Novembro, 2002

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Centro de Pesquisa Agropecuria de Clima Temperado Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Luis Antnio Suita de Castro

Pelotas, RS 2002

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Clima Temperado Endereo: BR 392 Km 78 Caixa Postal 403 - Pelotas, RS Fone: (53) 275 8199 Fax: (53) 275 8219 - 275 8221 Home page: www.cpact.embrapa.br E-mail: sac@cpact.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade Presidente: Mrio Franklin da Cunha Gastal Secretria-Executiva: Joseane M. Lopes Garcia Membros: Ariano Martins Magalhes Junior, Flvio Luiz Carpena Carvalho, Darcy Bitencourt, Cludio Jos da Silva Freire, Vera Allgayer Osrio Suplentes: Carlos Alberto Barbosa Medeiros e Eva Choer Supervisor editorial: Maria Devanir Freitas Rodrigues Revisoras de texto: Maria Devanir Freitas Rodrigues/Ana Luiza Barragana Viegas Normalizao bibliogrfica: Regina das Graas Vasconcelos dos Santos Editorao eletrnica: Oscar Castro 1 edio 1 impresso (2002): 100
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Castro, Luis Antnio Suita de. Processamento de mostras para microscopia eletrnica de varredura / Luis Antnio Suita de Castro. - Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2001. 37p. - (Embrapa Clima Temperado. Documentos, 93). ISSN 1516-8840 1. Microscopia eletrnica - I. Ttulo. II. Srie.

CDD 578.0282

Autor

Luis Antnio Suita de Castro Eng. Agr., M.Sc., Embrapa Clima Temperado Cx. Postal 403, CEP 96001-970 Pelotas, RS. e-mail: suita@cpact.embrapa.br

Apresentao

Desde 1997 a Embrapa Clima Temperado conta com a rea de microscopia eletrnica. Vrios trabalhos vm sendo desenvolvidos com relao microscopia de varredura permitindo obter imagens em trs dimenses, com ampliaes de at 300 mil vezes. Assim, disponibiliza-se o laboratrio de microscopia eletrnica a diferentes reas, desde a vegetal humana. Nesta publicao apresentamos resultados de algumas das atividades realizadas pela equipe que atua com esta tecnologia que, com certeza, beneficia produtores, tcnicos, acadmicos e demais interessados no segmento. O objetivo do Documentos 93 Processamento de Amostras para Miscroscopia Eletrnica de Varregadura oportunizar a prtica de atividades direcionadas a esta rea, a partir da descrio dos procedimentos bsicos realizados neste centro de pesquisa.

Arione da Silva Pereira Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento

Sumrio

Processamento de amostras para microscopia eletrnica de varredura ............................................ Introduo ............................................................. Etapas gerais do processamento de amostras para microscopia eletrnica de varredura ..........................
Coleta, seleo e limpeza Estabilizao da forma

9 9

12

.......................................... 12

............................................. 12 ............................ 13 13 14 15

Desidratao e secagem das amostras Montagem e cobertura

............................................ ........................................ ................................

Conservao das amostras

Condies de observao no MEV

Processamento geral para amostras de tecidos Animais e Vegetais ................................................. 17 Processamento de fungos ........................................ 17 Processamento de bacterias .................................... 18

1. Infeco externa em tecido animal ou vegetal ............. 2. Infeco interna em tecido animal ou vegetal .............. 3. Inoculadas em meio de cultura

18 18

........................... 18

Procedimento para visualizao de estruturas de artrpodes e vermes ................................................ 19

a) Artrpodes .................................................. b) Vermes ......................................................

19 19

Processamento de amostras humanas ........................ 20 Processamento de materiais ..................................... 20 Visualizao de compostos orgnicos ........................ 20 Reconhecimento de artefatos.................................... 21 Resultados obtidos ................................................. 22

Referncias Bibliiogrficas ........................................ 36 Agradecimentos ...................................................... 37

Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Luis Antnio Suita de Castro

Introduo
O mundo microscpico mostra-se fascinante quando observado de perto. A perfeio das formas, a maneira como esto estruturadas e a riqueza de detalhes impressionam at mesmo quem convive intimamente com esta realidade. Graas aos microscpios, este panorama pode ser colocado ao alcance de nossos olhos. Sem ajuda, o olho humano tem um poder de resoluo de 1/10 milmetro, ou 100 micrmetros. Isto significa que, se algum olhar para duas linhas que esto separadas por menos de 100 micrmetros, elas parecero ser uma s linha. Do mesmo modo, dois pontos que distam menos de 100 micrmetros um do outro parecero um nico ponto mal definido. Para que se possam distinguir estruturas que estejam mais prximas que este valor, necessria a utilizao de microscpios (Figura 1). De acordo com Raven et al. (1996), os melhores microscpios pticos tm um poder de resoluo de 0,2 micrmetro, ou aproximadamente 200 nanmetros, e portanto, aumentam a resoluo do olho nu em 500 vezes. teoricamente impossvel a construo de um microscpio ptico capaz de melhor resoluo. O fator limitante o comprimento de onda da luz, que varia de 0,4 micrmetro para a luz violeta at 0,7 micrmetro para a luz vermelha. importante notar que o poder de resoluo e a ampliao so diferentes. Usando o melhor microscpio ptico, ao tirar uma fotografia de duas linhas que distam menos de 200 nanmetros, possvel aument-la indefinidamente. No entanto, estas linhas tero pouca definio. A utilizao de lentes mais potentes permite que se obtenha um maior aumento, o que no implica em uma melhor resoluo.

Documentos

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

A resoluo do microscpio eletrnico de varredura (Scanning Electron Microscope) de 10 nanmetros, constituindo-se em uma ferramenta bastante importante em atividades de pesquisas (Tabela 1). As aplicaes do microscpio eletrnico de varredura (MEV) incluem desde estudo de organismos inteiros, tecidos e rgos, at em certos casos, visualizao in situ de organelas subcelulares. O MEV usa eltrons que se dispersam ou so emitidos a partir da superfcie da amostra. O feixe de eltrons localizado dentro de uma pequena sonda que passa rapidamente para frente e para trs sobre a amostra. O rastreamento completo de cima abaixo geralmente leva apenas alguns segundos. As diferenas na superfcie da amostra afetam o padro com o qual os eltrons so dispersos a partir deste. Buracos ou fissuras aparecem escuros, as protuberncias e salincias aparecem claras, resultando em uma imagem tridimensional. Somente estruturas superficiais podem ser examinadas com o MEV. Consequentemente, este utilizado para estudar clulas inteiras, tecidos e superfcies de diversas estruturas. O microscpio eletrnico de varredura o mais verstil instrumento para avaliao, exame e anlise das caractersticas microestruturais de amostras biolgicas e no-biolgicas. O interesse maior obter informaes topogrficas. A grande vantagem deste instrumento a elevada profundidade de campo, da ordem de 10 m para aumentos de cerca de 10.000 X, chegando a 1 cm para aumentos de 20 X. Esta caracterstica possibilita obter imagens estereoscpicas e bem enfocadas com espcimes at macroscpicos. Alm disso, no MEV a amostra pode ser inclinada e rotacionada sob o feixe eletrnico em todas as orientaes, logo precisa estar bem preservada nas trs dimenses.

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MICROSCPIO PTICO

MICROSCPIO ELETRNICO DE VARREDURA

Imagem visualizada diretamente

Imagem visualizada em monitor de tv

Figura 1. Esquema comparativo entre um microscpio ptico e um microscpio eletrnico de varredura (adaptado de Raven et al., 1996).

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Tabela 1. Equivalncia das medidas usadas em microscopia.

1 1 1 1

Medidas usadas em microscopia centmetro (cm) =1/100 metro = 0,4 polegada milmetro (mm) =1/1.000 metro =1/10 cm micrmetro (m)* =1/1.000.000 metro =1/10.000 cm nanmetro (nm)** =1/1.000.000.000 metro =1/10.000.000 cm

9 1 metro = 102 cm = 103 mm = 106 m = 10 nm

* Micrmetros eram antigamente conhecidos como mcrons () * Nanmetros eram conhecidos como milimcrons (m)

Etapas gerais do processamento de amostras para microscopia eletrnica de varredura

Muitos mtodos de preparao de amostras tm sido descritos na literatura, apresentando bons resultados na visualizao de materiais biolgicos e no biolgicos (Kessel & Shih, 1976; Hayat, 1972; Dawes, 1971; Hall & Hawes, 1991; Dykstra, 1993). Devido condio natural hidratada, a amostra biolgica apresenta relativa complexidade de processamento; somente objetos rgidos como sementes, espculas, etc. podem ser observados no MEV com tratamento preliminar mnimo. Na sua grande maioria, o preparo das amostras inclui diversas etapas (Silveira, 1989). - Coleta, seleo e limpeza Como princpio bsico, a amostra deve ser representativa da situao a ser analisada, evitando-se causar modificaes que possam resultar na formao de avaliaes equivocadas. Basicamente, as amostras devem possuir a dimenso mnima necessria para o estudo, embora muitas vezes seja importante trabalhar com objetos grandes; quanto maior a dimenso, maiores sero as dificuldades encontradas para uma boa imagem. A manipulao dos espcimes com pina deve ser minimizada, preferindo-se um pincel fino para objetos secos e um conta-gotas para transferir peas em meio lquido. - Estabilizao da forma As amostras, geralmente, so estabilizadas por fixao qumica, visando tornlas, ao mesmo tempo, condutoras. Da mesma maneira que em outra estrutura, a fixao qumica inicial responde pela integridade da amostra, sendo que o processamento anterior apenas garante a manuteno desta forma.

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Na formulao do fixador, ajustam-se as condies ideais de concentrao, pH, molaridade, etc., de acordo com o material. O fixador geralmente aplicado temperatura ambiente, por imerso. O tempo de ao do fixador pode ser de algumas horas a vrios dias, quando o objetivo aumentar a rigidez do espcime. Vrios agentes qumicos de uso corrente em laboratrio apresentam propriedades irritantes ou txicas. Todas devem ser manipuladas com prudncia. Agentes carcinognicos, mutagnicos e teratognicos, so por definio, as substncias que induzem aberraes qumicas irreversveis no DNA cromossmico. Outros agentes so alergnicos e podem levar ao desenvolvimento de alergias devido exposio continuada, seja por contato ou inalao. Recomenda-se, portanto, o mximo cuidado na manipulao das substncias qumicas, bem como dos resduos decorrentes da experincias realizadas. O tetrxido de smio (OsO4) precisa ser manipulado com o mximo cuidado, por ser um composto extremamente txico e voltil. Sempre que possvel, deve ser utilizado em capela com boa ventilao. - Desidratao e secagem das amostras O espcime devidamente fixado por agentes qumicos que o tornam resistente desidratado com acetona ou etanol, posteriormente substitudos por gs carbnico liqefeito, na cmara do aparelho de ponto crtico. O CO2 lquido lentamente aquecido, e passa imperceptivelmente da fase lquida para a gasosa; a expanso deste gs dentro da cmara faz a presso subir, at acima da presso crtica do CO2 (73 atm). Mantendo-se a temperatura da cmara acima de 3l C (temperatura crtica do CO2 ) no h risco de liquefao do gs. Nesta transio de fase gradual, a densidade da fase lquida iguala aquela da fase gasosa. Portanto, a tenso superficial zero e o espcime seco sem a ultrapassagem de nenhum limite de fases, isto , sem o efeito das foras atuantes de tenso superficial. Aps a despressurizao lenta da cmara at presso atmosfrica, o espcime removido seco da cmara, sem alteraes sensveis de forma. - Montagem e cobertura O espcime para MEV precisa ser montado no suporte porta-amostras do microscpio ("stub"), considerando a melhor orientao em relao ao feixe de varredura e o coletor de eltrons secundrios. Conforme as dimenses do espcime, podem ser usados vrios tipos de adesivos, representados por colas condutoras de prata ou carbono coloidal; esmalte de unha em quantidade mnima e fitas adesivas tambm podem ser empregadas. As fitas, por serem isolantes, devem ser recortadas em dimenses reduzidas e bordejadas com um filete de prata coloidal para melhorar a condutividade.

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

O trabalho de montagem feito sob lupa estereoscpica, usando como instrumentos um estilete, palito ou uma pestana aderida a um suporte. Devese considerar que espcimes secos pelo mtodo do CPD so especialmente frgeis, necessitando de bastante delicadeza para montagem. A cobertura dos espcimes biolgicos visa torn-los bons condutores trmicos e eltricos. Tanto os espcimes, como as lamnulas de vidro ou as fitas adesivas usadas na montagem so isolantes eltricos e ficam carregados negativamente durante a varredura do feixe eletrnico. Nestas condies, podem desenvolver um potencial eltrico localizado que deflete a sonda, introduzindo astigmatismo e brilho excessivo em alguns pontos. Devido ainda irradiao do feixe, a amostra pode ficar aquecida e, se for sensvel, pode mover-se ou mesmo ser destruda durante a observao no MEV. A camada condutora geralmente ouro ou carbono, evaporados em vcuo. O ouro (ou ouro/paldio) so usualmente depositados pelo processo de "sputtering", embora possam tambm ser evaporados em alto vcuo. No sistema de "sputtering" o depsito do metal bastante eficiente, mesmo em objetos muito irregulares, pois os tomos atingem sua superfcie oriundos de todas as direes. Basicamente, no sistema de "sputtering", o metal arrancado de um eletrodo recoberto com ouro, pelo bombardeio energtico de ons positivos; o eletrodo de ouro ligado ao potencial negativo de uma fonte de tenso da ordem de 1 a 2 KV. Os ons positivos so produzidos pela ionizao do argnio, injetado na cmara de descarga. A espessura da camada de ouro deve ser suficientemente fina para no influir na resoluo da imagem, mas suficientemente espessa, para garantir uma boa produo de eltrons secundrios, que sero usados para formar a imagem. Para espcimes mais sensveis pode-se aplicar uma camada de carbono, evaporado em alto vcuo, antes da cobertura com ouro. - Conservao das amostras Amostras bem preparadas so altamente higroscpicas e devem ser fotografadas imediatamente no MEV. Elas podem ser conservadas por certo tempo em um dissecador contendo slica-gel, se necessrio. O maior risco desta conservao diz respeito instabilidade das fitas adesivas usadas na montagem, pois elas tendem a se retrair, rompendo a condutividade do filme de cobertura. Embora nova camada possa sempre ser aplicada neste caso, evidente que a espessura compromete a resoluo.

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- Condies de observao no MEV O estudo de materiais biolgicos envolve na grande maioria dos casos, informaes de topografia da superfcie, e para este tipo de imagem usam-se eltrons secundrios (baixa energia), provenientes da interao do feixe primrio com a camada de ouro que recobre o espcime. No estudo de materiais biolgicos, geralmente so usadas tenses aceleradoras de 5 a 10 KV, podendo variar at 25 KV. Para assegurar melhor imagem, o operador deve cuidar do alinhamento correto das lentes e do canho, do ajuste do foco, da compensao do astigmatismo, etc. O registro fotogrfico , em geral, feito em negativos que tm dimenso menor do que o visor onde a imagem formada; assim, a qualidade do filme usado e as condies do registro adequadas (brilho, velocidade da varredura, contraste) so tambm importantes. Convm lembrar ainda que, nos microscpios de varredura, existe, normalmente, a possibilidade bastante interessante para o bilogo, de manipulao dos sinais do vdeo. Este recurso permite modular a intensidade luminosa, gerando efeitos de contraste diferenciado, mesmo em espcimes pouco favorveis (onde se depara com efeitos de carga, por exemplo). Estes recursos podem ser explorados para fazer ressaltar detalhes da amostra e colher mais informaes a seu respeito.

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Figura 2. Esquema ilustrativo das principais etapas do processamento de amostras para microscopia eletrnica de varredura (Adaptao do original de Judy Murphy, 1982).

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Processamento geral para amostras de tecidos animais e vegetais

A utilizao do glutaraldeido como fixador para microscopia eletrnica pode ser recomendada para a maioria dos tecidos animais e vegetais, devido s suas propriedades de penetrao e por precipitar prontamente as substncias proticas da clula, assegurando tima preservao da ultraestrutura. Partculas soltas, secas como, por exemplo gros de plen desidratados e esporos, so de preparo simples: basta fazer uma seleo sob lupa e dispersar o material, com orientao aleatria sobre uma fita adesiva. Este procedimento permite que sejam efetuadas anlises em vrias orientaes do material. Alguns tecidos vegetais podem apresentar dificuldade de penetrao aos agentes qumicos, o que pode ser contornado fixando-os sob vcuo (Louro et al., 1987). Basicamente, o procedimento usual segue a ordem: fixao/desidratao/ secagem pelo mtodo do "ponto crtico" e envolve as seguintes etapas: - Fixao das amostras (1 a 5 mm3) durante 2 h at 24 h ou mais. - Lavagem em soluo tampo cacodilato ou fosfato, vrias vezes. - Ps-fixao em 1 ou 2% OsO4 tamponado, durante 1 h. - Lavagem novamente em soluo tampo. - Transferncia das amostras, lavadas, para cestas permeveis do aparelho de ponto crtico. - Desidratao em banhos duplos de lcool (ou acetona): 30, 50, 70, 80, 95% e 100% de concentrao. Vrias trocas so necessrias para assegurar remoo completa da gua. - Secagem das amostras no aparelho de ponto crtico, usando gs carbnico. Exemplos desse tipo de preparao so apresentadas nas figuras 3,4 e 5.

Processamento de fungos
O processamento de fungos fitopatognicos pode ser realizado de duas formas distintas, dependendo da estrutura a ser observada ao microscpio eletrnico. Estruturas frgeis, com alto grau de umidade devem ser previamente fixadas, desidratadas e metalizadas para posterior observao. Estruturas rgidas, geralmente relacionadas ao processo de propagao, como por exemplo esporos de ferrugem, podem ser secos em estufas, montados sobre porta amostras, metalizados e observados. Neste caso, geralmente so coletadas pores de ramos, folhas ou frutos que apresentem leses ocasionadas pelo fungo. Exemplos desse tipo de preparao so apresentadas nas figuras 6 e 7.

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Processamento de Bactrias
A preparao de bactrias envolve tcnicas distintas, dependendo do substrato em que se encontram: 1. Infeco externa em tecido animal ou vegetal Tecidos animais ou vegetais, que apresentem infeco externa por bactrias, so geralmente preparados, como para observao de qualquer estrutura externa. Normalmente as bactrias esto aderidas s estruturas dos tecidos e, permanecem fixadas a eles, aps todo o processo de preparao da amostra. (Figura 8A). 2. Infeco interna em tecido animal ou vegetal Neste caso, utiliza-se a tcnica denominada Criofratura. Inicialmente, a amostra colocada no fixador apropriado, conforme a origem do tecido (animal ou vegetal). Aps os banhos e lcool ou acetona a 100%, as amostras so colocadas no interior de pequenos tubos de "Parafilm" confeccionados anteriormente. Aps vedao das extremidades, faz-se sua transferncia para o interior de uma cuba de isopor contendo nitrognio lquido. As amostras, depois de congeladas, so quebradas (fraturadas) atravs de golpes de uma navalha sobre uma superfcie de metal, tambm congelada com nitrognio lquido. Todos os fragmentos so recolhidos, novamente, para um frasco contendo acetona ou lcool absoluto, onde os fragmentos maiores de Parafilm so separados e retirados. As peas so levadas ao ponto crtico para desidratao e, posteriormente, montadas no porta amostra, para metalizao. A distribuio dos fragmentos de tamanho muito pequeno, durante a montagem, pode ser aleatria, pois qualquer posio do fragmento da amostra, tem possiblilidade de conter o material que desejamos analisar. Resultados desse tipo de preparao so apresentados nas figuras 8B e 8C. 3. Inoculadas em meio de cultura Quando as bactrias so isoladas em meio de cultura h a possibilidade de retirar pequenos fragmentos do meio contendo colnias. Estes fragmentos geralmente so cortados com aproximadamente 1mm2 e o mnimo de espessura possvel (0,5 mm). Deve-se procurar locais onde existam boas concentraes de bactrias, pois durante o processo de preparao podem ocorrer perdas considerveis desses microorganismos. As amostras coletadas so colocadas

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diretamente na soluo fixadora, recebem os banhos de lcool ou acetona necessrios. So submetidas ao ponto crtico e montadas sobre os portaamostras. Durante o processamento, ocorre leve curvatura do meio de cultura, o qual deve ser considerado durante o processo de montagem. Geralmente, no lado convexo da amostra encontram-se as bactrias e, portanto, esta face deve permanecer voltada para cima. As demais etapas devem seguir o procedimento padro.

Procedimento para visualizao de estruturas de artrpodes e vermes

a) Artrpodes: Pequenos insetos devem ser inicialmente narcotizados para preservar a forma distendida. Normalmente no exigem preparaes mais sofisticadas. Secagem em estufa a 37C, fixao ao porta-amostra utilizando tinta prata para melhorar a condutividade e metalizao so os procedimentos necessrios em observaes rotineiras. A Figura 9 mostra o resultado final da preparao. Insetos que apresentam estruturas delicadas ou larvas, passveis de deformaes por secagem direta, necessitam ser desidratados pelo mtodo do ponto crtico aps o processo de fixao convencional. Organismos mais resistentes, podem ser limpos no estgio de desidratao (100% etanol), usando um banho de ultra-som. Para assegurar boa penetrao do fixador, acrescenta-se 1 a 2 gotas de triton X-100 ao fixador. b) Vermes: Nematides devem ser inicialmente limpos de partculas indesejveis, fazendoos passar, ainda vivos, atravs de papel filtro, imerso em gua. So fixados, desidratados com lcool ou acetona e submetidos ao ponto crtico em pequenas "gaiolas" confeccionadas com tela de plncton ou em cpsulas de porcelana porosa, apropriadas para desidratao de estruturas muito pequenas. Durante o processo de montagem no "stub", devem seguir a orientao de um fio de cabelo, previamente aderido ao porta-amostra, sendo colocados um a um, com o auxlio de uma lupa, orientados de forma que a poro a ser visualizada fique apoiada sobre o fio de cabelo. A visualizao apresentada na Figura 10.

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Processamento de amostras humanas

a) O processamento inicial do material depende da observao a ser feita. Fragmentos de tecidos e organismos maiores, geralmente precisam de uma limpeza prvia a fim de remover detritos, sangue ou muco. A limpeza deve ser feita antes da fixao, usando soluo de Ringer; sacarose a 0,2 M; EDTA a 1%; carbonato de clcio 1% ou 0,1% hipoclorito de sdio. Em casos onde a limpeza preliminar pode afetar a estrutura a observar, esta deve ser evitada. Podem ser retirados fragmentos de menor tamanho e em maior quantidade, aumentando-se as chances de obter resultados satisfatrios. O procedimento rotineiro segue as etapas normais do processo padro de preparao de tecidos animais. A Figura 11 mostra o resultado final da preparao. b) Estruturas rgidas como dentes e cabelos so processados sem muita preparao prvia, geralmente podem ser aderidos ao porta-amostra, metalizados e observados. Um cuidado especial a ser observado em relao a amostras com tamanho relativamente grande, refere-se condutibilidade eltrica. O uso de fitas adesivas pode provocar o isolamento do material. Nestes casos essencial contornar a amostra com prata condutora, antes do processo de metalizao com ouro. O resultado desse tipo de preparao apresentado na figura 12.

Processamento de materiais
O processamento de materiais, ou seja, amostras no-biolgicas, relativamente fcil pois dispensa preparaes prvias. Neste caso, no so utilizadas solues fixadoras nem realizado a eliminao de lguido atravs do aparelho de ponto crtico. O requisito obrigatrio constitui-se na necessidade de que a amostra coletada seja o mais representativo das condies estveis do material a ser examinado. Devem ser evitados desgastes por atrito, contaminaes por lquidos e poeiras. Aps a coleta da amostra, esta deve ser fixada ao porta-amostra atravs de fita adesiva apropriada, posteriormente realizado o processo de metalizao. Alguns exemplos desse tipo de preparao so apresentados nas figuras 13 e 14.

Vizualizao de compostos orgnicos

Na maioria das plantas os acares acumulados so armazenados na forma de amido. Devido sua tendncia em formar hlices, as molculas de amido tendem a aglomerar-se em gros. Atravs de microscopia eletrnica de varredura as estruturas arredondadas que correspondem aos gros de amido, organizados em amiloplastos, podem ser visualizados. O processo bsico consiste em colocar o material a ser observado em fixador contendo

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glutaraldeido e cacodilato de sdio, ps-fixando em soluo tamponada de smio. Durante a desidratao (etanol 100%) faz-se a criofratura utilizando nitrognio lquido. Na observao, no interior das clulas quebradas, podem ser visualizados aglomerados que correspondem aos gros de amido. Ceras que revestem frutos tambm podem ser visualizadas, utilizando equipamentos apropriados que promovem a preparao da amostra em temperaturas extremamente baixas, devido facilidade com que estes compostos so removidos durante o processamento. Um mtodo alternativo pode ser utilizado, cortando-se seces finas da casca do fruto com posterior secagem em dessecador contendo slica gel. Aps montada no porta-amostra e metalizada, a amostra pode ser observada. Alguns exemplos dessa visualizao so mostrados nas figuras 15 e 16.

Reconhecimento de artefatos
A preparao incorreta da amostra pode ocasionar modificaes considerveis no material em estudo, resultando em diagnsticos totalmente equivocados ou imprecisos. O primeiro fator a considerar no trabalho que est sendo realizado o adequado levantamento bibliogrfico sobre o assunto em estudo. Considerar atividades realizadas anteriormente, resultados obtidos, dificuldades encontradas. Regulagens incorretas de equipamentos podem ocasionar deformaes nas estruturas a observar. Amostras coletadas em condies adversas, mal acondicionadas, submetidas a variaes de umidade e temperatura, podem apresentar variaes no condizentes com a realidade. Descries detalhadas envolvendo o estudo de artefatos em amostras biolgicas so apresentadas por Crang & Klomparens, 1988. Entretanto, como norma geral, amostras que podem sofrer variaes, devem ser coletadas e colocadas na soluo fixadora apropriada o mais rapidamente possvel, visando paralisar os processos metablicos que esto se desenvolvendo e que podero interferir na anlise do resultado final. Devem ser preparadas com o mximo de rigor tcnico e apresentar reprodutividade de resultados.

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Resultados obtidos Processamento geral para amostras de tecidos animais e vegetais

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

Figura 3. Micrografia eletrnica de eritrcitos (glbulos vermelhos) no interior de um tecido animal (25.000 X).

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Figura 4. Visualizao de tricoma em spalas de pessegueiro (1.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Figura 5. Visualizao de estmatos em folhas de pessegueiro (1.900 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Fungos

Figura 6. Leses ocasionadas pela infeco do fungo Tranzchelia discolor (Funckel) Tranz & Livt, em folhas de pessegueiro (5.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Figura 7. Desenvolvimento do fungo Colletotricum lindemunthianum em plantas de feijoeiro (700 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Bactrias

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

Figura 8. Diferentes tipos de processamento para visualizao de bactrias: (A) infeco externa em tecido animal (14.000 X), (B) inoculao em meio de cultura (5.000 X), (C) infeco externa em tecido humano(5.000 X), (D) infeco interna em tecido vegetal -criofratura (3.000 X).

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Procedimento para visualizao de estruturas de artrpodes e vermes

Figura 9. Extremidade do membro locomotor de um inseto (Ochetina spp.) (200 X)

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Figura 10. Poro anterior de um nematide infectado por esporos da bactria Pasteuria penetrans (3.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Processamento de amostras humanas

Figura 11. Visualizao da superfcie da pele humana (125 X) (notar os pequenos orifcios correspondentes aos poros).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Figura 12. Visualizao de um fio de cabelo, permitindo a observao das escamas estruturais (1.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

Processamento de materiais

Figura 13. Visualizao de uma partcula de cinza de carvo mineral (470 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Figura 14. Extremidade (ponta) de uma agulha de costura confeccionada em ao (1.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Visualizao de compostos orgnicos

Figura 15. Presena de gros de amido (estruturas arredondadas) no interior de clulas vegetais de armazenamento (540 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

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Figura 16. Visualizao da camada de cera que recobre a epiderme de mas, cultivar Fuji (3.000 X).

Foto: Luis Antnio Suita de Castro

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Processamento de Amostras para Microscopia Eletrnica de Varredura

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Agradecimentos

O autor agradece a colaborao e a dedicao dos funcionrios Valter Lopes Abrantes e Nara Eliane Moreira Rocha na realizao desse trabalho.