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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

AREA DE CONCENTRAÇÃO:
SISTEMAS DE PROCESSOS QUÍMICOS E INFORMÁTICA

ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA BROMELINA PURA E

DO RESÍDUO DE ABACAXI EM DIFERENTES PH E TEMPERATURA CONSTANTE

Autora: Mariele Nair de Campos Moura

Orientador: Prof. Dr. Elias Basile Tambourgi

Dissertação de Mestrado apresentada à

Faculdade de Engenharia Química como
parte dos requisitos exigidos para obtenção
do título de Mestre em Engenharia Química.

Campinas – São Paulo

Abril / 2010
 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

Moura, Mariele Nair de Campos

M865e Estudo da atividade enzimática da bromelina pura e
do resíduo de abacaxi em diferentes ph e temperatura
constante / Mariele Nair de Campos Moura. --Campinas,
SP: [s.n.], 2010.

Orientador: Elias Basile Tambourgi.

Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Engenharia Química.

1. Bromelina. 2. Análise enzimática. 3. Estabilidade.

4. Enzimas. I. Tambourgi, Elias Basile. II. Universidade
Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia
Química. III. Título.

Título em Inglês: Enzymatic activity studies of pure and starch bromelain from
pineapple at diferents ph and constant temperature
Palavras-chave em Inglês: Bromelain, Enzyme analysis, Stability, Enzymes
Área de concentração: Sistemas de Processos Químicos e Informática
Titulação: Mestre em Engenharia Química
Banca examinadora: Priscila Gava Mazzola, Flávio Vasconcelos da Silva
Data da defesa: 19/02/2010
Programa de Pós Graduação: Engenharia Química

ii
iii
iv
Dedico:
Aos meus pais, Walter e Fatima com muito
amor.

v
 AGRADECIMENTOS

A Deus.
Ao Professor Elias Basile Tambourgi pelo incentivo, dedicação e amizade
durante todo o desenvolvimento deste trabalho.
A toda minha família, especialmente meus pais Walter e Fatima e minha irmã
Juliana, pelo exemplo, ensinamento, amor, carinho, dedicação e incentivo dedicados a
mim durante este trabalho.
A Kleber Maciel, pelo carinho e incentivo dedicados a mim durante este trabalho.
A todos os amigos do Laboratório de Processos de Separação, José Carlos,
Juliana, Giovana, Dalva, Kleber, Edgar e Thayse pelo apoio, colaboração e amizade
durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores, funcionários da Faculdade de Engenharia Química da
Faculdade Estadual de Campinas – UNICAMP.
Aos amigos, que de uma forma ou outra contribuíram para a realização deste
trabalho.
A CAPES, pelo apoio financeiro.

vi
 RESUMO

Bromelina é o nome dado a um conjunto de enzimas proteolíticas encontradas

nos vegetais da família Bromeliaceae, na qual abacaxi é o mais conhecido. A bromelina
é encontrada na casca, no talo e no fruto do abacaxi. A enzima não esta presente nos
primeiros estágios de desenvolvimento do fruto, seu nível aumenta rapidamente,
ficando alto até a maturação do fruto. A bromelina tem diversas aplicações nas
indústrias alimentícias e farmacêuticas. Com o desenvolvimento de novas técnicas de
extração e purificação da bromelina, tornou-se necessário um estudo de estabilidade
desta enzima. É importante saber em que condições a bromelina se mantém estável, ou
seja, ativa e por qual período de tempo. Este trabalho apresenta um estudo da condição
do pH em que a Bromelina P.A e a da casca e talo do abacaxi, mantém se ativa, ou
seja, não desnaturada e suas influencias com o tempo. A atividade enzimática foi
medida através da hidrólise da caseína. Foi observado que a bromelina P.A e a da
casca e talo do abacaxi apresentam ótima atividade enzimática em pH neutro e
mantém-se estável por aproximadamente quinze dias.

Palavras Chaves: Bromelina, Análise enzimática, Estabilidade, Enzimas.

vii
 ABSTRACT

Bromelain is a set of proteolitics enzymes found in vegetables of the

Bromeliaceae family, from which pineapple is known more. The bromelain is found in
pineapple stem and fruit. The Enzyme are not presented in the early stages of fruit
development, however, their levels increase quickly, remaining high until the maturation.
Bromelain has several uses in food industry and pharmaceutical industry. The
development of new extraction and purification processes of bromelain have been
studied, however, its necessary a enzyme stabilization investigation. It is important to
know the conditions and the time which bromelain remain stabilized, active. This work
presents a study about pH condition which a bromelain aqueous solution and bromelain
of a pineapple stem, remains with biological activity and its influences within time. The
enzyme activity was tested across the casein hydrolysis. It was observed wich a
bromelain aqueous solution and bromelain of a pineapple stem showed optimum activity
at neutral pH and 37 °C and kept stable for around fifteen days.

Key-words: Bromelain, Enzyme analysis, Stability, Enzymes.

viii
 SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................... vii
ABSTRACT .............................................................................................................. viii
SUMÁRIO................................................................................................................... ix
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ................................................................................... 1
1.1 – Introdução .......................................................................................................... 1
1.2 – Objetivo .............................................................................................................. 2
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................... 3
2.1 – Fruticultura Brasileira.......................................................................................... 3
2.2 – Produção, Produtos e Subprodutos do Processamento ..................................... 4
2.3 – Caracterização e Composição Química do Abacaxi .......................................... 5
2.4 – Enzimas.............................................................................................................. 7
2.5 – Desnaturação ..................................................................................................... 8
2.6 – Consumo de Enzimas ........................................................................................ 9
2.7 – Bromelina ......................................................................................................... 10
2.8 – Consumo de Bromelina .................................................................................... 11
CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................ 13
3.1 – Materiais ........................................................................................................... 13
3.1.1 – Reagentes ..................................................................................................... 13
3.1.2 – Equipamentos ............................................................................................... 13
3.2 – Métodos............................................................................................................ 14
3.2.1 – Preparo das Amostras ................................................................................... 14
3.2.2 – Procedimentos Experimentais ....................................................................... 14
3.2.3 – Determinação da Atividade Enzimática ......................................................... 16
3.2.3.1 – Curva de Calibração ................................................................................... 16
3.2.3.2 – Atividade Enzimática da Bromelina ............................................................ 16
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................... 17
4.1 – Atividade Enzimática da Bromelina P.A em Função do Tempo para Diferentes pH
.................................................................................................................................. 18
4.2 – Atividade Enzimática da Bromelina da Casca e Talo em Função do Tempo para
Diferentes pH ............................................................................................................ 20
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES ...................................................... 22
5.1 – Conclusões....................................................................................................... 22

ix
5.2 – Sugestão .......................................................................................................... 23
CAPÍTULO 6 – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ...................................................... 24
ANEXOS ................................................................................................................... 31
ANEXO A. Descrição do método para a determinação da atividade proteolítica através
da hidrólise da caseína: ............................................................................................ 31
ANEXO B. Método Espectrofotométrico .................................................................... 36

x
 LISTA DE FIGURA

FIGURA 4.1 – Curva de calibração para determinar a atividade enzimática da

bromelina...................................................................................................................17

LISTA DE TABELA

Tabela 2.1 – Composição química média do abacaxi. ................................................ 6

Tabela 3.1 – Variáveis estudadas para a Bromelina P.A e Bromelina da casca e talo
................................................................................................................................... 15
Tabela 4.1 – Resultados da atividade enzimática obtidos para a Bromelina P.A. através
da hidrólise da caseína a 37 °C............................................................................. ....19
Tabela 4.2 – Resultados da atividade enzimática obtidos para a Bromelina da casca e
talo através da hidrólise da caseína a 37 °C..............................................................21

xi
 LISTA DE ABREVIATURAS

a: Absortividade.
A: Absorbância.
b: Distância que a luz atravessa.
c: Concentração.
I: intensidade da luz incidente.
Io: Intensidade da luz que conseguiu atravessar a amostra.
T: Transmitância.
TCA: Ácido tricloroacético.
U: Unidade de atividade enzimática ou específica ( mol/min)

xii
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Introdução

Grande parte da história da bioquímica é a da pesquisa sobre enzimas. Louis

Pasteur conclui que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por
fermentos. Ele postulou que esses fermentos depois de nomeados enzimas eram
inseparáveis da estrutura das células vivas dos levedos, uma hipótese que prevaleceu
por muitos anos. Assim, as enzimas são moléculas orgânicas presentes nas células de
organismos vivos, com a função específica de catalisar reações químicas. Possuem
atividade catalítica específica, e ainda, apresentam elevada especificidade em relação
aos reagentes cujas transformações químicas catalisam (HALPERN, 1997). O emprego
de enzimas em diversos setores industriais vem crescendo há vários anos (FORGATY
& KELLY, 1979; WISEMAN, 1987).
Bromelina é o nome genérico dado ao conjunto de enzimas proteolíticas
encontradas nos vegetais da família Bromeliaceae, na qual o abacaxi é o mais
conhecido. Para obtenção da bromelina, podem ser utilizadas diferentes partes do
abacaxi: folhas, talos, polpa da fruta, cascas e resíduos industriais do processamento
do fruto. A Bromelina é uma cisteína proteinase e a planta Ananas comosus possui
quatro cisteína proteinase distintas e duas no talo (ROWAN, BUTTLE & BARRETT,
1990). E atuam como ativadores da ação enzimática, agentes sulfetos, cianetos, sulfitos
e cisteína.
A bromelina aplica-se em diversas áreas: indústrias de alimentos, indústrias
farmacêuticas, indústrias de cosméticos (TECHNOBLE K. K. JAPAN; YAMADA, NAITO
& SAWAKI, 1997) e na desodorização de gases (UYAMA SHIZUO; UDA & UYAMA,
1991).
Diante das possíveis aplicações e do crescimento da biotecnologia, ou
seja, o surgimento de novas técnicas de extração e purificação, o estudo da
estabilidade desta enzima no sistema torna-se necessário para que não ocorra a

1
desnaturação enzimática. Deve-se considerar que temperatura e pH, são fatores que
exercem grande influência no processo de desnaturação. Assim, logo após a extração
da enzima é possível utilizá-la em solução por um longo período de tempo e em
condições apropriadas para mantê-la estável.

Neste trabalho, a atividade enzimática foi medida através da hidrólise da

caseína utilizando solução de bromelina pura e da casca e talo do abacaxi.

1.2 – Objetivo

Geral:
- Estudo da atividade enzimática da bromelina pura e do resíduo de abacaxi em
diferentes valores de pH a temperatura constante.

Específico:
- Determinar a melhor condição de armazenamento da bromelina;
- Determinar o período de tempo que a bromelina se mantém ativa.

2
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Fruticultura Brasileira

Nosso país é um grande produtor de frutas tropicais e o abacaxizeiro destaca-

se por possuir uma cultura muito exigente. Um fator que compromete a regularidade da
produção possibilitando a geração de frutos que não se enquadram no padrão
comercial é a não uniformidade do processo de florescimento (FERREIRA, 2007).
A época de colheita das frutas pode ocorrer durante o ano todo ou apenas por
nove meses variando com as regiões de cultivo e com os ciclos de maturação
(precoces ou tardias) no Estado de São Paulo. A colheita no clima tropical dura o ano
todo e no clima temperado começa em setembro e se estende até junho. (GODOI,
2007).
A produção do fruto necessita de um clima favorável, clima quente ou
mesotérmico, uma temperatura média entre 21 e 27 ºC. O abacaxizeiro, planta sensível
ao frio e resistente a seca, quando a temperatura esta abaixo de 20 ºC, a planta entra
em estado de inatividade e quando ultrapassa 32 ºC a planta é prejudicada pela
transpiração excessiva (MEDINA, 1978).
A maturação da polpa e da casca do fruto inicia-se pela base estendendo para
o ápice. Para a avaliação da maturação é necessário analisar o tamanho do fruto, a
variedade do produto e as condições ecológicas (CÉSAR, 2000), ou seja, não julgar
pela coloração da casca.
O Brasil produz em média de 30.000 a 40.000 frutos/ha/ano (CÉSAR, 2005). A
colheita é feita manualmente, com o auxílio de um facão, conforme o tempo de
amadurecimento de cada cultivar, seccionando a haste do fruto a 5-6 cm abaixo da
fruta.

3
 2.2 – Produção, Produtos e Subprodutos do Processamento

Na indústria de alimentos e para a obtenção de gomas e álcool etílico, utiliza-se

o caule. O fruto fresco é utilizado para a fabricação de refrescos, sucos caseiros, doces
e sorvetes. Segundo MEDINA et al. (1987) o suco do fruto é utilizado em alguns países
como vermífugo e o fruto doce e fermentado utilizado na fabricação de vinhos. Na
industrialização do fruto obtém-se geléia, polpa, xarope ou suco industrializado.
Estudos de purificação e extração de enzimas (RABELO, 2004) e aplicações
terapêuticas da Bromelina (MYNOTT, 1999) tem gerado resultados satisfatórios com os
resíduos agrícolas, especialmente a haste (stem). Grande parte da produção de
abacaxi no Brasil é consumida ao natural, tornando a quantidade industrializada
insignificante (BERTEVELLO 2001).
Segundo GIACOMELLI (1981), a coroa do fruto representa 25 % do peso médio
que é de aproximadamente um quilo. O fruto é constituído por frutilhos, variando de 100
a 200, fundido entre si sobre o eixo central ou coração. O fruto é encontrado na forma
cilíndrica ou ligeiramente cônico e sua polpa apresenta cor branca, amarela ou laranja-
avermelhada.
As indústrias retiram o máximo do rendimento da fruta em relação ao produto
principal (fruta em calda), secundário (suco simples e concentrado) e subprodutos
(ração e suco da casca e de resíduos) (GODOI, 2007) para a integração da
industrialização do fruto e evitam a produção de apenas um ou dois produtos.
O processamento do fruto inicia-se com a lavagem das frutas, corte da coroa e
talo, seleção do fruto por tamanho (pequeno, médio e grande). Segundo GODOI (2007),
entram na usina de processamento as frutas de tamanho médio que constituem 60 a 65
% do total de abacaxis. Em seguida é realizado o corte das extremidades,
descascamento da fruta e raspagem da polpa da casca e extremidade do fruto.
Produtos tais como suco, pedaços cristalizados, vinho, licor, vinagre e etc. foram
produzidos a partir do fruto natural e do processamento industrial. Ácido cítrico, ácido
málico, ácido ascórbico e bromelina foram produzidos como subprodutos.

4
 O talo, fonte de amido, é aproveitado para extração de bromelina, enzima que
auxilia a digestão (CÉSAR 2005). As folhas, para obtenção de fibras. A polpa, com alto
valor energético, contém vitaminas A, B1 e C.

2.3 – Caracterização e Composição Química do Abacaxi

Segundo CÉSAR (2000), devido a industrialização do abacaxi tornou-se

necessário padronizar a qualidade da fruta para a comercialização. Onde se observa:
- Cor: utilizada para avaliar a maturação, uma apreciação subjetiva, e qualidade do
produto para o consumo e para a indústria, evitando a amadurecimento completo.
- Tamanho: na indústria é indispensável na regulagem das máquinas ginacas, onde
comprimento e diâmetro são considerados.
- Sabor: como ocorre variação nas condições climáticas e mudanças de estação é
importante manter a relação Brix/acidez total titulável.
- Forma: para evitar desperdício da polpa no processo de descascamento mecânico é
viável a fruto no formato cilíndrico.
A composição química do abacaxi varia muito com a época em que é produzido.
De modo geral, a produção ocorre no período de verão e gera frutas com maior teor de
açúcares e menor acidez, como pode ser visto na tabela 2.1.

5
 Tabela 2.1 – Composição química média do abacaxi.
Componentes Quantidade ( por 100 gramas)
Glicídio 13,70
Proteínas 0,40 g
Lipídios 0,20 g
Cálcio 18,00 m
Ferro 0,50 mg
Fósforo 8,00 mg
Fibras 0,95 g
Niacina 0,82 mg
Ácido ascórbico 27,20 m
Tiamina 80,00 mcg
Riboflavina 128,00 mc
Retinol 5,00 mcg
Calorias 52,00 kcal
Fonte: FRANCO (1989).

O abacaxi destaca-se pelo valor energético, devido à sua alta composição de

açúcares e valor nutritivo pela presença de sais minerais (cálcio, fósforo, magnésio,
potássio, sódio, cobre e iodo) e de vitaminas (C, A, B1, B2 e Niacina). No entanto,
apresenta teor protéico e de gordura inferiores a 0,5 % (FRANCO, 1989).
O suco de abacaxi, ligeiramente ácido, é um alimento energético para nosso
organismo, 150 calorias. O teor de açúcares varia em geral em torno de 12 a 15 %, dos
quais aproximadamente 66 % são de sacarose e 34 % de açúcares redutores. As
cinzas, que apresentam 0,4-0,6 % do peso total, são ricas em bases, destacando-se o
potássio, magnésio e cálcio, tornando o resíduo do processamento da bromelina de alto
valor nutricional (CÉSAR, 2000).

6
 2.4 – Enzimas

A pesquisa sobre enzimas é parte significativa na história da bioquímica.

Contudo, no início do século XIX a catálise biológica foi reconhecida através da
conversão do amido em açúcares simples pela saliva e por vários extratos vegetais e
digestão da carne por secreções do estômago. No entanto, Louis Pasteur conclui que a
fermentação do açúcar em álcool pela levedura é catalisada por fermentos, ou seja,
enzimas eram inseparáveis da estrutura das células vivas dos levedos. Eduard Buchner
em 1987 descobriu que extratos de levedos podiam fermentar o açúcar até o álcool,
provando que as enzimas envolvidas na fermentação continuavam funcionando mesmo
quando removidas da estrutura das células vivas. Desde então numerosos estudo vêm
sendo realizados na tentativa do isolamento das numerosas enzimas e o estudo de
suas propriedades catalíticas (CAMPESE, 2004).

As enzimas são moléculas orgânicas presentes nas células de organismos

vivos, com a função específica de catalisar reações químicas. A enzima dá início ao
aumento da velocidade de uma reação química por atuar como catalisador (SAID &
PIETRO, 2002). Possuem atividade catalítica específica e elevada especificidade em
relação aos reagentes cujas transformações químicas catalisam (HALPERN, 1997). Por
ser economicamente viável, o emprego de enzimas em diversos setores industriais vem
crescendo há vários anos (FORGATY & KELLY, 1979; WISEMAN, 1987).

Reações lentas em condições biológicas relevantes, não são catalisadas.

Portanto, a maioria das moléculas biológicas são muito estáveis no ambiente aquoso de
pH neutro e temperatura moderada encontrado no interior das células. Reações
bioquímicas envolvem eventos químicos improváveis em condições do ambiente
celular, como a formação transiente de intermediários eletricamente carregados e
instáveis ou a colisão de duas ou mais moléculas com a orientação precisa e
necessária para que ocorra a reação (LEHNINGER et al., 1995).

7
 A característica distintiva de uma reação catalisada enzimaticamente é que ela
ocorre no interior dos limites de uma cavidade, ou fenda, na estrutura molecular da
enzima chamada sítio ativo. O substrato é a molécula que se liga ao sítio ativo e que
sofre a ação da enzima. O complexo enzima-substrato é extremamente importante na
reação enzimática, ou seja, ele é o ponto de partida para os tratamentos matemáticos
que definem o comportamento cinético das reações catalisadas enzimaticamente e para
as descrições teóricas dos mecanismos enzimáticos (SARTORELLO, 2004).

2.5 – Desnaturação

A desnaturação gera modificações fundamentais nas proteínas, destruindo, em

particular, a sua atividade fisiológica (MORRISON, 1976). Na atividade das enzimas um
agente crítico é a temperatura. A atividade aumenta com o aumento da temperatura,
acelerando o processo de desnaturação devido ao calor (HALPERN, 1997). Segundo
RICARDO & TEIXEIRA (1993) o pH exerce grande influência na manutenção da
atividade enzimática, devido a alterações no estado de ionização dos componentes do
sistema, em conseqüência da variação da concentração de H+.
Em grande parte da desnaturação de uma proteína ocorre a perda de sua
atividade biológica característica. Quando uma solução aquosa de enzima, por
exemplo, é aquecida até seu ponto de ebulição por uns minutos e depois resfriada, a
enzima torna-se insolúvel e não apresenta mais atividade catalítica, ou seja, desnatura
(HAQ et al., 2005; CORTEZ et al.,1999).

Em condições fisiológicas, moléculas de uma mesma proteína apresentam a

mesma conformação denominada nativa. E quando submetida ao isolamento e
purificação de uma proteína, onde ocorrem alterações físico-químicas no seu meio
ambiente, sua estrutura espacial é afetada ocasionando a perda da função biológica.
Assim, a proteína é dita desnaturada (CAMPESE, 2004).

8
 A coagulação da clara de ovo pelo calor representa a desnaturação de uma
proteína, a ovoalbumina. Depois que o calor coagulou a clara não sofre redissolução
pelo resfriamento, nem forma outra vez a solução límpida como a original.

Segundo BORRACINI (2006), a agitação vigorosa da solução protéica até a

formação abundante de espuma, presença de alguns íons ou sais caotrópicos em
soluções com proteínas, exposição da proteína a determinados detergentes, força
iônica, valores inadequados de pH, oxidação, solventes orgânicos, solutos e também a
ação do calor são fatores que desnaturam a proteína.

A ocorrência da desnaturação durante tratamentos suaves e em condições

amenas, não somente em drásticas, faz com que a proteína nativa seja frágil (YAO et.
al., 2002).

2.6 – Consumo de Enzimas

O consumo de enzimas subdivide-se em aplicações industriais, enzimas para

uso médico e enzimas para uso analítico e científico.
No contexto industrial, visa melhoria de processo e o uso de novas matérias
primas aprimorando suas características físico-químicas (LIMA, 2001) em biotecnologia
envolvendo genética, bioquímica, microbiologia e engenharia química.
As enzimas em diversas aplicações podem produzir um caminho intermediário
que não possa ser obtido quimicamente para a melhorar a qualidade dos produtos
(GODOI, 2007). Como exemplo, a aplicação de enzimas no processamento de couros
(LIMA, 2001).

Em usos terapêuticos, as enzimas são de suma importância. São utilizadas em

condições inflamatórias associadas a antibióticos ou analgésicos, como é o caso da
tripsina e da quimotripsina. Segundo GODOI (2007), no debridamento de feridas,
escaras e enxerto de pele, a papaína é essencial.

9
 2.7 – Bromelina

Bromelina, nome genérico dado ao conjunto de enzimas proteolíticas

encontradas nos vegetais da família Bromeliaceae, sendo o abacaxi o vegetal mais
conhecido. Para obtenção da bromelina, podem ser utilizadas diferentes partes do
abacaxi: folhas, talos, polpa da fruta, cascas e resíduos industriais do processamento
do fruto. As enzimas proteolíticas encontradas nos talos recebem o nome de bromelina
do talo (EC 3.4.22.32), e as encontradas no fruto são chamadas de bromelina do fruto
(EC 3.4.22.33). O teor de proteína total é igual para o fruto e o talo e a quantidade de
enzimas proteolíticas no talo é 60 % menor. A enzima presente no fruto é mais ativa
com relação à caseína do que a enzima presente no talo (SRIWATANAPONGSE,
BALABAN & TEIXEIRA, 2000).
A Bromelina é uma cisteína proteinase e a planta Ananas comosus possui quatro
cisteína proteinase distintas e duas no talo (ROWAN, BUTTLE & BARRETT, 1990). E
atuam como ativadores da ação enzimática, agentes sulfetos, cianetos, sulfitos e
cisteína.

A bromelina do talo é uma enzima sulfidrílica, essencial para a atividade

proteolítica. A bromelina do fruto é uma proteína ácida, e seu ponto isoelétrico foi
determinado por focalização isoelétrica como pH 4,6 e mudanças conformacionais
irreversíveis ocorrem em valores de pH maiores que 10,3 (MURACHI, 1976).

Segundo CÉSAR et al. (1999), a enzima não está presente nos primeiros
estágios de desenvolvimento do fruto, porém seu nível aumenta rapidamente,
mantendo-se elevado até o amadurecimento, quando tem um pequeno decréscimo. No
estado maduro o abacaxi mantém altas concentrações de proteases, mesmo com a
diminuição da atividade proteolítica. No mamão e no figo, tanto a papaína quanto a
ficina perdem as concentrações de proteases na maturação, sendo encontradas em
altos níveis quando o fruto está verde.

10
 A bromelina comercial é a obtida do talo (ROWAN et al., 1988) apesar da
grande quantidade disponível de resíduos do abacaxi fruto proveniente das indústrias
de conservas do abacaxi (CÉSAR, 2005).

Em outros trabalhos, estudou a extração da bromelina por micelas reversas

(FISCHER, 2006; HEMAVATHI, HEBBAR & RAGHAVARAO, 2007 e UMESH, SUMANA
& RAGHAVARAO, 2008) e também utilizando sistemas aquosos bifásicos por PEG/sal
(fosfato de potássio) (CÉSAR, 2000).

Em estudos de análises de proteína total, açúcares redutores e atividade

enzimática de amostras preparadas da polpa do fruto, da casca e do talo para a
caracterização do meio inicial observou-se a possibilidade de recuperar grande parte da
enzima originalmente presente superando 3 a 5 vezes a atividade específica inicial,
durante a precipitação em um estágio com 80% (v/v) de etanol a 5 oC (CÉSAR, 1999).

2.8 – Consumo de Bromelina

A bromelina aplica-se em diversas áreas: indústrias de alimentos, indústrias

farmacêuticas, indústrias de cosméticos (TECHNOBLE K. K. JAPAN; YAMADA, NAITO
& SAWAKI, 1997) e na desodorização de gases (UYAMA SHIZUO; UDA & UYAMA,
1991).
Na indústria de cervejas, a bromelina pode ser utilizada como clarificante
(BORRACINE, 2006). No amaciamento de carnes, pode-se utilizar a bromelina e a
papaína (KIM & TAUB, 1991; FREIMAN DE OLIVEIRA, 2001).
Introduzida como composto terapêutico em 1957, a ação da bromelina inclui:
inibição da agregação plaquetária, atividade fibrinolítica, ação antiinflamatória (HALE et
al., 2005; SECOR et. al., 2009), ação antitumoral (MAURER et al., 1988; HARRACH et
al., 1998), modulação de citocinas e imunidade, propriedade debridante de pele,
aumento da absorção de outras drogas, propriedades mucolíticas; facilitador da

11
digestão (QUATTRUCCI et al.,1991), acelerador da cicatrização, melhora da circulação
e sistema cardiovascular.
Bromelina é bem absorvida por via oral e a evidência disponível indica que sua
atividade terapêutica aumenta com as doses mais altas. A bromelina parece ter tanto
ação direta quanto indireta, envolvendo outros sistemas enzimáticos, ao exercer seus
efeitos antiinflamatórios (MATTOS, 2005).
Em análise laboratorial, a bromelina é empregada como reagente na análise do
sangue (SCOTT, JOHNSON & PHILLIPS, 1987; BOWELL, CULLY & YOUNG, 1988;
OGASWARA & MAZDA, 1989; BLOEMBERGEN et al., 1987; TAKEDA CHEMICAL
INDUSTRIES & WAKO PURE CHEM IND, SHUKUDA & NAKAJIMA, 1991) e no pré-
tratamento de amostras de sangue a serem tipadas para o grupo ABO/Rh tornando fácil
a retirada das proteínas de superfície, exposto os antígenos eritrocitários que
respondem aos testes analíticos, após contato com a superfície das hemácias.
O Ananas comosus é um produto fitoterápico com ação mucolítica e fluidificante
das secreções brônquicas e das vias aéreas superiores (CÉSAR, 2005). A bromelina
também tem aplicação na esterilização de produtos farmacêuticos e alimentícios
(RETROSCREEN LTD; SUTTON & OXFORD, 1990).

12
CAPÍTULO 3 – MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho experimental foi realizado no Laboratório de Processos de Separação II,

FEQ – UNICAMP.

3.1 – Materiais

3.1.1 – Reagentes

- Fosfato de Potássio Dibásico anidro P.A e Fosfato de Potássio Monobásico

anidro P.A ambos fornecidos pela Synth (São Paulo).
- Hidróxido de Sódio fornecido pela Quimex.
- Ácido Clorídrico fornecido pela Merck.
- Caseína Pura fornecida pela Synth.
- Ácido Tricloroacético fornecido pela Sigma Chemical.
- Reagente de L-Tirosina P.A fornecido pela Synth.

3.1.2 – Equipamentos

- Balança Eletrônica Marte, modelo AL 200.

- pHmêtro Analyser pH 300.
- Banho Termostatizado FANEM, modelo 100.
- Espectrofotômetro UV-Vis Cary 1G.
- Liquidificador Walita Twist.

13
 - Agitador Biomatic, modelo 1005.
- Micropipetas automáticas.

3.2 – Métodos

3.2.1 – Preparo das Amostras

Foram utilizadas como amostras solução 0,2 % de Bromelina P.A fornecida pela
Sigma-Aldrich e Bromelina da casca e talo do abacaxi da espécie Pérola.

As amostras da casca e talo do abacaxi foram obtidas através de moagem da

casca e talo em liquidificador por 5 minutos, a temperatura ambiente (24 ± 2) ºC e
filtrado em tela de Nylon para retirada de fibras e particulados presente no extrato.

3.2.2 – Procedimentos Experimentais

Para o estudo da avaliação do efeito do pH na estabilidade da atividade

enzimática da bromelina, o pH das amostras provenientes da solução de Bromelina P.A
e da casca e talo do abacaxi foram ajustados para 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0 com solução
tampão de fosfato de potássio 0,1 M. Esta solução tampão foi preparada à partir dos
sais fosfato de potássio dibásico e fosfato de potássio monobásico.

Após ajuste de pH, as amostras foram armazenadas primeiramente em

geladeira a uma temperatura de ± 2º C e a atividade enzimática medida
periodicamente.

14
 A Tabela 3.1 mostra as variáveis estudadas para a Bromelina P.A e a
Bromelina da casca e talo neste trabalho.

Tabela 3.1 – Variáveis estudadas para a Bromelina P.A e Bromelina da casca e talo

Temperatura (°C) Tempo (dias) pH

2 0 6,0

2 3 6,0

2 7 6,0

2 15 6,0

2 0 6,5

2 3 6,5

2 7 6,5

2 15 6,5

2 0 7,0

2 3 7,0

2 7 7,0

2 15 7,0

2 0 7,5

2 3 7,5

2 7 7,5

2 15 7,5

2 0 8,0

2 3 8,0

2 7 8,0

2 15 8,0

15
 3.2.3 – Determinação da Atividade Enzimática

3.2.3.1 – Curva de Calibração

Para determinação da atividade enzimática da bromelina através da hidrólise da

caseína foi construída uma curva de calibração com solução L-Tirosina P.A em
diferentes concentrações, abrangendo a faixa de resultados obtidos nas amostras. As
concentrações das soluções foram de 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 e 3,0 mM de tirosina e as
determinações foram feitas em triplicatas.

3.2.3.2 – Atividade Enzimática da Bromelina

Determinou-se a atividade proteolítica da bromelina através da hidrólise

enzimática da caseína conforme modificações das metodologias propostas por KUNITZ
(1947) e WALTER (1984).
Solução de caseína 2 % (m/v) e pH 7,5 a 37 oC durante 10 minutos, seguindo-se
da precipitação do substrato não hidrolisado com solução de ácido tricloroacético
(TCA). A quantidade de peptídeos solúveis em TCA (produtos hidrolíticos não
precipitados) foi determinada em Espectrofotômetro UV-Vis Cary 1G a 280 nm.
Utilizou-se Caseína Pura.

Uma unidade (U) de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima

capaz de variar em uma unidade a leitura de absorbância a 280 nm, durante 10 minutos
a 37 °C.

16
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES

A determinação da atividade enzimática para a Bromelina P.A e a Bromelina da

casca e talo através da hidrólise da caseína foi realizada numa temperatura de 37 ºC.
RASHEEDI et al. (2003) e KHAN et al. (2003) caracterizaram a bromelina do talo e
encontraram temperatura ótima de 37 ºC. De modo geral, a literatura afirma que,
temperaturas elevadas de uma ou duas dezenas de graus acima da temperatura do
meio natural das enzimas, conduzem frequentemente, à perda de atividade (HALPERN,
1997).
A curva de calibração com L-Tirosina, para a determinação da atividade
enzimática da bromelina como mostra a Figura 4.1 apresenta uma ótima linearidade, R2
= 0,9986 e equação da reta y = 0,0407 x – 0,0064. A concentração de tirosina utilizada
foi de 0,25 a 3 mM.

Figura 4.1 – Curva de calibração para determinar a atividade enzimática da bromelina.

17
 4.1 – Atividade Enzimática da Bromelina P.A em Função do Tempo para
Diferentes pH

O estudo do efeito do pH sobre a estabilidade da atividade enzimática da

Bromelina P.A através da hidrólise da caseína a uma temperatura de 37 °C foi realizado
variando o pH de 6,0 a 8,0 em tampão fosfato 0,1 M como pode ser verificado na
Tabela 4.1. As soluções de bromelinas nos respectivos pH foram armazenadas em
geladeira (Temperatura ± 2 ºC).
Os resultados da Tabela 4.1 demonstram que a atividade enzimática da
bromelina é afetada com o tempo.
É possível visualizar que a menor variação de atividade foi de 5,7 % para a
solução de Bromelina P.A em pH 7,0 após três dias de armazenamento, sendo que, a
maior variação foi de 18,85 % para a solução em pH 6,5. Durante o tempo total de
armazenamento verifica-se que apenas as soluções de pH 6,0 e 8,0 apresentam uma
tendência decrescente.
Observou-se que as atividades enzimáticas das amostras de Bromelina P.A
próximas a pH neutro apresentam mais de 70 % da atividade inicial após os 15 dias de
armazenamento.
Com os resultados obtidos, verifica-se que a perda de atividade enzimática
entre o sétimo e o décimo quinto dia não foi tão significativa como nos primeiros 3 dias,
tornando desnecessária a continuidade da determinação da atividade após o período de
quinze dias.

18
Tabela 4.1 – Resultados da atividade enzimática obtidos para a Bromelina P.A. através
da hidrólise da caseína a 37 °C.
Variação de
Temperatura Atividade Atividade no
Tempo (dias) pH
(°C) (U/mL) Período (Δ)
(%)
2 0 6,0 0,028 0,00

2 3 6,0 0,024 13,66

2 7 6,0 0,022 6,48

2 15 6,0 0,021 3,64

2 0 6,5 0,074 0,00

2 3 6,5 0,060 18,85

2 7 6,5 0,058 3,34

2 15 6,5 0,055 3,45

2 0 7,0 0,066 0,00

2 3 7,0 0,062 5,70

2 7 7,0 0,057 7,61

2 15 7,0 0,053 6,08

2 0 7,5 0,063 0,00

2 3 7,5 0,059 6,80

2 7 7,5 0,053 9,80

2 15 7,5 0,050 4,42

2 0 8,0 0,064 0,00

2 3 8,0 0,055 13,60

2 7 8,0 0,047 13,14

2 15 8,0 0,045 2,57

19
 4.2 – Atividade Enzimática da Bromelina da Casca e Talo em Função do
Tempo para Diferentes pH

O estudo do efeito do pH sobre a estabilidade da atividade enzimática da

bromelina da casca e talo através da hidrólise da caseína a uma temperatura de 37 °C
foi realizado variando o pH de 6,0 a 8,0 em tampão fosfato 0,1 M como pode ser
verificado na tabela 4.2. As soluções de bromelinas nos respectivos pHs foram
armazenadas em geladeira (T ± 2º C).
Analisando a Tabela 4.2, é possível visualizar que a menor variação de
atividade foi de 5,0 % para a solução de Bromelina da casaca e talo em pH 7,5 após
três dias de armazenamento, sendo que, a maior variação foi de 23,95 % para a
solução em pH 6,0.
Comparando o comportamento das soluções de Bromelina P.A após sete dias
de armazenamento com os das soluções de Bromelina da casca e talo em pH 6,5 e 7,5,
verifica-se que também não apresentam uma variação significativa da atividade.
Observou-se que a atividades enzimática da amostra de Bromelina da casca e
talo em pH 7,5, apresenta cerca de 75 % da atividade inicial após os 15 dias de
armazenamento, considerando a proximidade do pH com o ponto isoelétrico da
bromelina.

20
Tabela 4.2 – Resultados da atividade enzimática obtidos para a Bromelina da casca e
talo através da hidrólise da caseína a 37 °C.
Variação de
Temperatura Atividade Atividade no
Tempo (dias) pH
(°C) (U/mL) Período (Δ)
(%)
2 0 6,0 0,043 0,00

2 3 6,0 0,033 23,95

2 7 6,0 0,023 23,13

2 15 6,0 0,019 9,23

2 0 6,5 0,028 0,00

2 3 6,5 0,024 13,33

2 7 6,5 0,020 14,44

2 15 6,5 0,016 14,45

2 0 7,0 0,030 0,00

2 3 7,0 0,026 14,03

2 7 7,0 0,016 32,17

2 15 7,0 0,015 3,37

2 0 7,5 0,020 0,00

2 3 7,5 0,019 5,00

2 7 7,5 0,017 10,00

2 15 7,5 0,015 10,00

2 0 8,0 0,018 0,00

2 3 8,0 0,015 16,67

2 7 8,0 0,013 11,11

2 15 8,0 0,010 16,66

21
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES E SUGESTÕES

5.1 – Conclusões

Neste trabalho, foi estudado o efeito do pH sobre a estabilidade da atividade

enzimática da Bromelina P.A e da bromelina da casca e talo nos respectivos pHs, 6,0;
6,5; 7,0; 7,5 e 8,0 através da hidrólise da caseína 2 % (m/v) e pH 7,5 a 37 ºC durante 10
minutos, seguindo-se da precipitação do substrato não hidrolisado com solução de
ácido tricloroacético (TCA). A quantidade de peptídeos solúveis em TCA foi
determinada em espectrofotômetro a 280 nm.

Para que não ocorra o uso indevido de faixas de pH e não ocorra uma redução
na eficiência de métodos a serem utilizados, o estudo da estabilidade da enzima em
diferentes pH é viável.
O resultado do estudo do efeito do pH sobre a estabilidade da atividade
enzimática da bromelina da casca e talo mostra que a solução em pH 7,5 ainda
apresenta 75 % da atividade inicial após quinze dias de armazenamento.
Os resultados mostram que as atividades enzimáticas das amostras de
Bromelina P.A próximas ao pH neutro apresentam mais de 70 % da atividade inicial
após os quinze dias de armazenamento.
Após a realização deste estudo, conclui-se que as soluções de bromelina em
pHs próximos da neutralidade, podem ser preparadas e armazenadas a uma
temperatura de ± 2 ºC permitindo que a estabilidade se mantenha, ou seja, ativa, por
aproximadamente quinze dias.

22
 5.2 – Sugestão

Sugere-se para trabalhos futuros o estudo da atividade enzimática da bromelina

pura e de resíduo de abacaxi em diferentes temperaturas.

23
CAPÍTULO 6 – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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30
 ANEXOS

ANEXO A. Descrição do método para a determinação da atividade proteolítica

através da hidrólise da caseína:

A determinação da atividade proteolítica pode ser realizada conforme

modificações das metodologias propostas por KUNITZ (1947) e WALTER (1984), como
está descrito a seguir:

A. Reagentes:

1. NaOH 1 M: Dissolver 4 g de NaOH em 100 mL de água (destilada ou

deionizada).

2. Tampão fosfato 1 M, pH 7,5, dissolver:

a. 34 g de KH2PO4 em 250 mL de água.

b. 43,5 g de K2HPO4 ou 57 g K3PO4. 3 H2O em 250 mL de água.

Juntar (b) com (a) e ajustar o pH para 7,5.

3. Ácido clorídrico, HCl 1 M: Adicionar 9,8 mL de HCl (a pelo menos 32 %) em

72 mL de água.

4. Preparo do substrato tamponado.

a. Solução tamponada de caseína (2 % m/v; fosfato 0,1 M, pH 7,5):
b. Suspender 2 g de caseína com cerca de 5 mL de água em um frasco
volumétrico, adicionar NaOH (1), cerca de 30 mL de água e mexer bem
com agitador magnético até que a caseína esteja completamente
dissolvida. Adicionar 5 mL de tampão fosfato (2) para clarear a solução.
31
 Ajustar o pH 7,5 com HCl (3) e diluir para 100 mL com água. Solução
estável por 1 semana.

5. HCl 0,05 mol/L: Diluir 1 mL da solução (3) com 19 mL de água.

6. Solução estoque de tirosina ( 5 mmol/L): dissolver 45,3 mg de tirosina em 50

mL da solução de HCl (5) - S0. Diluir para 3 (P0), 2 (P1), 1 (P2), 0,5 (P3) e 0,25
(P4) mM com a solução (5). Homogeneizar a solução antes de diluir.

7. Ácido tricloroacético (TCA) 0,3 mol/L: Dissolver 4,9 g de TCA em 100 mL de

água (ou diluir 30 mL de TCA 15% para 90 mL).

8. NaOH 0,5 mol/L: Diluir 50 mL da solução (1) em 50 mL de água.

B. Procedimento:

1. Pipetar em tubos de centrífuga separados: 2,5 mL de solução de substrato

(4.1) nos tubos T e B3, 2,5 mL de solução de HCl (5) em B1 e B2 e 2,5 mL de
cada solução padrão de tirosina (6) (Padrões - P0, P1, P2, P3, P4).

2. Deixar em banho por 3 a 5 minutos em temperatura de 37 ºC.

3. Adicionar 0,2 mL da amostra (enzima) aos tubos T e B 1, e 0,2 mL de HCl

0,05 M (5) aos demais.

4. Misturar e deixar incubando por 10 minutos a 37 ºC.

32
 5. Ao fim do tempo adicionar 5 mL de TCA (7a).

6. Misturar e adicionar 0,2 mL de amostra ao branco.

7. Deixar em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente.

8. Remover o precipitado por filtração ou centrifugação por 20 minutos a 2300

g.

C. Medida da Atividade:

Ler a variação de absorbância a 280 nm (no filtrado ou sobrenadante).

a. Absorbância da amostra: AT
b. Absorbância do branco B1: AB1
c. Absorbância do branco B3: AB3
d. Através de AT - AB1 - AB3, encontra-se, na curva de calibração, a
concentração de tirosina, Ctir, produzida pela ação da protease presente
em 0,2 mL de amostra em 10 minutos a 37 ºC.

O resultado final, em atividade enzimática, é dado por:

Atividade = 0,02 . Ctir ( mol/min)

33
D. Procedimento Esquemático:

TUBO T ( Teste):

1. 2,5 mL de caseína 2 % (m/v); pH 7,5; tampão fosfato 0,1 M.

2. Repouso a 37 ºC por 3 a 5 minutos.
3. 0,2 mL de amostra.
4. Misturar, deixar a 37 ºC por 10 minutos.
5. 5 mL de TCA.
6. Repouso de 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000g durante 20 minutos.
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.

TUBO B1 ( Branco da amostra):

1. 2,5 mL de HCl 0,05 M.

2. Repouso a 37 ºC por 3 a 5 minutos.
3. 0,2 mL de amostra.
4. Misturar, deixar a 37 ºC por 10 minutos.
5. 5 mL de TCA.
6. Repouso de 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000g durante 20 minutos.
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.

34
TUBO B2 ( Branco do aparelho):

1. 2,5 mL de HCl 0,05 M.

2. Repouso a 37 ºC por 3 a 5 minutos.
3. 0,2 mL de HCl 0,05 M (em substituição à amostra).
4. Misturar, deixar a 37 ºC por 10 minutos.
5. 5 mL de TCA.
6. Repouso de 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000g durante 20 minutos.
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.

TUBO B3 ( Branco do substrato):

1. 2,5 mL de caseína 2 % (m/v); pH 7,5; tampão fosfato 0,1 M.

2. Repouso a 37 ºC por 3 a 5 minutos.
3. 0,2 mL de HCl 0,05 M (em substituição à amostra).
4. Misturar, deixar a 37 ºC por 10 minutos.
5. 5 mL de TCA.
6. Repouso de 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000g durante 20 minutos.
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.

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ANEXO B. Método Espectrofotométrico

A espectrofotometria é um dos métodos utilizados para a determinação da

atividade catalítica de uma enzima. A espectrofotometria e a colorimetria são métodos
analíticos de medida da quantidade de luz absorvida por uma substância em solução.
Todas as substâncias em solução absorvem luz num determinado comprimento de
onda e transmitem-na a outros comprimentos de onda.

Conceito importante para a compreensão da espectrofotometria é a aplicação da

Lei de Lambert-Beer, que afirma que a intensidade da luz emitida que atravessa um
meio material é proporcional à potência do feixe e à quantidade de substância
absorvente encontrada pela radiação no seu percurso através do meio considerado:

- log I/Io = - log T = A = abc

I = intensidade da luz incidente

Io = intensidade da luz que conseguiu atravessar a amostra

T = Transmitância

A = Absorbância

a = absortividade

b = distância que a luz atravessa

c = concentração

Analisando-se detalhadamente os princípios regentes da Lei de Lambert-Beer,

verifica-se que a representação da absorbância de um sistema absorvente em função
da concentração molar da espécie absorvente, deve ser uma linha reta. No entanto, as
medidas de absorbância dos sistemas químicos reais conduzem a uma não completa

36
linearidade sobre toda a faixa das concentrações interessadas. Uma curvatura não
significa necessariamente que não seja uma constante, independentemente da
concentração. Mas quando isso ocorre tem-se um desvio real decorrente da limitação
da própria lei, anteriormente enunciada.

Desvios reais ocorrem em conseqüência de interações que envolvem os centros

absorventes e variação do índice de refração com a concentração. A Lei prevê que os
centros absorventes atuam independentemente uns dos outros, isto é, manifestam
interações recíprocas ou com íons e moléculas presentes.

Desvios químicos ocorrem quando a espécie absorvente sofre associação ou

dissociação, ou então reage com o solvente. Assim, desvios químicos são desvios
aparentes, pois a Lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbância é diretamente
proporcional à concentração real da espécie absorvente, mas não necessariamente, à
concentração analítica de um componente.

Desvios instrumentais também são desvios aparentes relacionados com as

limitações do instrumento utilizado como, caráter finito da faixa espectral isolada,
radiações estranhas que alcançam o detector, não linearidade de resposta do detector
e instabilidade da fonte.

A medida de absorbância deve ser feita a um comprimento de onda

correspondente a um máximo de absorção sendo que é maior a variação de
absorbância por unidade de concentração, alcançando-se a sensibilidade máxima. A
relação entre a absorbância medida experimentalmente e a concentração da espécie é
estabelecida com a construção de uma curva-padrão. Prepara-se para o elemento a
determinar uma solução matriz (GODOI, 2005).

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