Graduao em Biotecnologia

Disciplina de Protemica
Caroline Rizzi
Doutoranda em Biotecnologia - UFPel

Introduo
Don't waste clean
thinking on dirty
enzymes!!!

Efraim Racker
(1913-1991)

Introduo
Desta
maneira, a
enzima alvo
pode finalmente
ser estudada

Assegurar-se
que a reao
catalizada por
um nico tipo
de enzima!

Purificar uma enzima

ao ponto que outras
enzimas no so
detectadas!!!!!

Introduo
Nenhuma enzima purificada at a absoluta homogeneidade!!!

Atividade cataltica e resposta a

inibidores e ativadores

Interaes com outros

componentes celulares
Mecanismos de represso ou
estmulo da sntese celular

Para que a enzima vai ser usada?

Quantidade
Atividade

Ensaio
O ensaio pode ser realizado?
Sensibilidade, acurcia, preciso
Disponibilidade de substratos, custo

Aditivos ao tampo
Ativadores, inibidores....
Conservadores da atividade

Ensaios enzimticos
Padronizao de unidades:
1. Quantidade de substrato
consumido ou produto
formado em mol;
2. Tempo da reao
(minutos);
3. Quantidade de enzima
(mg)

Atividade especfica
Unidades/mg

Atividade enzimtica
mol/min Unidade
1 unidade: quantidade de
enzima que catalisa a
transformao de 1 unidade
de massa de substrato ou
formao
de
produto
(geralmente
mol)
por
minuto sobre as condies de
pH e temperatura definidas.

Ensaios enzimticos
Componentes:
Mix:
Tampo para estabilizar
o pH
Substrato (s)
Cofatores ou ativadores

Enzima ou extrato bruto

(tratado)
Reagente stop
Espectrofotmetro

Temperatura tima da enzima

Ensaios enzimticos
Metodologias

Substrato consumido

Produto formado

Variao de absoro
de coenzimas

Ensaios enzimticos
Ponto Final

Metodologias

Cinticos
Acoplados

Substrato consumido

Produto formado

Variao de absoro
de coenzimas

Complementao gnica

Ensaios ponto final ou descontnuos

Reagente stop
Mix

Enzima

Geralmente o produto corado e quantificado

Ensaios ponto final

Avaliao do consumo de substrato
Teste da atividade da -amilase pancretica
Incubao da enzima com substrato (amido) e a diminuio
da cor azul aps a adio de iodo comparada com o controle

Ensaios ponto final

Avaliao da formao do produto
Teste da atividade da fosfatase alcalina
A FAL hidrolisa o substrato de timolftalena monofosfato
liberando timolftalena cor azul.

timolftalena monofosfato

timolftalena

pH alcalino=cor azul

Fosfato inorgnico

Ensaios cinticos
abs/tempo

Mix

Enzima

Ensaios cinticos
Avaliao do consumo de substrato
Teste da atividade da DAHP sintase

Eritrose 4-fosfato

Fosfoenolpiruvato
COOH

OH

+
P

H
H2O

_ O _ CH
P
2

C
O

CH2

C
H2

COOH

O
C

HO

OH
OH

DAHP Sintase
EC 4.1.2.15

OH
3-desoxi-D-arabino- heptulosonato 7-fosfato

Absortividade mxima a 232nm

(=2,8 x 103 M -1 cm-1)

Ensaios cinticos
Avaliao do consumo de substrato
Teste da atividade da DAHP sintase

Consumo de PEP/s
Absorbncia a 232 nm

0,35

abs/60 s = 0,1

0,3
0,25

PEP232 nm =2,8 x 103 M -1 cm-1

0,2
0,15
0,1
0,05
0
0

20

40

60

80

100

Tempo em segundos

120

140

160

C PEP= 0,1/2,8 x 103

C PEP= 3,57 x 10-5 M =
35,7 M/min

Atividade enzimtica: 35,7 U

Ensaios cinticos
Avaliao do produto formato
Teste da atividade da PNP
Metilguanina

Formao de produto
0,35
Absorbncia a 360 nm

Metilguanosina

0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0

50

100
Tempo em segundos

150

200

Ensaios cinticos
Ensaio da variao da absorbncia da coenzima associada
Ensaios utilizando a reao inversa
Teste da atividade da chiquimato desidrogenase

NADPH 340nm=2,8 x 103 M -1 cm-1

Atividade enzimtica: aumento de NADPH

Desidrogenao do chiquimato

Ensaios acoplados
Verificao da formao do produto utilizando-o
como substrato para outra reao enzimtica
Atividade da EPSP sintase

Metilguanina

Aumento proporcional
atividade enzimtica
de EPSP

Complementao gnica
Uso de mutantes para comprovar que a construo gnica capaz de reparar os mutantes
Atividade da desidroquinato sintase

Hin dIII (4221)

oriC

ADAPTADOR

Kan(R)

Xho I (3408)

pUP410

PKK223-3
+ aroB
4416 bp

Hin dIII (3262)

Escherichia coli AB2847 mutante

aroB
LeuD
OriM

RBS1
KpnI (2431)

Xho I (2016)

Ausncia de suplementos
+ complementao gnica

Presena de suplementos

De que maneira
avaliar a atividade
e cinticas
enzimticas???

1. Como montar uma reao

enzimtica???
Que reagentes e aparelhos vamos usar?

Verificar ensaios descritos na literatura;

Tampo, substrato, cofatores...
Preo, pureza, estabilidade;
Enzima pura ou extrato bruto;
Disponibilidade de filtros de espectrofotmetro;
O espectrofotmetro controla a temperatura?
A leitura cintica?
A reao em atmosfera com presena ou ausncia de O2?

1. Como montar uma reao

enzimtica???
Como preparar estes reagentes?
Solues estoques que sero diludas na concentrao final no
momento da reao!!!!
Dissoluo, conservao, utilizao, peso molecular, pKs, ...:
Manuais qumicos
Estabilidade dos reagentes durante a reao enzimtica.

1. Como montar uma reao

enzimtica???
Que parmetros devo considerar?

Km das anlogas para determinar a concentrao de substrato;

Velocidade da reao enzimtica (turnover);
Quais so os cofatores? uma metaloenzima?
O extrato bruto pode conter inibidores ou interferentes na reao?
O que utilizar como controle negativo?
A enzima multimrica? Faz parte de um complexo enzimtico?

2. A enzima tem atividade em estado

estacionrio?
Quais so as condies para o ensaio estacionrio?
A enzima est na forma ES
A velocidade inicial medida em estgio estacionrio
O substrato est em excesso = concentrao constante
Em relao [substrato], a [produto] formado desprezvel
Todos as outras condies da reao permanecem
constante durante a medio.

2. A enzima tem atividade em estado

estacionrio?

Mix

Enzima

Sem atividade?
Concentrao enzima
Inibidores
Desnaturao
Condio da reao

Excesso de
Substrato

Com atividade?
Aumento da concentrao
enzimtica

2. A enzima tem atividade em estado

estacionrio?
A atividade corresponde atividade da enzima recombinante???
Comparar com um controle negativo!!!!

3. A velocidade inicial proporcional

concentrao da enzima?

Atividade enzimtica linearmente dependente do volume de enzima

adicionado reao.
A velocidade proporcional concentrao enzimtica.
Medida da real da velocidade inicial.

O que podemos determinar utilizando

a reao em estado estacionrio?
O efeito do pH, da temperatura e diferentes
ativadores na velocidade inicial;
Curva de diluio do substrato: Km, Vmx;

3. Parmetros em estado prestacionrio

Metodologia tipo flow methods:
Baseados em mistura rpida dos reagentes (milisegundos);
Anlise de reaes enzimticas rpidas;
Estudo de mecanismos catalticos enzimticos.

Tcnica stopped-flow :
Mais apropriada para observao de reaes rpidas;
A real velocidade inicial a [substratos] baixas j
transcorreu em mix manual.

Reaes no estado prestacionrio:

Ligao ao
substrato, liberao de
produtos, associao a
cofatores, alteraes no pH
e temperatura....

Estado pr estacionrio

http://bcs.whfreeman.com/stryer/pages/bcs- ain.asp?v=chapter&s=08000&n=00010&i=99010.01&o=|00040|00010|&ns=0

Tabela de Purificao de uma Enzima

Provar que voc est trabalhando com a enzima j que a sua
atividade est aumentando em relao ao aumento do nvel
de pureza

Componentes da tabela de purificao:

Quantidade total de protena (mg)
Atividade total (U)
Atividade especfica (U/mg)
Purification fold: aumento da atividade especfica
Rendimento (%): recuperao da atividade em cada passo

Tabela de Purificao de uma Enzima

Quantificao protica /mL

X
Volume total da etapa

Atividade total

Protena total

Atividade enzimtica da etapa (U/mL)

X
Volume total da etapa

Atividade total
de uma etapa

Atividade total
do 1 etapa

Atividade especfica de uma etapa

Atividade especfica do 1 estgio

Quais so os destinos da enzima pura?

Imobilizao Enzimtica

100.000 compostos/dia!!!!!!!

Quais so os destinos da enzima pura?

Cristalografia e predio de
estruturas

Desenvolvimento
de frmacos

OBRIGADA!!!