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Quim. Nova, Vol. 25, No. 3, 420-428, 2002.

MTODOS DE EXTRAO E DETERMINAO DO HERBICIDA GLIFOSATO: BREVE REVISO

Reviso

Ozelito Possidnio de Amarante Jnior* e Teresa Cristina Rodrigues dos Santos Departamento de Tecnologia Qumica, Universidade Federal do Maranho, Av. dos Portugueses, s/n, 65080-040 So Lus - MA Natilene Mesquita Brito e Maria Lcia Ribeiro Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, Rua Prof. Francisco Degni, s/n, 14800-900 Araraquara - SP Recebido em 24/4/01; aceito em 24/9/01

METHODS OF EXTRACTION AND DETERMINATION OF THE HERBICIDE GLYPHOSATE: COMPACT REVISION. This paper supplies a compact revision about the main extraction, clean-up and pre-concentration methods of the herbicide glyphosate for water and soil samples, as well as methods for its determination and quantification. Keywords: glyphosate; extraction; determination.

INTRODUO O desenvolvimento acelerado da agricultura tem levado ao aumento da necessidade do uso de pesticidas. Nos ltimos anos, vrias alternativas foram criadas no sentido de reduzir esta necessidade. Entretanto, algumas mudanas, tais como o advento de alimentos transgnicos, resistentes a algumas pragas, no resultaram na diminuio do uso de herbicidas, uma vez que no impedem o desenvolvimento de ervas daninhas no campo. Dentre os vrios tipos de herbicidas, destacam-se aqueles de amplo espectro de ao, como o caso dos no-seletivos. O glifosato [N-(fosfonometil)glicina] classificado como herbicida no-seletivo, sistmico e ps-emergente, citado como o mais vendido em todo o mundo, em diferentes formulaes, produzidas por distintas companhias de pesticidas1, 2. As estruturas do glifosato e de seu principal produto de degradao, o cido aminometilfosfnico (AMPA), so apresentadas na Figura 1.

principais mtodos para extrao e anlise do glifosato encontrados na literatura bem como para seu produto de degradao. MTODOS DE EXTRAO E PR-CONCENTRAO Os mtodos de extrao de glifosato e AMPA em amostras de solo e gua so apresentados na Tabela 1. Extrao em amostras de solo Devido elevada polaridade do glifosato e sua tendncia em formar espcies inicas, a maioria dos procedimentos de extrao do herbicida se baseiam em reaes cido-base, onde o composto, inicialmente ligado a espcies inicas do solo atravs do grupo fosfato, passa, ento, a interagir com os ons da soluo2. Dessa forma, nos processos de extrao so utilizadas, basicamente, solues de bases fortes (por exemplo, KOH, NaOH), sais de bases fortes (como KH2PO4), bases fracas (tais como trietilamina, NH4OH) ou cidos fracos, seguindo-se, na maioria das vezes, de etapas de reteno/ eluio em resinas de troca inica. A eficincia no processo de extrao do glifosato e AMPA est diretamente relacionada com o tipo de solo. Em geral, melhores recuperaes so observadas para solos orgnicos, enquanto que para solos argilosos e minerais, devido elevada competitividade pelos stios inicos do solo, a eficincia no processo de extrao fica relativamente comprometida, resultando em menores recuperaes3. Vrios procedimentos4 de extrao para glifosato em amostras de solo foram testados, acompanhando a recuperao para solos tratados com substncias radiomarcadas em intervalos de 14 dias (glifosato,14C). Dos procedimentos testados, trs apresentaram recuperaes superiores a 73%: (i) extrao com soluo de NaOH 0,1 mol L-1; (ii) com soluo de H3PO4 0,35 mol L-1 e (iii) com soluo de NH4OH 0,5 mol L-1. Em outro estudo5, foi feita extrao com soluo de KOH 0,6 mol L-1, resultando em recuperaes entre 88-109% e 73-103% para glifosato e AMPA, respectivamente. Aps a extrao alcalina, o sobrenadante foi levado a pH entre 5,0 e 8,0 com soluo de HCl. Friestad e Broenstad6 utilizaram, igualmente, soluo de KOH, realizando duas etapas de extrao, seguidas de purificao com resina de troca aninica na forma OH-. A eluio foi feita com HCl 1 mol L-1 e as recuperaes obtidas foram superiores a 60%. Esta extrao pode ser feita, ainda, com mistura de NH4OH 0,25 mol L-1 e KH2PO4 0,1

Figura 1. Estruturas dos compostos

Tamanho sucesso nas vendas do glifosato se deve elevada eficincia na eliminao de ervas daninhas, com a vantagem adicional de ser de baixa toxicidade aos que o manipulam, comunidade e ao ambiente. Apesar do herbicida ser citado como pouco txico, h evidncias de efeitos deletrios em seres humanos devido toxicidade ambiental, causando danos indiretos e tambm levando resistncia de algumas espcies de ervas que se adaptam aps o uso prolongado do herbicida1. Em funo da ampla utilizao do glifosato em todo o mundo, o desenvolvimento de mtodos de extrao e anlise que permitam a deteco e quantificao do herbicida em amostras naturais so de suma importncia. O objetivo deste trabalho , portanto, discutir os

*e-mail: ozelito@terra.com.br

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Mtodos de Extrao e Determinao do Herbicida Glifosato: Breve Reviso

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Tabela 1. Extrao de glifosato e AMPA em amostras de gua e solo Amostra Solo Extrao NH4OH 0, 5 mol L
-1

Purificao Resina de troca aninica seguida de resina de troca catinica

Recuperao 79% (glifosato) 68,5% (AMPA) 73% (glifosato)

Ref. 3 4

NaOH 0,1 mol L-1 H3PO4 0,35 mol L-1 NH4OH 0,5 mol L-1 KOH 0,6 mol L-1 (neutralizando o sobrenadante com HCl) KOH 1 mol L-1 NH4OH 0,25 mol L KH2PO4 0,1 mol L-1
-1

88-109% (glifosato) 73-103% (AMPA) Resina de troca aninica (OH-) Resina de troca catinica (H ) Resina de troca aninica (Cl-) seguida de troca catinica (H+) Resina Dowex 1-X8
+

5 6 7 8 9 10

> 60% (glifosato e AMPA) 90-100% (glifosato) 89-103% (AMPA) 88-104% (glifosato)

Trietilamina 0,1 mol L-1 Trietilamina 0,1 mol L-1 KOH 0,2 mol L KH2PO4 0,1 mol L-1 FMOC-Cl 0,01 mol L-1 gua Triclorometano (extrao dos interferentes e descarte da fase orgnica) Diclorometano (extrao de interferentes) Diclorometano (extrao de interferentes) Hipoclorito de aminas em hexano, seguido de extrao em NaOH Extrao em Fase Slida (EFS) EFS Diclorometano/2-propanol (aps derivao, purificao e acidificao) EFS (aps derivao) EFS EFS
-1

Resina de troca catinica (Fe3+) seguida de troca aninica (Cl-) Resina de troca aninica (AG 1-X8) Resina de troca aninica (OH-)

80,9% (glifosato) 79,2% (AMPA) 98,3% (glifosato) 86,3% (AMPA) ~85% (glifosato)

12

13 14 15

Resina de troca catinica (Fe3+) seguida de troca aninica (Cl-) Resina de troca aninica (OH-)

> 95% (glifosato) 67-81% (glifosato)

16 6 17

> 94%(glifosato e AMPA) Resinas de troca catinica e aninica Resina de troca aninica 67-100%(glifosato)

18 21 22

mol L-1, seguida de uma etapa de purificao com coluna contendo resina catinica na forma H+. Foram obtidas recuperaes entre 90100% para o herbicida e 89-103% para seu metablito7. Thompson e colaboradores3 realizaram extrao com NH4OH 0,5 mol L-1, seguida de purificao em duas etapas: a primeira utilizando resina de troca aninica, eluda com NH4HCO3 1 mol L-1, em que o bicarbonato foi removido por repetidas evapora es e redissolues com gua deionizada; a segunda etapa, efetuada em coluna com resina de troca catinica, eluda com gua, depois de evaporada e redissolvida em soluo de KH2PO4 com 4% de metanol (pH 1,9). Foram obtidas recuperaes em torno de 79 e 68,5% para glifosato e AMPA, respectivamente, para solos orgnicos, enquanto que em solos minerais obtiveram-se recuperaes de 73 e 57% para estes compostos. Glifosato foi tambm extrado de quatro tipos distintos de solos, utilizando soluo de trietilamina 0,1 mol L-1, seguida de purifica-

o com resina de troca aninica, na forma Cl-, e resina catinica, na forma H+. Observou-se recuperaes entre 88 e 104% para extraes realizadas logo aps a fortificao do solo8. No entanto, para extraes feitas 13 h aps a fortificao com o herbicida, considervel decrscimo nas recuperaes foi observado. Deste estudo, pode-se concluir que a trietilamina eficiente para a extrao do herbicida solvel ou fracamente ligado, no sendo eficaz quando o glifosato est fortemente adsorvido pelos constituintes do solo. Em outro estudo utilizando trietilamina9, foi realizada etapa de purificao com resina Dowex 1-X8 (50 a 100 mesh) e eluio com soluo de HCl 0,1 mol L-1, obtendo-se resultados similares. Miles e Moye10 apresentaram diferentes formas de extrao do herbicida, de acordo com a caracterstica do solo. Para solos argilosos e com altos teores de matria orgnica, foi utilizada soluo de KOH 0,2 mol L-1 (extraes por 15 min). Para solos com baixos teores de argila e matria orgnica, foi usada uma soluo de KH2PO4

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0,1 mol L -1. Ambos os m todos de extra o s o seguidos de centrifugao, filtrao, derivao com cloroformato de 9-fluorenilmetoxicarbonil (FMOC-Cl) 0,01 mol L-1 em acetona, em meio tamponado com borato (pH 9) e extrao com acetato de etila ou ter. Extrao em amostras de gua Extraes de glifosato e seu principal metablito em amostras de gua so feitas, em geral, utilizando-se resinas de troca inica ou, ainda, com prvia derivao e transformao em compostos apolares que podem ser, em funo do agente derivatizante, mais facilmente extrados. Em alguns estudos, em amostras de guas filtradas, feito apenas o ajuste de pH, seguido de evaporao. Milles e colaboradores11 trabalharam com amostras de gua filtradas em papel Whatman n 1 (qualitativo), com adio de tampo fosfato (KH2PO4 0,1 mol L-1), em seguida concentrando as amostras diretamente em evaporador rotatrio e procedendo nova filtrao em filtro 0,2 mm. Foram obtidas recuperaes entre 80 e 100%, para AMPA, e 76 a 111%, para glifosato. Uma prtica comum efetuar a prvia extrao dos possveis interferentes, extraindo com solventes orgnicos. Cowell e colaboradores12 utilizaram extrao com triclorometano, purificando a fase aquosa em resina, na forma Fe3+. A eluio foi feita com HCl 6 mol L-1, seguida de tratamento com resina de troca aninica, eluio com HCl, evaporao at secura, retomando em gua. Foram obtidas recuperaes de 80,9% para glifosato e 79,2% para AMPA. Wigfield e Lanouette13 utilizaram partio, usando diclorometano, eliminando os compostos orgnicos de baixa polaridade pelo descarte da fase orgnica. A fase aquosa, contendo glifosato e AMPA, foi tratada com resina de troca aninica AG 1-X8, eluda com citrato de potssio. Efetuada uma segunda extrao em diclorometano, e descartando-se a fase orgnica, foi possvel obter recuperaes de 98,3% para glifosato e 86,3% para AMPA. No entanto, Abdullah e colaboradores14, realizando procedimento semelhante, obtiveram recuperaes em torno de 85%. No caso, a fase aquosa, aps extrao dos interferentes apolares com diclorometano, foi purificada por passagem atravs de cartucho contendo 2 mL de resina, na forma OH-, lavagem com gua e eluio com tampo citrato, pH 5. Mistura de hexano e benzeno (2:3), na presena de soluo de MgCl2 1 mol L-1 foi usada na extrao e anlise de dichlorvos, inseticida organofosforado, sendo aproveitada a fase aquosa para a determinao de glifosato, extrado com mistura de hipoclorito de aminas primrias de cadeia normal, com 10 a 12 carbonos (0,1 mol L-1) em hexano15. Neste procedimento, uma nova etapa de extrao foi realizada com NaOH 1 mol L-1, a fase aquosa sendo evaporada at secura, em presena de perxido de hidrognio a 30%, e redissolvida em gua. Outros procedimentos de extrao16 so baseados apenas na purificao com resina de troca inica, sendo a amostra filtrada e tratada com resina de troca catinica, na forma Fe3+, lavada com gua e HCl 6 mol L-1, eluda com esta mesma soluo cida. O uso de resina catinica dispensa a acidificao da amostra devido s propriedades zwiterinicas do glifosato, que o mantm na forma catinica mesmo em pH de guas naturais. O eluato, tratado com resina de troca aninica, na forma Cl-, lavada em pequeno volume de HCl 6 mol L-1, foi eludo com a mesma soluo cida. Aps evaporao at secura, o resduo foi redissolvido em gua. Recuperaes superiores a 95% foram obtidas. Tratamento mais simples foi dado por Friestad e Broenstad6, que utilizaram apenas uma etapa de purificao em coluna de troca aninica, na forma OH-, lavada com KOH e gua, e eluda com HCl 1 mol L-1. O eluato foi tratado com carvo ativado, obtendo recuperaes de 67 a 81%.

Entre os mtodos que fazem prvia derivao do glifosato, citase o de Gauch e colaboradores17 no qual foi utilizada gua potvel com tampo borato 0,5 mol L-1, derivando com FMOC-Cl em acetona e temperatura ambiente, purificando os derivados com extrao dos interferentes em diclorometano/2-propanol (3:1). A fase aquosa foi acidificada com cido sulfrico, e nova extrao com solventes orgnicos foi realizada, descartando a fase aquosa. A soluo orgnica contendo o derivado do glifosato foi seca por passagem em coluna de sulfato de sdio anidro, tendo seu pH corrigido com soluo de amnia 25%, evaporao a 60 C, lavagem do resduo com diclorometano e redissoluo em soluo aquosa de metanol 50%. Vreeken e colaboradores18, utilizando o mesmo procedimento de derivao prvia com FMOC-Cl, em meio tamponado com tampo borato, a 37 C, acrescentaram uma etapa automatizada de extrao em fase slida (EFS), usando adsorvente polimrico (PLRP-S). Recuperaes obtidas para glifosato e AMPA foram superiores a 94%. Avramov e Vasileu19 evaporaram amostras de gua at a secura, em atmosfera de N2 a 70 C, dissolvendo o resduo em gua e filtrando a soluo resultante. Em seguida, glifosato foi derivado com cloreto de dansila na presena de NaHCO3 e acetona. A derivao foi feita sob abrigo de luz e temperatura ambiente. Oppenhuizen e Cowell20 filtraram amostras de gua em fibra de vidro (1 mm), evaporaram at a secura e redissolveram em soluo de tampo fosfato 0,005 mol L-1 (pH 2,1) e EDTA 0,03 mol L-1. A mistura foi posteriormente filtrada em membrana 0,45 mm e diretamente analisada por cromatografia lquida com derivao em ps-coluna, resultando em recuperaes superiores a 82%. Procedimentos associando o tratamento com resinas de troca inica e a derivao tambm tm sido desenvolvidos. Brjesson e Torstensson21, trataram amostras de gua acidificadas com resina catinica e, em seguida, resina aninica, efetuando derivao com cido trifluoroactico anidro (TFAA) e trifluoroetanol (TFE), retomando com acetato de etila, para posterior anlise por cromatografia gasosa. Sem e Baddoo22, procederam a anlise com gua desaerada em banho de ultra-som, ajustando para pH 10 com soluo de NaOH. A amostra filtrada foi passada em resina de troca aninica e eluda com cido sulfrico 2 mol L-1, em seguida, feita a derivao utilizando iodeto de potssio, cido sulfmico e cido actico. Recuperaes entre 67-100% foram obtidas. MTODOS DE ANLISE A molcula do glifosato apresenta elevada polaridade e ausncia de cromforo. Por estes motivos, a determinao do glifosato por cromatografia necessita de adaptaes que permitam sua deteco. Tais adaptaes incluem, basicamente, reaes de derivao ou, ainda, alterao de alguma propriedade fsica que possa ser relacionada quantidade de glifosato na amostra. Embora em algumas anlises as alteraes da estrutura da molcula do herbicida sejam feitas ainda durante as etapas de extrao, na maioria das vezes, os procedimentos de derivao so feitos durante a anlise propriamente dita, em etapas que antecedem a separao cromatogrfica ou em reao ps-coluna. Anlise por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) A alta polaridade da molcula do glifosato e do seu metablito tem levado ao desenvolvimento de muitos mtodos de anlise baseados em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), de modo que a maioria das investigaes relatadas na literatura para este herbicida se referem a esta tcnica analtica. A dificuldade desta anlise se refere forma de deteco dos compostos, visto que ambos

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no possuem grupos cromforos que possam ser detectados diretamente por detectores colorimtricos ou de UV, acima de 200 nm. Faz-se necessrio, portanto, o uso de reaes de derivao, geralmente em ps-coluna, a fim de se obter um derivado que responda a estes detectores. Pode-se tambm, aps derivao, utilizar detectores de fluorescncia23. A Tabela 2 apresenta os mtodos de determinao do Glifosato e seu produto de degradao por CLAE. Determinao por cromatografia lquida usando deteco por UV Em 1983, Burns24 publicou trabalho de determinao de glifosato por cromatografia lquida e deteco direta por UV, realizando um estudo colaborativo, no qual 20 laboratrios analisaram trs pares de amostras combinadas, contendo alto teor do herbicida (41 a 96%). As amostras foram dissolvidas na fase mvel, tampo fosfato pH 1,9, contendo 4% de metanol, em um fluxo de 2,3 mL/min. Foi utilizada uma coluna de Partisil-10 SAX. A deteco foi realizada em 195 nm, com coeficientes de variao de 0,88 a 1,7%. Morlier e Tomkins25, utilizando o mesmo mtodo em formulados do herbicida, obtiveram resultados similares. No entanto, segundo Morovjan e colaboradores26, possvel obter limites de deteco de 10 mg/L utilizando coluna Dionex PAX-500 e fase mvel de tampo fosfato pH 3,15 e acetonitrila. A sensibilidade do mtodo pode ainda ser melhorada com uma etapa de derivao, obtendo-se um derivado que absorva em comprimento de onda maior. Powell e colaboradores27 derivaram o herbicida com metanol/fenil-isotiocianato/trietilamina/gua (7:1:1:1), utilizando para a separao cromatogrfica uma coluna recheada com material de C18 (4 mm) e eluindo com gradiente de acetonitrila em tampo acetato de sdio (pH 6,45) e acetonitrila/gua/metanol. O comprimento de onda usado na deteco foi 254 nm, resultando em adequada linearidade entre 0,05 e 10 nmol do herbicida. As recuperaes obtidas foram superiores a 77%. Huber e Calabrese28 derivaram o glifosato presente em amostras aquosas com FMOC-Cl, extraindo os derivados com acetato de etila, evaporando at a secura e, em seguida, retomando com trietoximetano, sob aquecimento. A anlise cromatogrfica foi feita em coluna recheada com C18 (5 mm) e a eluio com cido trifluoroactico. A deteco foi realizada em comprimento de onda de 264 nm. Determinao por cromatografia lquida com deteco colorimtrica Para determinao colorimtrica necessria a derivao obtendo-se, assim, compostos coloridos. Uma alternativa deriv-lo com 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno na presena de etanol e NaBH4. Os derivados so extrados com acetato de etila, evaporados at secura, dissolvidos em gua e depois separados em cartucho C18. Neste caso, a eluio foi feita com mistura de brometo de tetraetilamnio 0,02 mol L-1 e tampo fosfato de sdio pH 3,2. A deteco foi realizada em 405 nm, obtendo-se limite de deteco de 0,05 mg/g29. Thompson e colaboradores3 procederam a derivao em ps-coluna com ninhidrina, a 100 C e deteco em 570 nm. Os limites de deteco obtidos foram em torno de 0,03 mg/g para glifosato e 0,01 mg/g para AMPA. No entanto, melhor sensibilidade para glifosato poderia, ainda, ser obtida se fosse utilizada temperatura mais elevada durante a reao em ps-coluna. A separao cromatogrfica foi feita em coluna catinica, a 50 C, eluindo com tampo fosfato em pH 1,9, contendo 4% de metanol. Observou-se, no entanto, que as recuperaes obtidas no mtodo de derivao com ninhidrina variavam de acordo com o tipo de solo em estudo. Contrariamente ao citado na literatura, em solos orgnicos, geralmente, as recuperaes para glifosato foram superio-

res s obtidas em solos minerais. Concentraes de glifosato e AMPA entre 0,5-30 ng/mL e 0,125-7,5 ng/L puderam ser determinadas. Determinao por cromatografia lquida com detector de fluorescncia Certamente a determinao por fluorescncia o mtodo de deteco mais aplicado na anlise cromatogrfica de glifosato devido maior sensibilidade e seletividade deste tipo de deteco, se comparada com a deteco por absoro no UV-VIS. Desta forma, glifosato e seu produto de degradao podem ser devidamente transformados em compostos fluorescentes atravs de reaes de derivao especficas. Dentre os reagentes mais utilizados esto o oftalaldedo (OPA), o FMOC-Cl e o cloreto de p-toluenosulfonila. A derivao com OPA bastante citada na literatura. Neste caso, glifosato previamente oxidado a glicina, em meio alcalino e em temperaturas superiores a 40C. Para formao de um composto fluorescente mais est vel, a rea o feita em presen a de mercaptoetanol4. Tuinstra e Kienhuis30 utilizaram reao em ps-coluna, oxidando o glifosato com hipoclorito em pH 9,1, reagindo, em seguida, com OPA e 2-mercaptoetanol em metanol (pH 9,2). A separao cromatogr fica de glifosato e AMPA foi realizada em coluna Ionosphere A, eludos com KH2PO4 em pH 2,1, sendo medidos em 400 nm, com excitao em 360 nm. Recuperaes em torno de 80% foram obtidas. Em outro estudo12 a coluna cromatogrfica foi substituda por coluna catinica, operada a 50 C, eluda com KH2PO4 (pH 1, 9) em metanol, usando as mesmas reaes em ps-coluna, porm utilizando excitao em 340 nm e emisso em 455 nm. Recuperaes similares s anteriormente citadas foram obtidas para glifosato e AMPA, com limite de deteco de 0,05 a 5 mg/g. Abdullah e colaboradores14 obtiveram recuperaes pouco superiores (85%) substituindo a coluna por uma de fase reversa, eluindo com tampo KH2PO4 em pH 2,1. A deteco foi realizada nos mesmos comprimentos de onda j citados. Reupert e Fuchs31 obtiveram recuperaes superiores a 95% por substituio da coluna por uma especfica para glifosato, baseada em troca catinica, na forma de K+, operada a 55 C, e tambm eluda com tampo fosfato (pH 2,05). A oxidao prvia foi feita com hipoclorito de sdio em pH 11,9 em temperatura de 40 C e a derivao ocorreu com OPA e NN-dimetil-2-mercaptoetilamina em pH 10,6 e temperatura ambiente. O limite de deteco citado foi de 0,5 mg/L, com excitao em 340 nm e medida de fluorescncia em 440 nm. Outra derivao19 pode ser feita com cloreto de dansila em reao por 4 h, sob abrigo da luz e temperatura ambiente, utilizando tampo carbonato 0,05 mol L-1. A determinao, feita com lexc = 340 nm e lem = 550 nm, apresentou limites de deteco de 20 ng para glifosato e 2 ng para AMPA. O mtodo apresentou boa linearidade entre 0,2 e 1 mg e entre 0,02 e 0,5 mg para o herbicida e seu produto de degradao, respectivamente. A etapa de derivao do glifosato pode ser efetuada de forma direta em amostras de solo com FMOC-Cl em acetona por 20 min10. Os derivados obtidos foram posteriormente extrados em acetato de etila ou ter, realizando separao cromatogrfica em coluna de NH2 e eluindo com tampo KH2PO4 (pH 6) e acetonitrila. A deteco foi realizada com lexc = 270 nm e lem = 315 nm. Ainda utilizando FMOCCl como reagente de derivao, procedendo a reao por 30 min, Sancho e colaboradores5 testaram trs separaes cromatogrficas. A primeira foi realizada com coluna C18, eluindo com acetonitrila/ tampo fosfato pH 6,3; a segunda foi feita em coluna de menor comprimento, porm com mesmo material, eluindo com acetonitrila/tampo fosfato pH 5,7 e a terceira separao foi feita com coluna NH2, eluda com acetonitrila/tampo fosfato pH 5,7. A deteco foi reali-

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Tabela 2. Determinao de glifosato e AMPA por CLAE Amostra Formulados Derivao Coluna e eluio FM: tampo fosfato (pH 1,9) Coluna: Partisil-10 SAX FM: tampo fosfato (pH 1,9) Coluna: Partisil-10 SAX Solues padro FM: tampo fosfato (pH 3,15) e acetonitrila Coluna: Dionex PAX-500 Metanol/fenilisocianato/trietilamina/ gua (7:1:1:1) FM: gradiente de acetonitrila em em tampo acetato e acetonitrila/gua/metanol Coluna: C18 FM: cido trifluoroactico Coluna: C18 FM: brometo de tetraetilamnio e tampo fosfato (pH 3,2) Coluna: C18 FM: tampo fosfato (pH 1,9) Coluna: catinica FM: KH2PO4 (pH 2,1) Coluna: Ionosphere A FM: KH2PO4 (pH 1,9) Coluna: catinica FM: KH2PO4 (pH 2,1) Coluna: C18 FM: KH2PO4 (pH 2,05) Coluna: especfica para glifosato (troca catinica, K+) Deteco UV (195 nm) UV (195 nm) UV (195 nm) Ref. 24 25 26

UV (254 nm)

27

gua Solo

FMOC-Cl 1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno/ etanol/NaBH4 ninhidrina

UV (264 nm) VIS (405 nm)

28 29

VIS (570 nm) Fluorescncia lexc = 360 nm lem = 400 nm Fluorescncia lexc = 340 nm lem = 455 nm Fluorescncia lexc = 340 nm lem = 455 nm Fluorescncia lexc = 340 nm lem = 440 nm Fluorescncia lexc = 340 nm lem = 550 nm

3 30

Vegetais

Hipoclorito, OPA, mercaptoetanol (ps-coluna) Hipoclorito, OPA, mercaptoetanol (ps-coluna) Hipoclorito, OPA, mercaptoetanol (ps-coluna) Hipoclorito, OPA, N,N-dimetil-2mercaptoetilamina (ps-coluna) Cloreto de dansila

gua

12

14

31

19

Solo

FMOC-Cl

FM: KH2PO4 (pH 6) e acetonitrila Coluna: NH2 FM: KH2PO4 (pH 6,3) e acetonitrila - Coluna: C18 FM: KH2PO4 (pH 5,7) e acetonitrila - Coluna: C18 FM: KH2PO4 (pH 6,3) e acetonitrila - Coluna: NH2 FM: KH2PO4 (pH 2,3) e acetonitrila Coluna: C18 FM: soluo de nitrato de sdio - Coluna: PRP-X100 FM: soluo de cido ntrico Coluna: PRP-X400 Coluna: C18 FM: soluo de Na2CO3 e NaHCO3 (pH 10,30; isocrtica) ou de Na2CO3 e NaHCO3 (pH 10,30) (eluente A) e os mesmos sais em pH 10,08 (gradiente) Coluna: troca aninica

Fluorescncia lexc = 270 nm lem = 315 nm Fluorescncia lexc = 340 nm lem = 440 nm

10

FMOC-Cl (ps-coluna)

Solues padro

p-tolueno-sulfonila Alumnio e morina (ps-coluna)

Fluorescncia lem = 240 nm Fluorescncia

32 33

gua

FMOC-Cl

EM/EM EM

18 34

Ru(tris-(2,2-bipiridil))32+(ps-coluna) Ru(tris-(2,2-bipiridil))32+(ps-coluna)

FM: soluo de cido ntrico (pH 2,5) - Coluna: troca catinica FM: tampo fosfato (pH 9) Coluna: troca aninica FM: soluo de Ru(tris-(2,2bipiridil))32+ em acetonitrila/tampo fosfato- Coluna: troca aninica FM: soluo de cido sulfrico Coluna: troca aninica

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Iodeto de potssio, cido sulfmico e cido actico (ps-coluna)

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zada com lexc = 340 nm e lem = 440 nm, apresentando recuperaes de 88 a 109% para glifosato e 73 a 103% para AMPA. Kawai e colaboradores32 utilizaram p-tolueno-sulfonila em acetonitrila e tampo fosfato (pH 11) para derivao prvia do glifosato, a 50 C por 5 min, seguida de anlise cromatogrfica em coluna C18, eluda com tampo fosfato em pH 2,3 e acetonitrila. A deteco do composto fluorescente foi feita em 240 nm. Outra alternativa de anlise do glifosato foi feita a partir de composto fluorescente formado entre alumnio e morina, testando a separao com duas colunas cromatogrficas, PRP-X100, eluda com nitrato de sdio, e PRP-X400, eluda com cido ntrico33. A reao de derivao foi feita em ps-coluna, em meio de tampo acetato, em 80% de etanol, operada a 55 C. A deteco foi efetuada por fluorescncia, sendo obtido limite de deteco de 14 ng. Determinao por cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas Segundo Bauer e colaboradores34, a determinao cromatogrfica de glifosato com deteco por espectrometria de massas (EM) sem derivao no suficientemente eficiente. Vreeken e colaboradores18 realizaram deriva o com FMOC-Cl, seguido de separa o cromatogrfica utilizando coluna C18. Foi utilizado CLAE/EM/EM com ionizao por eletrospray, monitorando-se trs fragmentos para o herbicida e seu produto de degradao, melhorando a seletividade do mtodo. Bauer e colaboradores34, substituram a coluna C18 por uma de troca aninica, testando duas eluies: a primeira isocrtica com mistura de carbonato e bicarbonato de sdio em pH 10,30 e outra em gradiente de eluio onde o eluente A era a mistura j citada e o eluente B uma mistura dos mesmos sais, em pH 10,08. O uso de gradiente de eluio resultou em melhores cromatogramas, aumentando a sensibilidade do mtodo. Glifosato e AMPA foram determinados por fragmentos caractersticos, m/z 168 e m/z 110, respectivamente. Determinao por cromatografia lquida com quimiluminescncia A an lise por cromatografia l quida usando detec o por quimiluminescncia foi testada em trs metodologias: a primeira utilizando coluna de troca catinica, eluda com cido ntrico em pH 2,5 acoplada a uma p s-coluna com adi o de Ru(tris-(2,2 bipiridil))32+; a segunda com coluna de troca aninica, eluda com tampo fosfato em pH 9, acoplada a ps-coluna com adio de Ru(tris(2,2-bipiridil))32+ em tampo fosfato; e a terceira metodologia utilizando a mesma coluna de troca aninica citada anteriormente, mas eluda com Ru(tris-(2,2-bipiridil))32+ em acetonitrila/tampo fosfato em pH 9,8 (1:9), sem necessidade de ps-coluna35. Todas as trs metodologias utilizaram deteco por quimiluminescncia, usando cela de 2,5 mL, com eletrodo de trabalho de carbono mantido a 1,25 V e eletrodo de referncia de Ag/AgCl. Obteve-se limite de deteco de 0,01 mmol L-1. Sem e Baddoo22 utilizaram coluna cromatogrfica de troca aninica, eluda com cido sulfrico, e ps-coluna mergulhada em gua a 70 C, reagindo-se com iodeto de potssio, cido sulfmico e cido actico. O monxido de nitrognio gerado foi arrastado por Hlio para a cela, obtendo-se recuperaes de 67 a 100%. Anlise por cromatografia em camada delgada (CCD) Embora pouco aplicvel a amostras ambientais devido baixa sensibilidade, Bunyatyan e Gevorgyan36 determinaram glifosato quantitativamente por cromatografia em camada delgada (CCD), usando placas de Fixiona 50-X8 (forma Na+), operadas a 50 C e

utilizando soluo de Ba2B4O7 como fase mvel. A deteco foi realizada com ninhidrina 1% em acetona e acetato de cdmio em soluo aquosa de anidrido actico em meio cido (5:1). Segundo os autores, a relao entre a rea da mancha e a concentrao foi linear de 0,5 a 30 mg e 0,1 a 20 mg de glifosato e AMPA, respectivamente. Foram usados extratos aquosos das amostras, com limites de deteco de 0,05 mg/Kg para amostras de gua e solo. Anlise por cromatografia gasosa (CG) A tcnica de cromatografia gasosa a segunda mais amplamente empregada para determinao de glifosato. Para a determinao do herbicida por CG, faz-se necessria um prvia derivao para obteno de composto voltil, porm, esta tcnica apresenta a vantagem da tima sensibilidade. Os mtodos de anlise deste herbicida e seu produto de degradao por CG so mostrados na Tabela 3. Determinao por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas Tsunoda37 determinou glifosato por CG aps derivao com Nmetil-N-(t-butildimetilsilil)trifluoroacetamida em DMF, obtendo-se, assim, um composto voltil. A anlise cromatogrfica foi realizada em coluna DB-1, com gradiente de temperatura de 100 a 300 C, a 8 C/min, utilizando He a 1 mL/min como gs de arraste. A deteco foi realizada por EM utilizando ionizao por impacto de eltrons (IE) ou com ionizao qumica (IQ) com isobutano como gs reagente. Dois fragmentos caractersticos foram utilizados para quantificao. No estudo foram obtidos limites de deteco de 10 ng, para IE, e 20 ng, para IQ, de glifosato em solues padro. Metodologia similar para derivao de glifosato e AMPA foi feita com reao a 100 C, por 10 min e 60 min, respectivamente38. No entanto, utilizaram outro tipo de coluna, de menor comprimento, operada a 200 C para glifosato e 170 C para AMPA, com nitrognio como gs de arraste. Para a deteco combinaram FC e EM, o que garantiu boa sensibilidade e seletividade do mtodo. Alferness e Iwata7, entretanto, realizaram derivao com heptafluorobutanol e TFAA, seguida da anlise cromatogrfica. A programao de temperatura foi de 90 at 290 C a 30 C/min, usando He como gs de arraste. A deteco foi feita por EM, selecionando dois ons caractersticos para glifosato e AMPA. Recuperaes de 90 a 100% e 89 a 103% foram obtidas para o herbicida e seu produto de degradao, respectivamente, com limite de deteco de 0,01 mg/Kg. Outra reao de derivao foi feita com TFAA e TFE21. Amostras de gua previamente tratadas em colunas de troca inica, foram concentradas e retomadas com os reagentes de derivao. A reao foi feita por 1 h a 100 C. Aps evaporao e redissoluo em acetato de etila, os extratos contendo os derivados de glifosato e AMPA foram analisados por CG/EM, ambos identificados por trs ons caractersticos. Boa linearidade foi obtida para o pesticida e seu metablito (0,1 a 2,5 mg/L), embora baixos limites de deteco e quantificao tenham sido obtidos (0,05 e 0,1 mg/L). As recuperaes variaram de 58 a 91% para glifosato em solo, com coeficientes de variao de 23%. Determinao por cromatografia gasosa com deteco por fotometria em chama Tsuji e colaboradores39 puderam determinar glifosato em gros, utilizando CG aps derivao com trimetilortoacetato a 80 C por 1,5 h. Antes da anlise propriamente dita, foi necessria uma etapa de purificao. A anlise cromatogrfica foi feita com programao de temperatura de 50 C at 250 C, utilizando hlio como gs de

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Tabela 3. Determinao de glifosato e AMPA por CG Amostra Solues padro Derivao N-metil-N-(t-butildimetilsilil)trifluoroacetamida N-metil-N-(t-butildimetilsilil)trifluoroacetamida Heptafluorobutanol e TFAA TFAA e TFE trimetilortoacetato Trifluoroetanol e pentafluoropropanol Temp.: 50-250C Gs de arraste: He Temp.: 150C Gs de arraste: N2 Temp.: 170-270C (10C/min) Gs de arraste: N2 Temp.: 110-175C (10C/min) Condies analticas Coluna: DB-1 Temp.: 100-300C (8C/min) Gs de arraste: He Temp.: 170-200C Gs de arraste: N2 Temp.: 90-290C (30C/min) Gs de arraste: He Deteco EM usando IE ou IQ Ref. 37

Solues padro Solo gua Vegetais Solues padro

FC e EM EM EM FC FC (modo P) e DCE FC FC DCE DNP

38 7 21 39 40 41 42 8 43 44 45

gua Solo Razes Cloroformiato de isopropila e diazometano Vegetais Solo gua potvel gua Solo Sangue Anidrido trifluoroactico e diazometano Anidrido trifluoroactico e TFE Anidrido trifluoroactico e TFE N-isobutoxicarbonilmetilester Pirlise (Cr-Na2CO3)

Temp.: 170-270C (10C/min) Gs de arraste: N2 Coluna com 50% de PEG 20M Temp.: 50C Gs de arraste: N2

FC/EM DIC

arraste e deteco por FC. Recuperaes superiores a 70% foram observadas. Os limites de deteco foram de 0,02 mg/Kg. A deriva o com TFE ou pentafluoropropanol e anidrido trifluoroactico ou heptafluorobutrico apresentaram boa sensibilidade40. Aps a derivao, a separao e anlise foram feitas em coluna cromatogrfica operada a 150 C, com nitrognio como gs de arraste, a 27,6 mL/min. Utilizaram como detectores o fotomtrico de chama (no modo P) ou o de captura de eltrons, DCE. Melhor sensibilidade foi, ainda, obtida por Kataoka e colaboradores41 que derivaram o glifosato com cloroformiato de isopropila e diazometano, analisando por CG, com programao de temperatura de 170 at 270 C a 10 C/min, usando nitrognio como gs de arraste a 10 mL/min e obtendo limites de deteco de 8 a 20 pg. Seiber e colaboradores42 utilizaram derivao com anidrido trifluoroactico e diazometano, com prvia separao por cromatografia l quida e elui o em gradiente de t-butilmetileter e tetrahidrofurano e deteco a 220 nm. Aps a separao por CLAE, foi feita a anlise por CG, utilizando coluna especfica, operada com programao de temperatura de 110 C at 175 C, a 10 C/min e deteco por FC. Recuperaes de 87% foram obtidas para alimentos fortificados em concentraes variando de 0,1 a 0,25 mg/g de glifosato. A prvia derivao com anidrido trifluoroactico e trifluoroetanol tambm foi feita para anlise por CG utilizando DCE8. Foram obtidas recuperaes de 88 a 104% para o herbicida. Ainda com os mesmos reagentes sendo usados na derivao, a anlise por CG usando detector de nitrognio e fsforo (DNP) forneceu recuperaes de 75% para glifosato e 80% para AMPA com limite de deteco em torno de 0,01 mg/g43. Realizando derivao com N-isobutoxicarbonilmetilester, seguida de anlise cromatogrfica, Kataoka e colaboradores44 utilizaram a

deteco por fotometria em chama, confirmando as estruturas por espectrometria de massas. A anlise apresentou relao linear para concentraes entre 5 e 200 ng e recuperaes de 96,2 a 100,3%, para amostras de gua, e 81,7 a 99,1% para amostras de solo. Limites de deteco de 10 e 15 pg para glifosato e AMPA, respectivamente, foram obtidos. A pirlise a 590 C, durante intervalo de 4 s, aps adio de CrNa2CO3 (2:1), foi inicialmente feita, seguida por anlise cromatogrfica em coluna com 10% de PEG 20M, operada a 50 C, com nitrognio como gs de arraste e deteco por ionizao em chama (DIC), obtendo recuperaes de 98 a 102%45. Outras tcnicas Mtodos baseados em outras tcnicas, alm das cromatogrficas, vm sendo desenvolvidos para a determinao de glifosato e seu metablito, embora ainda sejam pouco utilizados. Estas tcnicas incluem ressonncia magntica nuclear de fsforo 31 (RMN 31P), pouco convencional, espectrofotometria, polarografia e eletroforese. Determinao por RMN 31P Amostras dissolvidas em D2O (0,5 mL) foram analisadas por ressonncia magntica nuclear de 31P, em freqncia de 81 MHz, obtendo-se o espectro em 1 min. As recuperaes no foram reportadas46. Determinao por espectrofotometria Segundo Dong e colaboradores47, possvel determinar glifosato em guas residurias, utilizando mtodo espectrofotomtrico. Amos-

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tras so diludas com gua destilada, seguida de reaes com EDTA dissdico, nitrito de sdio e cido sulfrico, e depois com iodeto de potssio e amido, toda a reao ocorrendo a 15 C. A absorvncia foi medida em 550 nm, com linearidade entre 0,375 e 4,5 mg/L e recuperaes de 95 a 104%. importante ressaltar que necessrio um sistema com temperatura controlada, pois a reao do iodo com amido produz composto colorido, que tm diminuio de absorvncia com o aumento de temperatura. Zhemchuzhin e Gorobets48 tambm descrevem um mtodo espectrofotomtrico, neste caso, usando reao com gua de bromo na presena de tampo acetato para formao de brometo do herbicida, e depois tampo pirofosfato, soluo de lcooldehidrogenase e NAD+, em etanol aquoso a 50%. A determinao foi realizada a 340 nm, observando-se a diminuio da atividade enzimtica. Determinao por polarografia Tanto amostras de solo quanto de gua, aps extrao, purificao e pr-concentrao, foram analisadas por polarografia para determinao de glifosato, tratando-se a amostra acidificada com carvo ativado, seguida de nitrao de uma alquota da amostra6. Um volume da amostra que no sofreu nitrao foi colocada na clula polarogrfica, sofrendo remoo do oxignio por passagem de N2. A medida foi iniciada depois de estabilizada a corrente inicial em 0,5 V, variando-se 2 mV/s na direo negativa, com pulso em amplitude de 100 mV e tempo de gota de 2 s. O procedimento foi repetido com a amostra que sofreu a nitrao. As recuperaes foram de 63 a 89% para solo e 67 a 81% para gua, tendo como limite de deteco 0,5 a 1,0 mg/g. Determinao por eletroforese Amostras de soro sanguneo foram desproteinizadas com cido tricloroactico, centrifugadas e derivadas com cloreto de p-toluenosulfonila na presena de tampo fosfato (pH 11), sendo analisadas por eletroforese em coluna capilar de slica fundida (72 cm x 50 mm) operada a 35 C e 30 kV. Foi utilizado tampo borato (pH de 8,7 a 9,6) contendo 10% de metanol e deteco a 240 nm. A calibrao mostrou linearidade para valores de 0,5 a 100 mg/L de glifosato e AMPA49. Alferness e Iwata7 desenvolveram um mtodo de eletroforese com uma coluna capilar (64,5 cm x 50 mm) operada a 25 C, com eletrlito de hidrogenoftalato de potssio ajustado a pH 7,5 e 0,5 mmol L-1 de brometo de tetradeciltrimetilamnio, aplicando 27,6 kV e detectando a 240 nm. Este mtodo foi aplicado a amostras de solo, gua, tecidos animais e vegetais. Para gua foram obtidas as recuperaes de 95-97% (0,2 mg L-1), 99-112% (10 mg L-1), 99-105% (100 mg L-1), enquanto que para solo obtiveram recuperaes de 84 a 97% para amostras com nveis de fortificao de 0,05 a 0,50 mg/kg. CONCLUSES O glifosato apresenta caractersticas muito especficas, o que dificulta seu monitoramento em solo e gua, sua determinao de grande relevncia devido sua ampla utilizao. A extrao em amostras de solo tem sido realizada principalmente com reaes cidobase, sendo extremamente afetada pelas propriedades e composio do solo. Bases fracas orgnicas, como trietilamina, so eficazes apenas para extrao do composto livre, no sendo capaz de extrair o composto adsorvido. Solos com maior teor de matria orgnica apresentaram melhores recuperaes, enquanto os minerais e argilosos apresentam recuperaes inferiores devido interao com os stios inicos do solo. Em amostras de gua, podem ser efetuadas extraes em fase slida (EFS) usando-se resinas de troca inica, sendo

possvel realizar a anlise por simples filtrao e evaporao da amostra. Uma outra metodologia a derivao, onde se obtm compostos apolares que podem ser extrados com solventes orgnicos. Esta derivao pode diminuir a recuperao do composto, uma vez que envolve o uso de maior nmero de etapas. Os estudos realizados para estes compostos, em geral, no avaliam a eficcia do processo de extrao, apresentando recuperaes relacionadas ao processo analtico completo, desde a extrao at a deteco. Deste modo, tornase difcil comparar as recuperaes no sentido de avaliar qual o melhor procedimento de extrao para o herbicida e seu produto de degradao. A tcnica mais utilizada para a determinao de glifosato a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), necessitando, entretanto de derivao para produo de compostos que interajam com radiao eletromagntica, aplicando-se, assim, deteco colorimtrica, por UV ou deteco fluorimtrica. Comparando com outros mtodos de deteco, a determinao por absoro no UV-VIS apresenta como vantagens a simplicidade, bem como menores coeficientes de variao, recuperaes e limites de deteco adequados. A cromatografia gasosa (CG) apresenta a vantagem de possuir elevada sensibilidade, porm, exige derivao para obteno de compostos volteis. Pode-se, ainda, adicionar a especificidade da espectrometria de massas s tcnicas cromatogrficas, tanto lquida quanto gasosa. Outras tcnicas tm sido aplicadas na anlise do herbicida, o que favorece o seu estudo. Entre elas, destacam-se a polarografia, a eletroforese capilar, a espectrofotometria e a ressonncia magntica nuclear, evidenciando a possibilidade de determinao por outras tcnicas menos convencionais para a anlise de resduos de pesticidas, podendo ser adequadamente aplicadas como alternativas de anlise do composto em amostras ambientais. REFERNCIAS
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