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Apostila de Aulas Prticas Profa. Elisabete Jos Vicente bevicent@usp.br 3091.7350 2004
MICROBIOLOGIA NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA indispensvel o uso de avental no laboratrio. O avental deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; No comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratrio; O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessrio ao trabalho prtico, como: roteiro de aula, papel e lpis ou caneta para anotaes; Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspirao de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o tcnico responsvel pela aula prtica; Descarte de material: a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios, existentes nos laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias; b) Placas de petri devero ser deixadas tampadas sobre a bancada; c) Lminas fornecidas para visualizao devero ser deixadas sobre as bancadas; d) Tubos com culturas devero ser deixados nas estantes. Prestar ateno s atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes Terminados os trabalhos prticos: a) b) c) d) e) f) Esterilizar alas e fios de platina; Verificar se as torneiras de gua e gs esto fechadas; Desligar lmpadas e microscpios; Limpar microscpios e cobri-los com a capa; Tirar o avental e guardar; Lavar cuidadosamente as mos com gua e sabo ou anti-sptico.
Mdulo I ......................................................................................................................... 4 Introduo microbiologia ............................................................................................. 4 Prtica 1 - NOES BSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7 Tcnica de semeadura ............................................................................................... 7 Objetivo .................................................................................................................... 10 Material ..................................................................................................................... 10 Procedimento e Resultados...................................................................................... 10 Questionrio ............................................................................................................. 11 PRTICA 2 - COLORAO DE GRAM........................................................................... 12 Fixao e colorao de microrganismos................................................................... 12 Preparao de esfregaos e colorao pelo mtodo de gram.................................. 13 A tcnica ................................................................................................................... 15 Objetivo .................................................................................................................... 16 Material ..................................................................................................................... 16 Procedimento:........................................................................................................... 16 Resultados:............................................................................................................... 18 Questionrio ............................................................................................................. 18 PRTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCPICA E MICROSCPICA MICROBIANA..... 19 Objetivo .................................................................................................................... 19 Materiais ................................................................................................................... 19 Procedimento e resultados ....................................................................................... 19 A. Visualizao de bactrias:.................................................................................... 19 B. Visualizao de fungos......................................................................................... 20 PRTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21 Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21 Curvas de crescimento ............................................................................................. 22 Objetivo .................................................................................................................... 25 Material ..................................................................................................................... 25 Procedimento............................................................................................................ 25 Resultados................................................................................................................ 25 Questionrio ............................................................................................................. 25 PRTICA 5 - DETERMINAO DA CONCENTRAO MICROBIANA NUMA SUSPENSO................................................................................................................... 26 Estimativa do nmero de clulas viveis .................................................................. 26 Problema: ................................................................................................................. 27 5
Verificao de entendimento: ................................................................................... 28 PRTICA 6 - AO DE ANTI-SPTICOS NA DESINFECO DA PELE ..................... 29 Anti-spticos e desinfetantes .................................................................................... 29 Objetivos................................................................................................................... 31 Material ..................................................................................................................... 31 Procedimento............................................................................................................ 32 Resultados................................................................................................................ 32 Questionrio ............................................................................................................. 32 PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA ...................................................................................... 32 Teoria ....................................................................................................................... 32 Objetivo .................................................................................................................... 33 Materiais ................................................................................................................... 33 Procedimento............................................................................................................ 33 Questionrio ............................................................................................................. 34 PRTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. ............... 35 Introduo................................................................................................................. 35 Objetivo .................................................................................................................... 35 Material ..................................................................................................................... 35 Procedimento............................................................................................................ 35 Resultados................................................................................................................ 35 Questionrio ............................................................................................................. 35 PRTICA 9 - CONJUGAO DE BACTRIAS............................................................... 36 Introduo................................................................................................................. 36 Objetivo .................................................................................................................... 37 Material ..................................................................................................................... 37 Procedimento............................................................................................................ 38 Resultados................................................................................................................ 39 PRTICA 10 - POSTULADO DE KOCH.......................................................................... 40 Abordagem clssica ................................................................................................. 40
TCNICA DE SEMEADURA
Toda a vez que se fizer uma semeadura importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminao dos meios de cultura por microrganismos presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais. 1. Flambagem da ala ou fio de platina: Tanto a ala quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operao de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45o em relao mesa de trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregao ou para uma semeadura, esfriar previamente a ala. Esta dever ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri;
2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a
boca dos mesmos imediatamente aps a retirada da tampa (ou tampo de algodo). Esta dever ser mantida segura pelo dedo mnimo, da mo que est segurando a ala ( Figura 2). Aps a retirada do material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. No pousar os tampes sobre a bancada!!! Flambar a ala aps o uso;
3. As pipetas utilizadas em microbiologia so previamente esterilizadas, so oferecidas embrulhadas em papel (s vezes, dentro de um cilindro metlico). Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente ponta da pipeta). Esta seqncia evite que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador. Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo soluo desinfetante. 4. As placas de Petri devero ser abertas prximo ao bico de Bunsen para evitar contaminao com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. 5. Na semeadura usando placas de Petri, aps flambar a ala at o rubro, e introduzi-la na cultura de bactria, semear na placa de Petri (fig.3).
6. Aps a primeira estria, flambar novamente a ala, girar a placa cerca de 30 e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa tcnica conhecida tambm por esgotamento. 7. As placas sero incubadas a 37C por 24h, e depois guardadas a 4C at a prxima aula.
Figura 4 Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficincia no isolamento de colnias
1No esquea!!!!!!
Sempre resfrie a ala (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou num pedao do gar sem cultura), antes de colocar a ala em contato com a cultura, lembre-se: ela est muito QUENTE!!! Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.
OBJETIVO
Fazer semeaduras em meios lquido e slido de cultura de Eschirichia coli, e obter colnias isoladas
MATERIAL
ala de platina; tubo de ensaio com meio completo lquido placa de Petri com meio completo slido; tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo, no esquecendo de ilustrar os resultados obtidos A) SEMEADURA EM MEIO LQUIDO
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QUESTIONRIO
1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferncia? 2. Por que deve-se manter sempre que possvel a placa de Petri com meio slido invertida? 3. Qual a finalidade de se fazer vrias estrias, na semeadura em placa, contendo meio slido?
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diferentes tipos de bactrias. A colorao de Gram e a lcool - cido resistente so exemplos de coloraes diferenciais. 3) Colorao especial - so aquelas utilizadas para corar e identificar partes especficas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presena de cpsulas. No processo de colorao podem ser usadas substncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espcime biolgico. Essas substncias so chamadas mordentes, e o caso do iodo na colorao de Gram. Uma outra funo do mordente tornar uma estrutura mais espessa e mais fcil de visualizar aps a colorao.
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Gram positiva
Membrana plasmtica
Complexo de membrana externa, com incluses de lipopoliprotenas e lipossacardeos Parede celular constituda de uma camada fina de peptdeoglicano Membrana plasmtica
Gram negativa
Figura 5 Estruturas tpicas das paredes de bactrias Gram positivas e Gram negativas
Quando aplicado em clulas Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo penetram facilmente, e dentro das clulas eles se combinam para formar o complexo CVIodo, que maior que a molcula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo no pode ser lavado das clulas Gram (+) pelo lcool e ento estas clulas permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta. Nas clulas Gram (-) o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo lavado atravs da camada fina de peptideoglicano, que no consegue reter o complexo. Estas clulas so ento contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas. Esta colorao o ponto de partida na identificao bacteriana, mas no deve nunca ser utilizada como um diagnstico definitivo. importante ressaltar que a colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til, quando corretamente realizada e interpretada.
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A TCNICA
O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, decorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Grampositivas e provoca a contrao dos poros do peptidioglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas, clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanolacetona pode ser substitudo por lcool 95%. O objetivo desta prtica demonstrar a importncia desta colorao e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente, devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.
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OBJETIVO
Colorao de microrganismos provenientes de meios, slido e lquido, pelo mtodo de Gram.
MATERIAL
ala de platina; lmina de vidro; placa de Petri com cultura de microrganismo em meio slido; tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio lqudo; cristal violeta a 1%; lugol;
PROCEDIMENTO:
A. PREPARO DO ESFREGAO Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio lquido 1) Flambar a ala corretamente 2) Esfri-la nas paredes do tubo 3) Introduzi-la no meio lquido de maneira que este forme um filme sobre a ala. 4) Colocar o material coletado sobre uma lmina limpa e seca. 5) Espalhar o material sobre a lmina, procurando obter um esfregao fino. 6) Secar tempetatura ambiente. 7) Fixar o esfregao na chama do bico de Bunsen, passando a lmina algumas vzes pela chama. OBS. Esperar que o esfregao esteja completamente seco para fix-lo. 8) Realizar a colorao.
Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio slido 1) Colocar com a prpria ala, j flambada, uma gota de gua de torneira no centro da lmina de vidro. 2) Flambar novamente a ala 16
3) Esfri-la na tampa da placa de Petri, ou no meio slido numa regio sem colnia. 4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 5) Homogeneizar este material com a gota de gua, cuidando para obter uma suspenso pouco densa e sem grumos. 6) Secar a lmina por exposio ao ar. 7) Fixar o esfregao. B. COLORAO 1) Cobrir o esfregao com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENO PARA NO COLOCAR A LMINA INVERTIDA!!!!!!!! 2) Lavar rapidamente em gua corrente; 3) Cobrir todo o esfregao com lugol por 1 minuto; 4) Lavar rapidamente em gua corrente; 5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a soluo diferenciadora: lcool ou acetona; 6) Lavar rapidamente em gua corrente; 7) Cobrir todo o esfregao com fucsina bsica por 30 segundos; 8) Lavar novamente em gua corrente; 9) Secar a lmina, tomando o cuidado de no remover o esfregao; 10) Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
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RESULTADOS:
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QUESTIONRIO
1. Descreva como so e do que se compem as paredes das bactrias Gram positivas e Gram negativas? 2. Cite alguns fatores que podem influenciar na colorao de Gram, podendo inclusive levar a erros?
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MATERIAIS
Lminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes e dois tipos de fungos); Microscpio tico;
PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Faa um esboo das caractersticas morfolgicas e suas propriedades tintoriais de cada uma das bactrias apresentadas. Repita o procedimento para os fungos apresentados.
A. Visualizao de bactrias:
b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus
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Leveduras
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bilhes de mutaes em pequenos intervalos de tempo. Portanto, o crescimento bem sucedido de uma populao bacteriana reflete seu grau de adaptao a um determinado ambiente e depende primariamente de sua composio: condies nutricionais, temperatura, pH, osmolaridade, oxignio e luz. As distintas espcies bacterianas diferem no mbito de fatores dentro dos quais podem crescer. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condies nas quais seu crescimento atinge uma taxa tima. Para se estudar o crescimento de uma bactria preciso cultiv-la, como cultura pura, em meios de cultura e condies ambientais que variam em condies qumicas e fsicas, tais como fontes de nutrientes, osmolaridade, pH, presena ou ausncia de oxignio e temperatura de incubao. O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado atravs do aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (atravs de curvas de crescimento) ou da estimativa do nmero de clulas viveis presentes na populao (mtodo de determinao do nmero de unidades formadoras de colnia). No h mtodo perfeito; ambos os mtodos apresentam vantagens e desvantagens. A escolha do mtodo depende da situao particular que se apresente.
CURVAS DE CRESCIMENTO
Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano a obteno de curvas de crescimento. Estas so representaes grficas do aumento do nmero de indivduos em um determinado perodo de tempo. Em condies experimentais, quando se inocula uma populao bacteriana em um frasco contendo uma quantidade inaltervel de meio de cultura (sistema fechado), o crescimento dessa populao passa por quatro fases caractersticas, dependendo do ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas quatro fases esto representadas na Figura 6.
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Fase lag: fase de adaptao metablica ao novo ambiente; o metabolismo celular est direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas condies ambientais encontradas pelas clulas. O nmero de indivduos no aumenta nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A durao dessa fase depende das condies ambientais nas quais as clulas se encontravam anteriormente. A fase lag ser to mais longa quanto maiores as diferenas de composio do ambiente anterior ou se a populao for constitudo de bactrias esporuladas. Fase exponencial ou logartmica: fase na qual o nmero de clulas da populao dobra a cada gerao. Esta taxa de crescimento no pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Aps um determinado perodo de crescimento exponencial, as condies ambientais tornam-se desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais, acmulo de metablitos txicos e limitao de espao. A taxa de crescimento da populao diminui e segue-se a fase estacionria. Fase estacionria: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se dividindo, mas parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito prxima da taxa de morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis na populao. A curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria depende do balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se tornando inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies ambientais tornarem-se progressivamente desfavorveis. Fase de declnio: fase de declnio exponencial do nmero de clulas viveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas viveis entra em declnio progressivo at a completa extino da populao. Para a construo de uma curva de crescimento bacteriano, mede-se o aumento da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio lquido atravs de medidas da densidade ptica da cultura. Alquotas da cultura em crescimento so retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbncia da cultura contra um comprimento de onda de 600 nm. Para tal utiliza-se um espectrofotmetro onde o branco o meio de cultura utilizado, ausente de inculo. Cada medida obtida corresponde densidade ptica (DO) da cultura em um dado momento do crescimento. A absorbncia aumenta proporcionalmente ao aumento do nmero de clulas (biomassa) na populao. Desta forma pode-se construir um grfico representativo do progresso do crescimento, relacionando-se a DO pelo tempo. 23
S so confiveis medidas de DO at 2.0. Acima disto as leituras perdem a confiabilidade. Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0 deve-se fazer uma diluio 10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Para a plotagem dos dados no grfico deve-se multiplicar a DO obtida por 10.
Quadro 1. Vantagens e desvantagens do mtodo de medidas da densidade ptica
Vantagens
simplicidade da metodologia; medidas prontamente obtidas: o resultado do experimento conhecido ao seu final; possibilita o reconhecimento do padro de crescimento da populao bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em grfico); pode-se estabelecer comparaes do padro de crescimento de diferentes populaes bacterianas; pode-se estabelecer comparaes do padro de crescimento sob diferentes condies ambientais; clulas bacterianas agrupadas aps a diviso celular no prejudicam os resultados; reduzida quantidade de material utilizado; a introduo de erros experimentais pelo operador menor; o experimento no cansativo, reduzindo a introduo de erros experimentais por parte do operador;
Desvantagens e limitaes
no possvel a estimativa do nmero de clulas/ml da populao; clulas inviveis, fragmentos de clulas mortas e material difundido no meio de cultura interferem na obteno de resultados ; s se obtm leituras acuradas da DO at o valor de 2.0, acima disto as leituras perdem a confiabilidade;
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OBJETIVO
Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de atravs de medidas de densidade ptica. E. coli
MATERIAL
Cultura bacteriana pura; Espectofotmetro; Soluo salina; Pipetas; Tubos de ensaio;
PROCEDIMENTO
Durante a aulas sero obtidos apenas alguns pontos experimentais, os demais pontos sero medidos pelos monitores e repassados para os grupos.
RESULTADOS
A) Construir um grfico a partir dos pontos obtidos.(No se esquea de identificar os eixos, e suas unidades!!!) B) Identificar cada uma das fases de crescimento no grfico.
QUESTIONRIO
1. Quais os problemas observados na construo dos grficos (em que etapa do crescimento)? Voc diria que todos os pontos so confiveis? Justifique sua resposta.
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Vantagens
permite uma estimativa do nmero de clulas viveis/ml da populao
Desvantagens e limitaes detecta somente as clulas viveis e que se repliquem, ou seja, aquelas capazes de formarem colnias; muitos indivduos viveis podem no se replicar, prejudicando o clculo se as clulas da bactria estudada mantm-se agrupadas aps a diviso celular (cada colnia em meio slido seria formada por mais de uma clula) se as diluies no forem homogeneizadas adequadamente
se um nmero muito pequeno ou muito grande de colnias for usado na contagem se o operador no fizer o espalhamento rapidamente e de forma
possibilita o reconhecimento do padro de crescimento da populao bacteriana em estudo (as diferentes fases do crescimento bacteriano podem ser visualizadas em um grfico)
pode-se estabelecer comparaes do padro de crescimento de diferentes populaes bacterianas pode-se estabelecer comparaes do padro de crescimento sob diferentes condies ambientais
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adequada. a cada diluio um erro experimental introduzido pela instrumentao e pelo experimentador este mtodo detecta apenas um nmero muito reduzido de clulas, o que prejudica a estimativa a grande quantidade de material utilizado a acuracidade dos resultados est diretamente relacionada quantidade de material (principalmente placas de Petri)
a limitao de material impe um aumento do erro experimental o resultado do experimento s conhecido aps o crescimento das colnias isoladas nas placas de Petri
A) BACTERIANA A determinano da concentrao de bactrias feita geralmente pela tcnica de determinao do Nmero de UFC (unidades formadoras de colnias).
PROBLEMA:
1. Voc tem um estoque de uma super bactria Escherichia coli (lac+). Voc fez um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE PRECISA RECUPERAR SUA BACTRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE, QUE FAZER? 2. Mas digamos que voc precisa ou deseja conhecer o nvel de que a bactria contaminante seja lac-. Neste caso voc poder: 0,1ml (diluio 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e 0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e 0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e 0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e contaminao e _________lac_________lac_________lac_________lac-
4. Qual a concentrao da bactria lac- contaminante (UFC/ml da cultura original)? ( Y) _________ Qual porcentagem da contaminao? _( Y) / (X)_____________________
VERIFICAO DE ENTENDIMENTO:
Vrias tcnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prtica. Voc saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos?
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LCALIS Os lcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigidade. O mecanismo de ao est relacionado concentrao do on hidroxila. Um pH maior do que 9 inibir a maioria das bactrias. LCOOIS Os lcoois alifticos comuns so bons solventes, anti-spticos e desinfetantes. So utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes. So potentes bactericidas contra micobactrias, Gram positivas, Gram negativas, fungos patognicos, muitos vrus e no em esporos. A presena de gua fundamental para a atividade dos lcoois (50-70%) e so mais eficazes na ausncia de sujeiras e matria orgnica. Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem timos solventes em relao a outros agentes germicidas, de terem ao rpida, de apresentarem baixo custo e praticamente serem atxicos. As desvantagens so: baixa atividade fungicida e virucida, baixa penetrabilidade, desidratantes, no possurem ao residual e no devem ser utilizados para limpezas de ferimentos abertos. SURFACTANTES um composto qumico que diminui a tenso superficial de uma soluo aquosa. Os surfactantes so adsorvidos em um grau significativo pelo algodo, pela borracha e materiais porosos, diminuindo assim, a concentrao eficiente e a eficcia antibacteriana. Com base na posio hidrofbica da molcula, h trs tipos: Aninicos : Os sabes so os mais importantes. So antibacterianos contra microrganismos Gram negativos e cido-resistentes; Catinicos : Os compostos de amnio quaternrio so os principais. Apesar de possurem efeitos limitados sobre os vrus, eles so eficientes contra bactrias Gram positivas e Gram negativas, mas em geral, os detergentes catinicos no possuem ao virucida, fungicida ou esporocida, Vantagens: No so em geral irritantes para a pele e tecidos, baixa toxicidade, so inodoros, podem ser usados em solues com gua e lcool. Desvantagens: So neutralizados por surfactantes aninicos (sabes), no agem na presena de matria orgnica e podem causar irritao quando em contato prolongado com a pele, mucosas e trato respiratrio. No-inicos. HALOGNIOS Possuem efeitos antibacterianos potentes devido alta afinidade pelo protoplasma. As atividades em solues livres de matria orgnica so, em ordem decrescente: 1. Cloro, 2. Bromo, 3. Iodo. J, na presena de matria orgnica o mais ativo o Iodo. METAIS PESADOS
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Derivados do mercrio Parecem ser primariamente bacteriostticos e apenas levemente bactericidas. A sua ao antibacteriana est relacionada inibio reversvel da atividade enzimtica essencial da bactria e capacidade de se combinar com ons de compostos metlicos orgnicos e inorgnicos. Possuem pouca atividade esporicida e so inativados por restos orgnicos. O uso para anti-sepsia de superfcies e objetos inanimados parece imprudente j que h agentes com um modo de ao mais eficiente. Compostos de Prata Produzem efeitos custicos, adstringentes, antibacterianos pela ao do on de prata livre e produz desnaturao de protenas. Os preparados de Prata coloidal no so corrosivos nem irritantes e so usados sobre tecidos sensveis. A prata metlica precipita as protenas e produz efeito irritante. AGENTES OXIDANTES So compostos germicidas de ao breve sobre algumas bactrias aerbicas Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaerbicos, mas no destroem esporos bacterianos. Liberam Oxignio que se combina com a matria orgnica se tornando inativos. A soluo de Perxido de Hidrognio libera Oxignio livre rapidamente ao entrar em contato com mucosas e superfcies sem plos que fornecem a enzima catalase. Quando distribudo sobre ferida com exsudato, a sua efervescncia vai remover o pus e restos celulares e confere atividade germicida limitada. valioso para limpar e desodorizar o tecido infectado. O Permanganato de Potssio libera Oxignio em contato com a matria orgnica. As solues possuem uma grande ao antibacteriana.
OBJETIVOS
Verificar a ao de anti-spticos no crescimento bacteriano.
MATERIAL
4 Placas com gar-sangue : Meio base para gar sangue ou TSB enriquecido com 5% sangue desfibrinado de carneiro; 4 zaragatoas (Swab) estreis; 3 cotonetes embrulhados em papel alumnio autoclavados, ou + 3 zaragatoas estreis; sabo, lcool iodado, mertiolate, anti-spticos comerciais (anti-spticos em geral disponveis 1 para cada grupo, podendo haver repeties); Ala de Platina , bico de Bunsen; Microscpio ptico, bateria de Gram, lminas;
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PROCEDIMENTO
1. Umedecer um cotonete estril em soluo fisiolgica e esfregar vigorosamente sobre as costas de uma das mos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de dimetro; 2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio gar sangue; 3. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar nas costas da outra mo, numa rea de mesmo dimetro da primeira; 4. Esperar 4 minutos para que haja ao do anti-sptico e passar na rea desinfectada um terceiro cotonete umedecido com soluo fisiolgica. Tomar cuidado para no atingir a regio no desinfectada; 5. Espalhar o contedo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo gar-sangue; 6. Marcar na placa o anti-sptico utilizado e o nmero do grupo que realizou o experimento; 7. Incubar a placa por 24h, em estufa a 37C.
RESULTADOS
Na quinta-feira: 1. Observar os resultados e anotar. 2. Analisar a Morfologia MACROSCPICA das colnias e MICROSPICA das bactrias aps colorao de Gram. (No se esquea de ilustrar o que voc observou!)
QUESTIONRIO
1. Descreva duas situaes: uma em que voc usaria um anti-sptico e uma em que usaria um desinfetante. 2. Faa uma lista com pelo menos seis anti-spticos e seis desinfetantes.Nesta lista deve conter o principal composto ativo, o nome comercial, e o uso .
PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA
TEORIA
Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactrias aos antimicrobianos. Estes testes so utilizados para avaliar in vitro a 32
atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergncia de bactrias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensvel, intermedirio ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo de diluio: consiste em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em meio slido ou lquido e em seguida semear a bactria em estudo. Aps incubao determina-se MIC e/ou MBC. 2- Mtodo de difuso de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no gar e produz inibio do agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta tcnica, alguns fatores so essenciais: Meio de Cultura: normalmente utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas; Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactrias, devendo-se realizar a colorao de Gram. A densidade do inculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padro de turbidez (Escala de MacFarland).
OBJETIVO
Analisar pelo mtodo de difuso a ressitncia de E. coli a alguns antibiticos.
MATERIAIS
Swab estril; cultura lquida fresca de Eschirichia coli; placas de Petri, com meio Mueller-Hinton slido; discos de papel com antibiticos; pinas; rgua.
PROCEDIMENTO
1. Introduzir nas culturas um swab estril, retirar o excesso de lquido comprimindo a ponta do swab nas paredes do tubo;
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2. Espalhar o contedo do swab sobre o meio de cultura slido distribudo numa placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem, de modo a obter um tapete de bactrias em toda a superfcie do meio slido; 3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos); 4. Colocar os discos de papel contendo os antibiticos sobre a cultura seca (usar pinas); 5. Incubar em estufa a 37C , por 16 a 24 horas; 6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a tabela abaixo: Bactria
Oxacilina OX (1g/mL) Carbemicilina CB (100g/mL)
QUESTIONRIO
1. 2. 3. 4. O que antibiograma e para que serve? Quais so os antibiticos beta-lactmicos? Qual o seu modo de ao? Qual a diferena entre agente bactericida e bacteriosttico? Dos antibiticos testados na experincia acima qual seria o mais indicado para o tratamento da infeco causada pela linhagem E. coli testada? Por que? 5. Faa um esquema da parede de uma bactria Gram-positiva e de uma bactria Gram-negativa?
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OBJETIVO
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.
MATERIAL
Placas de gar Sabouraud; Alho e cebola; Cotonetes; Graal e pistilo; Discos de papel de filtro; Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.
PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo; 2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na cultura; 3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal, 4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a superfcie do meio semeado; 5. Incubar a 25C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.
RESULTADOS
Descreva as observaes feitas ao final da incubao.
QUESTIONRIO
Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum j relatado na literatura ou algum de conhecimento popular.
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conjugao, tra, mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugao entre bactrias e bactrias e leveduras. Estes plasmdios ColE1 codificam protenas chamadas de colicinas que matam algumas linhagens sensveis de E. coli. Os plasmdios conjugativos aps serem transferidos e replicados podem permanecerem livres (autnomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano (chamados de estado integrado). No primeiro caso, a linhagem bacteriana chamada de F+ e no segundo Hfr ( a integrao do fator F parece ser mediada por pequenas sequncias chamadas de elementos IS). Neste estado, o fator F media a transferncia do cromossoma da clula Hfr para a clula F-. Raramente, o cromossomo inteiro da clula Hfr transferido. As clulas F+ aps contato com as clulas F-, transferem em alta frequncia para esta ltima uma rplica ou cpia do plasmdio F, tornando-a F+. Por outro lado, a linhagem Hfr cujo fator F est integrado ao cromossomo bacteriano, transfere, sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente, o cromossomo inteiro da clula Hfr transferido. O fator F tambm raramente transferido. Aps a descoberta do fator F, outros plasmdios conjugativos foram sendo descobertos como o caso dos fatores ou plasmdios R ou RTF (fator de transferncia de resistncia). Estes plasmdios possuem marcadores para a resistncia s drogas antibacterianas e no integram-se, normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns plasmdios no promovem conjugao, mas podem ser mobilizados por outros plasmdios conjugativos.
OBJETIVO
Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmdio que carrega o gene que confere resistncia a tetraciclina, para a Escherichia coli K12 .
MATERIAL
Tubos de ensaio ; Placas com meio slido; Linhagens a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um plasmdio que carrega o marcador que confere resistncia a tetraciclina (Tcr ). b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , Nalr). O fentipo de resistncia ao cido Nalidxico deve-se a uma mutao cromossomal. 37
Antibiticos a) cido Nalidxico (Nal) usar a concentrao de 10g/ml b) Tetraciclina (Tc) usar a concentrao de 50 g/ml
PROCEDIMENTO
1 Dia 1. Fazer os pr-inculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio TSB. Incubar temperatura de 37C por uma noite. 2Dia 1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB ou LB as seguintes culturas: 1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e 1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora) 2. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitao temperatura de 37C. 3. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio slido: 3.1 Clula doadora: S. typhimurium MG031 0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey-Nal 0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey -Tc 0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Tc 0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Tc 3.2 Clula receptora: E. coli K12 0,1ml (sem diluio) em meio YT-Nal-Tc 0,1ml (diluio 10-4 ) em meio MacConkey -Nal 0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Nal 0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Nal 3.3 Mistura de conjugao (Transconjugantes): 0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey -Nal-Tc 0,1ml (diluio 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc 0,1ml (diluio 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc 4. Incubar em estufa temperatura de 37C por 16-24 horas (durante uma noite). 38
RESULTADOS
3Dia Analisar os resultados e determinar a freqncia de conjugao. A freqncia determinada dividindo o nmero de clulas transconjugantes pelo nmero total de clulas receptoras.
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ABORDAGEM CLSSICA
Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relao casual entre um microrganismo em particular e uma doena. 1. A bactria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doena; a bactria ou seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doena; 2. A bactria deve ser isolada de leses de uma pessoa infectada e mantida em culturas puras; 3. A cultura pura quando inoculada em voluntrio humano susceptvel ou animal experimental deve produzir os sintomas da doena; 4. A mesma bactria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivduos intencionalmente infectados. Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactrias causadoras de epidemias como a clera e a tuberculose. Estes se constituram nas primeiras abordagens que forneceram bases cientficas para o estudo das doenas infecciosas. Estes postulados apresentam, contudo, uma srie de limitaes devido ao precrio conhecimento, ao tempo de Koch, dos mecanismos que regem a infectividade bacteriana. 1. Os postulados de Koch implicam que a virulncia uma caracterstica exclusiva das bactrias e independente do hospedeiro. Na realidade, a susceptibilidade do hospedeiro to ou mais importante que as caractersticas de virulncia da bactria: Indivduos cujo sistema imunolgico esteja seriamente comprometido por quimioterapia anti-cncer, tratamento com corticosterides, infeco por HIV ou diabetes e que podem ser infectados por bactrias incapazes de causar infeco em pessoas sadias; A mesma bactria pode ou no satisfazer os postulados de Koch dependendo da sub-populao usada como ponto de referncia. 2. O segundo postulado enfatiza a obteno de culturas puras do patgeno. H algumas 40
doenas cujo agente causativo no pode ser cultivado em meios de laboratrio ou cujo meio adequando no , ainda, disponvel: H considerveis evidncias para implicar as bactrias Treponema pallidum e Mycobacterium leprae como causadoras da sfilis e hansenase, respectivamente. Antibiticos que causam o desaparecimento de sintomas tambm causam a eliminao da bactria do tecido infectado. H tambm, uma resposta imunolgica dos indivduos infectados contra os antgenos de superfcie das bactrias observadas nas leses provocadas pela doena; A combinao das tecnologia da reao em cadeia da polimerase (PCR) com as de seqenciamento de cidos nuclicos possibilita a deteco e identificao de bactrias no-cultivveis e revela o agente causativo de muitas doenas. 3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espcie bacteriana so igualmente virulentos e que somente uma nica espcie causa uma determinada doena. diferentes linhagens de uma espcie bacteriana no somente variam consideravelmente em virulncia como podem causar doenas distintas; os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espcies de bactrias e h doenas cujas leses so causados por uma mistura de diferentes linhagens (infeces polimicrobianas); os casos nos quais uma nica espcie de bactria a nica responsvel por uma doena parece mais uma exceo do que uma regra; o cultivo de uma bactria em meio de laboratrio pode causar a "perda" do fator de virulncia: no expresso dos genes nas condies ambientais do meio. 4. O terceiro postulado requer que a bactria seja reinoculada em um voluntrio humano ou em um animal experimental e que a reinoculao cause os sintomas da doena. Em muitos casos no possvel a utilizao de voluntrios humanos e a nica alternativa a utilizao de um modelo animal, se houver um disponvel; Alguns patgenos humanos no causam doenas em animais ou provocam sintomas diferentes daqueles observados em humanos.
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