2013 Guia Pratico Biologia Celular Versao OnLine

GUIA PRTICO DE BIOLOGIA CELULAR
Ana Cristina da Silva Figueiredo, Luis Manuel Gaspar Pedro, Jos Manuel Gonalves Barroso, Maria Margarida Moutinho Giro de Oliveira
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL
GUIA PRTICO DE BIOLOGIA CELULAR
Por: Ana Cristina da Silva Figueiredo Luis Manuel Gaspar Pedro Jos Manuel Gonalves Barroso Maria Margarida Moutinho Giro de Oliveira
Figura da capa: Plasmlise em epiderme da pgina adaxial da ptala de Hibiscus rosa-sinensis L. (Malvaceae)
Os autores agradecem a todos quantos, directa- ou indirectamente, ajudaram na redao final deste Guia Prtico. Uma palavra particular de agradecimento ao Prof. Dr Ricardo Melo do Departamento de Biologia Vegetal da Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa pela valiosa contribuio na actualizao do captulo 2. Diversidade Celular.
FICHA TCNICA
Ttulo: Guia Prtico de Biologia Celular
1 Edio, Sebenta de Citologia Prtica, Lisboa, 1989 (edio dos Autores) 2 Edio, Sebenta de Citologia Prtica, Lisboa, 1992 (edio da Associao dos Estudantes da Faculdade de Cincias de Lisboa, AEFCL) 3 Edio, Sebenta de Citologia Prtica, Lisboa, 1994 (edio da AEFCL) 4 Edio, Citologia (Prtica), Lisboa, 1996 (edio da AEFCL) 5 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 1997 (edio da AEFCL) 6 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 1997 (edio da AEFCL) 7 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 1998 (edio da AEFCL) 8 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 1999 (edio da AEFCL) 9 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 2003 (edio da AEFCL) 10 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 2003 (edio da AEFCL) 11 Edio, Guia Prtico de Biologia Celular, Lisboa, 2004 (edio da AEFCL)
Autores: Ana Cristina da Silva Figueiredo Luis Manuel Gaspar Pedro Jos Manuel Gonalves Barroso Maria Margarida Moutinho Giro de Oliveira
Edio: Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal.
Composio, Impresso e Acabamentos: Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal.
Tiragem: 1 Edio, Lisboa, Maio de 2013 verso pdf online e verso impressa
ISBN: 978-989-20-3852-0 ISBN: 978-989-20-3850-6
Guia Prtico de Biologia Celular
NDICE
1. MICROSCOPIA PTICA ........................................................................................................................................... 3 1.1. Microscpio ptico ................................................................................................................................. 3 1.1.1. Componentes do Microscpio ptico ............................................................................................... 4 1.2. Tipos de Microscpio ptico ................................................................................................................. 6 1.2.1. Microscpio de fundo escuro ............................................................................................................ 7 1.2.2. Microscpio de contraste de fase ..................................................................................................... 7 1.2.3. Microscpio de interferncia ou de Nomarski .................................................................................. 8 1.2.4. Microscpio de fluorescncia ........................................................................................................... 9 1.2.5. Microscopia confocal ...................................................................................................................... 10 1.3. Como utilizar o microscpio ................................................................................................................ 11 1.4. Medies em preparaes microscpicas ......................................................................................... 11 2. DIVERSIDADE CELULAR ....................................................................................................................................... 13 2.1. Procariotas ............................................................................................................................................. 14 2.1.1. Bacteria ........................................................................................................................................... 17 2.1.2. Archaea ........................................................................................................................................... 19 2.2. Eucariotas............................................................................................................................................... 19 2.2.1. Protistas .......................................................................................................................................... 22 2.2.2. Fungos ............................................................................................................................................ 27 2.2.3. Animais ........................................................................................................................................... 28 2.2.4. Plantas ............................................................................................................................................ 28 3. A CLULA........................................................................................................................................................... 29 3.1. Parede celular ........................................................................................................................................ 29 3.1.1. Alteraes qumicas da parede celular .......................................................................................... 32 3.2. Matriz extracelular nas clulas animais .............................................................................................. 37 3.2.1. A diversidade celular nos diferentes tecidos animais..................................................................... 39 3.3. Membrana plasmtica ........................................................................................................................... 42 3.4. Movimentos de ciclose ......................................................................................................................... 45 3.5. Vacolos e Incluses vacuolares ........................................................................................................ 45 3.5.1. Contedo vacuolar .......................................................................................................................... 46 3.6. Plastos .................................................................................................................................................... 51 3.6.1. Cloroplastos .................................................................................................................................... 51 3.6.2. Leucoplastos ................................................................................................................................... 53 3.6.3. Amiloplastos .................................................................................................................................... 54 3.6.4. Cromoplastos .................................................................................................................................. 54 3.6.5. Proteoplastos .................................................................................................................................. 55 3.7. Ncleo ..................................................................................................................................................... 55 3.7.1 Ciclo celular...................................................................................................................................... 57 3.7.2. Mitose .............................................................................................................................................. 57 3.7.3. Meiose............................................................................................................................................. 59 4. MICROSCOPIA ELECTRNICA DE VARRIMENTO E DE TRANSMISSO ........................................................................ 63 4.1. Microscopia electrnica de transmisso ............................................................................................ 63 4.1.1. Fixao............................................................................................................................................ 65 4.1.2. Lavagens......................................................................................................................................... 65 4.1.3. Desidratao ................................................................................................................................... 66 4.1.4. Impregnao e Incluso.................................................................................................................. 66
Guia Prtico de Biologia Celular 4.1.5. Seccionamento ............................................................................................................................... 66 4.1.6. Contrastao .................................................................................................................................. 66 4.2. Microscopia electrnica de varrimento .............................................................................................. 66 4.2.1. Secagem ao ar ............................................................................................................................... 67 4.2.2. Criossecagem ................................................................................................................................. 68 4.2.3. Secagem pelo mtodo do ponto crtico .......................................................................................... 68 4.2.4. Metalizao ..................................................................................................................................... 69 5. PROTOCOLOS ..................................................................................................................................................... 71 6. APNDICE .......................................................................................................................................................... 95 7. BIBLIOGRAFIA..................................................................................................................................................... 98 8. INDICE REMISSIVO............................................................................................................................................... 99
II
1. MICROSCOPIA PTICA 1.1. Microscpio ptico

Instrumento de trabalho de numerosos cientistas, desde h mais de trs sculos, o microscpio tem permitido observar diversos objectos e organismos no perceptveis vista desarmada. Esta capacidade deve-se a um sistema ptico, composto por lentes, que fornece uma imagem ampliada do objecto. Foi no sculo XVII que a construo e o aperfeioamento do microscpio, em particular o sistema de lentes, conheceu a sua maior expanso. Anton van Leeuwenhoek e Hans e Zacharias Jansen, fabricantes de culos, desenvolveram os primeiros microscpios simples e compostos. Leeuwenhoek foi um dos primeiros a registar observaes feitas num microscpio simples, que constava de uma lente que se segurava com a mo e se dirigia para a fonte luminosa para que a luz atravessasse a lente e o objecto. So ainda de destacar os trabalhos de Campani (l662), Hooke (l665) e Divini (l668). No microscpio de Hooke o objecto era fixo por um grande alfinete e a luz fornecida por uma lamparina de azeite. O sistema de lentes permitia uma ampliao de 270x.
Mquina fotogrfica
Oculares Objectivas Platina Parafusos de focagem Condensador Base
Fig. 1.1. Representao esquemtica de um microscpio ptico.
At ao sculo XIX, os fabricantes no conseguiam obter lentes que no decomposessem a luz. Este fenmeno, conhecido como aberrao cromtica, levava a que se obtivesse uma imagem colorida imprecisa. S em 1830 se construiram as primeiras lentes acromticas. O outro defeito muito comum nas lentes, a aberrao esfrica, s viria a ser corrigido anos mais tarde com Ernst Abbe e Carl Zeiss (l886), que produziram as primeiras lentes apocromticas, capazes de corrigir no s as aberraes cromticas como as esfricas. Nas ltimas dcadas do sculo XIX, os microscpios comearam a assumir o aspecto que tm hoje. As grandes verses compostas passaram a exigir dos fabricantes melhorias significativas ao nvel do sistema de iluminao. Assim, em 1893, August Khler introduziu um novo sistema de iluminao, cujo princpio ainda hoje utilizado. O desenvolvimento e o aperfeioamento tecnolgicos tm permitido a construo de instrumentos de elevado poder de resoluo e ampliao. O microscpio hoje um instrumento de trabalho de aplicaes to diversas como a biologia, electrnica ou a metalurgia.
Guia Prtico de Biologia celular
1.1.1. Componentes do Microscpio ptico

P ou base Brao Tubo ou canho Platina ou porta-objectos com pinas e nnios Revlver ou porta-objectivas Parafuso macromtrico Parafuso micromtrico Sistema de Iluminao Fonte luminosa Condensador Parte ptica Objectivas Sistema de Ampliao Oculares Apocromticas Imerso Parafocais
Parte Mecnica
A microscopia pode ser definida como the art and science of making fine detail visible. Esta definio acarreta conceitos importantes para os utilizadores de microscpios: ampliao, resoluo, contraste e medio. A ampliao relaciona a dimenso da imagem do objecto com a sua dimenso real. A resoluo de um microscpio corresponde capacidade de separar dois pontos to prximos quanto possvel um do outro. O contraste corresponde a acentuar as diferenas entre os constituintes da preparao de modo a fazer sobressair uns em relao aos outros. Finalmente, fazendo uso de uma correcta ampliao, resoluo e contraste, possvel ao utilizador fazer medies precisas, vlidas e reprodutveis do objecto em estudo. Num microscpio de luz visvel, os raios de luz da fonte de iluminao so concentrados, sobre o espcime a observar, atravs de uma lente condensadora, Fig. 1.1. Os raios luminosos que atravessam o espcime so focados, numa imagem ampliada, por duas lentes colocadas nas extremidades opostas do tubo ou canho, Fig. 1.1. A lente mais perto do espcime designada objectiva e a da extremidade oposta a ocular. Com o auxlio de parafusos de ajuste grosseiro e/ou fino possvel mover o espcime de molde a coloc-lo na posio correcta para se poder focar. A posio do condensador pode ser igualmente ajustada por forma a convergir a luz sobre o espcime, Fig. 1.1.
Objectiva
leo de imerso Lamela a b
Fig. 1.2. Abertura da objectiva. a) Empregue a seco. b) Empregue com imerso num lquido com ndice de refraco idntico ao do vidro (n = 1,51). Os fotes no sofrem refraco pelo que o ngulo do cone til superior ao de a).
A resoluo de um microscpio depende de dois factores: 1) do comprimento de onda da
radiao empregue () e 2) da abertura numrica da objectiva (que condiciona o grau de luminosidade). O poder de resoluo ou separao do olho humano varia de pessoa para pessoa. Normalmente, a uma distncia de trabalho de 25cm, est apto a resolver dois pontos que distem, entre si 0,25mm. Quando a distncia entre os dois pontos superior, distingue-se o espao entre eles; quando inferior os dois pontos aparecem como um s. Como o olho humano no detecta luz com comprimento de onda inferior a 400nm, no possvel, recorrendo ao microscpio ptico, obter uma resoluo superior a 0,17 m. Isto quer dizer que, com o microscpio, no se distinguem, separadamente, dois pontos cuja distncia entre si seja inferior a 0,2 m (na prtica, o limite de resoluo do microscpio ptico de cerca de 0,5 m). Do ponto de vista experimental, no possvel distinguir dois pontos cuja distncia entre eles seja inferior a metade do comprimento de onda da radiao utilizada. O outro factor, que afecta o poder de resoluo do microscpio, a abertura numrica da objectiva. Quando uma objectiva possui uma lente frontal (lente da objectiva que fica mais prxima prxima da platina) de pequenas dimenses e elevado poder de ampliao, a quantidade total de luz que a atravessa muito inferior que atravessaria a lente frontal de uma objectiva de menor poder de ampliao. Adicionalmente, quando se trabalha com lentes de maior poder de ampliao, a distncia de trabalho (distncia entre a lente frontal e a lamela que cobre o objecto em foco) inferior utilizada para objectivas de menor poder de ampliao. Por outro lado, como a luz refractada pela camada de ar existente entre a lmina e a objectiva, o ngulo do cone de luz til que atinge a objectiva menor do que seria se esse fenmeno no se verificasse, Fig. 1.2. Da resulta a perda de luminosidade observada quando, por exemplo, se passa da objectiva de 40x para a de 100x. Este problema pode ser obviado se se utilizar, entre a lmina e a objectiva, uma substncia transparente (normalmente leo de cedro) com ndice de refraco idntico ao do vidro da lmina. Quando se procede imerso da objectiva num lquido com ndice de refraco 1,51, os raios que atravessam a preparao no so refractados, o que determina um maior ngulo do cone de luz til, Fig. 1.2. O poder de separao do microscpio , neste caso, superior, como pode verificar-se pela frmula de Abbe: Limite de resoluo () = 0,6. / n . sen em que:
o comprimento de onda, que, para a luz vsivel, 0,4 a 0,7m, isto , para o microscpio ptico o constante e 0,5, 0,6 uma constante que reflecte o grau de sopbreposio de dois pontos que ainda podem ser visualizados separadamente, n . sen a abertura numrica da objectiva (numa boa objectiva o seu valor de 1,4), n o ndice de refraco do meio = velocidade no ar / velocidade no material ex. ndice de refraco do vidro = Velocidade da luz no ar / velocidade da luz no vidro = 300000km.s / 200000km.s = 1.5 ar = 1,0; gua = 1,33; vidro = 1,5; leo = 1,51 ou blsamo do Canad = 1,53 o semi-ngulo com vrtice no cone formado pelos raios, que saindo da preparao, atingem a lente frontal da objectiva e depende da largura da lente e da sua distncia ao espcime (numa boa objectiva o seu valor de 70, o que d um sen 0,94). A ptica dos microscpios pode criar artefactos de imagem designados por aberraes, que podem ser de dois tipos: cromticas e esfricas. A aberrao cromtica deve-se ao diferente grau de refraco dos diversos componentes da luz, de tal modo que se criam orlas coloridas na extremidade do material, Fig. 1.3.a. A aberrao esfrica uma consequncia dos diferentes ngulos dos raios luminosos emergentes da lente, Fig. 1.3.b. Ambos os tipos de aberraes so
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corrigidos por um conjunto de lentes existentes no interior da objectiva, destinadas a compensar aberraes especficas (por ordem de complexidade crescente de correco: lentes acromticas, de fluorite e apocromticas). Diferentes tipos de microscpios pticos so correntemente utilizados no estudo de vrios aspectos da estrutura celular, o mais simples dos quais o microscpio de campo claro. O grau de visibilidade depende, neste caso, da capacidade do material refractar a luz diferentemente do meio circundante, Fig. 1.8. A visibilidade do material , correntemente, designada por contraste, isto , o aspecto diferente apresentado por zonas adjacentes do material, ou entre o material e o meio de montagem. Uma das maneiras mais eficazes de tornar um material, naturalmente fino e translcido, visvel em microscopia ptica, cor-lo com reagentes que absorvem s determinados comprimentos de onda dentro do espectro do visvel. Os comprimentos de onda que no so absorvidos so transmitidos ao observador, de tal modo que o material aparece corado. Diferentes reagentes marcam diferentes molculas biolgicas e, como tal, no s aumentam a visibilidade do material, como podem tambm indicar onde certos constituintes se encontram nas clulas ou nos tecidos, isto , permitem fazer uma caracterizao histoqumica.
Vermelho Verde Azul Azul Verde Vermelho
a)
b) Fig. 1.3. Tipos de aberraes. a) cromtica, b) esfrica.
A utilizao destes reagentes pe, no entanto, um grande problema: na sua maioria no podem podem ser utilizados em clulas vivas. Isto deve-se a vrios factores: em muitos casos a sua utilizao pressupe uma fixao prvia do material, com lcool, cido actico ou formaldedo, para preservar as estruturas celulares; os reagentes so, normalmente, txicos, mesmo a baixas concentraes; as condies de reaco no preservam a integridade celular (alguns reagentes no penetram a membrana celular e requerem aquecimento e/ou um tratamento prvio em cido para facilitar a penetrao). Um nmero reduzido de reagentes, designados corantes vitais, preservam a integridade celular, mas so, contudo, de utilizao limitada. Nas condies experimentais em que no se deve alterar a viabilidade celular, possvel recorrer a diferentes tipos de microscpios pticos que convertem as variaes de densidade ou espessura entre zonas adjacentes do material em diferenas de contraste, que aumentam a qualidade da imagem final.
1.2. Tipos de Microscpio ptico

Embora muitas regies do material biolgico no corado sejam transparentes, elas possuem diferentes densidades e, consequentemente, ndices de refraco diferentes. Assim, os raios luminosos atravessam estas regies a velocidades muito diversas, sofrendo refraces em diferente grau, Fig. 1.4. Existem, deste modo, diferenas ntidas entre as fases dos raios luminosos que atravessam um objecto e as dos que passam junto aos seus bordos, ou seja, na interface onde se verifica a alterao do ndice de refraco. Na prtica, os raios luminosos que passam pelos componentes celulares de maior ndice de refraco, so retardados cerca de 1/4 de comprimento de onda, e so mais refractados que os raios luminosos que atravessam
componentes com menor ndice de refraco. Existem diferentes tipos de microscpios pticos, de aplicaes vrias, que tiram partido de fontes luminosas e modos de formao de imagem diversos.
Fig. 1.4. Os raios luminosos so retardados diferentemente ao passarem pelos vrios constituintes celulares.
1.2.1. Microscpio de fundo escuro

No microscpio de fundo escuro existe um condensador especial, com um disco opaco na sua zona central, que orienta a luz de forma oblqua, Figs. 1.5 e 1.8. Assim, a luz s atinge as lentes da ocular se for desviada pelo objecto em observao. Daqui se infere que s os objectos com ndice de refraco diferente do do meio circundante faro chegar a luz ocular, isto , neste mtodo a periferia do objecto aparece brilhante sobre um campo escuro circundante. Refira-se, a ttulo de exemplo, que microtbulos com um dimetro de 25nm podem ser visualizados por este processo, e que as bactrias aparecem, neste microscpio, como pequenos pontos brilhantes em fundo escuro. Tambm cristais, grnulos de prata e paredes celulares, entre outros, podem ser visualizados deste modo, mas porque as poeiras tambm reflectem a luz, as lminas tm de estar particularmente limpas e isentas de riscos.
Objectiva Raios reflectidos Raios oblquos Espcime Condensador
a)
Disco opaco
b)
Fig. 1.5. a) Representao esquemtica do microscpio de fundo escuro e b) observao de bactrias com o microscpio de fundo escuro.
1.2.2. Microscpio de contraste de fase

O microscpio de contraste de fase permite uma melhor observao de espcimes sem qualquer colorao porque converte as diferenas de ndice de refraco dos diversos consituintes consituintes celulares, Fig. 1.4, em diferenas de intensidade luminosa visveis aos microscpio. Este tipo de microscpio possui um condensador especial provido com uma placa circular com
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diversos anis, Figs. 1.6 e 1.8. Os anis so de vidro opaco, mas incluem um anel central de vidro transparente que permite a passagem dos raios luminosos menos refractados. Os anis de vidro opaco tm um revestimento e uma espessura tal que retardam, adicionalmente, os raios mais refractados de 1/4 de comprimento de onda. Tais diferenas acentuam o contraste entre o objecto em observao e o meio circundante.
Raios difractados Placa de fase Objectiva Anis complementares
Espcime
Anel de fase Condensador
Fig. 1.6. Representao esquemtica do microscpio de contraste de fase.
Analizador
Prisma Objectiva Espcime Condensador de contraste de interferncia com prisma Polarizador
Fig. 1.7. Representao esquemtica do microscpio de contraste de Nomarski.
1.2.3. Microscpio de interferncia ou de Nomarski

A microscopia de Nomarski (equivalente a DIC, differential interference contrast), uma tcnica excelente para observar material biolgico, no s pelo elevado contraste conseguido, mas tambm pela tridimensionalidade que se obtm. Uma outra vantagem deste tipo de microscopia a de permitir observar materiais mais espessos, sem pr os mesmos problemas que a microscopia de contraste de fase, Figs. 1.7 e 1.8. Este microscpio utiliza luz polarizada e dois filtros separadores de modo que produz efeitos de de sombra que do particular relevo s extremidades das diferentes estruturas do material (membranas, ncleo, organitos, parede celular, etc.). Outra caracterstica interessante deste microscpio que os objectos podem aparecer corados, mesmo sem colorao prvia e apesar
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de se utilizar luz branca na iluminao.
a)
b)
c)
d)
Fig. 1.8. Comparao de imagens obtidas a) com um microscpio ptico normal, b) com contraste de fase, c) com contraste de Nomarski e d) de fundo escuro.
Vermelho Filtro de emisso Filtro de excitao Verde Espelho dicrico Fonte luminosa
Objectiva
a)
Espcime
b)
Fig. 1.9. a) Representao esquemtica do microscpio de fluorescncia. A cheio representa-se o exemplo de luz seleccionada, o verde. A tracejado representa-se a luz de maior comprimento de onda emitida pelo espcime, o vermelho. b) Corte transversal de um caule observado com microscpio de fluorescncia.
1.2.4. Microscpio de fluorescncia

Neste microscpio utiliza-se uma lmpada de mercrio de elevada presso que emite radiao entre 600nm e 300nm, Figs. 1.9 e 1.11. Na zona frontal da lmpada est colocado um sistema de filtros, que permite seleccionar o comprimento de onda desejado (ultra-violeta, azul, ou verde). Depois de passar pelos filtros, a luz de comprimento de onda seleccionado, atinge um espelho especial, espelho dicrico, que tem a propriedade de reflectir a luz de determinados comprimentos de onda e transmitir outros. Este espelho reflecte a luz seleccionada, que incide depois no espcime. As substncias fluorescentes emitem luz num comprimento de onda mais longo, que atravessa o espelho, e atinge a objectiva (ex. um espelho dicrico de 420nm reflecte toda a luz azul e UV, mas atravessado por luz de comprimentos de onda superiores - fluorescncia verde, amarela e vermelha). Para que a luz ultra-violeta se possa propagar, necessrio que os condensadores da lmpada e do microscpio sejam de quartzo. Em alguns casos convm, igualmente, utilizar porta-objectos de quartzo.
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Com este tipo de microscpio pode detectar-se a presena de substncias que emitam luz visvel quando irradiadas com luz ultra-violeta. Muitas substncias podem manifestar fluorescncia fluorescncia natural, designada autofluorescncia. Outras h, porm, que, para se detectar a sua presena, necessrio faz-las reagir com compostos fluorescentes (ou tornados fluorescentes aps reaco), os fluorocromos. Neste caso, a fluorescncia induzida.
1.2.5. Microscopia confocal

As clulas so, em muitos casos, suficientemente delgadas para serem consideradas aproximadamente bidimensionais, requerendo, como tal, uma capacidade de foco reduzida para observar tudo o que h para ver. Contudo, quando se est interessado nas inter-relaes das estruturas celulares necessrio obter uma informao tridimensional. H dois mtodos de obter este tipo de imagem em microscopia. Um corresponde a cortar fisicamente o material em seces finas, observar cada uma delas, e juntar as imagens obtidas para reconstruir a estrutura no seu todo. O outro, desenvolvido mais recentemente, corresponde a uma reconstruo de seces pticas, que utiliza a microscopia confocal. Com este segundo mtodo possvel observar, no s seces finas, mas tambm clulas vivas.
Detector Imagem focada Abertura confocal Imagem desfocada impedida de chegar ao detector Luz fluorescente emitida pelo espcime Espcime Focado Desfocado
Fig. 1.10. Representao esquemtica do microscpio confocal.
O microscpio confocal permite obter imagens permanentemente em foco, em qualquer plano focal, dum espcime com uma espessura at cerca de 100m, Figs. 1.10 e 1.11. Este tipo de microscopia , regra geral, utilizado com espcimes marcados com fluorocromos.
a)
b) Fig. 1.11. Comparao das imagens obtidas com a) microscpio de fluorescncia convencional e b) microscopia confocal.
Os microscpios confocais fazem um varrimento do espcime com um feixe de luz pontual focado, atravs duma objectiva, a uma profundidade seleccionada. A luz, emitida pelas molculas
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fluorescentes do espcime, regressa atravs da objectiva e filtrada da luz incidente por um mecanismo idntico ao do microscpio de fluorescncia. Contudo, antes que a luz atinja o detector detector passa por uma abertura regulvel, que est colocada exactamente na vertical em relao ao plano de foco do feixe de luz pontual. Deste modo impede-se que qualquer outra luz, que no a a emitida pelo espcime no plano de foco, chegue ao detector. Atravs dum controlo motorizado, podem recolher-se diferentes seces pticas que so armazenadas num computador e posteriormente processadas para formar uma imagem tridimensional.
1.3. Como utilizar o microscpio

A metodologia que a seguir se descreve o mtodo bsico de manuseamento do microscpio ptico de luz transmitida, adaptado observao da maioria dos espcimes, desde que tenham sido corados ou possuam contraste ou cor suficientes. Esta metodologia foi primeiramente descrita, no incio deste sculo, por August Khler, tendo como objectivo obter um bom campo de viso com uma iluminao homognea. Por este motivo muitas vezes designada como iluminao de Khler.
Focagem
1. Coloque a preparao na platina, com a lamela virada para cima, e, com o auxlio dos parafusos de movimento da sobre-platina, desloque o objecto a observar para o centro da abertura da platina. 2. Comece por observar a preparao com a objectiva de menor ampliao. Com o auxlio dos parafusos macromtricos aproxime, o mais possvel, a objectiva da lamela, tendo o cuidado de evitar o contacto entre ambas. Para focar o objecto, proceda, de forma lenta, ao movimento inverso, controlando a observao atravs da ocular. Logo que obtenha uma imagem suficientemente ntida, rectifique a focagem com os parafusos micromtricos.
Alinhamento do Microscpio
1. Foque a preparao. 2. Feche o diafragma da fonte luminosa, de molde a observar um pequeno crculo. 3. Centre o crculo com os parafusos do condensador. 4. Desloque o condensador na vertical de molde a obter os bordos do diafragma, que delimitam o crculo, perfeitamente focados. 5. No altere a posio do condensador para a objectiva alinhada. No decurso da observao, ajuste a quantidade de luz abrindo ou fechando o diafragma do condensador.
Nota: Depois de utilizar o microscpio no se esquea de: 1) desligar a luz; 2) levantar o canho do microscpio e colocar a objectiva de menor ampliao alinhada com o orifcio da platina; 3) limpar a platina e as objectivas (se tiver utilizado leo de imerso, limpe a objectiva com xilol) 4) tapar o microscpio.
1.4. Medies em preparaes microscpicas

As observaes em microscopia envolvem muitas vezes a medio do objecto de estudo. A medio pode ser realizada aps calibrao, de cada objectiva, com auxlio de uma ocular e uma escala (objectiva micromtrica), Fig. 1.12.
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Fig. 1.12. Representao esquemtica da calibrao da ocular com auxlio de uma ocular e objectiva micromtricas. M1 - escala (da objectiva micromtrica). Mx - escala da ocular micromtrica a calibrar.
Calibrao da ocular
1. Coloque a ocular micromtrica em posio no tubo do microscpio e instale a objectiva micromtrica na platina do microscpio. 3. Rode a ocular micromtrica de molde a que as escalas da objectiva e da ocular fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente, Fig. 1.12. 4. Desloque a objectiva micromtrica para que o incio da graduao das duas escalas se sobreponha (0 e 0,0), Fig. 1.12. 5. Tendo os zeros sobrepostos, verifique em que outro ponto do campo as duas escalas se sobrepoem igualmente. No exemplo da Fig. 1.12, verifica-se que 70 divises da ocular micromtrica correspondem exactamente a 0,4mm (= 400m) da objectiva micromtrica, i. e., 1 graduao = 400m / 70 = 5,7m. Este valor s vlido para a objectiva utilizada, sendo pois necessrio proceder calibrao para cada uma das outras objecticas. 6. Para a medio de um objecto desconhecido, determina-se primeiro o nmero de divises (por ex. 4) e multiplica-se pelo valor micromtrico previamente determinado (por ex. 5,7), obtendose a dimenso de 22,8m.
Exerccio
Com base na calibrao da ocular da Fig. 1.13a calcule o comprimento do estoma da Fig. 1.13b.
a)
b)
Fig. 1.13. a) Calibrao da ocular micromtrica (em cima) com auxlio de uma objectiva micromtrica (em baixo). b) Medio do comprimento de uma estoma com a ocular micromtrica.
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2. DIVERSIDADE CELULAR
As clulas so as unidades estruturais e funcionais de todos os seres vivos. A sntese proteica, regulada pelos cidos nucleicos, foi, sem sombra de dvida, um acontecimento crucial, que levou formao da primeira clula. Por outro lado, o aparecimento de membranas semipermeveis possibilitou a compartimentao celular, tanto do ponto de vista fsico como funcional. Um outro marco importante no processo evolutivo foi o DNA tomar o lugar do RNA como material hereditrio. Cr-se que todos os organismos e todas as clulas que os constituem tenham evoludo de um ancestral comum. A evoluo poder-se- ter dado por dois processos: 1. Variao ao acaso da informao gentica que passou de um indivduo aos seus descendentes; 2. Seleco da informao gentica que permitiu aos seus utentes a sobrevivncia e a propagao. Durante muitas centenas de anos, os bilogos classificaram os organismos vivos em apenas dois grupos: animais e vegetais. Com o desenvolvimento dos microscpios, tornou-se evidente que muitos organismos no se encaixavam bem nem no grupo dos animais, nem no grupo dos vegetais. Por exemplo, no s as bactrias no podem ser consideradas plantas, como organismos como as Euglenas apresentam caractersticas tanto de plantas como de animais. Com efeito, muitos organismos unicelulares tm entre si mais caractersticas em comum, do que com os animais ou as plantas. Este tipo de observaes levou criao de um sistema de classificao, proposto por Whittaker em 1969, que contemplava 5 reinos (Procariotas: Reino Monera; Eucariotas: Reino Protista, Reino Plantae, Reino Animalia, Reino Fungi). Este sistema de classificao no inclui vrus, virides ou pries, j que no se tratam de formas de vida celulares. Com a descoberta de tecnologias que permitiram a sequenciao e comparao da informao gentica das clulas - nas dcadas de 1970-1980 - foi possvel estabelecer as relaes evolutivas entre os organismos, ou seja, a sua filogenia, na forma de rvores filogenticas. Carl Woese foi pioneiro no uso de RNA ribossomal (rRNA), existente em todos os tipos celulares, para medir a divergncia evolutiva entre organismos. O principal resultado foi a descoberta da existncia de duas categorias de procariotas fundamentalmente distintas, o que levou proposta em 1990 de um sistema natural de classificao dos organismos em trs linhagens evolutivas / domnios: Bacteria e Archaea (ambos com clulas procariticas) e Eukarya (eucariotas), Tabela 2.1, Fig. 2.1.
Tabela 2.1. Comparao entre domnios Bacteria, Archaea e Eukarya. Caracterstica Invlucro nuclear Organitos membranados Peptidoglicanos na parede celular Lpidos membranares Ribossomas Iniciador tRNA Operes Plasmdeos Nmero de RNA polimerases Ribossomas sensveis ao cloranfenicol e estreptomicina Ribossomas sensveis toxina da difteria Bacteria Ausente Poucos Presentes Ligao ster No ramificado 70S Formilmetionina Presentes Presentes Uma Sim No Domnio Archaea Ausente Ausentes Ausentes Ligao ter Ramificado 70S) Metionina Presentes Presentes Uma No Sim Eukarya Presente Muitos Ausentes Ligao ster No ramificado 80S Metionina Raros Raros Trs No Sim
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Gram-positivas (GC ) Gram-positivas (GC ) Bactrias hipertermfilas Hadobactrias Cianobactrias
Origem da vida
Espiroquetas Clamdeas Proteobactrias Origem das mitocndrias Origem dos cloroplastos
Todos os filos de Eucariotas
Crenarchaeota Euryarchaeota
Fig. 2.1. Sistema natural de classificao dos organismos em trs linhagens evolutivas (adaptado de Sadava et al. 2012).
2.1. Procariotas
Os procariotas dos domnios Bacteria e Archaea, compreendem as clulas actuais com caractersticas mais primitivas e, por conseguinte, menos complexas. Estes organismos no apresentam compartimentao celular. Ao contrrio do que acontece com as clulas eucariotas, o seu material gentico localiza-se num corpo irregular, nucleide, no rodeado por invlucro nuclear. Nos procariotas incluem-se as Archaea (termoacidfilas, metanognicas e halfitas) e Bacteria (bactrias fotossintticas, saprfitas ou parasitas, cianobactrias e micoplasmas). Os procariotas encontram-se nos mais diversos ambientes naturais. Apesar da sua simplicidade, as espcies existentes so capazes de, virtualmente, metabolizar qualquer composto bio-orgnico (acares simples, polissacridos, aminocidos, protenas, lpidos e hidrocarbonetos). Muitos conseguem utilizar o CO2 e o N2 atmosfricos como fontes de carbono e azoto, respectivamente. Estas caractersticas conferem aos procariotas uma enorme aptido para explorar os diversos nichos ecolgicos. Por essa razo, so o tipo celular mais abundante superfcie da terra e nos oceanos. Apesar de serem frequentemente mencionadas como patognicos, s uma minoria das espcies conhecidas so realmente responsveis por doenas. Muitas mais espcies tm um papel positivo nas nossas vidas e na biosfera: participam nos processos digestivos dos animais, no processamento do azoto e enxofre do solo, como decompositores, e tm ainda um papel importante em muitos processos industriais e agrcolas. Os procariotas apresentam formas muito diversas, mas a maioria das espcies mais abundantes incluem-se em uma de trs categorias, Fig. 2.2:
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1. Bacillus (em bastonete) 2. Coccus (esfricas) Diplococcus (aos pares) Streptococcus (em rosrio) Staphylococcus (em agregados) 3. Spirillus (em hlice) Algumas espcies de procariotas possuem flagelos para se locomoverem. Neste caso os flagelos no so formados por microtbulos envolvidos por membrana plasmtica, como acontece nos eucariotas. So formados por uma nica fibrilha, flagelina de natureza proteica, Fig. 2.3.
a)
b)
c)
d)
e)
Fig. 2.2. Diferentes formas de procariotas, a) Coccus, b) Bacillus e c) Spirillus em microscopia de varrimento e d) e e) em microscopia ptica.
Os procariotas reproduzem-se, normalmente, por bipartio (reproduo assexuada), mas, em determinadas circunstncias, podem reproduzir-se por parassexualidade. Nestes casos existe apenas cariogamia. O material gentico no passa na sua totalidade de uma bactria para a outra, pelo que se forma um merozigoto (zigoto parcial). Algumas formas procariotas tm a capacidade de formar endsporos ou clulas de resistncia. Os endsporos so extremamente resistentes ao calor, radiaes e desinfectantes qumicos, sobretudo porque o protoplasma est altamente desidratado. Os procariotas apresentam uma enorme diversidade metablica, podendo ter vida livre, ser parasitas ou simbiontes. Podem ainda ser autotrficas ou heterotrficas. Quanto s autotrficas, estas podem ser fotossintticas ou quimiossintticas. As bactriass fotossintticas utilizam a luz como fonte de energia, que captam atravs de um pigmento, a bacterioclorofila. O pigmento est localizado em estruturas membranares que de alguma forma se assemelham aos tilacides das plantas superiores. Estas bactrias no libertam oxignio na fotossntese porque, em vez da gua, utilizam, como molcula redutora, um composto orgnico ou mineral. Os procariotas quimiossintticos utilizam diversos compostos como fonte de energia. So de
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destacar os que promovem a mineralizao do azoto orgnico atravs da nitritao (Nitrosomonas) e da nitratao (Nitrobacter). Nos procariotas heterotrficos incluem-se os saprfitas, os parasitas e os simbiontes. Neste ltimo grupo encontram-se algumas Azobactrias, como o Rhizobium, que fixam o azoto atmosfrico.
Cpsula Parede celular Membrana plasmtica Ribossomas Mesossoma Lamelas citoplasmticas Nucleide Citosol
Fmbria Corpo basal Gancho Filamento
Flagelo
Fig. 2.3. Representao esquemtica generalizada da estrutura de uma bactria.
As Bacteria possuem uma parede celular que difere quimicamente da dos vegetais superiores por possuir um peptidoglicano, tambm designado murena, mucopptido ou glicopptido. Esta macromolcula que se encontra apenas nos procariotas, consiste em dois tipos pouco usuais de acares (acetilglucosamina e cido acetilmurmico) ligados a pequenos pptidos. Os esqueletos de polissacridos adjacentes mantm-se ligados por pequenas sequncias de aminocidos, Fig. 2.4. A composio da parede celular bacteriana est na base da classificao histoqumica das bactrias em Gram-positivas e Gram-negativas. Hans Christian Gram, bacteriologista Dinamarqus, desenvolveu, por volta de 1800, a chamada tcnica de Gram que permite classificar as bactrias em um de dois grupos: Grampositivas ou Gram-negativas. A base qumica desta reaco permanece mal conhecida. Aps fixao pelo calor as clulas so coradas com violeta de cristal e iodo, e depois sujeitas aco de um solvente orgnico. As bactrias Gram-positivas, resistentes descolorao, mantm a colorao azul-violeta, enquanto as Gram-negativas a perdem rapidamente. Seguidamente efectua-se uma colorao com safranina para tornar vsiveis as Gram-negativas. A colorao acumulada no interior da clula e no a nvel da parede celular. A natureza desta ltima parece de algum modo impedir a remoo do corante violeta de cristal e iodo. A diferena pode ser simplesmente devido espessura da parede das Gram-positivas ser muito superior das Gramnegativas, retardando assim a remoo do corante. Por outro lado, a parede das Gram-positivas tem uma maior percentagem de peptidoglicanos e apenas 1-4% de lpidos, enquanto a parede das Gram-negativas tem uma menor percentagem de peptidoglicanos e 11-22% de lpidos. Os micoplasmas, que no tm parede celular, e as Archaea, que no tm peptidoglicanos no so corados pela reaco de Gram. A capacidade de resistir descolorao pelo etanol ou acetona parece ser dependente da idade das bactrias. Com efeito, verifica-se que enquanto algumas bactrias jovens se comportam comportam como Gram-positivas, as bactrias mais velhas da mesma espcie podem perder a capacidade de reter a colorao, e portanto comportam-se como Gram-negativas. Como tal, a reaco positiva tem mais valor do que a reaco negativa, j que esta ltima pode ser devida
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idade da cultura ou excessiva descolorao com o solvente.

Exterior da clula
Porina
Exterior da clula
Membrana Externa Peptidoglicanos
Membrana Plasmtica
Citoplasma
Gram+ b)
Gram-
a)
Fig. 2.4. Representao simplificada da composio da parede celular das bactrias a) Gram-positivas e b) Gram-negativas.
Em Microscopia Electrnica verifica-se que existem grandes diferenas na ultrastrutura da parede celular dos dois tipos de bactrias. A das Gram-positivas consiste numa nica camada relativamente espessa, composta de peptidoglicanos e molculas de cido teicico que se projectam para o exterior. A parede das Gram-negativas tem duas camadas, a interna de peptidoglicanos e, a mais externa, uma membrana celular externa (com porinas, lipopolissacridos e lipoprotenas). O espao entre a membrana plasmtica e a membrana externa externa designado espao periplsmico. A existncia da membrana externa funciona como uma barreira adicional que protege a clula contra o ataque de enzimas, antibiticos e detergentes. As bactrias Gram-negativas apresentam maior sensibilidade s penicilinas e s sulfamidas devido, possivelmente, presena da camada adicional de lipopolissacridos e protenas hidrfobas.
2.1.1. Bacteria
As Bacteria constituem um grupo diverso, com cerca de 80 linhagens / filos / divises, que vai dos organismos autotrficos quimiossintticos termfilos extremos, que oxidam o hidrognio ou reduzem compostos com enxofre, a autotrficos fotossintticos, representados pelas cianobactrias e pelas bactrias verdes e roxas. As cianobactrias sero as nicas referidas pela sua importncia.
Cianobactrias
As Cianobactrias representam, actualmente, a maior via de entrada de carbono e azoto na biosfera. Estes organismos so os mais auto-suficientes que existem na actualidade, podendo viver em apenas ar e gua, fazendo apelo a mecanismos que parecem ter permanecido constantes desde h cerca de 2700 milhes de anos. So tambm dos mais abundantes organismos na Terra com uma biomassa estimada em cerca de mil milhes de toneladas (peso fresco). A diversidade morfolgica deste grupo muito grande e serve de base taxonomia. Consideram-se em geral cinco grupos morfolgicos: (1) unicelulares, com diviso por fisso binria/ bipartio; (2) unicelulares formando colnias, com formas e arranjo das clulas muito
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variados; (3) filamentos simples (tricomas), que podem diferenciar clulas designadas heterocistos/ hetercitos; (4) filamentos simples, sem diferenciao de heterocistos; e (5) filamentos com verdadeiras ramificaes. Estes agrupamentos morfolgicos correspondem em geral a linhagens evolutivas distintas, com excepo das unicelulares que so muito diversas / polifilticas. Em muitos casos existe uma bainha gelatinosa a envolver as clulas, ou os filamentos (tricomas), facilmente visualizvel por montagem em tinta-da-china. Ao contrrio das bactrias fotossintticas, as cianobactrias efectuam fotossntese aerbia, isto isto , com libertao de oxignio, em que o CO2 fixado por formas de RuBisCO (RibuloseBisfosfato Carboxilase Oxigenase) idnticas s presentes nos cloroplastos de clulas eucariticas. eucariticas. No seu citoplasma, as cianobactrias possuem membranas citoplasmticas idnticas idnticas aos tilacides onde existe sempre clorofila a - ligada aos dois tipos de centros de reaco (fotossistemas I e II) - e dois tipos de complexos de antena com pigmentos acessrios. Na maioria das vezes, estes so ficobilinas, principalmente ficocianina (azulada), e por vezes tambm ficoeritrina (avermelhada), formando estruturas ganulares, os ficobilissomas, que se encontram acoplados membrana externa dos tilacides, em contacto com as protenas e citocromos transmembranares do fotossistema II (PS II->libertao de O2). Refira-se, a ttulo de curiosidade, que o mar vermelho deve esta designao predominncia de cianobactrias com ficoeritrinas do gnero filamentoso Trichodesmium que forma florescimentos superficiais muito extensos e visveis. Em algumas cianobactrias no existem ficobilissomas e o pigmento acessrio a clorofila b. Neste caso inclui-se, por exemplo, Prochlorococcus que uma importante componente do picoplncton dos oceanos apesar de s ter sido descoberta em 1988. Estima-se que Prochlorococcus produza cerca de 1/5 do total de oxignio atmosfrico. De realar ainda a presena de uma substncia de reserva de natureza proteica, a cianoficina, exclusiva deste grupo, e de amido cianofcio, semelhante ao glicognio dos animais e dos fungos. Em alguns gneros filamentosos observa-se a presena de heterocistos. Os heterocistos so clulas diferenciadas a partir de clulas vegetativas normais, de maiores dimenses e de parede espessa que aparecem intercaladas, ou terminais, nos tricomas (filamentos). Estas clulas so as responsveis pela fixao do azoto atmosfrico e a sua diferenciao desencadeada em resposta concentraes baixas de azoto orgnico (no atmosfrico) no ambiente. A diferenciao dos heterocistos um processo complexo, onde so activados e/ou desactivados milhares de genes, e tem como principal resultado a sntese e acumulao de complexos enzimticos designados nitrogenases que so responsveis pela reduo de azoto molecular (N2) em azoto reactivo (NH3). A actividade das nitrogenases requer um ambiente com baixo teor em oxignio, pelo que, durante a diferenciao dos heterocistos, os ficobilissomas e o fotossistema II acoplado, responsveis pela formao de oxignio, so desactivados mas os fotossistemas I mantm-se activos para formao de ATPs. Em algumas zonas da sia o arroz pode ser cultivado continuamente sem adio de fertilizantes devido presena de cianobactrias nos arrozais. Nesses locais, as cianobactrias, particularmente membros do gnero Anabaena, ocorrem em associao com um feto aqutico a Azolla. Quando as condies ambientais se tornam adversas formam-se muitas vezes endsporos, ou acinetos, que permitem ao organismo sobreviver em condies de seca, calor ou frio, extremas. Nas cianobactrias s se conhece reproduo assexuada por diviso ou por fragmentao, neste ltimo caso em formas filamentosas. A fragmentao dos tricomas (filamentos) ocorre, muitas vezes, ao nvel de clulas que realizam um processo de morte celular programada, as necrdias. Os pequenos segmentos de clulas vivas, separados pelas clulas mortas, so denominados hormognios, Fig. 2.5, e possuem capacidade de movimentao por deslizamento, sendo foto- e quimiotrficos.
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a)
b)
c)
d)
e)
f) Fig. 2.5. Representao esquemtica de Cianobactrias: a) Oscilatoria, b) Nostoc, c) Anabaena, d) Gloecocapsa e Lyngbya, e aspecto em microscopia ptica: e) Anabaena e f) Nostoc.
2.1.2. Archaea
O domnio Archaea constituido por dois filos, os Crenarcheota que incluem espcies termoflicas e hipertermoflicas (Pyrolobus) e os Euryarcheota que incluem espcies metanognicas, halfilas extremas e acidfilas extremas (Thermoplasma). Tidas inicialmente como ocupantes exclusivos de ambientes hostis, sabe-se hoje as rqueas de ambientes no extremos, apesar de pouco conhecidas, so tambm muito abundantes e provavelmente constituem uma grande parte do picoplancton (organismos <1). Morfologicamente variveis, as Archaea diferem das Bacteria na sequncia de bases no RNA ribossmico, na composio lipdica da membrana plasmtica e na ausncia de peptidoglicanos na parede celular (ver Tabela 2.1).
2.2. Eucariotas
Um dos marcos mais importantes da evoluo, foi a transio das clulas procariotas para as eucariotas, que se traduziu principalmente em: (i) estrutura celular mais complexa com compartimentao intracelular, permitindo maior controlo dos processos celulares; (ii) incluso dos cromossomas num desses compartimentos (ncleo), permitindo a separao entre transcrio de genes e sntese proteica e maior complexidade e controlo da expresso gentica; (iii) maior capacidade de recombinao gentica (meiose, cariogamia), potenciando maior aptido evolutiva. Muitas protenas e cidos nucleicos podem ser considerados como verdadeiros fsseis vivos, no sentido em que a sua estrutura se tem mantido dinamicamente conservada ao longo do
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processo evolutivo de milhes de anos. facto que determinadas sequncias de aminocidos e de nucletidos aparecem, actualmente, em formas relacionadas de eucariotas. Vrios cientistas se tm empenhado no sentido de elucidar a histria evolutiva com base no estudo destas sequncias. Apesar de haver muita incerteza, os mais recentes estudos baseados em sequncias de genes depois de aferidos por datao atravs do registo fssil, apontam para a existncia do ancestral comum eucaritico entre 1,87-1,68 mil milhes de anos.
Nmero de espcies conhecidas (descritas) Nmero estimado de especies existentes
Bactrias endosimbiontes tornaram-se nas mitocndrias dos Eucariotas
Bactrias endosimbiontes fotossintticas tornaram-se nos cloroplastos dos Eucariotas
BACTERIA ARCHAEA
Plantas Protistas Protistas Protistas Protistas Protistas Protistas
10000 300 270000
Milhes 1000 - 1milho 400000 - 500000
Cloroplastos
Vida
Fig. 2.6. Representao esquemtica da teoria da simbiose (adaptado de Sadava et al. 2012).
Tendo em conta as numerosas semelhanas entre os genomas mitocondrial e plastidial e o genoma de formas actuais de procariotas de vida livre, a origem dos eucariotas actualmente interpretada como o resultado de simbioses entre procariotas, Fig. 2.6. Existe um consenso praticamente geral sobre a existncia de um nico ancestral comum a todos os Eukarya (protoeucariota ou LECA-Last Eukaryotic Common Ancestor) e sobre a complexidade e longa durao do processo de transformao celular que lhe veio a dar origem. Existe tambm grande concordncia sobre duas outras caractersticas do proto-eucariota: (i) continha um endossimbionte, proto-mitocndria, derivado de uma alfa-proteobactria que veio a originar as mitocndrias (e organitos equivalentes, como os hidrogenossomas) existentes em todas as clulas clulas eucariticas; (ii) o seu genoma pode ser considerado como constituindo uma quimera, em que os genes envolvidos no armazenamento e processamento da informao (processos de replicao, transcrio e translao) mostram afinidade com o domnio Archaea, enquanto os genes implicados nos processos metablicos e de manuteno geral ('housekeeping genes') tendem a ser de origem bacteriana. Contudo, subsistem ainda muitas dvidas e grande polmica sobre qual precisamente a relao entre Eukarya e Archaea e sobre o momento exacto da aquisio do endossimbionte mitocondrial. Em relao primeira questo as vrias hipteses dividem-se em dois campos principais: (i) Eukarya e Archaea so linhagens irms, i.e., constituem ramos separados mas relacionados, sendo dois dos trs domnios primrios da vida celular; ou
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Mitocndrias
80000
5000000 1 milho
EUKARYA
Animais Fungos
1300000 10 milhes 100 milhes 100000 1 2 milhes
(ii) Eukarya emergem de dentro dos Archaea, i.e., tm um ancestral comum com um sub-grupo dos Archaea, e constituem um s domnio. Desta ltima hiptese resultam apenas dois domnios primrios. Quanto ao momento da simbiose com a alfa-proteobactria (proto-mitocndria), os dois modelos com mais suporte consideram ou que esta se deu muito cedo e directamente com um rquea, dando posteriormente origem complexidade celular caracterstica eucaritica, ou, em alternativa, que antes da endossimbiose ter ocorrido desenvolvimento significativo de membranas intracelulares endgenas, incluindo eventualmente um proto-ncleo, e outras estruturas celulares, num rquea progenitor que foi o ancestral da linhagem eucaritica. Os defensores do primeiro modelo argumentam com as vantagens energticas para o proto-eucariota de possuir uma mitocndria, enquanto os proponentes do segundo modelo do nfase necessidade de o proto-eucaritica j possuir mecanismos celulares que possibilitassem a fagocitose do endossimbionte. Na Figura 2.6 apresenta-se uma das hipteses actualmente em debate, considerando-se o domnio Eukarya um linhagem irm de Archaea (partilham um ancestral comum com excluso de Bacteria), sendo os 3 domnios monofilticos. As clulas eucariotas so tambm nicas pelo facto de possurem um citoesqueleto formado por filamentos de natureza proteica que d estrutura fsica ao citoplasma e desempenha papel preponderante na gerao de correntes citoplasmticas. As clulas eucariotas, ao contrrio das procariotas, possuem grande quantidade de DNA. importante salientar que, por vezes, apenas 1% do DNA nuclear transporta informao utilizvel pela clula, o que tem levado alguns autores a considerar a hiptese dos restantes 99% existirem apenas para aumentar a massa nuclear. Segundo outra hiptese pode tratar-se de uma existncia parastica; determinadas sequncias vo-se acumulando na clula ao longo dos anos, explorando os mecanismos celulares para a sua prpria reproduo, sem lhe trazer qualquer benefcio. Sabe-se, no entanto, que as pores de DNA nuclear que no codificam protenas desempenham funes estruturais, condicionando a condensao de parte do material gentico, e/ou funes reguladoras, ajudando a activar ou desactivar os genes que codificam as protenas, tendo assim papel crucial no controlo de expresso gnica nas clulas eucariotas.
Tabela 2.2. Comparao entre organismos Procariotas e Eucariotas. Organismo Dimenso celular Metabolismo Organitos DNA Procariotas Micoplasmas, Bactrias e Cianobactrias 1-10 m* Aerbico ou anaerbico Poucos ou nenhuns DNA circular no citoplasma Eucariotas Protistas, fungos, plantas e animais 10-100 m** Aerbico Ncleo, mitocndrias, plastos, retculo, Golgi, etc. DNA longo, organizado em cromos-somas, com muitas regies no codificantes. Cromossomas limitados por invlucro nuclear RNA sintetizado e processado no ncleo; protenas sintetizadas no citoplasma
Citoesqueleto composto por filamentos de protena; correntes citoplasmticas; endocitose e exocitose
RNA e Protenas Citoplasma
Diviso celular Organizao celular
Sintetizados no mesmo compartimento Sem citoesqueleto, correntes citoplasmticas, endocitose e exocitose Bipartio Unicelulares, podendo formar colnias
Mitose ou meiose Unicelulares ou pluricelulares, havendo, neste caso, diferenciao de tecidos
* Podendo atingir 50 m; ** Podendo atingir valores extremos de 0.8 m e 1 m.
O sucesso da adaptao das bactrias aos diferentes ambientes foi tal que, actualmente, estes estes organismos representam mais de metade da biomassa total do globo. Poder-se- ento perguntar o que motivou o aparecimento dos organismos pluricelulares. Na realidade, estes organismos utilizam, muitas vezes, recursos de difcil explorao para organismos unicelulares.
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Por outro lado, o facto em si, do aparecimento de organismos pluricelulares, determinou alteraes significativas do meio ambiente. Na concepo moderna, o domnio Eukarya constituido por vrios super-grupos: Protista, Plantae e Animalia.
2.2.1. Protistas
Os protistas so um vasto grupo de eucariotas que incluem os ciliados, dinoflagelados, apicomplexa, foraminferos, euglenfitos, diatomceas, algas castanhas, outras algas, 'fungos' mucilaginosos e aquticos, etc. etc., Algas e Fungos mucilaginosos e aquticos. Os protistas variam desde unicelulares microscpicos, coloniais at pluricelulares, os de grandes dimenses com alguma complexidade (algas castanhas tipo kelp). So organismos heterotrficos ou autotrficos, maioritariamente aerbicos, mas alguns anaerbicos, que na sua maioria apresentam vida livre, embora se conheam formas de associao simbionte ou parastica. So na sua maioria organismos aquticos, constituindo o plancton dos oceanos, lagos e rios.
Protozorios
A designao de Protozorios foi originalmente dada a organismos unicelulares com caractersticas semelhantes a animais. A unicelularidade no significa, contudo, simplicidade e muitos protozorios so estruturalmente complexos. Rizpodes Neste grupo incluem-se as amibas, organismos que podem atingir 0,6mm de comprimento. As amibas so incolores, de forma irregular e em constante mudana. Tudo indica que o seu movimento resulta da alterao do estado fsico do citoplasma, passando de sol (fluido) a gel (mais viscoso) e vice-versa. Para se alimentar, a amiba projecta pseudpodes que envolvem pequenas partculas de alimento e gua. O material em seguida encaminhado para vacolos digestivos, por um processo de endocitose, onde degradado, Fig. 2.7. A amiba reage negativamente luz forte, a solues salinas concentradas, a diversos produtos qumicos ou a objectos, como agulhas. A reproduo d-se por diviso binria. Alguns membros deste grupo produzem uma cobertura calcificada com poros atravs dos quais saem os pseudpodes.
a)
b)
Fig. 2.7. a) Representao esquemtica e b) microfotografia em microscopia ptica de uma amiba.
Ciliados Os representantes deste grupo possuem clios que utilizam na locomoo ou na captura de alimento. Apresentam formas diversas, caractersticas de cada espcie, Fig. 2.8. Possuem pelo menos dois ncleos: um menor, o microncleo relacionado com o processo
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reprodutor, e um macroncleo que controla o metabolismo celular e o cresimento. Certos ciliados, como, por exemplo, Stentor e Vorticella, possuem fibras contrcteis que lhes permitem movimentos de contraco. A paramcia, um ciliado muito comum em infusrios de feno, desloca-se nadando em espiral. Os vacolos digestivos percorrem rotas definidas no interior da clula, devido a correntes citoplasmticas.
a)
b) Fig. 2.8. a) Representao esquemtica de ciliados e b) observao em microscopia ptica.
Esporozorios So dois grupos cujos representantes so na sua quase totalidade parasitas, pelo que extremamente difcil encontrar formas de vida livre. Flagelados Os zologos incluem nos flagelados organismos como as Euglenas e Dinoflagelados por possuirem flagelos, manifestarem reaco a estmulos luminosos e possurem, ocasionalmente, nutrio saprfita. A este grupo pertencem tambm organismos parasitas como, por exemplos o Trypanosoma.
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Euglenides
Cerca de 1/3 dos 40 gneros de euglenas conhecidas tm cloroplastos com clorofila a, b e carotenides. A Euglena e o Phacus so organismos desprovidos de parede celular. Subjacente membrana plasmtica e formando com esta o periplasto, existe uma rede de natureza proteica com 6-17% de lpidos ou polissacridos. O periplasto pode ser rgido, como no Phacus, ou no, como na Euglena. Estes gneros apresentam em comum um estigma ou mancha ocular que recebe os estmulos luminosos, Fig. 2.9. Os representantes deste grupo podem ser autotrficos ou heterotrficos, dependendo da iluminao e dos nutrientes disponveis. Os zologos consideram-nos protozorios.
Fig. 2.9. Representao esquemtica de uma Euglena.
Dinoflagelados
Os dinoflagelados so includos, por alguns zologos, no grupo dos protozorios. Possuem parede celular, geralmente formada por placas. Apresentam carotenos e xantofilas alm das clorofilas a e b. Acumulam amido nos plastos e no hialoplasma. Possuem dois flagelos, um longo, que se projecta posteriormente em relao direco do deslocamento, e um mais curto que, tendo o mesmo local de insero, se dispe transversalmente em torno do organismo, Fig. 2.10.
Fig. 2.10. Representao esquemtica de dinoflagelados.
Diatomceas
As Diatomceas so organismos de extrema importncia no fitoplncton. A parede celular composta por celulose e pectinas, com impregnao de slica (SiO2) que podem atingir 95%, o que leva formao de ornamentaes, Fig. 2.11. Para alm das clorofilas a e c e do -caroteno, as diatomceas possuem tambm fucoxantina (xantofila) que lhes confere, geralmente, colorao tpica. Como substncia de reserva possuem a laminarina, um polissacrido diferente do amido. Apresentam ainda pirenides (estruturas de natureza proteica) nos cloroplastos.
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As diatomceas foram muito abundantes at ao Jurssico, perodo em que praticamente se extinguiram. A acumulao das suas paredes, ricas em silcio, originou os actuais depsitos de diatomito ou terra de diatomceas. Conhecem-se hoje em dia vrios locais onde se acumulam estes depsitos. Este material, semelhante a p, poroso e extremamente leve contm cerca de 6 bilies de conchas de diatomceas por litro. Entre as suas vrias aplicaes, salienta-se a de agente polidor de prata e outros metais, utilizado em pastas de dentes, para fabrico de tintas reflectoras para auto-estradas, sinais de trnsito e ainda em matrculas de automveis de alguns pases.
Ndulo central Epivalva Cinturas conectivas Rafe
Ndulo polar
Epivalva
a)
Hipovalva
b)
Cinturas conectivas Hipovalva
c)
d) Fig. 2.11. Diatomceas a) e c) penales e b) e d) centrales.
As diatomceas so frequentemente epfitas, vivendo superfcie de outros organismos. Considerando a sua simetria, possvel classific-las em penales, com simetria bilateral, ou centrales, com simetria radial. Estas ltimas so essencialmente marinhas, Fig. 2.11. As diatomceas possuem duas valvas, que encaixam uma na outra, Fig. 2.11. O movimento de vaivm, observado em algumas penales, parece dever-se a correntes citoplasmticas e presena do rafe. A reproduo assexuada nas diatomceas processa-se de tal modo que uma das clulas filhas sempre mais pequena. Quando essa clula atinge dimenses crticas, intervm a reproduo sexuada. Forma-se ento um zigoto que, funcionando como esporo, liberta-se da parede celular. Na sequncia, o protoplasto cresce, atinge a dimenso caracterstica da espcie e sintetiza uma nova parede celular.
Algas verdes
Na escala evolutiva, as algas surgem como os organismos eucariotas clorofilinos que mais caractersticas de primitividade evidenciam, Fig. 2.12. Embora o grupo Algae tenha j sido abandonado como categoria taxonmica e os seus representantes distribudos por vrias Divises, possvel encontrar algumas caractersticas em comum, nomeadamente do ponto de vista reprodutor: 1. Alguns indivduos, principalmente as algas unicelulares, podem comportar-se como clulas sexuais ou gmetas, fundindo-se para formar o zigoto; 2. Os gmetas podem ser produzidos em gametngios unicelulares especializados ou em
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gametngios pluricelulares em que todas as clulas so frteis; 3. Os esporos desenvolvem-se em estruturas unicelulares ou multicelulares (esporngios). Embora nas bactrias se verifique j a associao colonial, nas algas verdes que se encontram formas com graus de complexidade varivel, ilustrando o tipo de progresso que provavelmente ocorreu na evoluo das plantas superiores e dos animais.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
l)
m)
n)
o)
Fig. 2.12. Representao esquemtica de algas verdes unicelulares a) Chlamydomonas, b) Micrasterias; c) Cosmarium, d) Chlorella, e) Closterium, coloniais f) Coelastrum, g) Scenedesmus, h) Pediastrum e filamentosas i) Spirogyra, j) Zygnema. Observao ao microscpio ptico de l) Spirogyra, m) Pediastrum, n) Cosmarium e o) Scenedesmus.
As algas mais simples so unicelulares e elas s se mantm agrupadas temporariamente, na sequncia da diviso celular. A organizao colonial surgiu, provavelmente, devido incapacidade das clulas se separarem aps a diviso. Em algumas colnias j possvel observar diferenciao celular com especializao e diviso de trabalho.
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Quando a diviso celular ocorre apenas numa direco, formam-se cadeias de clulas denominadas filamentos. Certas clulas do filamento podem dividir-se numa outra direco, originando ramificaes. Divises celulares em dois ou mais planos podem resultar na formao de estruturas membranosas ou semelhantes a folhas, com uma ou mais camadas de clulas de espessura, formando um parnquima. Em algumas algas, a diviso nuclear no acompanhada da correspondente diviso celular, o que condiciona a formao de uma estrutura vesicular ou tubular multinucleada (estrutura cenoctica). Nos cloroplastos das algas verdes existem clorofilas a e b, - e -carotenos e xantofilas. As clorofilas predominam, regra geral, sobre os restantes pigmentos, conferindo a cor verde tpica dos representantes deste grupo. Os cloroplastos podem ter dimenses e formas diversas e, a maioria dos representantes, possui pirenides. O pirenide parece corresponder a aglomerao de amido-sintetase, uma enzima responsvel pela sntese do amido a partir da glucose. Alguns dos exemplares possuem flagelos, semelhana dos protozorios. As algas verdes podem ser unicelulares, coloniais, pluricelulares filamentosas ou membranosas, cenocticas ou tubulares, Fig. 2.12.
Algas vermelhas
A maioria das algas vermelhas pluricelular e abundante em guas marinhas. Os seus cloroplastos possuem clorofila a, carotenides, ficoeritrinas e ficocianinas. As paredes celulares das algas vermelhas contm polissacridos mucilaginosos de interesse comercial (agar).
Algas castanhas
Todas as algas castanhas so pluricelulares, variando em dimenso de alguns centmetros a aproximadamente 60m. Os cloroplastos possuem clorofila a e c, e fucoxantina (um pigmento amarelo-acastanhado que ocorre s nas algas castanhas, nos dinoflagelados e nas diatomceas). So comercialmente importantes pela produo de algina, um polissacrido que se acumula nas paredes celulares e que pode representar at 40% do peso seco. A algina extremamente importante do ponto de vista comercial, pela sua aplicao, entre outras, nas indstrias alimentar, de papel, txtil, farmacutica e cosmtica, de materiais de limpeza e cervejeira. O iodo tambm um elemento importante que se retira das algas castanhas, e pela elevada concentrao de azoto e potssio so tambm utilizadas como fertilizantes. O Mar dos Sargassos deve o seu nome, invaso das costas do Golfo do Mxico com a alga castanha Sargassum, aquando das tempestades tropicais.
Fungos Mucilaginosos e Aquticos

Estes organismos possuem caractersticas de protozorios ou animais durante parte do ciclo de vida e de fungos durante a restante. Os fungos mucilaginosos no possuem paredes celulares no seu estado activo, sendo o seu corpo constituido por uma massa protoplasmtica plurinucleada, o plasmodium. Os plasmodia deslizam sobre material em decomposio, e convertem-se em estruturas estacionrias, de vrias formas, quando as condies ambientais se alteram. Os fungos aquticos tm caractersticas em comum com as algas castanhas, das quais parecem ter derivado. Alguns so responsveis por doenas em peixes e outros organismos aquticos, e tambm em videiras e batateiras.
2.2.2. Fungos
Os verdadeiros fungos so filamentosos ou unicelulares e no possuem clulas mveis. Todos
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produzem hifas e tm paredes celulares cujo constituinte dominante a quitina. So maioritariamente organismos decompositores, responsveis por enormes percas econmicas por doenas e/ ou estragos em alimentos. Os liquenes resultam de uma associao entre um fungo e uma alga (alga verde ou cianobactria), em que a alga fornece o alimento para ambos, enquanto o o fungo protege a alga das radiaes luminosas intensas, produz uma substncia que acelera a fotossntese da alga e absorbe e retm gua e minerais para ambos.
2.2.3. Animais
Todos os animais so eucariotas pluricelulares heterotrficos, sem parede celular, cloroplastos ou pigmentos fotossintticos. A maioria capaz de se locomover, responde rapidamente a estimulos e reproduz-se sexuadamente. Excepto nas formas mais simples, as clulas que constituem os animais mostram uma diviso de funes em orgos especficos.
2.2.4. Plantas
Os membros do Reino Plantae apresentam uma grande diversidade e organizao estrutural. Quase todos apresentam cticula a cobrir as partes areas e desenvolveram embries e tecidos especficos para fotossntese, conduo, suporte, ligao e proteco. O ciclo de vida das plantas alterna entre uma fase haplide gametoftica, e uma diplide, esporoftica. Muitas plantas so de uma importncia econmica extrema para o Homem.
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3. A CLULA 3.1. Parede celular

A diferena entre animais e plantas no se situa ao nvel das caractersticas moleculares fundamentais, como a replicao do DNA, a sntese proteica, a produo de ATP na mitocndria ou a constituio das membranas protoplasmticas. A capacidade das plantas fixarem o CO2 atmosfrico, durante a fotossntese, e de produzirem uma parede celular rgida, marca, de facto, a diferena entre estes dois grupos de seres vivos. A parede celular uma forma particular de matriz extracelular, intimamente associada face exoplsmica da membrana plasmtica da clula vegetal. Embora a maioria das clulas animais possua tambm componentes da matriz extracelular superfcie da membrana plasmtica, constituindo o glicoclice, a parede celular vegetal , normalmente mais espessa, mais organizada e mais rgida. Com parede celular rgida, as plantas no tm possibilidade de se mover e, portanto, no desenvolvem sistemas muscular, sseo e nervoso. Com efeito, a maior parte das diferenas entre animais e plantas (nutrio, digesto, osmorregulao, crescimento, reproduo, comunicao intercelular, mecanismos de defesa e morfologia) est relacionada com a presena da parede celular. Numa planta, as clulas jovens so de tamanho reduzido, se comparadas com clulas adultas. Para permitir o alongamento celular, a parede das clulas jovens, parede celular primria, delgada e semi-rgida. Na clula adulta, que mantm a parede primria, embora por vezes bastante mais espessa, a deposio secundria de material da parede, parede celular secundria, secundria, leva ao aumento inevitvel da rigidez. A parede celular primria, apesar de apresentar, nos diversos grupos vegetais, variaes significativas em termos de organizao, possui sempre longas fibras de celulose unidas por uma matriz constituda por protenas e polissacridos. Os polissacridos da matriz so essencialmente pectinas e hemiceluloses. A ligao das fibras de celulose aos componentes da matriz faz-se por covalncia e por ligaes de hidrognio. Uma molcula de celulose consiste numa cadeia linear de vrios milhares de resduos de glucose, ligados covalentemente por uma ligao glucosdica (1- 4). Este tipo de ligao confere macromolcula uma estrutura planar, que estabilizada por ligaes de hidrognio intramoleculares. As molculas de celulose agrupam-se para formar as micelas. Outras ligaes de hidrognio, entre molculas adjacentes, levam formao de arranjos paralelos de 60-70 molculas de celulose, longos e altamente ordenados, as microfibrilhas. As microfibrilhas esto rodeadas por um grande nmero de cadeias de celulose livres e por molculas de hemiceluloses, Fig. 3.1.
Micelas
Pectina
Ca2+
Ca2+
Hemicelulose
Microfibrilha
10 m
Microfibrilha de celulose
Extensina
Fig. 3.1. Representao esquemtica do arranjo dos constituintes da parede celular primria.
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Hemiceluloses o nome dado a um grupo heterogneo de polissacridos da matriz que se ligam entre si e s microfibrilhas de celulose, envolvendo-as e interligando-as numa rede complexa. Existem diversas classes de hemiceluloses. O tipo de hemiceluloses de uma clula varia com o seu estdio de desenvolvimento e com a espcie vegetal. As pectinas so um grupo de polissacridos da parede, altamente hidratados e ramificados, constitudos por resduos de cido galacturnico, esterificado ou no. As pectinas so particularmente abundantes na lamela mdia, cujo funo cimentar as paredes celulares das clulas adjacentes. Com o alongamento celular, a lamela mdia sofre ruptura em diversos locais, dando origem aos meatos observados em diversos tecidos. A parede celular primria contm ainda pequenas quantidades de protena. A protena a existente possui, alm de resduos de serina, grande nmero de resduos de hidroxiprolina, um aminocido relativamente raro. Os resduos desses aminocidos encontram-se ligados a cadeias de oligossacridos, formando glicoprotenas. De molde a permitir o crescimento e a modelao da forma da clula, a parede celular exibe uma grande plasticidade. Ora, como as microfibrilhas de celulose so estruturas bastante rgidas, as modificaes da estrutura da parede devem-se ao deslizamento das microfibrilhas, umas em relao s outras. Esses movimentos dependem da orientao das fibrilhas na parede e das ligaes entre as diversas componentes da matriz e destes com as microfibrilhas de celulose, Fig 3.2.
Fig. 3 2. Ilustrao do modo como a orientao das microfibrilhas de celulose da parede celular primria determina a orientao do alongamento da clula.
Existem relativamente poucos tipos bsicos de clulas nas plantas superiores e todos eles so facilmente distinguveis pela forma e estrutura da sua parede. Todas as clulas definitivas se formam a partir de clulas com parede celular primria, por um processo de maturao que envolve, em muitos casos, a deposio de novo material da parede. Quando a clula atinge a sua forma definitiva, regista-se uma certa relaxao dos componentes da parede, devido tenso a que foram sujeitos durante o perodo de crescimento. A menor coeso dos diversos componentes compensada, quer pela deposio de novos materiais na parede celular primria, quer, em muitos casos, pela deposio de novas camadas de composio diversa, dando origem parede celular secundria. A deposio da parede celular secundria ocorre entre a membrana plasmtica e a parede celular primria. Faz-se, normalmente, em camadas sucessivas com orientao diversa, Fig. 3.3. A forma e a composio da parede esto relacionadas com a funo da clula no tecido. No floema, por exemplo, tecido responsvel pelo transporte dos produtos da fotossntese, sobretudo a a sacarose, das clulas fotossintticas para os restantes rgos da planta, a sua diferenciao envolve a deposio de grande quantidade de celulose e hemiceluloses na parede. Por seu turno, no xilema, tecido especializado no transporte de gua e ies da raiz para o resto da planta, as clulas, de forma tubular, possuem parede celular secundria extremamente espessa e rica em lenhina. J o colnquima, tecido vivo de suporte, localizado periferia dos orgos vegetais, possui possui uma parede celular primria espessa, de natureza pectocelulsica, muito rica em gua, Fig.
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Fig. 3.4. A parede pectocelulsica pode ser considerada uma estrutura semipermevel porque, possuindo poros com dimenso de 3,5-5,2nm, no permite que compostos com massa molecular superior a 15.000 a 20.000 a atravessem livremente. Sendo, no entanto, permevel gua e generalidade das substncias nela dissolvidas, a troca de materiais entre clulas contguas est grandemente facilitada. Exceptuam-se os casos em que a parede impregnada com compostos impermeveis como, por exemplo, a suberina.
Fig. 3.3. Representao esquemtica da deposio da parede celular secundria.
a)
b)
Fig. 3.4. Exemplo de modificaes da parede durante a formao de clulas especializadas: a) colnquima e esclernquima do caule, b) floema, xilema e endoderme da raiz.
Pontuao
a)
b)
Fig. 3.5. a) Representao esquemtica de pontuaes e b) observao de pontuaes e cristais de oxalato de clcio em microscopia ptica.
Quando as clulas possuem parede relativamente espessa, as trocas so consideravelmente
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favorecidas pela existncia de pontuaes. Uma pontuao consiste numa zona da parede onde, no decurso da diferenciao celular, no ocorreu deposio de novo material. As pontuaes surgem assim como zonas de estrangulamento da parede como se observa no pericarpo do fruto da roseira ou no caule do craveiro, Fig. 3.5. Quando existem pontuaes, os plasmodesmos localizam-se preferencialmente a esse nvel. Se no existem, os plasmodesmos distribuem-se, mais ou menos uniformemente, por toda a parede, Fig. 3.6.
Pontuao Plasmodesmos Plasmodesmos
Fig. 3.6. Ilustrao da distribuio dos plasmodesmos numa parede celular sem e com pontuaes.
3.1.1. Alteraes qumicas da parede celular

A celulose , geralmente, o constituinte mais abundante na parede celular. No entanto, em muitos casos, como consequncia do processo de diferenciao, este componente minoritrio, existindo outras substncias como, por exemplo, a lenhina, a suberina e a cutina, que conferem parede caractersticas especiais. As alteraes qumicas da parede, resultantes da deposio de compostos que no a celulose, podem afectar tanto a rigidez como a permeabilidade.
Lenhificao
A lenhina um heteropolmero de natureza fenlica que no forma microfibrilhas. Este composto confere maior resistncia parede uma vez que substitui os componentes da matriz. A lenhina pode impregnar total ou parcialmente as parede celular como, por exemplo, nas clulas do esclernquima, do tecido esclerenquimatoso, ou nos vasos lenhosos, Fig. 3.7. As clulas de parede lenhificada esto adaptadas a funes de suporte, graas s propriedades mecnicas e resistncia das paredes reforadas, e a funes de conduo, que so favorecidas pelo carcter hidrfobo da lenhina. A capacidade de elaborar paredes celulares lenhificadas caracteriza as plantas vasculares ou Traquefitas. O reforo adicional fornecido pela lenhina foi determinante para a aquisio do porte erecto e para a conquista do meio terrestre. Em consequncia da impermeabilizao da parede celular, todas as clulas de paredes lenhificadas so clulas mortas desprovidas de protoplasma. possvel distinguir, por mtodos histoqumicos, clulas com parede celulsica de clulas com parede lenhificada. Fazendo uma colorao com verde iodo e carmim aluminado, a parede celulsica surge corada de rosa enquanto a parede lenhificada apresenta colorao verde. As lenhinas podem ser ainda postas em evidncia com outros reagentes, entre os quais o floroglucinol, que reage com paredes lenhificadas dando uma cor vermelha em meio cido, Fig. 3.7. As lenhinas absorvem os raios ultravioletas, a um comprimento de onda entre 250 e 280nm e apresentam uma autofluorescncia amarela, Fig. 1.9b.
Paredes de Reserva
As sementes acumulam substncias que asseguram uma autonomia nutritiva para a germinao, enquanto a planta ainda no fotossinttica. Essas substncias acumulam-se preferencialmente no citoplasma ou nos plastos. Menos conhecido o facto de muitas plantas acumularem, temporariamente, glcidos particulares que so depositados massivamente nas paredes celulares, conduzindo sua hipertrofia, Fig. 3.8. Aquando da hidratao germinativa,
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essas substncias so mobilizadas, e os produtos de hidrlise so exportados para as regies de crescimento. Os tipos moleculares predominantes so a manose (mananos e glucomananos) e a glucose e xilose (xiloglucanos ou amilides).
v.a. v.e. v.ra. v.re.
v.p.
a)
b)
c)
d)
Fig. 3.7. a) Representao esquemtica da parede celular lenhificada dos vasos xilmicos (v.a. - vasos com espessamento anelar; v.e. - espiralado; v.ra. - raiado; v.re. - reticulado; v.p. - pontuado). b) Observao, em microscopia ptica de vasos xilmicos corados com Floroglucinol e de paredes celulares celulsicas, lenhificadas e suberificadas em cortes transversais de c) raiz e d) caule.
a)
b)
Fig. 3.8. a) e b) Paredes celulares de reserva ricas em xiloglucanos.
As paredes celulares das clulas do albmen das palmeiras e de famlias como a das Liliceas, Iridceas, Rubiceas e Umbelferas so particularmente ricas em manose. Estes espessamentos tornam as sementes muito duras, como o caso das sementes de Phytelephas
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macrocarpa, justamente apelidadas de marfim vegetal. As paredes celulares das clulas do embrio do ciclamen, do tamarindo ou da balsamina so ricas em xiloglucanos, tambm denominados amilides, por reagiram positivamente ao lugol, reagente habitualmente utilizado na deteco do amido.
Cutinizao e Cerificao
As clulas da epiderme possuem paredes celulares laterais e basal de natureza celulsica mais ou menos delgada. Durante a diferenciao, a parede celular celulsica externa destas clulas torna-se mais espessa e cobre-se por uma cutcula que constituda, essencialmente, por cutina, um polmero insluvel, e por ceras, facilmente extradas por solventes orgnicos. A superfcie da cutcula apresenta muitas vezes estrias orientadas de modo varivel, que correspondem a pregueamentos da sua superfcie, Fig. 3.9b.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Fig. 3.9. a) Representao esquemtica da cutcula e b) observao da cutcula em microscopia electrnica de varrimento. c) e d) Representao esquemtica de tricomas secretores, alguns com cutcula destacada d). e) Observao de tricomas lupa, f) em microscopia ptica e g) microscopia electrnica de varrimento.
A cutcula assegura mltiplas funes: regula o grau de hidratao da superfcie e a emisso de volteis, limita a lixiviao pelas guas da chuva e defende a planta da fora abrasiva do vento, da aco de poluentes e de infeces, entre outros.
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A cutcula uma estrutura composta por substncias lipfilas e, como tal, detectvel por corantes gerais de lpidos (Negro Sudo e Vermelho Sudo III). A sua espessura varivel, relativamente delgada em orgos jovens (0,5-1m), tornando-se mais espessa com a maturao celular, podendo atingir 10-20m na folha da oliveira e do loureiro. A cutina um polmero de cidos gordos, que forma uma extensa rede superfcie do corpo da planta, e que aparece frequentemente impregnada e coberta por ceras, Fig. 3.9a, que aumentam a impermeabilidade da epiderme. A acumulao das ceras muitas vezes to abundante (5g de cera por folha) que podem ser extradas e utilizadas comercialmente, como no caso de Copernica cerifera. Muitas clulas epidrmicas, designadas tricomas, podem sintetizar e acumular essncias volteis. Os tricomas, lato sensu, so estruturas uni- ou pluricelulares, que tm nos vegetais essencialmente dois tipos de funes: protectora (tricomas de cobertura) ou secretora (tricomas glandulares), Fig. 3.9. Nestes ltimos, a essncia secretada , muitas vezes, acumulada, temporariamente, entre a parede celular e a cutcula destacada, num espao designado espao sub-cuticular. Por ruptura da cutcula liberta-se a essncia, que em seguida se evapora, Fig. 3.9c e d.
Mineralizao
A parede celular pode ser impregnada por carbonato de clcio [CO3Ca], oxalato de clcio [(COO)2Ca] (ambos designados por calcificao) ou por slica (silicificao).
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Fig. 3.10. Representao esquemtica e observao em microscopia ptica de cistlitos em folhas de a) e b) Ficus elastica e c) Humulus lupulus. d) - f) Representao esquemtica e observao em microscopia ptica e em microscopia electrnica de varrimento do tricoma silicificado de Urtica dioica.
O fenmeno da calcificao frequente no talo de algumas algas vermelhas, como a Coralline
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e Lithothamnio, tornando-as rgidas e quebradias. Os cistlitos so, igualmente, depsitos de calcrio que aparecem no interior da clula, fixos a uma excrescncia da parede. Observam-se, com muita facilidade, na epiderme das folhas de Ficus elastica e de Humulus lupulus, Fig. 3.10. A silicificao consiste na deposio de xido de silcio hidratado amorfo ou opalino [Si(OH)4]. As diatomceas representam um caso de silicificao parietal massiva. Um exemplo caracterstico da silicificao nos vegetais superiores o dos tricomas de urtiga, Fig. 3.10. Neste caso, o reforo apical silicioso permite que estes funcionem como minsculas seringas.
Suberificao
A suberificao consiste na deposio de camadas sucessivas de suberina na face interna da parede celular, Fig. 3.11. Uma vez terminada a suberificao, e antes da morte da clula, deposita-se uma camada de celulose. A suberina tem uma natureza qumica prxima da da cutina, um polmero de steres de cidos gordos e de fenis. A suberificao tem um papel protector e impermeabilizador. Podemos encontrar exemplos de suberificao nas clulas da camada suberosa da rizoderme, e nas clulas da endoderme, Fig. 3.11. Tambm as clulas do sber, um tecido de crescimento secundrio, tm paredes celulares suberificadas em maior ou menor grau. Como o sber constitui uma camada impermevel que impossibilita as trocas gasosas, ela interrompida regularmente por lenticelas, constituidas por um conjunto de clulas parenquimatosas arredondadas, com numerosos meatos entre si. A suberificao pode ainda ocorrer em consequncia da destruio acidental da epiderme (feridas ou picadas).
a)
b)
c)
d)
Fig. 3.11. Representao esquemtica da endoderme de a) Taxus baccata (espessamento em banda, Bandas de Caspary) e de c) Iris florentina (espessamento em U) e b) e d) observao em microscopia ptica.
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Esporoderme
A parede dos gros de plen e dos esporos , geralmente, constituda por duas camadas: uma externa, a exina e uma interna, a intina. A exina apresenta, normalmente, ornamentaes caractersticas (papilas, pontuaes, bordos dentados, etc.), Fig. 3.12. Enquanto a exina constituda por esporopolenina, uma substncia de natureza lipdica, a intina rica em celulose. Graas ao facto de ser uma substncia dura e resistente aos ataques qumicos e de microrganismos e bem assim por possuir ornamentaoes caractersticas, a esporopolenina persiste nos sedimentos e permite a reconstituio da paleoflora.
Fig. 3.12. Representao esquemtica de diversos gros de plen.
3.2. Matriz extracelular nas clulas animais

A matriz extracelular uma estrutura constituda por protenas e polissacridos que envolve todas as clulas animais de tecidos slidos e rgos. Esta matriz fornece no s um suporte fsico para o desenvolvimento das clulas mas tambm responsvel por um conjunto de sinais bioqumicos e biomecnicos cruciais para a morfognese, diferenciao e homeostasia tecidulares. A matriz extracelular constituda por fibras proteicas embebidas numa rede gelificada de glicosaminoglicanos (polissacridos) e proteoglicanos (complexos glicoproteicos). Possui ainda algumas protenas adesivas que ligam os componentes da matriz uns aos outros e estes s clulas (molculas de adeso celular), Fig. 3.13a. A variao na abundncia relativa de cada um dos componentes responsvel pela diversidade das matrizes extracelulares e, consequentemente, pela diversidade dos tecidos animais. A cartilagem, por exemplo, possui uma percentagem elevada de polissacridos originando uma estrutura gelificada compacta, enquanto no tecido sseo a matriz endurecida pela deposio de fosfato de clcio. O tecido conjuntivo, como por exemplo o laxo e o cartilagneo, aquele em que a matriz extracelular mais abundante, sendo essencialmente constitudo pela prpria matriz extracelular, na qual esto dispersas as clulas, Fig. 3.13b.
Colagnio Fibronectina Laminina Proteoglicano
Integrina
a)
b)
Fig. 3.13. a) Representao esquemtica dos diversos componentes da matriz extracelular animal e da sua relao com a membrana plasmtica. b) Observao de tecido conjuntivo laxo em microscopia ptica.
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O colagnio a principal protena estrutural da matriz extracelular animal que faz parte de uma grande famlia de protenas com mais de 20 tipos diferentes (colagnios). Estas protenas caracterizam-se por formar hlices triplas em que 3 cadeias polipeptdicas, do mesmo tipo, se enrolam umas nas outras, Fig. 314a. Na sequncia de aminocidos que constitui os colagnios, a glicina ocorre sempre de 3 em 3 posies, sendo que, nas 2 intermdias, a prolina e a hidroxiprolina so os aminocidos mais frequentes, Fig. 3.14b.
a)
b)
Fig. 3.14. Representao esquemtica a) da hlice tripla de colagnio e b) da sequncia de aminocidos que constituem a molcula de colagnio.
As fibrilhas de colagnio formam-se apenas no espao extracelular, aps a secreo dos pr-colagnios (precursores solveis do colagnio). A associao das molculas de colagnio em fibrilhas fortalecida pela formao de ligaes covalentes cruzadas, Fig. 3.15a. As fibrilhas associam-se umas com as outras para formar fibras de colagnio, com vrios mcrons de dimetro, Fig. 3.15b.
Intervalo Ligao cruzada
Hlice tripla de colagnio
a)
b)
Fig. 3.15. a) Representao esquemtica da organizao das fibrilhas de colagnio. b) Observao das fibras de colagnio em microscopia electrnica de transmisso.
Para alm das fibras de colagnio, a matriz extracelular animal contm, ainda, fibras elsticas, particularmente abundantes em rgos que se expandem e contraem, como o caso dos pulmes. Estas fibras so constitudas, principalmente, por uma protena, a elastina, que se associa atravs de ligaes intercruzadas para formar uma rede. A rede de elastina funciona como uma faixa elstica permitindo a expanso e a retraco do tecido ou rgo ao seu estado inicial. As protenas fibrosas estruturais da matriz extracelular (colagnio, elastina) esto envolvidas numa rede gelificada constituda por polissacridos, denominados glicosaminoglicanos, e
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proteoglicanos (GAGs), Fig. 3.16a. Dado que possuem grupos sulfato, os GAGs tm muitos grupos aninicos negativamente pelo que, tal como as pectinas da parede celular vegetal, se ligam a caties e retm gua, formando gis. Na sua grande maioria os GAGs esto ligados a protenas formando os proteoglicanos. Diversos proteoglicanos ligam-se ao hialuronano para formar complexos supramoleculares. Exemplo disso o agrecano, o proteoglicano maioritrio da cartilagem, Fig.3.16b. Os complexos de hialuronano/proteoglicanos, de grandes dimenses, acabam por ficar aprisionados nas fibras de colagnio. Ao mesmo tempo, interagem com o prprio colagnio e com outras protenas da matriz constituindo redes gelificadas. As protenas adesivas constituem o 3 grupo de constituintes da matriz extracelular animal. So responsveis pela ligao entre os diversos componentes da matriz e entre esta e a superfcie das clulas. A fribonectina, as lamininas, a entactina, so exemplos de protenas adesivas que possuem locais de ligao para o colagnio e para os GAGs, estabelecendo ligaes cruzadas entre aqueles dois componentes da matriz extracelular, Fig. 3.13a. Algumas dessas protenas adesivas possuem, ainda, locais de ligao a receptores da membrana plasmtica, responsveis pela ligao das clulas matriz extracelular.
cido glucurnico N-Acetilgalactosamina Galactose N-Acetilglucosamina
Sulfato de condroitina
Protena
Agrecano
Sulfato de condroitina
Sulfato de queratano
Hialuronano
Agrecano Protena de ligao
cido Idurnico
N-Acetilglucosamina
a)
Sulfato de Heparano
b)
Fig. 3.16. a) Estrutura qumica de glicosaminoglicanos. b) Representao esquemtica da estrutura resultante da ligao de proteoglicanos ao hialuronano.
3.2.1. A diversidade celular nos diferentes tecidos animais

Todas as clulas que constituem um determinado organismo partilham o mesmo cdigo gentico nos seus ncleos. No entanto, as clulas no so todas idnticas. Muitos organismos multicelulares so compostos de diversos tecidos, grupos de clulas especializadas numa funo comum. Nos animais existem 4 tipos principais de tecidos: epitelial, conjuntivo, nervoso e muscular.
Tecido epitelial
Os epitlios so camadas de clulas que cobrem a superfcie do corpo e delimitam as suas cavidades internas tais como os pulmes e os intestinos. As clulas podem ser colunares (mais altas que largas), pavimentosas (achatadas) ou cbicas. Os tecidos epiteliais podem ser simples, estratificados ou pseudo-estratificados, Fig. 3.17. Tratando-se de tecidos de revestimento e proteco, as suas clulas no apresentam, regra geral, matriz extracelular na zona de justaposio.
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a)
b)
c)
d)
e)
f)
Fig. 3.17. Representao esquemtica de diversos tipos de epitlios. a) Escamoso simples. b) Cuboidal simples. c) Colunar simples. d) Escamoso estratificado. e) Cuboidal estratificado. f) Colunar pseudoestratificado.
Tecido conjuntivo
Constitui um grupo de tecidos, muito diversificado, com funes de armazenamento (tecido adiposo), de suporte mecnico (tecido sseo, cartilagem) ou de ligao entre outros tecidos (tecido conjuntivo laxo). Frequentemente, o tecido conjuntivo surge logo abaixo de tecido epitelial, Fig. 3.18.
Tecido conjuntivo laxo
Tecido epitelial colunar simples
Fig. 3.18. Representao esquemtica da frequente localizao do tecido conjuntivo, relativamente ao tecido epitelial.
O tecido conjuntivo caracterizado, na maioria dos casos, por ser constitudo por poucas clulas num grande volume de matriz extracelular, a qual constituda por diversos tipos de fibras embebidas numa substncia fundamental, Fig. 3.19. A mais abundante destas fibras o colagnio, uma protena que constitui cerca de 1/3 das protenas do corpo humano. A elastina outra protena abundante na matriz extracelular de clulas de alguns tecidos conjuntivos. Dependendo do tipo de tecido conjuntivo, os componentes predominantes da matriz extracelular so diversos. No tecido conjuntivo laxo, a matriz extracelular rica em fibras de colagnio e de elastina, embebidas numa rede polissacardica. Neste tipo de tecido, as clulas predominantes so os fibroblastos, que produzem as fibras e os componentes da substncia fundamental, Fig. 3.19a. O tecido cartilagneo caracterizado por uma matriz extracelular em que predomina a rede polissacardica gelificada, composta por glicosaminoglicanos e proteoglicanos. Os condrcitos so clulas facilmente observveis em lacunas dispersas na matriz extracelular,
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Fig. 3.19b. No caso do tecido sseo, a matriz extracelular rgida devido deposio de fosfato de clcio. Os ostecitos so as clulas que se destacam, Fig. 3.19c.
a)
Fibra Fibroblasto Rede gelificada
b)
Matriz gelificada Condrcito Lacuna
Neutrfilos Ostecito Matriz Linfcitos
Eosinfilos
Basfilos
c)
d)
Moncitos
Plaquetas
Eritrcitos
Fig. 3.19. Representao esquemtica de diversos tipos de tecido conjuntivo. a) Conjuntivo laxo. b) Cartilagneo. c) sseo. d) Sanguneo.
Existem casos particulares de tecidos conjuntivos que constituem excepes regra. No tecido sanguneo, os diversos tipos de clulas que o constituem encontram-se dispersos numa matriz lquida (o plasma), que no produzida pelas clulas, Fig. 3.19d. No caso do tecido adiposo, a matriz extracelular quase inexistente, sendo as clulas bastante volumosos devido grande acumulao de gorduras.
Tecido nervoso
O tecido nervoso apresenta uma matriz extracelular bem desenvolvida, onde se encontram dispersos dois tipos bsicos de clulas, Fig. 3.20. Os neurnios, envolvidos na conduo do impulso nervoso, so o principal tipo de clulas deste tecido e apresentam prolongamentos, os axnios, que podem atingir mais de 1 metro de comprimento. O outro tipo de clulas so clulas da glia, ou neuroglias, com funo de suporte e proteco dos neurnios.
Extenses citoplasmticas
Corpo celular do neurnio
Clula da glia
Fig. 3.20. Representao esquemtica de tecido nervoso. 41
Tecido muscular
O tecido muscular pode ser de 2 tipos: liso e estriado. As clulas do msculo liso so alongadas e finas, Fig. 3.21a, e encontram-se geralmente nas paredes de rgos tubulares tais como os intestino e os vasos sanguneos. As clulas musculares lisas contraem-se lentamente e so capazes de manter o estado de contraco durante um longo perodo de tempo.
Clula muscular
Ncleos
Ncleo
a)
Fibra muscular
b)
Ncleos
c) Fig. 3.21. Representao esquemtica de tecido muscular. a) Liso. b) Estriado cardaco. c) Estriado esqueltico.
Existem dois tipos de msculo estriado, o cardaco e o esqueltico, Fig. 3.21b, c. O msculo cardaco constitui as paredes das cavidades do corao. constitudo por clulas ramificadas, ligadas entre si, e a sua contraco automtica ritmada leva ao batimento cardaco. Cada msculo msculo esqueltico um feixe de centenas a milhares de fibras, sendo cada fibra uma clula gigante, com muitos ncleos (sinccio), resultante da fuso de vrias clulas.
3.3. Membrana plasmtica

Todas as membranas protoplasmticas so constitudas por um folheto bimolecular fosfolipdico, no qual esto integradas as protenas membranares, Fig. 3.22. Enquanto algumas protenas se ligam superfcie polar dos lpidos, as protenas extrnsecas, outras, penetram na bicamada, podendo mesmo atravess-la, as protenas intrnsecas. As protenas extrnsecas e as pores das protenas intrnsecas que ocorrem superfcie da face exoplsmica possuem, frequentemente, resduos de acar (i.e., so glicoprotenas). Os acares parecem estar envolvidos num grande nmero de fenmenos fisiolgicos, designadamente no reconhecimento e adeso celulares. Embora possam existir lpidos neutros nas membranas, o folheto bimolecular constitudo, essencialmente, por fosfolpidos. semelhana do que se passa com as protenas, a distribuio dos lpidos na membrana assimtrica. Assim, s existem glicolpidos na sua face exoplsmica. Pese embora a unidade estrutural de todas as membranas protoplasmticas, existem
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diferenas significativas entre as diversas membranas de uma mesma clula, no que diz respeito composio fosfolipdica e proteica. A bicamada fosfolipdica impermevel maioria das molculas polares. De molde a assegurar o transporte destas molculas atravs da membrana, existem protenas especficas que que promovem, de forma selectiva, a transferncia dos diversos solutos. Muitas dessas protenas so enzimas com locais especficos de ligao para as molculas a transportar. Outras h que formam canais atravs dos quais pequenas molculas podem deslocar-se por difuso, segundo gradientes de concentrao e/ou electroqumicos.
Fig. 3.22. Representao esquemtica tridimensional de uma seco da membrana plasmtica (tambm designada de plasmalema ou membrana celular).
Para assegurar o seu metabolismo, uma clula viva tem necessidade de trocar substncias com o meio exterior, incluindo outras clulas. Essas trocas fazem-se atravs da membrana plasmtica, que separa o meio intracelular do meio extracelular. O transporte das mais diversas substncias pode ser determinado por fenmenos de difuso. Neste caso, trata-se de transporte passivo, em que o movimento das molculas de gua e do soluto determinado pela diferena de concentrao entre os meios intra- e extracelulares, i.e. pelo gradiente de concentrao, ou devido existncia de potenciais de membrana, i.e. pelo gradiente electroqumico. As molculas de gua esto em constante movimento atravs da membrana plasmtica. Esse movimento no se traduz em alteraes visveis da forma ou do tamanho da clula devido ao fluxo ser o mesmo em ambas as direces. Quando a concentrao de um qualquer soluto difere, no interior e no exterior da clula, o fluxo da gua direccionado no sentido da maior concentrao de soluto podendo, em consequncia disso, a clula contrair-se ou dilatar-se, consoante os casos. Se da membrana plasmtica permevel s molculas do soluto, ento este difunde-se, sendo o seu fluxo inverso ao do da gua. Existem formas de transporte que no podem ser explicados por simples processos de difuso. difuso. Nesses casos intervm transportadores especficos que tanto promovem o transporte a favor de gradientes de concentrao, difuso facilitada, como contra esses gradientes. Quando o transporte efectuado contra gradientes de concentrao, transporte activo, a clula tem necessidade de recorrer a molculas de elevado potencial qumico como, por exemplo, o ATP. A gua o constituinte essencial da clula, representando 70-90% da massa total da componente citoplasmtica. O teor em gua da clula vegetal pode variar muito com o estdio fisiolgico da planta ou com as condies hdricas do meio. No entanto, o grau de hidratao do hialoplasma varia muito pouco. Com efeito, a perda e a acumulao de gua verifica-se ao nvel
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dos vacolos, como pode ser comprovado pelos fenmenos de plasmlise e de turgescncia, Fig. 3.23. Quando uma clula colocada num meio com tonicidade superior do fluido vacuolar (meio hipertnico) a gua tende a sair do vacolo, conduzindo diminuio do seu volume, e retraco do citoplasma. Este fenmeno, designado plasmlise, reversvel, por desplasmlise, se o meio onde se encontram as clulas for substituido por uma soluo hipotnica. Neste caso, a tonicidade do meio inferior do fluido vacuolar e, como tal, a gua tende a entrar para os vacolos, levando a um aumento do seu volume e pressionando o hialoplasma contra a parede celular. A clula diz-se, nesse caso, trgida.
a)
b)
c)
CH 3
(CH 3 )2 N
d)
N+ H
NH 2
Fig. 3.23. a) - c) Resposta da clula vegetal (clula trgida, incio de plasmlise convexa e plasmlise cncava / convexa com trabculas citoplasmticas) s alteraes da tonacidade do meio extracelular. d) Vermelho neutro.
Os fenmenos de plasmlise e desplasmlise podem ser estudados recorrendo a corantes selectivos e vitais como o vermelho neutro, Fig. 3.23d. O corante selectivo aquele que cora fundamentalmente uma estrutura celular para o qual especfico, neste caso, os vacolos. Diz-se vital porque, apesar de corados, os vacolos no manifestam alteraes das suas propriedades vitais, pelo menos num curto perodo de tempo.
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O vermelho neutro conduzido ao vacolo acabando por se fixar ao colide vacuolar electronegativo. Os corantes vitais so, em regra, electropositivos.
3.4. Movimentos de ciclose

Para que a actividade metablica celular ocorra, necessrio que os substratos, as enzimas, os cofactores e os produtos do metabolismo intermedirio se encontrem, virtualmente, em todos os locais do protoplasma. Em clulas de pequenas dimenses, como as das bactrias e a maioria das clulas animais, a simples difuso permite a rpida deslocao dos diversos solutos ao longo da clula. Sendo as clulas vegetais de grandes dimenses, algumas com 1cm de comprimento, este processo ineficaz. Basta recordar que o tempo dispendido por uma molcula para percorrer, por difuso, um determinado espao varia na razo directa do quadrado da distncia percorrida. No , portanto, de surpreender, que algumas clulas vegetais apresentem correntes citoplasmticas intensas, movimentos de ciclose, que arrastam solutos e organitos, Fig. 3.24. Estas correntes so direccionadas e permitem no s o contacto entre substratos e enzimas produzidos em locais distantes da clula como o transporte intercelular via plasmodesmos. As correntes citoplasmticas parecem ser geradas por filamentos de actina e miosina, tendo os microtbulos a responsabilidade do direccionamento. A velocidade dos movimentos de ciclose varia com a intensidade luminosa, a temperatura e certos agentes qumicos.
Fig. 3.24. Representao esquemtica de movimentos de ciclose, pondo em evidncia a deslocao de gotculas lipdicas atravs das trabculas citoplasmticas em clulas epidrmicas da escama de Allium cepa.
3.5. Vacolos e Incluses vacuolares

Nas clulas vegetais observa-se um nmero varivel de vacolos cuja membrana, o tonoplasto, tem a capacidade de manter constante o pH cido do fluido vacuolar. O volume ocupado pelo conjunto dos vacolos, vacuoma, varia numa clula de 5 a 95%, dependendo do tipo de clula, Fig. 3.25. Na clula vegetal tm como funo transportar ou armazenar nutrientes, metabolitos e produtos finais do metabolismo. Os vacolos surgem na clula jovem provavelmente por dilatao de cisternas do retculo ou por fuso de vesculas derivadas quer do retculo quer dos dictiossomas. Nas clulas meristemticas, o vacuoma reduzido e formado por pequenos vacolos globulares ou filamentosos, dificilmente observveis ao microscpio ptico. No decurso da diferenciao celular, os vacolos so, entre os organitos celulares, os que apresentam desenvolvimento mais notvel. Os minsculos vacolos das clulas meristemticas fundem entre si originando, muitas vezes, no final da diferenciao, um nico vacolo de grandes dimenses, Fig. 3.25. A simples funo de ocupao de espao pelos vacolos, extremamente importante nos vegetais, uma vez que estes tm de crescer para captar energia solar. A estabilidade mecnica conferida pela combinao da parede celular e da presso hdrica, permite que as clulas vegetais vegetais atinjam dimenses apreciveis. A produo de clulas de grandes dimenses, preenchidas unicamente por citosol, seria dispendioso quer em termos de sntese inicial quer em termos de manuteno. Embora algumas clulas sintetizem mais hialoplasma medida que se
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diferenciam, a maioria acumula gua em pequenos vacolos, que coalescem formando um nico vacolo. Esse vacolo pode ser atravessado por trabculas citoplasmticas e, muitas vezes, o hialoplasma aparece comprimido numa pequena faixa, entre o tonoplasto e a parede celular. O fluido vacuolar essencialmente constitudo por gua contendo em soluo ou suspenso diversas substncias. O vacolo pode armazenar muitos tipos de compostos, em particular, substncias potencialmente nefastas para a clula quando em concentraes elevadas no resto do citoplasma.
a)
b) Fig. 3.25. a) Representao esquemtica da evoluo vacuolar numa raiz. b) Representao do aspecto celular da evoluo vacuolar.
A permeabilidade diferencial da membrana plasmtica e do tonoplasto determina que o hialoplasma e o vacolo apresentem composio diversa, relativamente a certos solutos. Como a resistncia mecnica do tonoplasto relativamente baixa, a presso hdrica deve manter-se aproximadamente igual no hialoplasma e no vacolo; ambos devem actuar conjuntamente no controlo do balano osmtico, mantendo desse modo a turgidez celular.
3.5.1. Contedo vacuolar

O contedo vacuolar complexo, e a natureza dos compostos a acumulados varivel em funo da espcie, do tipo celular e do estdio fisiolgico. Algumas substncias acumulam-se exclusivamente no vacolo (antocianinas, inulina, etc.), enquanto outras podem encontrar-se igualmente no hialoplasma (sacarose, malato, aminocidos). Entre os produtos armazenados no vacolo encontram-se alguns de utilidade metablica imediata. Algumas plantas captam CO2 durante a noite e armazenam-no no vacolo sob a forma de malato, at que, em presena de energia luminosa, o possam utilizar na sntese de acares. O vacolo pode acumular tambm
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macromolculas, por perodos mais ou menos longos, como o caso do armazenamento de protenas em muitas sementes. Alguns dos compostos armazenados no vacolo podem desempenhar papel na interaco planta / animal. Como exemplo, refira-se a acumulao de antocianinas nas ptalas, como forma de atrair os polinizadores. Os compostos do vacolo nem sempre tm um papel to inofensivo. As plantas sintetizam e armazenam no vacolo, grande variedade de compostos txicos que so libertados quando as clulas so ingeridas ou, de alguma forma, danificadas. Estes compostos vo desde alcalides extremamente txicos at inibidores da digesto, de sabor desagradvel. As substncias incorporadas no vacolo podem ser agrupadas segundo a sua natureza em:
Sais minerais
A acumulao de nitratos, em particular nitrato de potssio, fosfatos e iodetos comum em certas algas como Fucus e Laminaria.
Substncias orgnicas
Entre as substncias orgnicas acumuladas no vacolo encontram-se os cidos orgnicos (cido mlico na ma, cido ctrico no limo, cido oxlico nas azedas), pigmentos, coumarinas, protenas, taninos, aminocidos, alcalides (morfina e cafena) e glcidos (glucose e frutose em diversos frutos, sacarose na cana de acar e na beterraba sacarina, inulina nas razes da chicria), Fig. 3.26a. A inulina, extrada pela primeira vez da Inula helenium, um glcido de reserva acumulado nos orgos subterrneos, em particular das plantas da famlia das Compostas e das Campanulceas, muitas vezes at 15% do seu peso seco. A inulina constituda por vrias unidades de frutofuranose unidas por ligaes (2-1) com um resduo de sacarose terminal, Fig. 3.26a. Enquanto a clula est viva, este glcido existe em soluo coloidal no interior do vacolo. Por desidratao artificial, numa srie ascendente de lcoois, ocorre a sua cristalizao de encontro parede celular. Formam-se numerosos cristais que se agregam, dando origem a uma estrutura em forma de leque, Fig. 3.26b e c. A acumulao de protenas no vacolo tambm frequente, em particular sob a forma de corpos proteicos entre os quais se salientam os gros de aleurona. Em algumas sementes fortemente desidratadas, as clulas do tecido de reserva no apresentam vacolos de contedo lquido. Nas sementes jovens e ainda no desidratadas, o parnquima de reserva formado por clulas com grandes vacolos. Durante a maturao, a desidratao dos tecidos est associada fragmentao dos vacolos noutros mais numerosos e de menores dimenses. Durante esta fase so a lanadas substncias de reserva, essencialmente protenas. Numa fase final, o contedo dos vacolos solidifica, constituindo-se os gros de aleurona. No caso da semente de rcino, estes gros, bastante volumosos, apresentam uma substncia fundamental contendo um ou dois globides (constitudos essencialmente por um sal derivado do hexafosfato de inositol) e uma importante incluso proteica, de contorno poligonal, o cristalide, Fig. 3.26d. O cristalide e a substncia fundamental so essencialmente constitudos por protena. Durante a germinao, as clulas da semente sofrem uma re-hidratao. Os gros de aleurona aumentam de volume e dissolvem-se por aco de enzimas. Os vacolos assim formados aumentam de tamanho, fundem-se e do origem a um nico vacolo de grandes dimenses. Durante a germinao o vacuoma evolui de forma inversa observada durante a maturao, Fig. 3.26d. Por vezes, o fluido vacuolar corado devido presena de pigmentos, genericamente denominados antocianinas. Numerosas flores e frutos assim como folhas de certas plantas ornamentais, devem a sua cor presena das antocianinas. As antocianinas possuem dois
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ncleos benznicos ligados a um anel heterociclico central, contendo oxignio, Fig. 3.27. A cor das antocianinas depende quer do grau de hidroxilao ou metilao (a hidroxilao responsvel responsvel pelas tonalidades azuis, enquanto a metilao pelas tonalidades vermelhas), quer do grau de quelao (os ies metlicos so quelados por alguns hidroxilos e modificam a cor inicial, em geral na direco da tonalidade azul), quer do pH. Estes pigmentos so, em geral, vermelhos em meio cido e azuis ou prpura em meio alcalino. No entanto, so instveis em meio de elevada alcalinidade porque, nessas condies, o anel heterocclico tem tendncia a cindir.
HOH 2C
H H
OH
HO OH H
H OH O HOH 2C O H H HO CH 2 OH H O HOH 2C O H H HO CH OH H O HOH 2C O OH H

2
H H HO CH 2
a)
b)
c)
Vacolos
Gro de aleurona Globide
Cristalide
d)
Substncia fundamenta
e)
f)
Fig. 3.26. a) Frmula da inulina. b) e c) Formao dos esferocristais de inulina por desidratao em lcool do contedo vacuolar. d) Formao de gros de aleurona durante a fase de maturao da semente (da esquerda para a direita) e sua hidratao durante a fase de germinao (da direita para a esquerda). e) e f) Observao dos gros de aleurona em microscopia ptica.
48

8 7 1 2' 1' 2 3 5 4 6' 3'
Metilao
4'
B
5'
Vermelho
OCH 3
A
6
B Hidroxilao
OH
OH
Estrutura base O A OH O Flavonis O A O B
Pelargonidina
B
OH
Peonidina
OCH 3
OH
OH OH
Cianidina
OH
Petunidina
OCH 3
OH OH
OH OCH 3
Delfinidina
Malvidina Roxo
a)
Flavonas
O
b)
O O OH
Azul
HO
Gluc
-H+
OH
HO HO O O O Gluc
-H+
HO
O+ O OH HO O OH
OH
-H+
O HO O O Gluc
OH
-H
+H2O
+
OH (Gluc)
Pelargonidina-3-Glucsido
OH HO O OH O OH
HO O OH O OH Incolor
OH
Gluc
Gluc
c)
Esverdeado (Descorado)
d)
e)
Fig. 3.27. a) Estrutura base das antocianinas. b) Relao entre a cor das antocianinas e o grau de hidroxilao e metilao do anel B. c) Variao estrutural das antocianinas em soluo aquosa a diferentes valores de pH. d) e e) Observao de vacolos corados em microscopia ptica.
Oxalato de clcio
O cido oxlico um cido dicarboxlico, Fig. 3.28. No vacolo, este cido pode formar
49
oxalatos solveis de sdio e potssio, ou oxalatos insolveis e cristalinos na presena de caties divalentes como o clcio, magnsio, brio ou estrncio. A formao de cristais de oxalato de clcio uma biomineralizao que merece algum detalhe, j que um processo tipicamente vegetal. A cristalizao ocorre em muitas espcies (folhas de begnia, rcino, cebola, etc.), mas apenas em certas clulas, de maiores dimenses, ditas cristalferas, dispersas no parnquima e nos tecidos condutores. As acumulaes de oxalato de clcio aparecem como cristais de formas muito diversas, que dependem da espcie, do grau de hidratao e das condies de cristalizao cristalizao (pH, velocidade): cristais prismticos (nas escamas externas do bolbo da cebola), cristais em agulha ou rfides (no pericarpo da banana, nas folhas do Alle) maclas de cristais em pirmide ou drusas (na folha de Nerium oleander, no caule de Humulus lupulus), etc., Fig. 3.28. Num mesmo orgo podem existir diferentes formas.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Fig. 3.28. a) Converso do cido oxlico em oxalato de clcio. b) h) Cristais de oxalato de clcio: b) e f) cristal isolado tetradrico, c) e g) drusa, d) e h) feixe de rfides e e) pequenos cristais dispersos.
Os diferentes tipos de substncias que podem ser acumuladas no vacolo, acima descritas, podem ainda ser agrupadas segundo derivam do metabolismo primrio da planta, i.e. so intermedirios normais do metabolismo celular resguardados temporria ou permanentemente do hialoplasma (cido mlico, cido oxlico cido ctrico, cido tartrico, cido ascrbico, sacarose, inulina, aminocidos e protenas), ou do metabolismo secundrio, i.e. de vias biossintticas mais especializadas (antocianinas, coumarinas, taninos, alcalides). Este ltimo grupo de susbstncias, susbstncias, tido durante muito tempo como desperdcios fisiolgicos, actualmente considerado considerado como um conjunto de compostos que intervem duma maneira subtil nos equilbrios naturais e nas relaes planta / animal e planta / patogneos, quer como agentes de atraco, quer quer como repelentes e meios de defesa.
50
3.6. Plastos
Como se referiu anteriormente, so basicamente duas as caractersticas que diferenciam as clulas vegetais das clulas animais: a presena de parede celular e a capacidade de realizar a fotossntese. A nutrio vegetal est dependente da produo de compostos orgnicos durante a fotossntese. Nos vegetais superiores esta funo ocorre nos cloroplastos. Os produtos da fotossntese podem ser utilizados directamente em diversos processos biossintticos, armazenados sob a forma de amido, um polissacrido osmoticamente inerte, ou convertidos em sacarose, um acar de baixo peso molecular, que transportada at outros tecidos da planta, consoante as suas necessidade metablicas. Os cloroplastos fazem parte de um grupo mais vasto de organitos, intimamente relacionados, os plastos. Possuem como caractersticas comuns, dimenso superior das mitocndrias, invlucro constitudo por dupla membrana e genoma prprio. De acordo com a colorao que manifestam, possvel distinguir cloroplastos (verdes), cromoplastos (amarelos, alaranjados ou vermelhos) e amiloplastos e leucoplastos (incolores). Os dois primeiros tipos so muitas vezes referenciados como cromatforos. Todos os plastos evoluem a partir de proplastos, organitos relativamente pequenos, que se encontram nas clulas meristemticas. Estes proplastos desenvolvem-se de acordo com as necessidades e condies ambientais de cada clula em diferenciao. Se a clula se desenvolve na escurido, os proplastos evoluem para estioplastos, organitos com arranjo membranar interno semicristalino e com protoclorofila (tambm designada protoclorofilida), um precursor amarelo da clorofila. Se expostos luz, os estioplastos originam cloroplastos, por converso da protoclorofila em clorofila bem como pela sntese de mais componente membranar, pigmentos, enzimas e componentes da cadeia de transporte electrnico.
3.6.1. Cloroplastos
Os cloroplastos so organitos citoplasmticos existentes nas clulas vegetais fotossintticas, Fig. 3.29. Nas clulas dos vegetais superiores o seu nmero varivel. Apresentam-se, em geral, sob a forma de discos lenticulares de 3-10 m de dimetro e 1-2 m de espessura. So facilmente observados ao microscpio ptico devido presena de clorofila que lhes confere a colorao verde caracterstica. As clorofilas a e b e os carotenides (carotenos e xantofilas) so os pigmentos mais importantes nos cloroplastos dos vegetais superiores. Estes pigmentos apresentam espectros de absoro caractersticos e so os responsveis pela absoro de energia luminosa, que fazem graas presena de ligaes duplas conjugadas. Do ponto de vista qumico, as clorofilas so complexos porfirino-magnesianos. Por seu turno, os carotenides so pigmentos de natureza terpnica, lipossolveis e de cor amarela, laranja ou vermelha. Nas algas castanhas, a cor verde, devida s clorofilas a e c, est mascarada por um caroteno de cor amarelo-acastanhada, a fucoxantina. As algas vermelhas e azuis possuem, alm dos carotenides, clorofila a e pigmentos de natureza proteica, as ficobilinas (ficoeritrina, ficocianina e aloficocianina). Outros tipos de clorofila, nomeadamente c, d e e, existem apenas em alguns grupos vegetais. Por seu turno, a bacterioclorofila encontra-se apenas nas bactrias autotrficas. Em microscopia electrnica, Fig. 3.30, observa-se o invlucro cloroplastidial constitudo por dupla membrana: a membrana externa e a membrana interna. Em alguns casos, a membrana interna invagina-se originando uma rede complexa de tbulos, o retculo perifrico. O invlucro cloroplastidial delimita o estroma onde se encontram diversos sculos achatados de natureza membranar, os tilacides.
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a)
b)
Fig. 3.29. a) Distribuio dos cloroplastos numa folha de um vegetal superior. b) Observao de cloroplastos numa folha de Elodea.
Os tilacides esto, regra geral, orientados segundo o eixo maior do cloroplasto. Em termos anatmicos, distinguem-se dois tipos de tilacides: os tilacides dos grana (discos achatados e empilhados uns sobre os outros que correspondem, em microscopia ptica, s zonas de verde mais intenso) e tilacides do estroma (membranas tilacoidais polimrficas que aparecem no estroma, unindo entre si tilacides de grana diferentes ou de um mesmo granum, Fig. 3.30.
a)
b)
Fig. 3.30. a) Representao esquemtica da estrutura de um cloroplasto e b) da organizao dos tilacides dos grana e do estroma.
No estroma finamente granular, observam-se diferentes incluses: glbulos osmifilos ou plastoglbulos, gros de amido, DNA plastidial agrupado em nucleides e ribossomas. Dos constituintes do estroma, apenas os gros de amido so observveis em microscopia ptica, que surgem como estruturas refringentes quando no corados.
Diversidade estrutural dos cloroplastos

A estrutura cloroplastidial descrita tpica dos vegetais superiores. Nas algas verdes, por exemplo, os tilacides formam pilhas de contorno mais ou menos irregular. Nas algas castanhas e nas diatomceas os tilacides agrupam-se em conjuntos de trs ao longo do eixo maior do cloroplasto. J nas algas vermelhas, os tilacides esto todos separados uns dos outros. Como se se referiu, nestas algas, a cor verde da clorofila est mascarada por pigmentos vermelhos de natureza proteica, as ficobilinas. Estes pigmentos associam-se formando partculas, ficobilissomas, ligadas face estromtica dos tilacides. Os cloroplastos sem grana ocorrem igualmente nos vegetais superiores, como na cana-deacar e no milho. Este tipo de cloroplastos existe apenas nas clulas que envolvem os feixes libero-lenhosos das folhas. Nas restantes clulas, os cloroplastos apresentam estrutura tpica. A forma e o nmero dos cloroplastos variam de organismo para organismo. Numerosas algas
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unicelulares ou filamentosas possuem apenas um ou dois cloroplastos por clula, que so de dimenses superiores aos observados nos vegetais superiores. o caso da Spirogyra, Zygnema e Mougeotia, Fig. 3.31. Para alm da forma e dimenso diferente, os cloroplastos das algas possuem ainda um ndice de primitividade no detectada nos vegetais superiores, que a presena de pirenide. O pirenide uma estrutura, de natureza proteica, diferenciada do estroma, que apresenta em microscopia electrnica uma estrutura finamente granular, e em redor do qual se acumula o amido. Esta particularidade torna-os facilmente identificveis em microscopia ptica, recorrendo ao reagente Lugol, que revela o amido depositado em torno do pirenide.
Gro de amido
Pirenide Cloroplasto
A)
B)
C)
D)
E)
Fig. 3.31. Diversidade morfolgica dos cloroplastos das algas: a) Spirogyra sp., b) Pleurosigma angulatum, c) Odegonium sp., d) Zygnema sp., e) Mougeotia sp., com pormenor de pirenide.
3.6.2. Leucoplastos
Os leucoplastos (plastos incolores) existem em rgos vegetativos expostos luz (epiderme e tricomas glandulares) e em orgos subterrneos (razes, bolbos e tubrculos), Fig. 3.32.
Fig. 3.32. Observao, em microscopia ptica, de leucoplastos rodeando o ncleo ().
Os leucoplastos totalmente diferenciados no possuem ribossomas 70S, tpicos dos plastos, nem sistema tilacoidal autnomo, independente do invlucro plastidial. O estroma , muitas vezes, vezes, menos denso do que o dos cloroplastos. A membrana interna do invlucro pode invaginar-
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se, formando um reticulado interno. Os leucoplastos podem acumular amido ou protenas ou participar na sntese de leos essenciais e resinas em clulas glandulares (canais secretores do pinheiro, tricomas glandulares das Labiadas, entre outros).
3.6.3. Amiloplastos
Os amiloplastos existem sobretudo em caules subterrneos, razes tuberculosas e sementes. Dizem-se polimrficos dadas as diferentes formas que assumem, em funo do nmero e volume dos gros de amido acumulados: lenticulares, piriformes, cnicos ou poligonais. Tambm a sua dimenso pode variar de 1-175m. Este tipo de plastos acumula grande quantidade de amido, no possui pigmentos e a sua ultrastrutura muito simples. O estroma reduz-se a uma estreita faixa, comprimida entre os gros de amido e o invlucro plastidial, e as estruturas membranares so raras.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Fig. 3.33. Representao esquemtica de diversos tipos de gros de amido simples a) do trigo, b) da batata, c) feijo, d) da aveia (gros simples associados); semi-composto e) da batata (estrias comuns) e composto f) da batata. g) e h) Observao de gros de amido em microscopia ptica.
A deposio do amido faz-se em camadas sucessivas em torno de um ponto, o hilo, Fig. 3.33. Em determinadas circunstncias, a deposio do amido to elevada que este acaba por ocupar todo o plasto. As estrias mais ou menos concntricas, que se observam em torno do hilo dos gros de amido de algumas espcies, devem-se deposio de amilose e amilopectina. Ambas so polissacridos com ligaes (1-4) mas com caractersticas fisco-qumicas diferentes): enquanto a amilose um polmero linear solvel em gua quente, a amilopectina um polmero ramificado e insolvel. A proporo entre estes dois constituintes depende do tecido e da espcie em estudo (por exemplo, a amilose representa 16% nos gros de amido da banana, 20% na batata, 25% no trigo e 50% em algumas variedades de pera), e determina a tonalidade apresentada quando corados com o reagente de Lugol.
3.6.4. Cromoplastos
A colorao dos cromoplastos deve-se presena de xantofilas (amarelo), carotenos (laranja)
54
e/ou licopenos (vermelho). Estes pigmentos existem no estroma sob a forma de gotculas ou de estruturas cristalinas. O significado biolgico destes plastos mal conhecido. Os cromoplastos so observados em clulas epidrmicas de ptalas de algumas flores (gladolos, amores-perfeitos, chagas, tlipas, calndulas, entre outros), no pericarpo de alguns frutos (tomate, fruto da roseira, entre outros) e em algumas razes como, por exemplo, a da cenoura, Fig. 3.34. Do ponto de vista da microscopia ptica, possvel distinguir dois tipos de cromoplastos: a) fibrilhares, em que os pigmentos (carotenos, licopenos) esto integrados em estruturas fibrilhares e b) globulares, em que os pigmentos (xantofilas) esto incorporados em gotculas lipdicas dispersas no estroma.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
Fig. 3.34. Representao esquemtica de diferentes tipos de cromoplastos. a) Rosa canina, b) Calendula vulgaris, c) Forsythia suspensa, d) Gladiolus sp., e) Viola tricolor. f) e g) observao de cromoplastos em microscopia ptica.
3.6.5. Proteoplastos
Este tipo de plastos pouco frequente. Observam-se no saco embrionrio de algumas espcies e no parnquima radicular de algumas orqudeas. As protenas acumulam-se no estroma sob a forma de feixes ou fibrilhas.
3.7. Ncleo
O ncleo a unidade estrutural e funcional de importncia vital para a clula, responsvel pelas caractersticas hereditrias sob a forma de DNA replicvel. Nos eucariotas, o ncleo existe em todas as clulas, excepto nos eritrcitos dos vertebrados superiores. A sua forma determinada pelo tipo de clula e presso vacuolar, varivel: esfrica, oblongo, discide, lobulada ou amebide. De igual modo, tanto a sua dimenso (que est estritamente relacionada com a massa citoplasmtica: relao ncleo/citoplasma) como a sua localizao na clula variam com o tipo celular, Fig. 3.35. De um modo geral, as clulas no possuem mais de um ncleo. No entanto, no raro
55
observarem-se clulas, como por exemplo no fgado, com dois ncleos. Atendendo ao modo de formao, as clulas polinucleadas so designadas plasmdios (quando a multiplicao nuclear no acompanhada pela correspondente citocinese) ou sinccios (quando resultam da fuso de vrias clulas). Ao microscpio ptico, os ncleos apresentam-se como zonas mais ou menos refringentes, raras vezes com movimentos muito lentos de rotao e oscilao. Aps colorao com corantes bsicos, observam-se, no seio do nucleoplasma pouco corado, o nuclolo e zonas mais cromfilas, constituindo estas a rede cromatnica. A presena de invlucro nuclear, separando o nucleoplasma do hialoplasma, a principal caracterstica que permite distinguir os organismos eucariotas dos procariotas. Ao microscpio electrnico, o invlucro nuclear aparece como uma diferenciao local do retculo endoplasmtico, caracterizada pela presena de numerosos poros, poros nucleares, Fig. 3.35, e ribossomas na face hialoplasmtica da membrana externa. O espao entre a membrana interna e a externa designado espao perinuclear.
a)
b) Fig. 3.35. a) Representao esquemtica do ncleo interfsico. b) 1-2 Ncleo interfsico observado em microscopia electrnica de transmisso.
Nos eucariotas, o nucleoplasma um gel proteico com propriedades comparveis s do citoplasma. Os nuclolos, Fig. 3.35, so estruturas densas, esfricas ou ovides, em nmero definido nos ncleos profsicos e interfsicos de todos os organismos superiores. Os nuclolos so diferenciaes cromossmicas funcionais, responsveis pela sntese da quase totalidade do RNA ribossomal. A cromatina uma zona densa, de estrutura fibrilhar, que cora com corantes bsicos (os grupos fosfato dos cidos nucleicos, carregados negativamente, fixam corantes com carga positiva) sendo a este nvel que o DNA cromossmico se associa s histonas (protenas acidfilas). O tempo que medeia duas divises celulares sucessivas designa-se interfase. Durante este perodo, o ncleo, ncleo interfsico, aparentemente em repouso, controla a sntese proteica, a gliclise, a sntese de ATP, e outros processos vitais. Pouco tempo antes da diviso celular, o ncleo assegura a duplicao da informao hereditria, promovendo a sntese de novo DNA. O controlo da actividade celular deve-se transmisso, para o citoplasma, da informao contida no DNA, por intermdio do RNA mensageiro.
56
3.7.1 Ciclo celular

O perodo de vida de uma clula comea quando esta se forma por diviso da clula me e acaba quando a clula d origem a uma clula filha, ou quando ocorre morte celular. O ciclo celular compreende um conjunto de fenmenos que ocorrem numa clula, desde que se forma, por diviso da clula-me, at ao momento em que d origem a clulas filhas. O ciclo celular pode ser dividido em duas fases: a fase M, que compreende a mitose e citocinse, e a interfase, Fig. 3.36. A durao do ciclo celular requer perodos variveis de tempo, dependendo do tipo de clula e de factores externos, como a temperatura e a disponibilidade de nutrientes.
G2 S
Profase Metafase Anafase Mitose Fase M
G1
Telofase Citocinse
Fig. 3.36. Cronologia do ciclo celular.
A maior parte do ciclo preenchida pela interfase, delimitada pelo final de uma diviso e pelo incio da seguinte. A durao desta fase varia em funo da natureza e condies fisiolgicas da clula: as clulas intestinais dividem-se duas vezes por dia, enquanto as clulas hepticas uma a duas vezes por ano. A interfase pode ser dividida nos seguintes perodos: G1, S e G2 (G de "gap" = intervalo, S de sntese), Fig. 3.36. O perodo G1 o que sucede a uma mitose, sendo a sua durao varivel de clula para clula. Neste perodo, enquanto se verifica um aumento significativo do volume do citoplasma, a quantidade de DNA permanece constante. Ao mesmo tempo os vrios organitos aumentam de nmero. No final da fase G1 a clula pode entrar em fase G0 (diferenciao celular) ou na fase S (proliferao celular). No perodo S, a totalidade do DNA nuclear replicada. No perodo G2, o ncleo e a clula preparam-se para entrar em diviso: dividem-se as mitocndrias e outros organitos e forma-se o fuso acromtico.
3.7.2. Mitose
Pela mitose formam-se dois ncleos filhos com o mesmo nmero de cromossomas do ncleo original e morfologica e geneticamente equivalentes entre si. Por mitose e citocinse (diviso celular) os organismos crescem por aumento do nmero de clulas e reparam tecidos danificados, substituindo clulas feridas ou mortas. No individuo adulto, estima-se que 25 milhes de clulas por segundo esto em diviso. Estas clulas destinam-se a substituir clulas velhas e mortas. Os eritrcitos velhos, por exemplo, so renovados a uma velocidade de 100 milhes/min. Nas plantas, a diviso nuclear e celular ocorre em reas especficas de clulas embrionrias, meristemas, localizados nas extremidades de caules e razes e no cmbio. Nas clulas animais possvel observar diferentes estdios de mitose em embries. Durante a diviso nuclear ou mitose, Fig. 3.37, 3.39, regista-se uma alterao progressiva da
57
estrutura e morfologia dos cromossomas. Embora a mitose seja um processo contnuo, ela dividida, por convenincia, em quatro etapas: profase, metafase, anafase e telofase. A durao da mitose varia com o tecido e organismo. Contudo, normalmente a profase o processo mais longo e a anafase o mais curto. Numa raz os perodos de tempo so, normalmente: profase 1-2h, metafase 5-15min, anafase 2-10min, e telofase 10-30min. A interfase dura normalmente 12-30h.
a)
b)
c)
d)
e) Fig. 3.37. Diversos estdios de mitose em clulas vegetais.
Profase
caracterizada pela condensao dos cromossomas, o desaparecimento dos nuclolos e do invlucro nuclear e formao dos microtbulos do fuso acromtico. Se no perodo que antecede a profase a clula apresenta centrolos, estes dividem-se e deslocam-se para os plos logo que o fuso se forma. Os cromossomas tornam-se distintos ao microscpio ptico, em consequncia do seu progressivo encurtamento e engrossamento por espiralao. Por vezes possvel verem-se os cromatdeos ligados pelo centrmero (sequncia especfica de DNA necessria ligao do cromossoma ao fuso). O aparecimento dos cromatdeos deve-se replicao do DNA cromossmico durante a fase S da interfase do ciclo celular. Na fase final da profase, o fuso acromtico alonga-se entre dois plos diametralmente opostos e os cromossomas alinham-se ao centro do fuso. As clulas animais possuem centrolos,
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estruturas envolvidas na organizao do fuso acromtico, que esto ausentes das clulas vegetais. Diferenciam-se os cinetocoros, sob a forma de condensaes lineares situadas de cada lado dos centrmeros. Os cinetocoros funcionam como centros organizadores de microtbulos (MTOCs).
Metafase
Na metafase, os centrmeros dos cromossomas esto ligados a fibras do fuso e alinhados ao longo da placa celular. Os centrmeros so duplicados e cada cromatdeo converte-se num cromossoma individualizado. Cada um dos cromossomas, assim formados, est ligado a uma fibra do fuso fixa a um dos plos.
Anafase
O incio da anafase caracterizada pela ascenso dos cromossomas para os plos. nesta fase que substncias como a colchicina, que interferem na formao e funo dos microtbulos, inibem a mitose. Sem microtbulos para afastar os cromossomas em direces diametralmente opostas na clula, o ncleo no se pode dividir em dois. Contudo, os centrmeros separam-se, permitindo a separao dos cromatdeos e, consequentemente a duplicao do nmero de cromossomas na clula. Durante a anafase tem incio um processo denominado citocinese, que divide a clula em duas.
Telofase
Na fase final da mitose, ou seja, na telofase, os cromossomas atingem os plos do fuso acromtico ao mesmo tempo que se inicia o seu processo de descondensao. Durante a telofase reaparece o nuclolo bem como o invlucro nuclear. Embora a citocinese seja um processo distinto do da diviso nuclear ela muitas vezes com ele sncrono, tornando-se mais evidente no final da telofase. Este processo decorre de modo diferente em clulas animais e vegetais. Nas clulas animais observa-se a formao de uma depresso na zona mediana da clula que vai aprofundando cada vez mais, at que as clulas acabem por se separar. Nas clulas vegetais a formao da nova parede celular comea na zona mediana da clula e vai crescendo para as extremidades opostas, at encontrar as paredes laterais da clula me. A formao da nova parede celular comea com a construo do seu precursor, a placa celular. O primeiro sinal da formao da placa celular comea no final da anafase incio da telofase, com o aparecimento do fragmoplasto, na zona mediana da clula em diviso. O fragmoplasto corresponde ao conjunto de microtbulos que se dispem na zona mdia de cada lado da placa celular, aos quais esto associadas vesculas que contm material denso aos electres. Depois da formao do fragmoplasto as vesculas golgianas movem-se para a zona mediana da clula, e fundem-se entre si originando a placa celular. Esta vai crescendo por adio de mais vesculas at a clula ficar separada em duas. As membranas das vesculas do origem membrana plasmtica, enquanto os produtos de secreo, contidos nas vesculas, contribuem para a formao da parede celular. Os plasmodesmos primrios formam-se nesta altura por aprisionamento de pores de RE entre as vesculas Golgianas que se fundem.
3.7.3. Meiose
A meiose uma forma de diviso nuclear de importncia fundamental entre os organismos com reproduo sexuada que resulta na formao de clulas reprodutoras designadas gmetas nos animais e esporos nos vegetais. Em contraste com a mitose, da meiose resulta diversidade
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gentica. Os gmetas no s so geneticamente diferentes da clula me, como so diferentes entre si. A meiose ocorre nos eucariotas cujas clulas contm nmero diplide de cromossomas (2n). A diploidia, entendida numa perspectiva gentica, implica que a informao contida num cromossoma esteja tambm armazenada num segundo cromossoma nuclear, cromossoma homlogo. Durante a meiose, os cromossomas replicados no ncleo so segregados pelos quatro ncleos filhos (clulas haplides), recebendo cada um deles metade do nmero de cromossomas da clula me (clula diplide). Embora estes ncleos possuam apenas metade do nmero de cromossomas, eles esto dotados da informao gentica completa porquanto recebem um membro de cada um dos pares de cromossomas homlogos. A segregao dos cromossomas homlogos faz-se ao acaso, durante a anafase, o que explica a grande variabilidade gentica que caracteriza os organismos com reproduo sexuada. importante salientar que para essa variabilidade contribui tambm um processo denominado crossing-over que tem lugar durante a profase da primeira diviso nuclear. A meiose, semelhana da mitose, pode ser dividida em fases caractersticas, Figs. 3.28-3.30:
Centrolos
Cromatina Nuclolo Interfase I Profase I
Metafase I
Anafase I
Telofase I
Interfase II
Profase II Metafase II Anafase II
Telofase II
4 gmetas
Fig. 3.38 Representao esquemtica dos diversos estdios da meiose.
Meiose I
Profase I
1. Leptteno. Os cromossomas, embora delgados e compridos (Lepto - delgado), tornam-se visveis medida que vo espiralando. Nesta fase, os cromossomas aparecem formados por dois cromatdeos. 2. Zigteno. Os cromossomas homlogos emparelham-se (Zigo = conjugao) formando dadas cromossmicas. nesta fase que os cromatdeos dos cromossomas homlogos se sobrepem ("crossing-over" ou quiasmas) e trocam pequenas pores de DNA, o que determina novas combinaes genticas nas geraes futuras. 3. Paquteno. Durante esta fase os cromatdeos tornam-se bem evidentes devido ao aumento de espessura e diminuio de comprimento (Paqui = grosso) resultantes de um elevado grau de espiralao.
60
4. Diplteno. Esta fase caracterizada pela separao dos cromossomas homlogos, excepto ao nvel dos quiasmas. Cada dada cromossmica constituda por quatro cromatdeos, ttrada cromatdica. 5. Diacinese. Com a diacinese termina a profase I. Os cromossomas afastam-se (Dia = separar) ao mesmo tempo que se desorganiza o invlucro nuclear.
Metafase I
Nesta fase forma-se o fuso acromtico e as dadas alinham-se na placa celular. Os centrmeros dos cromossomas homlogos ligam-se a fibras do fuso que emergem de plos opostos.
Anafase I
Os cromossomas homlogos separam-se uns dos outros e migram para plos opostos do fuso.
Telofase I
Com a telofase I termina a primeira diviso meitica do ncleo. Os cromossomas homlogos, cada um formado por dois cromatdeos, encontram-se separados nos respectivos plos, sendo por isso visveis duas reas nucleares. Em muitos organismos forma-se um novo invlucro nuclear e observa-se alguma desespiralao dos cromossomas.
Intercinese
A intercinese um perodo muito curto que separa o final da telofase I e o incio da profase II. Durante este perodo, o DNA dos dois ncleos formados durante a primeira diviso nuclear da meiose no sofre qualquer replicao. Meiose II
Profase II
Embora cada ncleo possua apenas metade do nmero de cromossomas, esta fase em tudo idntica profase de mitose. Cada cromossoma composto pelos dois cromatdeos formados na profase I.
Metafase II
Esta fase idntica metafase mittica. Os cromossomas, com os dois cromatdeos, migram para o centro do fuso acromtico.
Anafase II
Na anafase II os cromatdeos de um mesmo cromossoma separam-se e d-se a sua ascenso para os plos opostos do fuso.
Telofase II
Esta fase tambm idntica telofase mittica. Forma-se o invlucro nuclear em torno de cada conjunto de cromossomas que migrou para os respectivos plos e tem incio a desespiralao cromossmica.
61
Fig. 3.39 Aspecto, em microscopia ptica, de diversos estdios da meiose II.
Mitose
Meiose
Fig. 3.30 Representao esquemtica comparativa da mitose e da meiose.
62
4. MICROSCOPIA ELECTRNICA DE VARRIMENTO E DE TRANSMISSO

O estudo morfolgico de organismos vivos bem como das suas clulas pode ser efectuado tanto por microscopia ptica como por microscopia electrnica de varrimento ou de transmisso. Existem vrias diferenas entre os trs tipos de microscopia, Tabela 4.1, Fig. 4.1.
Tabela 4.1. Comparao entre microscopia ptica, microscopia electrnica de varrimento e de transmisso. Mic. Electrnico de Transmisso Filamento deTungstnio Electres Vcuo <10 6 Pa Electromagnticas 0,14 nm Elevada Alterao da corrente Alterao da largura das lentes de de varrimento ampliao Electres secundrios Disperso/Difraco Converso de Converso de electres em fotes e electres em fotes anlise em monitor de por um alvo televiso fluorescente < 10 mm < 1 m Relativamente fcil Difcil Mic. Electrnico de Varrimento Filamento deTungstnio Electres Vcuo <10-4 Pa Electromagnticas 5 nm Muito elevada
Mic. ptico Fonte de Radiao Tipo de radiao Meio de propagao Lentes Resoluo Profundidade de foco Modo de ampliao Contraste Observao Espessura do espcime Preparao de espcime Filamento deTungstnio Fotes Atmosfera Vidro ou Quartzo 200 nm Reduzida Substituio das lentes Absoro/ Reflexo Directa da imagem luminosa > 0,5 m Fcil
4.1. Microscopia electrnica de transmisso

No microscpio electrnico de transmisso o feixe de electres emitido pelo filamento atravessa o espcime. Os electres do feixe, emitidos pelo filamento, so acelerados por uma diferena de potencial gerada entre o nodo e o ctodo e direccionados para o espcime pelas lentes do condensador (Sistema de iluminao). Depois de atravessarem a amostra e a objectiva, os electres so encaminhados para o sistema de lentes formadoras da imagem. Este sistema constitudo por trs lentes: a lente intermediria, a 1 projectora e a 2 projectora (Sistema de imagem). A imagem observada pela projeco dos electres que atravessam o espcime num alvo impregnado com sulfureto de zinco. As molculas do alvo so excitadas pelo impacto dos electres e, quando regressam ao estado fundamental, emitem luz visvel, Fig. 4.2. No microscpio electrnico, a manipulao das lentes faz-se variando a corrente que por elas passa, o que determina alterao do respectivo campo magntico. A coluna atravs da qual fluem os electres encontra-se sob vcuo. Quando a presso no seu interior no adequada, os electres so deflectidos pelas molculas de ar residual. Embora seja possvel obter feixes de electres altamente energticos e, por conseguinte, penetrantes, a microscopia electrnica de transmisso de rotina requer seces ultrafinas ( 6090nm de espessura) do material a observar. Para se obterem estas seces de material biolgico, torna-se necessrio recorrer a mtodos que lhe confiram a rigidez necessria, como por exemplo a congelao. No entanto, o mtodo mais comum consiste na impregnao do tecido com resinas sintticas do tipo da Araldite. Como estas resinas no so miscveis com a gua, o tecido deve ser previamente desidratado. De molde a suportar todos estes tratamentos, o material biolgico tem de ser fixado com o objectivo de estabilizar quimicamente a ultrastrutura da clula, Fig. 4.3. O melhor fixador para um tecido particular aquele que preserva maior nmero de estruturas. Muitas variveis podem influir
63
na qualidade do resultado. Um dos grandes problemas encontrados na preparao de material para microscopia electrnica a escolha do fixador adequado. Alm disso, o pH, a tonicidade da soluo fixadora, a temperatura e a durao da fixao so factores a ter em conta.
PODER DE RESOLUO 10 10 10 10 10
1
ESCALA
EXEMPLO
1000 MILMETRO (mm) 100 10 1 1000 100 10 1
1,8 m Altura de um Homem 200 mm Raio do ovo de avestruz, clula gigante
-1
-2
-3
5 mm Raio duma clula de alga gigante
Olho -4 10 nu METRO (m) 10 10 10 10 10 MET

-5
MICRMETRO (m)
15 m Raio do ncleo 10 m Comprimento de um cromossoma 1 m Dimenso de uma mitocndria 430 nm Dimenso do vrus do mosaico do tabaco 100 nm Dimenso de um gene
-6
1000 NANMETRO (nm) 100
MO MEV
-7
ANGSTROM ()
-8
10 1
15 nm Raio do vrus do mosaico do tabaco 10 nm Raio de pequenos vrus 10 6 nm Raio das mais pequenas partculas de ouro 1 5 Raio de uma molcula de aminocido
-9
10 -10
Fig. 4.1. Comparao do poder de resoluo dos diferentes microscpios.
Cabo de Alta Tenso Canho Filamento Emissor Condensador Porta-objectos Objectiva Lente Intermediria Projectoras
Janela de observao Alvo fluorescente Placa fotogrfica
Vcuo
Fig. 4.2. Foto e representao esquemtica do microscpio electrnico de transmisso 64
4.1.1. Fixao
Os fixadores qumicos so de dois tipos: coagulantes e no coagulantes. No primeiro caso encontram-se o lcool, a acetona e o cido actico e no segundo os aldedos (formaldedo e glutaraldedo) e o tetrxido de smio. Na prtica, normal recorrer-se fixao dupla aldedo/ smio a fim de estabilizar o maior nmero de componentes das estruturas celulares. Na fixao aldedica, pr-fixao, utiliza-se frequentemente o glutaraldedo. O grau de estabilidade das moleculas fixadas funo do aldedo utilizado, dimenso do material, composio do tampo, durao do processo, temperatura, concentrao e rapidez de penetrao. A fixao deve ocorrer em meio tamponado, pH 7.2-7.5, e a temperatura prxima de 4C, para evitar as alteraes ps-mortem, resultantes da aco de enzimas hidrolticas libertadas em consequncia da ruptura de algumas clulas. A dimenso do material tambm um factor determinante. Este no deve possuir mais de 1mm3 para possibilitar uma adequada penetrao do fixador. O tempo de fixao deve ser ajustado a cada situao, devendo resultar do compromisso entre uma boa fixao e uma pequena extraco. pr-fixao segue-se uma ps-fixao com tetrxido de smio em soluo aquosa, a 4C.
Fixao Qumica Desidratao
Fixao aldedica
Lavagens no tampo de fixao
Ps-fixao em tetrxido de smio
Lavagens no tampo de fixao ou em gua
Desidratao numa srie ascendente de acetonas
Orientao
Resina pura
Mudana de xido de propileno para mistura de impregnao: Resina : xido Propileno
xido de Propileno
Incluso
Impregnao
60 C Seccionamento em tronco de pirmide
Polimerizao
Ultramicrotomia
Contrastao
Fig. 4.3. Principais passos da preparao de material biolgico para microscopia electrnica de transmisso.
4.1.2. Lavagens
As lavagens so necessrias para remoo do fixador que no reagiu. No devem ser prolongadas porque podem conduzir extraco e diminuio de volume, e devem decorrer no mesmo solvente dos fixadores para evitar desintegrao e extraco de material no fixado, por
65
alterao drstica do ambiente celular e da selectividade membranar.
4.1.3. Desidratao
A desidratao necessria para substituir a gua do material biolgico por outro lquido miscvel com as resinas de impregnao. normalmente realizada em acetona (parcialmente miscvel nas resinas de impregnao).
4.1.4. Impregnao e Incluso

A finalidade da impregnao e incluso poder manejar o tecido num meio slido que tenha suficiente resistncia para que dele se possam obter cortes finos. Consiste em infiltrar o tecido fixado e desidratado com uma mistura resinas que polimerizam em presena de um catalizador, em tempo apropriado.
4.1.5. Seccionamento
Do mesmo bloco, podem obter-se seces de diferente espessura, para observao quer em microscopia electrnica (10-100nm), quer em microscopia ptica (0,5-10).
4.1.6. Contrastao
Os materiais biolgicos so constituidos maioritariamente por molculas contendo C, H, O e N e poucos elementos de elevado massa atmica, pelo que so transparentes aos electres. O problema ainda maior em cortes finos porque a composio qumica dos componentes celulares idntica da resina. O contrastante deve aumentar o poder de disperso dos electres, ser selectivo e ter densidade superior do meio de incluso, Fig. 4.8.
4.2. Microscopia electrnica de varrimento

No microscpio electrnico de varrimento, ao contrrio do que se verifica no de transmisso, o feixe de electres emitido pelo filamento no atravessa o espcime. Os princpios por que se rege o funcionamento dos dois microscpios tambm diferente. O microscpio electrnico de varrimento permite obter imagens tridimensionais de superfcies. Neste microscpio, os electres emitidos pelo filamento, electres primrios, ao interagirem com o espcime promovem a emisso de electres, electres secundrios, da sua superfcie. Os electres do feixe varrem rapidamente a superfcie da amostra, obtendo-se assim grande nmero de electres secundrios. O maior nmero destes electres emitido pelas zonas mais proeminentes. Deste modo, o nmero de electres secundrios produzidos por cada ponto da superfcie da amostra, bem como a direco em que so emitidos, esto intimamente relacionados com a sua topografia. Os electres ejectados so acelerados em direco a um cintilador localizado lateralmente em relao ao espcime. As cintilaes luminosas, produzidas pelo impacto dos electres secundrios no cintilador, so conduzidos a um fotomultiplicador. Os impulsos elctricos, gerados a este nvel, so em seguida conduzidos a um tubo de raios catdicos. Obtm-se assim uma imagem de televiso a branco e preto. O varrimento da superfcie da amostra, pelo feixe de electres primrios, est sincronizado com a projeco do feixe no monitor da televiso, de tal modo que a cada ponto do espcime corresponde uma regio da imagem no monitor, Fig. 4.4.
66
Alta Tenso Canho Filamento Emissor
Condensador
Circuito de varrimento
Objectiva Bobina de varrimento Porta-objectos

Amplificador Detector Placa fotogrfica
Vcuo
cran
Fig. 4.4. Representao esquemtica do microscpio electrnico de varrimento.
Tal como no caso da microscopia electrnica de transmisso, o material biolgico deve ser, neste caso, previamente tratado de forma a preservar-se a sua estrutura e eliminar a gua tecidual. Com este objectivo, o material deve ser sujeito a um dos tratamentos a seguir esquematizados, Fig. 4.5. A escolha da processo de secagem depende, normalmente, das condies materiais do laboratrio. Pese embora este facto, importante ter-se uma ideia precisa sobre as diferenas qualitativas entre os dois mtodos.
Secagem ao ar Material Fixao Lavagens Ps-fixao Lavagens Secagem ao ar Desidratao Fludo Intermedirio Fludo de transio Secagem pelo Mtodo do Ponto crtico Metalizao Observao Criossecagem Criossecagem Criossecagem
Fig. 4.5. Esquema do procedimento geral a que deve ser submetido o material biolgico para observao em microscopia electrnica de varrimento.
4.2.1. Secagem ao ar
excepo de alguns tipos de material (diatomceas, esporos, entre outros) um processo que conduz a grandes alteraes morfolgicas do material (as foras a que o material sujeito podem atingir 46.000Kg/ cm 2).
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4.2.2. Criossecagem
A criossecagem requer uma congelao prvia do material. Esta congelao deve processarse rapidamente de molde a evitar a formao de cristais de gelo de grandes dimenses no interior das clulas. A temperatura extremamente baixa do azoto lquido (-15OC) adequada a este fim. No entanto, a imerso do tecido neste lquido criognico leva libertao violenta de azoto gasoso, devida grande diferena de temperatura, o que danifica o material. O propano lquido, com ponto de ebulio de -42C e de fuso de -l87C, substitui com vantagem o azoto lquido porquanto impede a formao de cristais de gelo de grandes dimenses e no liberta bolhas de gs. A secagem do material processa-se lentamente, a presso e temperatura muito baixas (10-1 Pa a - 65C). A sublimao lenta do gelo evita que o tecido seja danificado. Os tecidos sujeitos criossecagem sofrem, regra geral, uma reduo de volume de cerca de 15%.
4.2.3. Secagem pelo mtodo do ponto crtico

A secagem pelo mtodo do ponto crtico mais rpida do que a criossecagem. No entanto, como este ltima no requer desidratao do material com solventes orgnicos, torna-se menos agressiva. Embora se verifique contraco do material em qualquer dos processos, ela mais acentuada na secagem pelo mtodo do ponto crtico.
Sada de gs Manmetros Presso Temperatura Entrada de lquido Sada de gua
Janela de vidro
Cmara Material pressurizada
Entrada de gua quente
Sada Vlvula de Porta presso de de lquido segurana
Fig. 4.6. Aparelho de secagem pelo mtodo do ponto crtico.
Depois de desidratado numa srie ascendente de acetonas, o material transferido para o interior de uma cmara, onde a acetona substituida por CO2 lquido, sob presso. A cmara em seguida aquecida, o que leva a que o fluido (CO2 lquido) se expanda e evapore, Fig. 4.6. Desta forma, a densidade da fase lquida diminui enquanto a da fase gasosa aumenta, mas sem que a densidade total do fluido, em ambas as fases, se altere. Quando, pelo aumento de temperatura, a densidade de fase lquida idntica da fase gasosa, a tenso superficial zero e desaparece o menisco de separao das fases, a temperatura crtica e o ponto crtico. O material seco por este processo pode apresentar uma reduo de volume de aproximadamente 40%. Para esta reduo, contribui significativamente o emprego de solventes orgnicos durante a desidratao.
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4.2.4. Metalizao
A composio elementar do material biolgico (C, O, H, N, P, S) no favorece a emisso electres secundrios. De igual modo, a sua condutividade no tambm a melhor pelo que, para ser possvel fazer-se uma observao de qualidade, se torna necessrio revestir o espcime com material condutor e denso como, por exemplo, ouro ou ouro/paldio, Figs 4.7 e 4.8.
0,5 - 2,0 KV
Placa de ouro Parede de vidro da cmpanula Material no suporte

nodo
Ctodo
Entrada de Argon
Vcuo
- tomos de Argon carregados positivamente - tomos de ouro
Fig. 4.7. Aparelho de metalizao.
a)
b) Fig. 4.8. a) Observao de material em microscopia electrnica de varrimento (1) e de transmisso (2) e b) cortes semi-finos de material preparado para microscopia electrnica de transmisso.
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5. PROTOCOLOS
1 Protocolo - Microscopia ptica 1. Introduo utilizao do Microscpio ptico (focagem e alinhamento do microscpio, preparao do material biolgico). Iluminao de de Khler.
a) Destacar a epiderme da pgina abaxial da folha de Kalanchoe blossfeldiana. b) Montar em gua, cobrir com lamela, e observar.
2. Diferentes tipos de Microscopia ptica.
3. Medies em Microscopia ptica. Utilizao de ocular e objectiva micromtrica.
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2 Protocolo - Microscopia ptica (Continuao), Observao de Procariotas 1. Observao de bactrias da saliva (Streptococcus, Staphylococcus e Bacillus) ou do Iogurte (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgarus).
a) Colocar, numa lmina de vidro, uma gota de material a observar e espalh-la na superfcie de 1cm2. b) Secar lentamente chama (cerca de 5 min). No proceder a secagem rpida para evitar fissuras no esfregao. c) Colocar uma gota de soluo de Soluo de Lfler* e deixar corar durante 10 min. d) Escorrer o corante. e) Lavar suavemente com gua. f) Secar a lmina de vidro apenas na face sem esfregao. g) Observar.
* Alternativamente pode ser utilizada a soluo de Newman-Lampert, sendo, nesse caso, necessrio secar lentamente chama
2. Observao de preparaes definitivas de cocus, bacilos e espirilos coradas com safranina ou com a colorao de Gram.
3. Utilizao de ocular e objectiva micromtrica.
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Protocolo - Observao de Procariotas (Continuao), Observao Unicelulares, Coloniais e Filamentosas e de Protozorios de gua-Doce
de
Algas
1. Observao de cianobactrias: colnias de Nostoc ou Anabaena sp. em associao com o feto aqutico, Azolla filiculoides.
a) No caso da Anabaena destaque uma pequena poro da folha de Azolla filiculoides, seccione finamente e monte entre lmina e lamela. Observe, esquematize e legende, as colnias da cianobactria.
2. Com uma pipeta retire uma gota da amostra de lodo e coloque-a numa lmina de vidro. Coloque igualmente alguns filamentos das algas que lhe sero fornecidas. Monte entre lmina e lamela e observe ao microscpio.
3. Utilizao de ocular e objectiva micromtrica.
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Vorticella
Diatomaceas
Scenedesmus
Cosmarium
Pediastrum
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4 Protocolo - Observao da Matriz extracelular (matriz extracelular vegetal ou parede celular) 1. Caracterizao histoqumica dos constituintes de parede celular.
a) Efectue cortes transversais em caules jovens de Ruscus sp. b) Efectue a colorao com Azul de Toluidina*. I. Imerso em hipoclorito de sdio 30min II. Lavagem em gua actica 1% III. Lavagem em H20 IV. Imerso em Azul de Toluidina 0.05% V. Lavagem em H20, montagem e observao
2min 1min 5min
Resultado da colorao: Paredes celulares celulsicas rosa; paredes celulares lenhificadas - azul.
* Alternativamente pode ser utilizada a dupla colorao verde iodo/ carmim aluminado
I. Imerso em hipoclorito de sdio II. Lavagem em gua actica 1 % III. Imerso em verde iodo IV. Lavagem em H20 V. Imerso em carmim aluminado VI. Lavagem em H20, montagem e observao 30 min 2 min 10 seg 1 min 10 min
Resultado da colorao: Paredes celulares celulsicas rosa; paredes celulares lenhificadas - verde.
2. Identificao de paredes celulsicas, paredes lenhificadas e paredes suberificadas.

a) Observe a preparao definitiva que lhe foi distribuda. b) Faa o esquema de uma seco do corte e legende-o atendendo constituio das paredes celulares.
3. Caracterizao histoqumica da cutcula da folha de Ficus sp. e observao de cistlitos.

a) Efectue cortes transversais na folha. b) Coloque os cortes em Vermelho Sudo III, durante 5 min. c) Lavagem rpida em etanol a 50 % (desdiferenciao). d) Lavagem rpida em gua e montagem.
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5 Protocolo - Observao da Matriz extracelular (Matriz extracelular animal) 1. Observao de matriz extracelular em tecido cartilagneo.
a) Efectue cortes numa poro de tecido cartilagneo e coloque-os em gua. b) Coloque os cortes em Azul de Toluidina 0.05%, durante 10min. c) Lavagem rpida em gua e montagem.
2. Observao de matriz extracelular em preparaes definitivas de diversos tipos de tecidos animais.
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6 Protocolo - Observao da Parede Celular (Continuao) 1. Observao de pontuaes da parede celular.

a) Destaque uma poro de epiderme da pgina da folha ou do caule de Dianthus sp. e monte entre lmina e lamela. b) Observe atentamente ao nvel da parede celular e desenhe as pontuaes a existentes.
2. Observao de paredes celulares mineralizadas.

a) Destaque uma pequena poro da epiderme do caule de Urtica dioica. Monte entre lmina e lamela numa gota de gua. c) Faa um esquema legendado.
3. Observao de paredes celulares de reserva

a) Faa cortes transversais do fruto da palmeira (Attalea sp.) b) Efectue a dupla colorao com cido peridico / Reagente de Schiff (P.A.S.) I. Imerso em tetrahidreto boreto de sdio 1 % (preparar na altura) 30 min II. cido Peridico 1% 10 min III. Lavagem rpida em H20 IV. Imerso em Reagente de Schiff 30 min c) Lavagem em Metabissulfito de Sdio 0.5 % 5 min d) Lavagem em H20 d) Monte entre lmina e lamela numa gota de gua. Observe e faa um esquema legendado.
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7 Protocolo - Estudo da Plasmlise e Desplasmlise e Determinao da Permeabilidade Membranar 1. Observao da membrana plasmtica (plasmalema ou membrana celular) por induo de plasmlise
a) Destaque uma pequena poro da epiderme interna de uma escama do bolbo de Allium cepa e monte-a, entre lmina e lamela, em Vermelho Neutro. Observe e faa um esquema legendado. b) Substitua o meio de montagem por uma soluo saturada de sacarose, utilizando o mtodo de irrigao. Observe e faa um esquema legendado. c) Substitua a soluo saturada de sacarose do meio de montagem por H2O. Observe e faa um esquema legendado.
2. Determinao da permeabilidade membranar

a) Faa 5 preparaes diferentes, cada uma contendo cortes transversais finos de raz de beterraba montados entre lmina e lamela numa gota de gua e observe no menor poder de ampliao (4x). Faa um esquema legendado. b) Controlando atravs da ocular de 4x, substitua cada um dos meios de montagem por um dos lcoois abaixo mencionados, de modo que todo o corte fique submerso, mas sem causar derrame da soluo para fora da lamela. 22 M Methanol 8.5 M Ethanol 3.0 M n-Propanol 1.1 M n-Butanol c) Conte o tempo que decorre entre a substituio do meio de montagem pelo lcool e a libertao do pigmento para o meio de montagem. d) O processo pode ser repetido, com outros cortes, com os mesmos lcoois diluidos para metade e para um quarto. e) Para cada lcool, calcule o coeficiente de penetrao dividindo o tempo de aparecimento do pigmento pela concentrao molar do lcool. Faa um grfico em que relaciona o coeficiente de penetrao com a miscibilidade relativa do lcool (coeficiente de partio). lcool Metanol Etanol n-Propanol n-Butanol Frmula CH3OH C2H5OH C3H7OH C4H9OH Peso Molecular 32.04 46.07 60.09 74.12 Coeficiente Partio 0.01 0.03 0.13 0.58 Coeficiente de penetrao
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8 Protocolo - Estudo do Vacolo 1. Observao de cristais de oxalato de clcio.

a) Observao de Rfides: Faa um corte longitudinal na folha de Alle sp. (ou, em alternativa, na espata de Zantedeschia sp.). Monte, entre lmina e lamela numa gota de gua, e observe. b) Observao de Drusas: Destaque a epiderme da spala de Pelargonium sp.. Monte, entre lmina e lamela numa gota de gua, e observe. c) Observao de cristais Prismticos: Destaque uma pequena poro de epiderme da escama externa do bolbo de Allium cepa. Monte, entre lmina e lamela numa gota de gua (ou glicerina), e observe.
2. Observao de cristais de inulina.

a) Material: Fragmento de tubrculo de Dahlia sp. conservado em alcol a 70%. b) Faa seces finas do fragmento de tubrculo de dlia. c) Monte entre lmina e lamela numa soluo de glicerina e observe.
3. Observao de gros de aleurona.

a) Seccione uma semente de Ricinus communis. Faa cortes muito finos e proceda sua colorao com Azul Mercrico de Bromofenol. I. Imerso em Azul de Bromofenol 10 min II. Lavagem rpida em cido actico 0,5 % 1 min III. Lavagem rpida em H20 IV. Montagem e observao.
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9 Protocolo - Estudo do Vacolo (Continuao), Observao de Movimentos de Ciclose, Observao de Cloroplastos 1. Observao de vacolos corados (antocianinas).
a) Destaque uma poro da epiderme adaxial de base da ptala de Hibiscus sp. b) Monte numa gota de gua, entre lmina e lamela, e observe os vacolos corados. c) Depois de efectuado o esquema, substitua o meio de montagem, pelo mtodo de irrigao, por uma soluo de nitrato de amnio ou hidrxido de sdio (soluo alcalina) e observe as alteraes que ocorrem ao nvel do vacolo.
2. Monte, entre lmina e lamela, uma folha de Elodea e observe os movimentos de ciclose.
3. Monte, entre lmina e lamela, um filamento de Spirogyra e observe os cloroplastos com pirenides. Substitua, por irrigao, o meio de montagem por uma soluo de Lugol e observe.
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10 Protocolo - Observao de Plastos 1. Observao de cloroplastos

a) Faa cortes transversais da folha que lhe fornecida, monte-a entre lmina e lamela e observe. Seguidamente, substitua, pelo mtodo de irrigao, a soluo de montagem por uma soluo de Lugol e observe.
2. Observao de amiloplastos
a) Faa cortes finos do tubrculo de batata, monte entre lmina e lamela e observe. Substitua, pelo mtodo de irrigao, o meio de montagem por uma soluo de Lugol e observe. b) Faa cortes finos da polpa de banana. Proceda como em a).
3. Observao de leucoplastos e cloroplastos

a) Destaque uma poro de epiderme de um caule jovem de Tradescantia, monte entre lmina e lamela e observe. Seguidamente, substitua, pelo mtodo de irrigao, a soluo de montagem por uma soluo de Lugol e observe.
4. Observao de cromoplastos
a) Destaque uma poro da epiderme do fruto de Piracantha (ou, em alternativa, da epiderme adaxial da ptala de Alle, Tropaeolum ou de Gerbera), monte entre lmina e lamela e observe. Seguidamente, substitua, pelo mtodo de irrigao, a soluo de montagem por uma soluo de Lugol e observe. Faa uma nova preparao e substitua, pelo mtodo de irrigao, a soluo de montagem por uma soluo de NaOH e observe. b) Faa cortes transversais na raiz da cenoura, monte entre lmina e lamela e observe. Seguidamente, substitua, pelo mtodo de irrigao, a soluo de montagem por uma soluo de Lugol e observe.
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11 Protocolo - Observao de Figuras de Mitose e Meiose e Determinao da Durao das Diferentes Fases 1. Observao de figuras de mitose em pices radiculares de Allium cepa
a) Coloque um pice radicular de Allium cepa numa lmina de vidro e, sobre ele, uma gota de HCl 1N, e 3 gotas de orcena actica. Deixe em repouso durante 5 min. b) Aquea suavemente at concentrar o corante em torno do pice, sem deixar secar. c) Repita a operao, mais duas vezes, aps adicionar uma gota de orcena actica. d) Transfira o material para uma lmina limpa, faa um esfregao e observe.
* Alternativamente:
a) Coloque um pice radicular de Allium cepa num microtubo (Eppendorf) contendo uma gota de HCl 1N, e 2 gotas de orcena actica. Agite moderadamente e deixe em repouso durante 1 h. b) Transfira o material para uma lmina limpa, faa um esfregao e observe.
2. Observao de figuras de mitose em preparaes definitivas.
3. Determinao da durao das diferentes fases de mitose.

a) O ciclo celular de uma clula de cebola aproximadamente de 20h. possvel estimar a durao de cada uma das fases mitticas, contando o nmero de clulas em cada um dos estdios em vrios campos de observao e utilizando a frmula seguinte: Durao da fase = (n de clulas em cada fase / n total de clulas contadas) x 20h Fase Interfase Profase Metafase Anafase Telofase N total de clulas N de Clulas Durao da Fase
4. Observao de figuras de meiose em preparaes definitivas.
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12 Protocolo - Microscopia Electrnica 1. Princpios de funcionamento e observao de material em Microscopia Electrnica de Transmisso.
2. Princpios de funcionamento e observao de material em Microscopia Electrnica de Varrimento.
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13 Protocolo - Observao de imagens de Microscopia ptica e Electrnica 1. Discusso de imagens de Microscopia ptica e Microscopia Electrnica de Transmisso e de Varrimento.
2. Biologia Celular e Biotecnologia Vegetal.
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6. APNDICE
Reagente de Lfler Azul de metileno lcool 96% pH 8.4 Juntar o azul de metileno e o lcool e agitar at sua completa dissoluo. Acertar o pH Resultado da colorao: Colorao geral azul, no especfica. 4,2g/l 190g/l
Corante de Newman-Lampert Azul de metileno lcool 96% Clorofrmio cido actico glacial 1g 54ml 40ml 6ml
Adicionar o lcool ao clorofrmio e aquecer a mistura a uma temperatura no superior a 70 C. Para o efeito, mergulhar o balo num recipiente com gua aquecida. Sendo a mistura inflamvel, evitar a proximidade de chama. Juntar o azul de metileno e agitar at sua completa dissoluo. Depois de arrefecida a mistura, temperatura ambiente, adicionar, lentamente, o cido actico glacial. Filtrar. Resultado da colorao: Colorao geral azul, no especfica.
Vermelho Sudo III Soluo saturada (0.3%) de Vermelho Sudo III em Etanol 70%. Resultado da colorao: Os lpidos coram de vermelho.
Reagente de Schiff (P.A.S.) Dissolver 2g de Pararosanilina (Fucsina diamante) em 60ml de HCl 1N. Juntar 300ml de gua destilada qual se adicionaram 2g de metabissulfito de sdio. Misturar bem e deixar repousar 24h, em frasco rolhado. Adicionar 1.2g de carvo activado e agitar durante 2min. Filtrar a soluo e manter o filtrado incolor, no escuro, a 4C (por um perodo mximo de dois meses). Resultado da colorao: Os polissacridos coram de rosa vivo.
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Metabissulfito de Sdio 0.5% Metabissulfito de Na ou K ou Bissulfito de Na 1g HCl 1N 10ml H20 190ml
Vermelho Neutro Vermelho Neutro H20 500ml 5g
Adicionar Tampo Acetato ph 4.8 Filtrar antes de usar
20ml
Resultado da colorao: Os vacolos coram de vermelho claro.
Tampo Acetato 37mM ph 4.8 Acetato de Sdio anidro cido Actico glacial 0.6ml H20 500ml Verificar o ph 1.53g
Soluto de Lugol Iodo 1g Iodeto de Potssio gua destilada 2g 100ml
Resultado da colorao: Amido cora de castanho, roxo ou azul violceo de acordo com a porporo relativa de amilose e amilopectina.
Azul Mercrico de Bromofenol Soluo de Azul de Bromofenol 0,1% em etanol 95% adicionado de cloreto de mercrio (10% final) Resultado da colorao: As protenas coram de azul claro.
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Soluo de Ringer Cloreto de Sdio 6g Cloreto de Potssio 0.075g Cloreto de Clcio 0.1g Bicarbonato de Clcio 0.1g gua destilada 1000ml
Orcena Actica Orcena 1g cido Actico glacial 45ml gua destilada 55ml Aquecer a mistura a uma temperatura no superior a 70 C. Para o efeito, mergulhar o balo num recipiente com gua aquecida. Sendo a mistura inflamvel, evitar a proximidade de chama. Filtrar depois de arrefecida a mistura Resultado da colorao: Cromossomas coram de vermelho.
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7. BIBLIOGRAFIA
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Muitos dos esquemas apresentados so adaptaes dos encontrados na Bibliografia utilizada
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8. INDICE REMISSIVO
aberrao cromtica, 3, 5 aberrao esfrica, 3, 5 abertura numrica da objectiva, 5 alcalides, 47 algas, 25 Algas castanhas, 27 Algas verdes, 25 Algas vermelhas, 27 Alinhamento do Microscpio, 11 aloficocianina, 51 amilopectina, 54 Amiloplastos, 54 amilose, 54 aminocidos, 47 ampliao, 4 anafase, 58 Anafase, 59 Anafase I, 61 Anafase II, 61 Animais, 28 antocianinas, 47 Archaea, 19 autofluorescncia, 10 Bacillus, 15 Bacteria, 17 bacterioclorofila, 51 Calibrao da ocular, 12 carmim aluminado, 32 carotenos, 54 Cerificao, 34 Cianobactrias, 17 cianoficina, 18 Ciliados, 22 Cloroplastos, 51 Coccus, 15 colagnio, 38 Contrastao, 66 contraste, 4, 6 corantes vitais, 6 coumarinas, 47 Criossecagem, 68 cristais prismticos, 50 cristalide, 47 cromatina, 56 Cromoplastos, 54 crossing-over, 60 Cutinizao, 34 Desidratao, 66 Diatomceas, 24 difuso, 43 difuso facilitada, 43 Dinoflagelados, 24 Diplococcus, 15 Diplteno, 61 distncia de trabalho, 5 Diversidade Celular, 13 drusas, 50 elastina, 38 electres primrios, 66 electres secundrios, 66 endsporos, 15 espao perinuclear, 56 espao periplsmico, 17 Espirilos, 15 Esporoderme, 37 Esporozorios, 23 estrias, 54 Eucariotas, 14, 19 Euglenides, 24 exina, 37 ficobilinas, 18, 51 ficobilissomas, 52 ficocianina, 18, 51 ficoeritrina, 18, 51 Fixao, 65 Flagelados, 23 flagelina, 15 flagelos, 15 fluorocromos, 10 Focagem, 11 frmula de Abbe, 5 fucoxantina, 51 Fungos, 27 Fungos Mucilaginosos e Aquticos, 27 fuso acromtico, 58 glicosaminoglicanos, 37 globides, 47 glbulos osmifilos, 52 Gram-negativas, 16 Gram-positivas, 16 gros de aleurona, 47 heterocistos, 18 hilo, 54 histonas, 56 histoqumica, 6 hormognios, 18 Impregnao e Incluso, 66 ndice de refraco do meio, 5 Intercinese, 61 interfase, 56 intina, 37 inulina, 47 invlucro cloroplastidial, 51 invlucro nuclear, 56 lamela mdia, 30 Lavagens, 65 Lenhificao, 32 Leptteno, 60 Leucoplastos, 53 licopenos, 55 Matriz extracelular, 37 medio, 4
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Guia Prtico de Biologia celular meio hipertnico, 44 Meiose, 59 Meiose I, 60 Meiose II, 61 Membrana celular, 43 membrana celular externa, 17 Membrana plasmtica, 42 metabolismo primrio, 50 metabolismo secundrio, 50 metafase, 58 Metafase, 59 Metafase I, 61 Metafase II, 61 Metalizao, 69 micelas, 29 Microscopia confocal, 10 microscopia electrnica, 63 Microscopia electrnica de transmisso, 63 Microscopia electrnica de varrimento, 66 Microscpio de contraste de fase, 7 Microscpio de fluorescncia, 9 Microscpio de fundo escuro, 7 Microscpio de interferncia ou de Nomarski, 8 Microscpio ptico, 3 Mineralizao, 35 Mitose, 57 molculas de adeso celular, 37 Movimentos de ciclose, 45 Negro Sudo, 35 Ncleo, 55 ncleo interfsico, 56 nuclolos, 56 os tilacides, 51 Oxalato de clcio, 49 Paquteno, 60 Parede celular, 29 parede celular primria, 29 parede celular secundria, 29 Paredes de Reserva, 32 peptidoglicanos, 17 Plantas, 28 plasmalema, 43 plasmdios, 56 plasmlise, 44 plastoglbulos, 52 Plastos, 51 poder de resoluo, 5 pontuaes, 32 poros nucleares, 56 pr-fixao, 65 Procariotas, 14 profase, 58 Profase, 58 Profase I, 60 Profase II, 61 protenas adesivas, 37 protenas extrnsecas, 42 protenas intrnsecas, 42 proteoglicanos, 37 Proteoplastos, 55 Protistas, 22 Protozorios, 22 rfides, 50 resoluo, 4 retculo perifrico, 51 Rizpodes, 22 Sais Minerais, 47 Secagem ao ar, 67 Secagem pelo mtodo do ponto crtico, 68 Seccionamento, 66 sinccios, 42, 56 Staphylococcus, 15 Streptococcus, 15 Suberificao, 36 Substncias orgnicas, 47 taninos, 47 Tecido conjuntivo, 40 Tecido epitelial, 39 Tecido muscular, 42 Tecido nervoso, 41 tecidos animais, 39 telofase, 58 Telofase, 59 Telofase I, 61 Telofase II, 61 ttrada cromatdica, 61 tilacides do estroma, 52 tilacides dos grana, 52 tonoplasto, 45 transporte activo, 43 transporte passivo, 43 Vacolos, 45 vacuoma, 45 verde iodo, 32 vermelho neutro, 44 Vermelho Sudo III, 35 xantofilas, 54 Zigteno, 60
100

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DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

GUIA PRTICO DE BIOLOGIA CELULAR

Edio: Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa, Centro de Biotecnologia Vegetal.

ISBN: 978-989-20-3852-0 ISBN: 978-989-20-3850-6

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1. MICROSCOPIA PTICA 1.1. Microscpio ptico

Oculares Objectivas Platina Parafusos de focagem Condensador Base

Fig. 1.1. Representao esquemtica de um microscpio ptico.

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1.1.1. Componentes do Microscpio ptico

leo de imerso Lamela a b

A resoluo de um microscpio depende de dois factores: 1) do comprimento de onda da

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b) Fig. 1.3. Tipos de aberraes. a) cromtica, b) esfrica.

1.2. Tipos de Microscpio ptico

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1.2.1. Microscpio de fundo escuro

Objectiva Raios reflectidos Raios oblquos Espcime Condensador

1.2.2. Microscpio de contraste de fase

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Anel de fase Condensador

Fig. 1.6. Representao esquemtica do microscpio de contraste de fase.

Prisma Objectiva Espcime Condensador de contraste de interferncia com prisma Polarizador

Fig. 1.7. Representao esquemtica do microscpio de contraste de Nomarski.

1.2.3. Microscpio de interferncia ou de Nomarski

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de se utilizar luz branca na iluminao.

1.2.4. Microscpio de fluorescncia

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1.2.5. Microscopia confocal

Fig. 1.10. Representao esquemtica do microscpio confocal.

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1.3. Como utilizar o microscpio

1.4. Medies em preparaes microscpicas

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Gram-positivas (GC ) Gram-positivas (GC ) Bactrias hipertermfilas Hadobactrias Cianobactrias

Espiroquetas Clamdeas Proteobactrias Origem das mitocndrias Origem dos cloroplastos

Todos os filos de Eucariotas

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Fmbria Corpo basal Gancho Filamento

Fig. 2.3. Representao esquemtica generalizada da estrutura de uma bactria.

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idade da cultura ou excessiva descolorao com o solvente.

Membrana Externa Peptidoglicanos

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Bactrias endosimbiontes tornaram-se nas mitocndrias dos Eucariotas

Bactrias endosimbiontes fotossintticas tornaram-se nos cloroplastos dos Eucariotas

10000 300 270000

Milhes 1000 - 1milho 400000 - 500000

1300000 10 milhes 100 milhes 100000 1 2 milhes

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RNA e Protenas Citoplasma

Diviso celular Organizao celular

Mitose ou meiose Unicelulares ou pluricelulares, havendo, neste caso, diferenciao de tecidos

* Podendo atingir 50 m; ** Podendo atingir valores extremos de 0.8 m e 1 m.

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