Captulo XVI - leos e Gorduras

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LEOS E GORDURAS

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s determinaes feitas na anlise de leos e gorduras so geralmente as dos chamados ndices, que so expresses de suas propriedades fsicas ou qumicas dos mesmos e no as porcentagens dos seus constituintes. Assim, so determinados os ndices de iodo, saponificao, perxidos e as constantes fsicas como o ponto de fuso e o ndice de refrao. So estes ndices que, juntamente com as reaes caractersticas, servem para identificao e avaliao da maioria dos leos e gorduras, sendo o resultado da anlise baseado neste conjunto de dados. Os mtodos de cromatografia em fase gasosa so, desde h muito tempo, aplicados para o conhecimento da composio dos cidos graxos destes compostos. 325/IV Determinao da acidez A determinao da acidez pode fornecer um dado importante na avaliao do estado de conservao do leo. Um processo de decomposio, seja por hidrlise, oxidao ou fermentao, altera quase sempre a concentrao dos ons hidrognio. A decomposio dos glicerdios acelerada por aquecimento e pela luz, sendo a rancidez quase sempre acompanhada pela formao de cidos graxos livres. Estes so freqentemente expressos em termos de ndice de acidez, podendo s-lo tambm em mL de soluo normal por cento ou em g do componente cido principal, geralmente o cido olico. Os regulamentos tcnicos costumam adotar esta ltima forma de expresso da acidez. O ndice de acidez definido como o nmero de mg de hidrxido de potssio necessrio para neutralizar um grama da amostra. O mtodo aplicvel a leos brutos e refinados, vegetais e animais, e gorduras animais. Os mtodos que avaliam a acidez titulvel resumem-se em titular, com solues de lcali-padro, a acidez do produto ou solues aquosas/alcolicas do produto, assim como os cidos graxos obtidos dos lipdios.

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Material Balana analtica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, proveta de 50 mL e bureta de 10 mL. Reagentes Soluo de ter-lcool (2:1) neutra Soluo fenolftalena Soluo de hidrxido de sdio 0,1 M ou 0,01 M Procedimento As amostras devem estar bem homogneas e completamente lquidas. Pese 2 g da amostra em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 25 mL de soluo de ter-lcool (2:1) neutra. Adicione duas gotas do indicador fenolftalena. Titule com soluo de hidrxido de sdio 0,1 M ou 0,01 M at o aparecimento da colorao rsea, a qual dever persistir por 30 segundos. Clculos

v = n de mL de soluo de hidrxido de sdio 0,1 M gasto na titulao f = fator da soluo de hidrxido de sdio P = n de g da amostra Notas Para converter o ndice de acidez em soluo molar, divida o resultado por 1,78. Para expressar o ndice de acidez como acidez em cido olico, divida o resultado por 1,99. Para transformar a acidez em cido olico em acidez em soluo normal, divida o resultado por 3,55. No caso de produtos com baixo teor de cidos graxos, por exemplo, leos e gorduras refinados, use soluo de NaOH 0,01 M para a titulao.

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Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1.: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 245-246. 326/IV Determinao do ndice de perxido Este mtodo determina todas as substncias, em termos de miliequivalentes de perxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potssio nas condies do teste. Estas substncias so geralmente consideradas como perxidos ou outros produtos similares resultantes da oxidao da gordura. aplicvel a todos os leos e gorduras normais, incluindo margarina e creme vegetal, porm suceptvel e portanto qualquer variao no procedimento do teste pode alterar o resultado da anlise. Material Balana analtica, frasco Erlenmeyer de 125 ou 250 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, bureta de 10 mL com sub-divises de 0,05 mL. Reagentes cido actico Clorofrmio Soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N ou 0,01 N Amido solvel Iodeto de potssio Soluo de cido actico-clorofrmio (3:2) v/v Soluo saturada de iodeto de potssio Pese 30 g de iodeto de potssio e adicione 21 mL de gua. Conserve a soluo em frasco mbar e utilize no mesmo dia da sua preparao. Soluo de amido 1% m/v Procedimentos leos e gorduras normais Pese (5 0,05) g da amostra em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (ou 125 mL) . Adicione 30 mL da soluo cido actico-clorofrmio 3:2 e agiIAL - 597

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te at a dissoluo da amostra. Adicione 0,5 mL da soluo saturada de KI e deixe em repouso ao abrigo da luz por exatamente um minuto. Acrescente 30 mL de gua e titule com soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N ou 0,01 N, com constante agitao. Continue a titulao at que a colorao amarela tenha quase desaparecida. Adicione 0,5 mL de soluo de amido indicadora e continue a titulao at o completo desaparecimento da colorao azul. Prepare uma prova em branco, nas mesmas condies e titule. Margarina e creme vegetal Funda a amostra, com constante agitao, em placa aquecedora ou em estufa a (60-70)C. Evite aquecimento excessivo, particularmente prolongado temperatura acima de 40C. Uma vez completamente fundida, remova a amostra da placa at que a camada aquosa se separe. Decante o leo e filtre em papel Whatman n 4 ou equivalente. A amostra deve estar clara e brilhante. Proceda a determinao conforme o descrito para leos e gorduras normais. Nota: se o volume gasto na titulao da amostra for menor que 0,5 mL, usando soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N, repita a determinao com soluo 0,01 N. No caso do branco, o volume gasto no deve exceder a 0,1 mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N. Clculo

A = n de mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulao da amostra B = n de mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulao do branco N = normalidade da soluo de tiossulfato de sdio f = fator da soluo de tiossulfato de sdio. P = n de g da amostra Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, AOCS, 1990. [AOCS Official method Cd 8-53]. 327/IV Determinao do ndice de refrao O ndice de refrao caracterstico para cada tipo de leo, dentro de certos limites. Est relacionado com o grau de saturao das ligaes, mas afetado por outros fatores tais como: teor de cidos graxos livres, oxidao e tratamento trmico. Este mtodo aplicvel a todos os leos normais e gorduras lquidas.
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Material Refratmetro de Abb equipado com escala-padro e algodo. Reagente ter de petrleo ou outro solvente. Procedimento Ajuste da aparelhagem Ajuste previamente o refratmetro de Abb com gua. Faa circular uma corrente de gua a 40C pelo aparelho. Deixe estabilizar a temperatura. Ajuste a 40C para leos e a 60C para amostras com ponto de fuso mais alto. A temperatura do refratmetro deve ser controlada a 0,1C e, para isto, prefervel usar banho de gua controlado termostaticamente e com circulao de gua. O instrumento calibrado seguindo as instrues do fabricante, com lquido de pureza e ndice de refrao conhecidos ou, em alguns casos, satisfatrio usar um prisma de vidro de ndice de refrao terico de 1,333 20 C. Se o refratmetro for equipado com um compensador, uma lmpada eltrica como a de vapor de sdio, torna-se necessria. Tratamento da amostra Funda a amostra, caso no esteja lquida. Filtre para remover quaisquer impurezas e traos de umidade. A amostra deve estar completamente seca. Certifique-se que os prismas estejam limpos e completamente secos e ento coloque no prisma inferior algumas gotas da amostra. Feche os prismas e trave firmemente. Deixe por 1 a 2 minutos at que a amostra atinja a temperatura do aparelho. Ajuste o instrumento e a luz para obter a leitura mais distinta possvel e, ento, determine o ndice de refrao. A leitura na escala dar diretamente o ndice de refrao absoluto a 40C, com quatro casas decimais. Realize pelo menos trs leituras e calcule a mdia. A variao das leituras deve ser igual a 0,0002. Limpe os prismas entre as leituras com algodo umedecido com solvente e deixe secar. Clculo para correo da temperatura R+ K (T- T) = R R = leitura temperatura T (C) R= leitura temperatura T (C) T = temperatura padro (C) T = temperatura na qual a leitura de R foi feita (C) K = 0,000365 para gorduras e 0,0003885 para leos

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Referncias bibliogrficas INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 247. , AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 7-25]. 328/IV Determinao do ndice de saponificao O ndice de saponificao a quantidade de lcali necessrio para saponificar uma quantidade definida de amostra. Este mtodo aplicvel a todos os leos e gorduras e expressa o nmero de miligramas de hidrxido de potssio necessrio para saponificar um grama de amostra. Material Frascos Erlenmeyer de 250 mL, condensador de gua e banho-maria ou chapa aquecedora com controle de temperatura. Reagentes Soluo de cido clordrico 0,5 M Hidrxido de potssio Soluo de fenolftalena lcool Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4% m/v Procedimento Funda a amostra, se no estiver completamente lquida. Filtre em papel de filtro para remover impurezas e traos de umidade. A amostra deve estar completamente seca. Pese uma quantidade de amostra, de tal modo que sua titulao corresponda de 45 a 55% da titulao do branco. Esta massa normalmente de (4-5) g. Adicione 50 mL da soluo alcolica de KOH. Prepare um branco e proceda ao andamento analtico, simultaneamente com a amostra. Conecte o condensador e deixe ferver suavemente at a completa saponificao da amostra (aproximadamente uma hora, para amostras normais). Aps o resfriamento do frasco, lave a parte interna do condensador com um pouco de gua. Desconecte do condensador, adicione 1 mL do indicador e titule com a soluo
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de cido clordrico 0,5 M at o desaparecimento da cor rsea. Clculo

A = volume gasto na titulao da amostra B = volume gasto na titulao do branco f = fator da soluo de HCl 0,5 M P = n de g da amostra Nota: algumas amostras so mais difceis de serem saponificadas, requerendo mais de 1 hora de saponificao. Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA. A.O.C.S., 1990. [A.O.C.S. Official method Cd 3-25]. 329/IV Determinao do ndice de iodo pelo mtodo de Wijs O ndice de iodo de um leo ou gordura a medida do seu grau de insaturao e expresso em termos do nmero de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra (% iodo absorvido). O mtodo de Wijs aplicvel a todos os leos e gorduras normais que no contenham ligaes duplas conjugadas. Cada leo possui um intervalo caracterstico do valor do ndice de iodo. A fixao do iodo ou de outros halognios se d nas ligaes etilnicas dos cidos graxos. Material Balana analtica, agitador magntico, estufa, cronmetro, papel de filtro qualitativo, frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipetas volumtricas de 2, 5, 20 e 25 mL e bureta de 50 mL. Reagentes cido clordrico Iodo Tetracloreto de carbono
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Tiossulfato de sdio (Na2S2O3.5H2O) Amido solvel Iodeto de potssio Soluo de Wijs Soluo de iodeto de potssio a 15% m/v Soluo de indicador de amido a 1% m/v. Soluo de tiossulfato de sdio a 0,1 M Procedimento Funda a amostra, caso no esteja no estado lquido (a temperatura da fuso no dever exceder o ponto de fuso da amostra em 10oC). Filtre atravs de papel de filtro para remover algumas impurezas slidas e traos de umidade. Pese aproximadamente 0,25 g em frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa e adicione 10 mL de tetracloreto de carbono. Transfira com auxlio de bureta, 25 mL de soluo de Wijs no frasco Erlenmeyer que contm a amostra. Tampe e agite cuidadosamente com movimento de rotao, assegurando perfeita homogeneizao. Deixe em repouso ao abrigo da luz e temperatura ambiente, por 30 minutos. Adicione 10 mL da soluo de iodeto de potssio a 15% e 100 mL de gua recentemente fervida e fria. Titule com soluo tiossulfato de sdio 0,1 M at o aparecimento de uma fraca colorao amarela. Adicione 1 a 2 mL de soluo indicadora de amido 1% e continue a titulao at o completo desaparecimento da cor azul. Prepare uma determinao em branco e proceda da mesma maneira que a amostra. Clculo

M = molaridade da soluo de Na2S2O3 VB = mL gasto na titulao do branco VA = mL gasto na titulao da amostra P = n g da amostra Notas Quando o ndice de iodo for determinado em material contendo sistemas de duplas ligaes conjugadas, o resultado no uma medida do total de insaturao, mas um valor emprico indicativo da sua quantidade na molcula. Por ser de difcil preparao, recomenda-se a aquisio no comrcio do reagente de Wijs. Armazene as solues de Wijs em frasco mbar, temperatura ambiente e ao abrigo da luz e da umidade. Devido toxicidade, o tetracloreto de carbono est sendo substitudo por ciclohexano. Se o leo apresentar um ndice de iodo superior a 100, como por exemplo, os leos de origem marinha, o tempo de reao com a soluo de Wijs dever ser maior que 30 minutos.
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Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S., 1995 [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1 25]. 330/IV Determinao do ndice de iodo por clculo O ndice de iodo determinado por clculo aplica-se anlise de triglicerdios e de cidos graxos livres e seus produtos hidrogenados. Este mtodo determina o ndice de iodo de leos comestveis diretamente da composio de cidos graxos insaturados obtidos a partir da anlise por cromatografia em fase gasosa. Procedimento Determine a composio de cidos graxos da amostra a ser analisada por cromatografia em fase gasosa (344/IV). Clculos (% cido palmitolico x 0,950) + (% cido olico x 0,860) + (% cido linolico x 1,732) + (% cido linolnico x 2,616) + (% cido gadolico x 0,785) + (% cido ercico x 0,723) = ndice de iodo dos triglicerdios (% cido palmitolico x 0,990) + (% cido olico x 0,8986) + (% cido linolico x 1,810) + ( % cido linolnico x 2,735) + (cido gadolico x 0,8175) + (% cido ercico x 0,7497) = indice de iodo dos cidos graxos livres Nota: para leos com contedo de matria insaponificvel superior a 0,5% (ex.: leos de peixe), o resultado tende a ser inferior ao determinado pelo mtodo de Wijs. Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1995. [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1c-85]. 331/IV Determinao do ndice de Bellier Na anlise dos leos, a determinao do ndice de Bellier utilizada para a identiIAL - 603

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ficao do azeite de oliva. Material Chapa aquecedora, termmetro com divises de dcimos de grau, pipetas de 2, 5 e 50 mL, frasco Erlenmeyer de 125 mL e refrigerante de refluxo. Reagentes Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 8% m/v cido actico (1+3) lcool a 70% v/v Procedimento Transfira lentamente, com o auxlio de uma pipeta, 1 mL da amostra para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL da soluo alcolica de hidrxido de potssio a 8%. Adapte ao frasco Erlenmeyer um refrigerante de refluxo. Aquea em chapa aqquecedora por 10 minutos. Esfrie at (25-30)C. Adicione 50 mL de lcool a 70%. Agite e adicione 1,5 mL de cido actico (1+3). Agite e adapte ao frasco um termmetro de 50oC, dividido em dcimos de grau, de maneira que o bulbo do termmetro mergulhe no lquido. Se houver turvao, aquea lentamente at cerca de 10oC acima do ndice suposto. Resfrie o frasco, gradualmente e agitando sempre em um banho de gua da seguinte maneira: mergulhe sucessivamente o frasco durante 10 segundos, retire e agite por 10 a 20 segundos. A temperatura deve baixar lentamente.Tome, como ndice de Bellier, a temperatura na qual nota-se o incio da turvao. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos, 3 ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 255. , 332/IV Determinao do ponto de fuso Os leos e gorduras naturais, de origem vegetal e animal, so misturas de glicerdios e de outras substncias e consistem de inmeros componentes. Estas substncias no exibem um ponto de fuso definido e nem preciso. Portanto, o termo ponto de fuso no implica nas mesmas caractersticas das substncias puras de natureza definitivamente cristalina. As gorduras passam por um estgio de amolecimento gradual antes de se tornarem completamente liquefeitas. O ponto de fuso deve ser definido por condies especficas do mtodo pelo qual determinado e, neste caso, a temperatura na qual a amostra torna-se perfeitamente clara e lquida. O mtodo do tubo capilar aplicvel para
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todas as gorduras animais e vegetais normais. Material Aparelho para determinao do ponto de fuso, tubos de ponto de fuso, tubos capilares de vidro, termmetro com a especificao da A.O.C.S. : H 6-40 ou 7-45, bquer de 600 mL, papel de filtro e funil de vidro. Procedimento Funda a amostra e filtre em papel de filtro para remover qualquer impureza e resduo final de mistura. A amostra deve estar absolutamente seca. Mergulhe completamente pelo menos 3 tubos capilares limpos na amostra liquefeita, de maneira que a gordura fique a uma altura de 10 mm. Funda o final do tubo (onde a amostra est localizada) numa chama pequena, mas no queime a gordura. Coloque os tubos num bquer e deixe em refrigerador entre (4 - 10)C durante 16 horas. Remova os tubos do refrigerador e prenda-os com uma rolha de borracha ou de qualquer outra maneira ao termmetro, de modo que as extremidades inferiores dos tubos de fuso estejam no fundo junto com o bulbo de mercrio do termmetro. Mergulhe o termmetro num bquer de 600 mL, contendo gua at a metade de seu volume. O fundo do termmetro deve estar imerso a 30 mm na gua. Ajuste a temperatura inicial do banho de (8 - 10)C abaixo do ponto de fuso da amostra no incio do teste. Agite o banho de gua com um pequeno fluxo de ar ou com outros mtodos adequados e fornea calor de maneira que aumente a temperatura na faixa de 0,5C por minuto. As gorduras passam normalmente por um estgio de opalescncia antes da completa fuso. O aquecimento contnuo at que os tubos estejam completamente claros. Observe a temperatura na qual cada tubo se torna claro e calcule a mdia de todos os tubos. Esta deve estar dentro de 0,5C. Considere esta mdia como o ponto de fuso. Nota: as amostras devem estar completamente liquefeitas quando os tubos forem colocados no refrigerador. uma boa prtica passar o fundo dos tubos que contm a amostra momentaneamente por uma chama, antes de serem levados ao refrigerador. Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil ChemistsSociety. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 1-25]. 333/IV Reao de Kreis Chama-se rancidez a alterao no odor e sabor dos leos e gorduras, provocada pela
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ao do ar (rancidez oxidativa) ou de microrganismos (rancidez cetnica). O mtodo vlido para leos normais e gorduras lquidas. A floroglucina reage em meio cido com os triglicerdios oxidados, dando uma colorao rsea ou vermelha, cuja intensidade aumenta com a deteriorao devido, provavelmente, presena de aldedo malnico ou de aldedo epidrnico. Material Pipeta de 5 mL, provetas de 10 mL e proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Reagentes cido clordrico Soluo de floroglucina em ter a 0,1% m/v Procedimento Transfira, com auxlio de uma pipeta, 5 mL de substncia fundida para uma proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de cido clordrico e agite por 30 segundos. Adicione 5 mL de uma soluo de floroglucina a 0,1% em ter. Agite novamente por 30 segundos e deixe em repouso por 10 minutos. Na presena de substncias ranosas, a camada inferior apresentar uma colorao rsea ou vermelha. Nota: se a intensidade da colorao for fraca, compare a camada inferior com uma quantidade anloga de soluo de permanganato de potssio a 0,0012% (transfira 3,8 mL de uma soluo 0,01 M para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com gua). Se a intensidade for a mesma ou inferior, o resultado pode deixar de ser levado em considerao, caso os caracteres sensoriais do produto forem satisfatrios. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p. 260. , 334/IV Determinao da umidade e matria voltil A determinao da umidade e matria voltil um dos parmetros legais para a avaliao da qualidade de leos e gorduras, sendo realizada por aquecimento direto a 105C. Procedimento Faa a determinao conforme mtodo 012/IV alterando os intervalos
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de tempo de pesagem de trs para uma hora, at peso constante. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP 1985. p .22. , 335/IV Determinao de impurezas insolveis em ter Este mtodo, aplicvel para todos os tipos de gorduras e leos, determina sujidades e/ou outras substncias estranhas insolveis em ter de petrleo. Material Banho-maria, estufa, dessecador, proveta de 50 mL e cadinho de Gooch. Reagente ter de petrleo Procedimento Use o resduo resultante da determinao da umidade e matria voltil. Adicione 50 mL de ter de petrleo no resduo e aquea em banho-maria para dissolver a gordura. Filtre em cadinho de Gooch com ajuda de vcuo. Lave com cinco pores de 10 mL de ter de petrleo a quente, permitindo que cada poro escoe primeiro para depois adicionar a outra poro. Lave completamente com ter de petrleo. Seque o cadinho e aquea at peso constante em estufa a (101 1)C. Esfrie em dessecador at a temperatura ambiente e pese. Clculo

p = massa das impurezas insolveis no ter de petrleo P = massa da amostra seca Referncias bibliogrficas AMERICAN OIL CHEMISTS` SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1996. [A.O.C.S. Official method Ca 3a-46].
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INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985, p. 262. 336/IV Determinao de resduo por incinerao (cinzas) Este mtodo determina o resduo remanescente depois de incinerao sob condies especficas de teste. Aplicvel para gorduras animais e leos vegetais e marinhos. Fundamenta-se na perda de peso que ocorre quando o produto incinerado a 550C, com destruio da matria orgnica sem aprecivel decomposio dos constituintes do resduo mineral ou perda por volatilizao. Material Cpsula de porcelana de 50 mL ou cpsula de platina de 100 mL, bico de Bnsen, tela de amianto, trip, balana analtica, mufla, papel de filtro e dessecador. Procedimento Coloque o papel de filtro contendo os insolveis totais em ter obtido conforme 335/IV em uma cpsula de porcelana de 50 mL ou cpsula de platina de 100 mL, previamente aquecida em mufla a 550C por 1 hora, resfriada em dessecador at a temperatura ambiente e pesada. Carbonize em bico de Bnsen com chama baixa. Incinere em mufla a 550C. Resfrie em dessecador at a temperatura ambiente. Pese. Repita as operaes de aquecimento e resfriamento at peso constante. Nota: a combusto da amostra deve ser feita em capela, com exausto forada. Clculo

p = n de g de resduo P = n g da amostra Referncias bibliogrficas AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists`Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S.
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1990. [A.O.C.S. Official method Ca 11-55] INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 263. 337/IV Determinao da densidade relativa Este mtodo determina a razo da massa da amostra em relao da gua por unidade de volume a 25C e aplicvel a todos os leos e gorduras lquidas. Material Picnmetro com junta esmerilhada de 50 mL, banho-maria mantido temperatura de (25 0,1)C e termmetro com subdiviso de 0,1C. Procedimento Funda a amostra, filtre com papel de filtro para remover as impurezas e traos de umidade. Aquea temperatura de (20-23)C. Encha o recipiente do picnmetro, adicionando a amostra cuidadosamente pelas paredes para prevenir a formao de bolhas de ar. Tampe e coloque em banho-maria na temperatura de (25 0,1)C. Conserve o conjunto imerso na gua e espere atingir a temperatura acima especificada por 30 minutos. Remova com cuidado o leo que tenha escorrido pela lateral do recipiente. Retire do banho e seque, evitando o manuseio excessivo. Pese e calcule a densidade. Clculo

A = massa do recipiente contendo leo B = massa do recipiente vazio C = massa da gua temperatura de 25C Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended praticces of the American Oil Chemists` Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Cc 10a-25]. 338/IV Teste do frio

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Este mtodo mede a resistncia da amostra cristalizao e comumente usado tambm como ndice de winterizao e verificao da remoo da estearina no processo. aplicvel a todos os leos vegetais normais, refinados e em gordura animal isenta de umidade. Material Banho-maria a 25C, banho de gelo a 0C, frasco especial para leo de 115 mL, funil e papel de filtro. Procedimento Filtre uma quantidade suficiente da amostra (200-300) mL diretamente com papel de filtro. Aquea a poro filtrada. Agite a amostra continuamente durante o aquecimento e remova do calor quando a temperatura atingir 130C. Abastea um frasco especial para leo completamente at o gargalo com a amostra e tampe hermeticamente. Coloque o frasco num banho de gua a 25C e vede o banho com parafina. Mergulhe o frasco contendo a amostra em banho de gelo, de modo que o conjunto fique coberto com gua e gelo. Reabastea com gelo freqentemente, se necessrio, para manter o banho solidamente empacotado, caso contrrio, a temperatura poder subir acima de 0C. essencial que a temperatura do banho se mantenha a 0C. Ao final de cinco horas e meia, remova o frasco do banho e examine rigorosamente os cristais de gordura ou turvao formada. No confundir cristais com pequenas bolhas de ar. Para o teste ser positivo, a amostra precisa estar completamente clara, lmpida e brilhante. Notas A finalidade do tratamento a quente remover traos de impurezas, umidade e destruir algum ncleo de cristais. Recomenda-se utilizar um fundo preto iluminado para melhor visualizao do resultado do teste, devendo a amostra ficar a uma distncia de 2 metros. Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended pracctices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ce 11-53]. 339/IV Determinao de matria insaponificvel

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Matria insaponificvel inclui aquelas substncias que freqentemente se encontram dissolvidas nas gorduras e leos e que no podem ser saponificadas por tratamento usual com soda, mas so solveis em solventes normais para gorduras e leos. Incluem-se neste grupo de componentes, lcoois alifticos de alto peso molecular, esteris, pigmentos e hidrocarbonetos. O mtodo aplicvel para gorduras e leos animais e vegetais, no sendo adequado para gorduras e leos contendo quantidade excessiva de matria insaponificvel, como os leos marinhos. Este mtodo tambm no aplicvel para alimentos com elevado teor de gordura. Material Extrator de gordura de capacidade de 200 mL com tampa de vidro, frascos Erlenmeyer ou Soxhlet de 100 a 200 mL, funil de separao de 500 mL, sifo de vidro e balana analtica. Reagentes lcool a 95% v/v lcool a 10% v/v Soluo de hidrxido de potssio a 50% m/v ter de petrleo Soluo de hidrxido de sdio 0,02 M Soluo de fenolftalena Procedimento Pese cerca de 5 g de amostra bem misturada em um frasco Erlenmeyer ou Soxhlet. Adicione 30 mL de lcool a 95% e 5 mL de KOH a 50%. Aquea e deixe em refluxo por 1 hora ou at completa saponificao. Transfira para o funil de separao, ainda quente, usando um total de 40 mL de lcool 95%. Complete a transferncia com gua quente e depois fria at um volume total de 80 mL. Lave ainda o frasco com um volume de 5 mL de ter de petrleo e transfira para o funil. Esfrie at temperatura ambiente e adicione 50 mL de ter de petrleo. Insira a tampa e agite vigorosamente por um minuto at o total clareamento das duas camadas. Use sifo de vidro para remover completamente a camada superior sem incluir qualquer poro da camada inferior. Receba as fraes de ter de petrleo em um funil de separao de 500 mL. Repita a extrao pelo menos seis vezes, usando pores de 50 mL de ter de petrleo, agitando vigorosamente em cada extrao. Lave os extratos combinados no funil de separao trs vezes, usando 25 mL de lcool a 10%, agitando vigorosamente e retirando a camada alcolica depois de cada extrao. Evite remover qualquer parte da camada de ter de petrleo. Transfira o extrato de ter de petrleo para um bquer tarado e evapore at a secagem em banho de gua. Depois de
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todo o solvente ter sido evaporado, complete a secagem em estufa a vcuo temperatura de (75-80)C e presso interna de 200 mm de Hg. Esfrie em dessecador e pese. Depois da pesagem, dissolva o resduo em 50 mL de lcool a 95% a 50 C previamente neutralizado contendo fenolftalena como indicador. Titule com NaOH 0,02 M at o ponto de viragem. Corrija a massa do resduo para cidos graxos livres contidos, usando a seguinte relao: 1 mL de 0,02 M de NaOH equivalente a 0,0056 g de cido olico. Faa um branco sem a presena de leo ou gordura e proceda da mesma maneira que a amostra. Clculo

A = massa do resduo obtido aps secagem a vcuo B = massa de cido graxo determinado por titulao C = massa do branco. P = n de gramas da amostra Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA,. A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ca 6a-40]. 340/IV Prova de Halphen-Gastaldi Esta prova considerada especfica para a presena de estruturas ciclopropnicas contidas no cido esterclico ou cidos de estruturas similares. Detecta, qualitativamente, a presena de leo de semente de algodo em leos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipeta de 5 mL, tubo de ensaio, banho-maria e proveta de 10 mL. Reagentes Soluo de enxofre em sulfeto de carbono a 1% m/v Piridina. Procedimento Transfira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio. Adicione 5 mL de
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uma soluo de enxofre em sulfeto de carbono a 1% e uma gota de piridina. Adapte ao tubo de ensaio um tubo de segurana. Mergulhe o tubo em banho-maria durante 15 minutos. Recolha o sulfeto de carbono destilado em um bquer com gua. Na presena de leo de semente de algodo, aparecer uma colorao vermelha ou vermelho-cereja. A intensidade de cor depende da quantidade de leo de semente de algodo presente. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 264-265. 341/IV Prova de Holde Este mtodo detecta, qualitativamente, a presena de leo de amendoim em leos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipetas de 1 e 5 mL, tubo de ensaio graduado e bico de Bnsen. Reagentes Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 3,3% (lcool a 90%) m/v lcool Procedimento Transfira 0,65 mL da amostra para um tubo de ensaio graduado. Adicione 5 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio a 3,3% (lcool a 90%). Aquea at a ebulio e saponifique durante dois minutos. Esfrie e adicione uma quantidade de lcool a 90% equivalente ao evaporado. Coloque em banho a 18C, por 10 minutos. Na presena de leo de amendoim, aparecer uma turvao ou um precipitado gelatinoso, dependendo da quantidade de leo de amendoim presente. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 265

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342/IV Prova de Villavecchia-Fabris Este mtodo detecta, qualitativamente, a presena de leo de ssamo (gergelim) em leos e gorduras animais ou vegetais. Material Pipetas de 1 e 5 mL, proveta de 10 mL e tubo de ensaio. Reagentes Soluo alcolica de furfural purificado a 1% (lcool a 95%) m/v cido clordrico Procedimento Transfira 5 mL da amostra para um tubo de ensaio (se a amostra for muito espessa, adicione 5 mL de ter de petrleo). Adicione 0,2 mL da soluo alcolica de furfural a 1% (lcool a 95%) e 5 mL de cido clordrico. Agite o tubo durante 30 segundos. Deixe em repouso at separao das camadas. Na presena de leo de ssamo (gergelim), a camada cida apresentar uma colorao vermelha persistente. Referncia bibliogrfica INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1: Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3 ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 265. 343/IV Determinao da extino especfica por absoro na regio do ultravioleta. Este mtodo descreve o procedimento para o exame espectrofotomtrico de azeite de oliva e outros leos e gorduras na regio do ultravioleta. A anlise espectrofotomtrica na regio do ultravioleta pode fornecer informaes sobre a qualidade de um leo, seu estado de conservao e alteraes causadas pelo processamento. A absoro em 232 e 270 nm, comprimentos de onda especificados no mtodo, devida presena de sistemas dienos e trienos conjugados, respectivamente. Estes compostos so formados por oxidao e/ou refino do leo. Azeites de oliva virgem de boa qualidade e armazenados sob condies adequadas contm poucos produtos de oxidao os quais absorvem prximo a 232 nm. Em alguns casos particulares, azeites de oliva virgem alterados podem exibir caractersticas espectrais prximas dos leos refinados.
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Neste mtodo, o leo ou gordura em questo dissolvido em solvente apropriado e a extino da soluo determinada nos comprimentos de onda especificados, usando como referncia o solvente puro. Estas absores so expressas como extines especficas (a absorbncia de uma soluo a 1% do leo no solvente especificado, numa espessura de 1 cm), convencionalmente indicadas por K. Material Espectrofotmetro UV/VIS com leituras individuais para cada comprimento de onda, cubetas de quartzo com caminho ptico de 1 cm, bales volumtricos de 25 mL, colunas de vidro cromatogrficas com comprimento de 450 mm, dimetro interno de 35 mm, provida de tubo de descarga com 10 mm de dimetro aproximadamente e mufla. Reagentes Ciclohexano ou isoctano, grau espectrofotomtrico Alumina bsica Hexano, grau cromatogrfico Azeite de oliva virgem leo de amendoim refinado Preparao da alumina Coloque alumina, previamente dessecada em mufla a (380 400)oC por 3 horas, em um frasco hermeticamente fechado. Adicione gua na proporo de 5 mL para 100 g de alumina. Feche o frasco de imediato e agite repetidamente. Deixe em repouso por pelo menos 12 horas antes de usar. Verificao da atividade da alumina Prepare a coluna cromatogrfica com 30 g de alumina. Passe atravs da coluna uma mistura consistindo de 95% de azeite de oliva virgem (k < 0,18 a 268 nm) e 5% de leo de amendoim refinado (k > 4 a 268 nm). Se aps a passagem atravs da coluna a mistura apresentar uma extino especfica maior que 0,11 a 268 nm, a alumina aceitvel. Caso contrrio, o nvel de hidratao deve ser aumentado. Procedimento A amostra a ser analisada deve estar perfeitamente homognea e livre de impurezas. leos lquidos temperatura ambiente devem ser filtrados atravs de papel de filtro temperatura de aproximadamente 30C. Gorduras slidas devem ser homogeneizadas e filtradas temperatura no superior a 10C acima do ponto de fuso. Pese aproximadamente 0,25 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL. Dissolva e complete o volume com ciclohexano ou isoctano e homogeneze (soluo A). A soluo resultante
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deve ser perfeitamente lmpida. Se ocorrer opalescncia ou turbidez, filtre rapidamente atravs de papel de filtro. Transfira 5 mL desta soluo e dilua a 25 mL com o ciclohexano ou isoctano em balo volumtrico (soluo B). Encha uma cubeta com a soluo A e mea a absorbncia a 270 nm, usando o mesmo solvente como referncia, em espectrofotmetro previamente calibrado. Procedendo da mesma maneira, mea a absorbncia da soluo B a 232 nm. Os valores de absorbncia obtidos devem estar compreendidos na faixa de 0,1 a 0,8. Quando o valor obtido da extino especfica a 270 nm for superior ao limite mximo legal estabelecido para a classificao do azeite, torna-se necessria a purificao por coluna cromatogrfica com alumina ativada, como segue: transfira 30 g de alumina previamente ativada em suspenso com hexano para coluna cromatogrfica. Remova o excesso de hexano deixando o nvel do solvente a 1 cm da alumina. Dissolva 10 g de leo em 100 mL de hexano homogeneizado e livre de impurezas, conforme j descrito neste procedimento e passe esta soluo pela coluna. Colete o eluato e evapore todo o solvente sob vcuo e proceda como descrito anteriormente. Clculo

K = extino especfica no comprimento de onda A = absorbncia medida no comprimento de onda c =concentrao da soluo em g/100 mL l = caminho ptico da cubeta em cm Nota: a anlise espectrofotomtrica do azeite de oliva inclui a determinao da variao da extino especfica:

K = Extino especfica no comprimento de onda para a mxima absoro em torno de 270 nm Referncia bibliogrfica AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990. [A.O.C.S. Official method Ch 5-91].
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344/IV Anlise por cromatografia em fase gasosa dos steres metlicos de cidos graxos A determinao da composio de cidos graxos a partir da anlise dos steres metlicos auxilia no estudo de fraudes e na avaliao do contedo nutricional de leos e gorduras de origem vegetal ou animal. Por este mtodo, os steres metlicos de cidos graxos so separados, identificados e quantificados por cromatografia em fase gasosa. O mtodo aplicvel para a determinao de steres metlicos de cidos graxos contendo de 4 a 24 tomos de carbono, obtidos a partir de cidos graxos de leos e gorduras. Material Cromatgrafo a gs com sistema de injeo para coluna capilar (com capacidade de diviso da amostra) e coluna empacotada (com o menor volume morto possvel), forno com variao mxima de 1C para colunas empacotadas, 0,1C para colunas capilares e com temperatura programvel (fundamental para anlise de steres metlicos de cidos graxos com menos de 16 tomos de carbono na molcula); detector de ionizao de chama (DIC); seringa de 10 L graduada em 0,1 L e registrador ou integrador ou computador. Coluna empacotada A coluna deve ser construda com um material inerte s substncias que sero analisadas, isto , vidro ou ao inox. Deve possuir comprimento de (1-3) m e dimetro interno de (2-4) mm. Suporte de empacotamento So empregadas, normalmente, terras diatomceas que sofreram lavagem cida e silanizao. O tamanho das partculas deve estar compreendido na faixa de (60-120) e (125-250) mesh, sendo que a variao entre elas no deve ser superior a 25 m. Fase estacionria Pode ser empregado um lquido viscoso polar de polisteres, isto , polisuccinato de dietileno glicol (DEGS), polisuccinato de butanediol, poliadipato de etileno glicol. A fase estacionria deve corresponder de (5-20)% do empacotamento da coluna. Condicionamento de uma coluna nova Desconecte a coluna do lado do detector e gradativamente aquea o forno a aproximadamente 10C acima da temperatura de operao, sempre passando o gs de arraste. Mantenha esta temperatura, passando pela coluna o gs de arraste com fluxo de (20 - 60) mL/min por aproximadamente 16 horas e por mais 2 horas a 20C acima da temperatura de operao. Cuidado para no exceder a
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temperatura mxima recomendada pelo fabricante. Coluna capilar Tubo O tubo da coluna feito de material inerte, normalmente slica fundida. O dimetro interno pode variar de (0,2-0,8) mm. A superfcie interna do tubo sofre um tratamento apropriado, antes de ser depositada a fase estacionria. O comprimento da coluna varia normalmente de (25 - 100) m. Fase estacionria As fases estacionrias so filmes de polietileno glicol, polisuccinato de butanediol, ciano propil siloxanos, entre outras. A espessura do filme pode variar de (0,1 - 0,25) m. Instalao e condicionamento da coluna Tome os devidos cuidados na instalao das colunas nos fornos, ajustando as coneces para evitar vazamento dos gases ou quebra da coluna e reduzindo os espaos mortos. Condicione a coluna sempre passando o gs de arraste e programe o aquecimento da temperatura do forno a 3C/min a partir da temperatura ambiente at 10C abaixo da temperatura de decomposio da fase estacionria (verifique as recomendaes do fabricante). Mantenha esta temperatura por 1 hora at estabilizar a linha de base. Reagentes Gs de arraste para DIC: hidrognio (coluna capilar), nitrognio, hlio ou argnio (pureza 99,999%). Gases auxiliares para o DIC: nitrognio, hidrognio (pureza 99,999 %) e ar super seco (livre de hidrocarbonetos). n-Hexano grau cromatogrfico. Padres de referncia: mistura de steres metlicos de cidos graxos ou padres individuais de steres metlicos (ampolas seladas com mg dos padres) ou um leo de composio conhecida, de preferncia similar ao leo ou gordura a ser analisado. Solues-padro de referncia Dissolva o contedo da ampola (mg) dos padres de referncia em n-hexano e transfira para um balo volumtrico de 100 mL ou de outro volume apropriado. Complete o volume com o mesmo solvente. Procedimentos Condies otimizadas de operao Para coluna empacotada, considere as seguintes variveis: tamanho e dimetro interno da coluna, temperatura da coluna, fluxo do gs de arraste [proporo ideal: nitrognio, hidrognio e ar sinttico 1:1:10 (exemplo: N2 (gs de arraste) 30 mL/min, H2 30 mL/min e ar sinttico 300 mL/min)], resoluo requerida,
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tamanho da amostra para anlise. O tamanho da amostra escolhido deve situar-se dentro da faixa linear de resposta do detector. Para coluna capilar considere as mesmas variveis citadas para a coluna empacotada. A eficincia (nmero de pratos tericos) obtida para cada componente separado por uma coluna capilar deve ser ao redor de 100000 ou no mnimo 3000 pratos por metro de coluna. Dependendo do tipo de amostra e da coluna disponvel deve-se otimizar as condies de anlise para se obter a melhor eficincia e resoluo dos componentes. Para a anlise de steres metlicos de cidos graxos de leos vegetais, recomenda-se, por exemplo,as condies do mtodo Method Ce 1h-05 ou a descrita abaixo: Coluna de fase estacionria ciano propil siloxona de 50 a 100 m, com 0,25 m de espessura do filme e 0,25 mm de dimetro interno. Gs de arraste, hidrognio, velocidade linear entre (15 - 25)mL/min, razo de diviso da amostra 1:50. Exemplo: coluna de 50 m Temperatura programada da coluna de 80 a 220C, sendo a velocidade de aquecimento de 5C por minuto. Mantenha a 220C por 10 minutos. Temperatura do injetor: 230C Temperatura do detector: 240C Determinao da eficincia e resoluo Analise uma mistura de steres metlicos dos cidos esterico e olico com propores equivalentes dos dois compostos. Calcule o nmero de pratos tericos n (eficincia) e a resoluo pelas frmulas:

dR1 = distncia de reteno, medida em mm, do incio da injeo ao mximo do pico do metil estearato. w1 e w2 = larguras dos picos do metil estearato e oleato, respectivamente = distncia entre os mximos dos picos do metil estearato e metil oleato As condies de anlise que devem ser escolhidas so as que produzirem: n = 3000 pratos tericos por metro de coluna (no mnimo) para o estearato de metila R = 1,25 (no mnimo)
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Nota: deve-se trabalhar com temperatura do forno da coluna programvel na anlise de amostras contendo cidos graxos com pesos moleculares muito diferentes. Diversos equipamentos possuem softwares que calculam os parmetros de desempenho da coluna, auxiliando na seleo rpida da melhor condio de anlise. Determinao dos steres metlicos Prepare a amostra como descrito em um dos procedimentos a seguir: 054/IV, 055/IV ou 056/IV. Injete no cromatgrafo de 0,1 a 2 L da soluo de steres metlicos de cidos graxos de padres puros ou obtidas conforme descrito acima. Analise a mistura de padres de referncia de steres metlicos de cidos graxos de composio conhecida nas mesmas condies empregadas na anlise da amostra e determine o tempo de reteno (ou distncia de reteno) para cada ster metlico. Construa o grfico do logaritmo do tempo de reteno em funo do nmero de tomos de carbono dos cidos graxos. Em condies isotrmicas de anlise, o grfico para steres de sries homlogas e cadeia linear, deve ser uma reta. As retas so praticamente paralelas para diferentes sries homlogas. Empregando-se os grficos obtidos como descrito acima, pode-se identificar um ster de cido graxo de uma srie homloga por interpolao. Na prtica utiliza-se o clculo de ECN, isto , nmero equivalente de carbono, para identificao de cidos graxos de uma srie homloga. Os valores de ECN so calculados a partir dos valores dos tempos de reteno dos compostos.

Agi = cido graxo a ser identificado n e n+i = nmero de tomos de carbono de padres homlogos de cadeia reta, eludos antes e depois do cido graxo a ser identificado. tAgi = tAgi - t0 tAgi = tempo de reteno corrigido tAgi = tempo de reteno da substncia a ser identificada t0 = tempo de reteno de uma substncia no retida. (Ex: butano, pentano em colunas polares). tAgn + tAgn+i = tempos de reteno corrigidos de padres homlogos de cadeia reta, eludos antes e depois do cido graxo a ser identificado. (inormalmente igual a mltiplos de 2)
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Com determinada programao de temperatura (aumento linear de temperatura) a equao simplificada para:

Clculos Normalizao Exceto em casos excepcionais, assuma que todos os componentes da amostra estejam representados no cromatograma. Desta forma a soma das reas de todos os picos representar 100% dos constituintes (eluio total). Se o equipamento incluir um computador ou integrador, utilize seus recursos para o clculo. Caso contrrio, determine a rea de cada pico multiplicando a altura pela largura na meia altura. Quando necessrio, considere as vrias atenuaes utilizadas durante o registro dos cromatogramas. De uma maneira geral, quando no esto presentes quantidades significativas de componentes com menos de 12 tomos de carbono, calcule a porcentagem de rea do pico correspondente ao constituinte, em relao soma das reas de todos os picos. O resultado ser expresso como porcentagem de rea do componente (ster metlico).

AAgi = rea do pico correspondente ao componente i A = soma das reas de todos os picos. Normalizao com fatores de correo Os fatores de correo da resposta do detector so determinados quando esto presentes na amostra cidos graxos com menos de 12 tomos de carbono e/ou cidos graxos com grupos secundrios ou, ainda, quando se utiliza um detector de condutividade trmica. Estes fatores devem ser usados para converter as porcentagens de rea dos picos em porcentagem de massa dos componentes. Determine os fatores de correo com a ajuda de um cromatograma obtido da anlise da mistura de padres de steres metlicos, de composio conhecida, nas mesmas condies de anlise da amostra.

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Para a mistura padro:

Agi

MAgi = massa do componente i na mistura padro. M = massa total dos vrios componentes na mistura padro Do cromatograma da mistura padro, calcule:
Agi

AAgi = rea do pico correspondente ao componente i A = soma da rea de todos os picos.

Agi Agi

Geralmente os fatores de correo so calculados com relao ao KC16 (ster metlico do cido palmtico). Assim os fatores relativos so:
Agi

Expresse o resultado em % de massa (m/m) do componente (ster metlico):

Agi
Agi

Agi

Agi

Pode ser feito o clculo terico dos fatores de correo do detector de ionizao de chama (DIC):

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KAgi = fator de resposta para o cido graxo i M Agi = massa molecular do ster metlico de cido graxo i n Agi = nmero de tomos de carbono do ster metlico do cidos graxo i Ac = massa atmica do carbono (12,01) Pesos atmicos utilizados no clculo: Carbono = 12,01; Hidrognio = 1,0079; Oxignio = 15,994. Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relao ao C16:0:

KAg i = fator relativo de correo, para o cido graxo i K C16 = fator de resposta do DIC para o C16:0 KAgi = fator de resposta do DIC para o cido graxo i A determinao dos fatores de correo de resposta do DIC especialmente importante para os cidos graxos de baixo peso molecular (C4:0; C6:0), como por exemplo, para os derivados de gordura de leite e para os de alto peso molecular, como os de leos de peixe, pois nestes casos os fatores relativos desviam de forma considervel da unidade. Clculo com padro interno (PI) Empregue o mtodo de padronizao interna para determinar o valor absoluto de um cido graxo na amostra ou na quantificao de cidos graxos com baixo peso molecular (4 a 6 tomos de carbono) juntamente com cidos graxos de alto peso molecular (16 a 24 tomos de carbono) na mesma amostra. steres metlicos de cidos graxos com nmero mpar de carbonos so freqentemente usados como padro interno (Ex: C5:0; C11:0; C13:0; C19:0 ou C23:0). Expresse o resultado em % de massa do componente (ster metlico):

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M = massa em miligramas da amostra API = rea do PI MPI = massa em miligramas do PI AAGi = rea correspondente ao componente i KAgi = fator de correo da resposta do DIC para o cido graxo i (relativo a KC16) KPI = fator de correo da resposta do DIC para o PI (relativo a KC16) Nota: quando o resultado for expresso em gramas de cidos graxos por 100 g de leo, deve-se multiplicar pelo fator 0,956. Referncias bibliogrficas AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 2-66: Preparation of methyl esters of long chain fatty acids). AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign, USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatography). AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1995 (A.O.C.S. Official Method Ce 1d-91 Determination of fatty acids in edible oils and fats by capillary GLC). AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society. 4th ed. Champaign , USA: A.O.C.S., 1997 (A.O.C.S. Official Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in hydrogenated and refined oils and fats by capillary GLC). INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: Animal and vegetable fats and oils Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids. ISO 5508. 1990E INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1 Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 266.
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345/IV Determinao de tocoferis e tocotrienis por cromatografia lquida de alta eficincia Este mtodo quantifica tocoferis (alfa, beta, gama e delta) e tocotrienis em leos vegetais ou gorduras. Baseia-se na dissoluo da amostra em solvente orgnico e injeo direta em cromatgrafo a lquido para a separao e quantificao dos tocoferis e tocotrienis. Material Sistema de cromatografia a lquido de alta eficincia (CLAE) composto de: bomba de alta presso, dispositivo para injeo da amostra, detector de fluorescncia ajustado para os comprimentos de onda de 290 nm de excitao e 330 nm de emisso (na indisponibilidade de detector de fluorescncia, utilize o de UV ajustado em 292 nm), coluna analtica de CLAE (250mm x 4mm) empacotada com micropartculas de slica de 5 m, pr-coluna de slica; espectrofotmetro UV/VIS; rotavapor; bales volumtricos mbar de 25, 50 e 100 mL; pipetas volumtricas de 10 mL e pipetas automticas (20 a 200 L e 200 a 1000 L). Reagentes Padres de , , , - tocoferis de alta pureza (superior a 95%). Metanol. n-Hexano. Isopropanol Fase mvel para CLAE Hexano - isopropanol (99,5:0,5). Nitrognio seco Nota: todos os solventes devem ser grau CLAE Soluo-padro estoque de -tocoferol Pese cerca de 10 mg do padro em um balo volumtrico mbar 100 mL e complete o volume com n-hexano. Pipete 10 mL desta soluo para um frasco mbar e remova o solvente num rotavapor. A temperatura no deve exceder a 40oC. Retire o frasco e remova o solvente residual com nitrognio. Adicione 10 mL de metanol, com pipeta volumtrica, e agite para dissolver o tocoferol. Mea a absorbncia desta soluo a 292 nm e calcule a concentrao (como g/mL de -tocoferol) dividindo-se o valor da absorbncia lida por 0,0076.

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Solues-padro estoque de , , -tocoferis Prepare a soluo-estoque para cada um dos padres de , , -tocoferol e proceda como descrito para a soluo-padro de -tocoferol. Mea a absorbncia de cada uma das solues nos comprimentos de onda indicados abaixo e utilize os respectivos fatores para o clculo da concentrao e pureza. 296 nm -tocoferol = 0,0089 298 nm -tocoferol = 0,0091 298 nm -tocoferol = 0,0087 Notas Os fatores citados so derivados dos valores da absoro especfica dos tocoferis nos respectivos comprimentos de onda. Estoque as solues-padro em frasco de vidro mbar, ao abrigo da luz e sob refrigerao pelo perodo de uma semana. Soluo de trabalho de mistura de tocoferis Combine volumes apropriados das solues-padro estoque para obter solues de trabalho com concentraes dos tocoferis entre 1 e 5 g/mL. Escolha no mnimo cinco pontos para a curva de calibrao. Utilize n-hexano nas diluies. Nota: Quando utilizar detector UV prepare uma soluo mais concentrada dos padres. Procedimentos Otimizao dos parmetros analticos Condicione a coluna, se necessrio. Ajuste o fluxo da fase mvel [n-hexano/isopropanol (99,5:0,5 v/v)] em 1 mL/min e deixe pelo menos 30 min. Injete cerca de 20 L da mistura dos padres de tocoferis e, se necessrio, ajuste a proporo de isopropanol da fase mvel e o fluxo. O fluxo da fase mvel adequado deve estar entre (0,7 - 1,5)mL/min. O tempo de reteno do -tocoferol no deve ser menor que 5 minutos. O Fator de resoluo (R) para o e -tocoferol no deve ser menor que 1,0. Fator de resoluo (R) calculado por:

Rd1 = distncia de reteno do -tocoferol Rd2 = distncia de reteno do -tocoferol W1 = largura da base do pico do -tocoferol W2 = largura da base do pico do -tocoferol

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Preparao da amostra A amostra lquida de leo deve ser homogeneizada (no filtre). Para amostra slida, transfira uma certa quantidade representativa (no menos que 10% do peso total da amostra) para um bquer e homogeneze cuidadosamente. Faa a fuso em um banho-maria onde a temperatura no exceda a 40oC. O preparo da amostra deve ser feito na ausncia de luz. Pese com preciso, entre 0,2 e 0,5 g da amostra de leo e transfira para um balo volumtrico de 25 mL com n-hexano. Agite para dissolver e complete o volume com o mesmo solvente. Quando utilizar um detector de fluorescncia, podem ser necessrias algumas diluies para a obteno de um cromatograma adequado. A amostra deve estar protegida da luz durante os procedimentos de preparo e deve ser analisada no mesmo dia. Determinao de tocoferis na amostra Injete 20 L da amostra e identifique os tocoferis (e tocotrienis) presentes por comparao com os tempos de reteno dos padres. Registre as reas dos picos dos tocoferis e dos tocotrienis. Faa duas determinaes sucessivas para cada tocoferol, usando alquotas-teste preparadas recentemente. O resultado final deve ser a mdia de duas determinaes obedecendo a exigncia da repetitividade (vide resultados estatsticos do estudo colaborativo do mtodo IUPAC 2432). Curva de calibrao Injete cerca de 20 L das solues de mistura dos padres de tocoferis. Repita a injeo e verifique se os cromatogramas obtidos so reprodutveis. Construa as curvas de calibrao pelo mtodo de padronizao externa. Clculos A quantificao dos tocoferis feita por padronizao externa. Os teores dos tocoferis so calculados a partir de curvas de calibrao construdas pelos softwares dos equipamentos ou em planilhas de clculo (ex: excel). Para a construo da curva utilize no mnimo cinco pontos, isto , no mnimo cinco nveis de concentrao de cada padro. As curvas obtidas relacionam a concentrao dos padres e a resposta do detector (rea). O teor de -tocoferol presente em uma amostra, em g/g, dado por:

C = concentrao do padro de -tocoferol (g/mL) A = medida da rea do pico obtido pelo padro de -tocoferol a = medida do rea do pico obtida pela amostra de -tocoferol m = massa da amostra D = fator da diluio Os teores de , e -tocoferis da amostra so calculados como o procedimento anterior usando os dados do cromatograma do correspondente padro de tocoferol.
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Nota: os tocotrienis contidos na amostra podem ser estimados usando os valores de C e A para o correspondente tocoferol. De acordo com a literatura a intensidade da fluorescncia para os tocoferis a mesma do correspondente tocotrienol e a absorbncia no UV similar. Referncia bibliogrfica INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892, 346/IV Determinao de tocoferis e tocotrienis por cromatografia lquida de alta eficincia em produtos processados contendo steres de tocoferis. Produtos processados contendo steres de tocoferis, como por exemplo, margarinas, so saponificados e a matria insaponificvel obtida dissolvida em solvente orgnico e injetada em cromatgrafo a lquido para a separao e quantificao dos tocoferis e tocotrienis. Material Balana analtica, banho-maria, rotavapor, bales mbar de fundo chato de 50 e 100 mL com boca esmerilhada, funis de separao mbar de 250 mL, filtros de vidro, provetas de 10 e 50 mL, papel de filtro e balo volumtrico de 50 mL. Reagentes lcool aproximadamente 95% cool absoluto a 99% Pirogalol Soluo de KOH a 60% m/v ter etlico livre de perxidos (contendo 0,1% m/m de pirogalol) HCl 0,01 M Sulfato de sdio anidro Procedimento Pese cerca de 2 g da amostra em balo de fundo chato mbar de 100 mL. Adicione aproximadamente 8 mL de lcool 95%, para dissolver completamente a amostra. Agite levemente o frasco. Adicione 100 mg de pirogalol e agite para dissolver. Purifique com nitrognio, adicione 4 mL de soluo aquosa de KOH 60%. Passe nitrognio e
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tampe o frasco. Coloque o frasco em um banho-maria temperatura de 26C e agite vigorosamente por 10 minutos. Todas as operaes devem ser realizadas na ausncia de luz direta (use frascos de vidro mbar ou os envolvam com papel alumnio). Adicione 50 mL de gua ao frasco e transfira o contedo quantitativamente para um funil de separao de 250 mL. Lave o frasco com 50 mL de ter etlico livre de perxidos e transfira as lavagens para o funil. Agite vigorosamente o funil de separao por 1 minuto, abrindo a tampa ocasionalmente para liberar a presso formada. Deixe em repouso para que ocorra a separao das camadas. Retire a camada aquosa (camada inferior). Faa mais quatro extraes da camada aquosa com 30 mL de ter etlico isento de perxidos e combine os extratos etreos em outro funil de separao. Lave o extrato etreo combinado com 50 mL de gua (agitando cuidadosamente para evitar formao de emulso) e a seguir com 30 mL de HCl 0,01 M. Separe as fases. Despreze a fase aquosa. Filtre a frao etrea passando por cerca de 3 g de Na2SO4 anidro, com a ajuda de um funil e papel de filtro. Colete o filtrado em balo de fundo chato mbar para adaptar em um rotavapor. Remova o ter sob presso reduzida, no excedendo a temperatura de 40C. Se o resduo lquido permanecer no frasco, adicione lcool absoluto 99% e evapore at secura. Lave as paredes do frasco com n-hexano e transfira o contedo quantitativamente para um balo volumtrico de 50 mL. Complete o volume. Dilua adequadamente a amostra e proceda conforme 345/IV. Referncia bibliogrfica INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC 2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892, 1988.

Colaboradores Emy Takemoto, Mrio Tavares, Miriam Solange Fernandes Caruso, Regina Sorrentino Minazzi Rodrigues e Sabria Aued Pimentel
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