Cefar Diagnstica Ltda.

Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos para Diagnsticos

Av: Eng Alberto de Zagottis 635 - Jurubatuba So Paulo - SP - CEP. 04766-050 C.N.P.J. 44.562.700/0001-45 I. Est. 110.411.919.112 Fone: 0XX11 5521.9244 Fax 0XX11 5548.5132

Discos para Antibiograma, Discos para Identificao Presuntiva e Taxonmica Meios de Cultivo Hidratados, Bactrias Padro, Bioindicadores e Laminocultivos. de Bactrias, Suplementos e Misturas Seletivas ,

ANTIBIOGRAMA PASSO A PASSO

Teste de Sensibilidade por disco difuso (Metodologia de Kirby-Bauer) Etapa 1: Preparao dos Substratos
Os discos a serem utilizados devem ter passado por controle de qualidade prvio quanto a sua eficcia para evitar quaisquer desvios na leitura e conseqente erro ao reportar o status de sensibilidade de um microrganismo. Quanto ao meio de cultura, observar seu estado aparente (descolamento da placa, espessura 4mm, possveis contaminaes etc.) caso esteja pr-pronto. Ao se optar pela fabricao do meio de cultivo in house, deve-se determinar qual o meio mais adequado para o crescimento do microrganismo a ser avaliado. Para testes com microrganismos de crescimento rpido (p. ex. E. coli e Staphylococcus) usar meio de Mueller Hinton no suplementado. Para testes com microrganismos nutricionalmente exigentes (Haemophilus sp., Neisseria sp., pneumococos), usar meio de Mueller Hinton suplementado com sangue e/ou nutrientes especficos para o desenvolvimento do microrganismo. Em todos os casos atentar para a validade dos produtos utilizados.

Etapa 2: Preparao do Inculo

O inculo dever ser preparado a partir de colnias isoladas e representativas do microrganismo, presentes em placa de isolamento primrio. Para tanto, suspender em salina estril ou caldo de cultivo a colnia a ser testada de forma a obter uma suspenso com turvao equivalente a 0,5 da escala de McFarlland (1,5 x 108 UFC/ml). Essa turvao pode ser obtida por: pr-incubao do inculo (mtodo do crescimento), onde a colnia isolada e suspendida em meio de cultura e seu crescimento e monitorado at que atinja a concentrao desejada, ou por inoculao direta (mtodo da suspenso direta), onde se suspende um nmero suficiente de colnias para se atingir a concentrao desejada. A confirmao da concentrao do inculo pode ser feita atravs do mtodo de comparao visual com padro de turvao correspondente a 0,5 da escala de McFarlland ou pelo mtodo turbidimtrico, com leitura do inculo a 625nm. A D.O. (Densidade ptica Espectrofotmetro ) desejada de 0,08 0,10.

Etapa 3: Inoculao na Placa

Imergir um swab estril na suspenso bacteriana e, retirando o excesso de inculo atravs da compresso do swab nas paredes do tubo, semear a placa uniformemente em estrias. A placa uniformemente semeada por rotaes a cada 60 graus.

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Etapa 4: Aplicao dos discos de sensibilidade

Os antibiticos a serem utilizados no teste de sensibilidade so definidos um laboratrio de referncia (p. ex. Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI) atravs de documentos periodicamente atualizados (p.ex. M100-S16/2006 CLSI). No Brasil o padro utilizado o estabelecido pelo CLSI ou pelo FDA (Food and Drug Administration). Os discos podero ser utilizados de forma individual (Sensifar srie bsica e complementar, Sensifar-vet) ou em sistema multidisco (Multifar-15 e Multifar-24). Distribuir com o auxlio de uma pina estril os discos na superfcie do gar guardando distncia aproximada de 24mm de centro a centro. No remover ou reposicionar os discos aps fixao no gar Posicionar no mximo 12 discos (placas de 150mm) ou 5 discos (placas de 100mm) por placa de teste.

Etapa 5: Incubao das Placas

Aps 15 minutos temperatura ambiente, incubar as placas, invertidas, a 35C por 16-18 h. Condies diferenciadas de incubao: Staphylococcus aureus: 24 h ( Vancomicina e Oxacilina ) Haemophilus sp: 20-24 h a 5% CO2 Streptococcus pneumoniae: 18-24 h a 5% CO2

Etapa 6: Leitura da Zona de Inbio

Aps o perodo de incubao, checar a caracterstica do crescimento e o padro das zonas de inibio ao redor dos discos. Usando um paqumetro, ou halmetro Cefar, medir as zonas de inibio, em milmetros, incluindo o dimetro do disco. Observaes: Discos com crescimento adjacente s bordas devem ser medidos a partir do crescimento externo. Qualquer crescimento dentro dos halos de inibio deve ser subcultivado, reidentificado e retestado. No caso de bactrias hemolticas, fazer a leitura da zona de crescimento e no da zona de hemlise. No caso de antibiograma para Proteus sp., ignorar o vu formado na zona de inibio e ler normalmente seu dimetro.

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Etapa 7: Interpretao dos Resultados

Para limites dos halos de inibio consultar Tabela CLSI M2-A9 ou Tabela de Interpretao do Antibiograma Cefar. As definies das classificaes so: SENSVEL: A classificao significa que uma dada infeco causada por tal microrganismo pode ser tratada eficientemente com a dose recomendada do agente antimicrobiano. INTERMEDIRIA: Esta classificao inclui organismos com valores de CIM (Concentrao Inibitria Mnima) semelhantes queles atingidos por antibacterianos no sangue e tecidos e cuja avaliao da resposta venha a ser inferior a isolados sensveis. A classificao intermediria encontra aplicao clnica em stios corpreos onde as drogas so fisiologicamente concentradas (ex: quinolonas e beta-lactmicos na urina) ou quando uma alta dose de droga pode ser usada (ex: beta-lactmicos). A classificao intermediria tambm inclui uma zona tampo que preveniria pequenos fatores tcnicos que possam causar diferenas na interpretao, especialmente no caso de drogas com limites estreitos de farmacotoxicidade. RESISTENTE: Tal microrganismo no inibido pelas concentraes usuais do antibitico testado.

Principais Fatores de Erro na Tcnica

Erro na transcrio de dados Erro na leitura dos halos de inibio Erro na padronizao do inculo Contaminao ou alterao na cepa-controle (ensaio qualitativo de controle de qualidade) Padro velho da escala de McFarlland (suspenso de sulfato de brio) Espectrofotmetro no calibrado Temperatura ou atmosfera imprprias para incubao Semeadura no homognea no gar Variaes no desempenho do meio de cultivo Perda de potncia do disco durante o armazenamento (excesso de umidade, temperatura inadequada, expirao do prazo de validade) Qualquer dvida ou para solicitao de material tcnico, consulte-nos! e-mail: sacc@cefar.com.br Telefone: 5521-9244