrar em contato com este. resposta à contaminação do organismo.

São fragmentos ou toxinas, como fungos, vírus e São citocinas, como Interleucina 1 β (IL-1 β) Interleucina
bactérias. 6 (IL-6) Fator de necrose tumoral α (TNF α ); que
desencadeiam a liberação de prostaglandina E2

Toxinas bacterianas:

Os pirogênios já existem (matérias primas, embalagens, equipamentos e ambiente) ou se desenvolveram

durante o processo (processo lento, despirogenização inadequada).

Despirogenização:

Obs: somente isso não comprova a apirogenicidade ⇒ Necessita de testes de CQ,

A avaliação de pirogênios é realizada a cada novo lote produzido de injetáveis, e há 2 principais

metodologias:
1. Teste in vivo para pirogênios (Farmacopeia Brasileira)
2. Teste in vitro para endotoxinas bacterianas (Farmacopeia Brasileira)
Teste in vivo para pirogênios
É um ensaio biológico in vivo fundamentado na medida da temperatura corporal de coelhos após injeção
intravenosa da solução em análise.
● É um teste qualitativo (presença ou ausência);
● Também denominado de teste de hipertermia em coelhos.
● Modelo animal é preconizado, pois: A relação dose-resposta a pirogênios é similar com a do homem,
onde 5 Unidades Internacionais de Endotoxina/kg é a dose mínima que causa febre em ambas as
espécies.
● Coelhos preferencialmente do mesmo sexo, mesma raça, adultos e sadios.

Constituição do grupo experimental:

● n= 3 animais
● Selecionados segundo alguns critérios
1º) Peso mínimo: 1,5 Kg
2º) Temperatura usual → Ambientação dos animais no procedimento pelo menos 7 dias antes do teste.

Procedimento:
Local adequado → deve ser em uma sala específica dentro do setor de CQ biológico
● Temperatura e umidade controladas (20 – 23 ºC);
● Livre de perturbações;
● Animais mantidos contidos durante o procedimento.
Materiais:
● Devem ser estéreis e apirogênico;
● Deve-se empregar termômetros calibrados (manual, automático ou termopares).
No dia do teste:
● Supressão de alimentos (2h antes); água permitida.
● Pesagem e ambientação novamente dos animais pré-selecionados.
● Temperatura basal do dia é medida 30 minutos antes da injeção da amostra.

Registro e resultado do teste:

Produto cumpre o teste: quando nenhum dos três coelhos apresentar número individual da temperatura ≥ 0,5 °C.
Se algum coelho não cumprir a especificação, deve-se repetir o teste utilizando outros cinco animais.

Produto cumpre o teste:

● No máximo, 3 dos 8 coelhos apresentarem aumentos individuais de temperaturas ≥ 0,5 °C.
● Se a soma dos aumentos individuais de todos os coelhos não exceder 3,3°C.

Procedimento pós-teste:
Pode haver reutilização dos animais após os testes.
➔ Após teste negativo → Reutilização após 2 a 3 dias de intervalo
➔ Após teste positivo → reutilização após 2 a 3 semanas de intervalo
➔ Casos especiais de evitar a reutilização → a monografia informará

Vantagens: Desvantagens:

▪ Reproduz resposta fisiopatológica da febre ▪ Uso de animais

▪ Detecta todos os tipos de pirogênios ▪ Teste qualitativo
▪ Não necessita padrão ▪ Baixa sensibilidade
▪ Alta variabilidade
▪Não aplicável à alguns produtos (ex: analgésicos,
antitérmicos, anti-inflamatórios, radiofármacos)

Testes alternativos:
Teste in vitro para endotoxina → parcialmente substitutivo (compendial)
Teste in vitro para pirogênios → culturas celulares de monócitos (ainda não descrita em todos os
compêndios)

Teste in vitro para endotoxinas:

O teste de endotoxinas é um ensaio biológico in vitro descrito na FB e utilizado para detectar ou quantificar
endotoxinas presentes nas amostras para qual o teste é preconizado.
Para a sua execução, emprega-se o reagente LAL (Lisado de Amebócitos do Limulus) → Obtido a partir do
extrato aquoso dos amebócitos circulantes de alguns caranguejos, principalmente de Limulus polyphemus

Fundamento do teste:

O resultado do ensaio pode ser: qualitativo, semi-qualitativo ou quantitativo (dependerá da forma e avaliar o
meio reacional).
 Método da coagulação em gel: Métodos fotométricos (turbidimétricos e
cromogênicos):

▪ Método Semi-quantitativo ou qualitativo. ▪ Quantitativos

▪ Mais sensíveis do que método da coagulação

Limite de endotoxinas:
Febre em humanos → observada a partir de 5 UI de Endotoxina/Kg
Alguns exemplos de limites nos produtos são:
● Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL
● Água para injeção: 0,25 UE/mL
● Correlatos invasivos: 0,5 UE/mL

Limite de endotoxinas calculado (LE)

LE = k/M
Onde:
➔ k = 5 UI/kg ou 350 UE/70 kg (Febre em humanos);
➔ M = dose humana máxima do fármaco por kg ou por 70 kg, administrada numa injeção por hora (Bula
do medicamento)

Cálculo da máxima diluição válida

A máxima diluição válida (MDV) é a diluição máxima permitida para um produto com um determinado limite
de especificação para que a endotoxina bacteriana, caso presente, possa ser detectada.

Procedimentos:

Avaliação da amostra e padrões:

Obs: duplicatas em cada tubo.

1. Método da coagulação em gel
Diluir a amostra:
● Amostra + água para injetáveis (apirogênica);
● pH: deve estar entre 6 e 8 (corrigir se necessário com tampões, ácidos ou bases diluídas e
apirogênicas);
● O processo deve ser realizado de modo asséptico.

➔ Reação positiva: formação de gel firme;

➔ Reação negativa: ausência de gel ou formação de gel viscoso.
Coagulação em tubo → detecção pela observação do coágulo que não cai ao virar o tubo.

2. Métodos fotométricos:
Permite a detecção e quantificação de endotoxinas baseada na turvação ou reação colorimétrica com
posterior leitura da absorvância.

Métodos que empregam menos padrão e menos reagentes (+econômicos, porém necessitam do equipamento para
leitura).
 Vantagens: Desvantagens:

▪ Métodos rápidos; ▪ Não detecta todos pirogênios;

▪ Métodos sensíveis. ▪ Possibilidade de falsos positivos e negativos;
(Limitações de uso em alguns produtos)

Principais limitações de aplicações:

▪ Agentes desnaturantes
▪ Soro ou plasma (MUITOS PRODUTOS BIOLÓGICOS)
▪ Amostras com pH < 3 ou > 9
▪ Íons cálcio > 0,67 M
▪ Lipídios, emulsões para infusão
▪ Glutationa, acetilcisteína
▪ Cloranfenicol, tetraciclina, oxitetraciclina
▪ Penicilinas semi-sintéticas