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IMPORT NCIAAGRCOLA
Editores:
RICARDO S. ARAUJO
MARIANGELA HUNGRIA
.PlCIHS
1",1",1",1",1",1,,,111,1,,,1,,,1,,,1 ,,,1,,,1
EMBRAPA
MICRORGANISMOS DE
IMPORTNCIA AGRCOLA
Editores: Ricardo S. Araujo
Mariangela Hungria
EMBRAPA-SPI
Braslia, DF
1994
FIGURAS DA CAPA
esquerda: esporocarpo de Amanita sp. (Basidiomycotina).
No centro: soja no-inoculada ( frente) e inoculada (fundo), em rea de primeiro ano de cultivo nos
Cerrados.
direita: corte de ndulos ativos de soja mostrando cor vermelha devida leghemoglobina.
Comit de Publicaes
Pedro A. Arraes Pereira (CNPAF/Presidente)
Carlos Caio Machado (CNPSo/Presidente)
Editorao e Programao Visual
Danilo Estevo (CNPSo/Desenhos)
Hlvio B. Zemuner (CNPSoIFotografias)
Lauro Pereira da Mota (CNPAF/Fotografias)
Lgia M. de O. Chueire (CNPSo/Reviso)
Reinaldo Paulino da Silva (CNPAF/Desenhos)
Sebastio Pereira de Arajo (CNPAF/Desenhos)
Sinbio de Sena Ferreira (CNPAF/Digitao)
Normatizao Bibliogrfica
Ademir Benedito A. de Lima (CNPSo/Coordenao)
Ana Lcia D. de Faria (CNPAF/Catalogao na fonte)
Tiragem: 1000 exemplares.
CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao.
Microrganismos de importncia agrcola / editores Ricardo S. Arajo.
Mariangela Hungria; Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria,
Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo: Centro Nacional de
Pesquisa de Soja. - Braslia: EMBRAPA-SPI, 1994.
236p. - (EMBRAPA-CNPAf. Documentos. 44)
ISSN 0101-9716
Contedo: Introduo / Ricardo S. Arajo. Mariangela Hungria fixao biolgca do nitrognio em soja / Mariangela Hungria... [et aI.]
- Fixao biolgica do nitrognio em feijo / Ricardo S. Arajo Fixao biolgica do nitrognio em espcies arbreas / Fatima M.S.
Moreira - Micorrizas arbusculares / Jos Oswaldo Siqueira - A
biomassa microbiana do solo e sua importncia nos ecossistemas
terrestres / David A. Wardle. Mariangela Hungria - Biodegradao de
xenobiontes : potencialidades e limites / Tomaz Langenbach.
I. Microbiologia. 2. Solo - Microrganismo. I. Arajo, Ricardo S.
11. Hungria. Mariangela. 1/1. EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa
de Arroz e feijo (Goinia. GO). IV. EMBRAPA. Centro Nacional de
Pesquisa de Soja (Londrina. PR). V. Srie.
CDD 631.46
EMBRAPA 1994
APRESENTAO
Apesar do grande avano cientfico na rea de microbiologia do solo, poucos desses conhecimentos tm sido aplicados na tomada de decises em relao s prticas agronmicas que visam o
aumento da produtividade das culturas. Entretanto, a atividade biolgica oriunda da grande massa de
seres microscpicos que habitam o solo participa de vrios eventos que o transformam em um ambiente propcio ao crescimento das plantas.
Este livro traz os conhecimentos mais recentes sobre a atividade dos microrganismos do solo
de importncia agrcola. Os resultados nele apresentados e discutidos so frutos de muitos anos de
pesquisa por dedicados cientistas e representam o estado-da-arte dos conhecimentos na rea, qualificando este livro como bibliografia complementar de suma importncia para estudantes de Agronomia,
Biologia e Cincias afins. Sua publicao representa um esforo da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuria (EMBRAPA) no sentido de divulgar o trabalho de seus especialistas e difundir tecnologias
desenvolvidas para melhorar a agricultura brasileira.
Homero Aidar
Chefe do CNPAF
sUMRIO
1. INTRODUO ..................................................................................................................
Ricardo S. Araujo & Mariangela Hungria
91
6. A BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO E SUA IMPORTNCIA NOS ECOSSISTEMAS TERRESTRES. ............................ ....................................... ........... .................. ..... ..... 195
David A. Wardle & Mariangela Hungria
CAPTULO 1
INTRODUO
Ricardo S. Arauj o l
Mariangela Hungria2
A frao biolgica um dos principais componentes do solo. Essa frao composta por
comunidades de pequenos animais (mesofauna) e microrganismos (microfauna e microflora). Muitas
das propriedades dos solos so decorrentes da atividade biolgica, sendo comum dizer-se que um solo
sem atividade biolgica um solo sem vida. As relaes e interaes entre as diferentes comunidades
de organismos do solo contribuem para a manuteno da vida do solo, e para diversos outros processos que, por sua vez, esto intimamente ligados cadeia trfica.
Os componentes mais numerosos da frao biolgica do solo so, sem dvida, os microrganismos, representados por integrantes da microfauna (protozorios) e da microflora (fungos, bactrias,
algas e vrus). Esses organismos participam ativamente da decomposio de resduos orgnicos, dos
ciclos de reciclagem do nitrognio, do fsforo e do enxofre e da decomposio de poluentes. Muitos
desses componentes, portanto, desempenham um papel vital na construo do solo como suporte
fsico para as culturas agrcolas.
A pesquisa nas ltimas dcadas rendeu muitos resultados que contriburam para um melhor
conhecimento das propriedades dos organismos do solo e aproveitamento dos processos biolgicos
que influenciam na produtividade agrcola. Como exemplos, temos os conhecimentos adquiridos
sobre a capacidade de certos microrganismos de modificar ou destruir poluentes e defensivos agrcolas, a habilidade da microflora de produzir substncias txicas s culturas agrcolas e aos animais, a
utilizao da inoculao de leguminosas em larga escala, a micorrizao de mudas de caf e rvores
frutferas para o transplante, a utilizao de associaes entre plantas e microrganismos do solo na
recuperao de reas degradadas pela minerao, remoo da cobertura vegetal e construo civil.
O advento das tcnicas de biologia molecular permitiu o emprego de rigorosas anlises genticas nos estudos da composio e das propriedades das comunidades de microrganismos do solo. Com
isso, foi possvel, por exemplo, estudarem-se aspectos muito ntimos da relao entre as leguminosas
e seus simbiontes fixadores de nitrognio, da interao entre patgenos do solo e seus hospedeiros e
at da manipulao gentica de microrganismos para que atuem de acordo com o interesse do homem,
quer seja como simbiontes de plantas, agentes de controle biolgico de pragas e doenas, ou como
condicionadores dos solos para o cultivo agrcola.
Este livro relata os avanos obtidos com a pesquisa sobre microrganismos do solo de importncia agrcola. Ele est dividido em captulos, de acordo com os assun.t;().s ,a~nlad9Sj, ,contemplando
aspectos relevantes da microbiologia dos solos agrcolas. Apesar de-_uo ser uma -reyiso exaustiva
sobre cada assunto, so apresentados os conhecimentos mais relevantes e recentes';elll cada rea, e
discutidas suas implicaes para a produtividade agrcola e para a manuteno da vida do solo.
I
Pesquisador, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo (CNPAF), Caixa Postal 179, CEP 74001-970, Goinia, GO.
Pesquisadora, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo), Caixa Postal 1061, CEP 86001-970, Londrina, PRo
CAPTULO 2
10
Bactrias da famlia Rhizobiaceae fonnam estruturas altamente especficas, os ndulos, onde ocorre a
converso do N 2 atmosfrico a amnia, que ento incorporada em diversas formas:de N orgnico'
para a utilizao por algumas plantas da famlia Leguminosae, como a soja. Essas bactrias conseguem quebrar a tripla ligao pela ao de um complexo enzimtico, denominado dinitrogenase e o
processo denominado de fixao biolgica do N 2 .
Para que o N proveniente da fixao biolgica possa suprir todas as necessidades da planta,
porm, o processo precisa ser eficiente, o que resulta, principalmente, da escolha adequada dos parceiros simbiticos, ou seja, estirpes de bactrias mais eficientes e competitivas e gentipos de plantas que
respondam ao microssimbionte. Embora exista controvrsia, conforme ser discutido ainda neste captulo, os gastos energticos relacionados fixao biolgica do N 2 parecem ser mais elevados do que
os gastos para a assimilao do N dos fertilizantes, alm do gasto inicial com a formao e manuteno dos ndulos. Por isso, caso essa simbiose no seja eficiente, a associao pode se tornar parastica.
A fixao biolgica do N 2 um passo crucial no ciclo do N. Em reas no perturbadas, com
vegetao clmax, esse processo biolgico no limitante. Tambm em reas ridas, frias ou fracamente ensolaradas, a gua, temperatura ou luz limitam a produtividade biolgica. Mas, em reas perturbadas e ainda frteis, a introduo do N atravs da fixao biolgica, geralmente, limita a produtividade. Esses locais incluem as reas agrcolas, reas onde as florestas clmax foram perturbadas e
replantadas e aquelas perturbadas por desastres naturais, como o fogo (Postgate & RiU, 1979).
No caso da soja, muitos estudos foram conduzidos no Brasil desde a introduo dessa cultura,
tornando a simbiose muito eficiente e resultando em uma grande economia para o pas, pela no
utilizao de fertilizantes nitrogenados. Para alcanar produtividades de 2500 kg.ha-t, a soja absorve
cerca de 200 kg de N.ha- 1, dos quais 67% a 75% so alocados para as sementes. Devido baixa
eficincia de utilizao dos fertilizantes nitrogenados, normalmente inferior a 50%, pois h perdas por
lixiviao, nitrificao e desnitrificao, seriam necessrios 300 a 400 kg de N.ha- 1 para se obter essa
produtividade, portanto um custo certamente proibitivo para os agricultores. Utilizando dados do setor de economia do Centro Nacional de Pesquisa de Soja (CNPSo), da EMBRAPA, com uma estimativa de rea colhida de 1l.350.000 ha, na safra de 1993/94, uma produtividade mdia de 2156 kg.ha1 e considerando que a recomendao atual para essa cultura de utilizao de inoculao sem a
suplementao de qualquer fonte de fertilizante nitrogenado, calcula-se que o pas economize, hoje,
cerca de 1 bilho de dlares, por safra, pela inoculao da soja (Tabela 2.1). Alm disso, as vantagens
ecolgicas da fixao de N 2 incluem a economia de petrleo e gs natural, que so fontes energticas
no renovveis, e a menor poluio dos rios e lagos, causada pela lixiviao dos fertilizantes. As
principais vantagens e desvantagens da utilizao de fertilizantes nitrogenados e do processo de fixao biolgica do N 2 esto listadas na Tabela 2.2.
Finalmente, no poderia deixar de ser mencionada a importncia da cultura da soja no que se
refere ao valor protico para a populao, particularmente nos pases com carncias nutricionais, como
o Brasil. Um hectare de soja produzindo 2156 kg de gros com um teor protico de 40% tem-se um
acmulo de 862 kg de protena. Considerando que o consumo dirio de protenas recomendado pela
FAO de 53 g.pessoa-\ constata-se que a protena produzida seria capaz de suprir as necessidades
proticas de um adulto por 16.264 dias e que a produo nacional pode fornecer, para cada um dos 150
milhes de brasileiros, 179 g de protena.dia- 1.
II
Tabela 2.1. Comparao econmica entre a fixao biolgica do N 2 em soja e a adubao mineral.
Forma de Fornecimento
doN
Inoculante (2 doses.ha- 1)
Uria (290 kg.ha- 1) **
Uria (435 kg.ha- 1)
Custo (U$)
por ha
no pas*
(106)
1
60
90
11
681
1.021
porha
no pas
(10 6)
59
89
670
1.010
12
Tabela 2.2. Principais vantagens e desvantagens da utilizao de fertilizantes nitrogenados e do processo de fixao biolgica do N 2 .
Vantagens
Desvantagens
FERTILIZANTES
FIXAO BIOLGICA DO N 2
1- menor custo para o agricultor
2- diminuio dos problemas ambientais
3- manuteno da fertilidade do solo
A soja utilizada agronomicamente j foi denominada como Glycine soja e Soja max, mas
desde 1948 conhecida botanicamente por Glycine max (L.) Merrill. O tipo selvagem de soja, considerado o parental da soja cultivada hoje, j foi denominado de G. ussuriensis RegeI and Maack., mas
a designao como G. soja Sieb and Zucc. aceita desde 1970 (Verdcourt, 1970). O local de origem
de G. soja inclui o Vale do Rio Yangtze, as provncias do norte e nordeste da China, reas adjacentes
da Federao Russa, Coria e Japo. Informaes botnicas sobre a soja foram recentemente compiladas por Gazzoni (1994), e devem ser procuradas para maiores detalhes.
13
Tabela 2.3. Lista das estirpes de crescimento lento (Bradyrhizobium) e rpido (Rhizobium ou Sinorhizobium) que nodulam a soja
segundo nomenclatura utilizada por Jordan (1982), Scholla & Elkan (1984), Chen et aI. (1988) e Kuykendall et aI.
(1992).
Estirpe
Outras
Espcie
(Jordan, 1982)
Espcie
(Kuykendall et
aI., 1992)
Chemovar
(Scholla & Elkan, 1984)
Espcie
(Chen et aI., 1988)
.j>.
ATCC 10324
ATCC 49852
ATCC 35423
USDA201
CCBAU 110
USDA6
USDA 76
USDA205
RX42
B. japonicum*
B. elkanii *
R. fredii chemovar fredii*
R. fredU chemovar siensis*
S.jredii*
S.fredU
S. xinjiangensis*
15
grobocterlum tumefociens
Rhizobium loti
.R.: 9 0l egoe
~::--r--- R. meliloti, R. fredii
& tropici
!!guminosorum
Brod~rhizobium
Brod~rh izobium
joponicum (Tipo I a)
sp. (L)
(Tipo I )
~.
Rhodop-seudomonos p-olustris
Figura 2.1. rvore taxonmica mostrando as relaes provveis entre as espcies de rizbio. Segundo Young et a!. (1991, 1993) e Young
(1992).
2.3.2. Estirpes de crescimento rpido
Espcie: Rhizobiumfredii (Buchanan 1980) SchoIla & Elkan, 1984
Em 1982 foram isoladas algumas estirpes de crescimento rpido de solos e ndulos de soja
coletados na China (Keyser et a!., 1982). Essas estirpes foram classificadas coino Rhizobi1ll11 fi'edii
(Scholla & Elkan, 1984) e, posteriormente, foi proposto um novo gnero para as mesmas, Sillorhizobiul11
gen. nov., com duas espcies, S. fredii e S. xir?jiangensis (Chen et a!., 1988). Atravs de estudos de
seqenciamento por PCR (polymerase chain reaction) de um segmento de 260 pares de bases, correspondente s posies 44 a 337 da seqncia 16S rRNA de Escherichia coli Jarvis et aI. (1992) concluram, porm, que as estirpes de crescimento rpido deveriam continuar a ser classificadas como R.
fredii. Na Figura 2.1 pode-se observar um fenograma simplificado das estirpes que nodulam a soja e
na Tabela 2.3 esto listadas as estirpes-padro.
Aqui, convm definir alguns termos, muito usados neste captulo e no captulo seguinte:
infectiva, efetiva e eficiente. Bactrias infectivas (infective) so aquelas capazes de infectar as razes
e formar ndulos; o termo efetiva, eficaz (effective) foi proposto para avaliar a simbiose como um
todo, enquanto que eficiente (efficient) seria utilizado para indicar a quantidade de N z fixado por
unidade de tecido nodular (Dobereiner et aI., 1970). Os primeiros relatos indicavam que as estirpes de
crescimento rpido s conseguiam nodular Glycine soja e Glycine max cultivar Peking, cultivares
primitivas de soja, sendo ineficazes em linhagens comerciais (Keyser et aI., 1982). Mas, desde o
isolamento dessas bactrias, alguns estudos vm sendo conduzidos procurando estudar a compatibi-
16
lidade com os gentipos de soja norte-americanos (Devine, 1984, 1985a, 1991; Balatti & Pueppke,
1992) e brasileiros (Chueire & Hungria, 1994), tendo-se comprovado que diversas cultivares comerciais de soja so capazes de nodular com R. fredU, conforme ser discutido adiante.
Do mesmo modo que para as estirpes de crescimento lento, Jordan (1984) classifica essa espcie no reino Procaryotae e na famlia Rhizobiaceae. Nos estudos de evoluo molecular, porm, R.
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inclui diversos outros genes que esto envolvidos com a caracterizao da superficie das bactrias e
alterao da nodulao, tais como os genes exo (exopolysaccharides), lps (li12opoly~accharides) e ndv
(I;2-B-glucans, nodule .deyelopment).
Diversos eventos pr-infeco precedem -a formao do ndulo. Podem ser includos a, o
estmulo ao rizbio, ativao dos genes da nodulao, adeso da bactria a. determinados stios na
superficie das razes e troca de sinais moleculares entre o hospedeiro e o microssimbionte, levando a
-alteraes fenotpicas nas razes.
Inicialmente, diversos compostos so exsudados pela planta hospedeira, como aminocidos,
acares, cidos carboxlicos, homoserina e fIavonides, que agem como substncias quimiotticas,
atraindo o rizbio (Gaworzewska & Carlile, 1982; Agtiilaret aI., 1988; Kape et aI., 1991; Dharmatilake
& Bauer, 1992). A quimiotaxia pode auxiliar o processo da nodulao, embora no parea ser um
passo essencial, uma vez que mutantes imveis de R. meliloti ainda foram capazes de formar ndulos
(Ames & Bergman, -1981; Mellor & Glenn, 1987).
Outras substncias, exsudadas, principalmente pelas razes laterais, estimulam a multiplicao
das bactrias na rizosfera. Um exemplo de estmulo especfico o da homoserina produzida por ervilha, que estimula R. leguminosarum bv. viceae (van Egeraat, 1975 a,b; Kijne, 1992). Como resultado
desse estmulo, tem-se que, na rizosfera, normalmente ocorre um aumento na populao de rizbio da
ordem de cem vezes (Dowling & Broughton, ] 986). Mas o rizbio tambm precisa competir pelos
exsudatos das razes com outros microrganismos do solo, incluindo estirpes ineficientes mas adaptadas, outras bactrias, fungos, actinomicetos e protozorios, que tambm podem apresentar ao antagnica pela produo de substncias antibiticas (Holland, ] 970). Essa competio pode prejudicar a
co!onizao das razes e a nodulao.
Se _a' quimiotaxia e o estabelecimento do rizbio forem bem sucedidos, as bactrias ento
aderem supemcie dos plos radiculares_ Considera-se que a adeso do rizbio ocorre em dois passos: primeiro, clulas isoladas aderem superficie radicular, normlmente a stios especficos
(Bhuvaneswari et aI., ] 980; Gulash et aI., 1984) e, posteriormente, outras clulas aderem s bactrias
que j esto presas aos plos radiculares (Smit et aI., 1989). H indicaes de que algumas molculas
parecem estar envolvidas no processo de adeso e, recentemente, foi relatado que uma protena da
supemcie da bactria, a ricadesina, comum s diversas espcies de rizbio, estaria envolvida com a
ligao aos plos radiculares (Smit et aI., 1989). Fibrilas de celulose, de origem bacteriana, tambm
participam do processo de adeso do rizbio aos plos radiculares (Smit et aI., 1986, 1987), embora
no sejam essenciais nodulao. Nesse processo de adeso, que envolve tambm alguma
especificidade, h algumas evidncias de que o reconhecimento do rizbio envolve lecitinas da planta
hospedeira e a hiptese de que elas interagem com os radicais de acar dos polissacardeos da
supemcie celular do rizbio (Bohlool & Schmidt, 1974; Dazzo & Gardiol, 1984; Halverson & Stacey,
1985; Kijne et aI., 1988). Existem relatos, tambm, de que outros fatores, como a idade da cultura, prtratamento das clulas e composio do meio afetam a adeso das bactrias (Smit et aI., 1986; Smith
& Wollum 11, 199]). H indicaes, ainda, de que interaes fisico-qumicas entre as supemcies do
plo radicular e do rizbio tambm podem intermediar o processo de adeso (Morris et aI., 1989).
Proporcionalmente, porm, poucas bactrias aderem aos plos radiculares da leguminosa hospedeira,
variando de 0,4% a 15% da populao bacteriana total (Pueppke, 1984; Vesper & Bauer, 1985).
18
Provavelmente, em um processo simultneo com a adeso das bactrias, tem incio uma troca
de sinais moleculares entre o microssimbionte e a planta hospedeira, ativando genes dos dois parceiros. Em uma primeira etapa, a planta hospedeira libera sinais que so responsveis pela induo da
transcrio de genes do rizbio essenciais nodulao, nod e n%~~ O primeiro indutor de plantas
estudado foi isolado de extratos de sementes de alfafa e identificado como a flavona luteolina (5,7,3',4'tetra-hidroxi-flavona) (peters et aI., 1986). Aps a identificao .da luteolina, os fatores de ativao
presentes nas sementes e razes de diversas outras leguminosas hospedeiras comearam a ser investigados e foram tambm identificados como flavonides. A Figura 2.2 mostra que, no caso da soja, os
principais indutores dos genes nod de B. japonicum e R. fredU, presentes em extratos de sementes e de
plntulas, foram inicialmente identificados como os isoflavonides daidzena (7,4'-di-hidroxiisoflavona) e genistena (4,5,7-tri-hidroxi-isoflavona) (Kosslak et aI., 1987). Posteriormente, foi relatado que a isoliquiritigeninina (4,2',4'-tri-hidroxi-chalcona) tambm um indutor presente em exsudatos
de razes de soja (Kape et aI., 1992) e que os isoflavonides liberados pela soja so liberados na forma
glicosilada (Barbour et aI., 1992). Os isoflavonides, at ento, eram conhecidos apenas por seu papel
como ftoalexinas, ou seja, substncias utilizadas pelas plantas na defesa contra patgenos e, geralmente, sintetizadas em resposta infeco (Dixon et aI., 1983; Lawton & Lamb, 1987; Dixon &
Lamb, 1990). O papel desses isoflavonides como indutores dos genes nod de B. japonicum refora a
hiptese de Vance (1983), de que o processo de infeco das leguminosas por rizbio apresenta muitas semelhanas com a infeco por microrganismos patognicos.
Na segunda etapa de troca de sinais moleculares, as bactrias, atravs dos genes da nodulao,
produzem sinais especficos para o hospedeiro, induzindo as modificaes radiculares que ocorrem no
estdio de pr-infeco, como: a deformao dos. plos radiculares (Had, hair deformation); o
encurvamento dos plos (Hac, hair furling), podendo ser um encurvamento moderado, de 90 a 360,
ou acentuado, com 360 ou mais); a formao de razes curtas e grossas (Tsr,Jhick and hort [oot); e
o aumento no nmero de plos radiculares (Hai, hair increase) (Canter Cremers et aI., 1986; van
Brussel et aI., 1986; Zaat et aI., 1987a,b; Faucher et aI., 1988). Alguns desses fentipos, em razes de
soja, podem ser vistos na Figura 2.3. Esses sinais moleculares tambm so capazes de induzir
diviso das clulas no crtex das razes (Coi, cortical cell division induction), induo do meristema
do ndulo (Noi, nodule induction), formando ndulos contendo meristemas apicais, feixes vasculares
perifricos e endoderme, mesmo na ausncia do rizbio (Truchet et aI., 1991). O primeiro sinal estudado foi o produzido por R. meliloti e identificado como um lipo-oligossacardeo sulfatado, com a
estrutura de um /3-1,4-tetra-sacardeo de D-glucosamina, contendo trs grupos amino acetilados e um
acilado com um cido graxo bis-no-saturado (Lerouge et aI., 1990). Posteriormente, vrios sinais,
I
produzidos por outras espcies de rizbio, foram identificados e, no caso de B. japonicum, algumas
estruturas produzidas por trs estirpes esto representadas na Figura 2.2. Na soja, j foi relatado que
esses fatores Nod so capazes de induzir diviso celular do crtex (Sanjuan et aI., 1993) e produo
de novos flavonides (Ini, increased nod-inducing activity) (Cho & Harper, 1991). Mais detalhes
sobre essa sinalizao molecular podem ser obtidos em uma reviso recente realizada por Hungria
(1994).
Induto,res
da Bactria
Indutores
da
Soja
R5
I
CH20
Flavonides
O~
HO
OR 4
OH
Daidzeina
NHAc
Fatores Nod
'OH
\O
OH
Genisteina
OH
RI
R2
C18:1
2-0-Me-Fuc
-5
C18:1
Ac
2-0-Me-Fuc
C16:0
C16:0
C16:1
H
Ac
H
2-0-Me-Fuc
2-0-Me -Fuc
2-0-Me -fuc
CI8:I,Me
Ac
2- O-Me -fuc
R5
R4
Malla
E.tirpe
14115
110 (I)
15!5 (I)
14!58
15!5
151
H
H
H
3
5
5
1580
1452
1588
15!5
15!5
155
1472
61
Figura 2.2. Sinalizao molecular que ocorre entre a soja e Bradyrhizobium japonicum. Os metablitos foram
sintetizados pelas estirpes USDA 110, USDA 135 e USDA 61. Segundo Barbour et aI. (1992) e
SanJuan et aI. (1993).
20
Figura 2.3. Fentipos de razes de soja, cultivar BR-16, provocados peta inoculao com a estirpe
SEMIA 586 de lJ. japonicllm. esquerda, plantas no inoculadas e, direita. tratamento
inoculado. Avaliaes realizadas 15 dias aps a inoculao das plntulas. Aumento de
20 vezes. Segundo Nishi & Hungria (1993).
No estdio seguinte ocorre a dissoluo das paredes celulares, permitindo a entrada das bactrias nas razes. Um cordo de .infeco desenvolvido e cresce da extremidade do plo radicular
encurvado em direo ao crtex, conduzindo o rizbio para as clulas interiores. Com a diviso das
clulas do crtex e a induo de um meristema nodular, forma-se o primrdio do ndulo. Os cordes
de infeco penetram nas clulas individuais desses primrdios, em cujo citoplasma as bactrias so
liberadas (Sprent, 1984; Sobral et aI., 1991) e, ento, envolvidas em uma membrana de origem vegetal, chamada " membrana peribacteroidal", cuja formao envolve vrios sinais produzidos pelo rizbio
(Verma et aI. , 1993). Os primrdios diferenciam-se em um ndulo e a bactria sorre um processo de
diferenciao, transformando-se em bacteride. O processo de diferenciao do bacteride no totalmente conhecido, mas h indicaes de que alguns fatores relacionado s com ele seriam a
fosforilao protica, a concentrao do on potssio e a baixa concentrao de 02 (Gober & Kashket,
1987, 1989; Karr & Emerich, 1989). Em seguida, inicia-se a expresso dos genes lIifefix (nitrogen
fixation e fixation) . Genes l1if so os responsveis pela sntese e funcionamento do complexo da
dinitrogenase e apresentam homologia com os genes de bactrias associativas, como K. pnelll11olliae,
e genesfix so os necessrios fixao mas que no so. estruturalmente, equivalentes aos genes de K.
pneumolliae. Desenvolvem-se. ento, as enzimas relacionadas com a quebra da tripla ligao do N 2 e
com a assimilao do nitrognio fixado. J foram identificadas cerca de 40 protenas que so sintetizadas durante o desenvolvimento dou funcionamento dos ndulos. as chamadas nodulinas (nodulinas
precoces e tardias) e a expresso gentica dessas protenas vem sendo caracterizada.
21
Alm desses estudos citados, existem linhas de evidncia de que outros fatores, como
lipopolissacardeos, que esto presentes na superfcie das bactrias, podem estar envolvidos nos primeiros estdios de reconhecimento da simbiose (Carlson et aI., 1987; Priefer, 1989). Para maiores
detalhes sobre o processo de infeco, consultar revises recentes de Brewin (1991); Sobral et aI.
(1991); Franssen et aI. (1992); Kijne (1992); Venna (1992). As principais etapas da nodulao esto
resumidas na Tabela 2.4.
Tabela 2.4. Estdios para a formao dos ndulos e fentipos causados nas razes.
12345-
6789-
101112-
Quimiotaxia
Multiplicao do rizbio na rizosfera, colonizao (Roc, root folonization)
Adeso do rizbio s razes da planta hospedeira (Roa, root ttachment)
Troca de sinais moleculares entre a planta hospedeira e as bactrias
Alteraes nos fentipos radiculares, com a fonnao de razes curtas e grossas (Tsr, lhick and
hort [oot), encurvamento dos plos radiculares (Hac, hair furling), plos radiculares deformados
(Had, hair 4eformation), aumento no nmero de plos radiculares (Hai, hair increase)
Penetrao da bactria
Crescimento do cordo de infeco (Inf, infection)
Incio de formao e desenVolvimento dos ndulos (Noi, nodule initiation)
Liberao das bactrias (Bar, bacterial [elease)
Diferenciao dos bacterides (Bad, bacteroid 4ifferentiation)
Desenvolvimento da nitrogenase, leghemoglobina e enzimas relacionada" com a fixao do N 2
(Nif, nitrogen ftxation e Fix, fixation)
Manuteno do tecido bacteroidal, funo e persistncia do ndulo (Nop, nodule 12ersistence)
22
Em seguida, a protena reduzida. se liga dinitrogenase propriamente dita ou componente lI, com a
transferncia dos eltrons e a hidrlise concomitante do ATP a ADP. Finalmente, os dois componentes da dinitrogenase se dissociam. Os eltrons so transferidos um a um e, como todo o processo
requer oito eltrons, acredita-se que se formem vrios componentes intermedirios durante a reao.
complexo enzimtico da dinitrogenase muito sensvel ao 02' podendo ser irreversivelmente
inativado pela exposio aos nveis atmosfricos desse gs. As causas para essa sensibilidade ainda
so discutidas, mas podem ter originado durante a evoluo da enzima, quando o teor de 02 na atmosfera era baixo. No caso de microrganismos aerbicos, como Bradyrhizobium e Rhizobium, cria-se o
paradoxo da necessidade de 02 para gerar ATP e redutores para a dinitrogenase, mas ao mesmo tempo
manter uma p02 suficientemente baixa para no inativar a enzima. Devem existir, portanto, mecanismos de proteo dinitrogenase. Nos ndulos, um dos mecanismos uma barreira difuso do 02
formada pelas clulas do crtex perto da superficie externa dos ndulos (Witty & Minchin, 1990),
conforme pode ser visto na Figura 2.4. Em ndulos de soja, por exemplo, um minieletrodo de 02
inserido no ndulo a uma profundidade de 0,5 mm conseguiu deteQtar uma queda drstica na presso
parcial de 02 (Tjepkema & Yocum, 1974). H, ainda, evidncias de que diversas condies de estresse,
como suprimento de seiva do floema, exposio a nitrato e acetileno, temperatura e gua, resultam no
aumento da resistncia dos ndulos difuso de 02' podendo limitar a atividade da dinitrogenase.
segundo componente de proteo contra o 02 nos ndulos a leghemoglobina, uma molcula que se
prende ao 02 e serve para fornecer a quantidade adequada de 02 para a respirao mas, ao mesmo
tempo, manter a p02 baixa para a atividade da dinitrogenase (Layzell et a1., 1993).
Algumas estirpes possuem uma segunda enzima, a hidrogenase, capaz de oxidar o H 2 evoludo, recuperando parte da energia perdida (Evans et al., 1987). A representao para a atividade dessa
enzima seria, ento:
H 2 +X
-+ H2X,
ER=
23
Experimentalmente, essa eficincia pode ser calculada conforme a frmula abaixo, que se
baseia no princpio de que, na presena do acetileno (C 2H2), todos os eltrons so alocados para a
reduo desse gs.
ER= 1-
H 2 evoludo (ar}
C2H 2 reduzido
ER= 1-
H 2 evoludo (ar)
H 2 evoludo em uma atmosfera sem N 2
Endoderme
Crtex
Clulas
infectadas
Superfcie
do
Ndulo
Eletrodo
-o
300
::a..
C\I
Q)
200
'tJ
'0
(,).
oL..
100
Q)
o
c
o
u
O
O
50
100
150
200
250
300
Figura 2.4 Barreira difuso de 02 no crtex do ndulo, formada pelas prprias clulas do crtex perto da superficie externa
dos ndulos, e mudana na concentrao de 02 em um ndulo. Segundo Witty et aI. (1986).
24
Dinitrogenase
Redutase
da
Dinitrogenase
Doador de
e( Ferredoxina,
Flavodoxina)
2 NH 3
ambiente
H2~
2 Mg ATP
~
ATP
ou
Hidrogenase
ADP + Pi
Os autores constataram que diversos sistemas simbiticos estudados diferiam em sua eficincia relativa mas que, no caso de Bradyrhizobiu/11, ao contrrio de outras espcies de Rhizobiu/11, a
atividade da hidrogenase de algumas estirpes era capaz de reciclar todo o H 2 produzido pela
dinitrogenase.
Estudos conduzidos com cultura contnua de Azotobacter chroococcUl11 mostraram que, sob
condies de limitao de carbono e fsforo, as culturas so fortemente dominadas pelo fentipo
Hup-l-. J nos casos de limitao por ferro ou O 2, h uma pequena vantagem do fentipo Hup- (Yates
& Campbell, 1989). Alm disso, vrios outros fatores podem afetar a atividade da hidrogenase ou a
alocao de eltrons para a dinitrogenase, resultando em maior ou menor eficincia na converso de
eltrons para a reduo do N 2 (Neves & Hungria, 1987).
C?s resultados obtidos em diversos experimentos que investigavam as vantagens do fentipo
Hup-l- em leguminosas, porm, so conflitantes. Em soja, h indicaes de que as estirpes Hup-l- so
mais eficientes energeticamente do que as Hup-, podendo contribuir com maior acmulo de N nos
gros (Schubert et a!., 1978; Albrecht et a!., 1979; Zablotowicz et a!., 1980; Hanus et a!., 1981).
Nesses experimentos, porm, no foram utilizadas estirpes isognicas para o fentipo Hup. Comparando estirpes isognicas Hup -I- e Hup-, Devron et a!. (1987) no detectaram, na fase inicial, diferenas
25
entre as estirpes e, aos 75 dias, as plantas inoculadas com as estirpes Hup+ apresentaram menor matria da parte area seca, o que foi atribudo limitao de O2 nos ndulos, pela oxidao pela hidrogenase.
Em outros experimentos com estirpes isognicas de B. japonicum, porm, observaram-se aumentos de
9% e 11 %, respectivamente na matria seca e teor de N total na parte area (Evans et aI., 1985) e de
13% no N total acumulado pelas plantas (Hungria et aL, 1989).
Alm desse papel na economia energtica, h sugestes para pelo menos mais duas funes
para a hidrogenase: 1- mecanismo auxiliar de proteo respiratria, removendo o O2 do ambiente da
dinitrogenase e 2- prevenir a inibio da atividade da dinitrogenase pelo H 2 evoludo que, devido
compartimentalizao da estmtura do ndulo, pode atingir concentraes inibitrias (revisado em
Neves & Hungria, 1987).
Os estudos sobre a evoluo do H 2 e hidrogenase continuam em diversos laboratrios do mundo. Muito j se conhece, tambm, sobre as propriedades fsico-qumicas, propriedades catalticas,
aspectos genticos e regulao da expresso da hidrogenase (Maier, 1986; Evans et aI., 1987; O'Brian
& Maier, 1988; Arp, 1992). Embora a evoluo do H 2 tenha sido freqentemente indicada como um
dos fatores que limitam a efcincia da fixao do N2, restam muitas dvidas, tanto a nvel bsico
como a nvel mais aplicado, que precisam ser melhor estudadas e entendidas. Uma das dvidas surge
na constatao de que as estirpes Hup- parecem constituir a maioria dos isolados do solo representando, em alguns levantamentos realizados, de 75% a 81 % da populao rizobiana, o que poderia indicar
alguma vantagem em termos de competitividade (Carter et aI., 1978; Brewin, 1984; Arp, 1992).
2.6. Assimilao da Amnia Resultante da Fixao do N2
O primeiro produto da fixao do N 2 a amnia, que transferida do bacteride pela membrana peribacteroidal para o citossol da planta hospedeira (Bergersen, 1965; Bergersen & Turner, 1967).
As reaes de assimilao so ento mediadas pela glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase
(GOGAT) (Figura 2.6). O desenvolvimento dessas enzimas ocorre, principalmente, durante o estabelecimento da nodulao (Atkins et aI., 1980, 1984; Miflin & CuIlimore, 1984; Hungria et aI., 1991),
com mais de 95% da atividade localizada no citossol dos ndulos (Atkins et aI., 1980; Mit1in &
Cullimore, 1984).
Existem duas fonnas de GOGAT nos ndulos, a dependente de ferredoxina e a NADH-GOGAT,
cuja atividade geralmente maior (Suzuki et aI., 1986; Hungria et aI., 1991) e que est localizada em
plastdios (Shelp & Atkins, 1984). Inicialmente, a GS adiciona amnia ao cido glutmico, com a
hidrlise concomitante de ATP. O N-amida da glutamina, que o produto orgnico inicial do processo de fixao , ento, usado pela GOGAT, sendo adicionado a uma molcula de a-cetoglutarato
(cido 2-oxoglutrico), gerando duas molculas de glutamato. Essas duas molculas podem ser novamente usadas como receptoras da amnia ou podem ser usadas, posteriormente, como doadoras de
amida. Devido ao baixo Km da GS para a amnia (200 nM), essa considerada a principal via de
assimilao da amnia nos ndulos (Boland et aL, 1982; Shelp & Atkins, 1984; Atkins, 1991) .
Atividades elevadas da glutamato desidrogenase (GDH) tambm j foram detectadas nos ndulos (Shelp & Atkins, 1984; Hungria et aI., 1991) e a assimilao, via GDH, seria pela adio da
amnia ao cido 2-oxoglutarato, gerando glutamato. Entretanto, devido s baixas concentraes de
amnia encontradas nos ndulos e ao Km elevado dessa enzima, de 14 )..lM, pouco provvel que essa
26
via seja utilizada (Streeter, 1989; Atkins, 1991). A constatao de nveis elevados de atividade nos
ndulos, porm, deixa dvidas sobre a ao da GDH, que talvez possa ser importante sob condies
de estresse (Atkins et aI., 1984) ou durante a senescncia dos ndulos (Sutton, 1983).
CLULA INFECTADA
Na
IIACTERIDE
+1 2
N H , _ GLN
_-+-GLN
A
_
cl!LULA NAO
IN'ECTADA
P~RA
NH,
CITOSSOL
o(;
KG
ri+--
r--=1~-OOHH--:Ppiii'Riuvi'ATTo:---xxAiANiTTiN'NAA
'--+---t-..
ASN
GLN
~ GLU L4
SER
T~ A~: G~ C~HF
+ +
r(
COa
SNTESE DE PURINA
11
"CitO RICO
CIDO RICO
)~I~:
02-~15
XMP
ALAN
PRPP _Riboaa ap
115
PLAlTIDEO
XANTINA
12
12
URICO
ALAN
PEROXIISOMO
RET(CULO
ENOPi:sMTlCO
14
ACAL
ALAN
ASN
14
ALAN_ ACAL
...!!.. ACAL
ACAL
14
ACAL_ ALAN
ACAL
ENDODERME
Figura 2.6. Vias de assimilao da amnia fixada nos ndulos de leguminosas. (1) Nitrogenase
(E.C.1.18.6.1); (2) glutamina sintetase (E.C.6.3 .1.2); (3) glutamato sintase (E.C.2.6.1.53);
(4) aspartato aminotransferase (E.C.2.6. 1. 1); (5) serina hidroximetilase; (6) metileno
tetrahidrofolato oxidoredutase (E.C.1.5.1.5); (7) asparagina sintetase (E.C.6.3.54); (8)
fosfoglicerato oxidoredutase (E.C.1.1.1.95); (9) fosforibosil amido-transferase
(E.C.2.4.2.14); (10) inosina monofosfato oxidoredutase (E.C.12.I.14); (11) vrios
passos; (12) xantina oxidoredutase (E.C.I.2.3.2); (13) urato oxidas e (E. C. I. 7.3.3); (14)
alantoinase (E.C.3.5.2.5); (15) fosforibosilpirofosfato sintase (E.C.2. 7.6.1). Abreviaces
usadas: ALAN, alantona; ACAL, cido alantico; ASN, asparagina; ASP, cido asprtico;
GLI, glicina; OH-piruvato, hidroxipiruvato; IMP-inosina monofosfato; PRPP, fosforibosil
pirofosfato; SER, serina; THF, cido tetrahidroflico; XMP, xantina monofosfato. Segundo Neves & Hungria (1987).
27
+ 7,71
x r= 0,925 ** (x)
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~#~I----------~I~----------~I------~I
60
70
%
N -
80
uredo
Figura 2.7. Correlao entre o teor de N-uredo na seiva do xiI ema, aos 35
dias aps a emergncia (DAE) e (a) ndice de colheita para o N,
(b) N total dos gros aos 77 DAE. Experimento conduzido com
cinco cultivares e seis estirpes de feijo. Segundo Hungria &
Neves (1987 b).
28
Novos experimentos devem ser conduzidos para identificar e quantificar os beneficios do maior
transporte de uredos, pois tanto em soja como em feijo h resultados comprovando que o N-uredo
mais facilmente translocado para os gros do que o N mineral (Neves et aI., 1985; Hungria & Neves,
1987b; Yoneyhama, 1984a,b). Alm disso, permanece a dvida sobre as bases bioqumicas que explicariam a correlao positiva encontrada entre a maior eficincia relativa da nitrogenase (ER) e a maior
porcentagem de N-uredo transportada na seiva do xilema (Neves et a!., 1985; Hungria & Neves,
1987a,b).
2.7. Custos Energticos do Processo de Fixao do N2
Nas plantas dependentes exclusivamente do processo de fixao do N 2 , a energia das reaes
fotossintticas armazenada nos ndulos, para ser oxidada e produzir redutores fortes (eltrons) e
ATP, necessrios atividade da dinitrogenase. No caso das leguminosas dependentes de nitrato
(N03-), os gastos energticos so similares aos da fixao biolgica quando a assimilao ocorre nas
razes. Em algumas leguminosas, como a soja e o feijo, porm, o nitrato reduzido principalmente
nas folhas e o ATP necessrio para o metabolismo posterior da amnia pode ser fornecido diretamente
pela fotofosforilao nos cloroplastos, reduzindo os custos energticos. Na Figura 2.8 pode-se observar uma representao do fluxo de energia para os processos de reduo do N 2 ou do nitrato nas
leguminosas.
As diferenas no custo energtico do nitrato, assimilado pelas razes e pelas folhas e nas condies experimentais dos estudos conduzidos em vrios laboratrios, levaram aos mais diversos resultados quando compararam a eficincia energtica de leguminosas noduladas ou recebendo N mineral.
Mais detalhes podem ser obtidos nas revises de Phillips (1980); Schubert & Ryle (1980); Minchin et
a!. (1981); Mahon (198.3); Saari & Ludden (1986); Neves & Hungria (1987).
custo terico de reduo de 1 moi de N 2 para 2 mo1s de amnia de 28 ATP. Dependendo
da presena da hidrogenase, tipo de composto exportado e outros fatores, esse custo pode variar de
25,5 a 49 ATP.mol- 1 N 2 fixado (Minchin et a!., 1981; Saari & Ludden, 1986). Existem diversos
mtodos experimentais, conduzidos sob condies controladas de casa de vegetao ou a campo, para
calcular os custos energticos reais do processo de fixao do N 2 e compar-los com os valores tericos (Mahon, 1983; Saari & Ludden, 1986; Neves & Hungria, 1987). Um dos mtodos mais utilizados
o da avaliao dos custos energticos pelo fluxo respiratrio, cujos resultados podem ser expressos
em nmero de mols de glicose.mol- l de NH/, mols de CO 2 .mol- 1 de NH/, mg C respirado.mg- l N
fixado, etc. Segundo Mahon (1983), a estimativa termodinmica terica para a reao da dinitrogenase
seria de, no mnimo, 0,11 mols de glicose.mol- l de NH4+, mas, pela compilao dos valores encontrados em diversos experimentos, o autor considera como valor mdio 0,50 mols de glicose.mol- 1 de
NH/, portanto bem mais elevado do que o valor terico.
No caso da soja, os gastos de carbono para a fixao do N 2 encontrados por alguns autores
variaram de 2,4 g a 7,0 g C respirado.g- l N fixado (Saari & Ludden, 1986). Alm de diferenas nas
condies experimentais e nos gentipos de soja e estirpes de bactrias, a discrepncia dos resultados
tambm pode estar relacionada com a presena da hidrogenase, que reduz os custos no consumo de
carboidratos na ordem de 11 % a 25%, com a fixao de CO 2 pela enzima NADP-mlica e, principalmente, pela fosfoenol piruvato (PEP), que pode resultar em uma economia de 9% a 32% dos esquele-
29
tos de carbono, alm de diferenas no tipo de composto nitrogenado sintetizado e transportado pela
seiva do xilema (Minchin et aI., 1981; Saari & Ludden, 1986; Neves & Hungria, 1987). De qualquer
modo, procurar sistemas simbiticos mais eficientes uma meta importante, pois cerca de 30% dos
fotossintatos dirios da planta hospedeira so desviados para os ndulos (Minchin & Pate, 1973;
Mahon, 1983).
,
Agua
E nergia luminoso
~O2
CD
+ ATP
1/
ReduOo do
Nitrato
Fotossntese
Fotoreao
C02
Fotossintese
Reao no escuro
Carboidratos
NH4--- N03
1--------
Fixao
Biolgico
I~
I
/
C02
OxidaOo
Fosforilao
oxidativa
NH;--N2i
I
:---------E]
Figura 2.8. Representao do fluxo de energia envolvido na reduo do nitrato do
solo ou dos fertilizantes e na reduo do N 2 . Para a reduo do nitrato
podem ser utilizadas duas fontes de redutor: l-excedentes de energia
luminosa e 2-carboidratos produzidos pela fotossntese. Segundo
Mahon (1983).
No caso dos experimentos que encontraram maior eficincia nas plantas que assimilavam N
mineral, os valores so, em mdia, 30% superiores aos das plantas fixando N 2 (revisado em Mahon,
1983; Neves & Hungria, 1987). Essa menor eficincia energtica das plantas noduladas muitas vezes
tem sido mencionada como um desestmulo prtica da inoculao. Combatendo esse pensamento,
porm, tem-se que considerar, entre outros fatores, que o consumo energtico para a fixao do N 2
trs vezes menor do que o do processo Haber e Bosch .. Conforme salientado por Mahon (1983), em
30
termos agronmicos, as vantagens da adaptao e melhoria dos sistemas simbiticos so muitas, particularmente em comunidades com grandes perdas de N por lixiviao ou desnitrificao, como ocorre em vrios solos do Brasil.
Outras
Origem Principais caracteristicas
Nomenclaturas
EUA
TAL-1 02
USDA 122
PJ 17-1
PJI7
SEMIA 5071
SEMIA 5051
USDA 31
USDA 94
USDA 76
SEMIA 5072
SEMIA 5039
SEMIA 5019
NC1005
532c,G3
29w, BR29
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
EUA
Brasil
Brasil
R54-a
BR 54
Brasil
BR 103
BR 102
USDA 123
USDA 73
Isolada pelo Niftal, Hawai. Grupo Ia (Hollis et a!., 1981; Kuykendall el a!., 1988, 1992); sTI (St1n1ey et a!., 1985),
gentipo I - AI (Iv!inamisawa, 1990).
Gentipo I - A2 (lvlinamisawa, 1990).
Mutante revertante isognica Hup+ da estirpe PI 17 (Lepo et a!., 1981). Gentipo 1- A2 (lvlinamisawa, 1990).
Estirpe isognica Hup- da PJ 17. Gentipo 1 - A2 (Il.!inamisawa, 1990).
Grupo I (Hollis et a!., 1981; Kuykendall el aI., 1988). Sensvel alta temperatura e bai.,a umidade (Morote et a!., 1990).
Gentipo misto, entre I e Il (lvlinamisawa, 1989).
Grupo Il (Hollis et aI., 1981; Kuykendall el aI., 1988); sTIl (Stanley et a!., 1985); gentipo Il- Bl (lvlinamisawa, 1990); B. elkalJii Il (Kuykendall et aI., 1992).
Grupo Il (Hollis el aI., 1981; Kuykendall et aI., 1988); gentipo II - Bl (lvlinamisawa, 1990); sTIl (Stanle)" et aI., 1985); B. elkanii Ila (Kuykendall et a!., 1992).
Grupo Il (Hollis et aI., 1981; Kuykendall et a!., 1988); .TIl (Stanley et a!., 1985); gentipo Il - B2 (Minamisawa, 1990); B. elkalJii Il (Kuykendall et a!., 1992).
Isolada na Universidade da Carolina do Norte.
Isolada pelo IPAGRO, RS, em 1966. Eficiente, mas pouco competitiva (peres, 1979).
Isolada da linhagem IAC-70-559, pela EMBRAPA-CNPBS, RI. Eficincia alta (peres, 1979) a mdia (Neves et aI.,
1985). Competitiva (peres, 1979), recomendada comercialmente desde 1979 at o presente momento.
Isolada pela EMBRAPA-CNPBS, RI, em 1963, de solos com alto teor de mangans e que h8\iam sido inoculados com
inoculante misto da SARGS, RS. Eficiente (Dbereiner et a!., 1970).
SEMIA 587
BR96
Brasil
Isolada pelo IPAGRO,RS, em 1967. Eficiente e competitiva (peres, 1979). Recomendada comercialmente de 1968 a
SEMIA 5061
DF395
SM,b
lNFA 037
BR 76
BR 1
Brasil
Brasil
Brasil
965
DF383
SEMIA 586
BR95
BR 77
CB 1809, BR 33
USDA I36b
Japo
Brasil
Austrlia
SEMIA 527
SEMIA 5070 CPAC 74K
SEMIA 5080 CPAC 7
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Isolada pelo IPAGRO, RS, de inoculante americano, em 1966 e recomendada comercialmente at 1978.
Isolados
"s"
Brasil
v.>
32
As estirpes do grupo II tambm sintetizam cido indol actico (AIA) in vitro, acumulando
mais de 20 flM no meio, enquanto que nas estirpes do grupo I no se verificou sntese de AIA
(Minamisawa & Fukai, 1991; Minamisawa et aI., 1992). O triptofano geralmente um intermedirio
chave na biossntese de AIA em microrganismos (Morris, 1986). Minamisawa & Fukai (1991) observaram que a adio desse aminocido aumentava a concentrao de AIA nos sobrenadantes do GTII,
ao passo que as estirpes do GTI no acumulavam AIA, mesmo na presena de triptofano.
Quanto atividade enzimtica, Huber et aI. (1984) observaram que somente as estirpes do
grupo II exprimiam a atividade da dinitrogenase in vitro, avaliada pelo mtodo de reduo do acetileno.
Por outro lado, Minamisawa (1989) observou que o fentipo Hup+ est confinado ao gentipo I e que
a expresso do fentipo consistente com a presena dos genes estruturais hup (Minamisawa, 1990;
Minamisawa et aI., 1992). Nem todas as estirpes do grupo I, porm, so Hup+ (Minamisawa et aI.,
1992), o que sugere que a caracterstica Hup implicaria em transferncia gentica horizontal entre
estirpes do gentipo I (Minamisawa, 1990). Recentemente, porm, foi relatado que diversas estirpes
apresentam atividade da hidrogenase denominada Hup-hr, isto , Hup host regulated, caracterizada
por no expressar atividade da hidrogenase em soja, mas sim em caupi (Vigna unguiculata L.) (van
Berkum, 1990; van Berkum & Sloger, 1991). Algumas estirpes do gentipo II se enquadraram na
categoria de Hup-hr (Keyser et aI., 1982; van Berkum & Sloger, 1991), mas esse parmetro ainda no
foi considerado nos estudos de subdiviso em gentipos.
A sntese de rizobiotoxina e a presena de hidrogenase parecem ser incompatveis, desde que
a derrepresso da hidrogenase in vitro inibida pela presena de rizobiotoxina (Minamisawa, 1988).
Foi observado, ento, que as estirpes do gentipo II no parecem carrregar os genes estruturais hup e
que, portanto, a represso pela rizobiotoxina provavelmente no ocorre em condies naturais
(Minamisawa, 1990).
Em relao assimilao do N 2 fixado pelas bactrias in vitro, foi relatado que as estirpes do
grupo I assimilam amnia principalmente pela isoenzima GSn, enquanto que nas estirpes do grupo II
a assimilao ocorre, preferencialmente, pela GSI (Rumjanek et aI., 1993a).
Em simbiose, uma diferena observada foi a de que a principal oxidase terminal do cito cromo
aa", estava presente somente entre as etirpes do grupo II e que essas bactrias no possuam a
hemoprotena P-422 reativa com CO (Keister & Marsh, 1990).
Diferenas impoliantes foram encontradas na interao das bactrias com alguns gentipos de
soja. Foi relatado que a restrio da nodulao (proliferao do crtex sem formao de ndulos) pelo
gene dominante Rj4' presente na cultivar HiU, ocorre pela inoculao com a grande maioria das estirpes do grupo lI, mas no com as estirpes do grupo I (Devineet aI., 1990; Kuykendall et aI., 1992).
Recentemente, porm, Sadowsky & Cregan (1992) observaram que essa restrio poderia ser estendida a algumas estirpes do grupo I. Tambm foi constatado por Devine et aI. (1983) que as estirpes do
grupo II nodulavam soja "no-nodulante", que possui o alelo ':il,.jl e tambm iniciavam a nodulao
em amendoim (Arachis hypogaea L.), alm de induzirem clorose pela produo de rizobiotoxina. A
nodulao da soja com o alelo '.']/1 1 tambm ocorreu com algumas estirpes do gentipo II utilizadas
nos estudos de Rumjanek et a!. (1993a), mas no foi confirmada plenamente por La Favre & Eaglesham
(1986a).
33
Todas essas diferenas encontradas entre os dois gentipos, resumidas na Tabela 2.6, levaram
Kuykendall et aI. (1992) a sugerirem, recentemente, a subdiviso em duas espcies: B. japonicum,
com as estirpes do gentipo I, e B. elkanii, que incluiria as estirpes do gentipo TI (Tabela 2.3).
Para os estudos brasileiros, resta a deciso de quais parmetros poderiam ser mais facilmente
empregados para o enquadramento das estirpes nas duas espcies. Atravs de uma anlise dos parmetros
obtidos em diversos trabalhos, da repetibilidade e consistncia dos resultados entre autores e das
condies de muitos laboratrios brasileiros, podem ser recomendadas, hoje, as anlises de composio dos polissacardeos extra-celulares, resistncia intrnseca a nveis elevados de antibiticos, sntese
de rizobiotoxina e cido indol actico in vivo ou in vitro, presena da hidrogenase pela hibridizao
com os genes hup ou pelo fentipo Hup, alm da hibridizao especfica com algumas seqncias
genticas, como o nijDK, nijE, RS s e 16S rRNA (Stanley et aI., 1985; Kuykendall et a!., 1988;
Minamisawa, 1989, 1990; Minamisawa & Fukai, 1991; Minamisawa et aI., 1992; Rumjanek et aI.,
1993b; Boddey & Hungria, 1994a). Para a identificao inicial de diversos isolados, porm, deve-se
considerar a sugesto de Minamisawa et aI. (1992), da anlise de cido indol actico in vitro, por ser
uma anlise fcil, envolvendo custos baixos e que apresenta alta correlao com a diviso em gentipos
ou espcies.
2.8.2. Diviso das estirpes "brasileiras" em B. japonicum e B. elkanii
Embora os estudos mostrando diferenas entre estirpes de B. japonicum tenham iniciado nos
Estados Unidos na dcada de 80, anlises semelhantes no foram realizadas com as estirpes "brasileiras", isto , estirpes que foram ou so utilizadas em estudos e inoculantes no Brasil.
Recentemente, o uso de apenas dez oligonucleotdeos curtos pela anlise de RAPD (random
amplified polymorphic DNA) foi capaz de diferenciar algumas estirpes brasileiras (Lunge, 1993),
embora nenhuma correlao com a diviso em gentipos ou espcies tenha sido feita.
A anlise de alguns parmetros, como assimilao da amnia pela GSin vitro e hibridizao
com a seqncia 16S rRNA nas estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 587, recomendadas comercialmente,
mostrou que ambas apresentam caractersticas de B. elkanii (Rumjanek et aI., 1993a,b)
Em outro estudo, 32 estirpes "brasileiras" de Bradyrhizobium e oito estirpes-padro americanas dos gentipos I, TI e misto foram analisadas para diversos parmetros in vitro, como morfologia
das colnias, reaes sorolgicas, resistncia intrnseca a antibiticos, sntese de cido indol actico,
expresso da hidrogenase e parmetros in vivo, como produo de rizobiotoxina e restrio nodulao
pelos genes Rj4 e '1/1 1 da soja. Um fenograma obtido com esses parmetros mostrou que a SEMIA
586 e a SEMIA 5080 so as nicas estirpes "brasileiras" que pertencem ao gentipo I (B. japonicuin)
e que a maioria das estirpes utilizadas em inoculantes, ou em estudos conduzidos no Brasil, pertence
ao gentipo TI (B. elkanii) (Boddey & Hungria, 1994a) (Figura 2.9).
Diversos isolados das regies do Cerrado pertencentes ao sorogrupo SEMIA 566, porm, ficaram em uma posio intennediria entre as duas espcies. As principais diferenas detectadas nesse
grupo misto foram a sntese de nveis intermedirios de cido indol actico e a ausncia de sintomas
graves de clorose provocados pela rizobiotoxina (Boddey & Hungria, 1994a). Essas estirpes esto
sendo analisadas, agora, com diversos oligonucleotdeos pela tcnica de PCR e os resultados preliminares confirmam o fenograma obtido.
Tabela 2.6. Algumas diferenas encontradas entre as espcies Bradyrhizobium japonicum e Bradyrhizobium elkanii.
Caracterstica
B. japonicum
B. elkanii
Referncia
Fuhrmann (1990)
sim
sim
Minamisawa (1989)
Minamisawa & Fukai (1991),
Minamisawa et alo (1992)
Huber et alo (1984)
Rurnjanek et aI. (1993a)
Minamisawa (1990)
Minamisawa(1989)
Keister & Marsh (1990)
Devine et alo (1990)
Devine et al; (1983)
Devine et alo (1983)
Fuhrmann (1990), Teaney &
Fuhrmann (1992), Vasilas &
Fuhrmann (1993), Boddey &
Hungria (1994b)
Minamisawa et alo (1993), Boddey
& Hungria (1994b)
Minamisawa et alo (1993)
Sntese de rizobiotoxina
Sntese de cido indol actico in vitro em meio,
com ou sem triptofano
Atividade da dinitrogenase in vitro
Assimilao do N in vitro
Gentipo hup
Fentipo Hup
Presena, em simbiose, do citotromo aa3
Nodula soja com o alelo Ri4
Nodula soja com o par de alelos ri{i1
Nodula amendoim
Eficincia de fixao do N2
sim
isoenzima GSI
no
no
sim
no
sim
sim
menor
maior
menor
menor
maior
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35
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Figura 2.9. Fenograma de 40 estirpes de BradyrhizobiulIl que nodulam a soja, obtido pelas matrizes de similaridade pelo
mtodo UPGMA (unweight pair-group with arithmetic mean), considerando diversos parmetros morfolgicos,
fisiolgicos e bioqumicos. Segundo Boddey & Hungria (l994a).
36
Parmetros Analisados
Hup-
Hup+
48
(florescimento)
795 a
841 a
103,7 a
117,5 a
0,78 b
1,00 a
205 b
238 a
1,91 b
79,36 b
2,34 a
88,80 a
181,2 b
218,5 a
161,1 a
113,5 b
168,3 a
144,4 a
11,6 a
9,5b
0,40 b
0,45 a
70
(enchimento
dos gros)
N total (folha+caule+raiz)
(mg N.pl-I)
N total das vagens (mg N.pl-I)
N total nas folhas senescidas
(mg N.pl-I)
ndice de colheita para o N
[N nas vagens.(N total nas plantas)-I]
* Experimento conduzido em vasos de Leonard, esterilizados, contendo areia e vemliculita. Os dados representam mdias de cinco repeties. Para
cada parmetro, valores seguidos pela mesma letra no diferiram estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Segundo Hungria et a!. (1989).
37
Em relao aos estudos de ecologia microbiana interessante salientar que, embora vrios
mtodos tenham sido usados para caracterizar estirpes do solo, como sorologia (Fuhrmann, 1990;
Sawada et aI., 1990), mobilidade eletrofortica de protenas celulares (Noel & Brill, 1980; Kamicker
& Brill, 1986), resistncia intrnseca a antibiticos (Scotti et al., 1982; Sawada et aI., 1990), resposta
a bacteriofagos (Kowalski et aI., 1974), entre outros, raramente h menes sobre a relao entre esses
parmetros e a eficincia das estirpes que foram caracterizadas.
Recentemente, alguns trabalhos procuraram relacionar a eficincia das estirpes com as espcies B. japonicum e B. elkanii. Minamisawa (1989) classificou as estirpes do gentipo I como eficientes
e as do gentipo II como ineficientes, baseado principalmente na produo de rizobiotoxina e ausncia da hidrogenase. H, ainda, indicaes de que as estirpes do gentipo II apresentariam inferioridade
simbitica (Fuhrmann, 1990),' com menor matria de ndulos e da parte area secas, menor fixao de
N 2 e menores concentraes de clorofila e protena nas folhas (Teaney & Fuhrmann, 1992; Vasilas &
Fuhrmann, 1993). Recentemente, Boddey & Hungria (1994b) tambm observaram que, sob condies axnicas (isto , na ausncia de microrganismos estranhos), as estirpes classificadas na espcie B.
japonicul11 (gentipo I) apresentaram maior precocidade de fixao do N 2 e taxas mais elevadas de
fixao de N 2 no pr-florescimento do que as estirpes da espcie B. elkanii (Tabela 2.8).
Em relao competitividade, embora muitas vezes seja possvel obter estirpes mais eficientes, atravs de seleo ou de modificaes ge~ticas (Maier & Brill, 1978; Albrecht et aI., 1979;
Zablotowitz et aI., 1980; Hanus et aI., 1981; Williams& Phillips, 1983; Peres et aI., 1984; Kaneshiro
& Kwolek, 1985; Maier & Graham, 1990), o estabelecimento dessas bactrias no campo extremamente dificil, devido elevada capacidade competitiva das estirpes nativas ou naturalizadas do solo
(Ham et aI., 1971; Boonkerd et aI., 1978; Ham, 1980; Triplett, 1990a).
H trabalhos, j da dcada de 20, mostrando que as estirpes nativas do solo nem sempre eram
efetivas, tornando necessrio um processo de seleo para aumentar a produtividade pela inoculao
(Baldwin & Fred, 1929). Tambm so antigos os relatos de que o sucesso da inoculao dependia da
capacidade das estirpes inoculadas de competir com as estirpes infectivas mas ineficazes do solo
(Nicol & Thornton, 1941). A competitividade pode ser definida como a relao entre a proporo do
nmero de bactrias de uma determinada estirpe no inculo e a proporo de ndulos que essa estirpe
consegue ocupar nas razes da planta hospedeira. Para competir com as estirpes naturalizadas ou nativas do solo, a bactria introduzida deve apresentar caractersticas genticas ou fisiolgicas que permitam o seu favorecimento ou, ento, uma vantagem numrica.
Diversos laboratrios tm concentrado seus esforos na identificao dos fatores que influenciam a capacidade competitiva das bactrias. Alguns desses fatores incluem a mobilidade e quimiotaxia
(Mellor et aI., 1987; Caetano-Anolls et aI., 1988a,b; Liu et aI., 1989; Wadisirisuk et aI., 1989; Catlow
et aI., 1990a,b; Thies et al., 1991; Zdor & Pueppke, 1991), polissacardeos da superficie celular (Bhagwat
et aI., 1991; Zdor & Pueppke, 1991), produo de bacteriocina (Triplett, 1990b), taxa de infeco
(Hahn & Hennecke, 1988; McDermott & Graham, 1990), capacidade de responder a diversos substratos
(Bottomley et aI., 1990), taxa de crescimento em substratos de solos (Viteri & Sclunidt, 1987), eficincia da estirpe em formar ndulos (McDermott & Graham, 1990) e possibilidade de realizar manipulaes genticas (Triplett, 1990a). As respostas, porm, so variadas e pouco se sabe sobre as caractersticas genticas que determinam a capacidade competitiva das estirpes (Bhagwat & Keister, 1992).
38
Enquanto diversos laboratrios do mundo procuram descobrir as bases genticas responsveis pela
maior competitividade, uma estratgia simples pode ser a da seleo para maior atividade de fixao
do N 2 e para nodulao precoce. Isso porque foram obtidos diversos resultados mostrando que a seleo para maior atividade de fixao (Oliveira & Graham, 1990) e para nodulao precoce (Handelsman
et aI., 1984; Stephens & Cooper, 1988; Oliveira and Graham, 1990) podem conduzir, simultaneamente, seleo para maior habilidade competitiva.
Para entender melhor os mecanismos de sobrevivncia e competitividade, tambm necessrio um bom entendimento da ecologia dessas bactrias no solo e, no Brasil, poucos estudos tm sido
conduzidos nesse sentido. Alguns aspectos importantes da ecologia microbiana foram recentemente
revisados (Barnet, 1991; Giller & Wilson, 1991; BottomIey, 1992) e devem ser considerados em
estudos futuros.
Em relao s duas espcies de Bradyrhizobium, em estudos conduzidos em substrato estril
por Minamisawa et aI. (1993) as estirpes pertencentes ao gentipo I foram mais competitivas do que
as estirpes do gentipo 11 em diversas cultivares de G. max, exceto a cultivar Peking, enquanto que as
estirpes do gentipo 11 apresentaram maior competitividade em Glycine soja e Macroptiliiml
atropwpureum. Tambm em substrato estril, Boddey & Hungria (1994b) observaram que as estirpes
de B. japonicum foram mais competitivas do que as de B. elkanii, mas que as estirpes classificadas em
um gentipo misto foram mais competitivas do que as duas espcies (Tabela 2.8).
J em condies no estreis, foi sugerido que, embora a sntese de rizobiotoxina contri~ua
para a menor eficincia das estirpes, talvez essa toxina auxilie na sobrevivncia das estirpes no solo,
ajudando-as na competio com outros microrganismos (Minamisawa, 1990). Do mesmo modo, as
estirpes Hup-, embora menos eficientes, parecem constituir a maioria dos isolados e, nos levantamentos realizados, representaram de 75% a 81 % dos isolados do solo (Carter et aI., 1978; Brewin, 1984),
o que tambm poderia indicar alguma vantagem em termos de competitividade.
Todos esses estudos sugerem que ainda no h nenhum parmetro conclusivo que permita a
agilizao do processo de seleo de estirpes mais eficientes e competitivas para a soja e que os
mtodos tradicionais, de avaliao da quantidade de N 2 fixado e ocupao dos ndulos, ainda so os
mais confiveis.
2.9.2. Seleo de estirpes mais eficientes e competitivas no Brasil
Embora a seleo de estirpes mais eficientes e competitivas para a soja venha sendo feita
desde a introduo dessa cultura no Brasil (Freire, 1982), trabalhos atuais mostram que ainda existe
um grande potencial para incrementar os nveis de produtividade via fixao biolgica do N 2 (Scotti et
aI., 1981; Peres et aI., 1984; Neves et aI., 1985; Vargas et aI., 1992a).
Com a introduo da soja no Brasil, inicialmente foram utilizados inoculantes americanos, que
muitas vezes no se mostraram eficientes. Foi ento realizado o isolamento da estirpe "adaptada"
SEMIA 566, em 1966, de uma rea que havia recebido inoculante americano fabricado pela firma
Dixie Inoc. Essa estirpe passou, ento, a ser recomendada comercialmente no Brasil at 1978 com
grande sucesso (1. R. 1. Freire, comunicao pessoal).
Tabela 2.8. Valores mdios de trs repeties do nmero (NN, nmero. planta-I) e matria (MNS, mg.planta~l) dos ndulos secos e N
total (NTPA, mg N.planta- l) acumulado na parte area, aos 28 dias aps o plantio (DAP), MNS, NTPA e eficincia dos
ndulos (EN, mg N.mg de ndulo-I), no pr-florescimento (38 DAP), e capacidade competitiva (Compet., porcentagemde
ocupao dos ndulos quando inoculadas na proporo de 1: 1 contra a SEMIA 5019) para as estirpes-padro deBradyrhizobium
pertencentes ao gentipo I (SEMIA 5032, USDA 122, PJ 17-1, SEMIA 5071), gentipo misto (SEMIA 5051) e gentipo II
(USDA 31, USDA 94 e USDA 76), quando inoculadas em soja, cultivar BR-16 (Boddey & Hungria, 1994b).
Gentipo
Incio da Nodulao*
Pr-Florescimento *
w
\O
NN
MNS
NTPA
MNS
NTPA
EN
Compet.
GTI
GT misto
GTII
100,75 b
99,00 b
128,00 a
218,50 a
141,00 c
181,00 b
63,73 a
36,00 b
44,10 b
299,34 a
294,00 a
331,78a
89,38 a
74,15 a
52,26 b
0,290 a
0,252 a
0,174 b
80,56 b
88,89 a
71,43 c
mesma letra na mesma coluna no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%).
40
Na dcada de 70 foram conduzidos alguns estudos procurando selecionar estirpes mais eficientes para a soja e relacionar parmetros que permitissem a seleo in vitro. Um dos trabalhos pioneiros foi conduzido por Dobereiner et aI. (1970), que observaram que as estirpes "excepcionais" tinham
seu crescimento inibido em meio enriquecido com asparagina. Isso, porm, no foi confirmado posteriormente (Boddey & Hungria, 1994a; M.C.P. Neves, comunicao pessoal). Dentre as estirpes testadas por Dobereiner et aI. (1970), estava. a SEMIA 586 (=CB 1809), que em 1968 era recomendada
para a Austrlia pelo Commonwelth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO) e classificada como excepcional, tendo sido enviada para o Brasil pelo Dr. D. O. Norris em 1966 (Dobereiner
et aI., 1970). Nessa mesma poca, o teor de leghemoglobina nos ndulos tambm foi sugerido como
um parmetro diferencial entre as estirpes de eficincia "normal" e "excepcional" em soja (pedrosa et
aI., 1970). Outros estudos dessa poca procuraram rizbios adaptados s condies e solos brasileiros
(Lopes et aI., 1976a,b).
Ainda na dcada de 70, os rizobilogos tambm tiveram de solucionar o desafio de estabelecer
estirpes em solos de Cerrado recm.abertos para a cultl,lra da soja. O insucesso da inoculao nesses
solos levou a estudos que determinaram que a adubao e a calagem resultavam em um ambiente
favorvel multiplicao de actinomicetos produtores de antibiticos (Coelho & Drozdowicz, 1978).
Foi ento selecionada a "super estirpe" SEMI A 5019 (=29w) (Peres & Vidor, 1980), que conseguia se
estabelecer nesses solos, constatando-se que a sobrevivncia dos rizbios inoculados dependia da
resistncia a antibiticos, particularmente a estreptomicina (Scotti et aI., 1981, 1982). Hoje, porm,
acredita-se que as principais causas para aquele insucesso seriam a especificidade hospedeira da variedade IAC-2, que foi recomendada na poca de desbravamento dessas reas (Peres & Vidor, 1980;
Vargas & Suhet, 1980a), e o uso de baixas doses de inoculante, que no era de boa qualidade (Vargas
& Suhet, 1980a; Peres et aI., 1989; Vargas et aI., 1992b).
Trabalhos conduzidos em casa de vegetao e no campo, no final da dcada de 70 (Peres &
Vidor, 1980; Vargas & Suhet, 1980a), levaram recomendao nacional das estirpes SEMIA 5019 e
SEMIA 587 para a produo de inoculantes. Uma das principais vantagens dessas estirpes era a capacidade de formar uma simbiose efetiva com a cultivar IAC-2, que apresentava elevada especificidade
hospedeira.
Os trabalhos de seleo de estirpes continuaram e, no Centro de Pesquisa AgrOpecuria do
Cerrado (CPAC), da EMBRAP A, os estudos tomaram maior impulso pela utilizao do mtodo de
avaliao da atividade de ndulos individuais, pela tcnica de cromatografia gasosa (Peres et a1.,
1984), para a seleo de estirpes mais eficientes a partir de populaes estabelecidas em solos sob
cultivo de soja. Os estudos se concentraram em populaes de dois sorogmpos, o da SEMIA 566, que
uma estirpe muito competitiva e foi recomendada comercialmente de 1966 a 1978, se estabelecendo
em grande parte dos solos cultivados e o da SEMIA 586, que muito eficiente (Dobereiner et aI.,
1970; Neves et aI., 1985), mas apresenta baixa capacidade competitiva, alm de formar poucos ndulos com a cultivar IAC-2 (Peres, 1979).
Aps vrios anos de pesquisa, foram obtidas duas variantes das estirpes SEMIA 566 e SEMIA
586 que, alm de permitirem ganhos de produo, representam uma fonte de material gentico promissora para entender os mecanismos ligados eficincia e competitividade de B. japoniClfl11. A estirpe SEMIA 5080 (=CP AC 7) foi obtida atravs de uma sub cultura da SEMIA 586, mas caracterizada
41
por apresentar boa capacidade competitiva, alm de maior nodulao da cultivar IAC-2 (Vargas et aI.,
1992a; Nishi & Hungria, 1993). A estirpe SEMIA 5079 (=CPAC 15) foi selecionada pelo mtodo de
Peres et aI. (1984) de um solo na regio do Distrito Federal e pertence ao mesmo sorogrupo da SEMIA
566, embora se caracterize por uma maior eficincia de fixao do N 2 (Vargas et aI. 1992a,b).
Em relao ao par de estirpes SEMIA 566 e SEMIA 5079, foi observado que esta ltima
diferia da parental no fentipo Hai, ou seja, maior nmero de plos radiculares (Nishi & Hungria,
1993, 1994), o que poderia estar ligado maior capacidade competitiva da estirpe (Tabela 2.9). Atravs de estudos com diversos isolados do sorogrupo SEMIA 566 adaptados ao Cerrado, foi sugerido,
tambm, que a competitividade das estirpes dependeria da sua habilidade de alterar as protenas da
membrana em resposta ao estmulo das razes (Scotti et aI., 1993).
Tabela 2.9.
Efeito da inoculao da cultivar de soja BR-16 com a estirpe SEMIA 566 e a mutante
natural SEMIA 5079 na deformao dos plos radiculares (Had, hair deformation) e
aumento no nmero dos plos radiculares (Hai, hair induction), aos 15 dias aps a
inoculao. Em condies estreis foram tambm avaliados, aos 30 dias aps a emergncia, o nmero e eficincia (por grama de ndulos frescos, gNF) dos ndulos e a
porcentagem de ndulos ocupados por essas estirpes, quando inoculadas na proporo
1:1 com a SEMIA 5019*.
Had
Hai
N ndulos
Estirpe Comprimento
()l)
Espessura
()l)
(na. campo-I)
Eficincia
dos ndulos
(no.planta- I) (mgN.g-INF)
Ocupao
dos ndulos
(%)
566
62,50 b
23,75 a
50,25 b
49,38 a
28,76 b
52,10 b
5079
50,00 b
18,75 a
> 100,00 a
34,75 a
52,17 a
87,50 a
Controle
205,00 a
10,00 b
23,75 c
0,00
0,00
0,00
CV(%)
17,18
26,08
12,77
45,08
20,55
19,55
* Mdias
de quatro repeties. Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Na anlise estatstica dos
trs ltimos panimetros no Juram considerados os valores das plantas no inoculadas. Segundo Nishi & Hungria (1993, 1994).
As estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080 tm sido testadas h mais de sete anos nos solos do
cerrado, onde promoveram ganhos de rendimento de at 12,5 sacas de soja.ha- I (750 kg.ha- I), em
solos de primeiro cultivo, em relao ao tratamento sem inoculao, enquanto que as estirpes recomendadas comercialmente, SEMIA 587 e SEMIA 5019, promoveram aumentos mdios de 7 sacas.har (420 kg.ha- I ) (Vargas et aI., 1992a). A partir de 1992, essas duas estirpes passaram a ser recomendadas para utilizao nos inoculantes comerciais brasileiros, mas investigaes mais detalhadas sobre
essas bactrias precisam ser conduzidas.
42
Outras "sub-estirpes" mais competitivas do que aparentaI SEMIA 586 tm sido obtidas aps
a adaptao em solos de Cerrado corrigido com calagem e inoculao, repetida por vrios ciclos de
soja, e promoveram um pequeno incremento na nodulao no primeiro ano de cultivo (Neves et aI.,
1992), o mesmo ocorrendo com sub-estirpes do sorogrupo SEMIA 566 (Scotti et aI., 1993). Algumas
sub-estirpes do sorogrupo SEMIA 566, isoladas pela EMBRAP A-CP AC, apresentaram alta eficincia
e capacidade competitiva (Figura 2.10), indicando que a seleo de estirpes "adaptadas" pode resultar
em material gentico promissor para a soja.
NTPA
O % Ocupao
100
80-
60-
40
20-
o
(Q
(Q
10
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Hoje, a recomendao das melhores estirpes para a cultura da soja feita a cada dois anos,
durante a "Reunio de Laboratrios para Recomendao de Estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium"
(RELARE), que ocorre por iniciativa de pesquisadores da rea de microbiologia do solo e integrantes
das indstrias produtoras de inoculantes. So apresentados, nessa reunio, os resultados de pesquisa
relativos s estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium, em diversas leguminosas e diversas localidades
43
do Brasil, geralmente com os mesmos tratamentos e delineamento experimental para cada espcie.
Com base nesses resultados, procede-se recomendao nacional das estirpes e a ata da reunio segue
para o Ministrio da Agricultura. As indstrias de inoculantes passam a receber essas estirpes e se
comprometem a trabalhar somente com elas. A VI RELARE foi realizada em 1994, tendo sido decidido que as estirpes de Bradyrhizobium, recomendadas comercialmente para a cultura da soja, so a
SEMIA 587, SEMIA 5019, SEMIA 5079 e SEMIA 5080. Na Tabela 2.10 esto listadas as principais
caractersticas desejveis em estirpes de Bradyrhizobium que devem ser consideradas nos programas
de seleo.
Tabela 2.10. Caractersticas das estirpes de rizbio que devem ser consideradas durante os processos de seleo para a recomendao em inoculantes comerciais.
12345678-
44
genoma, j foram conseguidos diversos mutantes, como os no-nodulantes (Nod-), mutantes com
menor nodulao, supernodulantes, hipernodulantes e os que nodulam mas no fixam nitrognio
(Nod+Pix-).
Entretanto, j em 1946, Nutman salientava a importncia da planta hospedeira no sucesso da
fixao biolgica do N 2 (Dobereiner & Arruda, 1967) e algumas revises recentes salientam essa
importncia (phillips, 1991; Phillips & Teuber, 1992; Gresshoff, 1993). No Brasil, diferenas entre
variedades de soja, na eficincia da simbiose, foram relatadas desde os primeiros estudos conduzidos
(Dobereiner & Arruda, 1967).
Mais recentemente, variaes entre gentipos brasileiros de soja em resposta simbiose foram
relatadas por Galli (1987) (Figura 2.11). Uma anlise de 153 gentipos recomendados comercialmente e inoculados com a SEMIA 5019 constatou que a mdia do grupo mais eficiente superou em mais
de 100% a mdia do grupo menos eficiente (Bohrer et aI., 1994) (Tabela 2.11). Entre os gentipos
mais eficientes, esto algumas das parentais das novas cultivares, como a Davis e a Santa Rosa e, no
grupo das menos eficientes, esto algumas cultivares recentemente lanadas, como a BR-28, cujos
pais so a Santa Rosa e a BR-7811202. Isso mostra que, embora o melhoramento esteja sendo conduzindo na ausncia de adubao nitrogenada, muitas vezes est ocorrendo um declnio na eficincia da
simbiose, provavelmente porque vrios desses ensaios esto sendo conduzidos em solos ricos em N, o
que seria uma presso contra a fixao biolgica.
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ANALISE
DISCRIMINANTE
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Gentipos
Figura 2.11. Discriminao grfica dos 22 tratamentos correspondentes aos gentipos tardios de soja
submetidos anlise multidimensional (variveis dependentes: nmero e massa de ndulos, atividade da nitrogenase e produtividade). Segundo Galli (1987).
45
Tabela 2.11. Matria dos ndulos secos (MNS) e N total da parte area (NTPA) das 20 cultivares de
soja com melhor e pior desempenho quando inoculadas com a estirpe SEMIA 5019
(=29w). Coleta realizada cinco semanas aps o plantio, os dados representam mdias
de trs repeties. Segundo Bohrer & Hungria (1994).
Cultivar
NTPA
(mg N.pl-l)
- - - - -
MNS
(mg.pl-l)
Cultivar
NTPA
MNS
(mgN.pl-l)
(mg/pl)
IAC-9
76,13 a-d
281,6 abc
BR-7
17,65 d-g
93,4 abc
IAC-8
66,58 a-f
283,4 abc
Doko
31,88 a-g
148,4 abc
IAC-Foscarin
69,07 a-f
288,4 abc
EMBRAPA 9
13,94 fg
70,0 c
FT-14
77,06 a-c
278,4 abc
CAC-l
24,80 a-g
138,4 abc
Davis
68,45 a-g
243,4 abc
OCEPAR 10
25,04 a-g
95,0 abc
Tiaraju
65,77 a-g
230,0 abc
OCEPAR5
26,79 a-g
166,6 abc
Stuart
71,83 a-f
295,0 abc
EMGOPA-309
17,00 e-g
100,0 abc
Santa Rosa
68,04a-g
310,0 a
BR-15
29,07 a-g
156,6 abc
GO-BR-25
66,34 a-g
195,0 abc
UFV-9
23,44 a.,.g
206,6 abc
FT-Bahia
66,21 a-g
276.6 abc
Planalta
20,31 d-g
118,4 abc
FT-20
72,07 a-f
221,6 abc
BR-28
14,48 fg
155,0 abc
BABR-31
67,71 a-g
283,4 abc
CEP-20
23 ..66 a-g
146,6 abc
Andrews
71,14 a-f
280,0 abc
BR-35
18,34 c-g
95,0 abc
Bossier
68,87 a-f
273,4 abc
FT -Canarana
23,25 a-g
166,6 abc
FT-Guara
66,06 a-g
243,4 abc
UFV-I0
22,05 b-g
101,6 abc
Iva
79,55 ab
315,0 a
Paranaba
31,64 a-g
195,0 abc
J-200
81,32a
298,4 ab
EMGOPA313
23,63 a-g
151,6 abc
FT-6
74,24 a-d
280,0 abc
Paranagoiana
9,76 g
80,0 bc
MS BR-18
67,23 a-g
275,0 abc
BR-32
17,99 d-g
158,4 abc
EMBRAPA 1
68,04 a-g
255,0 abc
Tropical
28,77 a-g
133,4 abc
270,35
22,17
133,83
28,52
32,89
28,52
-------------------------------------Mdia do Grupo
70,58
-------------------------------------CV (%)
* Valores
32,89
seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ( 5%). Anlise estatstica considerando um total de 153
cultivares que foram estudadas.
46
47
Outro trabalho foi conduzido por Weiser et aI. (1990), que avaliaram 382 gentipos de soja,
selecionando 12 que excluam, em diferentes graus, os sorogrupos relativamente ineficientes encontrados nos solos do regio sul dos Estados Unidos. Segundo esses autores, dois tipos de gentipos
poderiam ser conseguidos: cultivares com alta produtividade em simbiose com as estirpes nativas, ou
cultivares com altas produtividades que conseguiam excluir as estirpes ineficientes do solo.
No caso do Brasil, no foram descritos genes de restrio nodulao, embora tenha sido
relatado que um dos problemas de nodulao no Cerrado fosse a alta especificidade hospedeira da
IAC-2, restringindo parcialmente a nodulao a estirpes como a SEMIA 586 e a SEMIA 5039 (Tabela 2.12, segundo Peres & Vidor, 1980). Restrio total nodulao pelos sorogrupos dominantes nos
solos brasileiros, SEMIA 566, SEMIA 587 e SEMIA 5019, no foi encontrada em nenhuma das 153
cultivares testadas por Bohrer & Hungria (dados no publicados).
Tabela 2.12. Matria de ndulos secos (mg.planta-1) de trs cultivares de soja em Latossolo Vermelho Escuro do Cerrado inoculadas com quatro estirpes de B. japoniclIl17. Segundo Peres
& Vidor (1980).
Estirpe
Cultivar de Soja
Bragg
Santa Rosa
IAC-2
43
18
SEMIA 5039
168
154
28
SEMIA 586
151
167
24
965
152
117
112
285
314
172
Testemunha s/inoc.
SEMIA 5019
* A estirpe
SEMIA 5019 (=29w) foi denominada de "super estirpe", por conseguir se estabelecer nesses solos j no primeiro ano de cultivo.
Pouca ateno tem sido dada atualmente, no Brasil, especificidade hospedeira, embora estudos conduzidos, j em 1975, tenham mostrado que gentipos de soja poderiam ter preferncia por
determinados sorogrupos de estirpes (Tabela 2.13).
48
Tabela 2.13. Porcentagem de recuperao de quatro estirpes deB.japonicum de ndulos de 12 cultivares de soja aps a aplicao de inoculante misto. * Segundo Freire (1977).
CultivaI'
de
Soja
532c
Planalto
25
30
45
Bragg
37
33
30
Bossier
15
12
73
IAS-1
12
15
73
IAS-5
38
12
50
Santa Rosa
27
25
47
Prata
13
38
49
Davis
55
10
35
IAS-4
34
45
21
Hardee
37
54
Prola
39
26
Pampeira
29
566
587
66
66
-------------------------------------Mdia
* Ensaio
30
21
0,25
48
Alguns grupos de pesquisa iniciaram, ento, duas linhas de investigaes, visando tentar: 1obter gentipos que pudessem nodular e fixar N 2 na presena de N03- (Betts & Herridge, 1987;
Herridge & Betts, 1988); e 2- obter mutantes que tolerassem a presena de N0 3- (Carroll et aI.,
1985a,b; Gremaud & Harper, 1989; Akao & Kouchi, 1992). Carroll et aI. (l985a,b) selecionaram
mutantes da cultivar Bragg e passaram a denominar essas mutantes de nts (nitrate lolerant -ymbiont),
determinando tambm que o controle ocorria pela parte area. Gremaud & Happer (1989) obtiveram
mutantes da cultivar Williams e Akao & Kouchi (1992) e conseguiram mutantes da cultivar Enrei.
Embora essas mutantes sejam parcialmente tolerantes ao nitrato e apresentem, alm de maior
nodulao, maior atividade da reduo do C2H 2 na presena de nitrato (Carroll et aI., 1985a; Gremaud
& Harper, 1989), tem sido questionado se as mutantes realmente toleram o nitrato (Eskew et aI. 1989).
Muitas vezes, essas mutantes apresentam nmero de ndulos duas a quatro vezes superior ao da parental,
tanto na ausncia como na presena de N03-, mas a biomassa produzida em condies de casa de
vegetao ou a campo pode ser menor (Carroll et aI., 1985a,b; Gremaud & Harper, 1989; Wu &
Harper, 1991). Mais detalhes de estudos recentes sobre o locus nts podem ser obtidos na reviso de
Gresshoff (1993).
49
50
Thomas, 1984). Por isso, muitas vezes se observa um amarelecimento das plantas no incio do ciclo
vegetativo, por volta de sete a nove dias aps a emergncia, mas que logo superado se a simbiose for
eficiente. No caso do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), estudos conduzidos com diversas estirpes
mostraram que algumas delas conseguem estabelecer ndulos funcionais mais precocemente do que
outras, contribuindo para o aumento do perodo ativo de fixao do N 2 (Hungria & Thomas, 1987;
Barradas & Hungria, 1989; Barradas et aI., 1989); possvel que essa seleo tambm seja vivel para
a sOJa.
Em condies de campo, a fixao biolgica do N2 pode iniciar j na segunda semana aps o
plantio. Vargas et aI. (1982a,b) observaram que os primeiros ndulos podem ser detectados aos cinco
dias aps a emergncia das plantas, aumentando em nmero ao redor dos 12 dias aps a emergncia.
Aps esse perodo inicial, a nodulao e a fixao do N 2 intensificam at o florescimento, havendo
ento a manuteno da atividade ou mesmo um incremento at a formao das vagens, quando inicia
a senescncia dos ndulos (Franco et aI., 1978; Carmen C. et aI., 1984). Na poca do florescimento,
uma planta de soja bem nodulada deve mostrar, no campo, entre 15 e 30 ndulos ou 100 mg a 200 mg
de matria de ndulos secos por planta (Vargas & Suhet, 1980a,b; Vargas et aI., 1982a; Cattelan &
Hungria, 1994). Muitas vezes, pode ocorrer uma populao secundria de ndulos aps o florescimento,
que contribuir para o fornecimento de N para as vagens (Franco et aI., 1978). A ontogenia da nodulao
e acmulo de N total em soja, cultivar IAC-2, pode ser observada na Figura 2.12.
Durante vrios anos, essa queda na atividade da dinitrogenase, aps o florescimento, era atribuda competio entre ndulos e vagens pelos fotossintatos da planta (revisado em Neves & Hungria,
1987). Hoje, outras hipteses, como o controle hormonal (Hungria & Neves, 1986; Neves & Hungria,
1987) ou fatores que controlam o suprimento de 02 na zona bacteroidal, afetando a disponibilidade de
ATP (Hartwig et a\., 1987; Vessey et a\., 1988; Layzell & Hunt, 1990; Layzell et aI., 1990) so considerados mais importantes. Ainda h discusses sobre os fatores fisiolgicos e genticos que seriam
responsveis pelo incio da senescncia dos ndulos, que tambm inicia logo aps o florescimento,
justamente no perodo de maior demanda-de--Npelas plantas (Sutton, 1983; Neves & Hungria, 1987).
No caso do feijo, algumas estirpes de rizbio e algumas cultivares permitiram um prolongamento na
atividade dos ndulos (Hungria & Franco, 1988; Barradas et aI., 1989; Boddey & Hungria, 1990),
sendo provvel que tambm exista variabilidade entre estirpes de B. japonicum e cultivares de soja em
relao senescncia dos ndulos, o que ainda no foi investigado.
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I
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(dias)
Figura 2.12. Nodulao e fixao de N 2 em diferentes estdios de desenvolvimento da soja IAC-2 em solo de primeiro
cultivo; onde cada ponto representa a mdia de quatro tratamentos com trs repeties, e as barras verticais
representam o erro da mdia calculado em cada ponto. Segundo Vargas et al.(1982a).
52
Diversos mtodos podem ser utilizados na avaliao da eficincia do processo de fixao biolgica do N2 e a escolha depender do tipo de estudo ou interesse considerado. Para o agricultor ou
extensionista, uma avali ao da nadulao a campo aos 10 a 15 dias aps a emergncia geralmente
recomendada. Nesse estdio, em solos com baixos teores de N, a soja bem nadulada deve apresentar
de quatro a oito ndulos Caso contrrio, um acompanhamento deve ser feito e, se aps uma semana
novos ndulos no tiverem sido observados e se as plantas apresentarem sintomas visuais de deficincia de N, pode-se recomendar a apli cao de fertilizantes nitrogenados.
Estudos com 153 cultivares de soja mostraram que 90% da nadulao ocorre na regio da
coroa ou colo da raiz principal (Bohrer et ai., 1994). A ausncia de ndulos na coroa e o aparecimento
de ndulos nas razes secundrias, particularmente na parte inferior do sistema radicular. indica que a
nodulao ocorreu tardiamente As cau sas da inibio da nodulao primria incluem solos com teores de N elevados. temperaturas elevadas, estresse hdrico, m qualidade do inoculante e falhas durante a inoculao, como a exposio do inoculante a temperaturas elevadas
A nodulao com estirpes eficientes pode ser facilmente visualizada pela distribuio na coroa, tamanho de 2-3 mm e colorao interna rsea dos ndulos, relacionada presena de
leghemoglobina ativa (Figura 2.13) A colorao verde das plantas, no florescimento. tambm pode
ser um indicativo de boa eficincia da simbiose. Um parmetro importante, em termos econmicos,
o da produo de gros O incio da senescncia dos ndulos pode ser detectado pela mudana da
colorao interna dos ndulos, que muda de rsea para verde, pela degenerao da leghemoglobina
Normalmente a senescncia inicia entre o florescimento e o perodo de enchimento das vagens; se
ocorrer antes di sso. provavelmente. algum fator ambiental ou nutricional acelerou o processo
Nos trabalhoss de pesquisa, outros mtodos so utilizados. Para maiores detalhes, procurar
Sprent (1984). Boddey (1987). Giller & Wilson (1991) .
Em trabalhos pioneiros, conduzidos no Brasil, foi sugerida a avaliao da simbiose pela regresso entre o peso dos ndulos e o N total das plantas, em uma equao representada por NF=hx,
53
onde o coeficiente de regresso b representava a eficincia do tecido nodular e x o peso dos ndulos
(Dobereiner, 1966; Dobereiner et aI., 1966, 1970). Na avaliao de estirpes, por exemplo, as combinaes das bactrias classificadas como "normais" apresentaram "b" variando de 0,165 a 0,240, enquanto que os valores de "b" para as "excepcionais" ficavam entre 0,279 a 0,439 (Dobereiner et aI., 1970).
Durante muitos anos, o mtodo de reduo do acetileno foi usado intensivamelte, por ser
simples, sensvel e rpido (Hardy et aI., 1968, 1973). Esse mtodo baseado no princpio de que
muitos compostos contm a tripla ligao que pode ser reduzida pela dinitrogenase, e que o acetileno,
um gs de fcil manipulao e baixo custo, reduzido pela dinitrogenase, em uma reao terica de
3: 1. Posteriormente, conforme j foi discutido, essa tcnica foi corrigida para a porcentagem de eltrons perdida pela evoluo do H 2, sendo necessrio corrigir a proporo para 4: I (Schubert & Evans,
1976).
Hoje, porm, o uso da tcnica de reduo do acetileno no mais recomendado em estudos
envolvendo a simbiose com a soja ou outros sistemas simbiticos. Isso ocorreu aps a constatao por
Minchin et aI. (1983) de que a atividade da dinitrogenase em razes noduladas e ndulos destacados,
caa rapidamente na presena do acetileno, com a reduo simultnea na respirao. O declnio
causado pelo aumento da resistncia da barreira de difiJso de O2 (Figura 2.4) devido ao acetileno. As
manipulaes da planta, necessrias tcnica de reduo do acetileno, como remoo da parte area e
retirada das razes e ndulos, tambm causam uma queda drstica na reduo do acetileno, que varia
com a estirpe de rizbio e com o gentipo da planta (Minchin et aI., 1986). O mtodo de reduo do.
acetileno, porm, pode ser utilizado para demonstrar que os ndulos esto ativos e para anlises rpidas e numerosas. Na EMBRAPA-CPAC, por exemplo, tem sido conduzido um programa de seleo
de sub-estirpes mais eficientes pela avaliao da atividade de reduo do acetileno em ndulos individuais (Figura 2.14). Quando os isolados dos ndulos com atividade mais elevada foram inoculados
em plantas, eles permitiram maior acmulo de N total (Peres et aI., 1984). Em estudos fisiolgicos,
tm-se utilizado cmaras de incubao com fluxo contnuo em sistemas no perturbados (LayzeIl,
1993).
Em casa de vegetao, em substrato livre de N-mineral, a anlise do N total nos d a quantidade de N 2 que foi fixada, tendo-se que excluir o N adicionado pelo inculo (e pelas sementes. Mas,
quando outras fontes de N esto disponveis, como fertilizantes ou N da mat~ria orgnica, o balano
de N total e as tcnicas com 15N, incluindo abundncia natural, valor "A" e diluio isotpica e o uso
de
15N2
so muito utilizadas. Algumas restries, porm, precisam ser consideradas, como o custo
elevado das anlises, a escolha correta da planta controle, estabilidade no enriquecimento com 15N do
solo, etc. (Ruschel et aI., 1979; Hardarson et aI., 1984; Boddey, 1987; Boddey et aI., 1984, 1990;
Giller & Wilson, 1991).
O uso da porcentagem de N como uredos, como um mtodo indireto de quantificao, tambm tem sido empregado (Herridge, 1982; van Berkum et aI., 1985) e o teor de clorofila nas folhas
pareceu ser um mtodo promissor (Mirza et aI., 1990), embora testes com cultivares e estirpes brasileiras no tenham mostrado correlao significativa (Nishi & Hungria, 1993; Boddey & Hungria,
1994b; Bohrer et aI., 1994).
54
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14
Atividade da Nitrogenase
(nmols/mg nod/h)
Figura 2.14. Variabilidade nas taxas de fixao do N 2 entre isolados de
uma mesma estirpe de B. japonicum. Segundo Peres et
aI.(1984).
2.13. Inoculantes
2.13.1. Mtodos de inoculao
Pode-se dizer que a inoculao j ocorria no incio do sculo passado, quando o transporte de
terra de alfafais j estabelecidos, na Inglaterra, era realizado para as novas reas onde se desejava
introduzir essa leguminosa. Na primeira metade deste sculo, teve incio a produo de inoculantes
em agar, mas devido fragilidade da embalagem, necessidade de manuteno em baixa temperatura
e pouca durabilidade do produto, sua difuso ficou limitada. Somente no final da dcada de 20, com
o uso da turfa como veculo para o inoculante, houve um incremento na utilizao desse insumo.
Hoje, os inoculantes para a soja so nonnalmente preparados em turfa, que previamente
corrigida para pH 6,5 a 7,0. O prazo de validade dos inoculantes no Brasil de seis meses, pois como
a turfa utilizada no desinfestada, o nmero de clulas de rizbio viveis decresce drasticamente. Na
VI RELARE foi decidido que, a partir de julho de 1996, os inoculantes brasileiros tero que ser
comercializados em turfa desinfestada. Com isso, o nmero de clulas viveis poder ser maior, bem
como o tempo de comercializao.
Outros veculos de inoculao tm sido testados, como leo diesel, leo mineral e querosene,
mas no se mostraram eficientes (Faria et a!., 1985; Peres et aI., 1986; Kolling et aI., 1990). Diversos
55
inoculantes lquidos, baseados em um meio mnimo de crescimento, ou com clulas liofilizadas, esto
entrando no mercado brasileiro, mas ainda no h resultados conclusivos de pesquisa sobre o seu
desempenho (Tabela 2.14).
Tabela 2.14. Nodulao durante o estdio vegetativo e rendimento de gros em resposta a adesivos
e tipos de inoculantes para a cultura da soja, em um solo sem populao estabelecida de
Bradyrhizobium, em Viamo, RS. Segundo KoIling et aI. (1990).
Tratamento
Nodulao*
(mg.planta- I )
Sem inoculao
- - - - - - - - - - - -
Rendimento*
(kg.ha- l )
9e
505 e
Adesivos para Inoculante Turfoso - - - - - - - - - - - -
147 de
2164 bc
Inoc. com gua
Inoc. com gua no dia anterior semeadura
3164 a
438 bc
Inoc. com soluo aucarada a 20%
555 ab
3267 a
Inoc. com soluo aucarada a 20% no dia anterior
691 a
3533 a
105 e
2064 c
Inoc. com leo mineral
Inoc. com leo queimado
358 bcd
2902 ab
- - - - - - - - - - - - - Outros Tipos de Inoculante - - - - - - - - - - - - Oleoso inoculado no dia anterior
18 e
924 e
Lquido
246 cde
2976 ab
Lquido no dia anterior
238 cde
2879 ab
56
e chumbo , no deveriam ser usados devido sua toxicidade. Como o tratamento de sementes essencial em muitos locais tradicionalmente plantados com a soja, os produtos so anualrnente testados e
aqueles listados, na recomendao anual para a cultura na Regio Central e na Regio Sul, causam
pouca ou nenhuma toxicidade ao rizbio.
De um modo geral, os herbicidas so menos txicos do que os fungicidas, mas a maioria dos
inseticidas organoclorados e alguns organofosfatados prejudicam a nodulao, embora os defensivos
contra nematides, geralmente, no prejudiquem a nodulao (De-Poli et aI., 1986; Cattelan & Hungria,
1994).
57
Aderncia
do
MNS
Sementes
(mg.pI- 1)
Inoculante
Vasos Estreis
MPAS
(g.pl-l)
Rendimento
Vasos c/Solo
MNS
(mg.pl-l)
MPAS
(g.pl-l)
de gros
(kg.ha- 1)
3089
250
92,18 a
47,60 a
0,51 a
57,70 a
0,87 a
3410
500
88,56 a
34,52 a
0,48 a
75,55 a
1,05 a
3608
750
80,00 b
47,12 a
0,54 a
75,62 a
1,07 a
3024
1000
66,21 c
42,16 a
0,48 a
61,08 a
0,85 a
2911
* Mdias
de cinco repeties. Valores seguidos pela mesma letra em cada coluna no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%).
Tabela 2.16. Efeito de doses do inoculante [g de inoculante.(40 kgr 1 de sementes] contendo as estirpes SEMIA 5079 e SEMIA 5080 na ocorrncia dos sorogrupos das estirpes introduzidas
e na produtividade da soja em solos do Cerrado com populao estabelecida. * Segundo
Vargas et aI. (1992b).
Dose
o
200
1000
200
* Mdias de quatro repeties.
Produtividade de
gros (kg. ha- 1)
5080
3575
3532
3943
3528
58
Em relao aos adesivos, sem dvida eles so importantes para garantir a aderncia do inoculante
s sementes (Tabela 2.14). A recomendao da soluo aucarada se deve principalmente a essa
adeso, permitindo o aumento da nodulao (Tabelas 2.14 e 2.17). Alguns resultados de pesquisa
mostraram que, at oito dias aps a inoculao das sementes, a viabilidade do inoculante foi mantida
(Figura 2.15, Peres et aI., 1986) mas, por segurana, recomenda-se que esse prazo no ultrapasse
quatro dias.
Tabela 2.17. Efeito da adio de gua e soluo aucarada a 25% na aderncia do inoculante s
sementes (% do inoculante que ficou aderido) e na matria dos ndulos e da parte area
seca acumulada aos 40 dias aps a inoculao de soja, cultivar BR-16*.
Dose
Aderncia
do
Acar
Sementes
Vasos Estreis
MNS
(mg.pl-l)
MPAS
(g.pl-l)
Vasos c/Solo
MNS
(mg.pl-l)
MPAS
(g.pl-l)
Testemunha
s/inoculao
Rendimento de gros
Virgem
(kg.ha- 1)
Cultivado
(kg.ha- 1)
2621
4262
Inoc.+gua
41,00 b
28,11 b
0,28 a
37,60 b
0,97 a
3648
4424
Inoc. +sol. a
25%
80,87 a
41,36 a
0,42 a
52,15 a
1,07 a
3477
3922
* Experimentos conduzidos
em vasos com soluo nutritiva estril sem N ou vasos com Latossolo Roxo com 10 5 clulas de Bradyrhizobill/JI.g'r de
solo. Mdias de cinco repeties. Valores seguidos pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (5%). Segundo Brando Jr. &
Hungria (1994). O eteito da soluo aucarada tambm foi analisado em experimento a campo em solo do CelTado virgem e aps o cultivo e
inoculao. Segundo Vargas et aI. (dados no publicados).
Nos casos em que se fizer necessrio o tratamento de sementes, deve-se: 1- misturar as mesmas com a soluo aucarada, utilizando-se 250 m} de soluo (25%) a 50 kg de sementes; 2- adicionar, a seguir, o fungicida; 3- aplicar 500 g de inoculante (ou 1000 g, no caso da Regio Central); 4deixar secar sombra por algumas horas; e 5- semear no mesmo dia e, caso isso no seja possvel,
repetir a inoculao no dia do plantio.
Hoje j existem mquinas no mercado que permitem a inoculao com turfa simultaneamente
com o tratamento de sementes, com um rendimento de 60 sacas.hora- 1 e dispensando a secagem. Com
essa facilidade, certamente mais agricultores passaro a adotar essa prtica.
2.13.4. Cuidados com o inoculante e com a inoculao
Para que a inoculao seja bem sucedida necessrio, primeiramente, que o inoculante apresente um nmero elevado de clulas viveis. De acordo com a legislao atual, esse nmero de 107
clulas.g- 1 de inoculante na hora do uso. Alm disso, alguns cuidados bsicos devem ser tomados,
como: 1- no utilizar inoculante com prazo de validade vencido; 2- ao adquirir o inoculante, certificar-
59
800
600
400
--o--
N2 Ndulos
Massa de Ndulos
200
o -I----r---r--..----.,.--.-----,r------r--"T
O
Dias de Armazenal11ento
Figura 2.15. Efeito do perodo de armazenamento de sementes na
nodulao de soja IAC-2, inoculadas com as estirpes
SEMIA 5019 e SEMIA 587 e utilizando-se uma soluo de sacarose a 25%. Segundo Peres et aI.(1986).
60
Os estresses trmicos e hdricos podem ser mais drsticos sob determinadas condies, como
solos arenosos ou descobertos. Nessas condies, a irrigao e cobertura morta (Sekhon et aI., 1984;
Morote et aI., 1990) e o sistema de semeadura por plantio direto, que tambm permite maior cobertura
morta (Voss & Sidiras, 1985), podem reduzir o estresse e favorecer a nodulao.
Embora a seleo de estirpes in vitro para tolerncia a temperaturas elevadas no correlacione,
necessariamente, com a tolerncia em simbiose (La Favre & Eaglesham, 1986b), h indicaes, de
que algumas estirpes de B. japonicum e gentipos de soja podem tolerar melhor os estresses trmicos
e hdricos (Morote et aI., 1990; Sall & Sinclair, 1991; Neumaier & Nepomuceno, 1994). Existem,
portanto, diferenas genticas que deveriam ser melhor exploradas.
2.13.6. Fatores nutricionais
As plantas que fixam N 2 so, nutricionalmente, mais exigentes, pois requerem os nutrientes
necessrios ao hospedeiro, ao rizbio e ao sistema simbitico. Neste item, os nutrientes que afetam a
simbiose com soja sero apenas mencionados. Para maiores detalhes, diversas revises podem ser
consultadas (Freire, 1977; Munns & Franco, 1982; Borkert & Sfredo, 1994; Cattelan & Hungria;
1994).
Os estudos indicam que a acidez afeta principalmente o estdio de infeco, devido reduo
da atividade das enzimas relacionadas com a quebra da parede celular. A acidez tambm prejudica a
sobrevivncia do Bradyrhizobium e apresenta efeitos indiretos, reduzindo a disponibilidade de clcio,
magnsio, molibdnio e fsforo e aumentando a de alumnio e mangans. Em relao ao
microssimbionte, o alumnio e o mangans afetam a diviso das clulas da bactria, podem causar
mutao do rizbio, diminuem a sua efetividade e, em relao ao hospedeiro, afetam o desenvolvimento das razes. O incio da nodulao e funcionamento dos ndulos tambm afetado, drasticamente, por nveis txicos desses elementos (Franco & Dobereiner, 1971; Keyser & Munns, 1979a,b; Munns
& Keyser, 1981), mas algumas estirpes de Bradyrhizobiu111 e gentipos de soja tm se mostrado tolerantes a essas condies (Dobereiner & Arruda, 1967; Franco & Dobereiner, 1971; Keyser & Munns,
1979b; Asanuma & Ayanaba, 1990; Taylor et aI., 1991.).
O clcio afeta o crescimento dos tecidos meristemticos das razes, a distribuio de -nutrientes, a sobrevivncia, a formao de flagelos e o potencial de infeco do rizbio, alm de ser um
componente da parede e da membrana celulares. Em solos cidos, incrementos no rendimento e
nodulao tm sido freqentemente relatados pela prtica da calagem (Freire, 1977). J o magnsio
muito importante para o crescimento da bactria, estabelecimento e rigidez de seus flagels, para a
atividade da nitrogenase, alm de desempenhar um papel importante no metabolismo da planta hospedeira (Freire, 1977; Robinson et aI., 1992). O potssio feta indiretamente a simbiose, pelo metabolismo da planta hospedeira e importante no transporte dos compostos nitrogenados fixados pela soja,
que vo para a parte area na forma de alantoato de potssio.
O fsforo, indiscutivelmente, desempenha um papel de extrema importncia, tanto no incio
da formao dos ndulos como pelo fornecimento de energia em todos os estdios da simbiose. Em
muitos solos brasileiros, caracterizados pelo baixo teor desse nutriente, adubaes fosfatadas aumentam a nodulao e o rendimento da soja (Freire, 1977). J o enxofre faz parte do complexo da
dinitrogenase, alm de estar associado com a fotossntese da planta hospedeira.
61
Tabela 2.18. Efeito de doses de adubao nitrogenada no rendimento dos gros de soja em solos da regio do Cerrado e do Paran.
Cultiyal'
EstillJe
ano
IAC-2
5019+587
2 ano
Paran
5019+587
Regio
Cultivo
Cerrado
10
Cerrado
Dose
(kg de N.ha- 1)
O
10
20
30
O
150
Cerrado
20 ano
Sta. Rosa
5019+587
150
Cerrado
20 ano
UFV-l
5019+587
150
O
150
Cerrado
20 ano
IAC-2
5019+587
Paran
1 ano
Paran
s/inoc.
566+587+
532c
Paran
Paran
Paran
[O
ano
> 20 ano
> 2" ano
Dados no publicados.
BR-16
BR-37
BR-16
s/inoc.
5079+5080
587+5019
O
10
20
40
O
O
O
s/inoc.
587+5019
s/inoc.
400
s/inoc.
s/inoc.
5019
O
400
400
Pl"Oduo
(kg.ha- 1)
1921
1963
2039
2023
2190
2034
2817
2871
3443
3527
3356
3673
1974
2252
2180
2175
2172
2680
2888
27J,.7
2982
-+268
4039
4009
3981
4400
Instituio
Ano
Refel"ncia
CPAC
1979/80
Vargas et
aI. (l982c)
CPAC
1977/78
CPAC
1977/78
CPAC
1977/78
CPAC
1977/78
CNPSo
1979/80
Vargas et
aI. (l982c)
Vargas et
aI. (1982c)
Vargas et
a!. (l982c)
Vargas et
a!. (l982c)
Campo et
aI. (1982)
CNPSo
CNPSo
1979/80
1991/92
Cattelan &
Hmlgria*
CNPSo
1992/93
Cattelan&
Hungria *
CNPSo
1992/93
Nishi &
Hungria (1994)
0\
63
3000
0
CJ)
1:1
c.o
0_
'E
GI
Ot
2000
(.!)~
1:1~
0C
GI
1000
"O
C
cu
a::
o
o
250
500
1000
Dose de Inoculonte
(0/40 kO de semente)
Figura 2.16. Rendimento de soja, cultivar IAC-2, recebendo quatro nveis de inoculante, em rea em que
o arroz havia sido ou no previamente inoculado com as mesmas doses. O experimento foi
conduzido em um latossolo vermelho-amarelo do cerrado sem populao estabelecida de
Bradyrhizobium e o inoculante foi preparado
com as estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 587.
64
eliminar a resposta inoculao, desde que algumas dessas bactrias sejam eficientes (Singleton &
Tavares, 1986; Thies et aI., 1991). No Estado do Paran, porm, mesmo em solos com populao de
105 a 106 clulas.g- 1 de solo, tem-se conseguido aumentar a porcentagem de ocupao dos ndulos
pelas estirpes do inoculante (Nishi & Hungria, 1993; Cattelan & Hungria, dados no publicados).
Tambm h muita controvrsia sobre a porcentagem de ndulos que uma estirpe eficiente
precisa formar para beneficiar o hospedeiro. Thies et aI. (1991) observaram que pelo menos 66% dos
ndulos da planta precisam ser formados pela estirpe introduzida. Entretanto, em solos do Paran,
uma ocupao de 36% dos ndulos pela estirpe SEMIA 5019 j foi suficiente para permitir um incremento de 419 kg.ha- 1 em relao ao tratamento recebendo 400 kg de N.ha- 1(Nishi & Hungria, 1993).
Esses resultados, e outros obtidos tambm em solos do Paran, indicam que talvez o nmero e massa
de ndulos formados por uma determinada estirpe sejam mais importantes do que a porcentagem de
ndulos ocupados por essa estirpe.
Alguns mtodos de inoculao, como a aplicao de um nmero elevado de clulas por alguns
anos, tambm podem ser recomendados para auxiliar no estabelecimento de estirpes desejveis (Triplett
& Sadowsky, 1992). Desse modo, a inoculao da estirpe USDA 110 por trs anos consecutivos, nos
Estados Unidos, permitiu o seu estabelecimento no solo (Duningan et aI., 1984), o mesmo acontecendo com uma estirpe para o trevo forrageiro (Martensson, 1990). Doses mais elevadas de inoculante
tambm tm permitido o melhor estabelecimento das estirpes em solos do Cerrado (Vargas & Suhet,
1980a).
Diversos fatores afetam a predominncia de uma determinada estirpe no solo, mas em grande
palie o estabelecimento est relacionado com as estirpes competitivas inoculadas nos anos anteriores.
Na Tabela 2.19, esto listadas as estirpes quej foram recomendadas em inoculantes no Brasil, algumas delas altamente competitivas, como a SEMIA 587, que em solos com populao estabelecida em
Guaba, RS, permitiu a ocupao de 68% a 77% dos ndulos (Freire, 1977). Na Tabela 2.20, esto
listados alguns levantamentos mostrando os sorogrupos dominantes em certas regies do Brasil.
Estirpes (SEMIA)
500
504
504
519
504
504
504
532
543
527
527
527
587
587
504
505
505
521
510
513
513
543
566
532
566
532
5019
5019
505
509
509
526
513
527
519
566
587
566
586
566
512
512
512
531
519
531
532
5079
5080
Kolling (1991).
513
513
515
534
527
516
516
517
535
531
517
519
519
519
521
534
521
525
535
Tabela 2. 20. Soro grupos presentes nos ndulos de soja detectados em levantamentos realizados em diversos locais do Brasil.
Local
Ano
527
532c
Referncia
566
587
5019
5061
N!!local
586
Guaba, RS
1973
37
32
n.a.
n.a.
Freire (1977)
Guaba, RS
1975
30
21
0,25
48
n.a.
n.a.
n.a.
Freire (1977)
Guaba, RS
1976
77
n.a.
n.a.
n.a.
Freire (1977)
Guaba, RS
1984
n.a.*
59
33
n.a.
Campo**
Maquin,RS
1984
n.a.
54
]7
19
n.a.
Campo**
Capinpolis, MG
1990
n.a.
n.a.
21
57
21
n.a
VargasetaI. (1992b)
Tupaciguara, MG
1990
n.a.
n.a.
48
49
n.a.
Nova Ponte, MG
1990
n.a.
n.a.
43
39
17
n.a.
Perdizes, MG
1990
n.a.
n.a.
46
64
n.a.
Sacramento, MG
1990
n.a.
n.a.
14
57
14
n.a.
14
Uberaba, MG
1990
n.a.
n.a.
50
50
n.a.
Tabatinga,DF
1990
n.a.
10
52
10
17
n.a.
VargasetaI. (1992 b)
Rio Preto, DF
1990
n.a.
37
12
31
n.a.
Jardilll, DF
1990
n.a.
11
34
18
26
n.a.
PAD.DF
1990
n.a.
32
16
26
n.a.
Pipiripau, DF
1990
n.a.
11
14
36
n.a.
Cristalina, GO
1990
n.a.
11
17
?~
_.J
33
n.a.
Vilhena, RO .
1990
n.a.
n.a.
68
18
14
n.a.
n.a.
So Gabriel do Oeste, MS
1990
n.a.
n.a.
63
13
23
Il.a.
Il.a.
Maracaju, MS
1990
Il.a.
51
25
21
n.a.
n.a.
* No avaliada .
Dados no publicados.
0\
1J1
66
Tabela 2.21. Resposta inoculao da soja em solo de cerrado no primeiro ano de cultivo. *
Tratamento
SEMIA 586
SEMIA 587
SEMIA 5019
5019+587
SEMIA 566 (isolado do cerrado)
N mineral
Sem inoculao
* lvIdia~
dos
r~sultados
Matria de Ndulos
Secos
(mg.planta- l )
Prod utividade
(kg.ha- 1)
(kg de N.ha- l )
46,0 b
176,2 a
121,2a
166,2 a
204,5 a
0,0
0,0
1600 a
1112 ab
1228 ab
1422 ab
1359 ab
1256 ab
812 b
98,04 a
61,83 ab
71,75 ab
83,46 ab
75,70 ab
71,23 ab
45,13 b
obtidos pelas cultivares ElvIGOPA-301 e Santa Rosa. Adaptado de Oliveira ot a!. (1991).
67
Tabela 2.22. Efeito da reinoculao na produtividade da soja e ocorrncia dos soro grupos nos
ndulos*. Segundo Vargas et aI., 1992b.
Tratamento
Produtividade
de gros
(kg.ha- I )
Testemunha
5019 + 587
5080
5079
Testemunha
5019+587
5080
5079
33
O
68
A**
D**
- - - - - 1988/89 25
20
73
- 1928
2074
2008
2028
- - - - - 1990/91 - - - - 3575
43
58
3763
1
3705
24
15
23
3744
~111
Produtividade
de gros
(kg.ha- 1)
D**
- - - - - 1989/90 - - - - - 3826
86
3497
82
3598
51
2
3799
44
19
----94
1
1
1991/92-----2321
92
2589
56
2612
57
2511
68
60
'"
.!:!
:I
Inoculollo
SEMIA 5080
SEMIA 5079
50
SEMIA 5019
CI"CI
"CI"0
o c
..
> o
:;:"CI
SEMIA 587
40
-o
IDO
Cl.g.
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30
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70
Clt
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o
OI
68
66
r-
64
r-
.62
60
240
250
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2.15. Concluses
Os estudos sobre a simbiose da soja tm mostrado grandes avanos, particularmente nas reas
de gentica e fisiologia do microssimbionte. No Brasil, a inoculao uma tcnica de baixo custo que
resulta na economia de milhares de dlares para o pas por ano. Em solos de primeiro ano de cultivo,
os ganhos no rendimento da soja pela inoculao so indiscutveis. Em solos j cultivados, os ganhos
geralmente so menos expressivos, mas da ordem de 5 % a 15 %. Alm disso, atravs da reinoculao
da soja, estirpes mais eficientes so introduzidas e a cultura deixa de retirar N do solo, bem como o
enriquece atravs dos restos culturais, podendo resultar em beneficios para as culturas posteriores. No
Brasil, existem diversas linhas de pesquisa promissoras em andamento, incluindo a seleo de estirpes
mais eficientes e competitivas e gentipos de soja com maior capacidade de fixao de N 2' Esses
estudos, associados melhoria na qualidade dos inoculantes comercializados no Brasil, podem resultar em aumentos expressivos na produtividade da soja.
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CAPTULO 3
3.1. Introduo
O feijo constitui uma das principais fontes de protena da dieta do brasileiro, sendo consumido por todas as classes de renda do pas. Entretanto, o consumo per capita caiu nos ltimos anos
(Vieira, 1988), refletindo uma queda no poder aquisitivo do consumidor, uma elevp.o do preo do
produto e uma reduo na oferta de feijo no mercado, provavelmente decorrente da reduo na produtividade da cultura.
Um dos fatores mais limitantes produtividade do feijoeiro a baixa disponibilidade de nutrientes, sobretudo fsforo e nitrognio, nos solos agrcolas. A adio de nitrognio na forma de fertilizantes cara e, em muitos casos, ineficiente, principalmente devido a perdas do elemento causadas
por prticas culturais inadequadas. As leguminosas evoluiram obtendo nitrognio da simbiose formada com bactrias fixadoras de nitrognio, os rizbios. Essa simbiose conhecida e explorada comercialmente h mais de cem anos, sendo a soja e os adubos verdes os exemplos de maior sucesso conhecidos.
H um descrdito crnico na capacidade de o feijoeiro fixar nitrognio atmosfrico suficiente
para expressar seu potencial produtivo, quando em associao com o Rhizobium, recomendando-se
indistintamente o uso de fertilizante nitrogenado para a cultura (EMBRAPA, 1993). Entretanto, resultados de vrios anos de pesquisa apontam na direo contrria, sugelindo que possvel que a cultura
do feijoeiro se beneficie, em nvel de campo, da fixao do nitrognio. A exemplo da cultura da soja,
se o uso da inoculao do feijoeiro se tornar uma prtica comum na agricultura, isto poder representar uma economia de divisas para o pas. Considerando-se uma rea plantada com feijo, de aproximadamente 5 milhes de hectares, e uma recomendao mdia de adubao nitrogenada com 60 kgde
N . ha- 1, os gastos com o fertilizante, sulfato de amnio ou uria, totalizam 320 ou 200 milhes de
dlares, respectivamente. Contudo, essa adubao na maiOlia das vezes no suficiente para que a
cultura atinj a seu potencial produtivo, pois a eficincia de uso do fertilizante nitrogenado pelo feijoeiro
muito baixa, o que faz com que seja necessria a aplicao de muito mais fertilizante.
Em contrapartida, considerando-se o preo (superestimado) de um dlar, por dose de inoculante,
e uma aplicao de uma dose de inoculante por hectare, os custos cairiam para cinco milhes de
dlares, representando uma grande economia de divisas que poderiam ser direcionadas para ouh'os
aspectos da melhOlia da produtividade agrcola, e ouh'os insumos exh'emamente importantes para a
cultura do feijo. Mesmo que a inoculao no seja suficiente para suprir todo o nih'ognio e seja
necessria a realizao de adubaes nih'ogenadas em cobertura, a eliminao ou reduo da adubao no plantio j representa uma economia a ser considerada.
Pesquisador, Ph.D., EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijo (CNPAF), Caixa Postal 179, CEP 74001-970. Goinia, CiO.
92
Neste captulo apresentado um resumo dos resultados de pesquisa sobre inoculao do feijoeiro,
e discutida a viabilidade do uso da inoculao na prtica.
3.2. O Microsimbionte
A pesquisa sobre o microsimbionte do feijoeiro teve um grande impulso nas dcadas de 80 e
90, e hoje se conhecem melhor algumas das propriedades e caractersticas desejveis desses organismos. s resultados mais relevantes so apresentados a seguir, de acordo com as caractersticas estudadas.
3.2.1. Nomenclatura/especificidade hospedeira
O feijoeiro foi sempre considerado uma leguminosa de nodulao especfica, tendo como
nicomicrosimbionte o Rhizobium phaseoli, posteriormente denominado R. leguminosarnm biovar
phaseoli (Rlp). Essa nova denominao resultou de esfudos genticos que mostraram que R.
leguminosarnm, R. tr(folii e R. phaseoli diferem apenas no plasmdio simbitico, tendo o restante de
seu genoma idntico. Por essa razo, as trs espcies foram agrupadas na espcie R. leguminosarnm,
identificando-se a especificidade por meio dos biovares viciae, trifolii e phaseoli, respectivamente
(Jordan, 1984). A transferncia do plasmdio simbitico entre os biovares lhes confere a habilidade de
n09-Jllao cruzada dos hospedeiros.
Rlp, porm, era um grupo muito heterogneo de isolados (Beynon & Josey, 1980; Roberts et
aI., 1980; Catteau et aI., 1984), tendo sido dividido em Tipos I e II, de acordo com a presena ou
ausncia, respectivamente, de mltiplas cpias (reiteraes) de seqncias de DNA ligadas fixao
de nitrognio e de acordo com a capacidade de nodular outros hospedeiros (Martinez et aI., 1985;
Flores et aI., 1987). Inicialmente, pensou-se que as mltiplas cpias desses genes representassem uma
vantagem evolutiva para Rlp (Martinez et aI., 1985; Romero et aI., 1988), mas depois observou-se que
as reiteraes esto relacionadas constante variabilidade de diversos fentipos de Rlp (SobernChavez et aI., 1986; Flores et aI., 1988).
Os estudos das diferenas entre os Tipos I e II de Rlp levaram Pinero et aI. (1988) a concluir
que a incluso de todos os isolados, capazes de nodular o fci.joeiro, em uma nica espcie ou biovar
uma irrealidade gentica, podendo ac~rretar erros de taxon01;riia. Os autores sugeriram ainda uma
classificao baseada em caractersticas genotpicas, e no fenotpicas. Em 1991, Martinez-Romero
et aI. apresentaram os resultados de laboriosos estudos que culminaram na separao dos isolados do
Tipo 11 emuma nova espcie, R. tropici (Rt), definindo assim um novo microsimbionte do feijoeiro
com a capacidade de nodular, tambm, a Leucaena. Com essa diviso, todos os isolados capazes de
nodular a Leucaena e o feijoeiro, e que no apresentam reiteraes gnicas, passaram a ser classificados como Rt, enquanto aqueles que nodulam exclusivamente o feijoeiro e apresentam reiteraes
foram classificados como Rlp.
Recentemente, os Rlp foram novamente subdivididos, dando origem espcie R. etli (Re;
Segovia et aI., 1993), que agrupa os lizbios que nodulam exclusivamente o feijoeiro e que foram
isolados dos solos do Mxico e das Amricas Central e do- Sul. Os rizbios que nodulam apenas o
feijoeiro e que foram isolados dos ~olos da Europa e Amrica do Norte continuam pertencendo
espcie Rlp. Em pouco tempo, portanto, o feijoeiro deixou de ser uma leguminosa de nodulao
93
especfica e se tornou uma das leguminosas de nodulao mais promscua, o que hoje confirmado
por saber-se que l;zbios isolados de diversas outras leguminosas so capazes de induzir a formao
de ndulos eficientes ou ineficientes no feijoeiro (Eardly et aI., 1985; Martinez et aI., 1985; Bromfield
& Barran, 1990; Hungria et aI., 1993; Laguerre et aI., 1993). As principais caractersticas de cada uma
das espcies so apresentadas na Tabela 3.1.
Tabela 3.1. Principais caractersticas das espcies de Rhizobium definidas como microsimbiontes
do feijoeiro comum.
Espcie de
Rhizobium
Origem
Hospedeiros
Caractersticas
Ecolgicas
R. l. bv. phaseoli
Europa e parte do
hemisfrio norte
Feijo
R. etli
Mxico e centros
de origem do feijo
Solos tropicais
Feijo
R. tropici
Feijo
Leucaena
94
inoculao do feijoeiro, em condies tropicais (Hungria et aI., 1993). Os programas atuais para
avaliao e seleo de estirpes buscam, portanto, isolados de Rt com alta eficincia na nodulao e
fixao de nitrognio em associao com o feijoeiro.
Tabela 3.2. Nitrognio total fixado por diferentes estirpes de Rhizobium spp., recomendadas para a
inoculao do feijoeiro, em associao com plantas de feijo (cv. Negro Argel), crescidas em vasos de Leonard, no CNPAF.
.
N total fixado (mg. pl -1)
Estirpe
abr./82
jun./82
out./82
jan./83
dez./83
dez./84
jan./85
maio/85
SEMIA476
74
88
NT *
NT
NT
NT
NT
SEMIA487
91
67
58
NT
NT
NT
NT
NT
SEMIA491
52
39
NT
NT
NT
NT
NT
SEMIA492
111
28
126
63
127
13
23
218
SEMIA4002
99
89
127
59
160
NT
NT
NT
SEMIA4021
87
106
114
NT
NT
NT
NT
NT
SEMIA4026
110
69
41
NT
NT
NT
NT
NT
* NT =
no testada.
Uma das caractersticas que conferem maior eficincia simbitica a certos rizbios a capacidade de recic1ar, atravs do sistema "uptake hydrogenase" (Hup; Schubert & Evans, 1976), o hidrognio evoludo durante a fixao de nitrognio. Esse sistema oxida o hidrognio produzido e os eltrons
recuperados pela reao so devolvidos cadeia de transporte, consrvando energia (Emerich et aI.,
1979). Essa conservao de energia pode proporcionar um aumento na eficincia da fixao de nitrognio (Evans et aI., 1985). Apesar de h alguns anos Piha & Munns (1987) terem sugerido que se
buscassem rizbios capazes de reciclar hidrognio para inocular o feijoeiro, s recentemente foi realizado um trabalho em que se identificaram combinaes entre gentipos de feijoeiro e rizbios que
expressam a caracterstica Hup (Navarro et aI., 1993). Esses autores, entretanto, observaram um efeito
significativo da variedade de feijo na atividade Hup, sugerindo que a planta exerce controle sobre a
expresso dessa caracterstica bacteriana, o que pode levar a diferentes nveis de eficincia simbitica,
dependendo da combinao estirpe x variedade. Esse tipo de controle foi observado tambm em
ervilha (Dixon, 1972), soja (Gibson et aI., 1981) e caupi (van Berkun, 1990). Finalmente, em trabalho
recente, van Berkun et aI. (1994) demonstraram que o sistema Hup uma caracterstica marcante de
Rt, sendo encontrada com baixa freqncia em Rlp e Re. Isto refora a necessidade de se buscarem
melhores estirpes de Rt para emprego em inoculantes, e de testes dessas estirpes, a nvel nacional, em
combinao com as diferentes variedades de feijo cultivadas.
95
Tabela 3.3. Nmero de isolad6S de Rhizobium spp., isolados de ndulos espontneos de feijoeiro,
coletados em diferentes localidades nas regies produtoras de feijo no Estado de Gois,
1982.
Localidade
Nmero de Isolados
Anicuns
40
45
Catura
40
Ceres
14
Firminpolis
39
Gois
30
Inhumas
49
Itabera
39
Itapuranga
71
Itau
48
Jaragu
34
Nazrio
10
Uruana
31
Total
490
96
97
com o objetivo de se estabelecerem modelos matemticos que permitissem predizer a resposta de uma
leguminosa inoculao levando em considerao a populao do solo (Thies et aI., 1991a, b). De
acordo com os dados, a resposta das leguminosas inoculao variou com o local e a espcie. A
inoculao resultou em aumento significativo da produtividade do feijoeiro em apenas 50% das vezes,
principalmente em solos com baixa populao de rizbios especficos 100 . g-l solo) para a cultura
(Thies et aI., 1991a). Em trabalho subseqente, os autores observaram que, na ausncia de rizbios
naturalizados no solo, a magnitude da resposta inoculao diretamente proporcional disponibilidade de N no solo, e desenvolveram um modelo matemtico para prever a resposta inoculao,
levando em conta a populao nativa de rizbios e o N do solo (Thies et aI., 1991b).
Como dito anteriormente, muito difcil encontrarem-se plantas de feijo sem ndulos. Alm
disso, o carter de promiscuidade nodular do feijoeiro mais uma barreira a ser transposta para que a
inoculao- tenha sucesso. preciso, portanto, que num primeiro passo na busca de inoculantes mais
eficientes, seja feito um levantamento qualitativo e quantitativo da populao naturalizada de rizbios;
preciso que se conhea bem o "inimigo" para elaborar a melhor estratgia numa batalha. Os resultados conhecidos, por exemplo, no deixam claro se Rt intrinsecamente mais ou menos competitivo
que Rlp/Re, pois so contraditlios (Martinez-Romero & Rosenblueth, 1990; Streit et aI., 1992; Straliotto
et aI., 1992). A competitividade relativa entre Rt e Rlp/Re pode, tambm, ser alterada de acordo com
as condies do solo (Wolff et aI., 1991). Amaioria dos levantamentos indica que 90% da populao
dos solos onde o feijoeiro cultivado composta por Rlp ou Re (Martinez et aI., 1985, 1988; N.M.H.S,
comunicao pessoal), mas ainda faltam dados sobre levantamentos de ndulos provenientes de plantas cultivadas em solos onde nunca houvera feijo. Provavelmente sero necessrias estratgias diferentes caso a inoculao v ser feita em um solo onde predomina Rt ou Rlp/Re.
98
Vargas & Graham, 1988), tendo sido mais competitivas na nodulao do feijoeiro cultivado sob condies de acidez elevada (Ramos et aI., 1987; Vargas & Graham, 1989; Wolff et aI., 1993). Esses resultados reforam a potencialidade da inoculao do feijoeiro com estirpes de Rt nos solos tropicais, e
justificam a busca dessas estirpes para a composio do inoculante comercial.
Alm dos efeitos nocivos da temperatura e acidez elevadas, os rizbios inoculados esto sujeitos a outros tipos de estresse, como deficincia hdrica e salinidade do solo, e a estresses biticos
como, por exemplo, a presena, no solo, de antibiticos ou outras substncias txicas produzidas por
membros da microflora do solo. Em relao salinidade, Santos et aI. (1990) observaram resposta
inoculao do caupi (Vigna unguiculata) com estirpes de Bradyrhizobium sp. previamente selecionadas
como tolerantes a alto nvel de salinizao. Essas observaes sugerem que a inoculao vivel, e as
respostas positivas, quando se empregam as plantas e bactrias apropriadas para cada condio. O
papel mais importante da pesquisa identificar essas combinaes.
99
Cultivar
Hbito de
Crescimento
Idade de
Florao
(dias)*
Peso de
Ndulos
(mg. pl-I)**
Ativ. Red. de
Acetileno
(flmol C2H 4 . pl-I . h- I)**
P635
42
8,8
0,8
P536
41
73,4
10,0
P417
II
55
23,1
7,5
P561
II
43
69,1
8,8
P589
III
60
46,9
8,5
P498
III
50
118,4
32,2
P717
IV
48
99,3
17,4
P590
IV
66
545,6
37,7
* Tempo at que 50% das plantas apresentassem pelo menos uma 110r abelia.
** Valores mximos obtidos para cada parmetro dUrlUlte o ciclo.
100
21
.I
.c.
15
.I
o.
9
N
25
39
TEMPO
67
81
PLANTIO (dias)
101
Tabela 3.5. Variabilidade na fixao de nitrognio por cultivares de feijo testadas em diversas localidades. Segundo Hardarson et alo (1993).
Localidade
Ano
NDAr*
(%)
Fixao
(kg. ha- l )
ustria
1987
27-67
25-165
29
1987
1987
12-25
12-25
4-12
11-53
17
7
Chile
1987
1988
38-60
27-60
27-62
25-115
21
12
Colmbia
1985
32-47
18-36
Guatemala
1989 (Vero)
1989 (Inv.)
69-73
22-57
92-125
12-50
10
10
Mxico, Irapuato
Colima
1987
1988 (Inv.)
5..58
O-50
7-108
0-70
20
17
Peru
1986 (Inv.)
1988 (Vero)
24-56
l3-56
15-59
7-81
20
22
Brasil,
Goinia
Piracicaba
N de cultivares
102
tanto, Hansen et aI. (1993a) observaram que a remoo dos frutos em formao, de plantas de feijo,
a partir dos 37 dias aps o plantio, estimulou a respirao nodular e no afetou a eficincia dos ndulos, sugerindo que a atividade simbitica no foi negativamente afetada pela competio por carboidratos
entre os ndulos e os frutos. Os autores conc1uiram ainda que a precocidade da reproduo no ciclo do
feij oeiro no parece ser responsvel pela performance inadequada de fixao de nitrognio no campo.
Em um estudo do desenvolvimento da fixao de nitrognio pelo feijoeiro, Peia-Cabriales et
aI. (1993) observaram que a maior taxa de assimilao de nitrognio ocorreu durante a fase reprodutiva,
coincidindo com o perodo em que a quantidade e a atividade dos ndulos da coroa da planta decresceram. Os autores sugeriram que essa contradio poderia ser explicada pela fixao ocorrida nos
ndulos formados nas razes secundlias do feijoeiro (nodulao mais tardia), que selia essencial para
suprir a planta com N, o que foi posteriormente confirmado por Hardarson et aI. (1989) e Wolyn et aI.
(1989).
Uma estratgia para melhorar a fixao de nitrognio pelo feijoeiro seria a extenso do perodo
de atividade fixadora, buscando-se combinaes de planta e bactria capazes de suportar uma nodulao
efetiva precoce e de manter os ndulos em atividade por mais tempo. A nodulao efetiva precoce j
foi observada e apontada como um fator que aumenta a fixao de nitrognio pelo feijoeiro por diversos autores (Hungria & Thomas, 1987; Barradas & Hungria, 1989; Barradas et aI., 1989; Chaverra &
Graham, 1992; Kipe-Nolt et aI., 1993; Kipe-Nolt & Giller, 1993). Se os ndulos formados nas razes
secundrias tm papel importante na fixao de nitrognio pelo feijoeiro, cabe pesquisa determinar
maneiras de fazer com que o inoculante atinja essas razes, garantindo assim que esses ndulos sejam
formados por estirpes mais eficientes que as do solo.
3.3.3. Nmero de ndulos
Em um trabalho pioneiro, Dbereiner (1966a) demonstrou que havia uma correlao positiva
e significativa entre a quantidade de tecido nodular ativo e a quantidade de nitrognio acumulado em
plantas de feijo dependentes do N fixado. Posteriormente, Wadisisuk & Weaver (1985) observaram
a mesma correlao em caupi. Essas observaes sugerem que uma estratgia que resulte em mais
ndulos por planta pode contribuir com maior fixao de nitrognio para a cultura. Recentemente,
Pereira et aI. (1993) demonstraram ser possvel aplicar tcnicas convencionais de melhoramento gentico para obterem-se plantas de feijo com maior nodulao, e que o ganho gentico em nmero de
ndulos acompanhado por ganho na quantidade de nitr'ognio fixado (Tabela 3.6). Os autores
sugerem que um dos benefcios advindos da maior suscetibilidade nodulao seria a formao de
maior nmero de ndulos nas razes secundlias que, segundo Wolyn et aI. (1989), contribuem com
uma grande proporo do N fixado pelo feijoeiro.
A correlao entr'e a maior nodulao e o aumento na fixao de nitrognio pelo feijoeiro,
entretanto, no linear. Hansen et aI. (1993) observaram que uma mutante supernodulante de feijoeiro
apresentou uma massa nodular duas vezes maior e um nmero de ndulos seis vezes maior que os
parentais. Entr'etanto, a fixao de nitrognio foi quase igual, sugerindo que a supernodulao resulta
em formao de ndulos menores, com menor eficincia relativa. So necessrios estudos mais detalhados das plantas com maior nmero de ndulos, no sentido de se quantificar, no campo, sua fixao
de nitrognio e a contribuio dessa fixao para o aumento da produtividade da cultura.
103
Tabela 3.6. N odulao de plantas de feijo aps trs ciclos de seleo visando o aumento do nmero
de ndulos. Segundo Pereira et aI. (1993).
CiclolPopulao*
NNd
Peso Nd-rng/pl
N Fixado
(% Cont.)**
(%Cont)
(kg . ha- 1)
Co
102 (100)
134 (100)
43
94 (92)
138 (103)
ND
130 (127)
153 (114)
ND
158 (100)
226 (100
ND
Populao Total
162 (102)
269 (119)
ND
Indiv. Selecionados
235 (149)
304 (135)
44
111 (100)
151 (100)
ND
Populao Total
175 (158)
210 (139)
ND
Indiv. Selecionados
234 (211)
242 (160)
53
Controle (Med.pais)
Populao Total
Indiv. Selecionados
C1
C2
co' C l e C2 so ciclos de seleo correspondentes populao basal (Co) e dois ciclos de recombinaes atravs de intercruzamentos (C l e C2 ).
104
Adubao*
Linhagem
NORH 54***
PK
902 b
Variedade
Apor
r,
2157
NPK
1314 ab
2008
NPK+N
1578 a
2258
* PK = 80 kg de P20 S ' h e 60 kg de K20 . lJa~; NPK = PK + 30 kg de N . ha~ no plantio; NPK + N = NPK + 30 kg de N . h em cobertura.
** Nmeros seguidos pela mesma letra, na mesma coluna, so significativamente diferentes de acordo com o teste de Tukey (a. = 0,05).
*** Linhagem llo"llodulallte de feijo.
105
106
no publicados), sugerindo a possibilidade de se estar trabalhando com uma variedade de feijo capaz
de suportar nodulao e fixao de nitrognio satisfatrias na presena de N combinado. Mais estudos so necessrios para que essas situaes possam ser elucidadas.
Finalmente, foi observado por Sanjuan & Olivares (1989) que um dos plasmdios da estirpe
GR4 de R. meliloti (Rm) carrega uma seqncia de DNA denominada nfe (noduleformation efficiency),
cuja expresso est sob controle da expresso da regio nffA (ligada sintese da dinitrogenase - ver
captulo anterior) que, por sua vez, regulada pela concentrao de N no meio. A expresso de nfe
aumenta a competitividade nodular da estirpe GR4. Apesar de no ter sido encontrada em outras
estirpes de Rm, essa regio gentica oferece uma fascinante idia para a manipulao da competitividade
de outras estirpes de Rhizobium. Por exemplo, bactrias que contenham a regio rife e que sejam
capazes de nodular e fixar nitrognio normalmente na presena de N combinado, podero ter vantagens competitivas sobre os rizbios do solo, permitindo resposta inoculao em solos com populao estabelecida. Essa linha de pesquisa merece mais ateno.
107
relativo sucesso na cultura do feijo. Entretanto, faltam resultados concretos de trabalhos de pesquisa
para que essa prtica se torne uma recomendao para a cultura.
A adubao recomendada para a cultura do feijo no Brasil pode ser generalizada em cerca de
250 kg de uma frmula do tipo 4-30-16 por hectare, adicionada de zinco, plincipalmente nos solos de
cerrado, e de outros micronutrientes de acordo com as necessidades detectadas pela anlise do solo. A
adubao nitrogenada recomendada para o feijoeiro , em mdia, de 60 kg de N . ha- 1, sendo normal
a aplicao de metade da dose no plantio e a outra metade em cobertura, dividida ou no em duas ou
mais parcelas. A resposta da cultura a essa adubao vai depender da cultivar plantada. Em diversos
experimentos recentes, por exemplo, constatou-se que a cultivar Apor no parece responder adubao nitrogenada ou, se responde, o incremento na produo em relao s plantas noduladas por estirpes nativas ou pelo inoculante questionvel, muitas vezes no compensando a adubao (Tabela
3.8.). Por essa razo, tem-se recomendado que seja eliminada a adubao nitrogenada no plantio em
favor da inoculao das sementes, fazendo-se uma adubao de cobertura durante a fase vegetativa
(Figura 3.2), caso a cultura apresente sintomas de deficincia de nitrognio. No caso de adubos
formulados, j contendo nih'ognio, os estudos preliminares indicam que essa dose de N no alta o
suficiente para inibir a formao dos ndulos, mas h necessidade de mais estudos para confirmar tais
resultados,
Tabela 3.8. Produtividade da cultivar de feijo Apor, em ensaios em rede realizados no Estado de
Gois, plantio da seca, 1993.
Produtividade (kg . ha- 1)*
Localidade
SI Inoculao
CI Inoculao
NPK**
Pirenpolis
2181
2136
2154
Goianira
2094
2113
2252
*
**
108
2500
Controle
Fase vegetativa
ElJFlorao
2000
,-..
cu
.=
'"'Sll
o
-=
........-=cu
....
-==
...=
1500
1000
500
O~.....L_-
Rio Tibagi
Carioca
WBR22.34
Cultivar
Figura 3.2. Produtividade do feijoeiro inoculado, resultante da realizao de adubao nitrogenada
em cobertura, em diferentes fases do ciclo da cultura.
Em relao aos micronuhientes, o molibdnio tem papel vital na fixao de nih'ognio pelos
rizbios e na assimilao do nitrato absorvido do solo pela cultura (Marschner, 1986). A maioria dos
solos dispe de teores adequados de molibdnio, porm as interaes do elemento com a acidez do
solo muitas vezes o tornam indisponvel ao feijoeiro. Recente trabalho realizado em Minas Gerais
(Vieira et aI., 1992) demonsh'ou que a aplicao foliar de 20 g de Mo . ha- 1 resultou em aumentos
significativos da produtividade do feijoeiro inoculado, substituindo parcial ou completamente a adubao nitrogenada nas condies do ensaio. Entretanto, esses resultados no podem ser generalizados, pois as respostas vo depender das condies de cada local de cultivo, Com efeito, em ensaios em
rede nacional para velificar a resposta da cultura adubao foliar com molibdnio, somente em
Viosa (MG) e no Esprito Santo tm sido observadas respostas positivas (dados no publicados).
Mais estudos so necesslios antes que se possa recomendar essa prtica para a cultura.
3.4.2. Acidez do solo
O feijoeiro, por ser uma planta sensvel acidez do solo, no cresce nem produz bem em solos
cidos (Moraes, 1988). Este tipo de solo, alm das deficincias em Ca e Mg, pode apresentar outros
problemas, como nveis altos de alumnio e mangans. As informaes a respeito da tolerncia do
feij oeiro acidez so relativamente escassas. H relatos que o pH timo para o crescimento da planta
109
situa-se entre 5,5 e 6,7 (Malavolta, 1976; Munns & Fox, 1976), e que o feijoeiro intolerante a nveis
de AI trocvel acima de 3 ppm (Ruschel et aI., 1968; Abruna et aI., 1975). Entretanto, existem diferenas entre cultivares de feijoeiro quanto tolerncia ao AI (Foy et aI., 1967; Spain et aI., 1975; Miranda
--& Lobato, 1978), e entre os rizbios quanto tolerncia ao pR, ao AI e ao Mn (Graham & Parker,
1964; D6bereiner, 1966; Graham et aI., 1982; Cunningham & Munns, 1984; Karanja & Wood, 1988a,
b; Vargas & Graham, 1988).
Dados de levantamentos de nodulao espontnea em feijoeiros cultivados no Estado de Gois
demonstram que a nodulao mais abundante quando as plantas so crescidas em pR mais prximo
da neutralidade (Figura 3.3). Essas observaes sugerem que o pR do solo afeta a quantidade de
rizbios disponveis para nodular a planta hospedeira, o que pode ter implicaes na competitividade
do inoculante, como demonstrado por Wolff et aI. (1993).
A calagem reduz os efeitos da acidez e das toxicidades de AI e Mn sobre a nodulao do
feijoeiro (D6bereiner, 1966b; Morales et aI., 1973; Graham et aI., 1980), alm de beneficiar a cultura
pela adio de Ca e, s vezes, Mg. A recomendao de calagem deve ser baseada na anlise do solo da
rea de cultivo. Em casos onde no se realiza a cal agem, a escolha da variedade de feijo e do inoculante
mais apropriado se torna o passo mais importante para que se obtenha uma produtividade razovel.
80~------------------------------------------------------------~
60
-==
"CI
. 40
"CI
=,
Z
20
o
5
6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 7.3 7.5
pH do solo
110
111
....
Q,I
=
E
Q,I
Sacarose a 20%
Q,I
.-
~
Q,I
.--=
;;..
'C':S
;;..
rIl
cu
'CI.I
Y
CII
10
112
Para fazer a inoculao das sementes do feijoeiro mistura-se uma dose de 250 g de inoculante
em um copo (do tipo americano) com gua a que se adicionaram duas colheres de sopa de acar
cristal, gerando uma lama preta. Essa lama , ento, aplicada a 40 kg de sementes, misturando-se bem
para que as sementes fiquem completamente revestidas pelo inoculante. A inoculao pode ser feita
sobre o cho (cimento) limpo, sobre uma lona, em sacos plsticos ou, preferencialmente, em um
tambor de eixo descentralizado, sempre sombra. As sementes inoculadas devem ser deixadas secar
sombra, e seu plantio deve ser feito imediatamente aps a secagem, no mesmo dia da inoculao.
Quando se faz a inoculao das sementes para plantio em reas onde nunca se utilizou o inoculante,
recomenda-se uma dose de 500 g de inoculante para cada 40 kg de sementes. No caso de inoculao
e tratamento das sementes com defensivos, as sementes devem ser tratadas com os produtos qumicos
antes da inoculao. Para mais detalhes sobre os cuidados com o inoculante e a inoculao, veja o
captulo anterior.
3.5. Concluses
Os estudos sobre a simbiose do feijoeiro progrediram bastante nos ltimos anos, sobretudo no
que diz respeito definio taxonmica dos microsimbiontes. O fato de se ter conhecimento da
inadequao dos inoculantes previamente empregados para o feijoeiro significa que praticamente todo
o h'abalho ter que ser refeito, no sentido de se aprender mais sobre os diversos aspectos da simbiose
do feijoeiro com o Rhizobium tropici, o microsimbionte preferencial para as nossas condies. Alm
disso, necessrio que se identifiquem novas estirpes mais eficientes e competitivas que possam ser
empregadas nos inoculantes. As variedades modernas de feijo apresentam maior aptido produtiva e
melhor adaptabilidade para a produo de gros nas diferentes regies produtoras de feijo no Brasil.
Apesar dessas vmiedades geralmente responderem adubao nitrogenada, alguns resultados sugerem que elas tm boa capacidade simbitica, merecendo portanto mais estudos. A conscientizao
atual da maioria dos produtores sobre a necessidade de se tecnificar a cultura do feijoeiro tem proporcionado pesquisa a oportunidade para a realizao de testes de inoculao nas mais diversas condies, inclusive com irrigao complementar e em vrzeas, onde antes no se cultivava feijo. Num
futuro prximo a pesquisa dever ser capaz de apontar as melhores combinaes enh'e parceiros
simbiticos para que se possa fazer da inoculao do feijoeiro uma prtica to comum e rentvel
quanto a inoculao da soja.
3.6. Referncias Bibliogrficas
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CAPTULO 4
FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO EM ESPCIES ARBREAS
Ftima M. S. Moreira 1
4.1. Introduo
Espcies vegetais que formam simbiose com microrganismos fixadores de N2 (EFN) podem
dispensar total ou parcialmente a adubao nitrogenada e ainda contribuir para outras espcies consorciadas ou em sucesso, garantindo a auto-sustentabilidade do ecossistema com relao ao N. As
EFN tm, em geral, maior concentrao de N nos tecidos do que espcies no-fixadoras (Tabela 4.1).
No caso das espcies arbreas, a maior concentrao de N associada maior produo de biomassa
(folhas, galhos, razes, ndulos etc.) possibilita uma contribuio significativamente maior de matria
orgnica para o solo, com baixa relao C:N.
Alm dos efeitos benficos diretos da matria orgnica sobre a frao mineral do solo (estabilizao dos agregados, maior reteno de gua etc.) evitando sua degradao, ocorre aumento da
disponibilidadade d~ N no ecossistema que pode ser utilizado por diversas espcies de microrganismos e de plantas, aumentando a diversidade biolgica (Parrota, 1992; Maschio et aI., 1992). Por outro
lado, a maior extenso do sistema radicular, tanto a nvel horizontal como vertical, permite o retorno
ao sistema produtivo' de nutrientes perdidos atr-avs da lixiviao para camadas mais profundas do
solo.
Entr-e as diversas espcies arbreas fixadoras de N2 , existe ainda uma ampla variabilidade de
utilizao econmica, como: madeira, forragem, adubao verde, lenha, flora agrcola, gomas, celulose e papel, carvo, alimentao humana e animal, cercas vivas, produtos medicinais e aromticos,
substrato para produo de cogumelos comestveis, quebra-ventos etc. (NAS, 1979; Nair et aI., 1984;
Sharma & Madan, 1993). Deve-se ressaltar tambm o enorme potencial ainda no explorado de vrias
espcies nativas. Todas estas caractersticas tornam as rvores que fixam N2 atr-avs de simbioses e~
importantes componentes de sistemas naturais, agroflorestais, agrosilvipastoris, "alley cropping" etc.
A famlIa Leguminosae, por exemplo, representa uma parcela significativa na composio
florstica de vri.os ecossistemas naturais, como a Floresta Amaznica (Ducke, 1949), o cerrado brasileiro (Kirkbride Jnior, 1984) e remanescentes da Mata Atlntica (Oliveira Filho et aI., 1994). Vrios
gneros e espcies nativas destes ecossistemas so capazes de formar simbiose com bactlias fixadoras
de N 2 dos gneros Rhizobiw/l e Bra(0)rhizobium (Allen & Allen, ,1981; Faria et aI., 1989; Moreira et
aI., 1992).
A biodiversidade das florestas nativas, principalmente das tropicais, pode ser considerada um
recurso material de valor intestimvel. Sua preservao garantir a geraes futuras uma fonte de
recursos genticos para os mais diversos fins. Neste contexto, a crescente demanda mundial por
celulose, papel, lenha, carvo e madeira no poder mais ser suprida pelo extrativismo predatrio, mas
sim por reflorestamentos de acordo com os princpios do desenvolvimento sustentado. A produo de
IProfessoia Adjunta, Ph.D., Escola Supelior de Agricultura de Lavras (ESAL), Caixa Postal 37, EP 37200-000, Lavras, MG.
122
alimentos, plincipalmente nos pases subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, no dever mais seguir o modelo "monoculturas com altas doses de adubos e outros insumos". Vrios resultados indicam que possvel passar da falcia para a prtica. rvores fixadoras de N 2 esto enh"e as importantes
alternativas.
Tabela 4.1. Teor foliar de nitrognio em espcies arbreas que formam ou no simbioses fixadoras
de nitrognio.
Espcie fixadora de N 2
%N
Referncia
Alnus glutinosa
3,84
Beching (1968)
Gliricidia sepium
3,74
Erythrina sp.
3,52
Albizia saman
3,20
Inga edulis
3,18
Leucaena leucocephalla
3,94
Sesbania rostrata
5,60
S. sesban
4,30
Mdia
3,92
Espcie no-fixadora de N 2
%N
Referncia
Brachystegia boehmii
1,84
H6gberg (1986)
B. microphylla
2,24
H6gberg (1986)
2,04
H6gberg (1986)
Diplorhynchus condylocalpum
1,30
H6gberg (1986)
Eucalyptus saligna
0,71
Haag (1983)
Cordia trichotoma
1,75
Haag (1983)
1,72
Haag (1983)
Pinus elliottii
1,23
Haag (1983)
Mdia
1,60
Julbernardia
Araucal'ia
glob~flora
angust~rolia
123
N de espcies
examinadas
Caesalp in ia ideae
123
27
22
Mimasaideae
107
78
73
Papilianaideae
158
107
68
Vasconcelos & Almeida (1979); Sylvester-Bradley et a!. (1980); Magalhes et ai. (1982); Faria et a!. (1984a, b); Magalhes & Fernandes (1984);
Magalhes (1986); Matos (1986); Magalhes & Silva (1986/87); Faria et a!. (1987); Moreira et a!. (1992); Souza et a!. (no prelo); Barbel; &
Moreira (1994).
124
Gnero no-noduIfero
Gnero com
informaes conflitantes
Abarema (M)
Affonsea (M)
Ateleia (P)
Bowdichia (P)
Cadia (P)
Cedrelinga (M)
Centrolobium (P)
Cyclolobi'Lllrl (P)
Dalhstedtia (P)
Diplotropis(P)
Etaballia (P)
Gagnebina (M)
Marmaroxylon (M)
Melanoxylon (C)
Moldenhaurea (C)
Platycialnus (P)
Plathymenia (M)
Plathypodium (P)
Poecilanthe (P)
Pseudopiptadenia (M)
Pseudosamanea (M)
Vouacapoua (C)
AcrocaJ'pus (C)
Aldina (P)
Amburana (M)
Apulia (C)
Bacoa (P)
Cenostigma (C)
Dinizia (M)
Elizabetha (C)
Exostyles (M)
Heterostemon (C)
Goniorrachis (C)
Grazielodendron (P)
Le~ointea (P)
Luetzelburgia (P)
Monoptel)lX (P)
Poeppigia (C)
Pterodon (P)
Sweetia (P)
Taralea (P)
Tetrap Ieura (M)
Vatairea (P)
Vataireopsis (P)
Acosmium (M)
Brownea (C)
Delonix (C)
Dialium (C)
DicOlynia (C)
Hym.enaea (C)
Myrocalpus (P)
Myroxilon (P)
Phyllocalpus (C)
Schizolobium (C)
Zollernia (P)
>I<
"
Sylvester-Bradley et a!. (1980); Magalhes et a!. (1982); Magalhes (1986); Faria et a!. (1984b, c); Faria et a!. (1987a); Moreira et a!. (1992);
Magalhes e Fernandes (1984); Bonetti et a!. (1984); Souza et a!. (submetido); Faria et a!. (1989); Barberi e Moreira (l994).
cQ)
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Cassiinae
C
Dialiinae
C
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L-
Acacieae &
Ingeae M.
M.imoseae
M
f
Detarieae
C
Grupo de Dimorphand ra
C
Ceratoni inae
C
Amherstieae
C
"-
/
\ Grupo de Gled itsia
tribos tropicais
avanadas
aliana genistide
P
Grupos'. d.e Peltophorum & \
Caesalplnla C.
p\
/
complexo galegide
P
8auhini inae
C
Grupo de Sclerolobium
C
srie epulvinada
temperada
Pf
Sophoreae
P
/
Cercidinae
C
V>
126
Nas Papilionoideae, a subfamlia com maior disperso e uma das mais intensivamente estudadas, o modelo de divergncia mais fcil de se traar. O modelo proposto por Polhi11 (1981) (Figura
4.2) bastante aceito por outros autores (ltwin, 1981). As Swartizeae esto na linha divisria entre
Caesalpinioideae e Papilionoideae. Polhill et aI. (1981) assinalam que a ocorrncia de ndulos
radiculares nas Swartizeae, alm de outras caractersticas, indica que elas esto melhor enquadradas
em Papilionoideae do que em Caesalpinioideae. Estima-se que 97% das Papilionoideae so capazes
de nodular. A irradiao das Papilionoideae complexa, existindo um reconhecimento geral dos
vrios componentes principais, com Sophoreae constituindo o grupo base da divergncia, sendo o
cenh'o da subfamilia dominado pelo enorme "complexo galegoide"(as tribos Galegae e Dalbergieae).
As Galegae podem ser separadas em outras tribos herbceas temperadas (Loteae, Viceae, Trifolieae,
etc.) - a srie apulvinada. A srie restante, pulvinada, predominantemente h'opical e pode ser subdividida em um centro - Tephrosieae e Robinieae - e vrias tr-ibos mais avanadas, com uma tendncia
regional (exceto a pantropical Phaseoleae) em direo tanto ao Velho como ao Novo Mundo. Separada de todos esses grupos est a "Aliana genistide", compreendendo as tribos Genisteae e Podalyrieae,
divididas em vrias tr-ibos regionais centr-alizadas em reas com clima mediterrneo.
As supostas divergncias de Leguminosae em geral e de Papilionoideae (Polhill et aI., 1981;
Polhi11, 1981) no implicam em que conceitos evolucionlios tenham alcanado o estgio de proposio de uma rvore filogentica. No entanto, representam os dados mais atualizados de divergncia
para a familia e a subfamilia como um todo.
19 LOTEAE
23 TRIFOLlEAE .
22
8 INDIGOFEREAE
.
. 1/ PSORALEEAE'
CICEREA~7 CARMICHAELlEA~
21
VICIEA~
10 PHASEOLEAE
9 QESMODIEAE
20 CORONILLEAE
"
12 AMORPHEAE
/ /
16 GdLEGEAE
13 SESBANIEAE
..
7 ROBINI'E-14 AESCHYNOMENEAE
18 HEDYSAREAE/"
/
~--15 ADESMIEAE
6 TEPHROSIEAE
29 CROTALARIEAE 5 ABREAE _____
24 BRONGNIARTIEAE
~28 LlPARIEAE_
32GENISTEAE
"-31
~6 BOSSIAEEAE
27 PODALYRIEAE
25 MIRBELlEAE
THERMOPSID~E
~4
DALBERGIEAE
1 SWARTZIEAE
Figura 4.2. Suposta divergncia dos principais grupos de Papilionoideae, segundo Polhill (1981).
.....
128
129
130
taxonmica dos isolados de crescimento rpido da maioria das espcies arbreas tambm no est
definida; com exceo de algumas estirpes de crescimento rpido, isoladas de Leucaena e Mimosa,
classificadas como R. loti. Isto dificulta o estudo e a obteno de inoculantes especficos eficientes
e a recomendao de inoculantes para espcies afins. Jordan (1987) assinalou que as estirpes da
"miscelnea caupi" representam um grupo altamente heterogneo e divergente de microrganismos,
dentro do qual as relaes taxonmicas no esto ainda bem definidas. de se esperar, portanto, que
todo o gnero Bradyrhizobium seja reorganizado nos prximos anos. J em 1976, Graham chamava
ateno ao fato de que a classificao de rizbio, ento vigente, seria gradualmente modificada
medida que um maior nmero de estirpes, principalmente aquelas provenientes do grande reservatrio
de leguminosas tropicais, fosse examinado.
Trabalhos posteriores publicao da ltima edio do Manual de Bergey demonstr"aram, com
o auxlio de tcnicas mais sofisticadas e precisas, que mesmo a tribo Papilionoideae uma fonte de
lizbio com grande vmiabilidade a ser explorada. Recentemente, um novo gnero e cinco novas
espcies de Rhizobium foram descritas: Azorhizobium caulinodans, para rizbio de crescimento lento,
que forma ndulos no caule de Sesbania ros-ata (Dreyfus et aI., 1988); R. ji-edii, para rizbio de
crescimento rpido, que nodula eficientemente variedades de soja selvagem da China (Scholla &
Elkan, 1984; Chen et aI., 1988); R.hualatii (Chen et aI., 1991); R. galegae, para lizbio de crescimento
rpido, isolado de Galega spp. (Lindstr6m, 1989); e R. tropici e R. etli, para estirpes isoladas de
Phaseolus vulgaris em reas tr"opicais (Martinez-Romero et aI., 1991; Segovia et aI., 1993). Est
sendo proposto, ainda, um novo gnero - Photorhizobium - com uma nica espcie - P thompsonianum
- o primeiro rizbio fotossinttico, isolado de ndulos caulinares de Aeschynomene indica (Eaglesham
et aI., 1990) e uma nova espcie de Bradyrhizobium - B. elkanii - para estirpes isoladas de soja
(Kuykendall et aI., 1992).
Atr"avs dos levantamentos da capacidade de nodular e/ou fixar nitr"ognio de espcies de
leguminosas florestais da regio amaznica, realizados pelo SMS/DCAlINPA2 , e da Mata Atlntica,
realizados pelo CNPAB/EMBRAPA3, acumulou-se uma coleo de estirpes de rizbio isoladas de
uma ampla vmiedade de gneros e grupos de divergncia de Leguminosae. Numa tentativa de definir
a posio taxonmica dessas estirpes foram estudadas suas caractersticas culturais, seus padres de
protena celular total, obtidos por SDS-PAGE, e a relao entre essas caractersticas e a filogenia de
LegUlninosae, comparando-as s espcies e gneros de rizbio j descritos na literatura (Moreira,
1991; Moreira et aI., 1993). Os resultados demonstr"aram uma ampla diversidade de tipos culturais
entre a maioria dos gneros e grupos de divergncia de Leguminosae, em relao ao tempo de crescimento, modificao do pH do meio de cultura e quantidade de goma produzida. Em todos os grupos
das trs subfamlias houve predominncia de estirpes de crescimento lento (CL), ocorrendo em menor
proporo as estirpes de crescimento rpido (CR), intermedirio (CI) ou muito lento (CML). Com
relao anlise numrica computadorizada dos padres de protena celular total de 171 estirpes,
comparadas a espcies atualmente descritas, foram obtidos 23 grupos com nveis de similaridade
iguais ou maiores a 86%, e 30 estirpes com padres de similaridade inferiores a 86% (Tabela 4.4).
Cinco destes grupos consistiam exclusivamente de estirpes tipo e referncia de : R. leguminosarum, R.
2Seo de Microbiologia do SololDepartamenlo de Cincias AmbienlaislInstituto Nacional de Pesquisas da Amaznia.
3Centro Nacional de Pesquisa de AgrobiologialEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria.
131
lati, R. meli/ati, R. trapici e A. caulinadans. Quatro grupos foram similares a espcies de rizbio
conhecidas. Um deles, o grupo 12, composto por 92 estirpes, foi similar estirpe tipo ATCCI0324
Bradyrhizabiumjapanicum. O grupo 2, com seis estirpes, foi similar aR.lati. O grupo 18, contendo
trs estirpes de Leucaena, foi similar aR. fredii e uma estirpe de Leucaena se agrupou com R. galegae
(grupo 8). Os outros 14 grupos podem representar novas espcies ou biovares e devem ser estudados
posteriormente.
Tabela 4.4. Grupos eletroforticos (SDS-PAGE), tipos culturais e origem de 171 estirpes isoladas de
espcies florestais nativas da Amaznia e Mata Atlnti ca e de estirpes tipo e referncia de
espcies de lizbio atualmente descritas. Modificado de Moreira et aI. (1993).
Grupo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Nde
estirpes
Origem*
Caractersticas
culturais**
2
6
2
P2
C3,M2
M2,M3
CR, cido
CR ou I, cido ou neutro
CR, cido ou neutro
R. lati (Pll)
M2,Pl
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CR, cido
CL, alcalino
CR, cido
R. loti (P 11)
92
4
2
6
2
2
3
19
20
21
22
23
*
**
2
2
2
2
P7
. Cl, C2, C3, C4,
Ml,M2,M3,
Pl, P2, P4, P5
P7
M3,P4,P7
P6,C4,M2,M3,P3
M3
P7
M2
Pl, P5
M2,M3
MI, P5, C2
CR,cido
CL,CML
Alcalino ou cido
(S 2 estirpes)
CL, alcalino
CI, alcalino
alcalino
CL, alcalino
CL, alcalino
CR, cido
CR, cido
CML, alcalino
CR, cido
CL, alcalino
R. tropici (P7)
R. galegae (P 1O)
A. caulinodans (P6)
R. leguminosarum
(P7, P9, P12)
B.japonicum (M3,P7)
R. fredii (P7)
R. meliloti (P9)
Grupos de divergncia em Legumillosae de acordo com Polhill (1981) e Polhill et aI. (1981): CI = grupo de Dim0!7'/talldra; C2 = grupo de M3 =
Acacieae e lllgeae; P I = Swartzieae; P2 = Da/bergieae; P3 = A/breae; 1'4 = Mil/etieae; P5 = Sophoreae; P6 = Robillieae; 1'7 = Phaseo/eae; P8 =
Aeschyllomelleae; P9 = Trifolieae; PIO = Ga/egeae; 1'1 1= Loteae; PI2 = Viceae.
Em meio YMA (Vincellt, 1970); sendo:CR = crescimento rpido; CL = crescimento lento; CI = crescimento intermedirio entre CR e CL; CML =
crescimento muito lento; alcalino = alcaliniza o meio de cultura; cido = acidifica o meio de cultura; neutro = no modifica o pH do meio.
Nota: 30 outros grupos foram formados por uma nica estirpe. Estas foram isoladas de CI, C2, C4, M2, M3, PI, P2, P4, P5 e 1'7.
132
As estirpes CL e CML formaram um conjunto com padres de protena celular total menos
heterogneo do que o das estirpes CR e CI. Estirpes do grupo XII, composto predominantemente por
estirpes de CL alcalinizantes, ocorreram em todos os grupos de Caesalpinioideae e Mimosoideae
estudados, desde os mais primitivos at os mais avanados, e tambm em quase todos os grupos de
Papilionoideae abrangidos por este estudo. Isto indica que este grupo parece ser o tronco ancestral de
onde se derivaram as demais espcies de tizbio, confirmando a hiptese de Nortis (1965). Os resultados deste trabalho, abrangendo vtios grupos de divergncia das h"s subfamlias de Leguminosae,
estenderam para toda a farrnlia as observaes de outros autores paraPapilionoideae (Young & Johnston,
1989), de que, aparentemente, no existe relao entre as filogenias atuais de tizbio e de Leguminosae.
Grande diversidade entre tizbios isolados de espcies arbreas foi tambm demonstrada por
Zhang et aI. (1991), Lajudie et aI. (1992) e Dupuy et aI. (1992). Com a diversidade existente entre
isolados de espcies arbreas e tambm indicaes de vatiabilidade nas espcies j desctitas, ou entre
isolados de espcies herbceas, previsto um nmero considervel de proposies de novas espcies
e gneros nos prximos anos. Essas proposies devero seguir regras mais rgidas para evitar, por
exemplo, descries inadequadas ou casos em que estirpes tipo no estejam disponveis (Graham et
aI.,1991).
133
Hospedeiros
Espcies testadas
N
N
N
N
total gneros espcies total
Pithecellobium edwalii
Sesbania marginata
Aeschynomene vi/osa
Albizia lebbeck
Acacia albida
39
18
15
39
39
15
11
1
15
15
21
12
7
21
21
1
1
2
13
13
3
6
13
33
33
Aeschynomene sensitiva
Acaeia albida
Acaeia senegal
Sesbania grandiflora
Aeschynomene pratensis
Aeschynomene afhlspera
Sesbania rostrata
Acaeia molssima
Leucaena leucocephalla
Acaeia seyal
Acaeia farnesiana
Acacia seyal
6
15
15
15
15
6
15
18
46
15
17
10
2
3
3
3
1
2
3
11
nd
3
nd
3
6
8
7
8
7
6
8
12
4
8
4
7
3
8
8
9
10
4
10
12
43
14
16
10
50
53
53
60
67
67
67
67
93
93
94
100
..
Efetividade*
nd
nd
E
nd
nd
E, e
I
E, e, I
E, e, I
E,I
E, I
E, e, I
nd
E, e, I
E, e, I
E, e, I
E, e, I
Grau(s) de efetividade encontrado(s) entre as estirpes nodulferas; onde: E = efetivo; e = pouco efetivo; I = inefectivo; nd = no determinado .
relativamente mais promscuas
e mais especficas.
.. * Embora outras espcies tenham sido estudadas por estes autores, selecionaram-se, em cada trabalho, as espcies
A eficincia relativa de ndulos (Schubert & Evans, 1976) de Prosopis glandulosa foi maior
para isolados CR (> 0,50) do que CL 0,80) conforme Jenkins et al. (1987), e no se correlacionou
com a efetividade simbitica medida pela concentrao total de N na parte area (J enkins et aI., 1987;
Virginia et aI., 1984). Diferenas estatisticamente significativas (> 22%) no contedo de N e acmulo
de matria seca foram observadas entre plantas de Sesbania sp. inoculadas com estirpes Hup+ e plantas inoculadas com estirpes Hup- (Saini et aI., 1987). Os efeitos do metabolismo de hidrognio no
crescimento de leguminosas de gros podem ser separados em duas classes: ausente ou significante
(Neves & Hunglia, 1987). Para espcies arbreas necessrio que se realizem mais testes (espcies
vegetais e estirpes simbiontes) de modo a obter dados mais conclusivos.
134
Faria et aI. (1984a) avaliaram a eficincia de estirpes de rizbio em simbiose com seis espcies'
arbreas atravs da relao entre o contedo de N na planta e peso de ndulos. Estirpes em simbiose
com plantas de N total acima da mdia foram consideradas eficientes. Estirpes induzindo N total
acima da mdia e peso de ndulos abaixo da mdia foram consideradas de eficincia superior e s
foram obtidas para quatro espcies (uma para cada espcie). Plantas em simbiose com a maior parte
destas estirpes consideradas eficientes tiveram cerca da metade do N total das plantas que receberam
adubao nitrogenada, o que pode indicar um baixo potencial do nitrognio obtido do ar (FBN) nestas
espcies ou condies inadequadas para que todo o potencial se expresse.
135
que podem ter efeito na quantidade e proporo do N 2 fixado: espcie e gentipo da planta;
microsimbionte; idade da planta; e manejo de fatores ambientais.
Sanginga (1992) relata variaes entre 20% e 68% no nitrognio obtido do ar (FBN) entre
plantas de Gliricidia sepium, de diferentes procedncias, enquanto que para plantas de Leucaena
leucocephala e Acacia albida, a variao encontrada foi respectivamente 37% a 74% e 6% a 37%, de
acordo com a procedncia (Sanginga et aI., 1990a).
A acidez e toxicidade de alumnio, fatores comumente associados aos solos tropicais, podem
afetar as simbioses de leguminosas herbceas (Carvalho, 1978; Munns & Franco, 1981). Para as
simbioses de rizbio com leguminosas arbreas foi observada uma alta freqncia de estirpes de
rizbio tolerantes a pH cido (Silva & Franco, 1984; Souza et aI., 1984; Moreira, 1991; Lesueur et aI.,
1993). Alguns resultados demonstraram tolerncia a at 100 mM de AI (AlzCSO 4)2)' quando os testes
so realizados em meio slido (Silva & Franco, 1984; Lesueur et aI., 1993), enquanto em meio lquido
algumas estirpes apresentaram tolerncia e outras foram extremamente sensveis (Lesueur et aI., 1993).
Silva & Franco (1984) observaram maior freqncia de estirpes tolerantes acidez (pH 4,5)
nas Caesalpinioideae (85,7%) e menor freqncia nas Papilionoideae (28,8%). As Mimosoideae
apresentaram 48,8% de estirpes tolerantes. Estirpes CR so geralmente consideradas menos tolerantes acidez do que estirpes CL. Porm, a procedncia da estirpe pode ser mais importante na sua
relao de tolerncia do que a caracterstica do crescimento (Silva & Franco, 1984). Estirpes nativas
de solos cidos se mostram mais adaptadas a estas condies do que estirpes isoladas de pH mais
elevado (Figura 4.5).
INPA 1-14b
D.
o (560
INPA 1-07b
ORS
leucaena
nm)
1,5
1,5
1,5
1,0
1,0
1,0
0,5
pHi
pHf
x 4,4
5,5
7,2
e:.
6,8
0,5
pHi
pHf
x 4,4
4,0
4,6
7,6
o 5,6
e:.
40
80
120
160
40
6,6
80
TEMPO
120
160
0,5
pHi
pHf
x 4,4
4,5
5,4
6,5
e:.
40
80
5,6
6,8
120
160
(horas)
Figura 4.5. Crescimento de estirpes de rizbio em meios lquidos diferindo quanto ao pH (pHi = pH
inicial do meio; e pHf= pH final).
INPA 14B isolada de Cliforia racemosa CL, alc. INPA 07B e ORS Leucaena isoladas de
Leucaena sp. CR, cido. Estirpes INPA 14B e INPA 07B isoladas de solos cidos da
Amaznia (pH == 4,0) e estirpe ORS Leucaena isolada de solo do Senegal, com pH prximo neutralidade.
136
o hospedeiro parece ser mais afetado pela acidez do que o rizbio. Aeacia mangium, Faidherbia
(Aeacia) albida e Leueaena spp. so afetadas pela acidez do meio (pH = 4,5), podendo existir diferenas significativas entre as procedncias de uma mesma espcie com relao a esta suscetibilidade
(Lesueur et aI., 1993; Hutton, 1984). Estas espcies, porm, so originrias de solos com pH mais
elevado. Em florestas tropicais, e particularmente na Amaznia, diversas leguminosas arbreas crescem e nodulam em condies naturais, em valores de pH extr"emamente baixos (pH < 4, O) (Magalhes
& Blum, 1984; Moreira et aI., 1992). Franco (1984) assinala que a acidez gerada pelaFBN na rizosfera
dessas plantas pode ser benfica, aumentando a disponibilidade de P para as plantas atravs da
solubilizao de rochas fosfatadas.
Fsforo
A deficincia de fsforo um dos principais fatores limitantes do crescimento de plantas nos
solos tr"opicais, principalmente devido imobilizao por fixao nos xidos de AI e Fe. Simbioses
mutualsticas com fungos micorrzicos ocorrem em vrias leguminosas permitindo que estas espcies
tenham bom desenvolvimento e nodulao em solos com baixos teores de nutrientes, especialmente o
P (Jasper et aI., 1989; Herrera et aI., 1993). De Faria et aI. (1993) observaram que o crescimento e
nodulao de espcies arbreas foram estimulados pela inoculao com MVA, e que baixos teores de
P foram suficientes para obter os maiores incrementos, indicando que estas espcies tm baixo requerimento de P. A resposta a P tambm pode variar enh"e gentipos de espcies arbreas (Sun et aI.,
1992).
Temperatura
Uma das simbioses mais sensveis a temperaturas altas a do feijoeiro. Resultados recentes
demonstr"aram que estirpes isoladas de leguminosas florestais tolerantes a altas temperaturas e eficientes na nodulao do feijoeiro podem ser uma valiosa fonte de recursos genticos para aumentar o
potencial da FBN nesta cultura (Hungria et aI., 1993). A temperatura crtica para FBN em Cyamopsis
tetregonoloba, por exemplo, situou-se enh"e 37C e 40C e acima de 40C no caso de plantas dependentes de N mineral (Arayangkoon et aI., 1990). Estirpes tolerantes a altas temperaturas podem
formar simbioses altamente eficientes com leguminosas arbreas, como por exemplo em Mimosa
fZoeeulosa (Cunha et aI., 1994).
Umidade
Simbioses de leguminosas com rizbio podem se estabelecer em condies exh"emas de seca,
como diversas espcies de Acacia no Sahel afiicano, ou em condies de longos perodos de inundao, como vrias espcies nativas da Amaznia, demonsh'ando uma ampla versatilidade adaptativa.
Em regies semi-lidas (zona ecoclimtica do Sahel), importantes populaes de BradyrhizobiwrL
vivem em solo sob vegetao de Acaeia aiNda at 34 m de profundidade ao nvel do lenol fretico
(Dupuy et aI., 1992). No deserto de Sonoran (Estados Unidos), populaes maiores que 5,9 x 103
clulas.g- 1 de solo foram encontr"adas a 6 m de profundidade ao nvel do lenol fretico sob Prosopis
glanduiosa (Jenkins et aI., 1987).
137
N combinado
Espcies arbreas podem ser mais afetadas pelo N combinado do que culturas anuais porque
ocorre ampla variao da FBN em virtude da idade e redistribuio do N na planta e no perfil do solo,
devido mineralizao da liteira (Sanginga, 1992).
A aplicao de 40 a 80 kg de N pode reduzir em 50% a FBN em Leucaena leucocephala
(Sanginga et aI., 1989). O grau de inibio pode variar de acordo com a fonte de N aplicada. Baixos
nveis de nitrato diminuiram mais a produo de ndulos em Acaeia auriculiformis do que baixos
nveis de amnio (Goi et aI., 1992). Por outro lado, pequenas doses de N podem beneficiar a FBN.
Em Cyamopyis tetragonoloba, a quantidade de N fixado duplicou em resposta aplicao de uma
dose "starter"de Nmineral (Arayangkoon et aI., 1990).
As respostas de diferentes procedncias de uma mesma espcie ao N combinado tambm podem variar. Sanginga (1992) sugeIu dois modos de aumentar a FBN em espcies arbreas na presena de N combinado: desenvolver parceIas rizbio/hospedeiro mais tolerantes ou explorar diferenas
genticas entre rvores para fixar N 2 na presena de altos nveis de N no solo.
4.2.2. Simbioses com Frankia
4.2.2.1. Introduo
Actinomicetos fixadores de N2 do gnero Frankia estabelecem simbiose, com formao de
ndulos radiculares, em cerca de 279 espcies de angiospermas, a maioria de porte arbustivo ou arbreo
(Baker & Mullin, 1992). O nmero de espcies vegetais actinorrzicas (i.e., que formam simbiose
com Franlda) bem infeIor ao das simbioses de rizbio com leguminosas (Tabela 4.6). No entanto,
so de extrema importncia, pois:
- a capacidade de formar simbiose com Fnwlda se estende a oito famlias botnicas, indicando maior
versatilidade simbitica deste microsimbionte;
- muitas espcies actinorrzicas so colonizadoras agressivas e capazes de crescer em solos degradados;
- muitas espcies so produtoras de madeira, lenha e carvo ou tm outros usos com potencial econmico e ecolgico.
Contudo, existe um enorme potencial para descoberta de novas espcies actinonzicas, dado
que trabalhos intensivos de levantamento em muitos ecossistemas no foram realizados (Gauthier et
aI., 19.84). Na Amaznia, por exemplo, no ocorrem os gneros at agora reportados, como actinorrzicos, mas algumas famlias botnicas s quais pertencem so representadas por outros gneros.
138
Rizbio
Frankia
Referncia
Simbiticas
FaITlllias botnicas com
as quais pode estabelecer
simbiose
Leguminosae
Ulmaceae
Casuarinaceae
Myricaceae
Batulaceae
Elaegnaceae
Rhamnaceae
Coriariaceae
Rosaceae
Datiscaceae
Trinick, 1979
Bond & Wheeler (1980)
Becking (1982)
Nmero de espcies
hospedeiras conhecidas
atualmente*
=300
279
Vrios
Tipo de infeco
plos radiculares,
epiderme, feridas
plos radiculares,
epiderme
Origem do ndulo
crtex da raiz
pericic10 da raiz
Sprent (1989)
Miller & Barker (1986)
Localizao do tecido
vascular
externo s clulas
onde esto os
bacterides
no centro do ndulo
Presena de hemoglobina
Cultnrais
Temperatura tima
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
pH timo
6,0 - 7,0
6,3 - 6,7
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Tempo de gerao
1,4 - 44,1 h
24 - 48 h
Jordan (1984)
Zhongze et aI. (1986)
Crescimento sob N 2 **
Jordan (1984)
Zhongze et at. (1986)
139
Comparando-se com as simbioses de rizbio com leguminosas, observa-se que existem poucos resultados sobre as simbioses com Franlda. Um dos motivos relacionado dificuldade de
primeiro isolamento de Franlda foi realizado quase 100 anos aps o priisolamento do endfito.
meiro isolamento de rizbio (Beijerinck, 1888) de ndulos de Comptonia peregrina (Syn Myrica
asplenifolia) (Callaham et aI., 1978). As principais limitaes para o isolamento de Franlda so devidas a anatomia dos ndulos, que dificulta a eliminao de contaminantes, e sua baixa taxa de crescimento em meios de cultura, considerados ainda no seletivos (Tabela 4.6).
Casuarina e Alnus so os gneros de importncia econmica mais estudados. Estimativas da
FBN em espcies destes gneros se situam entre 40 kg e 300 kg de N.ha- 1ano- 1 (Becking, 1973),
indicando grande potencial em sistemas sustentados.
140
Como os ndulos de Franlda geralmente apresentam colorao interna branca, por muitos
anos se pensou que eles no contivessem hemoglobina. Resultados recentes, utilizando novos procedimentos, confirmaram a presena de hemoglobina em ndulos de Casuarina (Appleby et al., 1983;
Tjepkema, 1984; Sellstedt et al., 1994).
141
142
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CAPTULO 5
NUCORErrZASARBUSCULARES
Jos Oswaldo Siqueira l
5.1. Introduo
lProfessor, Ph.D., Escola Superior de Agricultura de Lavras (ESAL), Caixa Postal 37, CEP 37200-000, Lavras. MG.
152
FOTOASSIMILADOS
Azigosporo
NUTRIENTES
Clamidosporo
Es poro
M
Manto
( facultativo
Rede de
Hartig
ECTENDOMICORRIZA
ENDOMICORRIZA
ORQUIDIDE
-[53
Principais caractersticas
Arbuscular ou vesculo-arbuscular
EctomiCorriza
Ericide
Orquidide
Ectendomicorriza
154
As micorrizas arbusculares (MAs) parecem ter evoludo nos trpicos (Pirozynski, 1981),
apresentam pouca ou nenhuma especificidade na relao fungo-hospedeiro e ocorrem de modo generalizado na maioria das espcies e ecossistemas, sendo consideradas uma simbiose universal (Nicholson,
1967). Excees notveis condio no-micornzica, incluem membros das famlias Brassicaceae,
Comelinaceae, Juncaceae, Proteaceae, Cyperaceae, Chenopodiaceae e outras. Das espcies de interesse agronmico, 87% das Crucferas (nabo, canola, mostarda, repolho), 61 % das Chenopodiaceae
(beterraba), 37% das Poligonaceae ("buckwheat"), 4% das leguminosas (tremoo) e membros da
Amarantaceae no formam MAs (Thompson, 1994). As razes para a resistncia das plantas
micorrizao parecem ser de natureza evolucionria e no so conhecidas com exatido. No entanto,
a condio no-micorrzica pode resultar do seguinte: a) produo e acmulo no crtex de compostos
fungistticos, como certos compostos aromticos em leguminosas, como tremoos, e glicosinolatos
nas crucferas; b) quantidade insuficiente de exsudatos ou de certos constituintes destes; c) ausncia
de fatores qumicos estimulantes que atuariam como sinais moleculares ou mediadores nutricionais; e
d) outras razes, como ausncia de reconhecimento e aderncia do fungo ao hospedeiro e barreira
fsica ou qumica na parede celular. Mecanismos distintos podem atuar nas diferentes espcies nomicorrzicas. Estima-se que as MAs ocorrem em quase 300 mil espcies e so to velhas quanto as
plantas terrestres (Jeffries, 1987). Devido a essa ocorrncia generalizada e aos benefcios para a
planta hospedeira e para o funcionamento do ecossistema, elas so de grande significncia ecolgica
e agrcola e tm sido objeto de grande volume de pesquisa bsica e aplicada (AlIen, 1992; Janos, 1983;
Jeffries, 1987). As MAs so de interesse especial para as regies tropicais e subtropicais, especialmente para o Brasil devido: al baixa fertilidade dos solos e elevado requerimento de nutrientes pela
maioria das culturas; b) condies ambientais estressantes; c) alta proporo de minifundirios com
pequeno poder aquisitivo; d) suprimento limitado de fertilizantes em certas reas; e) alto custo dos
financiamentos agrcolas; f) possvel exausto dos depsitos de fosfatos; e g) preocupao crescente
com a qualidade ambiental, visando minimizar os impactos da poluio do solo e gua e do
desmatamento sobre o ambiente.
Assim, as MAs so componentes importantes dos ecossistemas e desempenham papel crucial
para sua funcionalidade e sustentabilidade. A biologia, ecologia, efeitos no crescimerito das plantas e
aplicaes dos fungos formadores das MAs so abordados nos tpicos seguintes deste captulo.
5.2. Formao e Funcionamento da Simbiose
As MAs resultam de uma seqncia complexa de interaes entre a hifa fngica e clulas das
razes que estabelecem uma relao simbitica representada por um estado diflmico com perfeita
integrao morfolgica, fisiolgica e funcional. Embora algumas etapas fenolgicas do estabelecimento desta simbiose sejam bem caracteriiadas, muito pouco se conhece dos mecanismos bioqumicos
e moleculares da interao fungo-planta. Ao contrrio do que se verifica em outros sistemas simbiticos
entre plantas e microrganismos, no existe evidncia de especificidade na relao fungo-planta nas
MAs, no que refere colonizao, mas existe, no entanto, um alto grau de "compatibilidade funcionaI" que determina a efetividade simbitica da relao (Gianinazzi, 1991; Koide & Schreiner, 1992).
As expresses fenotpicas nas MAs so determinadas pelo genoma do fungo e da planta, dos
quais quase nada conhecido at o' presente. A capacidade de formar MAs restrita a um grupo de
fungos pertencentes a trs famlias da ordem Glomales dos Zigomicetos (ver item 5.3.1.), das quais
so conhecidas em torno de 140 espcies, distribudas em apenas seis gneros. Estes fungos so
simbiontes obrigatrios, com reproduo assexuada e ainda no foram cultivados em meios de cultura
155
156
f) Funcionamento do mutualismo - a planta fornece fotossintatos que servem como fonte de energia e
possivelmente fatores de crescimento, enquanto o fungo absorve e transfere nutrientes minerais
como o fsforo. Mecanismos de ajustes fisiolgicos na planta compensam o dreno energtico
causado pelo fungo na raiz.
Em termos prticos; o estabelecimento das MAs determinado pela densidade de propgulos,
que determina o potencial de inculo ou infectividade, e pelas caractersticas do hospedeiro, como sua
prpria suscetibilidade micorrizao e crescimento das razes, considerando qJ,le a chamada "hifa
infectiva" intercepta uma raiz suscetvel por acaso. No h. atrao especfica ou direcionada do
crescimento micelial na rizosfera (Ver Allen, 1992, captulo 1).
Tabela 5.2. Principais fases e eventos do ciclo dos fungos e das micorrizas arbusculares. Adaptado
de Brundrett (1991).
Fase ou componente do ciclo
Propgulos fngicos
(esporos, hifas, razes)
Razes do hospedeiro
Penetrao da raiz e
colqnizao do crtex
Stios de troca
Senescncia das
estruturas fngicas
Formao de propgulos
Senescncia da raiz
157
158
Embora algum avano tenha ocorrido nos ltimos cinco anos, muito pouco se conhece sobre
as bases moleculares do estabelecimento das MAs. Siqueira (1991) discute trs aspectos importantes
deste tpico:
a) Sinais moleculares - Plantas de trevo deficientes em fsforo produzem exsudatos radiculares capazes de promover grande estmulo no crescimento do fungo, ao contrrio daquelas bem supridas em
fsforo (Elias & Safir, 1987). Respostas semelhantes so vetificadas para culturas de clulas de
planta hospedeira crescendo em meio pobre em nutrientes (Paula & Siqueira, 1990). Vrias substncias foram isoladas e identificadas nestas plantas (Nair et aI., 1991; Rhlid et aI., 1993). Amostras autnticas destes compostos estimulam o crescimento assimbitico de fungos MAs e a coloniza.o mic.orrzica. Apesar das evidncias experimentais, ainda no existem provas qualificativas e
definio dos mecanismos de ao destas substncias sobre o fungo e sua relao com a planta.
b) Mecanismo de reconhecimento e formao de apressrio - A formao de apressrio um evento
feno tpico bem definido, mas o mecanismo de reconhecimento fundamentado em evidncias
circunstanciais nas MAs, baseando-se em analogia desta associao com outros sistemas simbiticos.
necessrio conseguir evidncias bioqumicas do reconhecimento fungo-planta. A descoberta de
mutantes Myc representa grande avano nesta rea.
c) PenetTao, colonizao e formao de arbsculos - Requer a formao de apressrio e atividade
enzimtica bem balanceada. Mecanismos de controle da penetrao e induo da formao de
arbsculos precisam ser elucidados.
Um quarto aspecto importante do estabelecimento das MAs a regulao da transferncia de
metablitos entre o fungo e a planta e o custo energtico da simbiose. Diversos estudos apontam que
plantas miconizadas translocam entre 5% a 15% mais carbono fixado para as razes que plantas sem
MAs (ver Schwab et aI., 1991). Assim, as MAs representam elevado custo energtico para a planta
hospedeira, que se ajusta smbioticamente de modo a compensar este dreno extra de energia que
consumido nas razes. No entanto, estima-se que os custos para manter as MAs so da mesma ma!,'11itude que aqueles gastos com a absoro de nutrientes "per se" e, seguramente, muito menores do que
se a planta hospedeira tivesse que produzir razes suficientes para atingir atividade de absoro equivalente a das razes micorrizadas. Desse modo, esta simbiose representa uma estratgia vantajosa
para a planta enfrentar condies estressantes de crescimento e, certamente, uma garantia de sobrevivncia do fungo, que biotrfico obtigattio.
159
sejam: a) observao e avaliao microscpica das razes quanto presena do fungo e estruturas
tipicas como arbsculos, vesculas e esporos; b) extrao e separao dos esporos do solo, cuja presena indicativo da ocorrncia da associao no ecossistema; e c) bioensaio para determinao da
infectividade do solo e do nmero mais provvel (NMP) de propgulos no solo. As diversas alternativas operacionais para a avaliao da ocorrncia das MAs e suas relaes ecolgicas acham-se resumidas na Figura 5.4.
Amostras de razes lavadas podem ser observadas diretamente pela presena de estruturas
fngicas usando microscopia de fluorescncia, mas isto requer muita experincia do observador e tem
aplicao muito Iimitada a certas espcies vegetais. O procedimento mais seguro e amplamente
empregado consiste na clarificao e alvejamento das razes com produtos qumicos e posterior colorao com corantes, como azul de trpano e fucsina cida, os quais evidenciam com muita segurana
as estruturas microscpicas do fungo na raiz. O procedimento laboratorial relativamente simples,
existindo diversas alternativas conforme descrito em Dalp (1993). Os resultados obtidos para colonizao micorrzica dependem do procedimento adotado, podendo ser expressos de diversas maneiras
como, por exemplo, porcentagem dos segmentos colonizados, porcentagem do comprimento de raiz
colonizada, intensidade da colonizao e porcentagem de colonizao arbuscular. Dois aspectos importantes na avaliao da colonizao so a amostragem e a identificao das eshuturas fngicas nas
razes. Deve-se selecionar apenas as razes finas 2mm de dimetro) e tomar o cuidado de distinguir
as eshuturas dos fungos Glomelianos daquelas dos saprfitas ou parasitas, normalmente tambm
associados s razes. Os fungos MAs (Glol1lales) so asseptados (hifas cenocticas, sem septos) enquanto os outros, na grande maioria, so septados e podem ser distinguidos mesmo com baixa ampliao microscpica. Os fungos das MAs so caracteJizados microscopicamente pela presena de hifas
no-septadas e/ou eshuturas tpicas inter e intracelular no crtex e miclio externo (extra-radicular),
tambm asseptado. Os arbsculos so fonnados dentro das clulas enquanto as vesculas, que s
ocorrem em certas espcies de FMAs, podem ser formadas entre ou no interior das clulas. Algumas
espcies de fungos formam tambm esporos dentro das razes, como espcies c1amidospricas do
gnero Glol1llls (Ex. Glomlls intraraclices). Neste caso, distinguem-se esporos intra-radiculares das
vesculas, pela espessura e estrutura das paredes. Esporos tm paredes muito espessas (que podem ser
laminadas) enquanto as vesculas tm paredes finas.
Outra maneira de avaliar a ocolTncia das MAs o isolamento e extrao dos esporos dos
FMAs do solo, para contagem do nmero de esporos, e a determinao da densidade de propgulos e
infectividade do solo, pelo mtodo do nmero mais provvel (NMP). Os diversos procedimentos
encontram-se tambm descritos em Dalp (1993). Enhe estes, o mais eficiente e simples o
peneiramento via mida, que consiste em fazer uma suspenso do solo em gua e o peneiramento
atravs de uma srie de peneiras com malhas, vmiando de 0,35 mm a 0,45 mm de abertura. Os
mateJiais retidos nas peneiras intermedirias e na mais fina so retirados e cenhifugados em gua e
sacarose (1 M), em cenhifugas com rotor hOlizontal com tubos balanantes. Os esporos ficam no
sobrenadante dos tubos e so lavados com gua corrente e transferidos para placas para observao e
contagem em microscpio estereoscpico, em baixa ampliao. Grupos homogneos de esporos so
montados em lminas, contendo fixadores como PVL (lcool polivini1 em lactofenol), para caracterizao microscpica detalhada (100-1000 vezes de aumento) e posteIior classificao taxonmica
(Schenck & Perez, 1987).
.~'
160
AMOSTRA DE
_Densidade
Separao
Bioensaio
L.....:--'T~--'
RIZOSFERA
Multiplicao
de propgulos
Infectividade
Armazenagem
\
An lise
qurmica -
'
Extrao _ _--',';--_ _
VASOS DE CULTIVO
(Multiplicao)
- -........
Lminas
+
Testes de Inoculao
Colorao
*~
,/'
/
Identificao - - . . Taxonom ia -
COLEO DE CULTURAS
HERBRIO
',,,,
--~I
\
,
I
I
,;
RESULTADOS
//
Avaliao
da
colonizao
Densidade total
Caracterizao
I-~~Clarificao
".
Lminas
Figura 5.4. Seqncia operacional para avaliao da ocorrncia e relaes ecolgicas das MAs.
Os fungos que formam as MAs pertencem classe Zigomicetina, ordem GlolllClles, que tm
apenas as famlias GlolllClceCle, ACCllIlosporaceae e GigasporaceCle, cada uma com apenas dois gneros, cujas principais caractersticas encontram-se na Tabela 5.3. A taxonomia destes fungos baseada essencialmente em caractersticas fenotpicas dos esporos, que so assexuados e apresentam elevada diversidade de cor, tamanho, forma (Figuras 5.2 e 5.3) e' caractersticas da parede (espessura,
arranjamento e nmero), dentre outras (Morton & Benny, 1990). So conhecidas atualmente cerca de
140 espcies descrtas, as quais ocorrem nos diversos ecossistemas terrestres, sendo o gnero Glolllus
o que apresenta maior nmero de espcies (em torno de 70) seguido por ACClulospora e Sclltellospora.
As espcies vegetais diferem quanto suscetibilidade micorrizao, existindo espcies que
no formam micorrizas de tipo algum. Considerando as informaes disponveis para as plantas
tropicais, Trappe (1987) relata que 13,4%. das espcies so no-micorrzicas, 70,9'% formam MAs e
15,7% formam outros tipos de simbiose radicular com os fungos. Grandes diferenas intra-especficas e em nvel de ecotipo, clone e cultivar quanto micorrizao podem ocorrer, principalmente em
espcies cultivadas submetidas a intenso programa de melhoramento gentico, que pode, ao longo do
tempo, selecionar indivduos pouco suscetveis ou at mesmo resistentes micorrizao (Hetrick et aI.
1992; Johnson & Pfleger, 1992).
Tabela 5.3. Famlias, gneros e principais caractersticas dos fungos MAs (Morton & Benny, 1990; Morton, 1988).
Famlia
Gnero
Tipo de esporo
Dimetro
mdio(J.!)
N" de
paredes
Rifa de
snstentao
Clnlas
anxiliares
Esporocarpo
VescuIas
Acalllosporaceae
Acaulospora
Azigosporo
100-300
2-5
sessil
no
no/sim
sIm
Acalllosporaceae
Entrophospora
Azigosporo
< 100
2-5
sessil
no
no
sim
Gigasporaceae
Scutellospora
Azigosporo
>300
3-6
bulboso
sIm
no
no
Gigasporaceae
Gigaspora
Azigosporo
>200
1-2
bulboso
sim
no
no
Glomaceae
Glo/11uS
Chlamidosporo
<200
1-3
forma funil
no
sim/no
sIm
Glomaceae
Sc/erocystis
Chlamidosporo
< 100
forma funil
no
sim
sIm
'"
162
A ocorrncia das MAs ento determinada pela vegetao e pelo ambiente do ecossistema
(Johnson et a1., 1992b). Trufem & Bononi (1985) propuseram a existncia de quatro padres de
ocorrncia de fungos MAs em ecossistema no-alterado do Estado de So Paulo, que so:
a) Espcies que ocorrem na maioria dos hospedeiros durante todo o ano;
b) Espcies que ocorrem em grande densidade no solo, mas so restritas a certos hospedeiros e pocas
do ano;
c) Espcies com baixa densidade, mas sem restrio de hospedeiros ou poca do ano; e
d) Espcies com baixa densidade em poucos hospedeiros e em pocas restritas.
Os esporos acham-se presentes em quase todos os solos, sendo extremamente reduzidos ou
inexistentes naqueles fumigados, severamente perturbados pela eroso, minerao, construo civil e
longos perodos de pousio ou inundao (Abbott & Robson, 1991; Brundrett, 1991). A disperso dos
propgulos ocorre por disseminao ativa, atravs do crescimento do miclio e razes colonizadas, e
por disperso passiva, pelo vento, micofagia, oligoquetas, pssaros, insetos, gua, transporte de solo e
de mudas de plantas. A diversidade fngica vara muito em virtude do ecossistema (Tabela 5.4),
sendo encontradas de duas a 33 espcies por ecossistema (Brundrett, 1991).
Fungos MAs
Ocorrncia
Diversidade
Baixa
Alta
Alta
Mdia/Baixa
Baixa
Muito baixa
Muito baixa
Baixa
163
Tabela 5.5. Principais fatores que afetam a fonnao e ocorrncia das MAs, confonne o componente.
Componente
Principais fatores
Solo
Disponibilidade de nutrientes, pH, elementos txicos, salinidade, textura, estrutura e agregao, densidade, umidade, organismos.
Planta
Espcies, variedade, cobertura vegetal, nutrio, idade, ciclo e taxa de crescimento, alelopatia, sistema radicular, exsudao, senescncia.
Ambiente
Manejo
Tabela 5.6. Condies e fatores que reduzem a ocorrncia das MAs (Johnson & Ptleger, 1992;
Thompson, 1994; Abbott & Robson, 1991).
Condio
Mecanismo ou processo
Eliminao da vegetao
Cultivo intensivo
Sistema de produo
Melhoramento vegetal
Uso de fertilizantes
Uso de pesticidas
164
a)
10
f..)
OLL~50~L-~12~0~~18~0~~2~40~~3~0~0J
N ou P adicionado, tJg/g
50
b)
- 60
E
'"~A
~ 50
......
l3
To
L-
40
MILHO " - . .
:;:- 30
+--+
CIl
o
+
o 10
(IJ
20
"
f..)
c)
20
40
50 .
P disponvel, flg/g
80
100
"c
+--+.
'iij
(IJ
20
40
60
80
100
P disponvel, 1-19/g
165
166
natural havia oito espcies predominantes contra apenas trs, em mdia, nos agrossistemas estudados.
O cultivo destes solos aumenta a populao de fungos MAs, mas reduz a diversidade de espcies,
tornando o sistema biolgico mais vulnervel a alteraes. As modificaes na composio de espcies refletem alteraes nas caractersticas qumicas do solo, resultantes das prticas de cultivo como
arao, gradagem, calagem e adubao. No entanto, tem sido difcil correlacionar a ocorrncia das
espcies com caractersticas qumicas do solo (Siqueira et aI., 1989; Fernandes & Siqueira, 1989;
Schenck et aI, 1989) mas, pelo menos para algumas espcies e variveis, certas tendncias sO bastante claras (Tabela 5.8). Por exemplo, A. 1Il01'/'Owae, A. spillosa e E. colombialla tm incidncia
reduzida em solos com pH mais elevado, ao contrro do que se verifica para o G. elUllicalulII. Outras
tendncias so verificadas para os nveis de AI+] e P no solo.
Tabela 5.7. Valores mdios para colonizao micorrizica e densidade de esporos no solo em
ecossistemas do Estado de Minas Gerais (Siqueira et a!., 1989).
Ecossistema
Razes colonizadas
(%)
Densidade de esporos
(No. 50 cc l )
Arroz
33
67
Milho
36
84
Soja
18
61
Algodo
17
99
Mandioca
20
90
Cana-de-acar
19
62
Citros
53
120
Eucaliptos (adultos)
37
Pastagem braquiria
33
52
Cafeeiro
35
20
Gramneas nativas
36
23
Leguminosas forrageiras
62
98
Cerrado (natural)
14
46
167
foram substitudas de modo diferenciado por GIOIllIlS etllllicatlllll, quando o solo recebeu calagem. O
mesmo no ocorreu no solo muito cido, cuja populao era dominada por Acalllo.lpo/rl scmhiclIlata.
Baseando-se nestes resultados e nos obtidos por Sierverding (1991), algumas generalizaes podem
ser feitas com relao interao pH-fungos MAs nos solos tropicais, havendo espcies com preferncia ou tolerncia a certas condies.
a) Predominam em condies de elevada acidez - Glo/lllls diapllC/Il11Ill, Glol/llls occlIltlllll,
Entroplzospora colombiana, SClIIellospora sp., G!gaspora lIlargarita, Acolllw,pora loev!s.
b) Preferem solos pouco cidos ou neutros - Glo1l111s JIl0sseae, GloJllus c1aJ71Ill, Sclemcystis sp., Glol/1us
fasciclllatllm, GIO/llllS etzmicatlllll.
c) So indiferentes acidez do solo -Acalllospora scrobiclIlata, Acau/ospora morl"Owae, G/IJIlllfol"
agrega/lIl1l.
Tabela 5.8. Incidncia relativa das principais espcies fngicas encontradas em Minas Gerais, em
relao a classes de pR, AI e P no solo. Adaptado de Siqueira et aI. (1989).
Espcies fngicas*
Fator
edfico
(classe)
pH
Asc
Amo
Asp
Ame
Ssp
Spel
Get
Gdi
Ecol
10
12
13
14
14
29
12
17
12
12
12
17
19
12
14
19
14
10
18
31
17
12
21
13
12
18
50
45
15
10
10
15
10
47
27
13
14
18
<50
33
43
14
29
lO
5-6
39
36
18
17
12
>6,5
29
14
14
14
<0,5
38
32
13
0,5 - 1,0
22
30
17
> 1,0
24
29
20
P (Meh1ich)
< 6,0
6 - 12
> 12
* A"c = A.scrobiculata;
etunicatllm; Gdi
168
Solo com pH
6,0
86%
0,,'14%
:-;
Gigosporo morgarito
ffilill
Acoulospora scrobicu/ato
Figura 5.6. Efeito da cal agem de solo cido na esporulao de fungos MAs de diferentes origens
(Siqueira et a!., 1990).
169
Embora os fungos MAs sejam considerados generalistas, existem diferenas causadas pelo
tipo ou seqncia de cultura na composio de espcies. Estudos recentes em solos cultivados do
meio oeste americano (Johnson et aI., 1992a) revelam resultados surpreendentes, relacionando alteraes na populao de fungos MAs com o efeito da rotao na produtividade das culturas. A monocultura
prolongada com milho favorece a populao de G10IllUS occlIltlllJ/, que se correlaciona negativamente
com a produtividade desta cultura, porm correlaciona-se positivamente com a produtividade da soja
em rotao. A monocultura da soja favorece GIOlllllS lIliCmCWpulIl, que se correlaciona negativamente com a nutrio e produtividade da soja, mas mostra-se benfica para o milho. Estes eshldos indicam que a monocultura prolongada seleciona fungos de rpido crescimento e esporulao, sendo
portanto uma seleo para sobrevivncia e no para efetividade ou eficincia. Isto pode resultar na
seleo de espcies inefetivas ou parasticas para a cultura, contribuindo para o chamado "declnio da
monocultura". Praticando-se a rotao de culturas, pode-se reverter este processo, favorecendo as
espcies efetivas que contribuiro para a nutrio e produo da cultura em rotao. Este , portanto,
um modelo desenvolvido com base nos resultados obtidos na rotao milho-soja nos Estados Unidos,
sendo sua validade para outras condies ainda sujeita a evidncias experimentais. Contudo, verificase que na monocultura do cafeeiro no Brasil, predominam na rizosfera espcies de Acalllospo/'il, principalmente A. scrobiclIlata que pouco efetiva para esta cultura. A comunidade fngica controlada
pelo solo e pela cultura (Johnson et aI., 1991; 1992b). Na mesma cultura, o nmero total de espcies,
densidade de esporos e espcies fngicas varia muito entre locais (Tabela 5.9), indicando a grande
influncia do ambiente sobre a ecologia das MAs. Comparando-se as espcies predominantes em
cafeeiros no sudeste brasileiro (Fernandes & Siqueira, 1989; Oliveira et aI., 1990; Lopes et aI., 1983),
tem-se, em ordem decrescente de ocorrncia:
A. scrobiculata, A. 1Il0ITOlVae, A. JIlel/ea, A. apendiclIla, GloJlllls etl/llicahllll (Sul de Minas).
A. scrobiculata, A. JIlorro1l'ae, EntropllO.I'pora coloJllbiana, A. spinosa, Glof/llls etllnicatuJll (Alto
Paranaba e Trin6'1110 Mineiro).
GIOf/lllsjllsciclIlatllJll, A . .I'cmbiclIlata, A. laevis, SClItel/ospotrl pel/lIcida e Gigll.\pora gigantea (So
Paulo).
Alm da monocultura, o pousio prolongado, o cultivo com espcies no-micorrzicas, a eroso do solo e o cultivo extensivo exercem enorme efeito negativo na ocorrncia das MAs (Thompson,
1994; Brundrett, 1991 l. Diversos estudos mostram que a alterao dos solos aglcolas reduz o desenvolvimento das MAs em at 80'% e isto tem conseqncias para a nutrio, produtividade e
sustentabilidade das culturas, conforme resumido na Figura 5.7. A reduo na colonizao pode ter
conseqncias drsticas a mdio e longo prazo para a produo agrcola. Para compensar o efeito da
alterao na queda de produtividade e diminuio dos efeitos benficos das MAs, maiores quantidades de fertilizantes so geralmente aplicadas. Isto contribuir para reduzir ainda mais a colonizao
das razes. Desse modo, a reduo da intensificao do cultivo, como a adoo do cultivo mnimo,
contribuir para a conservao da atividade das MAs no a6'TOssistema. De fato, as MAs contribuem
mais para a absoro de P pelo milho em solo com cultivo mnimo que em solo sob cultivo convencionaI (Kunishi et aI., 1989).
difcil fazer generalizao ou predies sobre a ocorrncia e diversidade dos f~ngos MAs,
mas sua ocorrncia geralmente alta em sistemas cultivados com baixo input e muito baixa, e at
mesmo inexistente, em condies muito alteradas como em solos degradados pela minerao, construo civil ou pela eroso. A diversidade, por outro lado, alta nos ecossistemas em clmax, como no
cerrado brasileiro, e baixo nos agrossistemas, principalmente na monocultura. As condies domi-
170
nantes nos ecossistemas manejados intensivamente e sem rotao de culturas reduzem a ocorrncia e
importncia das MAs. No obstante, as tendncias de modificaes para sistemas mais equilibrados
biologicamente, como reduo no uso de agroqumicos, cultivo mnimo e rotao de culturas, podem
contribuir para aumentar a ocorrncia e funo das MAs nos sistemas agrcolas.
Tabela 5.9. Ocorrncia de fungos MAs em lavouras de milho em diferentes locais (Siqueira et aI., 1989;
Maia & Trufem, 1990; Trufem & Bononi, 1985; Rich & Schenck, 1981).
Localizao
Espcies predominantes
Minas Gerais
Glo/71US etullicatum.
Acaulo~pora 1l1orrowae,
AcaulD.lpora scrohiclllata,
El1trepho~pora colo/11hiwlCl,
Acalllospora '\l!i/lo.m,
SC1/tello.\pora gil/71orei,
Acaulmpora /71l!lIea,
Gigaspora margarill/.
Pernambuco
So Paulo
Flrida
0,2 - 2,6
(1,4)
Acalllospora laevis,
Acalllmpora scrohiclllala,
Acalllospora appe/ldicllla,
Glo/71usfasciclllalll/71,
Glo/711/s OCCl1ltllll1,
Gigm7JOra heterogama,
Sclerocystis SllO/IS/IlJl.
0,2 - 2,4
(1,0)
Gigaspora heterogama,
Scutello.\pora lIigrll,
Scl1tellD.lpora pell1/cida,
Glol11l1s macroC//plll11,
Glo/11l1s caledonicll/l1,
Sclltello.\pora gilmorei,
G101111/.I' macroc//7mm.
14
<0,60
Gigaspora /I1argariltl,
G101111/.I' I11C1crocW1Jllll1,
Glo/11u.l' c1al1ll11,
G1011111S etllllicatlll7l,
Gigmpora heteroga111a,
Glol111/s mossae,
G1011111sfasciclllal1l111.
16
6-34
(21)
171
Cultivo
Quebra
da
Rompimento
Intensivo
macroestrutura
do miclio fngico
( Propgulos)
Reduz
' .
a colonizao micorrlzlca
Diminui a absoro
de gua e nutrientes
I--
Maior aplicao de
fertilizantes e defensivos
Favorece
Exige
Distrbios
nulricio no
L...-_ _ _ _ _-+ Severidade
de doenas
IS~
Estresse hdrico
r----------l
Queda da produtividade
Reduo da sustentabi Iidade
Figura 5.7. Conseqncias do cultivo (alterao) do solo na micorrizao e produo agrcola.
5.4. Efeitos no Crescimento do Hospedeiro
Os efeitos das MAs no crescimento das plantas foram inicialmente detectados por Asai (1943),
que relatou crescimento reduzido de certas espcies quando cresciam em solo esterilizado. Dez anos
depois, Mosse (1953) demonstrou a formao das MAs e, em 1957, verificd\! qe mudas de macieira
inoculadas com esporocarpos de Endogone (hoje Glolll!ls) crescei-am maisoe continham teores mais
elevados de nutrientes. Na dcada de 60, vrios outros estudos mostraram resultados semelhantes
com milho e outras espcies (Gerdemann, 1968). No entanto, os efeitos estimulantes do crescimento
172
das plantas s ficaram mais evidentes, e mereceram mais ateno, aps os problemas de crescimento
reduzido de mudas de espcies frutiferas. cultivadas em viveiros com solo fumigado. terem sido atribudos eliminao dos propgulos de fungos MAs (Kleinschmidt & Gerdemann, 1972) e no
toxicidade residual do fumigante. Nesta mesma poca, Ross (1971). demonstrou que, em solo infestado com propgulos de fungos MAs, a produo da soja era 122%, 67% e, 12% maior do que em solo
isento destes propgulos. em nveis de P baixo, media e alto, respectivamente.
Estes estudos despertaram interesses por lodo o mundo e a micorrizalogia tornou-se o assunto prioritrio de pesquisa em diversas especialidades das cincias vegetais e do solo. Os efeitos das
MAs no crescimento das plantas variam muito. Aumentos de produo de culturas anuais, devidos
inoculao, variam de 5% a 290%, enquanto que os beneficios para o crescimento ou produo de
mudas pr-colonizadas e transplantadas variam de 50% a 8000% (Siqueira & Franco, 1988). Algumas
espcies nem mesmo crescem na ausncia de fungos MAs (Figura 5.8). Os efeitos benficos so
muito complexos e, em muitos casos, bastante: inconsistentes, pois dependem de muitos fatores (Tabela 5.10) que atuam direta ou indiretamente sobre o sistema micorrizico e seus componentes. A
capacidade do fungo de estimular o crescimento da planta conhecida como "efetividade simbitica",
a qual determinada pelas caractersticas dos componentes da sill\.bjose, principalmente do fungo, que
pode apresentar diferentes graus de efetividade, sendo at mesmo ineficaz ou parasitico. De modo
similar, a planta hospedeira, pelas suas caractersticas, varia quanto ao grau de beneficio da associao, conhecido como "dependncia micorrizia". que definida como o grau pelo qual ela depende
das MAs para o crescimento normal em uma dada condio de crescimento. Quanto a esta caracterstica, as plantas so classificadas em:
a) Altamente ou obrigatoriamente dependentes - por exemplo, mandioca, citres. algodo, leguminosas
tropicais, cebola, cafeeiro, pimenta-do-reino, trema (Figura 5.8).
b) Dependentes - por exemplo. soja, milho, feijoeiro, braquiria, sorgo, tomateiro, trigo, seringueira,
cacau.
c) No-dependentes - plantas no-micorrizicas, corno as crucferas, beterraba, conferas.
173
Caracterstica
Fatores principais
Planta.
Sistema radicular
Requerimento nutricional
Taxa de absoro, concentrao no tecido, demanda, distribuio, eficincia de uso, consumo de luxo
e realocao.
Outras
Fungo
Relao
fungo-planta
Infectividade
Rifa externa
Esporulao
Interface
Taxa metablica
Troca de metabolitos
Regulao funcional
174
Tabela 5.11. Efeitos das MAs no crescimento (matria seca, g . planta'l) de algumas espcies de
plantas no-inoculadas (Ni) e inoculadas (M), em condies de alto e baixo P no solo
(Sieverding, 1991).
Espcie
Baixo P
Ni
Efeito*
Ni
Efeito
Mandioca
0,3
4,3
14,3
.0,5
16,4
32,8
Caupi
1,0
2,6
2,6
13,7
36,3
2,6
Estilosantes
O, I
1,3
13,0
2,7
12,2
4,5
Andropogon
0,2
1,3
6,5
34,2
32,2
0,9
Feijoeiro
I, I
3, I
2,8
8,3
25,0
3,0
Milho
1,2
4,8
4,0
59,4
53,7
0,9
Arroz
3,8
3,8
1,0
30,6
31,6
1,0
Soja
3,3
4,4
1,3
8,7
19,3
2,2
Cafeeiro
0,5
0,5
1,0
1,0
2,5
2,5
I~clan
Nj'l\1.
175
I~
Acm - A. morrowae
Gma - G. macrocarpum
10
/
/
/
...J
.=>
U
c:(
Gig- G gregrio
Gcl- G. clarum
I nc -Inoculao mltiplo
/
/
lJ..I
Baixo P
Alto
Efeitos no-nutricionais
Produo e acmulo de
mento.
s~bstncias
de cresci-
176
Nitrognio
Fsforo
Mangans
Zinco e Cobre
Efeitos na concentrao dependem da disponibilidade e do balano. Quantidade acumulada geralmente aumentada. So efeitos secundrios ou indiretos das MAs.
o.
177
Hifas e miclio externo crescem solo adentro e aumentam a explorao do solo, permitindo a
absoro de nutrientes fora da zona de esgotamento. A explorao de microstios ricos em nutrientes,
inexplorados pelas razes no-micorrizadas, resulta em grande eficincia no aproveitamento de P do
solo e utilizao pela planta (Figura 5.10).
fluxo de P via fungo a base de funcionamento desta
simbiose.
P absorvido da soluo do solo pelas hifas por um processo ativo, transfonnado em
grnulos de polifosfato, os quais so transportados pela corrente citoplasmtica at os arbsculos,
onde so hidrolisados pelas fosfatases, liberando Pi, que transferido passivamente para o hospedeiro
e h'anslocado via xilema para as folhas onde atua de modo regulatrio sobre a simbiose (ver Siqueira
& Franco, 1988; Schwab et al., 1991). No sentido oposto ocorre o fluxo de fotossintatos que sustentam o crescimento e atividade metablica do fungo na raiz e no solo.
(o )
a. 400
OI
~60
o
"O
.....
~300
OI
a:- 200
o
"O
o
18.
100
<1
+=
::J
o
.~ 45
co
x Sem micorrizos
!'ia Fungos indgenas
+ Glomus mocrocorpum
~:
1530
120
60
P,os aplicado, mg/kg
a.
~ 30
10
U.
+
li)
E! 15
8.
=>
u
" o
a::
245
( b)
+
~~
x
1530
60
120
P,Os aplicado, mg/kg
245
Figura 5.10. Efeito de MAs na utilizao (a) e recuperao do P (b) aplicado em um latossolo pela
cultura da soja (Siqueira & Paula, 1986).
Os estudos iniciais realizados com J2p indicavam que plantas miconizadas tinham acesso s
mesmas formas de P no solo que aquelas sem MAs (Bolan, 1991) e, ainda, que as plantas com MAs
eram capazes de explorar de modo mais eficiente o P do solo. No entanto, sabe-se hoje que as MAs
so capazes de mobilizar P do solo atravs de modificaes qumicas na rizosfera, incluindo a
mineralizao do P orgnico (Jayachandran et al., 1992). De acordo com as revises de Bolan (199 J)
e Siqueira (1991), a mobilizao do P do solo resulta dos seguintes mecanismos:
a) Produo de cidos orgnicos especficos eficazes na solubilizao ou alterao da dinmica das
formas de P no solo;
b) Elevao dos teores de CO, na lizosfera pela maior atividade heterotrfica da micorriza comparada
com razes no-colonizadas;
c) Produo de quelantes e complexantes capazes de mobilizar principalmente P ligado a ferro; e
d) Maior populao de microrganismos solubilizadores e mineralizadores de fosfatos.
De fato, em estudo conduzido em laboratrio da Escola Superior de Agricultura de Lavras
(ESAL), ficou evidenciado que a braquiriae o estilosantes so capazes de absorver P fixado ou retido
no solo quando inoculados com fungos MAs (Alves, 1988). fracionamento das fonuas de P no solo,
aps o cultivo das plantas, revelou menores quantidades de AI-PO, e Fe-PO, nos tratamentos com
178
MAs, indicando a capacidade das plantas micorrizadas de mobilizar o P retido. Isto, sem dvida, se
reveste de grande interesse para a produo agrcola nos trpicos, onde os solos apresentam elevada
capacidade de reteno de fosfatos, como os latossolos brasileiros.
O influxo de nutrientes na planta resultante da interao entre os fatores do solo e das razes
absorventes, em que as MAs participam ativamente. Quando plantas micorrizadas so tratadas com
fungicidas que matam as hifas, o influxo de P na planta reduzido drasticamente (Hale & Sanders,
1982), evidenciando a importncia da absoro de P via miclio rungico. Este efeito, no entanto,
reduzido em condies de elevado P na soluo do solo. Conforme discutido em Siqueira & Franco
(1988), o influxo pode ser descrito pela seguinte equao:
C
I=Imax
Km+C
onde: Imax = influxo mximo; C = concentrao na superfcie da raiz; e Km = constante de Michaelis
- Menten.
Verifica-se que I depende de C na superfcie, a qual controlada pela difuso do nutriente no
solo at a superfcie absorvente, e que a difuso funo do gradiente de concentrao, LiC, entre um
ponto no solo e a superfcie da raiz. LiC , ento. expressa da seguinte maneira:
[P-solo]- [P-raiz]
LiC =
179
O' Keefe & Sylvia (1991), usando modelos de absoro e considerando dimetro mdio de 8 .lm e 250
Jlm para hifa e razes, respectivamente, estimaram que o aumento de rea de superfcie devido as MAs
pode atingir 1800%, e que o influxo de P pode ser aumentado em 477'% para um aumento de apenas
3% na rea de superfcie. Estes valores, embora estimados, indicam a magnilIlde dos efeitos nutricionais
das MAs.
A quantidade de hifa ou miclio extra-radicular correlaciona-se com efetividade simbitica e
varia enormemente, em conseqncia do fungo, da planta e do ambiente, alcanando valores de at
32cm de hifa. cm" de raiz colonizada ou26m de hifa. g_1 de solo. O' Keefe & Sylvia (1991) salientam
tambm que, alm da elevada capacidade de absoro das hifas,' elas apresentam taxa de extenso 823
vezes maior que a das razes. No entanto, as hifas extra-radiculares so inibidas por alto P e Cu,
consumidas pelos colmbolos e inativadas por biocidas, como o benomyl (Ver Allen, 1992, captulos
4,7el0).
A presena de MAs exerce enorme influncia no requerimento externo de P das culturas
(Yost & Fox, 1979). Em estudo em Latossolo Roxo da regio de Lavras, o requerimento externo de P
foi reduzido em 34% e 56% para o milho e soja, respectivamente, pela presena do fungo GIOlllllS
lIlacrocwpulIl (Fernandes et a!., 1987). A avaliao do requerimento externo de P para algumas espcies pode ser superestimada em at 100 vezes, se realizada na ausncia de MAs (Howeler et a!., 1987),
como se verifica com a mandioca, estilosantes e citros. Os aspectos biolgicos, relacionados ao dficit de P na planta e resposta micorrizao so bem discutidos em Koide (1991). A resposta da planta
depende da sua eficincia de utilizao do P absorvido, sendo controlada pelas caractersticas
morfolgicas, fisiolgicas e fenolgicas que determinam sua demanda, pela capacidade de absoro e
pelo dficit de P (Figura 5.11), cujos valores delimitam o grau de micotrofismo da planta. Segundo
Koide (1991), as MAs beneficiam a planta pela reduo do dficit de P, que resulta do maior suprimento deste nutriente (Figura 5.11). Assim, quanto maior for a demanda de P, maior o dficit e
maior o benefcio ou dependncia da planta (Manjunath & Habte, 1991) e menor sua eficincia de
utilizao de P na ausncia de micorriza (8aon et a!., 1993). De fato, os estudos deste laboratrio
comprovam esta relao (Siqueira, 1990). O efeito equivalente estimado da inoculao com fungos
MAs foi de 20, 30, 60, 120 e 200 kg de P . ha- I , respectivamente para a braquiria, milho, soja,
cafeeiro e estilosantes, que apresentam dependncia micorrizica e demanda de P crescentes e eficincia de utilizao de P do solo decrescente.
A absoro de outros nutrientes tambm influenciada pelas MAs e est envolvida nas respostas em crescimento. Micronutrientes que apresentam baixa mobilidade tm baixa difuso no solo
e as MAs aumentam sua absoro (Marschner & Dell, 1994). Isto o caso de Zn e Cu, cuja presena
de MA pode aliviar deficincia pelo aumento na absoro, tal como se verifica para o P. Em milho
crescendo em solo calcrio, as MAs foram responsveis pela absoro de 16% a 25% do Zn, e 52'% a
62% do Cu (Li et a!., 1991). As MAs tambm aliviam os efeitos de deficincia destes nutr"ientes
induzidas por altos nveis de P (Siqueira & Saggin-Jnior, 1994). Em contraste, os teores de Mn so
geralmente menores em plantas micorrizadas, e isto parece ser devido a efeitos indiretos, resultantes
de alteraes microbiolgicas induzidas pelas MAs na rizosfera, principalmente diminuio na populao de bactrias redutoras de Mn (Marschner & Dell, 1994). Isto, contudo, no exclui outros mecanismos, como absoro seletiva pelas hifas dos fungos MAs. Resultados semelhantes so tambm
relatados para alguns metais pesados, podendo as MAs contribuirem para maior tolerncia das plantas
toxicidade destes elementos.
180
a)
//
/
/
Demando
de P
/'
Dficit / /
....
"O
......
o...
"O
/ )Suprimento
de P
L'/
Disponibilidade de P no solo
..
Figura 5.11. Deficincia de P na planta (a) e sua reduo pela presena de MAs (b); onde: Me NM =
plantas com e sem MAs e dP/dt = suprimento de P para a planta. Adaptado de Koide
(1991).
181
182
A reduo dos malefcios causados pelos fatores biticos tambm comumente relatada nas
MAs. Os fungos MAs nas razes no atuam como agentes de biocontrole, mas amenizam os efeitos ou
danos causados pelos nematides, fungos patognicos do sistema radicular e algumas pragas. As
MAs reduzem a incidncia de doenas na maioria dos casos conhecidos, mas podem aumentar em
algumas situaes. Patgenos foliares, por exemplo, podem ser favorecidos pelas MAs (ver Bagyaraj,
1984). No caso dos nematides, a interao com os fungos MAs pode resultar em aumento, reduo
ou nenhum efeito sobre o ataque, mas existem evidncias de maior resistncia de plantas micorrizadas
e reduo na reproduo dos nematides. Como tambm se verifica em relao aos patgenos
radiculares, os efeitos dos fungos MAs dependem de qual organismo se esLbelece primeiro nas razes.
A interao micorrizas com pragas ainda pouco explorada. Rabin & Pacovsky (1985)
demonstraram que larvas de Heliothis zeu e Spodoptera .Ii1lgiperdu tiveram crescimento e pupao
reduzidos quando alimentadas com folhas oriundas de plantas micorrizadas. Isto parece ser devido ao
acmulo de substncias txicas ou com ao repelente, como compostos aromticos nas plantas
micorrizadas. Estes resultados abrem novas perspectivas para as MAs no contexto da produtividade
agrcola nos trpicos e precisam ser melhor avaliados no Brasil. Alguns pesticidas podem interferir
na micorrizao, como se verifica com o uso do Carboxin, Captan e fungicidas sistmicos. Estes
podem controlar o agente alvo, mas podem tambm reduzir a micorrizao e tornar a cultura mais
exigente em nutrientes e mais suscetvel ao dficit temporrio de gua. A interao MA-patgenos
pode tambm estar envolvida no declnio das monoculturas, que geralmente se manifesta com deficincias nutricionais e ataque de patgenos radiculares. Os estudos conduzidos com aspargos nos Estados Unidos so evidncias destas relaes, envolvendo inclusive a ao de aleloqumicos (Siqueira et
aI., 199Ia). Os mecanismos envolvidos nestas respostas no so conhecidos, mas resultam do melhor
vigor das plantas miconizadas.
As MAs podem tambm atuar como amenizadoras de estresses abiticos diversos, como
acidez, metais pesados, esh'esse osmtico e produtos qumicos (Sylvia & Williams, 1992). Algumas
gramneas, como Brachiuria deClll/lbells e PalliclIlIl virgatlllll L., crescem melhor e absorvem menos
AI e mais Ca e P quando so micorrizadas (Koslowsh:y & Boerner, 1989; Siqueira et aI., 1990). As
MAs podem aumentar a absoro de metais pesados, mas protegem as plantas da toxicidade destes,
quando em concentraes moderadas (Sylvia & Williams, 1992). Os fungos MAs podem tambm
aliviar os efeitos fitotxicos de doses sub-letais de fito toxinas. Siqueira et aI. ( 1991 b) demonstraram
que a aplicao do isoflavonide formononetina, em solo contendo 13 ppb residual do herbicida da
Scepter (Imazaquin) e fungos MAs indgenas, reduziu a fitotoxicidade do herbicida residual para o
milho e sorgo. Estes efeitos no foram observados quando o solo foi autoclavado para eliminar os
propgulos dos fungos MAs. Como j foi exposto, a formononetina estimula a micorrizao, que
atravs de mecanismos desconhecidos protege as plantas da fototoxicidade induzida por Scepter. Embora
ainda sem resultados experimentais, acredita-se que as MAs possam proteger as plantas de outros
produtos fitotxi coso
As hifas dos fungos MAs e seus polissacardeos extracelulares desempenham funo importante na agregao do solo (Tisdall, 1994). Denh'o dos agregados, as hifas fonnam uma rede que
atinge at 50 m de hifa por grama de agregado estvel, contribuindo de modo significativo para a
estabilizao dos mesmos. Estudos realizados na Austrlia (Tisdall, 1994) mostram relaes muito
estreitas entre o cultivo e o comprimento total de hifa e a proporo de agregados estveis. Solos
cultivados ou em pousio continham menos de 5m hifa . g-l de solo e menos de 5% de agregados
estveis, enquanto no solo virgem havia em torno de 17 m de hifa e 24% de agregados estveis.
183
Assim, os agregados so estabilizados pelas MAs que so, por outro lado, protegidas pelos agregados.
Modelo conceitual para os efeitos das MAs na distribuio dos agregados por tamanho mostra que as
razes finas e as hifas so os principais fatores determinantes do dimetro mdio geogrfico (Miller &
Jastrow, 1992). Como solos bem agregados so menos afetados pela eroso e mais produtivos, os
efeitos das MAs na agregao contribuem para a.produtividade e sustentabilidade agrcola e para a
conservao ambiental.
5.5. Tecnologia das MAs
Uma das estratgias para alcanar a sustentabilidade de qualquer ecossistema maximizar o
uso dos microrganismos e processos biolgicos benficos do solo, dentre os quais destacam-se as
MAs. Esta a.sociao apresenta enorme potencial biotecnolgico, exercendo grande impacto na agricultura e qualidade ambiental.
As MAs ocorrem na maioria das espcies de interesse econmico, e os beneficios da
micorrizao para o crescimento, nutrio e sanidade das plantas variam marcadamente em virtude
dos componentes d sistema micorrzico (planta, fungo e solo) e do manejo destes componentes
(Johnson & Pfleger, 1991). Quando se pretende explorr esta simbiose, diversos aspectos destes
componentes precisam ser considerados (Tabela 5.14). Conforme a caracterstica ou condio de
cada componente tm-se estratgias diferentes e esperam-se sucessos variados. Para culturas nomicotrficas (no-micorrzicas), recomenda-se, no caso de agrossistema, a rotao com uma espcie
micotrfica para aumentar o nmero de propgulos no solo. Culturas micorrizo-dependentes devem
ser inoculadas e o grau de sucesso esperado com a inoculao pode ser alto, dependendo das outras
condies. Outro aspecto a fertilidade do solo. Os efeitos da micorrizao so mximos em condies de fertilidade mdia ou baixa (Figura 5.9) onde a inoculao, se praticada, ter sucesso. Em solo
de fertilidade muito baixa, recomenda-se a correo antes da inoculao, enquanto em solos muito
frteis devem-se reduzir as quantidades de nutrientes aplicadas via adubao. A densidade e qualidade dos propgulos do solo. que determinam sua infectividade, ou seja, capacidade de formar MAs
espontneamente, constituem outro aspecto importante. Os fungos indgenas do solo podem ocorrer
em densidade baixa ou alta ou, at mesmo, estar totalmente ausentes, e a efetividade simbitica destes
pode tambm variar muito. Deve-se praticar a inoculao em solos com baixa densidade de propgulos
de baixa efetividade, enquanto em solos com alta densidade de fungos efetivos deve-se manejar o
sistema de modo que esta populao seja mantida sem muita alterao. O sucesso desta prtica, no
entanto, difcil de ser previsto (M iller et aI., 1994). Considerando todos estes aspectos, inoculaes
bem sucedidas so esperadas nas seguintes condies:
a) Solos com baixa infectividade ou totalmente isentos de propgulos de fungos MAs. Exemplos:
solos degradados, fumigados, cultivados com plantas no-hospedeiras ou em pousio por perodos
prolongados;
b) Solos com condio nutricional abaixo do timo para o crescimento mximo da cultura;
c) Em condies ambientais estressantes;
d) Locais com alta incidncia de doenas do sistema radicular;
e) Quando espcies ou isolados fngicos efetivos e adaptados s condies edafoclimticas forem
disponveis para inoculao;
184
Grau de
sucesso
Inocular
Muito alto
Micorrizica
Dependente
Inocular
Alto
No-micorrizica
No se aplica
Rotao cultura
Muito baixo
Red. adubao
Muito baixo
Condies
(planta, solo, fungo)
I - Relao fungo-planta
Benfico
Inocular
Mdio
Baixa
Muito benfico
Inocular
Muito alto
Muito baixa
Nenhum
Adubar e inocular
Alto
Propgulos no solo
Efetividade
---------------------Ausentes
No se aplica
Inocular
Muito alto
Baixa densidade
Baixa
Inocular
Alto
Baixa densidade
Alta
Manejar
Alto
Alta densidade
Baixa
Inocular
Baixo
Alta densidade
Alta
Manter
Baixo
18S
"
absoro favorecida pelas MAs, especialmente Zn e Cu. Menge et aI. (1982) verificaram que. em
solos da Califrnia, Estados Unidos, contendo acima de 34, 12 e 27 ppm de P (Olsen), ln e Mn.
respectivamente, o citro no responde inoculao com G.[asiclllamltl (= G.deserricola). De acordo
com esse estudo, a inoculao seria benfica em 77% dos solos da Califrnia plantados com citros.
As condies biolgicas do solo so tambm de grande infiuncia nas respostas inoculao.
Os efeitos da inoculao so maiores em solos fUll)igados, mas ocorrem tambm em solos no-esterilizados (Figura 5.12 ). Em solos no-fumigados, o fungo introduzido tem que competir com fungos
indgenas, geralmente bem adaptados, e com antagonistas. hiperparasitas e outros componentes da
biota do solo. A produtividade da mandioca, em resposta inoculao com fungos MAs, decresceu de
15% a 28% em solos com at 2 \3 esporos. 100 g.1 para 12% e 11 %. em solos contendo 823 e 1717
esporos 100 g.1 de solo, respectivamente (Sieverding, 1991). Do mesmo modo, a resposta do
estilosantes in oculao foi minima em solos com mais de 20% de colonizao pelos fungos indgenas (Mosse, 1981). No entanto, a infectividade da maioria dos solos agrcolas baixa, podendo-se
obter respostas inoculao, como se verifica para o cafeeiro (Figura 5.12) e soja em solo de cerrado.
186
As MAs no so compatveis e nem mesmo necessrias em sistemas manejados intensivamente, mas podem "representar as razes de uma agricultura sustentvel". A importncia relativa e
potencial das MAs para a produo agricola mundial decresce na seguinte ordem: agrossistemas de
baixo insumo, sistemas altamente alterados e sistemas manejados intensivamente. Contudo, as presses para reduo no uso de fertilizantes e biocidas, a adoo de sistemas de rotao e cultivos reduzidos, melhor integrao com os ambientalistas e o desenvolvimento de tecnologias para explorao das
MAs contribuem para aumentar sua importncia para os atuais sistemas intensivos de produo agrcola. Nos sistemas alternativos de produo, como no LISA ("low input sustainable agriculture") e
agricultura orgnica, as MAs desempenham papel de grande importncia (Douds-Jnior et aI., 1993).
Em condies controladas de produo, como aquelas com plantas envasadas e substratos esterilizados, mudas em viveiros com solos fumigados .e programas de recuperao de reas degradadas, as
MAs so geralmente essenciais para garantir o sucesso da explorao.
Apesar do enorme potencial e do grande volume de estudos, a explorao dos fungos MAs
em larga escala ainda apresenta vrios obstculos, sendo os principais apresentados a seguir:
a) Biologia do fungo ainda pouco conhecida. O carter biotrfico obrigatrio dificulta estudos da
biologia bsica e multiplicao em larga escala;
b) Falta de inoculantes aceitos comercialmente. Apesar de vrias tentativas, a comercializao dos
fungos MAs ainda muito limitada. Vrias empresas internacionais colocaram no mercado produtos como Nutri-Link (NPl-Estados Unidos), Mykovan (Filipinas), Mycori-Mix (Primier Peat-Canad) e Vaminoc (UK e Japo), mas nenhum teve aceitao ampla.
c) Mercado muito fragmentado devido diversidade dos sistemas onde o uso promissor;
d) Expectativas irreais dos diversos segmentos envolvidos na explorao dos fungos MAs;
e) Falta de resultados consistentes e previsveis a campo e de anlise de custo e benefcios.
A falta de inoculante aceito comercialmente representa o principal obstculo para a explorao comercial dos fungos MAs. Mesmo existindo vrias alternativas para multiplicao do fungo in
vivo rSylvia & Jarstfer, 1994), utilizando-se meios inertes sem solo e hidroponia, inoculantes aceitos
comercialmente so ainda raros. Mesmo assim, os fungos MAs podem ser multiplicados em solos ou
substratos desinfestados e utilizados para inoculaes. Para se conseguir isto, fungos devem ser isolados ou introduzidos, multiplicados e selecionados para inoculao ou mesmo para serem fornecidos
aos produtores ou fornecedores de inoculantes (Figura 5.13). Organismos selecionados so utilizados para inoculaes diversas e a viabilidade tcnica e econmica do processo pode ser avaliada. A
partir das etapas iniciais de um programa de pesquisa, constatou-se, em laboratrio da ESAL, que a
inoculao do cafeeiro com fungos MAs, em solos pobres dos trpicos, vivel na cafeicultura brasileira (Siqueira et aI., 1993a). Mudas de cafeeiro devem ser inoculadas com isolados de G/OII/lIS
etlllJicatlllll nativos do agrossistema cafeeiro selecionados quant efetividade simbitica, ou com
Gigaspora lIlargarita, tambm de ocorrncia. natural noscafeel;os. Mudas de cafeeiro inoculadas na
repicagem para sacos plsticos, sementeiras mveis (bandejas) ou tubetes, crescem mais rapidamente
e com maior vigor que aquelas sem inoculao. Estes aspectos se manifestam tambm quando estas
so transplantadas para o campo (Siqueira et aI., 1993b). A pr-colonizao das mudas durante a
formao representou aumento de produtividade mdia, em trs anos, equivalente a 7 sacas (de 60 kg)
de caf beneficiado. ha" . ano", Apesar de no se conhecerem os custos exatos da inoculao nas
condies brasileiras, pode-se afirmar que a pr-colonizao das mudas economicamente vivel,
considerando os custos de U$ 5,00 , 1000 mudas" (equivalente a U$ 12,50 , ha"), praticados nos
Estados Unidos. Estudos conduzidos em laboratrio da ESAL indicam, em vrios experimentos.
187
aumentos de produtividade mdia do cafeeiro da ordem de 60% devido pr-colonizao das mudas
e plantio de lavouras em solo de cerrado (Siqueira e( al., 1993a): Testes de inoculao realizados por
agricultores, mediante o fornecimento de inoculante (solo infestado), tambm demonstram as vantagens da inoculao. Procedimentos semelhantes podem ser adotados para outras culturas que passam
por fase de formao de mudas e para espcies destinadas a reflorestamento ou recuperao de reas
degradadas (Franco et a1., 1992). Portanto, embora ainda sem uma tecnologia amplamente utilizada,
a aplicao das MAs em sistemas de produo de mudas uma realidade vivel.
Culturas de fungos
nativos ou introduzidos
Multiplicao em
planta
hospedeira
Fornecedores
de
(,no,",on,.
Aval i a o da efetividade
eficincia simbitica
em larga
e inoculao
Mu I tiplicao
Plantas
m icropropagadas
Substratos
inertes
Viabilidade
tcnica
el/
escala
Mudas
em viveiro
e econmica
Culturas
anuais
188
o uso das MAs em culturas de ciclo curto, como produtoras de gros, mais difcil de ser
praticado via inoculaes. A maioria dos solos agrcolas tem propgulos de MAs, mas geralmente
estes no se encontram em nveis suficientes para alcanar taxas de colonizao capazes de garantir
beneficios a culturas de ciclo curto, como a soja e o milho. A colonizao das razes deve atingir seu
mximo antes do pico de demanda de nutrientes (P) (O'Keffe& Sylvia, 1991), quando o dficit de P
mximo. Como isto no ocorre, devido baixa infectividade do solo, a inoculao geralmente
benfica quando existe dficit nutricional. Diversos estudos realizados no exterior apontam os benefcios da inoculao (por exemplo, Baltruschat, 1987), mas deixam claro a inviabilidade econmica da
tecnologia, devido principalmente elevada quantidade de inoculante necessria e ao custo de produo e aplicao do mesmo.
Alternativamente, pode-se manejar a populao fngica do solo atravs de rotao de culturas, visando aumentar a densidade de propgulos e colonizao micorrzica. Mas, segundo Mosse,
(1986), citado por MilIer et aI. (1994), "devido diversidade dos fungos MAs, ao conhecimento inadequado das relaes fungo-solo e variabilidade de resposta das plantas, difcil predizer os efeitos
da modificao dos sistemas micorrzicos na produo agrcola ". Assim, o manejo das MAs em
campos de produo, embora de grande interesse biolgico e ambiental, parece difcil de ser conseguido. No obstante, em casos como os de solos sob pousio prolongado, cultivados com planta nohospedeiras e nas monoculturas prolongadas, prticas como a rotao de culturas podem aumentar a
infectividade do solo. As condies micorrzicas do solo e a dependncia das culturas so fatores
importantes na definio de sistemas de rotao, devendo-se considerar o seguinte:
a) utilizar culturas com baixa dependncia micorrzica, em solos com baixa infectividade;
b) utilizar culturas com elevada dependncia micorrzica, em solos com alta infectividade;
c) utilizar, em solos infestados com patgenos, plantas no-hospedeiras destes.
A descoberta de compostos aromticos capazes de estimular a miconizao (Nair et aI., 1991;
Siqueira et aI., 1991 b) abre novas perspectivas para aplicao das MAs em sistemas agrcolas. A
aplicao de formononetina no solo, por ocasio da semeadura, acelera a micorrizao. Este composto acha-se patenteado nos Estados Unidos como bioestimulante de solo (US patents n 5002603, 5085682
e 5125955) e, conforme resultados preliminares (Tabela 5.15), apresenta enorme potencial para o
desenvolvimento de tecnologia para a agricultura brasileira e mundial. H necessidade, porm, de
ampla experimentao a campo, para determinar solos e condies onde a aplicao do composto
tenha efeito garantido.
Tabela 5.15. Efeito da aplicao de formononetina sinttica nas produtividades do milho e da soja,
em latossolo na regio de Lavras (Siqueira et aI., 1992).
Milho
Variveis
Controle
Produtividade (kg . ha")
Aumento produo (%)
Aumento receita (U$ . ha")
Impacto estimado (U$ bi)
Quantidade aplicada (g . ha")
Na agricultura bmsill!irn.
3555
Soja
Formononetin3
4405
24
72
0,9
125
Controle
1510
Formononetina
2289
52
140
1,6
250
189
190
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193
194
CAPTULO 6
A BIOMASSA MICROBIANA DO SOLO E SUA IMPORTNCIA
NOS ECOSSISTEMAS TERRESTRES
David A. Wardle 1
Mariangela Hungria 2
6.1. Introduo
A biomassa microbiana do solo definida como o corriponente microbiano vivo do solo e
composta de bactrias, fungos, microfauna e algas. O conceito de que, para determinados estudos,
toda a populao microbiana poderia ser tratada como um todo, foi proposto por Jenkinson (1966).
Para se ter uma idia da diversidade e quantidade de microrganismos, Ritz et a!. (1994) citam que em
apenas 1 cm 3 de solo sob pastagem pode conter milhes de bactrias, milhares de protozorios, centenas de metros de hifas de fungos, centenas de fungos, insetos e outros organismos maiores.
A biomassa microbiana um componente crtico de todos os ecossistemas naturais ou manipulados pelo homem, porque o agente regulador da taxa de decomposio da matl~a orgnica e da
ciclagem dos elementos (Jenkinson & Ladd, 1981), atuando, portanto, como fonte e dreno ("source"
e "sink") dos nutrientes necessrios ao crescimento das plantas (Ladd et a!., 1985). J foram constatadas relaes estreitas entre a biomassa microbianae a produtividade das plantas (Okano et a!., 1987),
taxa de amonificao (Holmes & Zak, 1994), taxa de decomposio de resduos vegetais (Flannagan
& Van eleve, 1983) e a biomassa dos nveis trficos superiores (Wardle, 1994a).
Desde o desenvolvimento da tcnica de incubao-fumigao para quantificar a biomassa
microbiana (Jenkinson & Powlson, 1976), o nmero de estudos sobre esse tema tem aumentado substancialmente, muitos dos quais relacionados ao desenvolvimento de metodologias para quantificar a
biomassa, o que foi discutido recentemente por Kunc (1994), Powlson (1994) e Wardle (1994b).
Mais recentemente, com o desenvolvimento das fcnicas de biologia molecular, os estudos
sobre aspectos fisiolgicos e genticos da biomassa e sobre a diversidade da comunidade microbiana
tambm tm sido intensificados. Em relao diversidade bacteriana, por exemplo, Torsvik et a!.
(1994) observaram que, pela extrao e anlise do DNA das bactl~as do solo, foi possvel detectar
uma diversidade cerca de duzentas vezes supel~or encontrada nos estudos tradicionais de caracterizao fenotpica ill vitm. Outros mtodos moleculares, como o uso de PCR ("polymerase chain
reaction") e hibridizao com seqncias 16S rRNA, foram recentemente compilados por Ritz et a!.
( 1994).
Neste captulo so abordados os principais aspectos ecolgicos da biomassa microbiana, particularmente em relao influncia dos fatores ambientais biticos e abiticos.
'Pesquisador, Ph.D" AgRcs\!lIrch Ruakum Agriculluml ReSl.!arch Celller. Privalc Hag 3123, Hamilton, New ZenJalll1.
2Pesquisadom, Ph.D. EMBHAI'A-Ccnlru Nil.l.:ional d..: P\!sl[uisa de Soja (CNI'Su), Cnixa !'ostal1fJl. CEI' H600J-(170, Londrina,PR.
196
197
Embora vrios estudos tenham sido feitos para investigar a resposta da biomassa microbiana
ao C e N da matlia orgnica, pouco se sabe sobre a resposta da biomassa microbiana a outros elementos, como o fsforo. A maioria dos estudos conduzidos investigou a resposta da biomassa microbiana
adio de fertilizantes contendo N e P, de modo que os efeitos no podem ser separados (Wardle,
1992). Os nveis de P limitam a biomassa microbiana em algumas situaes, mas no em outras
(Scheu, 1990), e a adio de P pode exercer efeitos estimulatrios (Biederbeck et aI., 1984) ou neutros
(Tate et aI., 1991). H evidncias, tambm, de que a biomassa microbiana pode mostrar uma relao
positiva com o teor de enxofre e potssio do solo (Lawrence & Germida, 1988).
Finalmente, parece haver concordncia que a reduo nos teores de C e N da matria orgnica
provoca um decrscimo no teor da biomassa microbiana. reas sob pastagem tm maior biomassa do
que solos cultivados (Drury et aI., 1991; Pfenning et aI., 1992) e menor do que solos sob vegetao
natural, como florestas (Ayanaba et aI., 1976; Srivasava & Singh, 1991). A retirada de florestas pode
resultar, a longo prazo, em efeitos negativos na biomassa microbiana (Luizou et aI., 1992; Mazzmino
et aI., 1993).
Resultados encontrados no Brasil geralmente contrastam com os obtidos em regies temperadas, apresentando maior ciclagem da biomassa. Desse modo, a queimada da vegetao natural reduz a
biomassa microbiana (Fritze et aI., 1993), tendo provocado uma queda de 87'Yo no teor desta, conforme estudo conduzido na Regio Amaznica (Pfenning et aI., 1992). Na Regio Sul do Brasil tambm
foi constatado que redues no teor de matlia orgnica causadas pelo cultivo do solo refletem na
biomassa microbiana. No Paran, a retirada da mata natural (Figura 6.1) ou do campo nativo no Rio
Grande do Sul reduziu o teor de C e N do solo. Em apenas quatro anos foi constatado um decrscimo
drstico no teor de biomassa microbiana no solo descoberto (Figura 6.2) e decrscimos menores,
porm substanciais, quando o campo nativo foi substituido por guandu e milho (39'%), siratro (33%1),
aveia e milho (47%), ou pangola (48%) (Cattelan & Vidor, 1990a,b).
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Mata
Convencional
Mata
Convencionai
Figura 6.1. C-orgnico e N-totalno solo, na camada de O-I Ocm, aps sete anos e meio de cultivo em
um LR eutrfico em Londlina, PR, e em um LR lico em Campo Mouro, PRo Letras
indicam diferenas estatsticas no nvel de 5%, pelo teste de Tukey, para cada local. Segundo Santos (1993 l.
198
60
D
50
Biomassa
lZ3 C-C02
40
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20
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O
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Figura 6.2. Biomassa microbiana, avaliada pelo mtodo de fumigao-incubao (mg.100 g-I solo), e atividade
microbiana, estimada pela liberao de CO2 do solo
no-fumigado, durante 20 dias, em um PVE do
Rio Grande do Sul, sob diferentes sistemas de cultivo. Avaliaes realizadas na camada de 0-5 cm
do solo. Valores mdios de 12 pocas. Segundo
Cattelan & Vidor (1990b).
Alguns sistemas de plantio tambm permitem teores mais elevados de matria orgnica. Um
exemplo tpico o do plantio direto em relao ao plantio convencional. No plantio convencional so
utilizadas as operaes de cultivo primrio, com arao (arado de disco, aiveca ou escarificador),
seguidas pelo cultivo secundrio, com grade de disco pesada. A arao e gradagem podem, ainda, ser
feitas em uma nica operao, com uma grade de disco. J no plantio direto, bastante utilizado no sul
do Brasil, a semeadura realizada sob resduos da cultura anterior sem movimentao do solo, exceto
na linha de semeadura, o que. permite grande acmulo de resduos vegetais (Figura 6.3). Quando
comparado ao plantio convencional, o plantio direto favorece o acmulo de matria orgnica (Figura
6.4) e a biomassa microbiana (Figura 6.5). Essa diferena observada na biomassa microbiana entre o
plantio direto e convencional nos solos do Paran muito mais elevada do que as observadas em
regies temperadas, que ficam em torno de 10% a 20'X, (Wardle, 1992, 1994a).
199
Nesses estudos, porm, dificil separar os efeitos diretos, da adio de C e N pela adio de
matria orgnica, dos efeitos indiretos, causados pelas menores variaes de temperatura e umidade,
fatores estes que esto diretamente relacionados atividade da biomassa microbiana. A adio de
6,6 t de palha.ha- I a um solo descoberto no Rio Grande do Sul, por exemplo, reduziu a temperatura
mxima do solo de 38" C para 3D" C (Morote et ai., 1990). No Paran, a temperatura mxima, a 3 cm
em solo sob plantio direto , atingiu 36"C, enquanto que sob plantio convencional foi de 46"C, constatando-se, ainda, menor disponibilidade de gua (Sidiras & Pavan, 1985). Essas diferenas na temperatura e umidade do solo podem ser responsveis, em grande parte, pela reduo do nmero de clulas
de certos microrganismos do solo, como os fixadores de nitrognio, fungos micorrzicos vesculoarbusculares (Voss & Sidiras, 1985; Andrade et aI., 19933), actinomicetos, solubilizadores de fosfato.
Por outro lado , foram observados incrementos de 57% na proporo de esporos de bactrias. que so
formas de resistncia que aparecem sob condies de estresse (Cattelan & Vidor, I 990b ).
200
C - Orgdnico (%)
0-1
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50
40
em
52%
30
20
10
O
Convencional
Direto
201
Como as plantas regulam a fonte de nutrientes para os microrganismos e contribuem qualitativa e quantitativamente para o acmulo de matria orgnica, a natureza da comunidade vegetal muito
importante. Conseqentemente, os estudos sobre sucesso de plantas normalmente mostram padres
previsveis de acmulo de biomassa, pelo menos nos estdios iniciais (Halvorson et aI., 1991; Fenn et
aI., 1993). Essas mudanas so, quase que certamente, relacionadas s limitaes de C e N (Zak et aI.,
1990; Bosatta & gren, 1994) e, nos estdios posteriores, possivelmente devido ao P (Scheu, 1990).
Flutuaes temporais da biomassa microbiana tambm so menores nos sistemas posteriores de sucesso (Santruckova, 1992), sugerindo que a dinmica da biomassa microbiana estabiliza medida
que o ecossistema desenvolve.
BIOMASSA MICROBIANA
(pg N/g SOLO SECO)
N
OI
Moi - 92
Ago- 92
cn
UI
.....
Antes do Trigo
O
Q
Out - 92
Nov- 92
Jan - 93
Abr- 93
Jun - 93
..
Antes da Soja
O"
da Soja
O"
202
203
do-se observar que a relao C:N da biomassa reduzida nas proximidades das minas de cobre (Bth
et aI., 1991). Os fungicidas freqentemente exercem efeito inibitrio nos componentes fngicos da
biomassa microbiana (Anderson et aI., 1981), mas os herbicidas tendem a exercer efeitos variveis,
geralmente de menor importncia e intensidade, quando comparados com a variao espacial e temporal da biomassa microbiana (Wardle & Parkinson, 1991). So poucos os relatos confiveis que
demonstram que quando os herbicidas foram aplicados em concentraes realistas afetaram a biomassa
microbiana. Muitos estudos que relataram efeitos inibitrios de herbicidas em nivel de campo estavam
provavelmente avaliando os efeitos indiretos pela alterao da cobertura vegetal (Wardle, 1994a).
I
1
1
Mocrofauno
predadora
I
Nematides
predadores
Nemafldes
de bactrios
de fungos
predador.s
1
1
I
1
1
1
1
caros e
cOlepteros
soprdfoQoG
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I
: ......... I ............. .
Macrofouna
soprofoga
Matria
orgnica
das plantai
I
I
I
__________________ J1
204
(1992) demonsh'ou que, de um modo gemi, a biomassa microbiana, mas no a relao C da biomassa:C
orgnico, fortemente correi acionada com o teor de argila no solo. Este resultado sugere que o principal papel da argila no estmulo da biomassa microbiana est relacionado sua habilidade de reter C
e N orgnicos.
6.3.2. Estl'UtUl'3
A biomassa microbiana do solo tambm alterada pela esh'utura do solo e, com o aumento no
tamanho e estabilidade dos agregados, geralmente ocorre um incremento no teor da biomassa (Drury
et aI., 1991; Carter & Mele, 1992). Em sistemas de cultivo onde as prticas de preparo do solo so
minimizadas, a estabilidade dos agregados do solo aumenta. Quando o sistema convencional foi
comparado com o plantio direto em solos do Paran, o ltimo favoreceu a estabilidade dos agregados,
avaliada pela maior proporo de agregados maiores do que 4mm e maior dimetro mdio geomtrico
das partculas (Santos, 1993). Essas condies do plantio direto favorecem o desenvolvimento de
hifas de fungos (Hendlix et aI., 1986) e, aparentemente, existe um mecanismo de reh'oalimentao
enh'e a esh"Utura do solo e a formao de cadeias de hifas de fungos.
6.4. Microclima do Solo
Normalmente a biomassa microbiana declina rapidamente com a secagem do solo e aumenta
com a recuperao do teor de umidade. Estudos com istopos indicam que uma proporo significativa do C e N da biomassa microbiana pode ser liberada durante os ciclos de secagem e umedecimento
(Mammoto et aI., 1982). Contudo, existem alguns relatos de relaes negativas entre a biomassa e a
umidade do solo, que ocorreram pelo estmulo de predadores sob alta umidade (Flanagan & van Cleve,
1977) ou morte das razes durante longos peIodos de seca, que estimulam o crescimento de fungos
tolerantes (Ross et aI., 1984). Outros esrudos que detectaram relaes negativas ou aleatrias entre a
biomassa microbiana e a umidade do solo provavelmente indicam problemas metodolgicos, ou mesmo que as avaliaes da biomassa microbiana variam com os gradientes de umidade do solo (Wardle
& Parkinson, 1990).
A biomassa microbiana composta de diversas espcies, que apresentam diferentes !,'Taus de
suscetibilidade secagem. Alm disso, a biomassa microbiana em solos submetidos a ciclos freqentes de secagem e umedecimento , de um modo geral, mais resistente deficincia hdrica do que a
biomassa de solos que no passam por ciclos de umidade (Sparling et aI., 1981 l. As condies de seca
reduzem a disponibilidade de solutos e, portanto, razovel assumir que os microrganismos adaptados seca sejam tolerantes a pelodos longos sem nutLientes (Rosacker & Kief, 1990). Por outro lado,
o metabolismo anaerbio menos ativo do que o aerbio e, provavelmente por isso, a biomassa de
solos continuamente alagados inferior a dos solos com boa aerao. Em um solo de vrzea na Amaznia, a biomassa foi duas a h's vezes inferior a do solo com boa aerao (Pfenning et aI., 1992).
A temperarura do solo tambm afeta a biomassa microbiana, embora no se tenha um entendimento perfeito sobre os processos envolvidos. Temperaruras elevadas podem encorajar a atividade
microbiana com a conseqente deficincia de substrato, resultando no declnio da biomassa microbiana
(Joergensen et aI., 1990). Entretanto, a biomassa microbiana mostra relaes variveis com a temperarura, o que est presumivelmente relacionado com a temperarura tima das espcies presentes em um
205
detenninado sistema (Wardle, 1992). Ciclos de congelamento e descongelamento podem ser importantes na ciclagem microbiana, uma vez que o descongelamento rapidamente seguido por crescimento microbiano, auxiliado, ainda que parcialmente, pela disponibilidade de substrato (Flanagan &
van Cleve, 1983).
As flutuaes na biomassa microbiana so governadas, pelo menos em parte, pela umidade e
temperatura do solo. razovel, portanto, esperar variaes sazonais elevadas no teor de biomassa
microbiana em locais onde as diferenas climticas entre as estaes do ano sejam grandes e, como
exemplo, Flanagan & van Cleve (1977) e Cochran et aI. (1989) citam as reas subpolar e boreal e
Singh et aI. (1989) as reas com estaes midas e secas pronunciadas. No caso da comparao entre
o plantio direto e o plantio convencional, certamente grande parte do efeito positivo do primeiro sistema na biomassa microbiana (Andrade et aI., 1993a) se deve s menores variaes da umidade e temperatura do solo (Sidiras & Pavan, 1985). Wardle (1992) identificou, atravs da anlise de dados da
literatura, quatro respostas da biomassa microbiana s variaes sazonais, que foram denominadas de:
1) resposta positiva ao aumento no teor de umidade do solo; 2) resposta negativa ao aumento no teor
de umidade; 3) resposta positiva ao aumento na temperatura; e 4) resposta positiva produo de
razes. As respostas da biomassa s mudanas sazonais so importantes nos estudos de modelagem
utilizados para prever a ciclagem microbiana. Segundo esses modelos, a ciclagem mais rpida em
climas quentes (que freqentemente apresentam menor variao entre as estaes. Contudo, admitese que a ciclagem microbiana em climas mais fi'ios, com extremos de temperatura durante o ano, possa
ser maior do que se acredita.
206
bacteriana regulada por foras "de cima para baixo" (pela macrofauna, por exemplo), enquanto que
os fungos so regulados "de baixo para cima", ou seja, pela disponibilidade de substratos e nveis de
matria orgnica (Wardle & Yeates, 1993; Ward1e, 1994a). As interaes entre a microfauna e a biomassa
microbiana (principalmente bactrias) incrementam a cic1agem microbiana, que tem implicaes importantes para intensi ficar a disponibilidade de nutrientes (Bouwman et aI., 1994) e o crescimento das
plantas (Ingham et aI., 1985).
207
208
Tabela 6.1. Valores mdios do C (C mic) e do N (N mic) da biomassa microbiana e da relao C mic:C
orgnico total do solo CC org) e N total do solo (N tot) em uma srie de ecossistemas,
resultantes de uma reviso de 112 estudos. Modificado de Wardle (1992).
N mic.(N total)-I
C mic
(llgC.g-1 solo)
C mie.(C org)-I
(x 100)
N mie
(llgN.g-1 solo)
986
1,99
100
4,41
653
3,21
65
3,44
Floresta temperada
(angiosperma)
877
1,43
93
3,19
Floresta temperada
(confera)
736
0,93
342
1011
2,87
2,04
35
170
4,24
3,66
Terra cultivada
tropical
240
1,96
48
3,99
Terra cultivada
climas amenos
331
2,47
47
2,73
Terra cultivada
climas frios
461
2,68
66
3,32
Ecossistema
Pastagem tropical
pastagem temperada
(x 100)
209
proveniente da decomposio mundial (SQlith & Paul, 1990). Deve-se salientar, ainda, que os outros
50% esto tambm relacionados com a atividade microbiana, embora no entrem diretamente na formao da biomassa, mas que so gerados pela ineficincia microbiana durante a sntese e manuteno
dos microrganismos.
6.7. Significado das Estimativas da Biomassa Microbiana
Enquanto a biomassa microbiana fornece uma indicao da quantidade de nutrientes imobilizados nos compartimentos lbeis da matria orgnica do solo, as avaliaes da biomassa, sem a associao a outros dados, no informam sobre a atividade biolgica dos solos, decomposio ou ciclagem
de nutrientes (Jenkinson, 1988). As avaliaes da biomassa microbiana so mais teis, portanto, quando combinadas com outros componentes do solo, como nos estudos sobre interao trfica (Andren et
aI., .1990), ecossistemas (Flanagan & van Cleve, 1983), atividade do solo (N ordgren, 1992), produtividade primlia (.Jenkinson et aI., 1992) ou em conjunto com outras avaliaes sobre estresses e alteraes ecolgicas. Informaes teis tambm podem ser obtidas pela avaliao da biomassa microbiana
em diferentes pocas do ano, desde que essa um indicativo dos fluxos de nutrientes que podem
ocorrer, e como eles interagem com o crescimento das plantas. Como exemplo, Singh et aI. (1989)
encontraram que, em florestas tropicais secas, o declnio na liberao de nutrientes devido s variaes sazonais coincidiu com o perodo em que a absoro de nutlientes pelas plantas era mxima.
Resultados semelhantes foram encontrados no Brasil, conforme discutido anteriormente (Figura 6.6).
H evidncias, tambm, de que somente parte da biomassa microbiana ativa (van de Werf & Verstraete,
1987).
Como cbncluso, pode-se dizer que a biomassa microbiana varia consideravelmente em termos temporais e espaciais, determinados por fatores abiticos e biticos. O desafio para o futuro ser
determinar as conseqncias diretas dessas variaes nos ecossistemas e na produtividade dos sistemas aglcolas auto-sustentveis.
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CAPTULO 7
Professor, Ph.D., Universidnde Fedeml do Rio de Janeiro (UFIU), Instituto de Microbiologia, Cidade Universitria, CCS, Bloco 1, CEP 21944-970,
Rio de Janeiro. lU.
218
219
220
to de mutantes. Para se ter uma idia, considerando o tempo de gerao de 30 minutos chega-se, a
partir de uma clula, a aproximadamente um milho de clulas, em nove horas e trinta minutos e a um
bilho de clulas em 15h. O aparecimento de um mutante resistente penicilina ocorre na proporo
de um para cada 10 milhes de clulas. interessante notar que, quando o ambiente muito adverso,
parece que a taxa de mutagenicidade aumenta entre os microrganismos. Sob intenso estresse, os
microrganismos no tm mais a possibilidade de atender grande demanda energtica para realizar o
reparo de seu DNA, persistindo todos os tipos de defeitos genticos, o que aumenta a taxa de mutao.
Conseqentemente, a probabilidade de aparecimento de um mutante adaptado quelas condies inicialmente adversas maior e, com isto, as possibilidades de sobrevivncia da populao aumentam
(Koch, 1993). Outra grande vantagem deste crescimento a de formar, em pouco tempo, grandes
biomassas, muito superiores quelas formadas por animais ou plantas no mesmo perodo.
221
consiste em captao da energia luminosa pelo fotossensibilizador e sua transmisso direta para a
molcula do xenobionte. Segundo outro mecanismo, estas substncias fotossensibilizadoras funcionam como receptores ou doadores de eltrons e/ou como grupos reativos, como o H+ ou OH-, que
promovem, por sua vez, a transformao do xenobionte. A ferredoxina e as flavoprotenas das algas
so fotossensibilizadores moi ecul armente bastante estveis, que permitem um tempo de sobrevivncia, aps a morte celular das algas, capaz de promover a degradao de pesticidas.
7.3.2.3. Cofatores
Os cofatores, como a porfirina, tm origem microbiana e so liberados no ambiente, tornandose capazes de promover reaes no-enzimticas de declorinao do DDT e DTE. possvel que
substncias como glutation, citocromos, NADH, entre outras, tambm sejam fatores de degradao de
xenobiontes no ambiente.
7.3.3. Reaes
7.3.3.1. Hidrlise
A hidrlise qumica ou enzimtica uma das reaes mais importantes, correspondendo
adio de uma molcula de gua ao xenobionte, transformando-o, muitas vezes, em substncia notxica. Uma das razes da alta freqncia com que estas reaes ocorrem , provavelmente, a excreo
de enzimas hidrolticas pelo microrganismo, as chamadas exoenzimas. Elas hidrolisam molculas
grandes, miando ouh'as menores, que podem, com isto, ser transportadas para o interior celular.
Exoenzimas so encontradas em ambientes terrestres e aquticos. Scheunert (1992) destaca como
exemplos deste tipo de reaes a hidrlise da ligao ster dos inseticidas organofosforados e a de!,'Tadao dos carbamatos e dos piretrides (Tabela 7.1). Reaes de hidrlise ocorrem tanto em animais
como em plantas.
7.3.3.2. Reduo
Uma das reaes mais comuns de reduo a de dehalogenao, cuja importncia se deve,
sobretudo, ao fato de ser condio para reaes subseqentes de degradao da mesma molcula
(Tabela 7.2) (Schneurt, 1992). Uma das possibilidades que esta reao ocorra em condies anaerbias
promovidas enzimaticamente pelo FADH, situado na membrana de E. t.:oli, transformando o DDT em
TDE. Ouh'o sistema de reduo, acoplado oxidao mista atravs do citocromo P-450, encontrado
em alguns microrganismos (Figura 7.1) (Matsumura, 1982). Este sistema s funciona em condies
anaerbias. Por fim, reaes no-enzimticas, envolvendo cofatores de flavoproteinas, como o FAD,
FMN ou ribofIavina resistentes a proteases e ao calor, tambm podem promover reaes de reduo
(Figura 7.2). Reaes de reduo de pesticidas tambm so enconh'adas em plantas. No ambiente, o
potencial de oxidorreduo um fator importante a ser considerado. A degradao de determinados
organoclorados, como beta e gama HCH (Iindane), est relacionada a um potencial redox entre -40 e
-100 m V, encontrado durante alguns dias aps inundao. Esta condio anaerbia estimula a proliferao de C/ostrliulIl sp. e a atividade de ouh'os anaerbios eficazes na biodegradao.
222
Frmulas
Exemplos
ster carboxlico
R - COOR' -t R -COOH
Malation, Kelevan
o
11
ster de sulfato
R-CH 2 -O -S-OH -t
Disul
II
O
II
R- CH2 0H e/ou HO - S - OH
11
Carbamatos
R-NH-C-R'-t
Benomil, Carbaril
11
O
R- NH2 e/ou HOOClt
"".0
Nitrilos
R-C=N -tR-C
"NH2
-tR- CO OH
Epxidos
-C-C--t-C-C\/
I I
O
OHOH
Dieudrin
Declorinao
- C - CI-t - C - OH
Tricloroacetato,
cido 4-Cloroben.zico
223
Frmulas
Exemplos
C-Idroxilao
R-H-+R-OH
R- CH, - R: -+ R-CHOH- R'
Cipennetrin,
2,4-dicIorotlmol,
Carbofuran
C-Carboxilao
R-CH, -OH-+R-COOH
Metabolito de Cipennetrina
Metiloxidao
R- CHJ -+ R-CH,OH
Bromacil
Epoxidao
/0,
H H
Formao de cetana
Clivagem C~C
Aldrin, heptacIor
R - CH, - R' -) R- CO - R:
R -CHOH- R: -+ R-CO- R'
Carbofuran
R-C~C-R:-+
R - COOH + HOOC - K
Clivagem C~O
R- C - R' -+ RCOOH
Kelevan
II
O
C-dehidrogenase
Lindane
N-demetilao
R- N-R' -+ [R- N - R]
Feniluria
CH]
CH,OH
-+R-NH-R'
R- NH, - R--NH
N-oxidao
R- NH,-+ R- NO
-+R-NO,
Anilinas clorinadas
I
O
S-oxidao
R - S - R' -> R - SO - K
-+R- SO,-R'
Aldicarb, carboxin
R - SH + HS - R' ->
R-S-S-R'
Substituio de S por O
/OR
/OR
(RO), P -+ (RO), P
- ~S'
- ~O
Paration
Etileno, uria
Clivagem de ter
R-O-R-+ROH
2,4-D
224
, ..-
substrato para
(oxidao (5)
- ------.....
"
r--L-J
'~
--1
r-'"
lOx. P450r,---:: 5 :
: Ox. P450 :
r-
'T---"
I
L----f!
aerbia
o,:
\'---,
IRed.
inibio por
+\
P4SO!
co-j ~
NADPH
~NADPH
redutase.
~ \substrato para
4501
I Red. P ~
reduo
\
CI-\
L_J
~---------,
anaerbia
(R-CI)
RFigura 7.1. Via metablica proposta para a reduo do pesticida pela funo das
oxidases mistas em condies anaerbias.
pesticida
flavina
condio
anaerbica
produto
reduzido
flavina
oxidada
flavoprotena- H
7.3.3.3. Oxidao
Muitas reaes de oxidao so conhecidas, como: a epoxidao dos ciclodienos; a oxidao
dos tiosteres a sulfxidos e a sulfonas; a dealquilao oxidativa de alquilaminas; a abertura de anel
aromtico, como o 2,4-D; e a decarboxilao (Tabela 7.3) (Schneurt, 1992). importante salientar
que as reaes de abertura do anel aromtico s foram observadas em microrganismos. Estas reaes
se do ah'avs de hidroxilao e incluem reaes de epoxidao. Podem ocorrer na presena de cloro
na molcula, e quanto maior o nmero de tomos de cloro, menor a biodegradabilidade. Por isso, os
PCBs com maior nmero de tomos de cloro tm biodegradao lenta e difcil, quando comparados
aos PCBs com pouco cloro.
225
Frmula
Exemplos
C=C
R - CH = CH - R' -7
R - CH2 - CH2 - R'
CS"C
R-CsC-R'-7
R - CH = CH - R: .
Buturon
Grupo N0 2
R- NO 2 -7 R-NH
.
2
Paration, Fenitrotion
Grupo sulfoxido
Sulfxido de forato
Clivagem S-S
R - S - S - R' -7 R - SH
Tiram
Declorinao
R-C1-7R-H
Debrominao
R-Br -7 R-H
1,2-Dibromo-3-cloropropano
Eliminao de N02
R-NO2 -7 R-H
Pentacloronitrobenzeno
226
CI
N~N
'~
R,HN
N
NHRz
atrazina
HS-CHz-CH-COOH
I
NH
N~N
R,HN
A.'~
N
NHRz
lsorgo
~Hz
HOOC- CH-CH z-S-C'L-CH-COOH
. "21
NH
N~N
R,HN
produtos solveis
- - - - . . e insolveis
*'~
N
NHRz
7.3.3.5. Isomerizao
So reaes promovidas pelos microrganismos, em que a frmula primria se mantm mas a
conformao molecular fica alterada. A transformao do gama HCH em alfa HCH, que reduz fortemente o grau de toxicidade, citada como exemplo.
7.3.4. Diversidade metablica e biodiversidade microbiana
A biossntese de molculas corno aminocidos apresenta uma via metablica com poucas variaes. As reaes de catabolismo, ao contrrio, possuem diversas vias metablicas para um mesmo
produto, em diferentes microrganismos (Clarke, 1984). s vezes, algumas vias metablicas distintas
podem ser encontradas num mesmo microrganismo para um mesmo produto. H urna velha teoria,
formulada por Kluyver, que sugere que os microrganismos tm enzimas degradativas com baixa
especificidade a diferentes substr'atos, de forma que a mesma enzima pode degradar muitos compostos diferentes. Embora se saiba que isto uma extrema simplificao, a ambigidade de muitas
enzimas catalticas, em relao a substratos, de considervel importncia. Muitas enzimas, como as
decarboxilases e as isomerases, guardam grande semelhana nas seqncias de aminocidos, sugerindo a duplicao e a divergncia a partir de um gene comun ancestral.
Para que se entenda a variao das vias catablicas preciso considerar a biodiversidade
microbiana, entendida corno a relao entre a diversidade dos microrganismos e o tamanho relativo de
suas populaes. Poucos microrganismos so capazes de biodegradar completamente uma substncia
e os xenobiontes, geralmente, so degradados por um consrcio de muitos microrganismos (Slater &
Lovat, 1984). No entanto, muito importante estudar separadamente a participao de cada microrganismo no processo de degradao. O teor de matria orgnica no solo aumenta a biomassa microbiana
227
228
ar
o
o
o
o
o
o
o
KOH
Figura 7.4. Aparelho para detenninar a decomposio de produtos orgnicos no solo.
7.4.1.2. Demanda bioqumica de oxignio (DBO)
um mtodo semelhante ao desClito anteriormente. A diferena que ao invs de quantificar
a biodegradao pelo CO 2 produzido, neste mtodo mede-se o oxignio liberado. muito utilizado
para caracterizar ambientes poludos, mas este mtodo funciona somente em solues relativamente
concentradas de substncia, na faixa entre 10 e 100 mg . L-I.
7.4.1.3. Demanda qumica de oxignio (DQO)
Neste mtodo, a amostra incubada, como anteriormente descrito, e a matria orgnica restante dosada com dicromato de potssio em 50% de cido sulfrico, com a presena de sulfato de
cobre como catalizador. Como a quantidade inicial da substncia conhecida, ao subtrair-se a quantidade residual tem-se a biodegradao.
7.4.1.4. Carbono orgnico dissolvido (COD)
A lgica deste mtodo idntica do DQO, exceto que a matria orgnica convertida em
CO 2 ou metano, e avaliada por cromatografia gasosa ou espectrofotometria de infravermelho. Este
mtodo, assim como o DQO, pode ser utilizado em concentraes menores do substrato.
7.4.2. Mtodos especficos
Os mtodos especficos so utilizados, geralmente, em estudos mais refinados, que exigem a
quantificao e identificao do produto inicial, chamado resduo, e dos transformados, chamados
229
metablitos. Para isto, necessrio um processo de extrao destas substncias do solo, utilizando
solventes orgnicos, para purific-Ias em seguida, finalizando com a anlise. No h uma metodologia
universalmente aceita e padronizada para a extrao de pesticidas do solo, de forma que se encontra
uma certa variao metodolgica nos diferentes trabalhos, correspondendo a eficincias tambm variadas. Quanto etapa da purificao, fica-se no dilema de aprimor-Ia, perdendo-se eficincia, ou
garantir a alta recuperao com amostras pouco purificadas. Alm dos mtodos analticos de separao e quantificao citados a seguir, pode-se usar o espectro fotmetro, o espectro fotmetro de
fluorescncia e o infravermelho.
7.4.2.1. Cromatogl'afia de camada fina (TLC)
A separao do produto, neste processo, feita sobre uma placa coberta com slica, o que
corresponde fase estacionria. Em seguida, aplica-se a amostra, utilizando-se um eluente para a
corrida, o que configura a fase mvel do processo. O eluente geralmente composto de uma mistura
de solventes adequados para a substncia a ser analisada, indicados por manuais. A identificao corre
por conta da mobilidade relativa (Ri) dos padres das substncias a serem analisadas e a revelao
pode ser feita por ultravioleta, vapor de iodo metlico ou outras substncias especficas para cada tipo
de molcula. Quando a revelao feita por mtodos no-destrutivos, o local onde se encontra a
substncia pode ser raspado da placa, eludo e quantificado. A desvantagem, em relao aos mtodos
de cromatografia lquida (HPLC) ou cromatografia gasosa, a resoluo mais baixa, permitindo,
muitas vezes, uma certa mistura entre as diferentes substncias.
7.4.2.2. Cromatografia lquida de alta presso (HPLC)
Este tipo de cromatografia tem excelente resoluo em anlises de substncias com polaridades distintas. A degradao de um resduo resulta, geralmente, em metablitos mais polares e, por
isto, mais hidroflicos. As colunas nonnalmente empregadas para este fim so as de fase reversa. O
detector mais utilizado o de ultravioleta, mas conta-se, atualmente, com os de infravermelho e radioatividade.
7.4.2.3. Cromatografia gasosa (CG)
utilizada para a anlise de molculas
apoIares, mas tem tambl1l~m
uso verstil para outras
_ "",.
"",,,,- ,.UI!
subtncias. Muitos pesticidas podem ser analisados pelo HPLC ou pelo CG. Geralmente, um dos
mtodos vantajoso para um determinado caso e, por isto, recomenda-se que um bom laboratrio de
anlise de resduos disponha de ambos os equipamentos. A cromatografia gasosa permite o uso de
uma grande variedade de detectores, como o de ionizao de chama (FID), mais comumente utilizado,
o de captura de eltrons (ECD), ideal para a anlise de organoclorados, e um detector especfico para
nitr'ognio e fsforo (NPD). O espectrmetro de. massa (MS) normalmente acoplado a um
cromatgrafo gasoso. O CG-MS um equipamento caro, que pennite uma tima identificao da
substncia correspondente a cada pico do cromatograma.
7.5. Onde ocolTe a biodegradao
Como j citado no incio deste capitulo, a biodegradao est presente em todos os ambientes.
Contudo, nos itens subseqentes so descritos sucintamente apenas os processos que envolvem o solo
230
~d
nao a sorvI o
'd
adsoro.4==~. desoro----__
degra~oj
res(duos
ligados
VOlatilizao-----+--_degradao
lixiviaao
adsoro em
organismos vivos
Figura 7.5. Distribuio e degradao dos pesticidas no solo.
Aplicao do
pesticida
Entrada
de ar ~i
C02
li
Bomba
Filtro de carvo
Entrada
de gua
Microcosmo
Lixiviado
Bom ba de vcuo
Figura 7.6 Esquema da montagem experimental para estudo da distribuio dos pesticidas solo~
t:l
232
Como j foi dito, a biodegradao a transformao do pesticida em outros produtos chamados metablitos que, por sua vez, podem se degradar novamente, em 'um processo que culmina na
mineralizao, isto , na liberao de CO 2 . Em experimentos de balano de massa, o CO 2 marcado
captado em armadilhas qumicas e a radioatividade quantificada por cintilao lquida. A
biodegradao , portanto, a soma da quantidade dos metablitos quantidade de pesticidas
mineralizados. Quando a taxa de mineralizao baixa no h uma degradao completa, embora,
freqentemente, o produto tenha se transformado em um metablito recalcitrante, que pode ser txico
s plantas ou aos microrganismos. A anlise destes metablitos no simples e s pode ser feita
corretamente se o processo. analtico for adequado para esta finalidade. Geralmente, o que se mede
o resduo do pesticida.
Quando a quantidade de radioatividade no-passvel de extrao por solvente orgnico e, portanto, fortementeadsorvida no solo, grande, a lixiviao de contaminantes para o lenol d'gua e a
biodegradao so pequenas. A forma qumica em que se encontra o material radioativo, assim
adsorvido n.o solo, no conhecida. Neste caso, as anlises so dificultadas por no permitirem
identificar os compostos ligados matria orgnica ou argila do solo (Kahn, 1978). A presena de
resduos e/ou metablitos fitotxicos no solo constitui motivo de preocupao, pois eles podem ser
absorvidos pelas plantas ao longo do tempo, acarretando a contaminao dos alimentos (Fuhr, 1987).
7.5.2. Biorremediao e descontaminao do subsolo poludo
A biorremediao constitui um conjunto de tcnicas que permitem aumentar a biomassa
microbiana do solo, estimulando a biodegradao de xenobiontes (Bouwer, 1993). Assim, reas contendo xenobiontes recalcitrantes podem ser descontaminadas. Como j foi dito, o subsolo tem populao microbiana, principalmente bacteriana, na concentrao de 10 6 a 107 de clulas.mg- I solo seco.
So encontrados fungos apenas na camada superficial, de at 1,5m. medida que a profundidade do
solo aumenta, passa-se da regio insaturada de b'lla, chamada vadose, para a saturada, onde a gua
subterrnea est em movimento. Ao longo deste eixo da superfcie para as camadas mais profundas
atravessa-se, inicialmente, uma regio aerbia para, em seguida, encontrar-se uma regio anaerbia
(Figura 7.7). Com isto, o potencial redox diminui de eletronegatividade, que passa de positiva para
negativa. H, evidentemente, uma mudana na populao de microrganismos, que nas regies mais
superficiais so aerbios, realizando a biodegradao por reaes de oxidao. Na regio um pouco
mais profunda, onde a eletronegatividade menor, ocorrem reaes de desnihificao. Estas reaes
so importantes na transformao de grupos funcionais de carboxilas e alcoilas ligadas ao anel aromtico. Como exemplo disto citam-se o benzeno, tolueno, xileno, p-cresol etc. Na ausncia de oxignio,
as oxidases no funcionam, mas foi constatado que o oxignio utilizado proveniente da gua.
Em camadas ainda mais profundas e eletronegativas, existem as bactrias sulfato-redutoras e
as metanognicas. Estas ltimas so particularmente importantes na declorinao de organoclorados,
cujas molculas tenham muitos tomos. Verificaram-se, em PCBs, a dehalogenao parcial de at
30%" com a formao de produtos intermedirios de biodegradao, por vezes muito txicos. Quando
a molcula tem poucos tomos de cloro, as reaes de oxidao so mais eficazes. Nos processos de
biorremediao, pode-se alternar a dehalogenao anaerbia, com uma degradao posterior final
aerbia. A pesquisa com tetracloroetileno mostrou que desta forma possvel degradar inteiramente
esta molcula. No se deve desprezar a capacidade das bactrias sulfato- redutoras e do cido sulfidrico
de mediar uma condio redutora capaz de promover biodegradao.
233
0,5
-5
234
suprimento
de gua
bomba _-,---'"
de suco
nutrientes adicionados
fonte de
oxignio
(usualmente N e P)
____~~____~~~~/~/~1/~~~~
/
~poo
zona insaturada
de extrao /
de gua subterrnea
tela de
poo
'7 I I
gua
- -I I
( vadose) /
--
tela de
poo
zona saturada
contaminada
/ I
poo de
injeo
I / I
235
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