MECANISMOS DE REPARO

Eduardo Montagner Dias Apesar de mutaes genticas serem de extrema importncia para a evoluo de uma espcie, a sobrevivncia do indivduo depende da estabilidade do seu genoma. A estabilidade resulta no s de um acurado mecanismo de replicao, mas tambm de mecanismos que reparem os danos que ocorrem continuadamente no DNA. Entende-se por reparo a capacidade da maquinaria celular de corrigir os erros causados por mutaes. Muitos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informao gentica preservada em ambas as fitas da dupla-hlice, de tal forma que a informao perdida em uma fita pode ser recuperada a partir da fita complementar. Os mecanismos existentes e conhecidos de reparao do DNA lesado so provavelmente universais e uma clula pode ter vrios sistemas capazes de atuar ao mesmo tempo no DNA lesado. Como os sistemas de reparao so mais bem compreendidos e estudados na Escherichia coli, muitos mecanismos discutidos faro referncia a esta bactria. Reparo por fotorreativao enzimtica Um dos mecanismos de reparo melhor estudados a remoo dos dmeros de pirimidina, formados pela exposio do DNA luz ultravioleta. Este dmero no se encaixa bem na estrutura de dupla-hlice e, assim, a replicao e a expresso gnica so bloqueadas at que a leso seja removida. Esse tipo de leso pode ser reparado de diferentes formas. A forma mais direta envolve enzimas que simplesmente revertem a modificao qumica que originou o dano. Dmeros de pirimidina so o alvo universal da enzima fotoliase, que se liga ao dmero e catalisa uma segunda reao fotoqumica, desfazendo o anel formado pela luz UV e refazendo as bases pirimdicas individuais. Esse processo chamado fotorreativao e envolve as seguintes etapas: inicialmente, a enzima reconhece e liga-se ao dmero (mesmo na ausncia de luz visvel); depois, a absoro de luz fornece energia para converter o dmero em monmero de pirimidina; por fim, a enzima dissocia-se do DNA. A reao depende do gene que codifica a fotoliase e ocorre especificamente em procariotos. Reparo de bases alquiladas A base nitrogenada primariamente afetada pelos agentes alquilantes a guanina. Na E. coli, esta leso removida pela enzima O6-metilguaninametiltransferase, que reconhece a alterao no DNA e remove o grupamento metila causador da mutao. A mesma enzima tambm pode remover grupamentos metila dos fosfatos que possivelmente interrompem a cadeia de DNA. Uma caracterstica importante dessa reao que cada grupamento metila removido consome uma enzima O6-metilguanina-metiltransferase, a qual no pode ser recuperada para nova utilizao.

Reparo por exciso de bases Ocorre quando a remoo da base defeituosa feita pela clivagem da ligao base nitrogenada desoxirribose, seguida pelo preenchimento da regio com a base correta por ao da DNA-polimerase. Um exemplo comum de reparo por exciso de base o que acontece na correo da desaminao da citosina uracila. O sistema de reparao reconhece a uracila como uma base estranha ao DNA. Primeiramente, a uracila-DNA-glicosilase hidrolisa a ligao entre a uracila e a molcula de desoxirribose. Nesse estgio, a cadeia de DNA est intacta, mas a base perdida. A enzima AP endonuclease reconhece, ento, essa fenda e cliva a cadeia em regies adjacentes base perdida. A DNA-polimerase insere novamente uma citosina, de acordo com a orientao fornecida pela fita complementar no-danificada, que contm uma guanina. Finalmente, a integridade da fita corrigida restaurada pela DNA-ligase. Existem outras glicosilases que reconhecem e removem hipoxantina, 3-metil-adenina e purinas com anel imidazol aberto por radiao ionizante ou pH elevado. Reparo por exciso de nucleotdeos (REN) Ocorre quando a remoo da base defeituosa feita pela inciso endonucleoltica nos dois lados da leso, com liberao dos nucleotdeos, seguida pelo preenchimento da regio por ao da DNA-polimerase. Em todos os organismos onde j foi estudado, o processo de REN consiste em cinco etapas: 1. Reconhecimento da leso por um complexo multienzimtico; 2. Inciso da fita anormal em ambos os lados da leso a alguma distncia desta; 3. Exciso do segmento contendo a leso; 4. Sntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita no-danificada como molde, por ao da DNA-polimerase; 5. Ligao/restaurao da molcula de DNA por ao da enzima DNA-ligase. A extenso mdia do fragmento de DNA removido de 12 nucleotdeos, razo pela qual esse modelo chamado de reparao de regies curtas. Em caso de grandes quantidades de leses, em que a substituio envolve de 1500 a 9000 nucleotdeos, o modelo conhecido como reparao de regies longas. A diferena entre esses dois modelos de reparao que o primeiro uma funo constitutiva da clula, enquanto o segundo deve ser induzido por leses no DNA pelo menos no que diz respeito clula bacteriana. O modelo proposto para o sistema de REN em mamferos o seguinte: 1. As protenas XPB, XPD e XPA esto envolvidas na deteco da leso, sendo que as duas primeiras percorrem a hlice e a segunda reconhece a leso; 2. Aps encontrar a leso, o DNA do local do dano desnaturado e as endonucleases XPF e XPG fazem a dupla inciso na cadeia; 3. O oligonucleotdeo contendo a leso removido pelas DNAs-polimerases e e pelos seus cofatores PCNA e RF-C, que tambm so responsveis pelo passo seguinte;

4. Ressntese do DNA utilizando a fita no danificada como molde; 5. Ligao da extremidade 5 da regio recm-sintetizada seqncia original, pela DNA-ligase. Outro exemplo muito interessante de REN o sistema de reparao global X genes ativos. Foi demonstrado em E. coli que, embora stios distintos contenham o mesmo tipo de leso, o sistema pode diferenciar um gene ativo de uma regio no-codificadora; assim, os stios crticos do genoma so os primeiros a ser reparados. Em mamferos, onde a quantidade de DNA presente no ncleo muito maior do que na E. coli, a reparao preferencial de seqncias transcritas tambm ocorre. Reparo de bases malpareadas Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da reviso realizada pela DNA-polimerase durante o processo de replicao. Por isso, na E. coli, a etapa final que confere preciso ao processo de replicao de responsabilidade do sistema de correo de erro, que consiste em vrias protenas codificadas pelos genes mut. Esse sistema percorre o DNA recentemente sintetizado procura de pares de base malpareadas e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotdeos incorretos. Isso permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada. A dificuldade que surge, aparentemente, a de distinguir qual das bases de um par erroneamente formado a incorreta, porque ambas so componentes naturais do DNA. Se a remoo de uma das bases fosse ao acaso, haveria a probabilidade de 50% de a base correta ser removida e a mutao poderia ser perpetuada, ao invs de ser corrigida. Existe, porm, um sinal especfico que direciona o sistema de exciso do erro exclusivamente para a fita recm-sintetizada: o reconhecimento de seqncias GATC prximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausncia de metilao nestas seqncias caracteriza a fita recm-sintetizada. O sistema de correo detecta no somente pares nicos de bases malpareadas, mas tambm adies e delees, o que reduz a incidncia de mutaes por modificao no mdulo de leitura, alm daquelas envolvendo substituio de bases. Reparo por recombinao No processo de reparao por recombinao, a fita complementar nodanificada utilizada como molde na substituio do fragmento lesado. Algumas vezes, porm, esse molde no est disponvel, por motivos diversos. A DNApolimerase, ento, forada a passar pela leso sem replicar aquela regio. Uma lacuna com um tamanho considervel deixada na fita recm-sintetizada. Toda a informao do stio danificado perdida e somente pode ser recuperada pela utilizao de uma outra molcula idntica de DNA. Como as clulas de organismos superiores so geralmente diplides, elas possuem a mesma seqncia, ou praticamente a mesma, em cada um dos cromossomos homlogos. Uma fonte apropriada de DNA, portanto, pode ser encontrada na clula.

Assim, como esquematizado na figura abaixo, aps uma mutao, a fita 1 do homlogo A (1A) no est disponvel; a fita 2 do homlogo A (2A) possui uma lacuna. As fitas 1 e 2 do homlogo A (1A e 2A, respectivamente) esto ntegras. No reparo por recombinao, a fita 1A permutada pela fita 2A, de modo que 1A sirva de molde para reconstruo de 1A; e 2A sirva de molde para 2A.

Na E. coli, de fundamental importncia a protena RecA, pois s ela capaz de parear duas molculas de DNA homlogas e catalisar as reaes de trocas de fitas, permitindo reparao e recuperao de leses. Reparo atravs do sistema SOS Uma vez que a clula pode regular a expresso gnica de acordo com sua necessidade, muitas enzimas envolvidas no reparo do DNA so induzidas pelo prprio defeito da molcula de DNA. As enzimas mais importantes desse processo so derivadas dos genes SOS, cuja expresso induzida por um defeito severo o bastante a ponto de impedir a sntese de DNA. Estes genes do origem a protenas de reparo como, por exemplo, endonucleases de exciso, helicases, entre outras. Os dmeros de pirimidinas constituem um exemplo tpico desse tipo de dano. Quando a forquilha de replicao encontra um dmero, a sntese pra e s reiniciada a alguma distncia alm do dmero, ficando uma lacuna no DNA na qual a enzima de recombinao RecA se liga. Essa ligao ativa em RecA uma atividade enzimtica completamente independente da recombinao: ela destri o repressor dos genes SOS (repressor LexA). Dessa maneira, a protena RecA promove reparao do material gentico de duas formas: por recombinao, com troca das fitas, e por induo dos genes SOS.

Reparo sujeito a erro Existem ocasies em que o dano no DNA to extremo que no h como os mecanismos celulares de reparo corrigirem de forma precisa a molcula. Nesses casos, a clula utiliza como ltimo recurso o sistema de reparo sujeito a erro, no qual qualquer uma das quatro bases inserida no local lesado, a fim de garantir a continuidade do processo de replicao. Devido ao fato de no haver a informao precisa (molde), o prprio mecanismo de reparo acaba sendo o causador de uma mutao, pois a chance de introduzir uma base incorreta na cadeia grande. De qualquer forma, para a clula prefervel incorporar uma base incorreta e permitir que a replicao continue, do que no replicar mais. Na E. coli, esse sistema de reparao envolve dois genes principais: umuC e umuD. Esses genes so tambm genes SOS e, portanto, seus produtos esto em abundncia somente aps a clula ter o sistema SOS ativado. Devido a isso, a protena RecA tambm necessria no sistema de reparo sujeito a erro, a fim de comandar a induo dos genes umuC e umuD. Reparo por unio de extremidades no-homlogas Quebras nas duas fitas de uma mesma molcula de DNA ocorrem nas clulas em diversas circunstncias e constituem uma das principais ameaas integridade do genoma. Se no forem reparadas, podem causar a morte celular e, em organismos multicelulares, podem causar o cncer. Uma grande variedade de agentes exgenos, incluindo a radiao ionizante e um nmero considervel de quimioterpicos (como a bleomicina), causam essas quebras, bem como agentes endgenos, a exemplo dos radicais livres. O principal mecanismo de reparao dessas quebras duplas, que ocorre comumente em mamferos, chamado de unio de extremidades no-homlogas. Neste mecanismo, as extremidades de uma molcula de DNA, apesar de terem perdido alguns nucleotdeos por degradao espontnea, so justapostas para recombinar. O mesmo complexo enzimtico realiza o processo de ligao entre as duas extremidades. Desta forma, a seqncia original de DNA acaba sendo alterada. Reparo por unio de extremidades homlogas O segundo mecanismo reparador de quebras na dupla-fita a unio de extremidades homlogas. O processo bem mais comum em bactrias e leveduras, e tambm mais preciso. Por este mecanismo, o cromossomo homlogo quele lesado faz uma cpia da seqncia de nucleotdeos perdida com quebra da dupla-fita e transfere esta seqncia para o stio de quebra no cromossomo lesado; este cromossomo lesado, ento, tem sua seqncia original restaurada.

Doenas Causadas por Deficincia de Reparo no Homem DOENA SENSIBILIDADE SUSCETIBILIDADE SINTOMAS AO CNCER UV, purina alquilada Carcinoma de pele Linfoma Fotossensibilidade de pele e olhos Ataxia; dilatao de vasos sangneos na pele e olhos; aberraes cromossmicas. Pancitopenia hipoblstica; anomalias congnitas Fotossensibilidade; mudanas faciais ENZIMA OU PROCESSO AFETADO Reparo por exciso de nucleotdeos Protena cinase ATM, ativada por quebra nas duas fitas Reparo de DNA cruzado interfitas DNAhelicase acessria para replicao

Xeroderma pigmentoso

Ataxia Radiao gama teleangiectasia

Anemia de Fanconi Sndrome de Bloom

Agentes que fazem Leucemias ligao cruzada UV Leucemias

Bibliografia: Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4th edition, New York: Garland Science, 2002 Zaha A, Ferreira HB, Passaglia LMP. Biologia Molecular Bsica. 3 edio, Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.