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Hlia Lucila Malta

Estudos de parmetros de propagao de fermento (Saccharomyces cerevisiae) para produo de cachaa de alambique.

Dissertao/Tese apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincia de Alimentos da Faculdade de Farmcia na Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincia de Alimentos. Orientadora: Profa. Dra Evelyn de Souza Oliveira Co-orientadora: Profa. Dra Amazile Biagioni R. A. Maia

Faculdade de Farmcia da UFMG Belo Horizonte, MG 2006

"Nada mais difcil, quando se procura um caminho, que descobrir se a fora que nos empurra vem do desejo de fugir ou do desejo de buscar. Talvez, em algum nvel bem profundo, nem haja qualquer diferena entre esses desejos. (Autor desconhecido)

AGRADECIMENTOS

Professora doutora Evelyn Souza Oliveira, pela orientao e pacincia; Professora doutora Amazile Biagioni Ribeiro Abreu Maia, pela valiosa co-orientao; aos Professores componentes da banca, pelas correes e sugestes; ao Professor Gecenir Colen por todos os palpites cientficos; aos Professores do PPGCA, pela contribuio cientfica e pessoal, ao estagirio Tiago Antnio Oliveira Mendes pela inestimvel ajuda, interesse e respeito pelo trabalho; Bunge Alimentos pelas amostras de SUPRO (isolado protico de soja) utilizado neste trabalho; Prodesa S.A., pelo fornecimento do extrato de levedura utilizado neste trabalho; Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais pelo suporte financeiro; aos meus amigos Thiago Lucas, Michely Capobiango e Raquel Santos pela amizade, diverso e toda ajuda durante esses dois anos; s minhas amigas Raquel e Letcia Alvarenga, rica Neves e Patrcia Pern pelo convvio, troca de experincias e companhia. ao Anderson pelo companheirismo, carinho, pacincia e ajuda em todos os sentidos. s minhas amigas Ana Flvia Resende (e Tlio) e Poliana Moreno, por serem a famlia que eu pude escolher, pela constncia na minha vida; aos meus avs, pela torcida e especialmente Tia France, s minhas irms Yara e Talita, pelo respeito e por ainda crescermos juntas, aos meus pais Helvcio e Mercedes, por significarem apoio invarivel, amor e incentivo nessa busca mesmo nas horas mais difceis, Deus, por me dar uma nova oportunidade todos os dias.

SUMRIO

LISTA DE TABELAS.................................................................. 7 LISTA DE FIGURAS................................................................... 8 9 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS..................................... RESUMO.................................................................................... 10 ABSTRACT................................................................................ 11 1 2

2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2
2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.2.3 2.3.2.3.1 2.3.2.3.2 2.3.2.3.3 2.3.2.3.4

INTRODUO...........................................................................
CONCEITUAO....................................................................................... PRODUO DE CACHAA....................................................................... Matria-prima.............................................................................................. Extrao do caldo....................................................................................... Fermentao............................................................................................... PROPAGAO DO FERMENTO............................................................... Leveduras utilizadas na fabricao de cachaa......................................... Fatores que influenciam na propagao do fermento.................................
Aerao e Agitao............................................................................................... Temperatura.......................................................................................................... Requerimentos para o crescimento e composio qumica do mosto.................. Fonte de carbono................................................................................................... Fonte de nitrognio................................................................................................ Adio de fub e farinha de soja ao mosto........................................................... Fonte de minerais..................................................................................................

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REVISO DA LITERATURA...................................................... 13
15 16 18 19 19 20 20 22 22 23 23 24 25 26 27 29 30 30 31 31 31 31 31

2.3.3 2.3.4 2.3.5

2.3.5.1 2.3.5.2 2.3.5.3 2.3.5.4 2.3.5.5

Parmetros cinticos................................................................................... Propagadores.............................................................................................. Estratgias para aprimorar a performance dos meios de fermentao......
Estratgia aberta................................................................................................... Utilizao dos resultados de testes conduzidos em shaker.................................. Aperfeioamento de meios j descritos na literatura............................................. Troca de componentes.......................................................................................... Cpia biolgica....................................................................................................

3.
3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6

MATERIAL E MTODOS........................................................... 32
MATERIAL.................................................................................................. Leveduras................................................................................................... Propagadores.............................................................................................. MTODOS ANALTICOS............................................................................ Viabilidade celular....................................................................................... Determinao dos acares redutores totais (ART) .................................. Acidez total do mosto e do vinho................................................................ Dosagem de etanol no vinho...................................................................... Determinao de massa seca celular (g de matria seca/L) ........................................................... Determinao de pH................................................................................... 32 32 32 35 35 35 35 35 35 36

3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.5

CLCULO DE PARMETROS DE CRESCIMENTO CELULAR................ Fator de converso de substrato clulas (Yx/s) ......................................... Fator de converso de substrato em etanol (Yp/s) .................................... Fator de converso de substrato em acidez (Yac/s) .................................. Aumento de biomassa (em nmero de vezes) .......................................... METODOLOGIA UTILIZADA NOS ENSAIOS DE PROPAGAO............ Ensaios preliminares cultivos realizados no Propagador A.................. Testes de propagao conduzidos em incubadora com agitao e temperatura controladas (shaker)............................................................... Testes de propagao conduzidos no Propagador B................................. Testes de propagao conduzidos no Propagador C.................. ANLISE ESTATSTICA.............................................................................

36 36 36 36 37 37 38 40 42 45 47

4
4.1 4.2 4.3 4.4

RESULTADOS E DISCUSSO.................................................. 48
ENSAIOS PRELIMINARES........................................................................ TESTES DE PROPAGAO CONDUZIDOS EM INCUBADORA COM AGITAO E TEMPERATURA CONTROLADAS (SHAKER)................... TESTES DE PROPAGAO CONDUZIDOS NO PROPAGADOR B....... TESTES DE PROPAGAO CONDUZIDOS NO PROPAGADOR C....... 48 51 53 55 59

5 6 7

CONCLUSES..........................................................................

PERSPECTIVAS........................................................................ 60 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................... 62

LISTA DE TABELAS
1 Composio Tpica da cachaa pela legislao brasileira...................................... 2 Limites mximos para contaminantes orgnicos e inorgnicos............................... 3 Composio de leveduras de fermento prensado................................................... 4 Constituintes inorgnicos das leveduras................................................................. 5 Composio dos meios de cultura utilizados nos ensaios preliminares Propagador A............................................................................................................. 6 Composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias dos ensaios preliminares .............................................................................................................. 7 Composio dos meios de cultura utilizados nas propagaes conduzidas em shaker......................................................................................................................... 8 Composio dos meios de cultura utilizados no Propagador B................................. 16 16 24 28 38 39 41 43

9 Composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias nas propagaes 44 no Propagador B...................................................................................................... 10 Composio dos meios de cultura utilizados no Propagador 45 C................................................................................................................................. 11 Sais minerais utilizados como micronutrientes no Teste 14...................................... 45 12 Composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias no Propagador 45 C................................................................................................................................. 13 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador A................................... 48 14 Resultados dos parmetros fermentativos - shaker ................................................. 51 15 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador B................................... 53 16 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador C.................................... 55 17 Resultado do Teste de mdias dos parmetros fermentativos.................................. 56

LISTA DE FIGURAS
1 Fluxograma da Produo de Cachaa............................................................... 18 2 Propagador A...................................................................................................... 34 3 Propagador B..................................................................................................... 34 4 Propagador C..................................................................................................... 34

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Yx/s Yp/s Yac/s m.x. -Fator de converso de substrato em clulas (g/g) -Fator de converso de substrato em etanol (g/g) -Fator de converso de substrato em cido actico (g/g) -Massa seca celular (g)

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RESUMO

A cachaa de alambique, produto tpico brasileiro, tem sido destaque na economia do estado de Minas Gerais. Tradicionalmente, a propagao do fermento nas fbricas de cachaa de alambique feita diretamente dentro das dornas de fermentao, que no so apropriadas para a fase aerbia (fase de propagao do fermento), por no possurem dispositivos de aerao e agitao. A introduo de um equipamento especfico para otimizar a propagao do fermento, tambm pode abrir caminho para a utilizao de linhagens selecionadas. Neste trabalho foram testados trs equipamentos para propagao de leveduras Saccharomyces cerevisiae estudando o efeito da adio de ar, nutrientes e micronutrientes (sais minerais) sobre a viabilidade e crescimento celular, rendimento em massa celular e fator de converso de substrato em clulas (Yx/s). Nas condies avaliadas, o uso do sulfato de amnio como fonte de nitrognio no foi suficiente para manter a viabilidade das clulas, resultado conseguido com extrato de levedura na concentrao de 0,9 g/100 mL. Os sais minerais testados (sulfatos de cobre, zinco, ferro, mangans) no interferiram no fator Yx/s, no aumento de massa celular e na viabilidade. A concentrao inicial do inculo foi um fator decisivo no aumento de massa celular, possibilitando um aumento de at 75 vezes em relao massa inicial.

Palavras chave: cachaa; Saccharomyces cerevisiae; propagao; nutrientes; micronutrientes; fermento.

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ABSTRACT

Cachaa, a typical Brazilian product, has been prominent in the economy of the state of Minas Gerais. Traditionally, the propagation of yeast in distilleries of cachaa occurs directly in the vats of fermentation, which are not appropriate for the aerobic phase (yeast propagation), because they do not possessing aeration and agitation devices. The introduction of a specific equipment to optimize the propagation stage of yeasts, can also open the way for use of selected yeasts. In this work three types of equipment for propagation of Saccharomyces cerevisiae were tested; studyng the effect of the addition of air, nutrients and micronutrients on the viability and cellular growth, yield of cellular mass and the substrate conversion factor in cells. Under the evaluated conditions, the use of ammonium sulphate as a nitrogen source was not sufficient to maintain the viability of the cells, result obtained with yeast extract in the concentration of 0,9 g/100 mL. The minerals tested (zinc, iron, copper and manganese sulphates) did not interfere with the Yx/s factor, the increase in cellular mass and the viability. The initial concentration of inoculum was a decisive factor in the increase in cellular mass, resulting increase of up to 75 times the initial mass.

Key words: cachaa; Saccharomyces cerevisiae; propagator; micronutrients, yeast inoculum.

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1. INTRODUO

Basicamente, a produo de cachaa consiste em se extrair o caldo da cana-deacar na operao de moagem, convert-lo em vinho pelo processo de fermentao e transformar o vinho de cana-de-acar em cachaa atravs da destilao.

Tradicionalmente, a propagao do fermento nas fbricas de cachaa de alambique feita diretamente dentro das dornas de fermentao. Esta prtica, no entanto, est associada a um elevado grau de contaminao por bactrias, devido precariedade operacional. As dornas de fermentao so apropriadas para a fase anaerbia do metabolismo das leveduras, quando ocorre predominantemente a fermentao do acar (sacarose) em etanol e gs carbnico. Assim sendo, as dornas no dispem de quaisquer dispositivos que permitam otimizar a propagao das leveduras, na qual a eficincia da aerao fator primordial para a predominncia do metabolismo respiratrio, que permite maximizar a reproduo das clulas e minimizar a formao de etanol. sabido que o etanol, alm de ser inibidor da propagao das leveduras, o substrato ideal para as bactrias acticas e do cido ltico que, em presena de oxignio, o convertem em cido actico. Isso explica o fato de ser a elevada acidez voltil um problema recorrente nas cachaas de alambique. A introduo de um equipamento especfico para otimizar a etapa de propagao do fermento, alm de resolver esses entraves, abre caminho para a utilizao de linhagens selecionadas, o que pode representar um salto de qualidade para a cachaa de alambique. Com efeito, os trabalhos de isolamento de linhagens, que vm sendo desenvolvidos por vrios grupos de pesquisa em Minas Gerais, apontam excelentes perspectivas para se implementar a qualidade sensorial do destilado. No entanto, isso s ser vivel para os produtores na medida em que disponham de um equipamento adequado para propagao dessas linhagens. Os processos tradicionais de propagao de leveduras requerem entre 8 e 15 dias. Em diversos casos, o prazo chega a ser de 25 a 30 dias. Dispondo de um propagador adequado, o produtor artesanal pode obter fermento suficiente para uma dorna em aproximadamente 24 horas, partindo de 500 g ou menos do fermento original (quer sejam clulas selecionadas ou naturais do prprio ambiente). Isso permite manter um controle muito mais eficiente da fermentao, substituindo-se as clulas de uma dorna a intervalos programados ou sempre que houver indcios de contaminao. O objetivo deste trabalho foi estudar o crescimento de leveduras Saccharomyces cerevisiae para produo de cachaa em diferentes propagadores de fermento, pelos processos descontnuo e descontnuo alimentado, sob aerao, alm de estudar o efeito

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da adio de nutrientes e micronutrientes (sais minerais). O desenvolvimento do trabalho constou basicamente de 3 etapas: i) Testar o efeito da adio de diferentes fontes de nitrognio (protica e amoniacal) ao meio de cultivo durante o processo de propagao do fermento; ii) Testar a adio de micronutrientes (zinco, cobre, ferro e mangans; iii) Testar a influncia da concentrao inicial de inculo no aumento do rendimento e da massa celular; contribuindo, assim para o desenvolvimento de um protocolo operacional de propagao de fermento que possa ser utilizado para produo de cachaa de alambique.

2. REVISO DE LITERATURA

Os dados histricos sobre bebidas alcolicas so imprecisos, sendo difcil saber quando foram obtidas as primeiras bebidas alcolicas fermentadas, embora haja citaes sobre seu uso antes da era crist. As descries mais precisas provm de autores rabes, do sculo X, supondo-se que eles tenham criado os termos lcool e alambique. Na Europa, as primeiras menes sobre o lcool datam do sculo XII (LIMA, 2001). A tecnologia de produo das bebidas alcolicas espalhou-se pelo Velho e Novo Mundo. Na Itlia, o destilado de uva fica conhecido como grappa. Na Alemanha, a partir da cerveja, o kirsh. Na Esccia, o Whisky, destilado da cevada sacarificada. Na Rssia, a vodka, de centeio. Na China e Japo, o sak, de arroz. Em Portugal, destilado do bagao de uva, a bagaceira (LIMA, 2001). Com o descobrimento do Brasil, Portugal trouxe a cana-de-acar, originria da sia Meridional entre 1532 e 1548. A histria da cachaa confunde-se ento com a prpria histria do Brasil, sendo produzida como uma bebida alcolica resultante dos tachos de melao, a garapa azeda que passou ento mais tarde a ser chamada cagaa e finalmente cachaa (LIMA, 2001) . A produo de cachaa no Brasil data do incio da colonizao. Entretanto, as indstrias de cachaa at 1945 eram rurais e rudimentares, no havendo padres de qualidade. A produo domstica aumentou bastante e desde ento o processo de produo vem sendo aperfeioado e melhorado, o que tem acarretado melhorias no rendimento, produtividade e qualidade do produto final (PATARO et al., 2002). Atualmente a produo artesanal de cachaa de alambique tem sido destaque na economia do estado de Minas Gerais. A produo de cachaa de alambique, mesmo registrando um alto grau de clandestinidade, desempenha importante papel na estruturao da economia agro-industrial do Estado. So 8.466 estabelecimentos

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produtores, que, combinando a produo da cachaa com atividades agropecurias, empregam, direta e indiretamente, cerca de 240.000 pessoas e geram uma renda anual total estimada de R$ 1,5 bilho, em toda a cadeia. Da produo do Estado, 43% so oriundas de estabelecimentos registrados, contra 57% de clandestinos. A produo de cachaa no estado de Minas Gerais da ordem de 230 milhes de litros/safra, representando perto de 18% da produo nacional de, de acordo com SEBRAE MG (2002). O mercado de cachaa no Brasil tem passado por recentes transformaes, configuradas, principalmente, por uma certa elitizao do consumo e por uma busca crescente de qualidade Atualmente, o mercado brasileiro da cachaa movimenta um volume de aproximadamente 1,3 bilhes de litros, o que coloca a bebida como a segunda mais vendida no Brasil, perdendo apenas para a cerveja. Embora a produo nacional seja consumida quase que totalmente no mercado interno, tem se verificado um crescimento acentuado da sua aceitao no mercado internacional, haja visto que hoje ela representa o terceiro destilado mais consumido no mundo (ESTANISLAU et al., 2002). Assim, o atual estgio de desenvolvimento do mercado da cachaa mostra grande potencial para a exportao, levando-se em considerao a crescente aceitao e a pequena parcela da produo que destinada ao exterior (ESTANISLAU et al., 2002). Apenas cerca de 1% da produo nacional exportada, o que no ano de 2002 totalizou 14,8 milhes de litros. Como conseqncia do aumento da produo, surgiu uma demanda tcnica e cientfica, da cultura da cana-de-acar ao engarrafamento da cachaa. Muitos estudos e pesquisas foram feitos na rea de fermentao do caldo de cana-de-acar e muitos foram os conhecimentos adquiridos quanto extrao do caldo, purificao, fermentao, desinfeco, tcnicas de destilao, busca de leveduras apropriadas e selecionadas, e outros parmetros. Esses estudos contriburam para o aperfeioamento tcnico da antiga e rotineira indstria aguardenteira, e seu acervo foi muito importante quando a indstria de lcool etlico no Brasil foi solicitada a incrementar suas atividades com a finalidade de produzir etanol como combustvel lquido alternativo (LIMA, 2001). Motivadas pela expanso do consumo, tm-se percebido aes voltadas no sentido de tornar a atividade mais eficiente e articulada, uma vez que historicamente ela se caracteriza como bastante pulverizada e com elevado ndice de informalidade. Destas iniciativas, temos o Programa Brasileiro de Desenvolvimento de Aguardente de Cana (PBDAC), o Programa Especial de Exportaes (PEE), o Programa dos Novos Plos para Exportao (PNPE) e a Rede Mineira de Tecnologia da Cachaa (RTMC).

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Embora o objetivo final seja a insero no mercado atravs da qualidade do produto final, esforos tm que ser dispensados desde a obteno da matria-prima, passando por todas as etapas do processamento, at chegar comercializao (ESTANISLAU et al., 2002).

2.1. Conceituao

As aguardentes so obtidas por destilao de um lquido que contm lcool etlico em sua composio. De maneira geral, o contedo de lcool deriva da fermentao de acares contidos na matria-prima. O teor de lcool das aguardentes varia de trinta e oito a cinqenta e quatro por cento v/v (volume por volume) a temperatura de vinte graus Celsius. Nesta operao, inevitavelmente, so destiladas algumas substncias que acompanham o lcool e que so chamadas de impurezas ou impurezas volteis. Elas contribuem para conferir ao destilado diferentes caractersticas de aroma e sabor, que so modificadas ou intensificadas pela maturao, ou envelhecimento em tonis de madeira, sob condies adequadas (LIMA, 2001). Cachaa a denominao tpica e exclusiva da aguardente de cana-de-acar produzida no Brasil, bebida fermento-destilada com graduao alcolica de trinta e oito a quarenta e oito por cento v/v (volume por volume) temperatura de vinte graus Celsius obtida pela destilao do mosto fermentado de cana-de-acar com caractersticas sensoriais peculiares, podendo ser adicionada de acares at seis gramas por litro, expressos em sacarose (BRASIL, 2005). Na TABELA 1, so mostrados a composio tpica da cachaa (coeficiente de congneres) segundo o novo Regulamento Tcnico para fixao dos Padres de Identidade e Qualidade para aguardente de cana e para cachaa:

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TABELA 1 Composio Tpica da cachaa pela legislao brasileira Composto Teor alcolico steres em acetato de etila Acidez voltil em cido actico Aldedos em aldedo actico Furfural e Hidroximetilfurfural Soma dos lcoois isobutlico (2-metil propanol), isoamlicos (2-metil -1- butanol +3 metil-1-butanol) e n-proplico (1- propanol), Fonte: BRASIL, 2005 Limite mximo 38 a 48 % etanol v/v 200 mg/100mL de lcool anidro 150 mg/100mL de lcool anidro 30 mg/100mL de lcool anidro 5 mg/100mL de lcool anidro 360mg/100mL de lcool anidro

Segundo

este

Regulamento

Tcnico

so

fixados

limites

mximos

para

Contaminantes Orgnicos e Inorgnicos, mostrados na TABELA 2, a seguir.

TABELA 2 - Limites mximos para contaminantes orgnicos e inorgnicos Contaminantes Orgnicos lcool metlico Carbamato de etila Acrolena (2-propenal) lcool sec-butlico (2-butanol) lcool n-butlico (1-butanol) Contaminantes Inorgnicos Cobre (Cu) Chumbo (Pb) Arsnio (As) Fonte: BRASIL, 2005 Limite mximo 20,0 mg/100 mL de lcool anidro. 150g/L 5mg/100mL de lcool anidro 10mg/100mL de lcool anidro 3mg/100mL Limite mximo 5mg/L 200g/L 100g/L

2.2. Produo de cachaa

Do ponto de vista biolgico, o processo para fabricao de cachaa de alambique constitui-se de duas etapas principais, do ponto de vista biolgico: na primeira preparado o inculo, chamado tambm p-de-cuba. Nesta etapa, basicamente os

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microrganismos

so

multiplicados

em

condies

apropriadas,

para

garantir

desenvolvimento adequado da segunda etapa, que corresponde converso de acar em lcool e gs carbnico, fase que chamada fermentao (PATARO et al., 2002). A fermentao a segunda e principal etapa do processo de produo de cachaa. Nesta etapa o acar e outros compostos presentes no mosto so transformados em etanol, CO2 e outros produtos que so responsveis pela qualidade e defeitos do produto. As fermentaes so conduzidas em recipientes prprios denominados dornas (JANZANTTI, 2004). O processo mais utilizado por produtores de cachaa de alambique o de batelada simples com reciclagem de inculo. Este mtodo consiste na incubao de uma dorna com o p de cuba. Quando a fermentao atinge um estado apropriado (formao de bolhas) passa-se metade do contedo para uma dorna vazia (corte de dorna). Em seguida, completa-se o volume das duas com o caldo a ser fermentado (PATARO et al., 2002). A FIGURA 1 a seguir, mostra o fluxograma da produo da cachaa. A cana-deacar aps moda e separado o bagao, submetida uma filtrao, por passagem em peneiras, ou decantado para separao do bagacilho. O caldo pronto para fermentar denominado mosto, colocado para fermentar na presena do fermento, normalmente o p-de-cuba. Aps terminada a fermentao do mosto, o caldo chamado de vinho, que aps sedimentado destilado. Durante a destilao, so separadas fraes de cabea e cauda, onde a cachaa a frao chamada de corao. A bebida ento pode ser envelhecida, ou engarrafada logo a seguir da produo (LIMA, 2001; MAIA et al., 1995).

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Cana-de-acar

Moagem Caldo de cana Filtrao/Decantao Caldo P-de-Cuba

Bagao

Bagacilho

Fermentao (mosto) Vinho P-de-Cuba

Sedimentao

Vinho clarificado Vinhoto Cabea Destilao Cauda

Cachaa (Corao)

Envelhecimento Cachaa envelhecida

Engarrafamento

FIGURA 1 Fluxograma da produo de cachaa.

2.2.1. Matria-prima:

A matria-prima para a fabricao da cachaa a cana-de-acar. No Brasil normalmente feita uma seleo, dentre as variedades existentes para produo de acar e lcool, tentando-se obter as que possam ser utilizadas na produo de cachaa de alambique (ANDRADE et al., 2002).

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A escolha das variedades produtoras de cana-de-acar em Minas Geras tem sido feita levando em considerao o perodo mdio de maturao das variedades, condies climticas e de solo (SILVEIRA et al., 2002). As variedades devem ser adaptadas s condies climticas da regio onde se encontra instalada a unidade industrial, com a finalidade de apresentar elevada produtividade de acar por rea (NOVAES, 1995 citado por JERONIMO, 2004).

2.2.2. Extrao do caldo

A extrao do caldo de cana-de-acar feita por esmagamento direto nas moendas, cuja capacidade vai variar de acordo com a capacidade de processamento da fbrica. O maior ou menor rendimento em cachaa est ligado eficincia na extrao do caldo (LIMA, 2001). Tecnologicamente, todo lquido suceptvel de fermentar denominado mosto. Aps moagem, o caldo de cana-de-acar filtrado e clarificado por decantao, que retira parte das impurezas em suspenso. O caldo obtido pela moagem da cana-de-acar constitudo de gua entre 78% e 86%, sacarose entre 11% e 18%, acares redutores entre 0,2% e 1,0%, cinzas entre 0,3% e 0,5% e compostos nitrogenados entre 0,5% e 1,0% (LIMA, 2001). O caldo de cana-de-acar a ser fermentado apresenta normalmente valores de pH entre 5,2 e 5,8. Os compostos orgnicos no acares so constitudos de substncias nitrogenadas (protenas, aminocidos, etc.), gorduras, ceras, pectinas, cidos (mlico, succnico, etc.), e de matrias corantes (clorofila, sacaretina e antocianina). Os no acares inorgnicos, representados pelas cinzas, tm como componentes principais: slica, potssio, fsforo, clcio, sdio, magnsio, enxofre, ferro, alumnio, cloro e outros (STUPIELLO, 1987, citado por JERONIMO, 2004).

2.2.3. Fermentao

A fermentao ideal ocorre com o caldo de cana-de-acar numa concentrao de acar em torno de 14 a 16 Brix. Teores de acar acima de 16 Brix podem acarretar fermentaes mais lentas e freqentemente incompletas (PATARO et al., 2002). Segundo OLIVEIRA & MAGALHES (2002), deve-se diluir o caldo de cana-de-acar para uma concentrao de slidos solveis totais entre 12 e 16 Brix.

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A fermentao descontnua tambm conhecida por fermentao por batelada ou processo descontnuo de fermentao. Tem a caracterstica principal de no instante inicial o mosto inoculado com microrganismos e incubado, de modo a permitir que a fermentao ocorra sob condies timas. No decorrer do processo fermentativo nada adicionado (CARVALHO & SATO, 2001). O processo definido como fermentao descontnua alimentada uma tcnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes so adicionados ao fermentador durante o cultivo e em que os produtos a permanecem at o final da fermentao. A adio de mosto pode ser contnua ou intermitente (CARVALHO & SATO, 2001). A durao mdia de um processo fermentativo de 24 horas. Em geral, a fermentao conduzida pelo sistema convencional em batelada e consiste em se colocar o inculo e todo o meio a ser fermentado na dorna de fermentao (PATARO et al., 2002). O processo fermentativo inicia logo que a levedura entra em contato com o mosto e dividido em trs fases: fase preliminar ou pr-fermentao, caracterizada pela adaptao das leveduras e multiplicao celular; fase de fermentao principal e tumultuosa, com desprendimento abundante de gs e produo de lcool e fase de fermentao complementar ou ps fermentao, onde se observa reduo da atividade fermentativa (JANZANTTI, 2004). Dentre os metablitos secretados pelas leveduras, o etanol produzido em maior quantidade (SILVA, 2003). Apesar disso, normal que uma pequena percentagem seja convertida em outros produtos. Estes incluem glicerol, cidos orgnicos (como succnico, actico, ltico, butrico, etc.), lcoois superiores (amlico, isoamlico, butrico, isobutrico, proplico e isoproplico), aldedos, steres, entre outros compostos volteis (JANZANTTI, 2004)

2.3. Propagao do Fermento:

2.3.1. Leveduras utilizadas na produo de cachaa

As leveduras utilizadas na fabricao de bebidas alcolicas geralmente so linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Nas fermentaes espontneas, um grande nmero de espcies podem estar envolvidas, com predominncia de S. cerevisiae (REED & NAGODAWITHANA, 1991; PATARO, 2000). Segundo ALVES (1994), a viabilidade celular extremamente importante para o desenvolvimento do processo fermentativo e a

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tolerncia da levedura ao produto da fermentao (etanol) determinante na produtividade em lcool de fermentaes em escala industrial. O inculo natural, chamado p de cuba usualmente preparado pelo mtodo conhecido como fermento caipira, que consiste numa mistura de caldo de cana-de-acar no diludo, farelo de arroz, farinha de milho ou soja, entre outros cereais, com adio de suco de limo ou laranja azeda para abaixar o pH. So feitas adies dirias de caldo de cana-de-acar no perodo de cinco a sete dias (LIMA, 1983; RIBEIRO, 2002), quando as leveduras esto se reproduzindo e o volume de massa celular est aumentado. Desta forma, o inculo obtido a partir da fermentao espontnea do caldo por microrganismos selvagens presentes no caldo da cana-de-acar, nos equipamentos e nas dornas de fermentao. A utilizao de leveduras selecionadas tem sido pesquisada, visando um aumento da produtividade, vantagens tecnolgicas e melhoria das caractersticas sensoriais da cachaa (PATARO et al., 2000; GUERRA et al., 2001; OLIVEIRA, 2001). Segundo MORAIS et al. (1997) foi observado que durante a multiplicao do fermento natural e no decorrer da fermentao para produo de aguardente de cana artesanal, a qual varia de 12 a 48 horas, h uma sucesso de espcies de leveduras, sendo a espcie predominante S. cerevisiae. Candida sake, Kluyveromyces marxianus var. drosophilarum e leveduras apiculadas tambm so freqentes. Nas grandes destilarias brasileiras de lcool e mesmo em pequenas fbricas, j comum o uso de fermentos selecionados no incio da safra, mas ainda h um grande nmero de fbricas que trabalha com leveduras de panificao, prensadas, e com fermentos naturais. Ao longo dos ciclos de fermentao, que dura normalmente entre 20 a 24 horas, o caldo de cana-de-acar vai sendo lentamente contaminado pelas leveduras indgenas, que se sobrepe e dominam o processo fermentativo. Isso ocorre em qualquer regio do pas, com predominncia de microrganismos adaptados s condies locais (LIMA, 2001). Observa-se que de uma forma geral, S. cerevisiae prevalece nas fermentaes, em fermentaes espontneas ou conduzidas (FIALHO, 2000; SCHWAN et al., 2001).

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2.3.2. Fatores que influenciam diretamente na propagao do fermento

2.3.2.1. Aerao e agitao Para preparao de culturas starter (ou inculo) e no controle da fermentao alcolica, importante considerar a funo do oxignio no controle do metabolismo e crescimento da levedura. Quando o oxignio est disponvel, o metabolismo da levedura direciona para a respirao, rendendo teoricamente 38 moles de ATP para cada mol de glicose, desta forma, permitindo uma maior velocidade de crescimento, maior produo de biomassa, e a sntese de materiais de reserva, como esteris e cidos graxos. Desta forma, a aerao usada na preparao de culturas starter quando uma quantidade maior de biomassa requerida (HENICK-KLING, 1988). Segundo AIBA et al. (1973), os propsitos da aerao e agitao em fermentao so, primeiramente, fornecer oxignio aos microrganismos, e agitar o caldo de fermentao de forma que uma suspenso uniforme de microrganismos esteja dispersa no meio. Muitos fermentadores so equipados com agitao mecnica do meio de cultura para desintegrar as bolhas de ar e intensificar a turbulncia dos lquidos, mas fermentadores desprovidos de agitadores mecnicos tambm so usados. Segundo SCHMIDELL (2001), um cultivo que seja altamente eficiente, ocorre com elevadas velocidades de crescimento celular, significa altas velocidades de consumo da fonte de carbono, a fim de que haja abundncia de eltrons transportados na cadeia respiratria (gerao de ATP), mas significa tambm, obrigatoriamente, a necessidade da existncia de oxignio dissolvido, a fim de que estes eltrons sejam drenados ao final desta cadeia. Ainda segundo este mesmo autor, a situao distinta para o oxignio, pois este elemento muito pouco solvel em gua. De fato, a concentrao de oxignio dissolvido na saturao apenas da ordem de 7 mg O2/L (ou 7ppm), ao se borbulhar ar atmosfrico a presso de 1 atm e a 35 C. Por esta razo que se costuma afirmar que a extenso de um processo descontnuo aerbio e, por conseguinte, a obteno de elevadas concentraes do produto desejado, depende enormemente da capacidade de se transferir o O2 para a fase lquida, especialmente nos instantes mais avanados do processo, onde a concentrao celular pode ser elevada. Em outras palavras, pode-se ter situaes em que a capacidade de transferncia de oxignio que ditar as condies de operao.

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Formas menos eficientes, em termos de transferncia de oxignio, podem ser interessantes sob outros aspectos, como, por exemplo, a de submeterem as clulas a um menor cisalhamento. Deve-se lembrar tambm que sempre se fermenta solues de nutrientes, o que significa a presena de muitas substncias dissolvidas, as quais, no cmputo final, reduzem a concentrao de oxignio em relao ao valor observado para a gua (SCHMIDELL & FACCIOTTI, 2001).

2.3.2.2. Temperatura PATARO et al. (1998) estudaram as caractersticas da fisiologia de crescimento de 210 linhagens de leveduras isoladas de um alambique de cachaa de alambique do estado de Minas Gerais. A maioria das linhagens foi fisiologicamente adaptada s condies ambientais observadas nas dornas de fermentao. Elas foram capazes de crescer a 35 oC, em meio contendo at 25% de glicose e em concentrao de 5 % (v/v) de etanol. A temperatura tima para a fermentao de 5-10 C acima do timo para o crescimento da levedura, que encontra-se na faixa de 25-30 C (JONES et al., 1981; WATSON, 1987). ALVES (1994) ressalta que estas consideraes no condizem com o fato de que nas regies tropicais a temperatura do processo facilmente atinge 40 C. STUPIELLO & HORII (1981) afirmam que a reproduo de clulas pode ocorrer at a temperatura da ordem de 38 C, havendo inibio da multiplicao a 40 C e na presena de 8 a 9 % v/v de etanol.

2.3.2.3. Requerimentos para o crescimento e composio qumica do mosto importante observar que as condies de cultivo que proporcionem o mximo de crescimento celular podem no ser necessariamente aquelas que proporcionem o mximo de rendimento de algum produto do metabolismo (AIBA et al., 1973). Sabe-se que metabolicamente as leveduras so predominantemente anaerbias facultativas, sendo capazes de crescer tanto na ausncia de ar (fermentao) como na sua presena (respirao ou metabolismo oxidativo). A presena do oxignio molecular, como ocorre na aerao, induz a mudana no metabolismo energtico de fermentao para respirao (REED & PEPPLER, 1973). A clula de levedura possui compartimentaes para adequao da atividade metablica. A fermentao alcolica (gliclise anaerbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a oxidao total do acar (respirao) se d na mitocndria (BASSO et al., 1996). Observa-se que, quando os microrganismos so capazes de crescer em ambas as

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situaes (aerobiose/anaerobiose), um substrato que metabolizado aerobiamente ocasiona um crescimento celular muito maior quando comparado ao substrato metabolizado anaerobiamente (AIBA et al., 1973). Na verdade, poucas espcies so capazes de crescer mais rapidamente sob estas condies, e S. cerevisiae se sobressai como leveduras geralmente conhecidas como anaerbias facultativas. comumente aceito que anaerbios facultativos tm a habilidade de crescer sob ambas as condies de aerobiose ou anaerobiose usando, respectivamente, oxignio molecular ou outro composto como aceptor final de eltrons ou redutores equivalentes vindos do processo anablico (RODRIGUES et al., 2006). Segundo REED & NAGODAWITHANA (1991), muitos autores tm demonstrado a relao entre a composio da biomassa das leveduras e a quantidade dos vrios nutrientes requeridos para alcanar esta composio. A composio de leveduras S cerevisiae de fermento prensado para panificao mostrada na TABELA 3, a seguir.

TABELA 3: Composio de leveduras de fermento prensado Componente % em base seca Protena 47 Carboidratos 33 Minerais 8 cidos Nuclicos 8 Lipideos 4 Fonte: REED & NAGODAWITHANA (1991) PULZATTO (2000) comenta que a composio qumica da levedura amplamente afetada pelas condies qumicas e fsicas do meio de crescimento, mas podem ser resumidas como tendo alto teor de protena, alto contedo de cidos nuclicos, baixo contedo de lipdeos, alto contedo de cinzas, contedo moderado de carboidratos e alto contedo de vitaminas.

2.3.2.3.1. Fonte de Carbono OURA (1974) afirma que a presena do oxignio no significa necessariamente que o metabolismo de fato aerbio. A concentrao de glicose no meio tem provado ter uma importante funo regulativa no metabolismo. A concentrao de acar no caldo de cana-de-acar deve ser diferente nas duas etapas distintas do processo fermentativo. A primeira est relacionada com a propagao de S.cerevisiae que feita sob intensa aerao. Normalmente recomendado que o teor de acar no seja superior a 2-3% (p/v), j que concentraes mais altas prejudicam a respirao da clula, que

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indispensvel para um crescimento eficiente. A segunda etapa est relacionada com a fermentao propriamente dita, ou seja, a converso de acar em etanol e CO2. Nesta etapa, o teor mdio de acar tolerado pela levedura em torno de 15% (p/v). Este limite pode ser varivel de acordo com a levedura e as demais condies do processo fermentativo (MAIA et al., 1992; SCHWAN & CASTRO, 2001). MAIA (2002) comenta que em cultura aerbia, o prprio substrato reconhecido com agente regulador do metabolismo da glicose. O efeito Crabtree descrito como o efeito repressor da atividade respiratria pela glicose livre. Assim, S cerevisiae seria sensvel glicose, pois em concentraes de 100 a 200 mg/L j iniciada a fermentao. Segundo REED & PEPPLER (1973) esta represso ocorre na concentrao de 0,2 % p/v, e esta a razo para se conduzir fermentaes em batelada alimentada. O acar deve ser alimentado continuamente uma taxa lenta para que possa ser consumido continuamente e no ultrapasse a concentrao crtica. Segundo PRESCOTT & DUNN (1959) a concentrao de acar mantida baixa no tanque de propagao com o objetivo de favorecer a utilizao do acar para a produo de clulas ao invs da produo de etanol. A concentrao usual de acar no propagador varia entre 0,5 a 1,5% p/v, dependendo do processo. Devido formao de etanol diminuir o rendimento em biomassa, necessrio controlar a taxa de alimentao de acar no propagador para minimizar a produo de etanol. Desta forma, a concentrao de acar o parmetro principal para efetiva produo de massa celular de levedura (MISKIEWICZ & KASPERSKI, 2000).

2.3.2.3.2. Fonte de Nitrognio As leveduras geralmente podem sintetizar todos os aminocidos e bases nitrogenadas necessrias para seu crescimento celular a partir do on amnio. O crescimento acelerado quando esto disponveis no meio de crescimento unidades de construo, como aminocidos, para a sntese de enzimas celulares e componentes estruturais (HENICK-KLING, 1988). No entanto, ALVES (1994) comenta que a utilizao de sulfato de amnio como fonte nitrogenada resulta em maior acidez do meio, que embora possa favorecer o controle da contaminao bacteriana (e consequente reduo da formao de cidos ltico e actico), causa estresse levedura, diminuindo a viabilidade e multiplicao. Pode-se usar suplementao com amnio ou sais de amnio, mas segundo AIBA et al. (1973), o crescimento mais rpido quando se usa nitrognio orgnico. PULZATTO

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(2000) constatou que a produo especfica de clulas de levedura (Yx/s) aumentou linearmente com o aumento do nitrognio protico no meio de fermentao sinttico. A reproduo de S. cerevisiae varia em funo do nvel de nutrientes encontrados na matria-prima, e dentre estes o nitrognio o que apresenta uma resposta mais significativa. A levedura no assimila instantaneamente o nitrognio quando adicionado na forma de uria (46% de N) ou sulfato de amnio (21% de N) (PINOTTI, 1991). Visando verificar a influncia da adio de nitrognio protico na fermentao alcolica de caldo de cana-de-acar para produo de cachaa, JERNIMO (2004) testou o uso de trs diferentes fontes de nitrognio protico, dentre elas, um isolado protico de soja (denominado comercialmente de SUPRO 780 anteriormente denominado Samprosoy 90 LH produzido pela Bunge Alimentos), obtendo uma boa multiplicao e viabilidade da levedura, propiciando assim, melhor qualidade no fermento reciclado. Neste experimento, a viabilidade manteve-se elevada at o final do experimento (6 reciclos), e a massa celular produzida tambm. Segundo esta autora, o nitrognio protico original do caldo de cana-de-acar foi praticamente todo consumido, o que significa estar em forma assimilvel pela levedura. Do ponto de vista nutricional da levedura, os resultados deste trabalho mostram que o N protico presente no caldo insuficiente para suprir a nutrio da levedura em fermentao.

2.3.2.3.3. Adio de fub e farinha de soja ao mosto: MAIA (1992) props que a adio de fub ao mosto resulta em alguns benefcios ao processo fermentativo, como a adsoro pelo amido de metablitos secundrios da prpria fermentao alcolica, cuja presena no mosto afeta a via glicoltica. Mas CLETO (1997) testou a suplementao do mosto com fub de milho, no obtendo alteraes significativas na viabilidade celular. O autor observou um menor teor de acidez no mosto suplementado com fub, resultando tambm numa cachaa com menor acidez total. Os cidos graxos insaturados podem ser sintetizados pelas clulas, sendo indispensveis para garantir sua viabilidade. Contudo, nas condies da fermentao alcolica a incorporo de suplementos nutricionais ricos em cidos graxos insaturados favorece nitidamente a fisiologia das clulas. Usualmente so empregados farelo de arroz, farinha de soja e o fub. Dentre estes, o mais rico em cidos graxos insaturados a farinha de soja (OLIVEIRA, 1998; MAIA, RIBEIRO E SILVEIRA, 1995).

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2.3.2.3.4. Fonte de Minerais: As leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto micro como milimolar para manifestarem timos crescimentos e rendimento fermentativo. Deficincias ou concentraes elevadas de tais minerais, ou seja, um desequilbrio entre os nutrientes minerais provocam alteraes metablicas significativas (BASSO et al., 1996). Microelementos tm uma funo importante no metabolismo celular,

principalmente devido aos seus requerimentos como cofatores para vrias enzimas (STEHLIK-TOMAS et al., 2004). Aparentemente, ons metlicos so vitais para todos os organismos, e desta forma, transportadores destes ons tm um papel crucial na manuteno da homeostase. Todavia, quantidades excessivas destes mesmos ons so txicos e podem causar danos s funes s quais se prestam (NELSON, 1999; COHEN et al., 2000 citado por STEHLIK-TOMAS et al., 2004). Em sua reviso, JONES & GREENFIELD (1984) dividem as funes destes ons em duas: enzimtica e estrutural. Na funo enzimtica, alguns ons so o centro cataltico de uma enzima, como um ativador ou estabilizador da funo enzimtica, ou mantm controle fisiolgico por antagonismo entre ativadores e desativadores. Dentre estes, Zn
2+ 2+ 2+

, Co

, Mn

e Cu2+

so comumente centros catalticos. A funo estrutural desempenhada pelos ons que agem neutralizando foras eletrostticas presentes nas muitas unidades celulares aninicas. Na maioria das vezes, K+ e Mg2+ so encontrados em polifosfatos, RNA, DNA e protenas. Segundo LIMA (2001), a adio de sais minerais vantajosa para corrigir deficincias que o caldo normalmente apresenta. De um modo geral, a adio no feita em todo o volume do mosto, mas nos ps de cuba, ou periodicamente, nas dornas de fermentao. A composio elementar de uma clula microbiana depende de muitos fatores, como condies de cultivo, espcie do microorganismo, e at mesmo do substrato utilizado para seu crescimento (CARVALHO & SATO, 2001). Zinco, cobre e mangans so muito interessantes devido ao efeito positivo na atividade respiratria e na taxa de crescimento de S. cerevisiae (JONES & GADD, 1990, citados por STEHLIK-TOMAS et al., 2004). Segundo AIBA et al. (1973), fsforo, potssio enxofre e magnsio so os minerais mais encontrados na composio de microrganismos, e estes e outros elementos presentes em quantidades significativas devem ser suplementados ao meio de cultura. A seguir, so mostrados na TABELA 4 os constituintes inorgnicos de leveduras, segundo

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estes autores e uma comparao com a composio descrita em REED & NAGODAWITHANA (1991).

TABELA 4: Constituintes inorgnicos das leveduras Elementos AIBA et al. REED AND NAGODAWITHANA (1991) (g/100g peso seco) (1973) Fsforo 0,8 2,6 1,35 Enxofre 0,01 0,24 0,39 Potssio 1,0 4,0 2,1 Magnsio 0,1 0,5 0,165 Sdio 0,01 0,1 0,012 Clcio 0,1 0,3 0,075 Ferro 0,01 0,5 0,002 Zinco 0,017 Cobre 0,002 0,01 0,0008 Mangans 0,0005 0,007 0,000002 Molibdnio 0,0001 0,0002 0,00004 Total de Minerais 5 - 10 Zinco

Segundo STEHLIK-TOMAS et al. (2004), o zinco, na sua forma biologicamente mais relevante (ons Zn2+) essencial como cofator cataltico em vrias enzimas, inclusive lcool desidrogenase, fosfatase alcalina, anidrase carbnica e vrias carboxipeptidases, no sendo substitudo por nenhum outro on em suas funes (JONES & GREENFIELD, 1984). Tem sido apontado que a presena de ons Zn2+ em quantidades de 5-15 M no meio nutriente otimizam o fator de crescimento de clulas de levedura, assim como a produo de etanol. De forma oposta, sua deficincia paralisa o crescimento celular e atividade fermentativa. Todavia, altas concentraes de zinco no meio de crescimento podem ser txicas, uma vez que o zinco afeta a permeabilidade das membranas ao potssio, causando um efeito antagonista no crescimento e fermentao (JONES & GADD, 1990; LIU et al., 1997, citados por STEHLIK-TOMAS et al. (2004).

Cobre

O cobre tambm um ction divalente vital para clulas de leveduras, agindo como cofator de algumas enzimas como citocromo c-oxidase, lactase e Cu-Zn superxido dismutase (STEHLIK-TOMAS et al., 2004). A concentrao tima no meio nutritivo para crescimento da levedura e atividade fermentativa est na faixa de 1-10 M. Segundo JONES & GREENFIELD (1984), a concentrao de 10 M j pode inibir o crescimento, estando a concentrao tima entre 1-1,5 M.

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Mangans

Segundo JONES & GADD (1990) e LIU et al. (1997), citados por STEHLIK-TOMAS et al. (2004), clulas de levedura requerem mangans como um elemento trao essencial a uma concentrao de 2-10 M para otimizar o crescimento. O mangans tem uma funo importante no metabolismo de S. cerevisiae como parte de algumas enzimas, por exemplo, piruvato descarboxilase. Segundo JONES & GREENFIELD (1984), mangans na concentrao de 7 M estimula os efeitos do Zn. STEHLIK-TOMAS et al. (2004) conduziram um experimento visando estudar a incorporao de alguns microelementos a clulas de S. cerevisiae e o impacto no estado fisiolgico das clulas. A adio de 0,1 g/L de cada um dos sais ZnSO4, CuSO4 e MnSO4 aumentou o rendimento em biomassa celular em 30% em condies semiaerbias. Em condies de anaerobiose, o rendimento de biomassa aumentou 10%, e a produo de lcool aumentou 20%.

Ferro:

JONES & GREENFIELD (1984) citam que a presena de ferro na concentrao de 1 a 3 M parece ser a concentrao tima para o crescimento. Apenas pequenas concentraes deste on so requeridas na funo de heme-enzimas. Apesar disso, segundo estes autores, no tem sido reportados efeitos sobre o fator Yx/s. BACH et al. (1978) utilizaram 0,01g/100 mL de (NH4)2Fe2(SO4)3 em meio de cultivo aerbio de S. cerevisiae. AIBA (1976) e OURA (1974) utilizaram 0,03 g/100mL de (NH4)2Fe2(SO4)3 em cultivos em batelada alimentada desta mesma levedura, ambos obtiveram resultados de Yx/s.acima de 0,5. 2.3.3. Parmetros Cinticos

Segundo HISS (2001), o estudo cintico de um processo fermentativo consiste inicialmente na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema de cultivo, em funo do tempo de fermentao. Entende-se como componentes, o microrganismo (ou biomassa), os produtos do metabolismo (ou metablitos) e os nutrientes ou substratos que compe o meio de cultura. O perfil cintico representa o ponto de partida para a descrio quantitativa de uma fermentao, sem o conhecimento cintico torna-se invivel a transposio de um experimento para a escala industrial. Afirmar que certa composio do mosto, por

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exemplo, melhor do que a outra, equivale a dizer que um fator de converso (substrato em clulas, por exemplo) maior no primeiro caso.

2.3.4. Propagadores

Modernos biorreatores na forma de fermentadores so usados em produo em larga escala de produtos farmacuticos e na indstria de alimentos, para produtos de fermentao (COONEY, 1983). Vrios autores reportam trabalhos onde biorreatores so desenvolvidos e utilizados (RECH et al., 2002; SCHIMIDELL, 2001; STEHLIK-TOMAS et al., 2004; OURA, 1974) como forma de minimizar custos otimizando resultados, seja em produto ou massa celular. A utilizao de um biorreator com a funo de propagar o fermento para a produo de cachaa permitiria a otimizao do processo de produo de fermento. Quase a totalidade dos produtores de cachaa ainda efetua a propagao do fermento em recipientes improvisados ou dentro da prpria dorna de fermentao. Nestas condies, a reproduo do fermento mais lenta e muito mais suscetvel a contaminaes. O ideal dispor-se de um equipamento especialmente destinado propagao do fermento, onde se propiciem condies timas para as leveduras desejveis e certo nvel de proteo contra microrganismos invasores. Alm disso, o propagador indispensvel para assegurar bons resultados no emprego de leveduras selecionadas (MAIA, 2002).

2.3.5. Estratgias utilizadas para aprimorar a performance dos meios de fermentao

Diversos autores empregam numerosas tcnicas para produo de biomassa, ou produtos produzidos por biotecnologia. Dentre vrios, RECH et al. (2002), FERRARI et al. (2001), MISKIEWICZ & KASPERSKI (2000), e AIBA et al. (1976) utilizaram estratgias semelhantes s utilizadas neste trabalho. Muitas tcnicas so empregadas no desenvolvimento de fermentaes industriais, sendo a composio do meio de importncia crtica, que pode afetar a concentrao do produto, rendimento e a produtividade volumtrica (KENNEDY & KROUSE, 1999). Dentre estas estratgias, as mais frequentemente utilizadas foram reunidas em um artigo

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publicado por estes autores, as tcnicas que serviram de suporte ao desenvolvimento da metodologia utilizada neste trabalho esto descritas a seguir.

2.3.5.1. Estratgia aberta: Define-se um nmero fixo de componentes a serem testados, na melhor combinao possvel. Na estratgia aberta, no se faz um pressuposto de qual seriam os melhores componentes.

2.3.5.2. Utilizao dos resultados de testes conduzidos em shaker (equipamentos incubadores dotados de agitao constante): Alguns autores assumem que o melhor meio escolhido dos testes em shaker vo ser os meios com melhores resultados posteriormente, em biorreatores.

2.3.5.3. Aperfeioamento de meios j descritos na literatura: Para crescimento de microrganismos de mesmas espcies ou gneros j relatados na literatura cientfica, utiliza-se ou adapta-se meios previamente testados, tambm j descritos.

2.3.5.4.Troca de componentes: Utiliza-se uma composio de meio como padro e troca-se um componente por vez, como por exemplo, a fonte de nitrognio ou carbono. Desta forma, possvel avaliar especificamente a influncia daquele componente.

2.3.5.5. Cpia biolgica: Baseia-se no conceito que a clula vai crescer melhor no meio que contenha todos os componentes que ela precise nas propores corretas. Utiliza-se a composio da clula, ndices de rendimento celular, entre outros, para calcular quantos componentes ter o meio de cultura e sua concentrao. WANG et al. (1979), citado por CARVALHO & SATO (2001), sugerem que a formao de um meio de cultivo leva em conta a composio celular, o requerimento energtico e a necessidade de substncias especficas.

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3 .MATERIAL E MTODOS

3.1. Material

3.1.1. Leveduras No primeiro teste exploratrio foi utilizado o fermento seco liofilizado, composto por clulas de S. cerevisiae. Nos demais testes, foi utilizado o fermento comercial prensado fresco, marca Itaiquara, tambm constitudo de clulas de S. cerevisiae., contendo 3031% de massa seca. Antes da utilizao, o fermento foi submetido ao teste de viabilidade celular. Apenas no Teste 09 foi utilizada, para fins de comparao, uma linhagem selecionada de S. cerevisae (Sc 19), da coleo de culturas do Laboratrio de Microbiologia Industrial da Faculdade de Farmcia/UFMG, isolada de uma unidade produtora de cachaa de alambique, do estado de Minas Gerais por OLIVEIRA (2002). A linhagem de levedura foi armazenada sob refrigerao em gar GYMP (glicose 2%, extrato de levedura 0,5 %, extrato de malte 1%, Na2HPO4 0,2% e gar 2% e coberta com leo mineral. Antes do uso esta levedura foi pr ativada no mesmo gar GYMP, a 30 C por 24 horas, e em seguida crescida em meio PDA (gar batata) a 30 C por 24 horas. As clulas de leveduras foram ressuspensas em gua destilada estril antes de serem inoculadas.

3.1.2. Propagadores Foram utilizados trs diferentes modelos de propagadores com aerao, aqui descritos como Modelos A, B e C. Os propagadores testados neste trabalho podem ser definidos como reatores agitados pneumaticamente, que se caracterizam basicamente pela ausncia de agitador mecnico. Resultam neste tipo de reator menores tenses de cisalhamento (SCHMIDELL & FACCIOTI, 2001). Segundo estes autores, os modelos testados neste trabalho seriam do tipo coluna de bolhas, onde tem-se um movimento aleatrio do lquido dentro do reator. O Modelo A consistiu de um equipamento de ao inox, cilndrico, com capacidade aproximada de 20 L, base com 20 cm de dimetro e altura de 66 cm. A aerao foi feita atravs de injeo de ar comprimido, por cinco bicos porosos (vela sinterizada) presos na base do propagador, como mostrado na FIGURA 2. Os Testes 1, 2, 3, 4, 5 e 6 foram conduzidos neste equipamento, conforme descrito no item 3.4.1; adiante.

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Os Testes 7, 8 e 9 foram realizados em incubadora com agitao orbital (shaker), temperatura de 30C e agitao de 150 rpm. O Modelo B consistiu de um frasco de vidro de base retangular (base medindo 11x 8 cm, 26 cm de altura), com capacidade para 0,8 L . A aerao foi feita na forma de microbolhas, utilizando-se uma bomba de aqurio ligada a dois bicos porosos (vela sinterizada), como mostrado na FIGURA 3. Os Testes 10 e 11 foram conduzidos neste equipamento, conforme descrito no item 3.4.3; adiante. O Modelo C consistiu de um equipamento cilndrico de vidro borossilicato, com base em ao inox, de 32 cm de altura e 16 cm de dimetro, com 5 L de capacidade til. Este propagador foi construdo para cultivo de S. cerevisiae. O difusor de ar constituiu-se de uma placa metlica de dimetro 100 mm, com orifcios na parte superior de 1 mm. Um tubo metlico de dimetro 12 mm foi soldado placa na parte inferior e esse tubo foi conectado a uma linha de ar comprimido, de acordo com a FIGURA 4. Os Testes 12, 13, 14, 15 e 16 foram conduzidos neste equipamento, conforme descrito no item 3.4.4; adiante.

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2a

2b

2c

FIGURA 2: Propagador A - 2 a: Lateral do propagador; 2 b:Frente do propagador, com entrada p aerao; 2 c: Bicos aeradores.

3a

3b

FIGURA 3: Propagador B 3 a: Foto da montagem do Modelo B; 3 b: Aerao com velas sinterizadas.

4a 4b 4c FIGURA 4: Propagador C 4 a: Propagador C; 4 b: Aerador e Vlvula de sada; 4 c: Aerador do Propagador C em destaque.

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3.2. Mtodos analticos

3.2.1. Viabilidade celular Foi determinada utilizando corante azul de metileno, segundo BONNEU et al. (1991). As clulas foram mantidas em contato durante 10 minutos com a soluo azul de metileno, em seguida contadas ao microscpio (aumento de 400 X), em cmara de Neubauer. As clulas coradas foram consideradas mortas, as no coradas, vivas.

3.2.2. Determinao dos acares redutores totais (ART) Nos testes preliminares foi utilizado refratmetro manual, escala 0-32Brix. Para a determinao dos acares redutores totais e residuais do mosto e do vinho, foi utilizada a metodologia do DNS (cido 3,5 dinitrossaliclico) de acordo com MILLER (1959). Quando necessrio, as amostras eram previamente submetidas hidrlise cida da sacarose presente no meio de cultura, com HCl (cido clordrico), segundo metodologia descrita por SILVA (2003).

3.2.3. Acidez total do mosto e do vinho Foi determinada por titulometria, com hidrxido de sdio 0,025 mol/L, segundo ABNT (1997).

3.2.4. Dosagem de etanol no vinho A concentrao de etanol foi determinada pelo mtodo espectrofotomtrico do dicromato de potssio (ABNT, 1997). O preparo das amostras para dosagem de etanol foi feito conforme descrito por OLIVEIRA (2001). Alquotas de 25 mL das amostras foram previamente destiladas por arraste de vapor em microdestilador de lcool Tecnal (Modelo TE-012).

3.2.5. Determinao de massa seca celular (g de matria seca/L): Para esta determinao, uma alquota da amostra foi centrifugada (caldo fermentado) a 6000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi separado para as outras anlises (etanol, acidez, ART) e a massa celular foi ressuspensa em gua destilada e centrifugada. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes. A matria seca (biomassa centrifugada) foi determinada por secagem de biomassa das leveduras em estufa a 105 C, at peso constante.

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3.2.6. Determinao de pH: Foi utilizado pHmetro eletrnico digital, marca QUIMIS, modelo Q400A. As amostras foram submetidas leitura direta no aparelho, depois da calibrao do mesmo.

3.3. Clculos dos parmetros de crescimento celular

3.3.1. Fator de converso de substrato clulas (Yx/s) Expressa a massa celular produzida em relao a massa de ART consumida. Este parmetro fornece a quantidade de massa celular produzida por grama de acar consumido (HISS, 2001 e SILVA, 2003). Frmula utilizada para o clculo: Yx/s = XF XO ST - SR Onde: SR (g)= massa de substrato residual no meio ST (g) = massa de substrato total adicionada ao meio XO (g) = massa seca inicial, expressa em g XF (g)= massa seca final, expressa em g 3.3.2. Fator de converso de substrato em etanol (Yp/s) Expressa a quantidade de etanol formada por unidade de acar consumido. Yp/s = PF PO ST SR Onde: PF (g)= massa de etanol final PO (g)= massa de etanol inicial 3.3.3. Fator de converso de substrato em acidez (Yac/s) Expressa a quantidade de cido formada por unidade de acar consumido. Yp/s = AcF AcO ST SR AcF (g)= massa de cido final AcO (g)= massa de cido inicial

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3.3.4. Aumento de biomassa (em nmero de vezes) O aumento de biomassa foi determinado pela quantidade de biomassa formada (XF) em relao quela inicialmente inoculada (Xo), expressa em nmero de vezes. O clculo foi feito da seguinte forma: Aumento de biomassa = Massa seca final (aps a propagao) Massa seca inicial

3.4. Metodologia utilizada nos ensaios de propagao

Preparo do caldo e inoculao: Em todos os ensaios, o caldo ou meio de cultivo, de composio variada conforme

o teste, foi esterilizado em autoclave a 121 C por 20 minutos. Depois de resfriado at 2528 C, o meio de cultivo foi inoculado, e aerado de forma contnua. Adies intermedirias de meio de cultivo: Durante o perodo de propagao em batelada alimentada, com exceo dos Testes 8 e 9, foram feitas adies peridicas de meio de cultivo (descritos em cada teste), com o objetivo de manter a concentrao de acares em torno de 1-2 Brix (ou 10 a 20 g/L). As adies foram sucessivas, a intervalos de aproximadamente 2 horas, em volumes crescentes. O meio de cultivo adicionado nestes intervalos continha teor de acar mais elevado que o mosto inicial (em torno de 10 a 25 g/100 mL, conforme o teste), de modo a adicionar pequenas quantidades que no aumentassem muito o volume final. Por este motivo, foi aqui denominado xarope. O volume de xarope a ser adicionado foi calculado por balano de massa, de acordo com o volume de meio contido no propagador e o acar residual. O balano de massa foi calculado da seguinte forma: ( S0 * V0) + ( Sx * Vx ) = (V0+ Vx )* SF Onde: SR = Concentrao de acar residual no propagador (g/L) V0 = volume inicial (L) Sx = Concentrao de acar no xarope a ser adicionado V0 + Vx= Volume final (L) SF = Concentrao desejada final de acar (g/L) Vx = Volume de xarope

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Quando necessrio, adicionou-se como antiespumante, dimeticona (em gotas, 75 mg/mL, laboratrio Medley). Todos os testes foram conduzidos em temperatura ambiente, que variou entre 20 e 23 C. Apenas o teste de nmero 11 foi realizado em estufa, a 30 C, e os testes 7, 8 e 9 em incubadora com agitao, a temperatura tambm controlada de 30 C. As particularidades de cada teste sero descritas a seguir.

3.4.1. Ensaios preliminares cultivos realizados no propagador A Os ensaios preliminares englobaram os Testes 1 at 6. Dentre os mtodos descritos por KENNEDY & KROUSE (1999), o mtodo utilizado nestes testes preliminares foi a estratgia aberta, a fim de conhecer o comportamento da levedura S. cerevisiae sob aerao, em meios de crescimento, neste propagador. A composio dos meios de cultura utilizados nestes experimentos encontram-se na TABELA 5, assim como os meios (xaropes) utilizados nas adies intermedirias se encontram na TABELA 6.

TABELA 5 - Composio dos meios de cultura utilizados nos ensaios preliminares Propagador A. Concentrao g/100 mL Componentes Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste 5 Teste 6 Caldo de cana diludo (ART) 1,80* 2,00* 1,90 2,80 0,60 1,10 (NH4)2SO4 0,38 0,60 1,34 1,34 --Extrato de levedura ----0,90 0,90 --0,40 0,40 0,50 0,27 KH2PO4 MgSO4.7H2O --0,16 0,16 0,10 0,05 KCl ----0,10 0,05 Fermento (mx) 0,12 0,12 0,40 0,40 0,40 0,20 Volume inicial de meio ( mL) 5000 5000 10000 10000 3000 5600 *Resultados obtidos em Brix

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TABELA 6 - Composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias das propagaes - ensaios preliminares. Concentrao g/100 mL Componentes Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Teste 5 Teste 6 Caldo de cana diludo (ART) 16,00* 16,00* 22,00 23,00 18,50 20,00 Extrato de levedura 0,38 0,60 --0,90 0,90 KH2PO4 ----0,50 0,60 MgSO4.7H2O ----0,10 0,10 KCl ----0,10 0,10 Volume adicionado(mL) 320 800 2830 2500 330 390 *Resultados obtidos em Brix TESTES 1 e 2 O meio de cultura utilizado nos Testes 1 e 2 foi caldo de cana-de-acar diludo, adicionado de sulfato de amnio. O inculo utilizado foi fermento liofilizado (S. cerevisiae). No Teste 2 o fermento mido prensado (S. cerevisiae) foi escolhido em substituio ao liofilizado (Teste 1) por apresentar uma viabilidade inicial maior que o fermento liofilizado granulado. O caldo de cana-de-acar foi adicionado de sulfato de amnio (TABELA 5). A concentrao de acares no meio de propagao foi estimada pelo Brix, em refratmetro manual. Em ambos os testes, foram feitas adies sucessivas de caldo de cana-de-acar a 16 Brix, a cada 2 horas.

TESTES 3 e 4 Foi adotada a estratgia de aperfeioamento de meios de cultivo descritos na literatura (KENNEDY & KROUSE, 1999). Nestas propagaes, o caldo de cana-de-acar foi suplementado com alguns sais, segundo algumas referncias: OURA (1974) utilizou 1,2% p/v de sulfato de amnio no meio, e segundo REED & PEEPLER (1973) o fosfato deve corresponder a 1/3 do sulfato adicionado. Adicionou-se, ento, 1,3% p/v de sulfato de amnio, e 0,4% p/v de fosfato dicido de potssio. Os meios de cultura utilizados nos Testes 3 e 4 tiveram a mesma composio, variando apenas a concentrao inicial de acar. O consumo de acar pela levedura passou ento a ser acompanhado por anlise de ART (mtodo DNS), uma vez que os sais adicionados interferem na leitura do Brix pelo refratmetro. Nas primeiras doze horas foram feitas adies de caldo de cana-deacar (a 22 Brix). Nas quatorze horas restantes, nada foi adicionado ao propagador. No Teste 4, periodicamente foram retiradas amostras de apenas seis mL, as quais foram centrifugadas em tubos Eppendorf para separao de clulas e determinao posterior de ART no sobrenadante. Este procedimento reduziu sensivelmente o volume de amostra retirado durante a propagao, em comparao com os testes anteriores (1, 2

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e 3), cujos volumes de amostras retiradas foram de aproximadamente 200 mL por intervalo de tempo.

TESTE 5 Neste teste a fonte de nitrognio foi substituda por extrato de levedura ao invs de sulfato de amnio com o objetivo de verificar a sua influncia na viabilidade celular. Com o intuito de melhorar a aerao, e conseqentemente, o crescimento celular, o volume inicial de meio de cultura utilizado nessa propagao foi diminudo de 10 litros (como nos Testes 3 e 4), e 5 litros (Testes 1 e 2) para 3 litros neste teste. A composio do meio de cultura foi corrigida, de acordo com JERNIMO (2004), conforme estratgia descrita por KENNEDY & KROUSE, 1999, e mostrado na TABELA 04.

TESTE 6 A quantidade de inculo inicial foi modificada de 0,4 g/100 mL de massa seca para 0,2 g/100 mL de massa seca e a concentrao dos sais adicionados foi reduzida. O volume inicial de meio de cultura utilizado neste experimento foi de 5,6 litros.

3.4.2. Testes conduzidos em incubadora com agitao e temperatura controlada (shaker)

Os Testes 7, 8 e 9 descritos a seguir, foram conduzidos em incubadora com agitao orbital, a 150 rpm e temperatura controlada a 30 C, largamente utilizada por pesquisadores para testes em pequena escala, seja com o objetivo de produzir massa celular, ou algum produto metablico do microrganismo em questo (KENNEDY & KROUSE, 1999). A composio dos meios usados nestes dois testes se encontra na TABELA 7. No Teste 7, apenas um tipo de meio foi utilizado. No Teste 08, foram preparados e testados 4 diferentes meios de cultivo. No Teste 09, foram utilizadas duas leveduras (S. cerevisiae): fermento mido prensado e cultura pura selecionada (Sc 19).

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TABELA 7 Composio dos meios de cultura utilizados nas propagaes conduzidas em shaker Concentrao g/100 mL Componentes Teste 7 Teste 8 Teste 9 Caldo de cana diludo (ART) 1,60 3,20 11,00(*) pH 4,5 4,5 6,00 (NH4)2SO4 0,20 0,20 -(NH4)2Cl --0,50 MgSO4.7H2O 0,04 0,04 0,10 KH2PO4 0,50 0,50 0,50 KCl 0,05 0,05 0,10 Fermento (mx) 0,40 0,40 0,012 Farinha de soja 0,50 ---Nitrognio protico -0,90 (**)
(*) Foi utilizada glicose na concentrao descrita, ao invs de caldo de cana-de-acar diludo. (**)Foram utilizadas como fontes de nitrognio protico: Meio 1: Extrato de Levedura 0,9 g/100 mL (JERNIMO, 2004; OLIVEIRA 2001 e PULZATTO 2000). Meio 2: Isolado Protico de Soja 0,4 g/100 mL (produto comercial, fornecido pela Bunge alimentos), segundo JERNIMO (2004). Meio 3: Farinha de Soja 0,5 g/100 mL (segundo MAIA, 1992). Meio 4: Isolado Protico de Soja 0,4 g/100 mL + Farinha de Soja 0,5 g/100 mL. TESTE 09: Extrato de Levedura 0,9 g/100 mL

TESTE 7 O objetivo deste teste foi verificar se adies peridicas de meio de cultivo, de forma a manter a concentrao de acares entre 5-20 g/L, melhorariam a converso de substrato em clulas e o rendimento em massa celular, em condies controladas de temperatura e agitao. Este experimento foi conduzido em frascos de Erlenmeyer de 250 mL, contendo 50 mL de meio de cultura. Os frascos foram inoculados e incubados sob agitao orbital de 150 rpm a 30 C, por doze horas. Este teste foi conduzido em batelada alimentada, e foram feitas adies de caldo de cana-de-acar puro (19,5 Brix) a cada 2 horas. Foi escolhido um meio de cultura descrito por MAIA (1992), contendo farinha de soja. A farinha de soja tem seu uso conhecido como suplemento nutricional no incio do processo de propagao das leveduras, nos alambiques de cachaa de alambique e em pesquisas com S. cerevisiae (OLIVEIRA,1988; MAIA, 1992; RIBEIRO 2002 ).

TESTE 8: No intuito de determinar a melhor fonte de nitrognio para propagao de S. cerevisiae, foi feito um teste com quatro meios de composio base idntica, e variadas

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fontes de nitrognio, identificados como meio 1, 2, 3, 4. A composio dos meios se encontra descrita na TABELA 07. Os meios foram distribudos em frascos de Erlenmeyer de 250 mL, cada um contendo 50 mL de meio de cultura. Os frascos foram inoculados e incubados em incubadora com agitao orbital de 150 rpm, a temperatura controlada de 30 C por 7 horas. Os testes foram conduzidos em batelada simples, ou seja, no foram feitas adies de meio de cultivo durante a propagao. A cada hora, identificada como tempo 0, 1, 2, 3, e assim sucessivamente, uma amostra de cada meio foi coletada e centrifugada para determinao de massa celular (expressa em g massa seca) e do teor de ART residual.

TESTE 9 Este teste foi realizado com o objetivo de verificar a influncia da concentrao inicial do inculo, a influncia do tipo de fermento utilizado e comparar resultados com os obtidos por ALVES et al. (2005). O meio de cultura foi preparado segundo metodologia descrita por OLIVEIRA (2001), com formulao descrita na TABELA 7. Os meios foram distribudos em frascos de Erlenmeyer de 250 mL, cada um contendo 100 mL de meio de cultura. Os frascos foram inoculados e incubados em incubadora com agitao orbital de 150 rpm, a temperatura controlada de 30 C por 24 horas. Foram testados dois tipos de leveduras S. cerevisiae. O fermento mido prensado, o mesmo utilizado nos testes anteriores, na concentrao de 0,012 g/100 mL e a levedura selecionada Sc 19 (S. cerevisiae), testada por ALVES et al. (2005) na mesma concentrao inicial de 0,012 g/100 mL de inculo .

3.4.3. Testes conduzidos no Propagador B Este modelo de propagador foi testado devido sua simplicidade de operao alm de possibilitar o trabalho com menores volumes e com temperatura controlada. Para a formulao do meio de cultivo, utilizou-se a estratgia descrita por KENNEDY & KROUSE (1999) onde a composio da clula e o fator de rendimento celular so usados para se calcular a composio do meio. Os componentes e balanceamento do meio foram calculados da seguinte forma:

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1) De acordo com os testes preliminares realizados neste trabalho, calculou-se o volume de acar (em g) normalmente consumido pelas leveduras em propagaes com 12 horas de durao. 2) Considerou-se o fator de converso de substrato em clulas (Yx/s) terico de 0,5 (OURA, 1974) e a partir deste fator, a massa celular terica que seria obtida. 3) Tendo como base a composio qumica de S. cerevisiae, descrita por AIBA et al, (1973) e REED & NAGODAWITHANA (1991), foi calculada a composio do meio necessria para se obter a massa celular calculada no item 2 acima. Nestes experimentos foi utilizada a sacarose como fonte de carbono, ao invs do caldo de cana-de-acar, para uma melhor padronizao do meio. O propagador foi colocado dentro de uma estufa e a temperatura foi mantida a 30 C. O aerador (bomba de aqurio) foi mantido ligado durante todo o tempo das propagaes. Na TABELA 8 se encontra a descrio da composio dos meios utilizados nos Testes 10 e 11.

TABELA 8 - Composio dos meios de cultura utilizados no Propagador B Concentrao g/100 mL Componentes Teste 10 Teste 11 Sacarose 1,00 1,00 Extrato de levedura 0,90 0,90 (NH2)2CO 0,20 -(NH4)2Cl --0,20 (NH4)2SO4 --0,40 KH2PO4 0,10 0,10 0,10 0,05 MgSO4.7H2O NaH2PO4.H2O 0,10 -Farinha de soja 0,30 1,20 Fermento (mx) 0,40 0,015 gua q.s.p. 500 mL 500 mL Foram feitas adies de xarope de sacarose, complementado com sais, a cada 2 horas de propagao, dentro das doze primeiras horas do processo. Aps as primeiras doze horas os meios de cultivo foram mantidos com a alimentao de ar ligada durante as doze horas seguintes. Na TABELA 9, a seguir, est descrita a composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias dos Testes 10 e 11.

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TABELA 9 - Composio dos intermedirias no Propagador B Componentes Sacarose Extrato de levedura comercial (NH4)2Cl KH2PO4 MgSO4.7H2O (NH2)2CO gua q.s.p.

xaropes

utilizados

nas

adies

Concentrao g/100 mL Teste 10 Teste 11 10,00 24,00 -2,60 -0,60 -0,30 -0,05 0,70 ---300 mL 220 mL

TESTE 10: A fonte de nitrognio escolhida neste teste foi a uria ((NH2)2CO), por ter mais nitrognio por grama de peso, quando comparada com o sulfato de amnio. A uria tambm no adiciona sulfato ao meio (ao contrrio do sulfato de amnio), o que facilita clculo do balanceamento. OURA (1974) e FERRARI et al. (2001) utilizaram uria na composio dos seus meios de cultura para obteno de massa celular.

TESTE 11 Neste teste, foram feitas modificaes no balanceamento do meio de cultura, a uria foi substituda por duas outras fontes de Nitrognio, o cloreto de amnio e o sulfato de amnio. Conseqentemente, outras modificaes foram feitas na composio para que o balanceamento no fosse alterado. Novamente, foi adotada a estratgia de aperfeioamento de meios, descrita por KENNEDY & KROUSE (1999).

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3.4.4. Testes conduzidos no Modelo C Foi utilizado o propagador Modelo C, tipo coluna de bolhas, projetado e construdo para o cultivo de leveduras em aerobiose.

TABELA 10 - Composio dos meios de cultura utilizados no Propagador C Componentes Concentrao g/100 mL Teste 12 Teste13 Teste 14 Teste 15 Teste 16 Glicose 1,00 1,00 1,00 1,00** 1,00 Extrato de levedura 0,90 -0,90 0,90 0,90 Isolado Protico de soja ----0,55 Farinha de soja 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 (NH4)2SO4 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 (NH4)2Cl KH2PO4 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 MgSO4.7H2O 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Fermento (mx) 0,20 0,20 0,20 0,016 0,012 Soluo de micronutrientes ----(*) gua q.s.p. 2000 mL 2000 mL 2000 mL 2000 mL 2000 mL
*No Teste 14, foi feita uma soluo dos sais contendo os micronutrientes, sendo essa soluo adicionada ao meio de propagao no tempo zero, ou seja, no incio da propagao. Os micronutrientes e a concentrao utilizada esto descritos na TABELA 10. **O acar utilizado no teste 15 foi sacarose

TABELA 11 - Sais Minerais utilizados como micronutrientes na Teste 14 Ction Sal utilizado Concentrao utilizada (mol/L) 1,5 5,0 1000 2000

Cu 2+ Cu SO4 5H2O 2+ Zn ZnSO4 7H2O FeSO4 7H2O Fe 2+ Mn 2+ MnCl2 4H2O Fonte: JONES & GREENFIELD(1984)

TABELA 12 - Composio dos xaropes utilizados nas adies intermedirias no Propagador C Concentrao g/100 mL Componentes Teste 12 Teste 13 Teste 14 Teste 15 Teste 16 Glicose 10,0 10,0 10,0 25,00* 25,00 Extrato de levedura 0,90 0,90 0,90 0,90 -Isolado protico de soja ----0,55 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 (NH4)2Cl KH2PO4 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 MgSO4.7H2O 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 gua q.s.p. 500 mL 500 mL 500 mL 650 mL 1000 mL
*O acar utilizado no teste 15 foi sacarose

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TESTES 12, 13, 14 Dentre as estratgias descritas por KENNEDY & KROUSE (1999), consta a troca de componentes do meio como forma de verificar a influncia sobre o crescimento celular. Desta forma foram conduzidos os Testes 12 e 13, a fim de verificar a influncia de duas diferentes fontes proticas sobre o crescimento. No Teste 12, foi feita a propagao, em triplicata, utilizando o extrato de levedura como fonte principal de nitrognio. No Teste 13, a formulao do meio utilizado foi idntica do experimento 12, com exceo da fonte de nitrognio protico, que foi substituda por isolado protico de soja SUPRO 780 (90% de protena), fornecido pela Bunge Alimentos. A quantidade utilizada de isolado protico foi calculada de forma a adicionar a mesma quantidade de nitrognio que o extrato de levedura do experimento anterior, variando assim, apenas a fonte de nitrognio. Este teste tambm foi realizado em triplicata. No Teste 14 a composio do meio de cultivo foi idntica do meio do Teste 12, acrescida de micronutrientes. O objetivo foi verificar a influncia de sais minerais descritos na literatura como micronutrientes sobre o crescimento e viabilidade celular. Foram testados: Cu
2+

; Zn2+ ; Fe

2+

e Mn

2+

. Depois de preparados e esterilizados os

meios, os sais foram adicionados e ento iniciada a propagao. O teste tambm foi realizado em triplicata. Nos Testes 12, 13 e 14, foram feitas adies de xarope de glicose, complementado com sais, com formulao descrita na TABELA 12, a cada duas horas de propagao, dentro das doze primeiras horas do processo. Nas doze horas seguintes, no foi adicionado meio de cultivo ao propagador e o aerador foi mantido ligado, borbulhando ar comprimido.

TESTES 15 e 16 Estes testes foram planejados para que fosse possvel comparar melhor os resultados obtidos neste trabalho com os resultados obtidos por ALVES et al. (2005). O meio de cultivo utilizado foi basicamente o mesmo utilizado nos Testes 12, 13 e 14. O inculo foi reduzido de 0,20 g/100 mL (Testes 12, 13 e 14) para 0,016 g/100 mL (Teste 15) e 0,012g/100 mL (Teste 16) como no Teste 09 realizado anteriormente. A composio dos meios mostrada na TABELA 10, assim como a composio do xarope utilizado nas adies intermedirias na TABELA 12. O teste 15 foi realizado para estudar a influncia da concentrao inicial de clulas na propagao. Como nos testes 12, 13 e 14, foram feitas adies de meio de cultivo a

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cada duas horas, durante as primeiras 12 horas de propagao. O aerador foi ento, mantido ligado durante 12 horas. O teste 16 foi feito com o objetivo de verificar a influncia da reduo da concentrao inicial de inculo e do aumento do tempo de alimentao (de 12 para 24 horas). Neste teste, foram feitas adies de meio de cultivo a cada duas horas, durante as 24 horas de propagao.

3.5. Anlise estatstica: Os resultados obtidos nos Testes 12, 13 e 14 (feitos em triplicata) foram submetidos anlise de varincia (teste F) e as mdias comparadas pelo teste Duncan, adotando-se o nvel de significncia de 5% para ambos os casos.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Ensaios preliminares Propagaes conduzidas no propagador Modelo A em sistema de batelada alimentada. Com exceo dos Testes 1 e 2, todas as outras propagaes dos ensaios preliminares foram conduzidas por 12 horas. Os resultados destes testes esto resumidos na TABELA 13.

TABELA 13 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador A Testes 3 4 5 6 Yp/s

g/g

Yac/s
g/g

Yx/s
g/g

Viabilidade (%) 80 63 99 98

Xf / Xo 2,4 3,0 2,2 5,5

0,007 0,008 Nd 0,024

0,031 0,037 0,004 0,027

0,07 0,10 0,22 0,36

Nd.=No determinado

TESTES 1 e 2 No Teste 1, o tempo de propagao foi de 6 horas e 30 minutos. Durante o processo de propagao, a acidez total produzida aumentou em 3,9 g cido actico/L. A viabilidade inicial era de 77,9%, e se manteve ao final do processo de propagao (78%). Por apresentar uma viabilidade inicial baixa, o fermento liofilizado foi substitudo pelo fermento prensado mido nos testes seguintes. No Teste 2, o tempo de propagao foi de 7 horas e 30 minutos. Durante o processo de propagao, a acidez total produzida aumentou em 2,7 g cido actico/L. A viabilidade inicial das clulas era de 96% caiu muito durante o tempo de propagao, terminando 20% menor (79%). O aumento de massa no pode ser verificado nestes dois testes devido retirada de amostras volumosas (cerca de 200 mL a cada 2 horas) durante a propagao. Estes dois testes foram exploratrios, e foi possvel fazer algumas observaes: Apesar da determinao do Brix oferecer apenas uma estimativa do teor de acar, sua utilizao permitiu observar que todo o acar adicionado foi consumido (leitura acar residual 0,5 Brix). O refratmetro utilizado apresenta limitaes com relao interpretao do resultado na escala do aparelho, uma vez que o teste foi conduzido com

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um baixo teor de acar. A viabilidade celular no se manteve ao final do Teste 2, o que sugere que o uso de sulfato de amnio no foi suficiente para manter as clulas viveis. Com relao acidez titulvel total, o comportamento observado era esperado, sendo o sulfato de amnio a nica fonte de nitrognio. BASSO et al. (1996) comentam que, em meios de cultivo onde a nica fonte de nitrognio amoniacal, ocorre uma acidificao do meio pelas leveduras, que ao absorverem o NH4+, liberam o on H+ no meio. Em um trabalho de acompanhamento do processo de propagao do fermento, MORAIS et al.(1997) citam que durante a propagao do fermento (preparo do p-decuba), a atividade das leveduras promoveu a acidificao do mosto. A acidez total correspondeu a 0,110 g de cido actico/litro no primeiro dia de propagao e 0,461 g/litro no quinto dia, valores bastante inferiores aos resultados encontrados nos testes 1 e 2.

TESTES 3 e 4 No Teste 3, a massa celular seca final aumentou 2,4 vezes (de 39 g iniciais para 93 g ao fim do processo), o Yx/s obtido foi 0,07. A viabilidade diminuiu 20% de 99% no incio da propagao para 80% no final do processo. A cada intervalo de propagao, um volume significativo de amostra era retirado (200 ml), o que dificultou a interpretao dos resultados, uma vez que a retirada da amostra implica tambm na retirada de clulas. No Teste 4, a amostragem foi reduzida (6 mL a cada duas horas), para evitar o problema descrito. A massa celular seca no Teste 4 aumentou de 42 g inicial para 124 g final, ou seja, 34%, mas apesar disso a viabilidade diminuiu de 99% no incio da propagao para 63% no final do processo. Em ambos os testes, pode-se observar que apenas a presena dos sais nas concentraes testadas no foram suficientes para manter a viabilidade das clulas durante a propagao. Apesar dessa queda na viabilidade no Teste 4, o Yx/s foi de 0,10; ou seja, melhorou quando comparado ao teste anterior. A acidez total aumentou dentro do esperado, de 1,6g cido actico/L para 3,8 g cido actico/L, sendo o nitrognio amoniacal a nica fonte de nitrognio disponvel no meio.

TESTE 5 Houve um aumento de 2,2 vezes da massa celular. O fator de converso (Yx/s) foi de 0,22. Ao trmino da propagao, a viabilidade se manteve constante (99%), o que pode ser atribudo adio do extrato de levedura ao meio de cultivo, conforme

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observado por JERONIMO (2004), que relatou queda na viabilidade celular na ausncia de nitrognio protico no mosto. A acidez aumentou menos quando comparada aos valores das propagaes anteriores (acidez inicial de 2,3 g cido actico/L; acidez final de 2,2 g cido actico/L), que pode ser devido ausncia do sulfato de amnio na composio do meio de cultura.

TESTE 6 O Yx/s obtido de 0,36, o que pode ser considerada uma boa converso de substrato em clulas. A massa inicial foi aumentada 5,5 vezes ao final do experimento. Observouse que a diminuio da concentrao de sais minerais no meio de cultivo em relao ao experimento anterior (Teste 5) e a presena do extrato de levedura como fonte protica melhoraram sensivelmente os resultados, mantendo as clulas viveis, aumentando a massa celular e o Yx/s . Ao trmino da propagao, a acidez apresentou um pequeno acrscimo (incio 1,6 g cido actico/litro; final da propagao 2,2 g cido actico/litro), a viabilidade se manteve constante (incio 99,3% final da propagao 98,4% de clulas viveis). Com estes resultados, pode-se verificar que a presena do extrato de levedura no meio de cultura manteve a viabilidade celular, aspecto importante quando se trata de propagao de clulas de levedura para a produo de cachaa. Observando a TABELA 13, os fatores de converso de substrato em acido actico (Yac/s) dos testes 3 (0,031), 4 (0,037), 5 (0,004) e 6 (0,027) se encontram abaixo do valor encontrado para este fator por OLIVEIRA (2001), em fermentaes alcolicas, que foi de 0,080. Dentre os testes preliminares, verifica-se que o Teste 6 foi o que proporcionou maior aumento de massa celular (5,5 vezes) e tambm foi obtido um valor de Yx/s0,36. importante comentar que, apesar do Teste 4 ter apresentado um maior aumento de massa celular (3 vezes) do que o Teste 5 (2,2 vezes), ocorreu uma grande perda de viabilidade celular durante o experimento (caiu para 63,3%). Houve um efeito positivo da adio de extrato de levedura aos meios de cultivo como fonte de nitrognio. JERNIMO (2004), explica que na ausncia de suplementao do meio de cultivo com extrato de levedura durante a fermentao alcolica, a viabilidade celular diminui drasticamente, podendo comprometer a utilizao do fermento. A queda de viabilidade nos Testes 1, 2, 3 e 4 pode ser devido ausncia de nitrognio protico. Segundo BASSO et al. (1996), a acidez resultante da utilizao do sulfato de amnio causa estresse levedura diminuindo a viabilidade e multiplicao.

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REED & NAGODAWITHANA (1991) comentam que, sob condies estritamente aerbias, o melhor fator de converso (Yx/s) obtido 0,54. importante comentar que este fator atingido quando se trabalha com reatores totalmente automatizados, com todas as condies bem controladas (temperatura, oxignio dissolvido no meio, pH, formao de etanol, consumo de acar). Este dado nos sugere que as condies estudadas devem ser aprimoradas.

4.2. Testes de propagao conduzidos em incubadora com agitao e temperatura controladas (shaker)

TABELA 14 Resultados dos parmetros fermentativos - shaker Testes 7 8 - Meio 1 8 - Meio 2 8 - Meio 3 8 - Meio 4 9 a* 9 b**
nd.=No determinado Meio 1: Extrato de Levedura 0,9 g/100; Meio 2: Isolado Protico de Soja 0,4 g/100 mL; Meio 3: Farinha de Soja 0,5 g/100 mL; Meio 4: Isolado Protico de Soja 0,4 g/100 mL + Farinha de Soja 0,5 g/100 mL. 9a * Sc 19 Levedura selecionada para produo de cachaa S. cerevisiae 9b ** Fermento mido prensado.

Yp/s Nd Nd Nd Nd Nd 0,023 0,025

Yac/s 0,013 0,038 0,027 0,050 0,041 0,008 0,005

Yx/s 0,08 0,20 0,11 0,15 0,11 0,070 0,074

Viabilidade(%) 87 96 88 90 95 98 98

Xf / Xo 3,3 2,65 1,67 1,99 1,53 52 57

TESTE 7 Observa-se na TABELA 14, que a massa celular aumentou 3,3 vezes ao final da propagao, resultado prximo faixa de aumento obtida nos experimentos anteriores, em propagador aerado tipo coluna de bolhas. O Yx/s obtido foi baixo em se tratando de propagao de clulas de levedura, j que as condies de cultivo foram controladas (temperatura e agitao), e a concentrao de substrato foi mantida baixa (entre 1 a 2% p/v) durante o experimento. Em estudo com fermentao alcolica com S. cerevisiae, SILVA (2003) encontrou valores para Yx/s entre 0,039 a 0,072, semelhantes aos

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resultados obtidos neste teste, e nos testes 3 e 4, sugerindo que o meio e as condies de cultivo ainda no foram adequadas ao cultivo das clulas. Ao fim das 12 horas de propagao, a viabilidade celular foi de 87% (viabilidade inicial era 98%). Neste teste o meio foi adicionado de sulfato de amnio (entre outros sais) e farinha de soja. Segundo MAIA (1992) esta ltima tem efeito positivo sobre a viabilidade das clulas, mas nas condies deste experimento isto no se comprovou, j que ao final das 12 horas de propagao, a viabilidade que era inicialmente de 98% caiu para 87%.

TESTES 8 (Meios 1, 2, 3 e 4) Durante a propagao, o teor de acar (ART) foi todo consumido ao final de quatro horas, o que determinou o fim do experimento, uma vez que este teste foi conduzido em batelada. Observando-se a TABELA 14 verifica-se que, dentre os meios testados, os resultados obtidos com o Meio 3 (com 5 g/L de farinha de soja) foram satisfatrios, por apresentar resultados semelhantes aos obtidos com o meio 1 (com 9 g/L de extrato de levedura). Estes meios apresentaram os maiores valores de Yx/s, maiores aumentos em massa celular, assim como maior percentagem de clulas viveis. Os resultados corroboram com MAIA (1992), que testou a adio de farinha de soja em meios para fermentao alcolica, conseguindo manter a viabilidade inicial do fermento. Por estes motivos e tambm por ser um substrato de baixo custo, a farinha de soja foi incorporada aos meios de cultivo testados neste trabalho.

TESTE 9 Os resultados dos testes feitos com a levedura selecionada S. cerevisiae Sc 19 e com fermento mido prensado esto apresentados na TABELA 14. A viabilidade inicial do fermento selecionado era de 100%, e ao final da propagao era de 98,5%. A viabilidade final do fermento mido prensado manteve-se em 98%. Ambos os fermentos testados apresentaram baixos fatores de converso de substrato em clulas (Yx/s de 0,070 e 0,074). O teste foi conduzido em batelada, com alta concentrao inicial de acares (11 g/100 mL) , que segundo REED & PEPPLER, (1973), tambm desfavorece o ciclo metablico respiratrio, e conseqentemente, uma menor converso de substrato em massa celular. Este teste, assim como nos estudos desenvolvidos por ALVES et al. (2005), tiveram um nvel inicial de acares elevado (7 g/100 mL), e foram conduzidos em batelada. O nvel elevado de acares pode ter

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interferido negativamente numa melhor converso de substrato em clulas (Yx/s). Segundo PRESCOTT & DUNN (1959) nveis de acares abaixo de 1,5% favorecem a produo de clulas. No entanto, estes foram os maiores aumentos de massa celular conseguidos at ento (52 e 57 vezes), valores muito superiores aos encontrados nos testes anteriores, o que sugere que a concentrao inicial do inculo teve influncia direta no aumento de massa celular de S. cerevisiae, nas condies avaliadas. Os testes conduzidos em incubadora de agitao orbital nos sugerem a ineficincia da aerao dos meios, pois os Testes 07 e 09 apresentaram resultados de Yx/s muito baixos (0,079, 0,070 e 0,074), assim como os meios 2 e 4 do Teste 08, que foram de 0,11. Os resultados de Yac/s encontrados nos testes em shaker podem ser comparados com os resultados em fermentao alcolica obtidos por OLIVEIRA (2001) e SILVA (2003), que utilizaram a classificao proposta por ANDRIETTA (1999), onde os resultados dos parmetros fermentativos so divididos entre nveis que vo de muito baixo a muito alto. Os fatores Yac/s dos Testes 7, e 9 se encaixam nos nveis baixo (0,005 a 0,0079) e mdio (0,0080 a 0,013) desta classificao. Os resultados do Teste 8 se encontram acima do nvel definido como muito alto (>0,024) por este autor. Observou-se que necessrio verificar o desempenho de formulaes mais complexas e elaboradas em um propagador que tenha um sistema de aerao mais eficiente, uma vez que a incubadora com agitao orbital no permite uma aerao eficiente do meio

4.3. Testes de propagao conduzidos no Propagador B Os resultados dos Testes 10 e 11 esto apresentados na Tabela 15. Ambas propagaes tiveram 12 horas de durao.

TABELA 15 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador B Teste 10 11 Yp/s 0,036 0,015 Yac/s 0,003 0,028 Yx/s 0,12 0,06 Viabilidade (%) 97 51 Xf / Xo 2,0 40,0

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TESTE 10 A massa celular aumentou apenas 2,0 vezes, e o fator de converso (Yx/s) obtido foi de 0,12 tambm no pode ser comparado com os ndices considerados ideais e comentados por PRESCOTT & DUNN (1959) e REED & NAGODAWITHANA (1991). Estes autores citam que fatores de converso de substrato em clulas entre 0,63 a 0,54 so possveis. A viabilidade diminuiu de 99% no incio para 97,4% ao fim do processo. O resultado de Yac/s se encontra abaixo do nvel considerado por ANDRIETTA (1999) como muito baixo. Este teste foi o nico feito com o meio de cultivo contendo uria, e o primeiro a ser feito com balanceamento dos componentes, segundo a composio da clula de levedura. Em condies de fermentao com leveduras S. cerevisiae, existe a possibilidade de formao de carbamato de etila a partir da uria e por este motivo, essa composio no foi mais utilizada. Segundo ANDRADE-SOBRINHO et al. (2002) e POLASTRO et al. (2001), a uria uma fonte de nitrognio para as leveduras, que no passado era freqentemente adicionada dorna de fermentao, para produo de etanol, porm atualmente sabe-se que no aconselhvel, pois este composto pode reagir com o etanol produzindo carbamato de etila, o qual considerado potencialmente carcinognico. Passou-se, ento a utilizar outras fontes de nitrognio que pudessem atender aos propsitos do trabalho.

TESTE 11 A massa inicial aumentou 40 vezes, mas o fator de converso Yx/s foi muito baixo (0,06). A viabilidade inicial foi de 97%, caiu para 51% ao final das 12 horas de propagao, o que pode ser atribudo aerao ineficiente, ou falta de algum nutriente na composio do meio. A temperatura de 30 C, que foi mantida durante a propagao, pode ter piorado a solubilidade do oxignio, que sabidamente baixa, principalmente em se tratando de meios de cultivo temperatura descrita (HISS, 2001). O resultado de Yac/s se encontra acima do nvel considerado por ANDRIETTA (1999) como muito alto. A concentrao inicial de clulas foi de 0,015 g/100 mL, que pode ser comparada concentrao inicial de clulas do Teste 09 (0,012 g/100 mL), o que novamente nos sugere a influncia da concentrao inicial do inculo sobre o aumento da massa celular.

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4.4. Testes de propagao conduzidos no Propagador C Os resultados de cada experimento esto apresentados na TABELA 16.

TABELA 16 Resultados dos parmetros fermentativos do Propagador C Teste 12 * 13 * 14 * 15 16 Yp/s 0,005 0,009 0,019 0,167 0,022 Yac/s 0,011 0,021 0,010 0,031 0,020 Yx/s 0,26 0,17 0,22 0,39 0,17 Viabilidade (%) 95 86 98 83 97 Xf / Xo 4,4 2,0 3,5 50,5 75,4

*Testes feitos em triplicata, valores mdios

Como pode ser observado na TABELA 16, o fator de converso de substrato em clulas obtido (Yx/s) foi menor para o Teste 13, no qual se utilizou isolado protico de soja. O ganho de massa calculado em nmero de vezes (massa final / massa inicial) tambm foiinferior aos testes realizados com extrato de levedura (Teste 12) ou extrato de levedura adicionado de sais (Teste 14). JERONIMO (2004) prope que o isolado protico de soja possa ser utilizado em substituio ao extrato de levedura, mas no presente trabalho tal equivalncia entre as duas fontes proticas no foi verificada. tambm importante observar que a massa celular seca inicial, no tempo zero (logo aps a inoculao) foi maior nos testes feitos com isolado protico de soja (Teste 13), o que indica maior insolubilidade deste. Tal observao se torna mais pertinente devido ao fato de que a metodologia de anlise abrange centrifugao, e o volume de centrifugado foi visivelmente diferente. Os resultados finais do Teste 14 mostraram uma maior produo de etanol quando comparados s propagaes anteriores. Os Testes 12, 13 e 14 foram realizados em triplicata e por este motivo, foi feita a anlise de varincia. As mdias foram testadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Os resultados esto mostrados na TABELA 17.

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TABELA 17 - Resultados dos testes de mdias dos parmetros fermentativos Teste 12 13 14 Viabilidade 95,0a 86,2a 98,3a Xf - Xo 17,3a 13,0a 16,2a Xf / Xo 4,4 a 2,0ab 3,5a Yac/s 0,011 b 0,021 a 0,010 b Yx/s 0,267a 0,176b 0,223ab Yp/s 0,005b 0,009ab 0,019a

Obs.: Mdias seguidas pela mesma letra, na mesma coluna no diferem entre si ao nvel de 5% de probabilidade ( teste de Duncan a 5%).

No tratamento com isolado protico de soja (Teste 13), obteve-se maior fator de converso de substrato em acidez, sendo que os outros dois tratamentos (Testes 12 e 14) no diferiram entre si. Os resultados de Yac/s se encontram entre os nveis mdio (0,008 a 0,013) e muito alto (0,0201 a 0,024), na classificao de ANDRIETTA (1999), em fermentao alcolica. Embora fermentao alcolica e propagao sejam dois processos distintos, em ambos os casos no se deseja que o fator de converso de substrato em cido actico seja muito alto, o que implicaria na reduo de outros fatores desejados em fermentao alcolica (neste caso, Yp/s) ou em propagao (fator desejado Yx/s). Entre os trs tratamentos avaliados (Testes 12, 13 e 14), no se observa diferena significativa no parmetro viabilidade celular. Este resultado pode ser atribudo presena de nitrognio protico (como extrato de levedura ou isolado protico) na formulao de todos os meios testados no propagador Modelo C. Segundo JERONIMO (2004), a adio de nitrognio protico influi positivamente na manuteno da viabilidade celular. Os resultados de viabilidade corroboram com os dados desta pesquisadora, que relata ter conseguido manter a viabilidade celular da levedura utilizada em fermentaes utilizando o mesmo isolado protico de soja utilizado no Teste 13. No Teste 12, com adio de extrato de levedura ao meios de cultivo permitiu um maior aumento de massa celular, em nmero de vezes, do que o tratamento com isolado protico de soja (Teste 13), como pode ser observado na TABELA 17. De acordo com STEHLIK-TOMAS et al. (2004), a adio de sais minerais (sulfatos de Zn, Cu e Mn 0,01 g/100 mL) aumentou em 30% o rendimento em biomassa em condies semiaerobias. Na concentrao de sais utilizada no presente trabalho, no conseguiu-se atingir este aumento de massa, discordando tambm de JONES & GREENFIELD (1984).

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O tratamento com extrato de levedura (Teste 12) apresentou fator de converso de substrato em clulas (Yx/s) significativamente maior do que o tratamento com isolado protico de soja (Teste 13). O tratamento com extrato de levedura mais sais (Teste 14) apresentou maior fator de converso de substrato em etanol (Yp/s) do que o tratamento com extrato de levedura (Teste12).

TESTES 15 e 16: No teste 15 a viabilidade inicial era de 97% e caiu para 83% ao final das 12 horas de propagao. Apesar desta queda de 15% da viabilidade, este foi o melhor fator de converso (Yx/s) obtido neste trabalho (0,39). A massa foi aumentada 50,6 vezes em relao massa inicial. No teste 16 houve um aumento de 75 vezes a massa inicial. A viabilidade celular inicial era de 98%, caiu para 97,3% ao final das 24 horas de propagao em batelada alimentada. O fator de converso de substrato em clulas (0,17) foi mais baixo que o encontrado no Teste 15 (0,39), mas ficou prximo dos valores encontrados nos Testes 12, 13 e 14 (0,26; 0,17; 0,22, respectivamente). No Teste 16 a batelada alimentada por 24 horas no interferiu na melhora deste fator, uma vez que o Teste 15 foi alimentado por 12 horas. Os resultados de Yac/s nestes dois testes se encontram acima do nvel muito alto (0,0201 a 0,024), na classificao proposta por ANDRIETTA (1999), em fermentao alcolica. No foram encontrados dados de Yac/s para propagao de S. cerevisiae para comparao com o presente trabalho. Os resultados de aumento de massa encontrados nos Testes 09, 11, 15, e 16 nos sugerem que o aumento de massa celular final est diretamente relacionado com a baixa concentrao do inculo. Estes dados so confirmados pelos resultados encontrados por ALVES et al. (2005), que conseguiu aumentos de 30 a 80 vezes na massa celular, partindo de inculo de 0,012g massa seca/100 mL meio de cultivo. A influncia da quantidade de inculo sobre a fermentao alcolica com leveduras foi reportada por NAGODAWITHANA & STEINKRAUS (1976) citado por FERREIRA (2002) e no trabalho de STREHAIANO et al. (1983). Estes autores citam que, embora o rendimento em etanol permanecesse constante, a velocidade especfica de crescimento e o rendimento em biomassa diminuam com o aumento da concentrao do inculo inicial, dado que coincide com os resultados deste trabalho. STREHAIANO et al. (1983) conduziram um trabalho com quatro diferentes concentraes de inculo (2, 10, 20 e 60% v/v), e

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constataram que o rendimento em biomassa e a taxa especfica de crescimento decresceram continuamente enquanto a concentrao de inculo era aumentada.

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5. CONCLUSES

Nas condies avaliadas, o sulfato de amnio como fonte de nitrognio no foi capaz de manter a viabilidade das clulas durante o processo de propagao. Da mesma forma, a adio de fosfato dicido de potssio e sulfato de magnsio nos meios testados apenas com nitrognio amoniacal (sulfato de amnio) tambm no foram suficientes para manter a viabilidade celular e promover o crescimento.

A viabilidade celular no sofreu interferncia da presena dos micronutrientes (sais de Cu, Zn, Fe, Mn) nas condies avaliadas (Teste 14), no meio com extrato de levedura (Teste 12) e no meio com isolado protico de soja (Teste 13). Tambm no interferiu na viabilidade das clulas.

Os melhores fatores de converso de substrato em clulas foram obtidos nos testes 12, 14, 15 e 16, nos quais se adicionou extrato de levedura na concentrao de 0,9 g/100 mL, em comparao com a outra fonte protica testada (isolado protico de soja), na mesma concentrao de nitrognio.

A concentrao inicial de clulas do inculo foi um como fator determinante no aumento de massa celular. Nos Testes 9, 11, 15 e 16, onde a concentrao inicial de inculo foi de no mximo 0,016 g/100 mL, o aumento de massa celular foi de 55; 40; 50,5 e 75,4 vezes; respectivamente.

O fator de converso de substrato em clulas (Yx/s) descrito na literatura, de aproximadamente 0,5, no foi atingido em nenhum dos testes feitos neste trabalho. Este fato sugere que as condies trabalhadas ainda no sejam as ideais. Este fator vem sendo reportado por vrios autores, que de uma maneira geral utilizam reatores que operam de forma inteiramente controlada, inclusive com leituras instantneas das concentraes de etanol, clulas, substrato e taxa respiratria.

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6. PERSPECTIVAS

Protocolo de propagao: Levando-se em considerao os resultados obtidos neste trabalho, pode-se propor um protocolo de propagao de leveduras para produo de cachaa. Equipamento: o Propagador C utilizado neste trabalho foi facilmente

opervel, e seu modelo pode ser adaptado para outro equipamento de maior capacidade (volume); Aerao: aspersor em forma de chuveiro, ou de vela sinterizada. A aerao

deve estar ligada de forma contnua (ar pressurizado) durante todo o tempo de propagao, de forma a aerar, movimentar o mosto, sem causar turbulncia excessiva; Temperatura de operao: deve ser mantida entre 20 a 23 C, por isso o

propagador em maior escala dever possuir dispositivos de resfriamento externo (tanque camisado); Composio do mosto:

Mosto composto por caldo de cana-de-acar, com seu teor de sacarose diludo entre 10 a 20 g/L (ou 1 a 2% p/v). A suplementao do caldo deve ser feita com extrato de levedura de uso industrial alimentcio 9 g/L; (NH4)2SO4 2 g/L; KH2PO4 1,2 g/L e MgSO4.7H2O 0,5 g/L. O mosto deve ser esterilizado em autoclave por 20 minutos a 121 C, ou submetido tratamento equivalente. Depois de resfriado at 25-28 C, o mosto ou meio de cultivo deve ser inoculado, e aerado de forma contnua.; Tipo de Inculo: fermento mido prensado, de panificao, de

aproximadamente 30% de massa seca, composto por leveduras S.cerevisiae. A concentrao inicial de inculo deve ficar na faixa de 0,12 g/L a 0,16 g/L; Metodologia de propagao: Aps as primeiras duas horas de propagao,

devem ser feitas adies sucessivas de caldo de cana-de-acar, sem diluio, a intervalos de aproximadamente 2 horas, em volumes crescentes. A propagao deve durar 12 horas, desta forma, neste intervalo possvel fazer de cinco a seis adies de caldo. Aps a ltima adio deve-se aguardar mais duas horas, para que as leveduras consumam propagao; Clculo da quantidade de caldo a ser adicionado: o caldo de cana-de-acar a sacarose adicionada, antes de encerrar a

adicionado nestes intervalos deve teor de ART mais elevado que o mosto inicial

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(em torno de 10 a 25 g/ L), o que pode ser verificado com o uso de um sacarmetro. O volume de caldo a ser adicionado deve ser calculado por balano de massa, de acordo com o volume de meio contido no propagador e o acar residual. O balano de massa pode ser feito de acordo com a metodologia exposta na pgina 37, item. 3.4.

Dentro das perspectivas de continuao dos estudos de propagao e ainda da adaptao deste protocolo para uso em maior escala, sugere-se: meio; Usar uma bomba peristltica para as adies intermedirias do meio de Deve ser adaptado um rotmetro na linha de ar para melhor controle da

vazo de ar, de forma que a aerao fique padronizada e constante; Deve-se tambm acompanhar a concentrao de oxignio dissolvido no

cultivo, de forma que o propagador seja vagarosa e continuamente alimentado durante todo o tempo da propagao.

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7.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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