TCNICAS BSICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Sandra Regina Ceccato Antonini Silvana Perissatto Meneghin Alfredo Seiiti Urashima

COORDENADORES Prof Sandra Regina Ceccato Antonini Doutora no Depto.Tecnologia

Agroindustrial e Scio-economia Rural, CCA/UFSCar, com ps-doutorado em gentica molecular de leveduras na Universidade de Sheffield, Inglaterra. Prof Silvana Perissatto Meneghin Assistente no Depto.

Biotecnologia Vegetal, CCA/UFSCar, doutoranda em Microbiologia. Prof. Alfredo Seiiti Urashima Doutor no Depto. Biotecnologia

Vegetal, CCA/UFSCar, com ps-doutorado em fitopatologia e biologia molecular na Universidade de Kobe, Japo.

Esta apostila se refere ao curso de extenso universitria Tcnicas bsicas de biologia molecular, oferecido no perodo de 12 a 16 de julho de 2004, no Laboratrio de Microbiologia Agrcola e Molecular (LAMAM), Depto. Biotecnologia Vegetal / Depto. Tecnologia Agroindustrial e Scio-Economia Rural, Centro de Cincias Agrrias, Universidade Federal de So Carlos.

Endereo:

LAMAM - UFSCar Via Anhanguera, km 174 Fone : (19) 3543-2612 / 3543-2614 13600-970 Araras - SP e-mail: lamam@cca.ufscar.br

Julho/2004

INDICE

1. Introduo 2. Segurana no laboratrio e disposio de resduos perigosos 3. Introduo biologia molecular e marcadores moleculares..

03 03 05

4. Extrao de DNA genmico total..... 24 5. Quantificao de DNA... 6. Reao PCR... 7. Polimorfismo por RAPD 8. Polimorfismo por RFLP 9. Anlise dos resultados 10. Bibliografia. 11. Preparo de solues 26 29 33 37 45 48 49

1. INTRODUO

H vrias tcnicas em biologia molecular usadas numa ampla variedade de estudos tais como gentica de populaes, estudos sobre evoluo ou filogenia, mapeamento e expresso gnica. Fica difcil cobrir as tcnicas exatas em cada uma das reas de estudo mas estas tcnicas se desenvolveram a partir de mtodos bsicos. O objetivo desse curso introduzir os alunos s tcnicas bsicas como PCR e suas variaes, como RAPD, e tambm RFLP, discutindo que condies afetam essas tcnicas, os cuidados, a forma de avaliao dos resultados e as aplicaes nos mais diversos campos do conhecimento.

2. SEGURANA NO LABORATRIO E DISPOSIO DE RESDUOS PERIGOSOS

Durante

trabalho perigosos

experimental, e

trabalhar-se- sendo

com

reagentes adotar

potencialmente

equipamentos,

necessrio

procedimentos de segurana no laboratrio.

Segurana no laboratrio 1. proibido comer, beber, fumar, estocar alimentos e usar cosmticos no laboratrio.

2. Devem ser usados sapatos adequados, fechados, e com sola no deslizante em todas as reas do laboratrio.

3. Cabelos longos devem estar presos.

4. Jalecos devem ser usados para a proteo contra contaminao ou danos s roupas. Eles devem ser removidos ao deixar as reas do laboratrio para

evitar transferncia de contaminantes do laboratrio para as reas normalmente limpas (como escritrios, copas, etc.)

5. As mos devem ser lavadas depois da retirada das luvas, antes de deixar o laboratrio, e a qualquer tempo depois do manuseio de materiais tidos como suspeitos de contaminao.

6. A proteo da face e dos olhos (usando culos,visores ou outros equipamentos de proteo) deve ser feita, para evitar o impacto de objetos, substncias prejudiciais, luz ultravioleta ou outras radiaes.

7. Pipetar qualquer substncia com a boca proibido.

Disposio de resduos perigosos Resduos biolgicos perigosos A definio de resduos biolgicos perigosos (biohazard) qualquer material que est ou esteve em contato com carcaa de animais e/ou produtos animais. Isto inclui todos os resduos associados com procedimentos microbiolgicos (bactrias e vrus) e qualquer item que esteve em contato com enzimas e DNA recombiante. Portanto, a maioria das ponteiras e tubos so perigosos (biohazardous). Todos os materiais lquidos e slidos contaminados ou infectados devem ser autoclavados por 40 minutos antes de serem dispostos ou reutilizados.

Resduos orgnicos Solventes orgnicos como fenol, clorofrmio e lcool isoamlico no devem ser despejados na pia. A maioria dos materiais contaminados com solventes orgnicos devem ser colocados num recipiente reforado. Quando estes recipientes estiverem cheios, devem ser encaminhados ao servio de coleta especializado.

Brometo de etdio Os materiais contaminados com brometo de etdio (luvas, ponteiras, tubos e gis) devem ser colocados num recipiente reforado e dispostos como os resduos orgnicos. A disposio de soluo de brometo de etdio com concentrao inferior a 0,5 g/mL pode ser feita da seguinte maneira: acrescentar 1 g de carvo ativado por litro de soluo agitar por 1 hora a temperatura ambiente filtrar usando papel de filtro Whatman no. 1 e dispor como slido contaminado com luvas, ponteiras, etc.

Outras solues Solues solveis em gua, no perigosas, podem ser despejadas na pia.

3. INTRODUO BIOLOGIA MOLECULAR E MARCADORES MOLECULARES

Entre todas as propriedades dos organismos vivos, a capacidade de auto-replicao fundamental. Conter a informao gentica significa no somente armazenar e transmitir ao longo das geraes, mas expressar, ou seja, servir de molde para a sntese de RNAs e alguns desses serem traduzidos nas protenas correspondentes. Com o desenvolvimento tcnico, vrios avanos significativos tm sido obtidos atravs do isolamento, anlise e sntese de seqncia de DNA e genes, e da introduo desses DNAs recombinantes em clulas vivas para o estudo da sua funo e dos mecanismos que controlam sua expresso. Atualmente, os esforos esto voltados para o entendimento das relaes entre cidos nuclicos e protenas que resultam em, virtualmente, todos os eventos genticos na clula.

Estrutura do DNA

O material gentico de toda a vida neste planeta formado por apenas seis componentes. Esses componentes so: uma molcula de acar

(desoxirribose), um grupamento no fosfato e quatro bases nitrogenadas diferentes: adenina, guanina, citosina e timina. A unidade essencial que forma a molcula do DNA chamada nucleotdeo que mais precisamente, desoxinucleotdeo. Um desoxinucleotdeo consiste em uma molcula de desoxirribose com um fosfato ligado em uma posio e uma das quatro bases nitrogenadas ligada outra posio. Os tomos de carbono da poro acar desoxirribose de um nucleotdeo so sempre numerados do mesmo modo. A base est sempre ligada ao carbono 1 e o grupamento fosfato est sempre ligado ao carbono 5 (Figura 1). Na molcula do DNA, milhares ou milhes destes nucleotdeos esto agrupados em uma cadeia, pela unio do grupamento fosfatos, ligados ao carbono nmero 5 de uma molcula desoxirribose, com o carbono nmero 3 de uma segunda molcula de desoxirribose (uma molcula de gua liberada no processo). As ligaes formadas entre as molculas de desoxirribose, atravs do grupamento fosfato, so chamadas ligaes fosfodister. Como os nucleotdeos so unidos por ligaes entre seus grupamentos acar e fosfato, freqentemente dito que o DNA possui um esqueleto de acar-fosfato (Figura 2). O esqueleto acar-fosfato do DNA um elemento estrutural importante, mas toda a informao est contida nas quatro bases nitrogenadas. A chave para a transmisso da informao gentica reside em uma caracterstica dessas bases: adenina e timina juntas formam um par qumico estvel e citosina e guanina formam um segundo par estvel. Os pares so formados de interaes qumicas fracas, chamadas pontes de hidrognio. Estes dois pares, adenina-timina e citosina-guanina, so chamadas pares de bases

complementares.

Na molcula de DNA, dois esqueletos acar-fosfato permanecem lado a lado, uma fita disposta da extremidade 5 para a extremidade 3 e a outra disposta da extremidade 3 para 5. As bases ligadas a uma fita esto pareadas com suas bases complementares, ligadas fita oposta. Assim, a seqncia de bases especficas em uma fita refletida perfeitamente na seqncia das bases complementares na outra fita. O conhecimento da seqncia de bases de uma fita nos permite deduzir a seqncia de bases na fita complementar. O DNA geralmente representado como uma molcula plana, j que esta forma mais fcil tanto para representar quanto para analisar. Na realidade, cada um dos dois esqueletos acar-fosfato enrolado ao redor do outro, em uma conformao chamada dupla hlice. Os pares de bases ficam voltados para a face interna da hlice, como os degraus de uma escada. Para facilitar a representao e visualizao, o DNA pode ser apresentado por um modelo no qual cada esqueleto representado como uma fita delgada e os pares de base so representados esquematicamente. Na verdade, como a seqncia de nucleotdeos de uma fita, uma molcula de DNA ou uma regio de uma molcula freqentemente representada pela seqncia de apenas uma fita, sempre escrita na direo de 5 para 3.

Funo do DNA: replicao fiel

A estrutura do DNA sugere imediatamente como o DNA cumpre a primeira funo crtica do material gentico: a replicao fiel. Voc pode

observar que qualquer uma das duas fitas do DNA pode ser usada como um molde, ou padro, para reproduzir a fita oposta, por meio do uso das regras de pareamento de bases complementares. Quando uma clula est pronta para replicar seu material gentico, as duas fitas opostas so gradualmente desenroladas, expondo as bases individualmente. Cada fita, ento, usada como um molde para sntese de duas novas fitas. O resultado duas molculas de DNA filhas, cada uma composta por uma fita original e uma fita

10

recm-sintetizada, e cada nova molcula de DNA idntica molcula de DNA original. Como ocorre a replicao do DNA na clula? O DNA duplicado por enzimas, as protenas que servem como cavalos de batalha das clulas. Enzimas celulares especializadas trabalham juntas para desenrolar a dupla hlice do DNA, capturar nucleotdeos livres, parear os novos nucleotdeos corretos com a fita-molde e formar as novas ligaes do esqueleto acarfosfato em crescimento. O componente principal deste conjunto de protenas chamado DNA polimerase. Esta a enzima que, de fato, faz o correto pareamento das bases e forma as novas ligaes fosfodister. Finalmente, algumas das enzimas de replicao do DNA conferem a nova fita de DNA, chegando erros no pareamento de bases e corrigindo quaisquer erros que tenham encontrado. Estas cuidadosas enzimas asseguram que muito poucos erros ocorram durante a replicao do DNA, de modo que a informao gentica seja transmitida corretamente (Figura 3).

Funo do DNA: transmisso da informao.

Embora a estrutura do DNA sugira imediatamente como a molcula pode, pela duplicao, transmitir fielmente a informao gentica, no to bvio como uma molcula to simples pode determinar o desenvolvimento de criaturas to complexas e variadas quanto uma baleia azul ou uma rosa. Para entender como a estrutura do DNA elegantemente cumpre esta exigncia, necessrio pensar sobre o que faz uma baleia ser uma baleia ou uma rosa ser uma rosa. O que faz uma baleia ser uma baleia? A resposta : suas protenas. Assim como as protenas cumprem a complicada tarefa de duplicar o DNA da baleia, outras protenas cumprem praticamente todas as outras funes necessrias para a sobrevivncia da baleia. Protenas estruturais formam os tijolos e o cimento de sua pele, msculos, rgos e tecidos; outras protenas

sintetizam componentes estruturais adicionais, como ossos e lipdeos. Protenas transportadoras conduzem oxignio, nutrientes, hormnios e outras

11

12

molculas importantes atravs de seu corpo e entre suas clulas. Receptores proticos embebidos nas superfcies celulares, ligam com grande

especificidade, os hormnios da baleia, permitindo que ela cresa e se desenvolva adequadamente. Protenas do sistema imunolgico da baleia defendem-na de infeces. Protenas catalisadoras (enzimas) digerem seus alimentos, sintetizam as gorduras que a baleia armazena, replicam seu DNA para transmisso aos filhotes e executam todas as outras tarefas metablicas necessrias para a sobrevivncia das clulas da baleia. Assim, as protenas fornecem a estrutura e desempenham as funes vitais da baleia. O mesmo verdadeiro para uma rosa, uma mosca-da-fruta, uma bactria, um ser humano e qualquer outra forma de vida na Terra. No simplesmente a natureza das protenas de um organismo que lhe d uma identidade particular. Afinal, as protenas de diferentes animais podem ser muito similares protenas musculares, hemoglobina, enzimas de replicao do DNA e assim por diante. As protenas de animais estreitamente relacionados podem ser muito semelhantes. Mesmo organismos to diferentes quanto animais e plantas possuem alguns tipos de protenas em comum. Muito da diversidade na natureza deve-se organizao das protenas dentro de um organismo, particularmente s protenas estruturais e quelas envolvidas na sntese de componentes estruturais adicionais. De certa forma, a organizao de protenas similares dentro dos diferentes corpos anloga ao uso de uma pilha de tijolos em uma construo. Voc pode usa-los para construir o muro de um edifcio, uma churrasqueira ou mesmo uma calada. Esta analogia , obviamente, uma simplificao, j que so as protenas que fazem os organismos diferentes, e quanto mais distantemente relacionados os organismos, mais as protenas diferem. A organizao da sntese de protenas durante o desenvolvimento de um organismo leva sua forma singular, quer seja uma baleia, uma rosa, um crisntemo ou um humano. Um organismo executa determinadas atividades e possui determinada aparncia em razo da natureza de suas protenas e da forma como elas so organizadas durante o desenvolvimento.

13

Voltando s questes. O que determina a organizao da sntese de protenas durante o desenvolvimento de um organismo? Voc pode imaginar a resposta? Mais protenas. Quando estas protenas no funcionam

adequadamente, os resultados podem ser dramticos, como nas moscas que tm pernas no local onde deveriam ter antenas ou nas larvas de moscas com duas regies posteriores e sem regio anterior. Mas o essencial que, no final, as protenas organizam o corpo, compem ou sintetizam seus componentes estruturais e cumprem suas atividades metablicas. Assim, para ditar o desenvolvimento dos organismos, a informao do DNA deve de algum modo ser convertida em protenas, a matria-prima do organismo. Como esta converso ocorre? Para responder esta questo, devemos saber um pouco mais sobre as protenas.

Protenas

Ento, o que exatamente uma protena? Uma protena uma cadeia de aminocidos. Aminocidos so pequenas molculas orgnicas, composta principalmente de carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio. As protenas so formadas a partir de um conjunto de 20 aminocidos diferentes, pela ligao de poucos ou milhares desses aminocidos em vrias seqncias, formando cadeias. Para uma analogia simples, pense na fabricao de um colar de contas a partir de uma coleo de contas coloridas. Mas uma protena mais que uma cadeia linear de contas. Voc deve tambm imaginar que a cadeia est dobrada e enrolada dentro de uma estrutura tridimensional especfica. O que torna uma protena capaz de desempenhar sua funo? Uma protena pode desempenhar sua funo graas sua estrutura tridimensional nica. Como exemplo, vamos considerar um nico receptor protico encravado na membrana externa de uma clula. Nosso receptor protico imaginrio parece uma circunferncia de forma irregular, com salincias e reentrncias. As formas dessas salincias e reentrncias so absolutamente cruciais para a funo da protena: uma reentrncia na face externa da membrana celular o lugar onde um hormnio do crescimento deve se encaixar perfeitamente, para

14

transmitir clula o sinal de crescimento. Outras salincias e reentrncias na face interna da membrana celular so locais onde outras molculas se encaixam perfeitamente para comunicao com o restante da clula. Por meio destas interaes, o receptor protico pode propagar clula o sinal hormonal. Nosso receptor imaginrio ilustra um ponto crucial na funo das protenas. Uma protena depende de sua habilidade de encaixar ou ligar-se a outras molculas (algumas vezes outras protenas) para desempenhar suas funes. Essa habilidade determinada por sua estrutura tridimensional. O que determina a estrutura tridimensional de uma protena? Quando os aminocidos esto unidos em uma cadeia protica, essa cadeia imediatamente se dobra sobre ela mesma para adquirir a conformao mais confortvel ou energeticamente mais estvel. A conformao energeticamente mais estvel determinada pelas interaes de todos aminocidos que compem a protena. Portanto, as caractersticas dos aminocidos que formam a protena e a seqncia na qual eles ocorrem na cadeia protica determinam a estrutura tridimensional final da protena. A seqncia dos aminocidos na cadeia , por conseguinte, extremamente importante para a funo das protenas. Como voc pode imaginar, as possibilidades para construo de cadeias proticas diferentes e nicas so quase ilimitadas. (Imagine quantas cadeias de contas diferentes voc poderia fazer usando 20 cores diferentes de contas). Esta variedade favorvel, considerando as muitas e variadas funes que as protenas devem desempenhar. Na verdade, as formas e funes das protenas so to importantes biologia molecular. Mas, por hora, voltemos questo de como o DNA controla o desenvolvimento de um organismo. Vimos que um organismo a soma de suas protenas. Vimos tambm que a funo das protenas depende de sua estrutura tridimensional. Alem disso, sua estrutura depende da seqncia de aminocidos na cadeia de protena. O DNA determina as caractersticas de um organismo porque ele determina a seqncia de aminocidos de todas as protenas deste organismo. Como o DNA determina seqncia de aminocidos? O DNA contm um cdigo gentico para os aminocidos, no qual cada aminocidos

15

representado por uma seqncia de trs bases do DNA. Estas trincas de bases so chamadas cdons. A seqncia dos cdons em uma seqncia de DNA refletida na seqncia dos aminocidos reunidos em uma cadeia protica. O trecho completo de DNA necessrio para determinar a seqncia de uma protena um gene, a unidade da hereditariedade definida pelos geneticistas clssicos. O conjunto completo dos genes de um organismo chamado de genoma.

Sntese de protenas

O processo pelo qual protenas so sintetizadas a partir do cdigo gentico tem diversas etapas. O DNA , basicamente um deposito passivo de informao funcionando como um mapa. A ao da sntese de protenas ocorre em locais especiais da clula chamados ribossomos. Por isso, a primeira etapa da sntese de protenas retransmitir a informao do DNA para os ribossomos. Para efetuar esta etapa, enzimas celulares sintetizam uma cpia funcional de um gene para levar seu cdigo gentico at os ribossomos . Essa cpia funcional chamada RNA mensageiro. O mRNA transporta o cdigo gentico de uma protena at os ribossomos. Em uma segunda etapa da sntese protica, os cdons do mRNA devem ser associados aos aminocidos corretos. Essa etapa cumprida por um segundo RNA chamado transportador. Finalmente, os aminocidos devem ser ligados para formar uma cadeia protica. O ribossomo executa essa funo. Quando a cadeia proteica est completa, um sinal de terminao gentico informa ao ribossomo para liberar a nova protena na clula.

16

RNA

A sntese de protena, portanto, requer um segundo tipo de molcula de cido nuclico: o RNA. Como o DNA, o RNA formado por nucleotdeos compostos de acar, fosfato e uma das quatro diferentes bases orgnicas. Entretanto, existem trs diferenas importantes entre o DNA e o RNA, duas delas qumicas e uma estrutural. As diferenas qumicas so: no lugar do acar desoxirribose, o RNA contm o acar ribose, no lugar da base Timina, o RNA tem a base Uracila. O esqueleto acar- fosfato do RNA unido da mesma forma que o esqueleto do DNA. Suas bases tambm esto ligadas ao carbono nmero 1 do acar, como no DNA. A diferena estrutural importante que apesar das bases do DNA tambm poderem formar pares complementares, o RNA geralmente formado por apenas uma fita de esqueleto acar-fosfato e bases. Ele no possui a estrutura em dupla hlice com as bases pareadas como o DNA, embora seja capaz de parear com outras fitas simples de DNA ou RNA.

Sintese de mRNA

O primeiro passo na sntese de protenas sintetizar o mRNA. Esse processo assemelha-se em muitos aspectos a replicao do DNA. Primeiro, a dupla hlice do DNA deve ser desenrolada para revelar as bases, que contm a informao. Ento os nucleotdeos complementares so pareados com as bases expostas. Durante a sntese de RNA, a base Uracila substitui a Timina e pareia com a Adenina. Ligaes fosfodister so formadas entre os nucleotdeos, e o mRNA recm-sintetizado possui uma sequncia de bases que exatamente complementar fita-molde de DNA. O processo de usar um molde de DNA para criar uma molcula de mRNA complementar chamado de transcrio. Molculas de tRNA e de RNA ribossomal tambm so codificadas no DNA e sintetizadas por transcrio, mas diferentemente do mRNA, elas no so traduzidas em protena.

17

Existem duas diferenas principais entre a transcrio e a replicao do DNA. Na replicao do DNA, ambas as fitas so usadas como molde para a gerao de duas novas fitas para duas novas hlices. Na sntese de RNA, apenas uma fita do DNA usada como molde e apenas uma fita simples de RNA produzida. A segunda diferena que a nova molcula de mRNA liberada do molde de DNA medida que sintetizada. A dupla hlice de DNA "enrola-se de volta" a medida que o mRNA liberado. O DNA recm sintetizado permanece como parte da nova hlice de DNA, pareado com sua fita original. Como o mRNA sintetizado na clula? Por enzimas. A enzima que sintetiza o RNA tem uma tarefa interessante. Ela no apenas deve selecionar corretamente os nucleotdeos complementares e lig-los, mas tambm deve decidir onde um gene est localizado. A hlice de DNA pode conter milhares ou milhes de pares de base. A RNA polimerase deve determinar exatamente onde iniciar e terminar a sntese de RNA de modo a transcrever um gene completo. Ela reconhece onde comear a sntese atravs de sinais de comandos genticos especiais inseridos na sequncia de bases do DNA. Um sinalizador importante o promotor. Um promotor uma sequncia especial de bases de DNA que indica RNA polimerase onde iniciar a sntese de RNA. Outros sinais informam RNA polimerase para parar a sntese de RNA e liberar o molde de DNA, esses sinais so chamados terminadores.

Usando um mRNA para sintetizar uma protena

Aps a transcrio estar completa, o mRNA desloca-se at o ribossomo, o local da sntese de protena. O ribossomo reconhece o mRNA e o prende na posio adequada para que seus cdons sejam lidos corretamente. As molculas de tRNA so dobradas sobre elas mesmas, parecendo-se com as folhas de um trevo. Na extremidade de um dos lbos, est uma sequncia de trs bases chamada anticdon. Esse pareia exatamente com um dos cdons da fita simples de mRNA. NA outra extremidade da molcula de tRNA est um aminocido. Cada tRNA diferente est ligado ao aminocido correto para seu anticdon. Cada clula contm um conjunto de enzimas

18

extremamente especficas, cuja tarefa reconhecer tRNAs individuais e liglos ao aminocido correto, de modo que cada tipo de tRNA tenha um aminocido especfico ligado a ele. O resultado que, quando o anticdon do tRNA pareia com seu cdon do mRNA, o aminocido correto trazido at o ribossomo. O ribossomo prende a molcula de mRNA para que ento os tRNAs pareiem com seus cdons complementares, um de cada vez, em ordem. A medida que o tRNA traz o aminocido correto, os ribossomos ligam os aminocidos em uma cadeia proteica crescente. Uma vez que um aminocido tenha sido ligado cadeia, a molcula de tRNA separada e liberada do complexo mRNA ribossomo. Esse processo, no qual a sequncia de bases do mRNA traduzida para uma sequncia de aminocidos de uma protena, chamado traduo. As tecnologias de anlise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referncia nos cromossomos, tecnicamente denominados marcadores moleculares. Por marcador molecular define-se todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento especfico de DNA (correspondente a regies expressas ou no do genoma). Diversas tcnicas de biologia molecular esto hoje disponveis para a deteco de variabilidade gentica ao nvel de sequncia de DNA, ou seja, para a deteco de polimorfismo gentico. Estas tcnicas permitem a obteno de um nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo. Tais marcadores podem ser utilizados para as mais diversas aplicaes. O desenvolvimento tecnolgico na rea de marcadores moleculares tem sido fascinante e extremamente rpido. A tecnologia de DNA recombinante e o desenvolvimento da amplificao dos segmentos de DNA via PCR

(Polymerase Chain Reaction, ou a reao de polimerase em cadeia), abriram o caminho para uma mudana no paradigma gentico bsico: da inferncia do gentipo a partir do fentipo, onde Mendel foi o pioneiro, para a anlise

19

gentica direta da variao na sequncia de DNA. Tecnologias de anlise molecular mais acessveis e eficientes esto constantemente sendo

aprimoradas. Mtodos estatsticos acompanham este desenvolvimento, e tm permitido a manipulao de enormes quantidades de dados.

Reao da polimerase em cadeia (PCR)

A tecnologia da reao de polimerase em cadeia (PCR) foi concebida por Kary Mullis em meados da dcada de 80. Desde sua concepo, esta tecnologia causou uma verdadeira revoluo na biologia, tanto na pesquisa visando o entendimento de processos biolgicos fundamentais, como nas reas aplicadas, envolvendo diagnsticos e melhoramento gentico de plantas e animais domsticos. PCR uma tcnica poderosa, que envolve a sntese enzimtica in vitro de milhes de cpias de um segmento especfico de DNA na presena da enzima DNA polimerase (Figura 4). A reao de PCR se baseia no anelamento e extenso enzimtica de um par de oligonucleotdeos (pequenas molculas de DNA de fita simples) utilizados como iniciadores (primers ), que delimitam a sequncia de DNA de fita dupla alvo da amplificao. Estes primers so sintetizados artificialmente de maneira que suas sequncias de nucleotdeos sejam complementares s sequncias especficas que flanqueiam a regio alvo (Figuras 4 e 5). Um ciclo de PCR envolve 3 etapas: desnaturao, anelamento e extenso. A fita dupla do DNA alvo desnaturada atravs da elevao da temperatura para 92 a 95 C. Na etapa de anelamento, a temperatura rapidamente reduzida para 35 a 60 C, dependendo essencialmente do tamanho e sequncia do primer utilizado, permitindo a hibridizao DNA-DNA de cada primer com as sequncias complementares que flanqueiam a regio alvo. Em seguida, a temperatura elevada para 72C para que a enzima DNA polimerase realize a extenso a partir de cada terminal 3 dos primers . Esta extenso envolve a adio de nucleotdeos utilizando como molde a sequncia alvo, de maneira que uma cpia desta sequncia feita no processo. Este ciclo

20

21

22

repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da sequncia alvo dobra a cada ciclo, a amplificao segue uma progresso geomtrica de maneira que, depois de apenas 20 ciclos, so produzidos mais de um milho de vezes a quantidade inicial de sequncia alvo. Esta escala de amplificao permite, portanto, iniciar com quantidades mnimas de DNA (da ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e terminar a reao com grandes quantidades de DNA de uma sequncia especfica de interesse. A facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR, a torna particularmente poderosa para estudos gentico-moleculares envolvendo grande nmero de indivduos de qualquer organismo vivo. Um dos aspectos mais fundamentais da revoluo causada pela PCR foi a possibilidade de se gerar grandes quantidades de DNA de segmentos especficos do genoma. DNA em grande quantidade pode ser

facilmente detectado a olho n diretamente em gel de eletroforese atravs de corantes especficos para DNA (exemplo o brometo de etdio). Entretanto, a tcnica de PCR ainda apresentava uma limitao significativa na obteno de marcadores moleculares annimos distribudos pelo genoma. A construo de primers para amplificao via PCR dependia essencialmente do conhecimento prvio das sequncias de nucleotdeos que flanqueiam a sequncia de DNA de interesse. Para se conhecer estas sequncias necessria a clonagem e sequenciamento da regio. Em vista disso, com exceo de alguns genes de sequncia conhecida, a PCR apresentou, de incio, um uso limitado como tcnica para a obteno de marcadores moleculares.

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD)

Muitos mtodos tradicionais de clonagem, sequenciamento e anlise de polimorfismo de DNA foram acelerados ou substitudos pelo uso das inmeras derivaes da tcnica de PCR. Uma destas variaes a tecnologia RAPD que

23

envolve a amplificao simultnea de vrios locos annimos no genoma utilizando primers de sequncia arbitrria. O grande avano na rea de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990, com a idia de se utilizar primers mais curtos e de sequncia arbitrria para dirigir a reao de amplificao, eliminando assim a necessidade do conhecimento prvio de sequncia. Esta tcnica foi desenvolvida independentemente por dois grupos nos Estados Unidos. WILLIAMS et al. (1990) patentearam a tecnologia com o nome mais

comumente utilizado, RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA), DNA polimrfico amplificado ao acaso. WELSH & McCLELLAND (1990), por sua vez, propuseram a denominao mais apropriada para a tcnica, chamando-a de AP-PCR

(Arbitrarily Primed-Polymerase Chain Reaction), uma vez que os primers possuem sequncia arbitrria , mas a amplificao tecnicamente no ocorre ao acaso e sim em lugares especficos no genoma. O experimento desse grupo foi essencialmente a gerao de fingerprints (impresses digitais)

genmicos simples e reproduzveis para a identificao de linhagens, utilizando gis de eletroforese em poliacrilamida de maior poder de resoluo juntamente com primers um pouco mais longos. Independentemente do nome utilizado e das pequenas variaes na metodologia, a tcnica de PCR utilizado e das pequenas variaes na metodologia, a tcnica de PCR utilizando primers de sequncia arbitrria abriu uma perspectiva inteiramente nova para a anlise genmica de indivduos e populaes. Alm de facilitar e acelerar os estudos que j ocorriam com as espcies tradicionais, a tecnologia RAPD trouxe uma verdadeira

democratizao da anlise de polimorfismo molecular, ao permitir a realizao de estudos de anlise gentica em espcies anteriormente no contempladas.

24

Protocolos laboratoriais para PCR e RAPD

1. Extrao de DNA genmico total de leveduras

Vrios procedimentos de extrao de DNA de tecidos vegetais ou de microrganismos tm sido descritos na literatura. O que se observa em geral que protocolos padro so utilizados com algumas modificaes visando resolver os problemas especficos da espcie em estudo. Os protocolos se caracterizam por utilizar o detergente catinico CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide) no tampo de extrao e so, portanto, comumente denominados de protocolos CTAB; ou fenol (Figura 6). A maioria dos protocolos de extrao de DNA envolvem em geral cinco etapas bsicas. Na primeira etapa, algum tipo de macerao mecnica utilizada para romper as paredes e membranas celulares das clulas microbianas, crescidas em meio lquido e separadas desse por filtrao ou centrifugao, normalmente feita na presena de nitrognio lquido. Na segunda etapa, as clulas maceradas so ressuspendidas em um tampo de extrao, contendo algum detergente (SDS no caso da extrao que utiliza fenol), antioxidantes, EDTA e agente tamponante, visando a solubilizao de membranas lipoproteicas e desnaturao de protenas enquanto o DNA protegido da ao de enzimas de degradao. Esta suspenso submetida a uma temperatura entre 50 e 650 C durante 15 a 60 minutos para facilitar a solubilizao e homogeneizao da suspenso. Na terceira etapa, esta suspenso submetida a uma extrao com um solvente orgnico, clorofrmio-alcool isoamlico. As fases orgnica e aquosa so separadas atravs de centrifugao. Nesta extrao, lipdios, protenas e a maioria dos polissacardeos so retidos na fase orgnica inferior , enquanto que o DNA, RNA e alguns polissacardeos so retidos na fase superior (aquosa). Na quarta etapa, um lcool (isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) so adicionados fase aquosa. O DNA na presena de sal e lcool forma um precipitado frequentemente visvel que pode ser pescado ou peletizado por

centrifugao. Aps lavagens do precipitado com lcool, na quinta e ltima

25

26

etapa, este precipitado de DNA/RNA ressuspendido em um tampo TrisEDTA contendo RNAse para degradar o RNA, restando apenas o DNA genmico desejado.

2. Quantificao de DNA em Gel de Agarose

Aps finalizar os procedimentos de extrao de cidos nuclicos devese verificar a quantidade de DNA obtida. A quantidade de DNA pode ser determinada por dois mtodos: a espectrofotometria ou em gel de agarose, por leitura da intensidade de fluorescncia do brometo de etdio. Neste curso, utilizaremos o mtodo por leitura da fluorescncia do brometo de etdio sob luz UV, aps eletroforese do DNA em gel de agarose 0,8% (p/ vol). O brometo de etdio um corante que se intercala nas molculas dos cidos nuclicos sendo que a luz ultravioleta induz sua fluorescncia. A quantidade observada sob UV proporcional massa total de DNA da

amostra colocada no poo da eletroforese. Para quantific-la, faz-se a foto em cmara polaride (utilizamos tambm cmera digital) e compara-se a fluorescncia da amostra quela de um padro conhecido (Figura 7). Os gis de agarose so dissolvidos na presena de tampo apropriado at se obter uma soluo clara e transparente. Aps a sua fuso em alta temperatura (ou em forno microondas) a soluo ainda quente (500C) colocada em um suporte ou molde em geral, de acrlico. Aps ocorrer a solidificao da matriz, cuja densidade determinada pela concentrao da agarose, as amostras podem ser aplicadas. Quando o campo eltrico aplicado atravs do gel, o DNA, que carregado negativamente em um pH neutro, migra para o nodo. A taxa de migrao determinada por uma srie de parmetros dentre os quais podem ser citados: concentrao da agarose, peso molecular do DNA, conformao do DNA, voltagem aplicada (para uma mxima resoluo, a voltagem no deve ser maior que 5 V/cm entenda-se pela medida em cm, a distncia entre os eletrodos da cuba de eletroforese), direo do campo eltrico, composio do tampo, presena de agentes intercalantes, etc...

27

28

Procedimento As linhagens de leveduras sero incubadas durante 15 horas, a 30 C, em 50mL de meio YEPD. O material a seguir ser centrifugado a 4.000 rpm por 5 minutos em tubos Falcon de 50mL e o sobrenadante descartado. A massa celular obtida ser transferida para um almofariz previamente esterilizado e congelado, onde sero adicionados aproximadamente 30mL de nitrognio liquido, sendo o material macerado com o auxilio de um pistilo, tambm estril e congelado. No prprio almofariz sero adicionados 3mL de tampo Tris-HCl 0,1 M pH 8. Alquotas de 1.200 L sero transferidos para dois tubos eppendorf de 1,7mL ( 600L em cada) e adicionados de 75L de soluo SDS 10% mais 60L de -mercaptoetanol, sendo os tubos agitados lentamente at que a soluo se torne viscosa. Para executar a desproteinizao do material, sero adicionados o mesmo volume (635L) de clorofane (Fenol-Clorofrmio-lcool isoamlico na proporo 25:24:1 vol/vol, respectivamente) aos tubos, os quais sero agitados lentamente por inverso durante 10 minutos e centrifugados a 12.000 rpm por mais 10 minutos. Aps a centrifugao, a parte superior da soluo ser transferida para novo tubo eppendorf com o auxlio de uma micropipeta de 100L, sendo a parte inferior descartada. Este procedimento ser repetido por 3 vezes sendo que na ultima vez, o clorofane ser substitudo por clorofrmio-lcool isoamlico na proporo24:1 vol/vol, respectivamente. Aps a desproteinizao, ser executada a precipitao dos cidos nucleicos adicionando-se 5% do volume de Acetato de sdio 3M e o dobro do volume de Etanol absoluto resfriado a -20 C. Os tubos sero levados ao feezer tambm a -20 C onde permanecero por 10 minutos, sendo ento submetidos a centrifugao de 12.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante ser descartado cuidadosamente evitando dispensar o pellet de acidos nuclicos formado no fundo do tubo. Os tubos sero invertidos e deixados em temperatura ambiente para total evaporao do etanol remanescente.

29

O material ser ento ressuspendido em 400L de tampo TE 1X. A esse material sero adicionados 15L de soluo de RNAse (10mg/mL) incubando-se a 37 C por 1 hora, para degradao do RNA . Ser adicionado aos tubos o dobro do volume da soluo Clorofrmiolcool isoamilico na proporo 24:1 vol/vol, sendo os mesmos agitados lentamente por inverso durante 10 minutos. A poro superior ser ento transferida para novo tubo eppendorf com o auxilio de uma micropipeta de 100L. Para nova separao dos cidos nuclicos, repetir-se- o procedimento citado anteriormente utilizando-se 5% do volume de Acetato de Sdio 3M e o dobro do volume de etanol absoluto resfriado a -20 C. Os tubos sero levados ao freezer tambm a -20 C onde permanecero por 10 minutos, sendo ento submetidos centrifugao de 12.000 rpm por 5 minutos e lavados com cerca de 50L de Etanol 70% e invertidos para a evaporao do etanol. O material gentico ser ento ressuspendido em 50L de tampo TE 1X e congelados a -20C. Para estimativa da presena, quantidade e integridade do DNA o material ser submetido ao processo de eletroforese em gel de agarose 0,8% junto ao marcador molecular /HindIII. 3. Reao PCR

Componentes da reao de PCR

1. gua: a qualidade da gua do laboratrio pode influenciar na reao, de preferncia, use gua filtrada em aparelho Milli Q e esterilize por autoclavagem, renovando os frascos semanalmente.

2. Tampo: o tampo da reao de PCR fornecido juntamente com a Taq polimerase e vem 10x concentrado: faa uma leitura do folheto que acompanha a enzima para conhecer a composio do tampo de reao. A composio de tampo de reao da enzima fornecida pela Pharmacia, por

30

exemplo, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl e 15 mM MgCl2. O mais importante observar quanto o tampo contm de Magnsio, o qual fundamental para o funcionamento da Taq.

3. dNTP: os dNTPs podem vir na forma de um mix, em uma concentrao de 20 mM cada. Este estoque deve ser mantido no freezer. Os estoques para uso dirio podem ser preparados em volumes de 800 l, por exemplo em 8 tubos. Para preparar este estoque de uso, pipete 100 l de dNTP 20 mM e adicione 700 l de gua. Mantenha as aliquotas no freezer, use conforme necessidade e, renove sempre estes estoques (2,5 mM). Alm disso, os dNTPs podem vir separadamente, em concentraes por exemplo, de 100 mM. Para preparar o mix misture partes iguais de tal forma a reduzir a concentrao de cada nucleotdeo para 25 mM e depois prepare os estoques de uso dirio, diluindo 10X, e portanto tendo-se uma concentrao de 2,5 mM. As concentraes finais de dNTP na reao variam de um laboratrio para outro. Na formulao original proposta por Williams et al, 1990, concentrao 100 M. a

4. Primers: os primers vm na forma de pellets liofilizados. Os de sequncia arbitrria so comercializados pela Operon Technologies, CA, USA, e custam cerca de US$ 150,00 sendo fornecidos em Kits contendo 20 oligonucleotdeos. Cada Kit designado por uma letra do alfabeto, A, B, C, D etc. e os respectivos primers , por algarismos: OPA-1, OPA-2, OPA-3 etc. Para clculo do volume de TE a ser adicionado nos pellets, verifique no folheto que acompanha o Kit, o peso molecular de cada um deles. Prepare estoques de 50 M, seguindo o raciocnio do exemplo abaixo. As informaes dadas pelo fornecedor so as seguintes:

31

OP-3: 5 CCTGATCACC 3 Peso Molecular 2939 Pellet com 17 g 2939 g/l = 1 Molar 2939 g /1 x 10 3 l = 1mM 2939 g / 1 x 10-6 l 2939 g / 2 x 10-4 l = 1 M = 50 M

Se o frasco contm 17 g, para obter uma soluo 50 M, ento deve-se adicionar 116 l sobre o pellet. Os estoques de 50 M devem ser mantidos no freezer. Para a obteno dos estoques de trabalho dirio dilua-o de tal forma a obter uma concentrao de 2,5 M, ou seja 1/20. Ao adicionar 2,5 l da soluo de primer (2,5 M) na reao de RAPD de 25 l, a concentrao final de primer ser de 250 nM. Concentraes entre 200 a 400 nM so as mais usuais.

5. Mg ++: O magnsio um cofator da Taq polimerase. A concentrao deste cofator na reao pode variar, em geral, desde 1,0 at 4,0 mM. Convm otimizar para cada enzima e material biolgico, a concentrao mais adequada. O Magnsio vem na forma de MgCL2, acompanhando o tubo de enzima, em uma concentrao de 50 mM. conveniente reduzir a concentrao deste para 10 mM, por exemplo, uma vez que ocorre precipitao deste em pH alcalino (o tampo da reao tem pH em torno de 8,0) e em baixa temperatura. Verifique tambm, se o tampo da Taq j contm MgCl2. No caso afirmativo, acrescente somente o volume necessrio para obter a concentrao final desejada.

6. Taq DNA polimerase: este o componente mais caro da reao, variando de 30 at 60 centavos de dlar americano a unidade de enzima, dependendo do fabricante. A taq vem em tampo contendo glicerol, em concentraes de 5 unidades/ l. So usuais concentraes de 1, 1,5 e 2 unidades por reao.

32

7. DNA molde: os DNAs devem ser extrados, quantificados em gel de agarose, observando-se se h degradao ou no. Esporadicamente, devese verificar no gel, a integridade dos DNAs mantidos no freezer ou em geladeira. As diluies de uso (5ng/l) so feitas em H2O ou em 10 mM Tris-HCl. As concentraes de DNA genmico necessrias reao de amplificao na presena de primers arbitrrios (RAPD), varia em funo da espcie. Para a maioria das espcies a concentrao ideal est em torno de 25 ng.

Procedimento

A regio ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal incluindo o gene 5,8S ser amplificada atravs da reao PCR. Utilizar-se-o os primers ITS-1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS-4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC). A reao PCR ser feita num volume de 100 L, contendo 100 ng de DNA genmico, 1 M de cada primer, 1,25 U Taq DNA polimerase, 350 M de cada dNTP, 2,25 mM de cloreto de magnsio, tampo 1X e gua mili-Q (Tabela 1). O termociclador utilizado para a amplificao da regio ITS com os primers acima ser programado para um ciclo inicial de 940C por 3 minutos, seguido de 45 ciclos de 940C por 1 minuto, 560C por 1 minuto e 680C por 1 minuto, seguidos de 1 ciclo final de 680C por 10 minutos. Os produtos PCR sero revelados por eletroforese em agarose 1,5% (p/vol) em TAE 1X, a 65 volts, 90 miliamperes, por 2 horas, usando o marcador de peso molecular 100 bp. Utilizar-se- brometo de etdio 0,5 mg/mL e a visualizao do DNA ser feita em transiluminador de UV, sendo as imagens fotografadas em cmera digital. Na Tabela 1, h um quadro com os componentes da reao. Faa um exerccio calculando as concentraes finais com base nas concentraes estoque que sero utilizadas nesse protocolo.

33

Tabela 1. Reao de amplificao de DNA (PCR)

Componentes

Estoque comercial

Estoque laboratrio

do Volume

para

1 Concentrao final

reao (l)

gua Tampo DNTP Primer ITS-1 Primer ITS-4 Magnsio Taq polimerase DNA molde

10X 100mM cada 100 M 100 M 50 mM 5 U/ L 100

2. Reao RAPD
Na Figura 8, h um esquema do protocolo para RAPD. Para obteno de polimorfismos, ser utilizado o primer OPA-11 (CAATCGCCGT), onde os tubos de reao com 20 L contendo o primer e os demais reagentes (5 L primer 30 M, 2 L de tampo de reao 10X, 0,25 mM de cada um dos dNTPs, 0,4 L de enzima Taq DNA polimerase 5 U/L, 2 L MgCl2 25 mM, 5-20 ng de DNA genmico e gua mili-Q para completar o volume da reao), foram submetidos 45 ciclos de 920C por 1 minuto, 370C por 1 minuto, 720C por 3 minutos, seguidos de um ciclo final de extenso por 3 minutos. Os produtos RAPD sero revelados por eletroforese em agarose 1,5% (p/vol) em TAE 1X, a 65 volts, 90 miliamperes, por 3 horas, usando o marcador de peso molecular 1kb. Utilizar-se- brometo de etdio 0,5 mg/mL e a visualizao do DNA ser feita em transiluminador de UV, sendo as imagens fotografadas em cmera digital.

34

35

Na Tabela 2, h um quadro com os componentes da reao. Faa um exerccio calculando as concentraes finais com base nas concentraes estoque que sero utilizadas nesse protocolo. A Figura 9 traz fotos de gis de agarose gerados por PCR e RAPD.

Tabela 1. Reao de amplificao de DNA (RAPD)

Componentes

Estoque comercial

Estoque laboratrio

do Volume

para

1 Concentrao final

reao (l)

gua Tampo DNTP Primer OPA-11 Magnsio Taq polimerase DNA molde

10X 100mM cada 100 M 50 mM 5 U/ L 20

36

37

Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrio (RFLP)

Por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) entende-se, em uma traduo livre do termo, o polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA. Tal polimorfismo evidenciado pela fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio e observado

por hibridizao destes fragmentos com sequncias homlogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que desencadeiam uma reao de luminescncia. Para que polimorfismo seja detectado, necessrio que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas. Como a diferena em sequncias de nucleotdeos ao longo da fita de DNA de indivduos distintos potencialmente enorme, a deteco destas diferenas abre perspectivas relevantes ao estudo do genoma, naturalmente com implicaes em diversas reas de gentica (Figura 10). O polimorfismo observado na tcnica de RFLP ocorre porque o DNA de individuos geneticamente distintos difere na seqncia de nucleotdeos ao longo da fita. A presena ou ausncia de seqncias especificas de 4 a 8 pares de bases, reconhecidas e clivadas pelas enzimas de restrio, pode variar entre diferentes indivduos, gerando polimorfismo. Diferenas na seqncia de DNA dos individuospodem tambm resultar de inseres, delees ou outros rearranjos (translocaes, inverses) que alterem a distncia entre pares de stios de restrio. Ao ser submetido a clivagem com uma enzima de restrio, o DNA de indivduos geneticamente distintos cortado nos stios de restrio, gerando frangmentos de diferentes tamanhos. A base gentica do polimorfismo observado resulta assim de mutaes nos stios de restries ou de inseres, delees e rearranjosentre estes stios. Resumidamente, a idia da tcnica de RFLP pode ser apreendida de um exemplo simples. Tome-se dois indivduos distintos que tm o DNA extrado e submetido a clivagem por enzima de restrio. O uso da tcnica de RFLP visa detectar diferenas na seqncia de DNA dos dois indivduos. Uma maneira de se fazer isto sequenciar o DNA dos dois indivduos e comparar as

38

39

seqncias obtidas. Uma estratgia simples e relativamente rpida de se amostrar diferenas nas seqncias de DNA destes indivduos fazer o uso da tcnica de RFLP. Aps a extrao, o DNA dos indivduos tratado com enzimas de restrio, que o corta em um grande numero de pontos (stios de restrio), gerando uma enorme quantidade de fragmentos (da ordem de 104 a 107 , dependendo do tamanho do genoma). As diferenas na seqncia de DNA dos indivduos resulta na clivagem de fragmentos de tamanhos distintos, que so separados atravs de eletroforese em gel de agarose. As diferenas nos tamanhos dos fragmentos no podem ser visualizadas diretamente no gel, uma vez que os inmeros fragmentos que resultam do tratamento com enzimas de restrio ao serem separados pela eletrolise produzem o efeito de um arraste continuo no gel. Para efetuar a deteco dos marcadores RFLP, os fragmentos separados no gel de agarose pela eletroforese so transferidos para uma membrana de nylon (ou nitrocelulose) por capilaridade ou vcuo atravs de um processo denominado Southern Blot. Como a membrana de nylon colocada sobre o gel, a ordem dos fragmentos separados por eletroforese mantida na transferncia. A seguir, os fragmentos so fixados covalentemente na membrana atravs de alta temperatura em forno a vcuo ou com luz ultra-violeta, o que permite a reutilizao da membrana algumas vezes. Esta reutilizao importante pois facilita o trabalho de gerao de dados e quando maximizada, diminui significativamente o custo da tcnica. Por fim, a visualizao de fragmentos polimrficos entre os inmeros fragmentos transferidos para a membrana feita atravs da hibridizao de pequenos fragmentos clonados de DNA denominados sondas, com seqncias homologas do DNA imobilizado na membrana. Assim, somente os fragmentos fixados na membrana que so homlogos ao DNA da sonda sero visualizados entre os milhares de fragmentos resultantes do corte com enzima de restrio. Esta etapa da tcnica pode se comparada capacidade de se encontrar uma agulha no palheiro, visto que entre os milhes de fragmentos resultantes da clivagem do DNA, somente uns poucos fragmentos homlogos sonda so identificados. O detalhe que isso feito com sucesso atravs da hibridizao da sonda (que

40

pode ou no ter uma seqncia conhecida) com fragmentos homlogos na membrana. Para a preparao das sondas incorporam-se nucleotdeos contendo molculas de fsforo radioativo ou nucleotdeos modificados nos fragmentos clonados do DNA. Aps a hibridizao com as sondas, a membrana exposta a filme de raio X em um processo chamado autoradiografia, revelando bandas que constituem os marcadores RFLP. Estas bandas so produzidas como resultado da sensibilizao do filme pela emisso de partculas beta do fsforo radioativo, ou ftons de luz. Se os dois indivduos diferem entre si em relao posio do sitio de restrio enzimtica na fita de DNA, gerando fragmentos de tamanho distinto, a banda ser observada em posies diferentes na autoradiografia. Se caracterizada a segregao Mendeliana de tais bandas, conclui-se que elas representam um loco RFLP e, portanto, podem ser

utilizadas como marcador gentico. Segregao Mendeliana , em geral, evidenciada atravs da utilizao de populaes segregantes (F2,

retrocruzamento, etc).

Obteno de sondas para deteco dos marcadores RFLP

Os clones a serem utilizados como sondas podem ser obtidos de diferentes formas, as mais comuns so:

(1) atravs da transcrio reserva de mRNA do organismo em estudo, produzindo-se uma biblioteca de molculas de DNA complementar (cDNA library); (2) atravs de fragmentos de DNA genmico clonados ao acaso (genomic library); (3) atravs da amplificao via PCR de sequncias conhecidas utilizando primers especficos; (4) atravs de bandas RAPD selecionadas e obtidas de gel de eletroforese, e ampliadas via PCR.

41

Uma vez obtida uma coleo (biblioteca) de clones um passo importante no processo de analise de RFLP a seleo daqueles clones que sero utilizados como sondas. Neste processo objetiva-se selecionar os clones que possuam copia nica, ou seja, que no contenham seqncias de DNA repetitivo. Clones contendo DNA repetitivo hibridizam com vrios fragmentos na membrana o que resulta em borres no interpretveis na autoradiografia ou em padres de bandas mltiplas difceis de acompanhar do ponto de vista de distino dos locos, alelos e segregao Mendeliana. Por outro lado, sondas contendo seqncias moderadamente repetidas no genoma tornam-se muito teis quando o objetivo for a obteno de uma impresso digital gentica (genetic fingerprint), especifica para cada individuo. Populaes de cDNAs so intrinsicamente constitudas por uma grande maioria de clones de cpia nica. Por outro lado, bibliotecas genmicas no so, mas podem ser constitudas utilizando-se procedimentos especiais que favorecem o

enriquecimento com clones de cpia nica. Em geral, cada sonda detecta um loco, ocasionalmente mais do que um.

Procedimento Digesto do DNA 1. Descongelar as amostrar de DNA e colocar no gelo a Enzima EcoRI e o tampo da enzima. 2. Ligar banho-maria a 37 C. 3. Para cada reao adicionar: _ DNA (1g) ...................................4 L _ Enzima EcoRI (20U/L)...................1L _ 10X tampo EcoRI.2 L _ gua milli Q estril.........................13 L _ Volume final = 20 L

42

OBS. Preparar o mix utilizando somente a gua, a enzima e o tampo. Aliqotar o DNA separadamente em tubos de 0,5 mL devidamente identificados. Distribuir o mix em cada um.

4. Deixar os tubos over night a 37C

Preparo do gel e eletroforese 1. Preparar um gel de agarose 0,8% em TBE 0,5% para uma cuba grande. 2. Pulsar as amostras digeridas, retirar 10 L e adicionar 2 L do tampo de carregamento. 3. Carregar o gel com as amostras (12 L). 4. Utilizar marcador ladder1 kb (0,5 L marcador + 9,5 L gua mili-Q + 2 L tampo de carregamento. 5. Deixar 18 horas em eletroforese (30 V e 30 A).

Transferncia do DNA para membrana 1. Transferir para soluo de brometo de etdio (5 g/mL) por 10 min. 1. Lavar em gua mili-Q, e retirar a gua (5 X com gua). 2. Desnaturar DNA com soluo de desnaturao por 30 min a 24 rpm. 3. Drenar. 4. Neutralizar com soluo de neutralizao por 15 min a 24 rpm. 5. Repetir operao 3. 6. Fazer a transferncia do DNA para a membrana (por capilaridade) e deixar over night.

Soluo 10 X SSC: 500ml Soluo 2 X SSC: 200ml

a vidro da ponte

43

b papel 3 M mido em 10X SSC (tirar ar) c gel (tirar bolha) d membrana mida 2 X SSC (tirar bolha) f papel 3M 2 X SSC (raio X, nos 4 lados) f colocar 1 papel toalha, depois os papeis

7. Tirar a membrana e cort-la no canto para verificao do lado. 8. Deixar o DNA para cima sobre o papel 3M e colocar os grampos. 9. Secar a 10 mim a 68C com o DNA por cima, invertendo o lado que estava no gel 10. Fazer o Cross link (30 seg em luz UV)

Pr- Hibridizao 1. Colocar 2 tubos falcon com soluo de pr-hibridizao, a 68C.

2. Adicionar 20 ml 6 X SSC ( 6ml de 20X SSC adicionado de 14 ml de gua MilliQ) 3.Colocar a membrana no tubo maior, com o DNA para dentro 4.Mexer manualmente por 2 minutos. 5.Drenar. 6.Colocar soluo de pr-hibridizao (10 mL). 7.Incubar a 680C por 1 hora em circulao mdia.

Preparo da sonda 1. Colocar 200 L gua mili-Q + 18 L probe (pot 2, marcado na tampa). 2. Desnaturar sonda por 5 minutos em gua fervendo. 3. Colocar no gelo por 5 a 8 minutos e pulsar.

Hibridizao (Ne-Blot Phototope kit Biolabs) 1. Drenar a soluo do tubo com a membrana. 2. Colocar probe na soluo de hibridizao e deixar overnight. 3. Drenar a soluo do tubo com a membrana.

44

4. Colocar a soluo 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 680C para ser utilizada no dia seguinte. 5. Retirar a membrana do tubo e lavar com 2X SSC, 0,1% SDS por 12 minutos em bandeja, com agitao. 6. Drenar e repetir a lavagem, enrolar a membrana com o DNA para dentro com a membrana ainda na soluo. 7. Colocar a membrana no tubo, que estava no balano 0,1 X SSC, 0,1% SDS por 15 minutos a 680C. 8. Drenar e repetir. 8. Colocar wash I para preservar 2-3 dias no escuro 9. Retirar wash. 10. Seno, colocar a membrana em novo saquinho. 11.Colar o plstico deixando uma ponta para escoamento (fazer solues) 12. Colocar 9 ml blocking dentro do novo saquinho. 13. Mexer manuamente por 4 minutos. 14. Drenar (basto).

Deteco (Phototope - Star Detection kit Biolabs) 1.Preparar stretovadina (9ml blocking e 9uL de stretovadina) 2.Colocar no saquinho. 3. Mexer manualmente por 4 minutos, nos 4 lados. 4.Drenar (basto). 5.Colocar wash I (10% blocking), 200 mL. 6.Mexer mecanicamente por 5 minutos. 7.Drenar e repetir mais duas vezes a operao anterior, mudando os lados. 8.Drenar (basto). 9.Preparar alcaline phosphate (9 mL blocking e 9L alkaline phosphate). 10.Colocar o phosphate e mexer por 4 minutos manualmente. 11.Drenar. 12.Colocar wash II 200 mL por 4 minutos, mexer mecanicamente. 13.Repetir mais duas vezes a operao anterior. 14.Drenar (basto).

45

15. Preparar CDP (9 L CDP e 9 ml CDP buffer 1X) 16.Mexer 4 minutos manualmente, mudando o lado. 17.Drenar completamente. 18.Fechar o saco plstico. 19.Levar para fotografia e revelao.

9. ANALISE DOS RESULTADOS

Abordagem metodolgicas utilizadas no tratamento de dados gerados por RAPD

A principio, marcadores de RAPD podem ser tratados como alelos mendelianos. O fato desse marcador ser do tipo dominante faz com que a anlise das relaes de parentesco, entre organismos diplides, no possa ser conduzida a partir do clculo das frequncias allicas. Os dados de RAPD so de natureza binria (presena ou ausncia da banda) e requerem tratamento estatstico apropriado. Matrizes binrias so geradas, e a partir delas calculamse coeficientes de similaridade. Existem vrias medidas de similaridade. Os coeficientes de coincidncia simples e de Jaccard tm sido amplamente usados em anlises de dados gerados via RAPD. Esses coeficientes de similaridade medem o grau de concordncia entre duas unidades. O coeficiente de similaridade de coincidencia simples dado pela frmula S(SM) = a + d/a + b +c + d, enquanto o coinficiente de Jaccard pela formulao, S(J) = a/a + b + c. O valor de a corresponde ao numero de bandas presentes na unidade J e na unidade K; b o numero de bandas presentes na unidade K mas ausentes na unidade J; c o numero de bandas presentes na unidade J mas ausentes em K; d o numero de bandas ausentes em K e J. Portanto, a e d representam o numero de concordncias positivas e negativas,

respectivamente, enquanto b e c representam as discordncias. necessrio observar que o coeficiente de coincidncia mede o grau de concordncia entre

46

as unidades, levando-se em conta as concordncias negativas e positivas e positivas, enquanto o coeficiente de Jaccard desconsidera as concordncias negativas. O processo de agrupamento envolve basicamente duas etapas: a primeira relaciona-se com a estimao de uma medida de similaridade (ou dissimilaridade) entre as unidades taxonmicas, e a segunda, com a adoo de uma tcnica de agrupamento, a formao do grupo (Figura 11). Para facilitar o clculo dos coeficientes de similaridade deve-se construir uma matriz de dados, atribuindo-se valor 1 para a presena de banda a valor zero para a ausncia de banda. Quando o nmero de estimativas de medidas de similaridade grande, torna-se difcil o reconhecimento de grupos homogneos pela simples observao visual dessas estimativas. Os mtodos de agrupamentos hierrquicos permitem que as unidades sejam agrupadas por um processo que se repete em vrios nveis, at que seja estabelecido um dendrograma. Existem vrios mtodos de agrupamentos disponveis, e cabe ao pesquisador decidir qual o mais apropriado ao seu trabalho, uma vez que os diferentes mtodos podem levar aos diferentes padres de agrupamentos. No caso de anlise de dados de RAPD aplicados a problemas taxonmicos, o mtodo denominado UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetical averages) tem sido bastante utilizado. Dependendo do nmero de unidades e variveis (bandas), torna-se difcil a anlise de agrupamento sem o uso da informtica. Existem vrios programas de computador que realizam esse tipo de anlise. Um desses programas o Numerical taxonomy system of multivariate programs(NTSYS), desenvolvido para auxiliar pesquisas em taxonomia numrica.

47

48

10.BIBLIOGRAFIA

FERREIRA, M.E., GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. Braslia: EMBRAPA-CENARGEM, 1995. 220p.

FUNGARO, M.H.P., VIEIRA, M.L.C. Aplicaes da PCR em ecologia molecular. In: MELO, I.S., AZEVEDO, J.L. Ecologia microbiana. Jaguarina:

EMBRAPA-CNPMA, 1998. p.205-227.

KREUZER, H., MASSEY, A . Engenharia gentica e biotecnologia. Porto Alegre: ARTMED, 2002. 434p.

SAMBROOK, J., RUSSELL, D.W. Molecular cloning. A laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor, 2001 (volumes 1, 2 e 3)

WELSH, J., McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res., v.18, p.7213-7218, 1990.

WILLIAMS, J.G., KUBELIK, A.R., LIVAK, K.J., RAFALSKI, J.A ., TINGEY, S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., v.18, p.6531-6535, 1990.

49

11.PREPARO DE SOLUES

Solues para extrao de DNA

Soluo estoque de Tris-HCl 1M A soluo foi preparada dissolvendo-se 121,10g de Trizma base (Tris [hidroximetil] amino metano) (Sigma: T-1503) em aproximadamente 800mL de gua bidestilada (Milli-Q). O pH foi ajustado para 8,0 ( ou 7,5, quando necessrio), com HCl concentrado (aproximadamente 40mL) e o volume final completado para 1000mL com gua bidestilada. A soluo foi distribuda em frascos (100mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados temperatura ambiente.

Soluo estoque de NaCl 5M A soluo foi preparada dissolvendo-se 292,24g de NaCl em 1000mL de gua bidestilada (q.s.p.). A soluo foi distribuda em frascos (100 mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados temperatura ambiente.

Soluo estoque de EDTA 0,5 M (pH 7,5 ou 8,0) A soluo foi preparada dissolvendo-se 186,10g de EDTA (Sigma: E-5134) em 800mL de gua bidestilada, sendo a mesma titulada com NaOH slido (aproximadamente 20,00g) at atingir o pH desejado (7,5 ou 8,0). Aps a dissoluo completa do EDTA, o volume foi completado para 1000mL com gua bidestilada. A soluo foi distribuda em frascos (100mL por frasco), os quais foram esterilizados e estocados temperatura ambiente.

SDS 10% (detergente) A soluo foi preparada dissolvendo-se 10g de SDS em aproximadamente 80mL de gua bidestilada aquecida. Aps a dissoluo completa do SDS, a soluo foi resfriada e o volume completado para 100mL com gua bidestilada.

50

A soluo foi estocada temperatura ambiente, no sendo necessria a esterilizao. ( O SDS precipita ao ser colocado em refrigerador).

Fenol Saturado Foram dissolvidos 50,00g de fenol cristalizado (Synth) em banho- maria a 65C durante 5 a 6 horas e adicionando um volume de tampo Tris HCl 0,5 M pH 8,0. A soluo foi submetida a agitao durante 30 minutos, a fim de equilibrar o pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M pH. A fase aquosa foi retirada e o procedimento repetido com Tris HCl 0,1 M pH 8,0. Em seguida, foi adicionado 1/10 do volume final de tampo Tris HCl 0,1 M pH 8,0 e estocado em frasco escuro a 4 C.
1-

Remover o fenol do freezer. Esperar atingir a temperatura ambiente. Derret-lo (50g) em banho-maria (65C) dentro de um bquer. Manter o frasco com a tampa levemente fechada. Ao fenol liquefeito, adicionar o volume igual de Tris HCl 0,5 M pH 8,0. Colocar em erlenmeyer.

2-

3-

Agitar a soluo em agitador magnetico por 30 minutos para equilibrar o pH. Cobrir o frasco todo com papel aluminio para evitar a oxidao do fenol. Aps 30 minutos, desligar o agitador e transferir o fenol para uma proveta. Quando as duas fases se separarem, aspirar a fase aquosa superior (TrisHCl 0,5 M) e descart-la.

4-

Repetir o procedimento com Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. Aps a separao a fase aquosa ficou em cima e a fenolica embaixo.

5-

Repetir o procedimento at a fase fenlica apresentar pH> que 7,8. Utilizar o papel medidor de pH.

6-

Remover a fase aquosa final. Adicionar 1/10 volume de Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 e hidroxiquinolina a 0,1% do volume de fenol. Estocar a 4 C em frasco escuro.

TRIS HCl 0,5 M Ph 8,0 - Diluiu-se a soluo de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em gua bidestilada na proporo de 1:1.

51

TRIS HCl 0,1 M pH 8,0 - Diluiu-se a soluo de TRIS-HCl 1M pH 8,0 em gua bidestilada na proporo de 1:10.

CLOROFANE Este foi obtido a partir da mistura de um volume de fenol a aproximadamente um volume de clorofrmio e lcool isoamlico (25:24:1).

ETANOL 70% lcool Etlico....................................................342mL gua destilada..................................................58mL

TAMPO TRIS-EDTA (TE) TRIS-HCl 1M pH 7,5.........................................10mL EDTA 0,5M pH 8,0............................................ 2mL O volume foi completado para 1000 mL com gua bidestilada e a soluo esterilizada.

RNase A RNase pancreatica (RNase A) foi preparada na concentrao de 10mg/mL, em 10mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 15 mM de NaCl. A soluo foi aquecida em banho-maria a 98 C por 15 minutos e estocada a -20 C.

Tris-HCl 10mM=Tris-HCl 0,01M Tris-HCl 1MTris-HCl 0,01 M (diluir 100x) = 1mL de Tris-HCl 1 M + 99mL de gua bidestilada

NaCl 15 mM = NaCl 0,015 M Na Cl 1M NaCl 0,015 58,45g 0,877g em 1000,00 mL 0,00877g de NaCl em 10,00mL de Tris-HCl 0,01M

52

0,01g de RNase em 1,0mL de soluo Tris-HCl/NaCl

Solues para eletroforese

Soluo Estoque de brometo de Etdio - 10mg/mL Foi dissolvido 1% (p/v) de brometo de etdio em gua destilada, agitado durante 1 hora e estocado temperatura ambiente ou refrigerador em um frasco mbar. No momento do uso, 3L desta soluo foram adicionados 100mL de tampo TEB 1X.

Brometo de etdio: 1% = 1g em 100,00mL de gua destilada = 0,01g/mL = 10mg/mL Em 1,0mL de gua destilada, teremos 0,01g ou 10mg de brometo de etdio

TAMPO TRIS-BORATO-EDTA (TBE) - 10X - Tampo de Corrida Trisma base.....................................................108g cido Brico.................................................... 55g EDTA 0,5 M (pH 8,0)...................................... 40mL O volume foi acertado para 1000mL com gua destilada, deionizada e filtrada em filtro Milli-Q (gua Milli-Q). o tampo foi autoclavado e mantido a 4C. No momento do uso, o mesmo foi diludo com gua Milli-Q para a obteno da concentrao desejada.(0,5X ou 1,0X). TEB 1X Diluir o tampo TEB 10X na proporo de 1:10 em gua Milli-Q. 1volume de tampo TEB 10X : 9 volumes de gua Milli-Q. 100mL de tampo TEB 10X : 900mL de gua Milli-Q. 200mL de tampo TEB 10X : 1800mL de gua Milli-Q.

53

TAMPO DE AMOSTRA Este tampo foi preparado a partir de uma soluo de glicerol 30% em gua destilada, qual adicionou-se azul de bromofenol (0,25%), sendo a soluo final estocada sob refrigerao. No momento de uso, um volume deste tampo ( equivalente a 10% do volume da amostra a ser aplicada no gel de agarose) colocado sobre papel parafilm, e a esse adicionado o volume correspondente a amostra. Ambos so homogeneizados e aplicados na canaleta do gel de agarose com uma micropipeta. Exemplo: amostra a ser aplicada no gel de agarose - 20,0L tampo de amostra - 2,0L

GEL DE AGAROSE 0,8% (para verificar a integridade do DNA) Agarose (Sigma A-0169/Pharmacia/GIBCO)........................0,8g TEB 1X.............................................................................100mL

Pesar a agarose em um Erlenmeyer e dilu-la em tampo TEB 1X. Ferver no microondas durante aproximadamente 3 minutos (ou mais) na potncia mdia, pausando a cada 30 segundos, agitando levemente o frasco, a fim de homogeneizar a agarose. OBS: Medir o peso antes e aps a fervura. Corrigir o peso, completando com gua Milli-Q. OBS: A agarose dissolvida (aps a fervura) deve ser resfriada at 50-60 C, e a seguir, vertida sobre a placa de eletroforese. Deixar a agarose se polimerizar temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.

54

Solues para hibridizao

1- Tampo de Desnaturao (0,5 N NaOH; 1,5 M NaCl), para 1 Litro:

20,0 g NaOH 87,66 g NaCl Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ e completar o volume p/ 1 Litro.

2- Tampo de Neutralizao (1 M Tris-Cl; 1,5 M NaCl), para 1 Litro:

121,14 g Tris-Cl, pH 7,5 (Tris-base) 87,66 g NaCl Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 7,5 com HCl e completar o volume para 1 Litro.

3- 20X SSC (3 M NaCl; 0,3 M Citrato de sdio), para 1 Litro:

175,3 g NaCl 88,2 g Citrato de Sdio Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 7,0 com HCl, completar o volume para 1 Litro e autoclavar.

4- Washing Buffer I (10% de Blocking Solution), p/ 1 Litro:

100 mL Blocking Solution 900 mL de H2O MilliQ

5- 10X Washing Buffer II (100 mM Tris-Cl; 100 mM NaCl; 10 mM MgCl2), p/ 1 Litro:

12,1 g Tris-Cl (Tris base)

55

5,8 g NaCl 2,0 g MgCl2 Dissolver em 800 mL de H2O MilliQ, ajustar pH 9,5 com HCl, completar o volume para 1 Litro. Estocar 4 C.

6- Blocking Solution (5% SDS; Phosphate, pH 7,2{17 mM Na2HPO4, 8 mM NaH2PO4};125 mM NaCl), para 1 Litro:

7,3 g NaCl 2,4 g Na2HPO4 (dibsico) 1,0 g NaH2PO4 ( monobsico) 50 g SDS Dissolver em 800 mL de H2O e ajustar o volume para 1 Litro.

7 - 0,1 X SSC, 0,1 % SDS, p/ 1 Litro:

10 ml SDS 10 % 5 ml 20 X SSC Completar para 1 Litro com H2O MilliQ.

8- 2 X SSC, 0,1% SDS, p/ 1 Litro:

100 ml 20 X SSC 10 ml SDS 10 % Completar para 1 Litro com H2O MilliQ.

9- 0,4 N NaOH, 0,1% SDS, p/ 1 Litro:

16 g NaOH 1 g SDS (ou 10 mL da soluo SDS 10%) Completar o volume para 1 Litro com H2O MilliQ.

56

10- 0,2 M Tris-HCl, 0,1X SSC, p/ 1 litro:

200 mL Tris-HCl, pH 7,5 (tris base) 5 mL 20X SSC Completar o volume para 1 Litro com H2O MilliQ.

11- 4 M LiCl (Cloreto de ltio), p/ 100 mL:

17 g Cloreto de ltio Dissolver em 80 mL de H2O MilliQ, completar o volume p/ 100 mL. Autoclavar e guardar na geladeira (4 C).