Animais de Laboratorio Criaçao e Experimentacao

Animais de laboratrio
criao e experimentao
Antenor Andrade Sergio Correia Pinto Rosilene Santos de Oliveira Orgs.
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ANDRADE, A., PINTO, SC., and OLIVEIRA, RS., orgs. Animais de Laboratrio: criao e experimentao [online]. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ, 2002. 388 p. ISBN: 85-7541-015-6. Available from SciELO Books <http://books.scielo.org>.
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nimais de Laboratrio
FUNDAO OSWALDO CRUZ Presidente Paulo Marchiori Buss Vice-Presidente de Desenvolvimento Institucional, Informao e Comunicao Paulo Gadelha EDITORA FIOCRUZ Coordenador Paulo Gadelha Conselho Editorial Carlos E. A. Coimbra Jr. Carolina M. Bori Charles Pessanha Hooman Momen Jaime L. Benchimol Jos da Rocha Carvalheiro Luis David Castiel Luiz Fernando Ferreira Maria Ceclia de Souza Minayo Miriam Struchiner Paulo Amarante Vanize Macdo Coordenador Executivo Joo Carlos Canossa P . Mendes
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nimais de Laboratrio
Antenor Andrade Sergio Correia Pinto Rosilene Santos de Oliveira
Organizadores
Copyright 2002 dos autores Todos os direitos desta edio reservados FUNDAO OSWALDO CRUZ / EDITORA
ISBN: 85-7541-015-6
Capa, projeto grfico e editorao eletrnica Anglica Mello Copidesque e reviso Cludia Cristiane Lessa Dias Janaina Souza Silva Superviso editorial Marcionlio Cavalcanti de Paiva
Catalogao-na-fonte Centro de Informao Cientfica e Tecnolgica Biblioteca Lincoln de Freitas Filho A598a Andrade, Antenor (org.) Animais de Laboratrio: criao e experimentao. / Organizado por Antenor Andrade, Sergio Correia Pinto e Rosilene Santos de Oliveira. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, 2002. 388p., il., tab., graf. 1. Animais de laboratrio 2. Manuais de Laboratrio [tipo de publicao] I. Pinto, Sergio Correia (org.) II. Oliveira, Rosilene Santos de (org.).
CDD - 20.ed. 619 2002 Editora Fiocruz Av. Brasil, 4036 1o andar sala 112 Manguinhos 21040-361 Rio de Janeiro RJ Tels.: (21) 3882-9039 e 3882-9041 Telefax: (21) 3882-9007 e-mail: editora@fiocruz.br http://www.fiocruz.br
os bioteristas, que com seu senso tico, profissionalismo e habilidade proporcionam conforto e bem-estar aos animais de laboratrio, contribuindo significativamente para o desenvolvimento da pesquisa, do ensino, da produo e do controle de imunobiolgicos e frmacos na rea da cincia e tecnologia em sade.
A utores
ALEXANDRE DE
OLIVEIRA SAISSE
Bilogo, especialista em microbiologia veterinria, National Institutes of Health (EUA); chefe do Departamento de Controle da Qualidade Animal, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [saisse@fiocruz.br]
ANA
MARIA APARECIDA GUARALDO
Biloga, doutora em imunologia pela Universidade Estadual de Campinas; diretora do Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica da Universidade Estadual de Campinas [guaraldo@cemib.unicamp.br]
ANA
MARIA JANSEN
Mdica-veterinria, doutora em microbiologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; pesquisadora, chefe do Laboratrio de Biologia e Tripanossomatdeos/Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz [jansen@ioc.fiocruz.br]
ANDR
LUIZ FRANCO SAMPAIO
Bilogo, doutor em biologia celular e molecular pelo Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz; tecnologista do Laboratrio de Farmacologia Aplicada/Fundao Oswaldo Cruz [asampaio@far.fiocruz.br]
ANDR
LUIZ RODRIGUES ROQUE
Mdico-veterinrio, bolsista do Departamento de Medicina Tropical/Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz [alrroque@yahoo.com.br]
ANDRA
MENDES PEREIRA
Mdica-veterinria, tecnologista do Departamento de Produo Animal, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/ Fundao Oswaldo Cruz [andreamp@fiocruz.br]
ANBAL
RAFAEL MELGAREJO-GIMNEZ
Bilogo, doutor em patologia experimental pela Universidade Federal Fluminense; pesquisador e chefe da Diviso de Animais Peonhentos do Instituto Vital Brazil [anibalmg@provide.psi.br]
ANTENOR
ANDRADE
Mdico-veterinrio, especialista em zootecnia pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro; diretor do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [ande@fiocruz.br]
BELMIRA
FERREIRA DOS SANTOS
Mdica-veterinria, especialista em produo de animais consangneos e no-consangneos pelo The Jackson Laboratory (EUA); tecnologista do Departamento de Produo Animal, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/ Fundao Oswaldo Cruz [bel@fiocruz.br]
BERNARDO
RODRIGUES TEIXEIRA
Bilogo, bolsista do Departamento de Medicina Tropical/Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz [bernardo@biologo.com.br]
CELIA
VIRGINIA PEREIRA CARDOSO
Mdica-veterinria, especialista em cincia de animais de laboratrio pela Universidade de So Paulo; vice-diretora do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [cardoso@fiocruz.br]
DELMA
PEGOLO ALVES
Biloga, mestre em cincias biolgicas pela Universidade Estadual de Campinas; responsvel tcnica pelas reas de matrizes, produo e expedio de animais, Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica da Universidade Estadual de Campinas [delma@cemib.unicamp.br]
EKATERINA
AKIMOVNA B. RIVERA
Mdica-veterinria, mestre em cincia de animais de laboratrio pela University of London (Reino Unido); coordenadora do Biotrio Central da Universidade Federal de Gois [e.rivera@uol.com.br]
ELIANA
SAUL FURQUIM WERNECK ABDELHAY
Fsica, doutora em biofsica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; professora-adjunta do Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro [abdelhay@biof.ufrj.br]
LEDA
MARIA SILVA KIMURA
Mdica-veterinria, mestre em microbiologia veterinria pela Universidade Federal Rural do Estado do Rio de Janeiro; pesquisadora responsvel pelas reas de virologia e biotrio, Empresa de Pesquisa Agropecuria do Rio de Janeiro [lba@domain.com.br]
LUIZ
AFONSO PIRES AUGUSTO CORRA PASSOS
Bilogo, Laboratrio de Criobiologia da Universidade Estadual de Campinas [afonso@cemib.unicamp.br]

LUIZ
Bilogo, mestre em imunologia pela Universidade Estadual de Campinas; responsvel pelos Laboratrios de Controle da Qualidade, Gentica e Criopreservao da Universidade Estadual de Campinas [passos@cemib.unicamp.br]
MARCIA
AGOSTINI
Sociloga, mestre em psicossociologia das comunidades e ecologia social pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; pesquisadora e vice-coordenadora de ensino do Centro de Estudos da Sade do Trabalhador e Ecologia Humana, Escola Nacional de Sade Pblica/Fundao Oswaldo Cruz [agostini@ensp.fiocruz.br]
MRCIA
CRISTINA RIBEIRO ANDRADE
Mdica-veterinria, mestre em cincia em biologia parasitria pelo Instituto Oswaldo Cruz; tecnologista do Departamento de Primatologia, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [andrade@fiocruz.br]
MARCOS
ANTNIO PEREIRA MARQUES
Bilogo, mestre em cincia em microbiologia veterinria pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro; tecnologista do departamento de Controle da Qualidade Animal, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/ Fundao Oswaldo Cruz [marques@fiocruz.br]
MARCOS
ZANFOLIN
Bilogo, responsvel pelas sees de Fundao e Expanso de Matrizes de Camundongos e Ratos, Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica, Universidade Estadual de Campinas [zanfolin@biot.fm.usp.br]
MARIA DAS
GRAAS MLLER DE OLIVEIRA HENRIQUES
Biloga, doutora em biologia celular e molecular, rea de farmacologia, pelo Instituto Oswaldo Cruz; pesquisadoratitular, chefe do Laboratrio de Farmacologia Aplicada e diretora de Pesquisa do Instituto de Tecnologia em Frmacos/ Fundao Oswaldo Cruz [gracahen@far.fiocruz.br]
OCTAVIO
AUGUSTO FRANA PRESGRAVE
Bilogo, tecnologista do Departamento de Farmacologia e Toxicologia, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade/Fundao Oswaldo Cruz [octavio@alpha.incqs.fiocruz.br]
PAULO
GUILHERME DA SILVA S
Mdico-veterinrio, doutor em toxicologia ambiental pela Escola Nacional de Sade Pblica/Fundao Oswaldo Cruz; pesquisador-visitante, Escola Nacional de Sade Pblica/Fundao Oswaldo Cruz [pgsa@brfree.com.br]
PAULO
SERGIO DANDREA
Bilogo, mestre em zoologia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro; pesquisador-adjunto, vice-chefe do Laboratrio de Biologia e Controle da Esquistossomose, Departamento de Medicina Tropical/Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz [dandrea@ioc.fiocruz.br]
SEBASTIO
ENES REIS COUTO
Mdico-veterinrio, especialista em planejamento e produo de animais de laboratrio gnotobiticos e SPF pelo National Institutes of Health (EUA); chefe do Departamento de Produo Animal, Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [scouto@fiocruz.br]
THIAGO
HENRIQUE CIMADON DINI
Bilogo, Laboratrio de Criopreservao de Embries, Universidade Estadual de Campinas [dini@cemib.unicamp.br]

THIAGO
MARINHO SANTANA
Bilogo, Laboratrio de Criopreservao de Embries, Universidade Estadual de Campinas [santana@cemib.unicamp.br]
ORGANIZADORES
ANTENOR
ANDRADE
Mdico-veterinrio, especialista em zootecnia pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro; diretor do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [ande@fiocruz.br]
SERGIO
CORREIA PINTO
Administrador, responsvel pelas reas de informtica, planejamento e oramento do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [spinto@fiocruz.br]
ROSILENE
SANTOS DE OLIVEIRA
Administradora, coordenadora de ensino do Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fundao Oswaldo Cruz [rosilene@fiocruz.br]
S umrio
Prefcio ............................................................................................................................................. 15 Apresentao ..................................................................................................................................... 17 1. O Bioterismo: evoluo e importncia ......................................................................................... 19
Antenor Andrade
2. Modelo Animal ........................................................................................................................... 23

Belmira Ferreira dos Santos
3. tica na Experimentao Animal ................................................................................................ 25

Ekaterina Akimovna B. Rivera Celia Virginia Pereira Cardoso Sebastio Enes Reis Couto Sebastio Enes Reis Couto
4. Classificao de Biotrios quanto Finalidade ............................................................................ 29 5. Instalaes e Barreiras Sanitrias ................................................................................................. 33 6. Equipamentos, Materiais e Insumos ........................................................................................... 45 7. Macro e Microambientes ............................................................................................................ 55
Belmira Ferreira dos Santos Sebastio Enes Reis Couto
8. Classificao dos Animais de Laboratrio quanto ao Status Sanitrio .......................................... 59 9. Classificao dos Animais de Laboratrio quanto ao Status Gentico .......................................... 65
Belmira Ferreira dos Santos Sebastio Enes Reis Couto Andra Mendes Pereira
10. Criao e Manejo de Cobaias ...................................................................................................... 71 11. Principais Doenas das Cobaias .................................................................................................. 81 12. Criao e Manejo de Coelhos ...................................................................................................... 93
Sebastio Enes Reis Couto Andra Mendes Pereira
13. Principais Doenas dos Coelhos ............................................................................................... 105
14. Criao e Manejo de Camundongos .......................................................................................... 115

Belmira Ferreira dos Santos Belmira Ferreira dos Santos Belmira Ferreira dos Santos Andra Mendes Pereira
15. Criao e Manejo de Ratos ........................................................................................................ 119 16. Criao e Manejo de Hamsters ...................................................................................................... 123 17. Principais Doenas dos Camundongos, Ratos e Hamsters ......................................................... 127 18. Camundongos Mutantes mais Utilizados .................................................................................. 139
19. Criao e Manejo de Primatas No-Humanos ........................................................................... 143

Mrcia Cristina Ribeiro Andrade Mrcia Cristina Ribeiro Andrade Paulo Guilherme da Silva S Ana Maria Jansen
20. Principais Doenas de Primatas No-Humanos ........................................................................ 155 21. Criao e Manejo de Ces ......................................................................................................... 161 22. Marsupiais Didelfdeos: gambs e cucas ................................................................................... 167 23. Criao e Manejo de Serpentes ................................................................................................. 175
Anbal Rafael Melgarejo-Gimnez Leda Maria Silva Kimura
24. Principais Zoonoses .................................................................................................................. 201 25. Gnotobiologia ........................................................................................................................... 211

Delma Pegolo Alves, Luiz Augusto Corra Passos, Ana Maria Aparecida Guaraldo e Marcos Zanfolin
26. Criopreservao de Embries Murinos em Biotrios ................................................................. 225

Luiz Augusto Corra Passos, Ana Maria Aparecida Guaraldo, Delma Pegolo Alves, Luiz Afonso Pires, Thiago Marinho Santana e Thiago Henrique Cimadon Dini Ekaterina Akimovna B. Rivera Ekaterina Akimovna B. Rivera Ekaterina Akimovna B. Rivera Celia Virginia Pereira Cardoso Celia Virginia Pereira Cardoso
27. Analgesia em Animais de Experimentao................................................................................. 247 28. Anestesia em Animais de Experimentao ................................................................................. 255 29. Estresse em Animais de Laboratrio ......................................................................................... 263 30. Eutansia .................................................................................................................................. 275 31. Descarte de Carcaas ................................................................................................................ 281
32. Fatores que Influenciam no Resultado do Experimento Animal ................................................ 289

Antenor Andrade
33. Tcnicas de Risco Desenvolvidas na Experimentao com Roedores ........................................ 295

Octavio Augusto Frana Presgrave Celia Virginia Pereira Cardoso
34. Controle da Qualidade de Animais de Laboratrio ................................................................... 299 35. Controle Parasitolgico ............................................................................................................. 303
Marcos Antnio Pereira Marques Marcos Antnio Pereira Marques Alexandre de Oliveira Saisse
36. Controle Sorolgico de Viroses Murinas ................................................................................... 317 37. Controle Bacteriolgico, Micolgico e Micoplasma: animal e ambiental ................................... 325 38. Tcnica de Necropsia ............................................................................................................... 331
Celia Virginia Pereira Cardoso
39. Alternativas para Animais de Laboratrio: sistemas in vitro ......................................................... 337

Maria das Graas Mller de Oliveira Henriques e Andr Luiz Franco Sampaio Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
40. Criao e Produo de Animais Transgnicos e Nocautes ......................................................... 345 41. Alternativas para Animais de Laboratrio: uso de animais no-convencionais roedores silvestres .................................................................................... 353
Paulo Sergio DAndrea, Andr Luiz Rodrigues Roque e Bernardo Rodrigues Teixeira Octavio Augusto Frana Presgrave Marcos Antnio Pereira Marques Marcia Agostini
42. Alternativas para Animais de Laboratrio: do animal ao computador ........................................ 361 43. Sade e Bem-Estar Social ......................................................................................................... 369 44. Sade do Trabalhador .............................................................................................................. 375 45. Biossegurana em Biotrios ....................................................................................................... 381
Antenor Andrade
Estresse em animais de laboratrio
P refcio
A contnua evoluo do conhecimento humano, especialmente o da biologia, bem como das medicinas humana e veterinria, repercute no desenvolvimento de aes envolvendo a criao e a experimentao animal, desencadeando uma constante e necessria atualizao de suas tcnicas e procedimentos. H mais de um sculo, os animais de laboratrio vm sendo utilizados na pesquisa biomdica. A produo e o desenvolvimento de vacinas e de anticorpos monoclonais; a avaliao e o controle de produtos biolgicos; os estudos de farmacologia e toxicologia; os estudos da bacteriologia, virologia e parasitologia; os estudos de imunologia bsica, de imunopatologia, de transplante e de drogas imunossupressoras etc. exigem o emprego de animais definidos gentica e sanitariamente. incalculvel o valor da contribuio dos animais de laboratrio s novas descobertas para a preveno de doenas e sua cura, bem como para o desenvolvimento de novas tcnicas de tratamento clnico e cirrgico. Os animais, como parte do processo de pesquisa, vm contribuindo para o controle de mais de dez mil produtos farmacuticos em uso corrente no mundo que, testados quanto eficcia, toxicidade, potncia e esterilidade, resultam na sobrevida de muitos seres humanos. As tcnicas atuais de engenharia gentica e biologia molecular abriram muitos caminhos para a criao e a produo desses animais. A rea dos transplantes de rgos e tecidos cada dia mais impulsionada, bem como a rea de produo de derivados biolgicos para uso em humanos, a partir da obteno de animais transgnicos, mutantes e knockouts. Para fazer frente a todos esses avanos, necessrio tambm no perder de vista a qualidade da formao do pessoal tcnico envolvido em cada uma dessas reas. Nesse sentido, o Centro de Criao de Animais de Laboratrio da FIOCRUZ elaborou este livro, com base no contedo programtico do curso internacional Criao e Produo de Animais de Laboratrio, realizado em 2001. Este livro traz uma contribuio muito importante, apresentando ao leitor os diversos aspectos do bioterismo, exatamente no momento em que se verifica uma profunda mudana nos padres das pesquisas realizadas em nosso pas. Na ocasio do seu lanamento, a presidncia da FIOCRUZ cumprimenta a equipe que participou da elaborao e execuo deste projeto, reconhecendo como uma conseqncia do esforo e da dedicao ao longo de vrios anos. Paulo Marchiori Buss
Presidente da FIOCRUZ
15
A presentao
A necessidade de um programa de treinamento em tcnicas aplicadas cincia em animais de laboratrio evidente, em virtude dessa carncia nos cursos formais de nossos estabelecimentos de ensino. As diferentes espcies de animais empregadas no controle da qualidade de produtos para a sade e nas atividades de pesquisa, bem como as diferentes linhagens genticas, precisam ser estudadas e aprofundadas. O mesmo ocorre com os controles sanitrio e gentico desses animais e com os modernos conceitos de manejo empregados na criao e produo de animais sanitria e geneticamente definidos. Esse programa abrange as reas diretamente envolvidas com a criao, produo e manuteno de animais de laboratrio, que se destinam s pesquisas biomdicas voltadas sade pblica. com imensa satisfao que apresentamos comunidade este livro, composto pelos temas discutidos em aulas tericas, prticas e em visitas tcnicas realizadas durante um ms de curso para profissionais que desenvolvem atividades em biotrio de criao ou de experimentao animal. Os assuntos aqui abordados proporcionaro aos bioteristas e a outros profissionais, que utilizam animais de laboratrio, conhecimento das tcnicas e necessidades bsicas no seu manejo, considerando principalmente a biossegurana, o bem-estar e a tica com animais em todos os seus aspectos. Propiciaro, tambm, discusses sobre a aplicao e o uso tradicional dos animais de laboratrio, buscando fortalecer a conscincia quanto necessidade de racionalizar os experimentos que envolvem animais, evitando assim a sua utilizao desnecessria e substituindo-a, sempre que possvel, por tcnicas alternativas. Esta publicao vem ao encontro da necessidade de aperfeioamento e fortalecimento, cada vez mais exigidos na cincia e tecnologia em sade, e das aes voltadas para o desenvolvimento de novos procedimentos com animais de laboratrio. Expressamos nossos agradecimentos presidncia da Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo incentivo e apoio para a concretizao deste projeto, tornando-o possvel. Aos orientadores e palestrantes autores deste livro , o nosso reconhecimento pela dedicao com que transmitiram seus conhecimentos, contribuindo para a divulgao da cincia em animais de laboratrio. Aos profissionais treinados por este projeto que, com a troca de conhecimentos e experincias, demostraram dedicao e interesse, contribuindo assim para o seu xito. Ao Departamento de Multimeios, ligado ao Centro de Informao Cientfica e Tecnolgica (CICT/FIOCRUZ), por sua valiosa colaborao na reproduo deste material em forma de apostila, que veio a dar origem a este livro. A todos os profissionais do Centro de Criao de Animais de Laboratrio (CECAL/FIOCRUZ) que contriburam para a realizao deste projeto na organizao do curso, na coleta e ordenao dos assuntos didticos, na aquisio de material de apoio e na orientao prtica nas salas de animais pela importante colaborao prestada. Os Organizadores
17
O bioterismo
O Bioterismo:
INTRODUO
evoluo e importncia
Antenor Andrade
A contnua evoluo do conhecimento humano, especialmente o da biologia, bem como das medicinas humana e veterinria, repercute no desenvolvimento de aes envolvendo a criao e experimentao animal, desencadeando a constante e necessria atualizao de suas tcnicas e procedimentos. Por mais de um sculo, os animais de laboratrio vm sendo utilizados na pesquisa biomdica. Estudos de anatomia, fisiologia, imunologia e virologia, dentre outros, realizados em animais de laboratrio, permitiram um avano considervel no desenvolvimento da cincia e tecnologia. Anteriormente, os animais de laboratrio eram utilizados como simples instrumentos de trabalho que ajudavam na investigao de diagnstico e diferentes pesquisas sem se levar em conta sua qualidade gentica e sanitria. Em geral, os institutos de investigao eram responsveis pela criao dos animais de laboratrio, porm no possuam estruturas adequadas e o pessoal no era habilitado para desenvolver essas atividades. Alm disso, a inexistncia de rao apropriada e a ausncia de condies higinicas nos criadouros no permitiam que fossem produzidos animais geneticamente definidos e com garantia sanitria. Dessa forma, para alguns, os animais de laboratrio eram considerados como um mal necessrio e nessas circunstncias, quando eram utilizados nas investigaes e pesquisas, os resultados obtidos no eram confiveis. Atualmente, porm, os pesquisadores exigem que esses animais renam condies ideais, isto , que atendam aos parmetros de qualidade gentica e sanitria, uma vez que nada mais so que reagentes biolgicos e os resultados dos experimentos so afetados em razo da qualidade de cada espcie utilizada. Assim, para garantir a confiabilidade do experimento, animais definidos devem ser usados. Animais de laboratrio definidos so aqueles criados e produzidos sob condies ideais e mantidos em um ambiente controlado, com conhecimento e acompanhamento microbiolgico e gentico seguros, obtidos por monitorao regular. Os chamados animais de laboratrio convencionais podem satisfazer as exigncias da experimentao biolgica, ao passo que animais obtidos na natureza no as satisfazem, pois no so submetidos a nenhum tipo de controle. Tais exigncias levaram nossos antecessores busca de soluo para essa problemtica e, assim, criou-se uma autntica especialidade A Cincia em Animais de Laboratrio. Esta tem tido grande desenvolvimento nos ltimos anos, alcanando nveis muito elevados em vrios pases como: Estados Unidos da Amrica, Alemanha, Inglaterra, Japo, Holanda e Frana.
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ANIMAIS DE LABORATRIO
HISTRICO
A utilizao de animais de laboratrio em investigao biolgica teve, inicialmente, estreita relao com a patologia comparada. Na poca, como as autpsias em cadveres humanos estavam proibidas, os cientistas procuravam nos animais a origem e as caractersticas dos processos patolgicos que afetavam a espcie humana, fazendo necropsias nesses animais para deduzir semelhanas. Cientistas como Aristteles, Galeno, Hipcrates, entre outros, estudaram as semelhanas e diferenas entre os rgos dos animais e do homem, interpretaram fenmenos biolgicos, descobriram o funcionamento de rgos, estudaram a circulao sangnea, a respirao, a nutrio e os processos de digesto, utilizando vrias espcies de animais. Isso ocorreu alguns anos antes de Cristo e foi o comeo do uso de animais de laboratrio, que contriburam sobremaneira para o desenvolvimento da cincia. Mais tarde, com os estudos da bacteriologia, a utilizao de animais de laboratrio tornou-se mais necessria ainda. Assim, desde os primeiros trabalhos de Pasteur e Koch, j no sculo XVIII, coelhos, cobaias, ratos, camundongos e hamsters passaram a ser ferramenta de trabalho dos pesquisadores, imprescindvel para identificar os germes causadores das enfermidades contagiosas. Sem a experimentao nesses animais, no teriam sido produzidas as primeiras vacinas contra o carbnculo e contra a raiva. Analisando-se historicamente, observa-se que o Brasil apresentava, at a dcada de 70 do sculo passado, uma situao precria em matria de instalaes e cuidados na produo de animais em condies de utilizao em trabalhos experimentais. Todavia, o esforo exercido por algumas instituies oficiais, no sentido de construir biotrios em condies adequadas, dotados de barreiras fsicas contra a propagao de infeces, com sistema de climatizao apropriado, tem mudado esse quadro, constituindo grande avano. Algumas delas, inclusive, j produzem animais SPF (livres de germes patognicos especficos), gnotobiticos (flora conhecida) e germfree (livres de germes). O considervel progresso alcanado nos ltimos 30 anos, nessa rea, exige o treinamento de profissionais de nvel superior na especialidade Animais de Laboratrio, bem como a capacitao de tcnicos que desenvolvem suas atividades em biotrios de criao e de experimentao. Na maioria dos pases, a produo e padronizao dos animais de laboratrio mais utilizados em pesquisa encontram-se em pleno aperfeioamento. Tudo converge para a aquisio de modelos genticos ecolgica e sanitariamente definidos solicitados para a realizao dos trabalhos dos pesquisadores. As tcnicas atuais de engenharia gentica e de biologia molecular abriram muitos caminhos para a criao e produo desses animais. A rea dos transplantes de rgos e tecidos cada dia mais impulsionada, bem como a de produo de derivados biolgicos para uso em humanos com base na obteno de animais transgnicos. O controle das doenas hereditrias tambm se desenvolve proporo que os dias passam. A evoluo vertiginosa da Cincia & Tecnologia alerta para a necessidade urgente da implantao de um sistema moderno e gil por que no dizer, de vanguarda , em biotrios, que permita a troca eficiente entre os avanos das pesquisas, incluindo a tendncia atual da criao de mtodos alternativos que venham a minorar a aplicao e o uso tradicional dos animais de laboratrio.
IMPORTNCIA
incalculvel o valor da contribuio dos animais de laboratrio s novas descobertas para a preveno de doenas e para a sua cura, bem como para o desenvolvimento de novas tcnicas de tratamento cirrgico. Esse reagente biolgico fundamental como modelo no estudo de doenas ainda incurveis como muitos cnceres, a AIDS e a esclerose mltipla. Contribui ainda para o controle de mais de dez mil produtos
20
O bioterismo
farmacuticos em uso corrente no mundo e que, testados quanto eficcia, esterilidade, toxicidade e potncia resultam na sobrevida de muitos pacientes. Atualmente o animal de laboratrio prioritrio no campo da experimentao, e os centros de produo desses animais tm uma grande preocupao com sua produo e manejo. Para assegurar a produo de animais de laboratrio, na qualidade que satisfaa os requisitos para o uso nas pesquisas mdicas, so necessrias instalaes apropriadas, equipamentos especializados e pessoal habilitado, sem o que no conseguiremos obter adequadamente este reagente. Esses animais representam modelos adequados e, portanto, necessrios ao estudo de diferentes modalidades da biologia e medicina experimentais. Assim, o desenvolvimento da biotecnologia depende da utilizao desses animais que necessariamente tero de ser limpos para que no haja interferncia nos resultados das pesquisas. A produo e o desenvolvimento de vacinas e de anticorpos monoclonais, a avaliao e o controle de produtos biolgicos, os estudos de farmacologia e toxicologia, estudos de bacteriologia, virologia e parasitologia, estudos de imunologia bsica, de imunopatologia, de transplantes e de drogas imunossupressoras etc., exigem o emprego de animais definidos gentica e sanitariamente. Pelas razes descritas anteriormente e pela necessidade das experimentaes serem realizadas em animais antes que qualquer produto seja aplicado ao homem uma vez que este no pode ser transformado em cobaia e considerando, ainda, que a essncia de nosso trabalho salvar vidas humanas mediante a produo desses animais e sua posterior utilizao , o bioterismo assume um papel de suma importncia e deve ser encarado com total responsabilidade tanto por parte daqueles que desenvolvem tais atividades quanto por parte de nossos dirigentes.
DEFINIO
Um biotrio nada mais que uma instalao dotada de caractersticas prprias, que atende s exigncias dos animais onde so criados ou mantidos, proporcionando-lhes bem-estar e sade para que possam se desenvolver e reproduzir, bem como para responder satisfatoriamente aos testes neles realizados.
NECESSIDADES BSICAS DE UM BIOTRIO

INSTALAES devem ser especficas para esse fim, porque somente assim conseguiremos condies ideais para a produo e manuteno desses animais. EQUIPAMENTOS dada a especificidade do trabalho, necessrio se faz que tenhamos mquinas especiais para a obteno dos resultados desejados (mquinas de lavar gaiolas, autoclaves etc.). MODELO ANIMAL criar o animal desejado, de acordo com as pesquisas e os testes a serem realizados. O pesquisador biomdico trabalha com modelos animais que, necessariamente, diferem do homem. Entretanto, tais modelos podem ser comparados com o homem, baseados, principalmente, no que consiste em uma semelhana geral sob o aspecto de caracteres anatmicos e fisiolgicos. Necessrio se faz, portanto, que sejam produzidos animais que, quando inoculados com uma determinada substncia, apresentem reaes semelhantes s do homem. Dessa forma, os animais criados para esse fim devero possuir as seguintes caractersticas:
fcil
manejo; prolificidade; docilidade;

21
pequeno porte; consumo alimentar; fisiologia conhecida; ciclo reprodutivo curto.
baixo
ROTINAS E PROCEDIMENTOS devem ser adotadas rotinas dirias para que se possa cumprir um programa de produo, de controle ou de pesquisa. Os procedimentos operacionais dos equipamentos devem ser rigorosamente observados para sua melhor utilizao e para a segurana do operador. PESSOAL as atividades desenvolvidas em um biotrio exigem pessoal qualificado para que se possa obter bons resultados. Alm de pessoal capacitado, bem treinado e que goste de animais, o bioterista deve possuir alguns requisitos, como: deve ser controlada, periodicamente, para evitar a transmisso de doenas aos animais. A periodicidade desse controle depende do tipo de biotrio e das condies particulares de cada instituio; DISCIPLINA para que possa cumprir com acerto todas as tarefas e determinaes, o bioterista deve possuir autocontrole e disciplina; TEMPERAMENTO CALMO o bioterista, ao executar suas atividades, deve ser tranqilo nas aes, a fim de evitar o estresse dos animais; RESPONSABILIDADE para que possa desenvolver seu trabalho sem causar nenhum prejuzo aos animais, o bioterista deve ter responsabilidade suficiente para no deixar, sob hiptese nenhuma, de executar suas tarefas, principalmente quando se trata de alimentao dos animais; RESPEITO PARA COM O ANIMAL o animal deve ser respeitado como um ser vivo, que sente dor, fome, sede e medo, para que possa ter assegurada a sua sobrevivncia; CUIDADO COM O MATERIAL o material caro e de difcil aquisio, alm de ser indispensvel para a execuo do trabalho. Assim, deve-se ter o mximo de cuidado com ele, a fim de se preserv-lo e t-lo sempre disposio; GOSTAR DO QUE FAZ outro importante requisito que o bioterista deve possuir, porque fazemos sempre melhor tudo aquilo que prazerosamente executamos.
SADE
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratrio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto National de Investigaes Agrarias/Ministrio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1983. STEPHENS, U. K. & PATTON, N. M. (Eds.). Manual for Laboratory Animal Technicians. USA: Ed. The American Association for Laboratory Animal Science, 1984. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFORE (UFAW) The Ufaw Handbook on The Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churcill Livingstone, 1986.
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Modelo animal
M odelo Animal
DEFINIO HISTRICO
Em primeiro lugar, definiramos modelo como algo que permite imitao ou reproduo. O prximo passo associar animal e modelo. O que seria um modelo animal?
Desde a mais remota Antigidade, o homem, levado pela curiosidade, tem tentado desvendar os mistrios do ambiente que o cerca. Nas cincias biolgicas o mesmo aconteceu. Os precursores da medicina adquiriram a maioria dos seus conhecimentos por meio da observao e utilizao de animais como cobaias. Por considerlos seres inferiores, o homem os utilizava para ampliar os seus conhecimentos e realizar experincias que de outra forma no seriam possveis. Com a expanso da espcie humana e de suas culturas pela Terra, o conhecimento cientfico se ampliou, passou a ser divulgado e escolas comearam a surgir. Tais escolas aceitavam alunos de outras partes do mundo, que depois retornavam a seus pases de origem e l continuavam a desenvolver e a disseminar os ensinamentos recebidos. exatamente nesse ponto que a noo de modelo animal comeou a tomar forma. Para que os experimentos pudessem ser reproduzidos e o trabalho continuasse, havia a necessidade de se utilizar o mesmo animal. Eis ento que o conceito de modelo animal surgiu: era aquele animal que melhor respondia ao experimento e possibilitava a sua reproduo, de maneira que qualquer pesquisador pudesse ter acesso aos mesmos resultados. Em virtude desse novo conceito, cada vez mais espcies foram trazidas para os laboratrios, pois havia aquelas que forneciam respostas satisfatrias, as que no eram modelos to bons e as que no sobreviviam ao cativeiro. A pesquisa cresceu e se refinou. Com isso, os modelos usados tomaram o mesmo caminho. No princpio, bastava capturar animais ou consegui-los de criadores; quando esses morriam, era s repor o nmero perdido. Com o curso da experimentao, conhecimentos sobre os animais utilizados comearam a se fazer necessrios e estes passaram a ser criados nos prprios laboratrios. O estudo de sua biologia e de seu comportamento corria paralelo ao experimento realizado. Os biotrios nasceram da necessidade de se ter os animais em nmero, idade e sexos adequados ao estudo em andamento, alm de facilitarem o alojamento, a manuteno e o transporte dos mesmos, j que, na maioria dos casos, a criao se dava no prprio laboratrio de experimentao. Conforme a necessidade de aumentar a quantidade ou de diversificar as espcies de animais, houve a urgncia de se separar os biotrios dos laboratrios de experimentao para que cada atividade pudesse ser realizada de maneira mais adequada. Com o estudo das diferentes espcies, o conhecimento sobre a sua biologia se expandiu e algumas comearam a ser mais utilizadas do que outras. Isso ocorreu graas a uma srie de caractersticas inerentes aos
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animais usados tais como: tamanho reduzido, ciclo reprodutivo curto, prole numerosa, precocidade, nutrio variada e adaptao ao cativeiro. Essas, entre outras, foram as caractersticas determinantes para a maior utilizao de algumas espcies. No incio do sculo XX, a cincia tomou grande impulso e, com ela, a cincia de animais de laboratrio comeou a progredir. Os roedores conquistaram um lugar de destaque, sendo os mais utilizados at hoje, pois atendem s caractersticas mencionadas antes e ainda apresentam outras, tais como: docilidade, fcil domesticao (= fcil manuseio), adaptao a ambientes variados e sociabilidade. Alm destas, algumas foram adquiridas ou fixadas, ao longo da sua utilizao, como o albinismo, que possibilita a marcao e visualizao de experimentos realizados na pele. preciso que se esclarea que o albinismo existe na natureza, mas o indivduo portador mais facilmente localizado pelos predadores naturais e dificilmente chega idade reprodutiva, de forma que a caracterstica no passada gerao seguinte.
CONCLUSO
Pelo grande conhecimento acumulado sobre os roedores, sua manipulao gentica foi um passo natural, e hoje, obedecendo ainda ao conceito de modelo animal, podemos dispor de animais muito mais adequados, j que seu genoma resultante de acasalamentos dirigidos, os quais realam determinadas caractersticas. O grau de sofisticao tanto que se pode afirmar existir, para cada experimento realizado, um modelo cuja resposta a mais adequada, e que esses modelos so facilmente encontrados, fazendo com que a pesquisa seja universalizada.
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tica na experimentao animal
E tica na Experimentao Animal

INTRODUO
Ekaterina Akimovna B. Rivera
tica a cincia da moral e tem relao com o certo e o errado; uma atitude cultural, crtica, sobre valores e posies de relevncia no momento de atuar. Como cientistas, no falaremos da tica sob o ponto de vista filosfico, mas sim da tica prtica ou utilitarista. Desde o fim do sculo passado, o homem est procurando adotar um novo ethos, um novo tipo de . Ele responsvel pelos bens da terra, e como tal est buscando comportamento e de tica perante a natureza. no explor-los aleatoriamente, mas sim preserv-los para as geraes futuras. Cabe lgica, e tica que dela provm, a explorao do que a natureza nos oferece. O homem tambm est repensando a cincia de um modo mais racional. Porm, no fcil pensar racionalmente sobre cincia quando a mesma envolve o uso de animais. Nesse caso, h muita emoo envolvida. O tipo de atitude de cada pessoa com relao aos animais depende de vrios fatores, muitos dos quais remontam ao incio de nossas vidas. Tambm a atitude das pessoas com as quais temos contato nos influencia; o modo de elas agirem faz com que tenhamos uma atitude de sensibilidade ou no para com os animais. Na cincia no diferente. Assim como h cientistas que valorizam a vida animal, considerando-os seres sensveis e procurando diminuir seus sofrimentos sempre que possvel, h outros para os quais os animais tm o mesmo valor que um vidro de substncia qumica usado em sua pesquisa.
TICA NO USO DE ANIMAIS

A cincia viveu, por muito tempo, sob a influncia filosfica de Ren Descartes. Este afirmava que os animais no tinham alma, eram autmatas e, portanto, incapazes de sentir ou de sofrer. No h dvida de que esse postulado era bastante conveniente para contestar qualquer alegao de crueldade nas pesquisas cientficas. Entretanto, os prprios trabalhos cientficos ajudaram a derrubar esse conceito. Charles Darwin, que chocou muitas religies com a sua teoria da evoluo, da relao homem/primata, ajudou no processo de demonstrar que o homem um animal e que, logo, as preocupaes morais com o homem deveriam se estender aos animais. Essa preocupao com a tica no uso de animais comeou antes de Darwin e j vinha se manifestando. No incio do sculo XIX, comearam a surgir movimentos que indicavam o desejo de mudar as atitudes que o homem tinha para com os animais, chegando mesmo a atingir altos graus de sentimentalismo, haja vista as pinturas de Landseer que mostravam ces velando o corpo de seus amos. Na Inglaterra, durante a poca vitoriana, vigorava um grande paradoxo em que se comeou a supervalorizar a vida animal e desvalorizar a vida humana. Crianas faziam trabalho escravo em minas de carvo sem que
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nenhuma atitude fosse tomada para acabar com isso, enquanto no Parlamento se tentava passar uma lei contra a crueldade para com animais, que posteriormente foi designada The Cruelty to Animals, 1875. Nesse processo de supervalorizao dos animais, os movimentos antiviviseccionistas tiveram importante papel. O que essas pessoas queriam era que a experimentao cirrgica fosse feita somente com anestesia, o que era possvel, j que as propriedades anestsicas do clorofrmio haviam sido descobertas. A primeira sociedade antiviviseccionista criada foi a Victoria Street Society, em Londres. Logo outras sociedades foram criadas, a Liga Alem contra a Tortura Animal, em 1879; La Societ contre la Vivisection, em 1882 etc. Todas essas sociedades continuam ativas at hoje e sabem explorar a mdia em seu favor. O problema que a maioria desses grupos formada por fanticos, com mtodos muito agressivos, que aprimoram cada vez mais seus ataques. Porm, devemos reconhecer que tiveram importante papel, pois alertaram os cientistas de que algo deveria ser feito para proteger os animais da crueldade e evitar seu sofrimento. Em 1926, Charles Hume fundou a sociedade University of London Animal Welfare (hoje, Universities Federation for Animal Welfare), numa tentativa de fazer com que os cientistas pensassem racionalmente sobre suas atitudes para com os animais. E no meio da briga em que se posicionavam cientistas versus antiviviseccionistas, estes a colocar o bem-estar animal em situao ridcula, Hume (apud Rempry, 1987) disse: o que o bem-estar animal precisa de pessoas educadas com cabeas frias e coraes quentes preparados para ver o sofrimento dos animais e procurando meios prticos de alivi-los. Em colaborao com outros cientistas, Hume publicou a primeira edio do Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals, em 1947, mostrando assim a preocupao, cientificamente embasada, com o bem-estar animal. um axioma o fato de que necessitamos dos animais, seja para pesquisas, trabalhos, diverso, companhia, alimentao. O homem, como animal superior, considera-se no direito de usar os outros animais, porm esse direito de usar inseparvel do dever de no abusar desse direito.
E OS ANIMAIS, TM DIREITOS OU NO ?
H posies extremas como a de Reagan, em 1976, o qual considera que qualquer associao homem/animal no de interesse para o mesmo, sendo, portanto, exploradora. Essa posio no aceita pela maioria dos filsofos. Nessa questo do direito dos animais, h no s diferenas de opinies como tambm diferenas devido aos sistemas legais dos pases, e nessa rea de atuao h dois deles que detm maior influncia no assunto os Estados Unidos e o Reino Unido. Nos Estados Unidos, o propsito da lei visto como a proteo dos direitos. Como existem leis para proteger os animais, mesmo contra seus proprietrios, resulta que os animais gozam de direitos. Em teoria, as leis podem proteger a vida de um animal, com base em que estes tm o direito de realizar seus propsitos naturais. Atualmente, porm, tais leis protegem os animais dos maus-tratos abusivos, de crueldades e de sofrimentos, no reivindicando outros direitos. Na Gr-Bretanha, as leis de proteo animal no so vistas como conferindo direitos aos animais, mas sim colocando deveres ao homem. As pessoas adultas capazes de responder por si mesmas possuem direitos legais, porque se presume que estas tm responsabilidade moral por seus atos. Nesse caso, os adultos teriam responsabilidade no s por si mesmos, mas tambm para com crianas, deficientes e idosos incapazes de responder por seus atos. Dentro da lgica desse pensamento, o homem tem deveres e no direitos sobre os animais. Esses deveres podem ser especificados e sustentados por lei, o que no implica que os animais tenham direitos prprios. E podemos citar o princpio de reverncia pela vida, preconizando que o homem deve proteger e cuidar de suas criaturas amigas, os animais. Como cuidar de nossos animais no caso de experimentao, j que sabemos que muitas vezes essa atividade decisiva para o conhecimento de fenmenos vitais, e que forosamente teremos de utiliz-los?
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tica na experimentao animal
A experimentao animal uma atividade humana com grande contedo tico. Os problemas ticos da experimentao animal surgem do conflito entre as justificativas para o uso de animais em benefcio de si prprios e do homem e o ato de no causar dor e sofrimento aos animais. Esse conflito inevitvel, e s pode ser tratado equilibrando-se os valores opostos. Quanto maior o sofrimento que um experimento ir causar aos animais, mais difcil a sua justificativa. No nada fcil tomar decises ticas. Podemos considerar como legitimamente ticos os experimentos em animais que sejam de benefcio direto para a vida e para a sade humana e animal. Tambm podem ser considerados como ticos, mesmo no sendo benefcios diretos, os que procuram novo saber que contribua significativamente para o conhecimento da estrutura, funo e comportamento dos seres vivos. Os experimentos com animais no so eticamente vlidos se houver mtodos alternativos fidedignos para o conhecimento que se procura. O princpio tico de reverncia pela vida exige que se obtenha um ganho maior de conhecimento com um custo menor no nmero de animais utilizados e com o menor sofrimento dos mesmos.
O PRINCPIO DOS 3 RS
Dois cientistas ingleses, Russell & Burch (apud Remfry, 1987), conseguiram sintetizar com trs palavras o Princpio Humanitrio da Experimentao Animal. Por sua grafia em ingls conter a letra R no incio de cada palavra Replacement, Reduction e Refinement , ficou definido como o Princpio dos 3 Rs. REPLACEMENT traduzido como Alternativas, indica que sempre que possvel devemos usar, no lugar de animais vivos, materiais sem sensibilidade, como cultura de tecidos ou modelos em computador. Os mamferos devem ser substitudos por animais com sistema nervoso menos desenvolvido. O Fundo para Alternativas ao Uso de Animais em Experimentao (FRAME, sigla original em ingls), fundado em 1969, no Reino Unido, procura encontrar novas tcnicas para a substituio dos animais em pesquisas. J surgiram vrias alternativas como, por exemplo, culturas de tecidos humanos para a produo de vacinas da plio e da raiva e testes in vitro para testar a segurana de produtos. Porm, h inmeras reas onde no possvel usar alternativas como pesquisa de comportamento, da dor, cirurgia experimental, ao de drogas etc. REDUCTION traduzido como Reduo; j que devemos usar animais em certos tipos de experimentos, o nmero utilizado dever ser o menor possvel, desde que nos fornea resultados estatsticos significativos. Atualmente, o nmero de animais usados em experimentao diminuiu porque utilizam-se animais com estado sanitrio e gentico conhecidos, bem como so feitos o delineamento experimental e a anlise estatstica antes de se iniciar a pesquisa ou teste. Os cursos ministrados sobre animais de laboratrio contriburam enormemente para a reduo no nmero de animais utilizados, pois ensinam como usar o menor nmero possvel deles. REFINEMENT traduzido como Aprimoramento, refere-se a tcnicas menos invasivas, ao manejo de animais somente por pessoas treinadas, pois uma simples injeo pode causar muita dor quando dada por pessoa inexperiente. Estamos ainda longe de atingir os 3 Rs. As farmacopias esto cheias de anomalias sobre o uso de animais empregados em testes. Exemplificando, se para um teste de insulina so suficientes 12 coelhos, porque ainda se utilizam 96 camundongos? Porque so mais baratos ou sero os camundongos menos sensveis? Atualmente, a maioria dos cientistas envolvidos com experimentao animal possui respeito pela vida e se preocupa em conduzir suas pesquisas sem causar dor e sofrimento aos animais, seguindo os princpios ticos da experimentao animal. Sabemos que no fcil policiar a pesquisa, pois esta realizada em laboratrios fechados e pode-se dizer que o uso tico de animais depende muito da integridade e conscincia de cada cientista.
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CONCLUSO
Falamos sobre a questo tica da experimentao animal e a inquietao de proporcionar-lhes bem-estar. Teramos, ento, condies de sensibilizar nossos colegas cientistas e todas as pessoas que trabalham com animais? Se isso for possvel, como se concretizaria tal atitude? Cremos que, em primeiro lugar, vem a educao, que pode ser adquirida por meio de palestras sobre tica, bem-estar, mtodos alternativos, aprimoramento, intercmbio de conhecimentos. Outra maneira de proporcionar educao incorporar cursos de experimentao animal ao currculo de graduao e ps-graduao de medicina, medicina veterinria, cincias biolgicas e reas afins. dever dos pesquisadores ensinar aos estudantes mais do que responder a uma pergunta cientfica. Precisamos ensin-los a pensar na validade do experimento, faz-los entender que seus trabalhos utilizam seres que possuem sensibilidade, sentem dor e medo tambm. Aos cientistas, devemos lembrar-lhes que tm deveres especficos:
responsabilidade
pelo bem-estar geral dos animais por isso devem conhecer muito bem a etologia e a biologia da espcie com que esto trabalhando para poder proporcionar bom alojamento, manejo, alimento etc. aos seus animais. Tambm devem dar treinamento ao pessoal com quem iro trabalhar; calcular meios e fins esse experimento necessrio? relevante? No ser o mesmo uma repetio desnecessria? How much gain for how much pain?; usar sempre os 3 Rs. O empirismo da experimentao animal, inevitvel quando dos albores da cincia, deve dar lugar a uma aproximao mais racional e, portanto, mais apropriada a uma cincia exata. Assim, no haver conflito entre os apelos da cincia e a obrigao de humanidade para com os animais.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REMFRY, J. Ethical aspects of animal experimentation. In: Laboratory Animals: an introduction for new experimenters. New York: Ed. Tuffery, 1987.
BIBLIOGRAFIA
ACADEMIA SUA DE CINCIAS. Ethical principles and guidelines for scientific experiments in Switzerland. Iclas Bulletin, 53:9-15, 1983. CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Laboratory Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Tcnicos em Bioterismo. 2.ed. So Paulo: Winner Graph, 1996. HOWARD-JONES, N. Cioms ethical code for animal experimentation. Iclas Bulletin, 57:29-36, 1986. RIVERA, E. A. B. tica e bem-estar na experimentao animal. Revista do Conselho Federal Medicina Veterinria, 1(1):12-15, 1992. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.
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Classificao de biotrios quanto finalidade
C lassificao de Biotrios quanto Finalidade

INTRODUO
Os biotrios podem ser classificados por trs critrios diferentes:
quanto
finalidade a que se destinam; quanto existncia ou no de uma rotina de controle microbiolgico (condio sanitria); quanto rotina existente de mtodos de acasalamento dos animais (condio gentica). Este captulo destinado ao primeiro critrio acima citado, enquanto os demais sero tratados nos captulos 8 e 9 deste livro.
QUANTO FINALIDADE A QUE SE DESTINAM

H trs tipos de biotrios, segundo esta classificao:
Biotrio
de Criao; Biotrio de Manuteno; Biotrio de Experimentao.
BIOTRIO
DE
C RIAO
Quando submetemos diversos animais a um determinado experimento, esperamos obter deles respostas as mais parecidas possveis, de modo que possamos comparar os resultados com a hiptese feita anteriormente. Para que os animais possam dar respostas similares, deveremos, por conseguinte, procurar controlar todas as variveis que esses animais possam ter. Assim, um biotrio de criao aquele onde se encontram as matrizes reprodutoras das diversas espcies animais que originam toda a produo e cujos objetivos visam a controlar e definir, antes do experimento, as seguintes caractersticas:
o
estado de sade do animal; sua carga gentica; o manuseio feito com o animal de modo a torn-lo dcil; a alimentao empregada; o ambiente adequado; outros fatores que possam ocasionar estresse, influenciando, assim, indiretamente, na resposta esperada.
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Para que todos esses objetivos sejam atingidos, um biotrio de criao necessita de uma edificao especialmente construda para tal fim, pessoal capacitado e uma rotina de trabalho bem definida. Certamente, essas medidas adotadas determinaro um biotrio de qualidade, com baixo ndice de transmisso de doenas e, conseqentemente, baixa mortalidade. O grande problema enfrentado pelas diversas instituies cientficas o alto custo que representa a construo e a manuteno desse tipo de biotrio. Porm, devemos lembrar que a preciso e a confiabilidade nos resultados de pesquisas ou produtos que incidem sobre a sade de uma populao no tm preo.
B IOTRIO
DE
M ANUTENO
Este tipo de biotrio tem duas finalidades especficas:
Adaptao do animal ao cativeiro

Nesse caso, o animal utilizado provm de fontes externas, tais como: os exemplos mais comuns so os macacos e tatus que so capturados diretamente na floresta. geralmente, as aves e animais de mdio e grande portes so adquiridos dessa forma. RUA os casos mais clssicos so representados pela aquisio de ces e gatos.
NATUREZA GRANJAS CONHECIDAS
Todos esses animais devem passar por um perodo de aclimatao para depois serem utilizados. Essa aclimatao visar a adaptar o animal ao ambiente de laboratrio, alimentao empregada, ao manuseio utilizado e ao controle de possveis doenas (quarentena).
Produo de sangue animal e fornecimento de rgos

Esta finalidade muito importante, visto sua necessidade na produo de meios de cultura, fixao de complemento, desenvolvimento de tcnicas cirrgicas em transplantes e em outras prticas biomdicas. Considerando que o sangue deve ser proveniente de animais sadios, alguns biotrios mantm, principalmente, os mdios e grandes animais para esse fim. No entanto, pequenos animais, como o coelho por exemplo, podem ser utilizados. Ao contrrio do biotrio de criao, o biotrio de manuteno tem um custo menor na aquisio e/ou manuteno de animais, sendo recomendado, especialmente, no caso em que necessria a conservao de espcies que no so utilizadas com freqncia. Esse tipo de biotrio pode fazer parte de um biotrio de experimentao sem necessitar de uma instalao em separado. Os principais problemas advindos dos animais mantidos nessas instalaes so: o risco de perdas acentuadas devido ao transporte e/ou m adaptao; caractersticas no definidas quanto ao estado de sade; desconhecimento do background gentico, ou seja, das caractersticas genticas dos antecessores da espcie e/ ou cepa ali mantida e risco de transmisso de doenas ao ser humano, como por exemplo, a raiva, as encefalomielites etc.
B IOTRIO
DE
E XPERIMENTAO
Para que o experimento feito no animal tenha o resultado esperado, necessrio controlar, ao mximo, os fatores que possam interferir, direta ou indiretamente, e s fazer variar aquelas caractersticas que se quer estudar. Assim, em um biotrio de experimentao se procura padronizar o ambiente, a alimentao e o manejo de acordo com as normas dadas pelo experimento.
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Classificao de biotrios quanto finalidade
Tal como o biotrio de criao, o biotrio de experimentao deve possuir uma edificao especialmente projetada, pessoal capacitado e uma rotina de trabalho bem definida, porm, neste caso, adaptada ao experimento. Quando se tratar de estudos de doenas potencialmente transmissveis ao homem (zoonoses), a estrutura desse biotrio, bem como a rotina de trabalho tero de, obrigatoriamente, oferecer barreiras transmisso de doenas para o funcionrio que trabalha no local.
RECOMENDAES
Nunca um biotrio de experimentao poder estar anexado ao biotrio de criao, pois o primeiro representa um enorme risco de contaminao para o segundo. O biotrio de criao dever estar sempre em uma situao independente quanto estrutura fsica, pessoal e material, em relao aos demais laboratrios da instituio, a fim de prov-lo de maior segurana e menor risco de contaminaes indesejveis. Qualquer animal que entrar em um biotrio de criao dever passar por um perodo de quarentena. Do mesmo modo, animais que chegam ao biotrio de experimentao tero de passar por um pequeno perodo de aclimatao antes de serem utilizados.
BIBLIOGRAFIA
SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratrio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto National de Investigaes Agrarias/Ministrio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1983. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 5th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1976.
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Instalaes e barreiras sanitrias
I nstalaes e Barreiras Sanitrias

INTRODUO
Sebastio Enes Reis Couto
Para criar ou manter animais de laboratrio necessrio que tenhamos instalaes adequadas, uma vez que suas necessidades bsicas devero ser atendidas, para que possam sobreviver e tenham assegurado seu desenvolvimento fisiolgico. Assim, tais instalaes devem possuir temperatura, umidade, ventilao e presso de acordo com as exigncias de cada espcie a ser criada ou mantida, e de acordo com a finalidade do biotrio.
INSTALAES
As instalaes de um biotrio devem ser projetadas de forma a atender s recomendaes para a criao e/ou manuteno de animais, bem como s necessidades particulares de cada instituio. Na escolha do local para a construo de um biotrio, devemos levar em considerao os seguintes aspectos:
no
devem haver fontes poluidoras nas proximidades (aerossis, rudos etc.); a rea deve permitir ampliao das instalaes e modernizao dos equipamentos. Uma instalao moderna deve ser constituda por um edifcio reservado para a criao animal e/ou experimentao, com total independncia de suas reas. Alm disso, deve ter tamanho suficiente para assegurar que no haja criao/manuteno de espcies diferentes em um mesmo ambiente. Como regra geral, recomendamos a seguinte distribuio de reas:
46% 14%
para sala de animais e quarentena; para circulao (corredores); 14% para depsitos (alimentos, materiais e insumos); 11% para higienizao e esterilizao; 8 % para laboratrio; 7% para administrao.
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Figura 1 Distribuio das reas de um biotrio
8% 11%
7%
46%
14% 14% Sala de Animais Circulao Laboratrio Depsitos Higienizao e Esterilizao Administrao
ESTRUTURA FSICA
A estrutura fsica deve possuir trs elementos bsicos: salas de animais, corredor de distribuio e corredor de recolhimento. As salas de animais devem estar compreendidas entre os dois corredores. O fluxo de acesso e retorno das salas de animais, efetuado por corredores independentes, permite diferenciar duas reas distintas:
aquela
destinada ao preparo do material a ser enviado para as salas de animais, incluindo o corredor de distribuio, denominada rea de preparo/corredor de acesso ou de distribuio de materiais, ou simplesmente rea limpa; o corredor de retorno das salas e a rea destinada higienizao e esterilizao de materiais provenientes das salas, denominada rea de limpeza/corredor de retorno e/ou de recolhimento, ou simplesmente rea suja. O fluxo de pessoal e de materiais deve ser feito no sentido unidirecional (rea limpa para rea suja). Numa tentativa de aumento da rea destinada aos animais, preconiza-se que mesmo biotrios de alto padro sanitrio podem operar com um corredor tanto para acesso e/ou distribuio quanto para retorno e/ou recolhimento. Todo o material a ser enviado para as salas de animais passa por autoclave de dupla porta e o material de retorno das salas sairia, tambm, pela autoclave. Associado a esses ambientes so de fundamental importncia, para uma boa operacionalizao, a existncia de um acesso independente para os bioteristas que trabalham na rea de criao, uma rea para materiais e insumos processados e uma rea de higienizao e desinfeco/esterilizao com acesso prprio, bem como um depsito de materiais e insumos no processados.
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Figura 2 Estrutura fsica e equipamentos

Depsito de Material rea de H igienizao X Corredor de Recolhimento
1
Sala de Animais Sala de Animais Sala de Animais Sala de Animais
T
rea de P reparo
Corredor de Distribuio rea de E stoque
Vestirio S S B B B Vestirio
Administrao
Laboratrio
Quarentena
Almoxarifado
1 2 3 4
Mquina de lavar gaiolas Autoclave Guich Cmara de xido de etileno
X T S B
Air lock ou autoclave T anque de imerso Tanque Sanitrio Box de higienizao
DETALHES DE CONSTRUO
OBS.: a seleo dos materiais a serem usados na construo do biotrio importante, medida que podem propiciar condies adequadas e um funcionamento eficiente e higinico, principalmente s reas destinadas aos animais. PISO deve ser liso, altamente polido, porm no escorregadio, impermevel, no absorvente, resistente a agentes qumicos (detergentes, desinfetantes, cidos etc.). Exemplo: Korodu. Tambm deve suportar o peso dos equipamentos sem apresentar rachaduras ou deformaes para que no permita o acmulo de sujidade ou sirva de esconderijos para insetos. PAREDES devem ser impermeveis, lisas e sem fendas. Deve-se evitar que as juntas com o piso e o teto formem ngulos agudos, pois dificultam a limpeza. O revestimento (pintura) deve ser resistente a agentes qumicos, bem como a lavagem tem de ser, preferencialmente, com gua sob presso. A adoo de medidas de proteo contra possveis danos provenientes de carrinhos e equipamentos sobre rodzios aconselhvel. Se possvel, devem ser tratadas acusticamente para se evitar a propagao de rudos. No aconselhvel o revestimento cermico (azulejos) em virtude das juntas. TETO deve ser de concreto plano, sem fundo falso, desfavorecendo a permanncia de formas de vidas indesejveis. O revestimento deve ser idntico ao das paredes.
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JANELAS nas salas de animais no deve haver janelas. Recomendamos visores equipados com dupla armao de vidro 4 mm, isolando o ambiente. PORTAS as portas e os marcos devem ser, de preferncia, metlicos, ou de madeira revestidas de material lavvel e resistente a agentes qumicos. Devem se ajustar perfeitamente aos marcos, de forma a impedir a passagem de insetos e animais indesejveis. aconselhvel que possuam visores para facilitar a visualizao do ambiente, bem como dos corredores, sem que haja a necessidade de abri-las. Devem ter, no mnimo, 1 m de largura por 2 m de altura, a fim de facilitar a passagem de equipamentos e materiais. CORREDORES devem ser amplos, com no mnimo 1,5 m de largura, para favorecer o trnsito de materiais e equipamentos. As juntas piso/parede/teto devem ser arredondadas, a fim de facilitar a limpeza e desinfeco. SALA DE ANIMAIS devem ser em nmero suficiente para abrigar somente uma espcie por sala, isto , numa sala deve ser criada ou mantida uma nica espcie animal. A rea recomendada de 3 m de largura por 6 a 10 m de comprimento, considerando a espcie e o nmero de animais, bem como os materiais a serem utilizados. REA DE RECEPO deve estar situada de forma que somente os animais que cheguem ao biotrio tenham acesso, e que estes no necessitem passar por outras reas. DEPSITOS as reas de estocagem de raes peletizadas e de materiais utilizados como cama (maravalha) devem ser ventiladas e secas, a fim de minimizar a proliferao de fungos e outras contaminaes. Em se tratando de alimentos perecveis (hortifrutigranjeiros), devem ser estocados separadamente das raes peletizadas e da maravalha, em ambiente adequado, em virtude da facilidade de deteriorao, decomposio e conseqente contaminao. REA DE HIGIENIZAO esta rea deve estar localizada de forma a no causar estresse aos animais e tcnicos. A ventilao deve ser suficiente para evitar odores, excesso de calor e vapor, que podem afetar outras reas. Autoclaves e outros equipamentos, como mquinas de lavar gaiolas, devem ser instalados nessa rea. Deve haver separao entre ambientes limpo e sujo. LABORATRIO DE CONTROLE DA QUALIDADE as atividades exercidas nesta rea subdividem-se entre os laboratrios de parasitologia, microbiologia, micologia, virologia, patologia e gentica, que podem estar localizados no prprio biotrio ou pertencerem a laboratrios de apoio dentro ou fora dos institutos de pesquisa. INSTALAES PREDIAIS o acesso s instalaes (hidrulica, eltrica etc.), que necessitam de manuteno ou conserto, deve estar localizado na rea suja, de forma que os tcnicos de manuteno no necessitem entrar na rea limpa. A drenagem (esgoto) deve ser provida de sistema que impea o refluxo de gua, gases e a penetrao de insetos ou outros animais.
CONDIES AMBIENTAIS
As condies ambientais de um biotrio devem ser adequadas a cada espcie e mantidas em nveis sem variaes. A manuteno de condies ambientais estveis assegura o padro sanitrio dos animais. O relacionamento dos vrios fatores que compem a atmosfera do biotrio, tais como temperatura, umidade relativa, ventilao, luminosidade e rudo, to interdependente que se torna praticamente impossvel estudlos separadamente, alm do fato de que so os principais fatores limitantes para criao e manuteno de animais de laboratrio.
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Para roedores e lagomorfos, os seguintes padres so recomendados:

temperatura umidade
de 18 C a 22 C (20 +/- 2); relativa de 45% a 55% (50 +/- 5); ventilao de 10 a 15 trocas de ar por hora (volume do ambiente). Para manter tais fatores nos padres recomendados, imprescindvel a utilizao de vrios aparelhos, formando um sistema de condicionamento do ar. LUMINOSIDADE de 500 luxes no teto da sala de animais e cerca de 150 luxes a um metro do piso, fornecida por lmpadas fluorescentes com o fotoperodo de 12 horas claro X 12 horas escuro, utilizando um timer. RUDO acima de 85 decibis (d) prejudicial aos animais de laboratrio. Rudos irregulares e inesperados produzem estresse, ao passo que os animais podem se adaptar a alguns rudos contnuos. Em salas de animais, recomendado de 50 d a 60 d.
BARREIRAS SANITRIAS
Visam a impedir que agentes indesejveis, presentes no meio ambiente, tenham acesso s reas de criao ou experimentao animal, bem como agentes patgenos em teste venham a se dispersar para o exterior do prdio. As barreiras de proteo de um biotrio compreendem vrios elementos, desde os materiais usados na construo at os equipamentos mais sofisticados para filtrao de ar ou esterilizao de materiais. Essas barreiras devem ser determinadas pela quantidade de animais, tipos de materiais, fluxos (de pessoal e de material), e sero mais sofisticadas quanto maior for a exigncia microbiolgica. O conceito de barreira inclui as barreiras externas, chamadas perifricas (paredes externas, portas com exterior, telhado, tratamento de gua etc.) e as internas (higienizao corporal, presso diferencial entre ambientes etc.). Assim sendo, barreira sanitria compreende todo um conjunto de elementos fsicos, qumicos, de instalaes, de procedimentos de pessoal e uso de equipamentos, que tende a impedir a entrada de enfermidades que possam afetar os animais.
F SICAS
AUTOCLAVE o principal equipamento utilizado na esterilizao de materiais e insumos. Essa deve possuir dupla porta, com intertravamento das mesmas, de forma a impedir que haja comunicao entre as reas limpa e suja. Esse equipamento utiliza o processo de calor mido para esterilizao em conseqncia da presso e do isolamento trmico, obtm-se temperaturas elevadas, podendo atingir at 135 C. De modo geral, recomendamos o ciclo de esterilizao de 121 C durante 20 minutos. Os materiais normalmente autoclavveis so: gaiolas plsticas, tampas de gaiolas, bicos, cama, uniformes, raes etc. ESTUFA DE ESTERILIZAO o processo de esterilizao por calor seco, que oxida as protenas. menos eficiente que a autoclave, pois o calor sem presso tem menos poder de penetrao. O tempo mnimo necessrio para a esterilizao de 60 minutos temperatura de 180 C. RADIAO a radiao ionizante, como a luz ultravioleta ou os raios gama, tambm destri o metabolismo dos microorganismos.
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A luz ultravioleta controla infeces transmitidas pelo ar e til para desinfeco de superfcies, porm possui baixa penetrao (no atravessa vidro transparente e objetos opacos). utilizada em guichs e/ou em air locks. Os raios gama so utilizados para alimentos e equipamentos cirrgicos e somente podem ser utilizados em estabelecimentos especializados. As fontes mais comuns so o cobalto 60 e o Csio 137. FILTROS PARA AR tm por finalidade reter materiais ou substncias indesejveis. Retiram impurezas do ar ambiente e, dependendo de sua porosidade, podem reter microorganismos em suspenso. No sistema de ventilao, recomendado o uso de pr-filtro com a funo de preservar o filtro terminal, retendo partculas maiores de 10 micras, bem como a de melhorar a eficincia do sistema. Para segurana mxima, o suprimento de ar deve ser feito por meio de filtros absolutos de alta atividade, onde a eficincia 99,997% na reteno de partculas maiores que 0,3 micra.
Q UMICAS
Um agente, para ser satisfatrio, deve ter capacidade de destruir todos os microorganismos na concentrao aplicada, deve permanecer em contato com o agente infeccioso o tempo suficiente para destruio e no deve deixar resduo. ESTUFA DE XIDO DE ETILENO semelhante a uma autoclave, porm com a cmara hermtica, por ser um elemento altamente explosivo quando em contato com o oxignio. O gs de xido de Etileno atua oxidando as protenas dos seres vivos presentes nos materiais, matandoos. Necessita de um ciclo longo para esterilizao e o material dever ser colocado em embalagem porosa para haver penetrao. Os materiais normalmente esterilizados nesse equipamento so os mesmos citados para a autoclave, com exceo de raes e cama, pois concentram esse gs que pode intoxicar os animais. Esse equipamento utilizado para esterilizao de materiais que no possam ser esterilizados pelo calor. GUICH E/OU PORTO DE PASSAGEM (entrada e sada de materiais) recomendamos que seja confeccionado na forma de um cilindro em PVC ou em ao inox, com no mnimo 45 cm de dimetro por 70 cm de comprimento. Tanto na extremidade externa (rea suja) como na interna (rea limpa) utilizada uma capa que funciona como porta e podem ser removidas, porm nunca ao mesmo tempo. TANQUE DE IMERSO possui comunicao entre a rea limpa e suja, porm deve ser construdo de forma que o nvel de soluo desinfetante impea a comunicao direta entre os dois ambientes. O perodo de desinfeco varia com o agente desinfetante utilizado e sua concentrao. Na desinfeco, o contato do microorganismo com o agente desinfetante muito importante, portanto devemos providenciar, para que isso ocorra com maior facilidade, a limpeza do material e a remoo de gorduras e matria orgnica. Os agentes desinfetantes no agem instantaneamente, necessrio um tempo mnimo de ao, e seu efeito tem durao limitada. O acmulo de matria orgnica e microorganismos mortos diminui a concentrao do desinfetante, reduzindo seu poder de ao. Por esse motivo, devemos substituir a soluo regularmente. Para evitar a resistncia de alguns microorganismos, recomendamos a troca peridica de desinfetante.
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Figura 3 Tanque de imerso
LADO SUJO
LADO LIMPO
SOLUO DESINFETANTE
PRINCIPAIS COMPOSTOS QUMICOS UTILIZADOS EM DESINFECO E ESTERILIZAO

CIDO PERACTICO atua rapidamente, porm uma pelcula de gordura suficiente para impedir sua ao, devendo-se ento fazer uma limpeza prvia do local a ser aplicado com detergente a 0,3% para dispersar as partculas de gordura. Uma soluo aquosa 0,1 destri esporos em 20 minutos, mas no atua sobre ovos de parasita. O cido peractico usado na esterilizao de isoladores e/ou em guichs e em materiais que no podem ser esterilizados por processo fsico. Na composio de cido peractico, cada 100 ml de soluo contm cido actico glacial, 88,22 ml, perxido de hidrognio a 30 volumes, 8,82 ml, e cido sulfrico, 2,96 ml, deixando em descanso 12 horas em geladeira antes do seu uso. Quando em estado lquido, corrosivo e inflamvel. Em dias especialmente quentes e no caso de forte aquecimento do lquido, formam-se misturas explosivas mais pesadas que o ar. O cido peractico mistura-se completamente com a gua e mesmo em grande diluio ainda corrosivo. Quando do manuseio do cido peractico, importante que o tcnico esteja protegido com avental, luvas de borracha e mscara respiratria contra vapores, evitando o contato direto com a substncia que pode causar irritaes nos olhos, nas vias respiratrias e srias leses de pele. FORMALDEDO utilizado tanto em desinfeco como em esterilizao, principalmente de ambiente. Apresenta, porm, a desvantagem de ter baixo poder de penetrao. altamente desidratante. FENOL E COMPOSTOS FENLICOS (fenol, cresol, timol) so utilizados como desinfetante geral, porm so altamente perigosos por serem irritantes e corrosivos. LCOOIS ETLICO E PROPLICO desinfetantes bsicos para pele, termmetros e materiais como pinas ou superfcie de mesas e estantes. Agem desnaturando protenas e na dissoluo da membrana lipdica. CLORO utilizado na desinfeco de guas. Tem a limitao de apresentar odor e sabor indesejveis quando utilizado em grandes concentraes. QUATERNRIO DE AMNIO desinfeco ambiental com baixo poder irritativo quando inalado. Atua como agente bactericida, viricida e fungicida. No , porm, esporocida. Recomendamos para uso em tanque de imerso numa diluio de 1%. HIPOCLORITO DE SDIO na diluio de 1%-2%, por 10 minutos, atua na desinfeco de superfcies em todos os ambientes. No deve ser usado em metal por ser corrosivo. A 5%, por 24 horas, atua na descontaminao de materiais com vantagem bactericida, porm corrosivo e instvel em gua. Deve ser usado imediatamente aps o preparo; inativado por matria orgnica.
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IODOS entre os halogneos, o iodo sob a forma de tintura (2% a 5%) um dos anti-spticos mais utilizados na prtica cirrgica. Os iodforos consistem de iodo combinado com agentes de superfcie, (detergente e geralmente cido fosfrico). Eles atuam rapidamente e tm baixa toxicidade para os tecidos; so desinfetantes e deixam resduos com efeitos antibacterianos. So utilizados em tanque de imerso. Quadro 1 Mtodos de esterilizao
MTODO Calor mido Calor Seco xido de Etileno com Vapor Formaldedo com Vapor Paraformaldedo em Tabletes cido Peractico Radiao Gama Radiao Ultravioleta Filtrao TRATAMENTO 121 C x 15 minutos 126 C x 10 minutos 134 C x 3 minutos 160 C x 45 minutos 170 C x 18 minutos 180 C x 7,5 minutos 190 C x 1,5 minutos 1.200 mg / litro a 80 C x 1-2 h 5 ml de formalina/ 0,03 m3 a 80 C x 1-2 h Despolimerizao de 5 g/m 3 a 20 C x 24h 2% x 20 minutos 1-5 Mrads APLICAO Rao, cama, gaiola de metal e de plstico, tampas de gaiolas, prateleiras, bebedouros, instrumentos cirrgicos. Instrumentos cirrgicos, tampas de gaiolas, gaiolas de metal, cama. Rao, cama, todo tipo de caixa, bebedouros, tampas de gaiolas, papel e livros, microscpios e outros equipamentos delicados. Salas, utenslios de limpeza. Cmaras para formol, salas, utenslios de limpeza. Isoladores e air lock. Rao, seringas embaladas, material cirrgico.
1.000-150.000 W/cm2 Sistemas simples de passagem de material. Filtro Hepa (99,997% de Sistemas de ventilao. eficincia para reteno de partculas < 0,5 )
Fonte: The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals (1986).
VALIDAO DE PROCESSOS DE ESTERILIZAO

A eficincia de qualquer mtodo de esterilizao deve ser comprovada periodicamente por meio de indicadores. Para tanto, cada ciclo de esterilizao deve ser registrado em um protocolo e em freqncia a ser determinada por cada biotrio. Para isso existem mtodos qumicos, biolgicos e fsicos. INDICADOR QUMICO baseia-se na temperatura de fuso de um elemento qumico quando atinge a temperatura. Indica somente que foi atingida a temperatura, no apontando o tempo em que o material esteve em contato com essa temperatura. Exemplos:
Enxofre:
funde-se a 119 C 120 C, usado como indicador em esterilizao por autoclave; cido Tartrico: funde-se a 170 C 180 C, usado como indicador de esterilizao por estufas. INDICADOR BIOLGICO so os mais aconselhveis, por se basear na resistncia de esporos de microorganismos resistentes a altas temperaturas. So colocados estrategicamente junto com o material a ser esterilizado; aps o processo, devem ser incubados em temperatura adequada para revelao se houve ou no inativao dos esporos. So indicados Bacillus stearothermophilus para esterilizao por vapor mido sob presso, e Bacillus subtilis para esterilizao por xido de etileno.
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INDICADORES FSICOS so aparelhos sensveis, colocados no interior da cmara interna das autoclaves para indicar as temperaturas atingidas. Por exemplo: termopares, registradores de temperatura, termmetro, microprocessadores etc. Os indicadores devem ser colocados no centro e nos quatro cantos (superiores e inferiores) da cmara interna do aparelho utilizado para esterilizao, seja por calor mido, seco, radiao gama ou xido de etileno. Os indicadores biolgicos apresentam como desvantagem o tempo necessrio para se obter o resultado do processo, tendo em vista que a leitura no imediata. O mtodo mais seguro de validao por microprocessador, uma vez que terminado o processo se obtm o registro de todas as temperaturas alcanadas, assim como o tempo.
Air
OUTRAS BARREIRAS Lock so pequenos ambientes, com presso positiva ou negativa, que tm por finalidade impedir a penetrao ou a sada de ar de um ambiente contguo, alm de dar maior segurana quando colocados entre sala de animais e corredor de recolhimento (sujo) no fluxo unidirecional. Quarentena as dependncias destinadas quarentena no requerem instalaes especiais, porm devem garantir o perfeito isolamento dos animais, uma rpida e eficiente higienizao e desinfeco, bem como facilidade para recolhimento e destruio de cadveres e dejetos. A quarentena deve ser localizada prxima rea de recepo e, alm disso, dispor de espao suficiente para abrigar somente uma espcie por ambiente. de Presso as diferentes reas de um biotrio (corredor de distribuio, salas de animais, corredor de recolhimento) devero ser dotadas de um gradiente de presso, a fim de impedir contaminaes. O fluxo do corredor de recolhimento para o corredor de distribuio dever ser completamente banido e as presses de ar devero ser sempre maiores nas reas limpas ou estreis em que se requer maior assepsia. Exemplo: Biotrio de Criao: Corredor de distribuio P1 Sala de animais P2 (P1 > P2 > P3) Corredor de recolhimento P3 Biotrio de experimentao: Corredor de distribuio P1 Sala de animais P2 (P1 > P2) Corredor de recolhimento P1 a utilizao de pinas para o manuseio de pequenos roedores tem por finalidade diminuir o contato do operador com o animal e permite uma desinfeco deste instrumento entre manuseio de animais de gaiolas diferentes.
Gradiente
Pinas
Filtro
para lquidos a filtrao pode ser feita por vrios processos. O mais utilizado por filtros porosos e sua eficincia depende das dimenses dos poros e do comprimento do canal filtrante, alm das propriedades eletrostticas. de ar equipamento que tem por finalidade impedir a penetrao do ar de um ambiente no controlado para um ambiente controlado.
Cortina
Higiene pessoal normalmente encontramos microorganismos associados ao nosso corpo que fazem parte de nossa flora microbiolgica normal. Os animais tambm possuem sua flora, que pode ser diferente da nossa. Dessa forma, quanto manuseamos o animal sem os cuidados necessrios, podemos transmitir uma srie de microorganismos patognicos a
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ele. Para evitarmos a contaminao dos animais por essa via, devemos tomar banho e vestir uma roupa estril (paramentao) antes de ingressarmos na rea de animais.
Procedimentos
visam a normatizar e uniformizar as atividades, tcnicas e fluxos de todos os elementos em um biotrio. No aspecto sanitrio, os seguintes procedimentos so recomendados:
retirada dos calados e colocao de outros, usados somente no biotrio, antes das reas de animais; retirada de toda a roupa de rua, dos acessrios de uso pessoal e higienizao corporal (banho); paramentao apropriada (calados, meias, macaco, luvas, gorro e mscara); as vestimentas e calados devem ser depositados em recipiente apropriado, antes de sair das reas de criao; no se deve comer, beber ou fumar nas reas de animais, rea de higienizao e depsitos; desinfeco de ambientes todas as reas envolvidas direta ou indiretamente com a criao devem ser rotineiramente limpas e desinfetadas. Essa desinfeco tem por finalidade evitar que agentes indesejveis, que tenham conseguido ultrapassar as barreiras, cheguem aos animais.
Em uma rea que no tenha animais e permita uma boa vedao, de grande eficincia a utilizao de formaldedo (35 ml de uma soluo de formalina a 10% para cada m3). Este deve agir por 24/48 horas com circulao de ar aps esse perodo. Na desinfeco de ambientes com animais, deve-se utilizar substncias inofensivas a estes. As mais recomendadas so lcool e a amnia quaternria. As mesas de trabalho e pias (se houver) devem ser desinfetadas imediatamente aps o uso. O piso deve ser higienizado e desinfetado diariamente. As paredes, tetos, visores, portas, luminrias etc., devem ser higienizadas e desinfetadas semanalmente. A acidificao da gua de bebida dos animais, atravs da adio de uma parte de HCl (36,5% a 38%) para trs partes de gua, resultando em pH 2,5 a 3,2, evita o crescimento de pseudomonas spp. Os bebedouros das gaiolas dos animais devem ser trocados a cada 48 horas. Estudos demonstraram que a contagem de coliformes em gua esterilizada nesses bebedouros excede o padro para gua potvel aps 24-48 horas de uso.
BIBLIOGRAFIA
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NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH). Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Maryland: National Research Council/Public Health Service, 1985. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Animales de Laboratorio: guia para instalaciones y cuidado de animales de laboratorio. Publicacion Cientfica n.158. Organizacin Panamericana de la Salud. Washington, D.C., 1968. SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratorio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias/Ministerio da Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1983. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.
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Equipamentos, materiais e insumos
E quipamentos, Materiais e Insumos

INTRODUO
Dada a especificidade das atividades desenvolvidas em um biotrio, necessrio se faz que tenhamos equipamentos e materiais com desenho apropriado para que possamos obter os resultados desejados. Uma das medidas fundamentais no manejo de animais de laboratrio a de proporcionar-lhes alojamentos cmodos dentro da rea exigida conforme a espcie. Para obtermos um padro de manejo ideal, necessrio se faz, antes de tudo, conhecermos alguns dos direitos desses animais, entre os quais se destacam: mant-los secos e limpos, conserv-los em um estado de relativa regulao trmica (conforme a espcie envolvida), oferecer-lhes espao suficiente para que possam se movimentar com certa facilidade, dot-los de alimentao e gua convenientes e, em ltima palavra, garantir sua sade e bem-estar. Para isso, necessrio que se utilize, em um biotrio, material especfico e convenientemente selecionado, que atenda aos seguintes princpios gerais:
limitar
ou evitar o contato entre o animal e o tcnico, visando ao conforto do animal; ser fabricado com material impermevel aos lquidos; ser resistentes corroso; no possuir rebarbas e bordas cortantes; ser desenhado e fabricado de modo a simplificar seu manuseio e manuteno, assim como a facilitar a limpeza e desinfeco; ser durvel e de fcil reposio; ser autoclavvel.
MATERIAIS DESEJVEIS EM UM BIOTRIO

em plstico (polipropileno ou policarbonato), usadas para camundongos, ratos e hamsters; gaiolas em plstico (polipropileno), usadas para cobaias e coelhos; tampas de ao inox, na forma de grade, com um rebaixamento para o interior da gaiola que serve de comedouro (usadas nas gaiolas para camundongos, ratos e hamsters); caixa em ao inox, tipo tabuleiro, com furos de 4 mm de dimetro, usadas para esterilizao de rao; frascos em plstico (policarbonato), usados para bebedouros; rolhas de borracha, tipo buna, usadas como tampa dos frascos (bebedouros); bicos em ao inox, usados nas tampas dos frascos (bebedouros); bebedouros automticos, ligados diretamente na rede hidrulica, com vlvulas que chegam em cada gaiola;
gaiolas
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suporte
de bebedouros para gaiolas de coelhos e cobaias; em ao inox, usados nas gaiolas para coelhos e cobaias; bandejas em ao inox, usadas sob a gaiola para coelhos, para coletar os dejetos dos animais; estantes em ao inox, sobre rodzios, para gaiolas de camundongos, ratos e hamsters. troiller estante em ao inox, sobre rodzios, para gaiolas de coelhos e cobaias; mesas em ao inox, sobre rodzios, para manuseio dos animais; caixas de papelo descartvel para transporte dos animais; carros em ao inox, tipo plataforma ou chassi para transporte de materiais; caixas em ao inox, tipo engradado para frascos (bebedouros); carros tipo cuba para transporte e depsito de rao.
comedouros
CARACTERSTICAS DESEJVEIS PARA AS GAIOLAS DOS ANIMAIS

serem
seguras, no permitindo fuga dos animais; permitirem, com facilidade, a observao do animal e sua alimentao; terem ventilao apropriada; serem higinicas e de fcil limpeza; serem confortveis, permitindo aos animais ampla liberdade em seus movimentos; permitirem fcil acesso aos alimentos e gua. Quadro 1 Espao mnimo recomendado para gaiolas dos animais de laboratrio e a temperatura em seu interior
ANIMAL Camundongo OCUPANTE Em crescimento Adultos Fmea c/ filhotes Em crescimento Adultos Fmea c/filhotes Em crescimento Adultos Fmea c/filhotes Em crescimento Adultos Fmea c/filhotes Em crescimento Adultos Fmea c/filhotes ESPAO POR ANIMAL (cm2) 65 100 160 150 250 800 100 150 900 300 650 800 3.700 4.600 7.400 38 ALTURA (cm) 13-15 TEMPERATURA
22-25
Rato
18
20-25
Hamster
18
21-24
Cobaia
16-20
Coelho
16-20
Fonte: Guide to the Care and Use of Experimental Animals (1980).
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CARACTERSTICAS DESEJVEIS PARA AS ESTANTES DAS GAIOLAS

estarem
apoiadas sobre rodzios, permitindo o deslocamento para higienizao e limpeza das salas; possurem distncia adequada entre prateleiras, possibilitando a retirada das gaiolas e bebedouros, facilitando a administrao da rao sem obstculos e com segurana; terem altura no superior a 1,80 m para que haja segurana na retirada das gaiolas que esto na prateleira superior; permitirem condies para incidncia de luz e exposio ventilao semelhante para todas a gaiolas. Figura 1 Estantes e gaiolas para criao de coelhos
Fonte: Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz.
EQUIPAMENTOS DESEJVEIS EM UM BIOTRIO

A UTOCLAVE
o principal equipamento de esterilizao de materiais e insumos em um biotrio. Este equipamento deve ter dupla-porta, com intertravamento das mesmas, de forma a impedir que haja comunicao entre reas de higienizao e estoque de materiais esterilizados.
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Figura 2 Autoclave de dupla-porta
I SOLADORES
Este equipamento, mais sofisticado que os demais, oferece maior segurana e tem sido utilizado, principalmente, para manter animais livres de germes e estudos de alto risco. Basicamente, constitudo de uma cmara de polivinil, normalmente em forma de paraleleppedo. Em uma de suas faces h um par de luvas para manipulao no interior e em outra face uma porto de entrada. Figura 3 Isolador flexvel com presso positiva
Fonte: Centro de Criao de Animais de laboratrio/Fiocruz.

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Nas laterais, instalam-se os filtros de entrada e sada de ar. A renovao do ar mantida atravs de um ventilador (isoladores com presso positiva) ou de um exaustor (isoladores com presso negativa). A introduo de insumos e materiais feita pelo porto com auxlio do cilindro de esterilizao, no qual os materiais foram previamente esterilizados. Para maior facilidade e segurana, utiliza-se a luva de transferncia que interliga o porto ao cilindro. A utilizao de isoladores com presso negativa em estudos de alto risco confere ao pesquisador um eficiente mtodo de segurana, alm de propiciar a vantagem de ter numa mesma sala isoladores com animais portadores de diferentes germes.
ESTANTE
COM
M ICROISOLADORES
um equipamento que permite o estabelecimento de sistema fechado de criao para cada microambiente, ou seja, para cada gaiola de animais. constitudo por dois motores, responsveis pelo insuflamento e a exausto do ar por meio de ductos com orifcios, para cada gaiola de animais, sob as prateleiras. O ar insuflado e/ou exaurido passa por dois filtros absolutos de alta atividade, onde a eficincia 99,997% na reteno de partculas maiores de 0,3 micra, que se encontram prximos aos motores e sobre as tampas de cada gaiola de animais. As gaiolas providas desse filtro permitem o isolamento do meio ambiente, dando segurana aos animais quando transportados. Utiliza-se uma capela de fluxo laminar para o manejo dos animais. Figura 4 Estante com microisoladores e capela de fluxo laminar
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F ORNO
DE
E STERILIZAO
um equipamento tambm utilizado em biotrio para materiais que no possam ser esterilizados por calor mido.
CMARA
PARA
EUTANSIA
Seu tamanho depende das espcies a serem sacrificadas e normalmente se utiliza o gs dixido de carbono (CO2). Este equipamento deve ter uma boa vedao para evitar que o gs atinja o meio ambiente. Deve ser dotado de um visor para que os animais possam ser observados durante o sacrifcio.
M QUINAS
DE
L AVAR G AIOLAS , F RASCOS
B ICOS
Existem muitos tipos dessas mquinas, desde as mais simples s mais sofisticadas (semi-automticas e totalmente automatizadas). Seu tamanho e capacidade dependem do tipo e do nmero do material a ser lavado. Figura 5 Mquina de lavar gaiolas de coelhos e cobaias
INSUMOS UTILIZADOS EM UM BIOTRIO

Denominamos insumos todos os elementos que entram na produo de determinado bem ou servio, tais como: rao, gua, maravalha e feno.
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R AO
A nutrio adequada constitui um dos fatores mais importantes para o animal de laboratrio, uma vez que oferece condies de atingir seu potencial gentico, de crescimento, de reproduo, de longevidade e de resposta a estmulos. Fornecer alimentao adequada s vrias espcies de animais de laboratrio envolve a formulao de dietas com concentraes requeridas de aproximadamente 50 componentes essenciais e a manipulao de numerosos fatores relacionados com a sua qualidade. O tipo de rao, sua biodisponibilidade (a quantidade de nutrientes que o organismo pode absorver e metabolizar), os procedimentos relacionados preparao e estocagem e concentrao de contaminantes qumicos so exemplos de fatores que exercem profundos efeitos no desenvolvimento animal. A maioria das espcies possui hbito alimentar complexo. Dessa forma, a dieta balanceada, isto , a rao industrializada, apresentada na forma de peletes, atende a todas as necessidades alimentares dos animais, e no deve ser suplementada. Assim, a utilizao de rao vantajosa, pois, alm de proporcionar nutrio adequada, de fcil manuseio e de melhor rendimento. Ao escolhermos uma rao para os animais, devemos verificar se produzida com ingredientes de boa qualidade e se a empresa produtora tem condies de fabricao que atendam s exigncias nutricionais e microbiolgicas. Outra preocupao que devemos ter quanto no-incluso de bacteriostticos e se h indicao do prazo de validade do produto e condies adequadas de armazenamento. As dietas so esterilizadas, geralmente, utilizando-se mtodos de calor mido ou por radiao.
Esterilizao por Calor mido

Normalmente feita em autoclave, a 121 C, durante 20 minutos. A rao deve ser acondicionada na autoclave, de modo a permitir que o vapor atinja todas as partes do material. Podemos utilizar caixas tipo tabuleiro com orifcios, embalagens microperfuradas (plstico ou papel) etc.
Esterilizao por Radiao

feita utilizando-se raios gama. Em termos de manuteno da qualidade nutritiva e segurana, esse o melhor mtodo de esterilizao e tambm o mais caro.
H IDRATAO
A gua um dos mais importantes componentes do organismo e a sua ausncia incompatvel com a vida. Dessa forma, imprescindvel que os animais de laboratrio tenham livre acesso a ela. As necessidades bsicas de gua variam em virtude da dieta (rao), condies ambientais e espcie animal. A gua oferecida aos animais deve ter os mesmos padres de qualidade de gua potvel para humanos, porm necessita de tratamento antes de ser oferecida, visando a impedir a veiculao de agentes e substncias nocivas que podem comprometer a qualidade sanitria das colnias. A freqncia da substituio da gua dos bebedouros reduz o desenvolvimento de microorganismos. Desse modo, quanto menor for o espao de tempo da sua substituio, menor ser o risco de ocorrer doenas nas criaes. H diferentes processos de tratamento da gua a serem administrados aos animais de laboratrio:
PROCESSOS QUMICOS acidificao atravs da adio de uma parte de HCl (36,5% a 38%) para trs partes
de gua, resultando em o pH 2,5 a 3,2, evita o crescimento de Pseudomonas spp;

PROCESSOS FSICOS
filtrao, esterilizao por autoclavao.
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Para adotarmos um desses processos, devemos considerar a eficincia e o custo em relao ao padro sanitrio dos animais que mantemos ou criamos. Quadro 2 Quantidade necessria de rao e gua animal/dia
ANIMAL ADULTO RAO (g) Quantidade Ingerida *Consumo (Ingerida + Desperdcio) 10 25 25 45 130 Quantidade Ingerida 3-7 20-45 8-12 60-75 240-300 GUA (ml) *Consumo (Ingerida + Desperdcio) 10 50 15 90 350
Camundongo 3-6 Rato 10-20 Hamster 7-15 Cobaia 20-25+Vit. C Coelho 75-100
C AMA
Os animais so mantidos em gaiolas em que o piso coberto por uma camada de maravalha (raspa de madeira picada), casca de arroz, bagao de cana-de-acar desidratado, sabugo de milho ou outro produto, dependendo da facilidade de obteno e do custo. Qualquer que seja o material escolhido para as camas, deve ser assegurado que as plantas que lhes deram origem no receberam inseticidas durante o cultivo. O material utilizado para cama tem por finalidade absorver a urina dos animais e a gua derramada no interior da gaiola, mantendo seu fundo sempre seco, bem como servir de isolante trmico para reduzir a conduo de calor do corpo dos animais atravs do fundo da gaiola. O material utilizado para cama dos animais deve possuir as seguintes caractersticas:
ser
incuo, isto , no ter sido tratado com substncias txica; no ser oriundo de madeiras resinosas; ter alto poder de absoro; permitir o isolamento trmico as propriedades isolantes diminuem com o aumento da umidade; ser confortvel para proporcionar sensao de bem-estar; ser desprovido de cheiro; ser facilmente descartvel vantajoso que o material possa ser incinerado, pois a cama poder estar contaminada (qumica ou biologicamente); ser facilmente transportado, manuseado e estocado (embalagens adequadas a estes fins). A cama, por estar em contato ntimo com os animais, fazendo parte do seu microambiente, deve ser tratada, evitando-se assim o aparecimento de doenas nas colnias. Seu tratamento consiste na autoclavao, 121 C durante 30 minutos, em embalagens que permitam a penetrao do vapor at a camada central.
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Quadro 3 Quantidade necessria de cama de madeira de pnus nas gaiolas e bandejas*

ANIMAL Camundongo Rato e Hamster Cobaia Coelho GAIOLA (mm) 300 x 195 x 120 410 x 340 x 175 900 x 600 x 300 900 x 600 x 30 (bandejas sob gaiola) QUANTIDADE (g) 60 100 1100 260
*Quantidade para troca de gaiolas e bandejas a cada 2 (dois) dias. Fonte: Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz.
FENO
A qualidade de um material ideal para ninho semelhante quela do material utilizado para cama, exceto que o animal deve ser capaz de construir um ninho adequado e o material no deve absorver a umidade, mas permitir que escorra para a cama absorvente, deixando que o ninho fique seco. O feno de capim cort-cross adequado para o ninho dos coelhos, oferecendo ao animal conforto e facilidade na construo do ninho. Tambm utilizado nas gaiolas das cobaias, juntamente com a cama de madeira de pnus, com o objetivo de ocup-las roendo este material, evitando, assim, que elas arranquem os plos umas das outras.
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1980.
BIBLIOGRAFIA
CENTRO DE DESENVOLVIMENTO E APOIO TCNICO EDUCAO (CEDATE). Programao Arquitetnica de Biotrios. Braslia: MEC/SG./Cedate, 1986. DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Tcnicos em Bioterismo. 2 ed. So Paulo: Winner Graph, 1996. LANE-PETTER, W. & PERASON, A. E. G. The Laboratory Animal: principles and practice. London/New York: Academic Press, 1971. 279p. MCSHEEHY, T. Laboratory Animal Handbooks no 7: control of the animal house environment. London: Laboratory Animals Ltd., 1976. MENNDEZ, R. C. Animales de Laboratorio en las Investigaciones Biomedicas. Habana: Editorial Ciencias Mdicas, 1985. NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH). Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Maryland: National Research Council/Public Health Service, 1985.
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ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Animales de Laboratorio: guia para instalaciones y cuidado de animales de laboratorio. Publicacion Cientfica n.158. Organizacin Panamericana de la Salud. Washington, D.C., 1968. SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratorio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias/Ministerio da Agricultura, Pesca y Alimentacion, 1983. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 5th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1976.
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Macro e microambientes
M acro e Microambientes
INTRODUO
O ambiente onde se encontra o animal dividido em macro e microambientes, sendo a gaiola o divisor entre os dois. Tudo o que se encontra do lado externo da gaiola constitui o macroambiente e tudo o que se encontra em seu interior constitui o microambiente.
MACROAMBIENTE
I NSTALAES
Sua arquitetura e manuteno adequadas influenciam diretamente no manejo. As reas destinadas aos animais devem ser isoladas fisicamente de laboratrios de controle ou experimentao e reas administrativas; alm disso, devem possuir estrutura que as torne prova de agentes infecciosos e vetores, como insetos e roedores silvestres. Elas compreendem as salas para as colnias de animais e as reas de apoio, como as reas de higienizao e esterilizao, salas de estoque de materiais limpos e insumos, corredores de acesso etc. A arquitetura influencia e define o trfego de animais e pessoal, o qual deve ser o menor possvel. Para isso, so estabelecidas as barreiras sanitrias, que, de acordo com as suas caractersticas, do a classificao do biotrio quanto ao seu status microbiolgico.
T EMPERATURA
UMIDADE R ELATIVA
A temperatura e a umidade relativa do ambiente so importantes para a manuteno da higidez animal. A temperatura costuma ser mantida pelo resfriamento ou aquecimento do ar que entra nas salas de criao, formando um complexo sistema de condicionamento de ar. A temperatura de conforto para pequenos roedores de 21 oC a 24 oC. As cobaias e os coelhos se adaptam melhor a temperaturas de 18 oC a 20 oC. A gaiola serve de divisor dos macro e microambientes, e sabido que a temperatura pode aumentar de 3 oC a 5 oC, no seu interior, assim como a umidade sempre mais elevada. As mudanas bruscas de temperatura costumam provocar estresse, com queda de resistncia e maior susceptibilidade s infeces. Temperaturas altas provocam queda na reproduo e at sua parada total, enquanto temperaturas baixas podem provocar afeces respiratrias. A umidade relativa tambm exerce importante papel no bem-estar animal. Com a liberao contnua de vapor dgua, atravs da respirao e pela evaporao da urina, a umidade dentro das salas tende sempre a aumentar, tornando-se necessrio um sistema que retire eficazmente o excesso de gua do ambiente. Esse
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processo realizado durante a troca de ar da sala, que deve ser regulada para que a retirada do vapor no seja excessiva, tornando o ambiente muito seco, o que provoca problemas respiratrios com ressecamento de mucosas e pele e o surgimento de feridas nos animais (a afeco denominada ringtail, nos ratos, conhecida por surgir em ambientes com baixa umidade). A umidade muito alta, entretanto, propicia problemas respiratrios. A umidade ideal para roedores e lagomorfos de 45% a 55%.
I LUMINAO
O fotoperodo (ciclo de luz/escurido) , sem dvida, um dos mais importantes itens que influenciam o ritmo biolgico do animal de laboratrio, atuando no seu comportamento e na reproduo. Sendo a maioria dos roedores animais noturnos, a luz fria lhes menos irritante do que a luz incandescente e a iluminao natural contra-indicada, j que no pode ser controlada. Perodos de luz de 12-14 horas/24 horas parecem ser os mais adequados reproduo dos animais e a sua manuteno.
V ENTILAO
FILTRAO
DO
AR
Um sistema de ventilao que produza trocas regulares do ar das salas de animais essencial para controlar a temperatura e a umidade, e diluir os possveis poluentes qumicos (resduos de desinfetantes usados na higienizao das salas). O nmero de trocas recomendado de 10 a 15/hora. A recirculao do ar requer um sistema que seja capaz de retirar do ar partculas de patgenos. A filtrao tem por objetivo a reteno de partculas de poeira e microorganismos, que poluem e contaminam o ambiente. A filtrao tima est em 99,97% de reteno de partculas acima de 0,5mm. As salas de criao devem possuir, ainda, um gradiente de presso diferenciado dos corredores para evitar soluo de continuidade com essas reas e possveis contaminaes. Em biotrios de criao, a presso do corredor de distribuio superior das salas, onde superior do corredor de recolhimento. Em infectrios, as presses dos corredores so superiores s das salas.
R UDO
O rudo, apesar de inevitvel, deve ser controlado para que no afete os animais, tendo em vista que, quando atinge nveis acima do tolerado, principalmente em roedores, provoca estresse, podendo levar a convulses e at morte. Os rudos tambm podem afetar o operador, sendo aconselhvel o uso de protetores em ambientes como as reas de higienizao e esterilizao. O nvel aceitvel de rudos de at 85 decibis.
A NIMAIS S ILVESTRES
VETORES
sabido que a transmisso de grande parte das doenas e zoonoses que afetam os animais de laboratrio se d por vetores ou animais silvestres. Impedir o seu acesso o papel primordial das barreiras sanitrias e do projeto das instalaes, mas tambm os tcnicos devem ser treinados de modo a eliminar a transmisso das zoonoses. Programas de desinsetizao e controle de roedores silvestres e pragas devem ser postos em prtica para evitar que, de alguma maneira, estes tenham acesso aos animais, ou aos equipamentos, materiais e insumos utilizados nas colnias.
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Macro e microambientes
GAIOLAS
Para roedores e lagomorfos, temos basicamente dois tipos de gaiolas: as de fundo slido e as de fundo perfurado. As primeiras so mais utilizadas por animais pequenos (camundongos, ratos, hamsters, gerbis, cobaias etc.); as de fundo perfurado so destinadas a coelhos. Geralmente, so fabricadas em metal ou plstico (policarbonato ou polipropileno) resistentes autoclavao. Quando de metal, o ao inoxidvel o mais indicado. Algumas vezes o ferro galvanizado tambm utilizado, mas elas se tornam menos durveis e os animais acabam por ingerir metais, principalmente o zinco, seja por lamberem os plos que encostam nas paredes das gaiolas e se impregnam com os elementos, seja por lamberem a prpria gaiola. Atualmente, as gaiolas mais utilizadas so feitas de plstico, por serem mais baratas, mais leves, bastante durveis e resistirem aos mtodos de esterilizao. O desenho das gaiolas deve ser tal, que no permita cantos vivos em seu interior, j que os animais tendem a roer qualquer salincia para tentar escapar. No caso dos pequenos roedores, as gaiolas seguem o desenho retangular e so fechadas por cima com uma tampa de ao inoxidvel, que permite a acomodao da rao peletizada e o frasco bebedouro. As tampas so muito importantes, porm restringem a ventilao, o que nos leva a considerar cuidadosamente a adoo de campnulas ou filtros por cima das gaiolas, uma vez que isso aumenta o nvel de amnia em seu interior. O ideal que tenhamos um sistema de ventilao forada para dentro das gaiolas.
MICROAMBIENTE
C AMA
A cama usada no fundo das gaiolas ou em bandejas, por baixo das gaiolas de fundo perfurado. Sua principal funo absorver a urina dos animais e aquec-los, alm de prover as fmeas com material para a construo de ninhos para abrigar as ninhadas, quando em contato direto com os animais. As caractersticas de uma boa cama so: alta capacidade de absoro de umidade, sem desidratar ou machucar os recm-natos; no conter poeira; no ser abrasiva; estar livre de agentes qumicos ou patognicos; ser de baixo custo e de fcil aquisio. O material para cama mais utilizado a maravalha (raspas de madeira) de pnus. A cama se constitui uma das mais importantes fontes de contaminao para os animais; por isso, deve ser sempre autoclavada antes de ser utilizada. Seu fornecedor deve ser idneo e garantir que no houve contato do material com roedores silvestres e/ou pssaros vetores das principais doenas que acometem os animais de laboratrio , alm de produtos qumicos como agrotxicos e resinas. A quantidade de cama a ser colocada na gaiola muito importante, j que pouca quantidade priva a fmea de material para a construo do ninho, levando morte dos recm-nascidos, e seu excesso pode gerar calor, aumentando a temperatura.
D ENSIDADE P OPULACIONAL
O espao requerido aquele onde os animais possam apresentar postura adequada e movimentao ou comportamento padro da espcie. Animais mantidos isolados ou superpopulados, por longos perodos, desenvolvem estresse.
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ODORES
O odor muito importante para os animais de laboratrio, uma vez que a identificao e o reconhecimento dos indivduos se faz pelo cheiro inato de cada espcie e atravs dos feromnios que machos e fmeas se encontram para a reproduo e delimitam os seus territrios. A esses odores, juntam-se a amnia da urina e outros odores, como o da rao, o dos tcnicos da sala etc. A troca dos animais das gaiolas sujas para as limpas interfere diretamente nesse universo. Deve ser observada cuidadosamente, pois devemos eliminar os odores irritantes (amnia) e os alheios espcie, mas no os , pois cada vez que o animal trocado, fabrica nova quantidade de feromnios e de outras substncias feromnios, para marcar seu territrio e atrair parceiros. A troca demasiada estressa o animal, que acaba produzindo essas substncias em excesso. A falta da troca faz com que a amnia e outros odores se concentrem em nveis intolerveis dentro das salas, prejudicando os animais e os tcnicos. Os odores devem ser removidos atravs de uma boa ventilao, com renovao do ar, e pela sanitizao dos materiais e equipamentos.
GUA
R AO
A gua oferecida aos animais deve ser microbiologicamente pura (esterilizada e acidificada), uma vez que se constitui importante fonte de contaminao. Deve ser trocada com freqncia, para evitar que se transforme em meio propcio proliferao de microorganismos existentes na boca do animal e que so passados aos bicos, juntamente com restos de rao, quando este bebe. Deve ser oferecida ad libitum em frascos bebedouros apropriados. Os frascos so de material autoclavvel e de preferncia transparentes. Os bicos, por onde o animal bebe, devem ser de ao inoxidvel e autoclavados antes de entrar em contato com os animais. Devem ser inspecionados para que no haja entupimentos, impedindo o acesso do animal gua. A rao ideal a industrializada, na qual o requerimento nutricional de cada espcie levado em conta na formulao, o que garante uma alimentao balanceada. A rao deve ser autoclavvel para evitar contaminaes. Tambm oferecida ad libitum, e a quantidade no consumida deve ser desprezada. Nos casos em que a rao fresca ou a complementao se fazem necessrias, os alimentos devem ser inspecionados e acondicionados em local apropriado, mas nunca em grandes quantidades, para se evitar a deteriorao.
BIBLIOGRAFIA
UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.
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Classificao dos animais de laboratrio quanto ao status sanitrio
C lassificao dos Animais de Laboratrio quanto ao Status Sanitrio

INTRODUO
Quanto mais uniforme os animais utilizados na experimentao, menor ser o nmero necessrio para atingirmos o padro de exatido ou receptibilidade. Por isso, os pesquisadores estabeleceram os animais como um dos mais refinados componentes da experimentao. Aps vrios anos de pesquisa, foram descobertas numerosas linhagens de animais consangneos e hbridos capazes de reduzir as variveis causadas por diferenas genticas e, mais recentemente, classificaram os animais quanto ao status sanitrio ou ecolgico, visando a prevenir erros induzidos por diferenas ambientais. A classificao dos animais quanto ao status sanitrio ou ecolgico pode ser definida como a relao dos animais com o seu particular e especfico ambiente. Este ambiente inclui os organismos associados aos animais e os organismos presentes dentro dos limites do ambiente fsico e barreiras sanitrias. O conjunto de organismos associados denominado microbiota (vrus, bactrias, fungos e parasitas), e quanto mais eficientes forem as barreiras sanitrias deste ambiente, menores as chances de contaminao dos animais. A partir dessa definio, podemos classific-los em trs grupos distintos:
Animais
Gnotobiticos; Animais Livres de Germes Patognicos Especficos (Specific Pathogen Free SPF); Animais Convencionais.
ANIMAIS GNOTOBITICOS
GNOTOBITICO palavra de origem grega (gnoto = conhecer + biota = vida) DEFINIO: so animais que possuem microbiota associada definida e devem ser criados em ambientes dotados de barreiras sanitrias absolutas. Outra definio comumente usada: so os animais que possuem flora microbiolgica conhecida, no existente ou no detectvel. A produo de animais desse padro sanitrio somente possvel mediante sua manuteno em equipamentos especiais, como isoladores. A evoluo tecnolgica dos isoladores permitiu o avano da gnotobiologia, cincia que teve incio com Pasteur, que questionava a sobrevivncia de organismos superiores na ausncia de bactrias. Nesse tipo de estudo, equipamentos como os isoladores so imprescindveis. Diferentes materiais foram utilizados no desenvolvimento das primeiras unidades, que evoluram para ao inox plstico rgido, acrlico, fibra de vidro etc. (Gustafsson, 1948). Porm, os isoladores rgidos apresentaram algumas dificuldades prticas e tcnicas
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(acomodao da presso etc.). O sucesso definitivo no avano tecnolgico dos isoladores somente foi alcanado em 1957, quando Trexler e Reynolds desenvolveram o isolador flexvel, mais adequado pela transparncia, que permite a viso total de seu interior e pela flexibilidade, que facilita a sua manipulao. Esse novo modelo permitiu o uso mais extenso dos isoladores com aplicabilidade prtica em diferentes reas, como em laboratrios de pesquisa, biotrios e at na indstria. O termo gnotobitico (vida conhecida) pode ser utilizado tanto para animais livres de germes como para aqueles contaminados com um ou mais organismos detectveis. Assim, em virtude da quantidade de microbiotas que estejam associados ao animal, este pode ser classificado como germfree (GF) ou Flora Definida (FD).
GERMFREE (GF)
DEFINIO:
so animais totalmente livres de microbiota, isto , isentos de quaisquer parasitas internos e externos, bactrias, fungos, protozorios, algas, richetsia e vrus. Um termo similar usado neste contexto animais axnicos (animais livres de vida associada).
Vrios animais tm sido criados e mantidos livres de germes, tais como: ratos, camundongos, cobaias, coelhos, galinhas, porcos, peixes, macacos, carneiros e ces. Embora com alguns desses animais no se tenha obtido sucesso em sua reproduo no ambiente GF, os camundongos e ratos tm respondido muito bem.
OBTENO: o mtodo primrio de obteno de animais GF, por meio da interveno cirrgica (histerectomia estril do tero gravdico) e sua subseqente introduo num isolador estril. Os embries em desenvolvimento so protegidos da contaminao pela barreira placentria, uma membrana semipermevel constituda de tecidos placentrios que limita o tipo e a quantidade de material trocado entre a me e os fetos no tero. Dentro desse ambiente protegido, os fetos so essencialmente descontaminados, mas, aps o parto, so geralmente expostos a vrios organismos. Para se obter camundongos GF, o problema est na preservao do estado virtual no-contaminado aps a perda da proteo da barreira placentria.
Para que os recm-nascidos possam sobreviver, o tero deve ser removido da camundonga grvida (fmea doadora) no perodo de 24 horas que antecede o parto. O perodo de gestao da camundonga varia em cada linhagem, mas geralmente seu limite fica entre 19 a 21 dias. Aps a morte da me doadora, mediante o deslocamento cervical, a parte ventral do abdmen preparada para a cirurgia. Inicialmente, faz-se a tricotomia e, ento, o corpo da fmea imerso numa soluo esterilizante ( temperatura corporal de 36 C a 37 C). Coloca-se o animal em uma bancada e sobre o abdmen uma tira adesiva de plstico estril. Uma inciso na linha mdia feita atravs do plstico e da pele. A seguir, abre-se a pele e o peritnio, expe-se o tero e liga-se prximo aos ovrios e na crvix com fio cirrgico ou com pinas hemostticas, cortando-o em seguida. Liberado o tero, este deve ser colocado em um recipiente contendo soluo esterilizante, com temperatura entre 36 C a 37 C, com o objetivo de proteger os filhotes em seu interior contra possvel contaminao e choque trmico. Logo em seguida, transporta-se para o interior de um isolador o recipiente com o tero, atravs de um tanque de imerso com substncia esterilizante, ou atravs do porto de passagem do isolador, utilizando substncia esterilizante (cido peractico), vaporizado com auxlio de um nebulizador acionado por corrente de ar comprimido. Uma vez dentro do isolador, remove-se o tero gravdico do recipiente e, ento, cuidadosamente, retiramse os filhotes, limpando-os e ativando-lhes a circulao e a respirao, mantendo-os aquecidos e ligados placenta por um pequeno perodo antes de remov-los para a gaiola da ama-de-leite. Os recm-nascidos obtidos assepticamente nos isoladores estreis tm a opo de usar uma ama-de-leite GF ou amamentao manual para mant-los.
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O parto da ama-de-leite deve ocorrer sempre um pouco antes da introduo do tero da fmea doadora para assegurar aos recm-nascidos a alimentao, j que estar em plena lactao. muito importante ter a certeza de que a ama-de-leite e os recm-nascidos no sejam perturbados por algumas horas, a fim de que sua . Para confundir o olfato da ama-de-leite, recomendamos o uso da prpria cama e/ou adaptao seja facilitada. da urina sendo colocada sobre os recm-nascidos, compelindo-a a aceit-los como seus prprios filhos. Se no houver nenhuma ama-de-leite disponvel, necessrio amamentar os recm-nascidos manualmente. Essa tcnica extremamente cansativa, trabalhosa e nem sempre bem-sucedida, tornando-se frustrante na maioria dos casos e sendo raramente utilizada. A maioria das colnias de GF obtida pelo mtodo de ama-de-leite. Estas podem ser obtidas em criaes comerciais e usadas para obteno de GF e de outra classificao ecolgica. O estado GF o primeiro degrau para atingirmos os animais de Flora Definida e SPF. Todo material (rao, gua, cama, gaiolas etc.) a ser introduzido no isolador deve ser esterilizado, porm podem ocorrer falhas na operao e materiais no-estreis que podem comprometer a qualidade dos animais. O fato de que algumas bactrias e muitos vrus so difceis de se cultivar ou detectar limita o grau ao qual o animal pode ser chamado de GF, assim como tambm os procedimentos operacionais para a obteno desses animais no so infalveis. Infelizmente, a barreira placentria no bloqueia toda contaminao. Alguns vrus, portanto, so conhecidos por transporem essa eficiente barreira. Um exemplo desse tipo de transmisso intrauterina ou vertical o vrus da Crio Meningite Linfoctica. Pollard (1966) indicou que os agentes da leucemia entraram na colnia pela barreira placentria ou pelo plasma seminal sem que tivessem certeza da rota. Se animais GF podem ser obtidos de colnias existentes que tenham sido testadas e so reconhecidas como livres de agentes que possam ser transmitidos verticalmente, as chances sero maiores de se alcanar o verdadeiro estado GF. Em qualquer nvel para a classificao desses animais, devemos test-los para uma ampla variedade de microorganismos, uma vez que os animais GF no so antgenos free. Existem organismos mortos mais intactos nos alimentos e na cama, diretamente associados aos animais e que esto sujeitos a numerosas estimulaes antignicas. UTILIZAO: apesar dessas limitaes, informaes suficientes foram utilizadas para fazer dos animais GF uma ferramenta adicional de pesquisa no estudo do cncer, da imunologia, das radiaes, doenas entricas, dentrias e nutricionais etc.
FLORA DEFINIDA (FD)

DEFINIO: so animais GF que foram intencionalmente contaminados com microorganismos ou parasitos especficos. So continuamente monitorados para constatar a presena dos organismos selecionados e a ausncia de outros. Tambm o termo monoxnico usado quando o animal foi contaminado, deliberadamente, com apenas um tipo de microbiota, o que equivale a dizer que possui um microbiota associado. Dixnico o termo designado ao animal contaminado, deliberadamente, com dois tipos de microbiota e polixnico relativo ao animal contaminado, deliberadamente, com vrios microbiotas. OBTENO: o primeiro passo para a obteno de animais de FD obter-se animais GF, uma vez que esse estado alcanado e confirmado por teste laboratorial. Qualquer nmero de microorganismos prselecionados pode ser administrado, de vrias maneiras, aos animais. Um dos mtodos adotados a transferncia dos animais GF do isolador para um equipamento de barreira restrita (outro isolador). Uma vez dentro desse equipamento, o animal GF pode ser alimentado com rao saturada com
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microorganismos especficos. Os animais nascidos nesse ambiente so contaminados por microorganismos atravs da amamentao, contato com a rao, com a cama e com as fezes de seus pais. Para maior confiabilidade, inoculamos cultura pura dos contaminantes selecionados, antes de retir-los do isolador. Depois que a flora selecionada estiver estabelecida, os animais devem ser testados e ento transferidos para outro isolador.
UTILIZAO:
a seleo da flora ideal depende do pesquisador que vai usar o animal. Uma quantidade considervel de pesquisa tem sido feita para restabelecer a relao entre a flora entrica selecionada e a taxa de crescimento, susceptibilidade infeco experimental e o efeito de endotoxinas.
ANIMAIS LIVRES DE GERMES PATOGNICOS ESPECFICOS (SPF)

DEFINIO: so animais livres de microorganismos e parasitos especficos, porm no necessariamente livres de outros no-especficos.1 Tambm denominamos Animais Livres de Germes Patognicos Especficos (Specific Pathogen Free SPF), ou heteroxnicos, aqueles que no apresentam microbiota capaz de lhes determinar doenas, ou seja, albergam somente microorganismos no-patognicos. Sua criao realizada em ambientes protegidos por barreiras sanitrias rigorosas, as quais podem ser resumidas do seguinte modo: cada vez que se entra nas reas onde se encontram os animais, os tcnicos devem tomar banho e utilizar uniforme esterilizado. Todo material a ser utilizado (peas do vestirio, rao, gaiolas, cama, gua, bebedouro e outros) deve ser esterilizado, seja por meio de autoclavao, cmara com gs esterilizante ou por soluo esterilizante em guich de passagem de materiais. Sua criao tambm pode ocorrer dentro de isoladores. OBTENO: animais SPF so obtidos e mantidos livres de contaminantes especficos (condies opostas dos animais FD, os quais so intencionalmente expostos a contaminantes especficos). Para se estabelecer uma colnia de animais SPF, animais GF so infectados com flora conhecida e nopatognica. Ento, o animal SPF alojado em um ambiente estril, porm no necessitando mais de isoladores. Os materiais utilizados para sua criao e manuteno podem ser transferidos para ambientes estreis, atravs de barreiras fsicas e qumicas. A freqente monitorao dos animais SPF absolutamente necessria, para se ter certeza de que os contaminantes indesejveis no se estabeleceram. A freqncia e a quantidade de amostras necessrias para essa avaliao devem ser padronizadas de acordo com a instituio. necessrio, no entanto, colher-se amostras ao acaso dos animais, materiais, equipamentos e do ambiente.
UTILIZAO: os animais SPF esto sendo cada vez mais utilizados, medida que os pesquisadores necessitam
de respostas mais confiveis e seguras de seus experimentos.
ANIMAIS CONVENCIONAIS
DEFINIO: so animais que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitrias rigorosas.
Nomenclatura recomendada pelo Comit Internacional de Animais de Laboratrio, em 1964. 62
Sua criao apresenta apenas princpios bsicos de higiene nos quais se procede somente limpeza e desinfeco do ambiente e material utilizado. Quanto ao pessoal tcnico, em geral, realiza-se apenas troca de uniforme (avental) para o trabalho com os animais. Por causa da dificuldade de uma definio precisa de animais convencionais, muitos mal-entendidos tm surgido entre diferentes centros e fornecedores de equipamentos. O mtodo para classificao desses animais consiste em definir que aqueles que no so germfree, Flora Definida, ou SPF, so arbitrariamente chamados de Convencionais. Por definio prpria, animais que no so espontaneamente infectados por alguns microorganismos patognicos so considerados convencionais, ao passo que animais infectados com todos os microorganismos tambm so considerados convencionais. Dessa forma, temos alguns animais mais convencionais do que outros, embora ainda se ajustem aos limites da nossa definio. Como problema prtico, muitas vezes a escolha do grau convencional dos animais depende primariamente de dois fatores:
origem
dos animais; condies sob as quais os animais so mantidos durante a experincia. Obviamente, o que se pretende fazer com os animais a chave para o problema. Isto , no faz sentido pedirse animais SPF e coloc-los diretamente num ambiente altamente contaminado. O processo de receber os animais tambm importante. Quarentena e testes so necessrios quando os animais convencionais so recebidos, a menos que o investigador queira aceitar qualquer infeco que esses animais possam ter. Enquanto outra classificao ecolgica requer sistemas especiais de estrutura fsica, o prdio para colnia de animais convencionais varia desde as possveis barreiras sanitrias at espaos sem ventilao e iluminao. claro que esses extremos do ambiente podem ser tolerados pelos animais convencionais porque estes j se encontram de alguma forma resistentes. A maioria dos animais usados em pesquisa, nos ltimos 30 anos, tem sido convencional. Eles so relativamente mais baratos para se produzir e manter, so adequados propriamente a determinados experimentos e tm sido usados praticamente em todo tipo de pesquisa, desde a gentica at a cirrgica.
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Classificao dos animais de laboratrio quanto ao status gentico
C lassificao dos Animais de Laboratrio quanto ao Status Gentico

INTRODUO ANIMAIS NO-CONSANGNEOS OU OUTBRED
Os animais de laboratrio podem ser classificados em dois grandes grupos: no-consangneos, outbred ou heterognicos, e consangneos, inbred ou isognicos. Aos inbred, foram acrescentados os hbridos, congnicos, mutantes e animais engenheirados, como, por exemplo, os transgnicos.
So animais que apresentam na constituio gentica uma alta heterozigose (99%), o que faz com que seja mantida numa mesma colnia uma grande diversidade gentica (vrios alelos), possibilitando a reproduo de populaes naturais.
ANIMAIS CONSANGNEOS OU INBRED

Um animal consangneo o produto de 20 geraes consecutivas do acasalamento entre irmos, ou pais e filhos. Utilizando esse tipo de acasalamento, conseguimos obter um ndice de homozigose de 99%, o que torna tais animais os mais idnticos possveis que se pode obter. Para cada 50 mil ou mais genes que um camundongo possui, 99% apresentam o mesmo alelo em dose dupla. Isso significa que cada linhagem consangnea apresenta um conjunto nico de caractersticas que as diferencia entre si. Esse conjunto de caractersticas, que constitui cada linhagem, composto de genes que sofrem menor ou maior grau de influncias ambientais. Por isso a manuteno dessas linhagens deve ser feita de maneira rigorosa, de modo que as variaes, atravs das geraes, sejam mnimas. A propagao de uma linhagem sempre tenta diminuir ao mximo a divergncia gentica, o que faz com que todos os animais mantidos em um biotrio de criao estejam ligados a um ancestral comum por um intervalo mnimo de geraes. O aparecimento desses animais ocorreu no comeo do sculo XX, com os estudos de herana de cor em camundongos, realizados por Clarence C. Little. Aps o surgimento da linhagem de camundongo denominada DBA, pesquisas em cncer fizeram surgir outras linhagens; as mais utilizadas at hoje datam dessa poca. A maioria das linhagens se desenvolveu para tentar provar a existncia de fatores genticos que influenciassem a herdabilidade do cncer e a independncia dos diversos tipos de cncer dentro de famlias.
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Por meio da seleo feita durante o processo de construo das linhas consangneas, vrios tipos de cncer surgiram, com freqncias previsveis, e foram incorporados ao genoma dos animais. Quando as primeiras linhas se tornaram disponveis e suas informaes relatadas em publicaes cientficas, os pesquisadores descobriram que elas podiam ser muito teis na pesquisa biomdica. O uso de material biolgico uniforme e confivel possibilitou que as nicas variveis fossem aquelas que o pesquisador introduzisse, o que diminua o nmero de animais usados e a necessidade de repetio do experimento. Durante o desenvolvimento das linhas inbred, no s o estabelecimento de padres de cores ou cnceres foi determinado, mas outras doenas constitucionais e estados patolgicos anlogos aos do homem foram se fixando, j que tambm eram influenciados por genes, o que tornou esses animais modelos nicos para o estudo de doenas humanas. Com o surgimento das inmeras linhagens, alguns pesquisadores se deram conta do potencial dos hbridos F1 (produto do cruzamento entre duas linhagens consangneas), j que esses animais so geneticamente homogneos e heterozigotos para aqueles pares de genes em que as linhagens parentais diferem entre si. Suas respostas so to uniformes quanto s das linhagens consangneas e os animais so mais vigorosos, crescem mais rpido e sobrevivem mais tempo. Alm disso, tais animais aceitam transplantes de tecidos de ambas as linhagens parentais.
SISTEMAS DE ACASALAMENTO
As caractersticas que constituem um indivduo so de carter gentico e ambiental. Os investigadores que utilizam animais se preocupam com o controle de ambas as fontes de variao. Algumas das caractersticas ambientais podem ser controladas pela padronizao do manejo e das instalaes onde se encontram os animais. As caractersticas genticas so controladas pelo sistema de acasalamento apropriado para a colnia. O propsito de um sistema de acasalamento preservar ou controlar as causas genticas para determinada caracterstica. Se tivermos uma populao de tamanho infinito em condies ambientais especficas, o acasalamento ao acaso, sem a presena de seleo ou mutao, vai manter a mdia e a variao de todas as caractersticas quantitativas constantes. O inbreeding subdividir essa populao em subpopulaes, nas quais a mdia aumentar ou diminuir e a variao gentica se reduzir. O outbreeding (acasalamento entre diversas populaes) far a variao gentica aumentar e mudar a mdia. Acasalamentos seletivos de iguais aumentaro, diminuiro ou mantero constante a mdia, dependendo da direo da seleo adotada, e diminuiro a variao gentica, sem necessariamente elimin-la. Se, ao contrrio, mantivermos o acasalamento entre animais os mais diferentes possveis, a variao gentica ser grande. A combinao da consanginidade com sistemas de seleo deu aos geneticistas mtodos de controle das caractersticas herdveis dos animais de laboratrio.
A CASALAMENTO
AO
A CASO
Em princpio, o acasalamento ao acaso aquele em que a chance de se acasalar um macho qualquer da populao com uma fmea qualquer da populao seja igual para todos os animais. Em termos numricos teramos: 1/m X 1/f = 1/mf m = nmero de machos f = nmero de fmeas Em grandes populaes, o acasalamento ao acaso preserva os genes e as suas freqncias ao longo das geraes desde que no haja seleo ou mutaes ocorrendo (Lei de Hardy-Weinberg).
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Em populaes finitas, o resultado obtido um pouco diferente, j que haver perda de alelos e fixao de outros, o que resultar em homozigose. A velocidade com que a homozigose se instala na colnia depender basicamente do nmero de unidades reprodutivas existentes, sendo inversamente proporcional a esse nmero. Outro fator a considerar que no se mantm populaes de laboratrio sem seleo, mutao ou variaes ambientais, o que tambm resulta em variao gnica e de freqncias. Com base em tais fatos, vrios sistemas de acasalamento ao acaso foram desenvolvidos para minimizar os efeitos da seleo e do ambiente. As mutaes so impossveis de serem evitadas. Entre os sistemas desenvolvidos, o fator de importncia o nmero de animais que se quer manter em reproduo. Para colnias com 10 a 25 unidades reprodutivas, o sistema mais utilizado o que evita ao mximo a consanginidade (consanginidade mnima), em que o princpio bsico diz que cada macho acasalado contribui com um macho, e cada fmea acasalada, com uma fmea, para a gerao seguinte. Para que esse sistema possa ser posto em prtica, todos os animais devem ser acasalados ao mesmo tempo, no havendo, assim, sobreposio de geraes. Esse mtodo mantm a consanginidade em menos de 1%. Para colnias, onde o nmero de unidades reprodutivas de 25 a 100, o sistema mais utilizado o rotacional. O principal objetivo o de evitar o acasalamento de parentes prximos e assegurar que a prxima gerao venha de um espectro mais amplo de pais do que ocorreria se fosse ao acaso. Sem esses sistemas poderamos selecionar inadvertidamente matrizes de somente um pequeno segmento da populao, limitando e alterando a sua freqncia gnica ao longo das geraes. Tais mtodos so empregados onde existe uma contnua substituio das colnias sem distino entre as geraes. A colnia subdividida em grupos e os acasalamentos so arranjados entre estes de maneira sistemtica. A escolha dos animais para o acasalamento feita dentro do grupo, seguindo critrios prprios a cada colnia. Temos vrios exemplos de sistemas rotacionais, dentre os quais podemos destacar dois:
Mtodo Poiley
A colnia subdividida de 3 a 12 grupos e quanto menor o nmero de unidades reprodutivas, maior o nmero de grupos formados. Os acasalamentos seguem esquemas predefinidos e podem ser realizados de acordo com as necessidades de reposio de cada grupo. Exemplo: Fmea
1 2 3 GRUPO A FORMAR 3 1 2 Macho 2 3 1
Mtodo Falconer
tambm um sistema rotacional, em que a colnia subdividida em grupos e, em vez de embaralharmos os novos grupos a serem formados, fixamos um dos sexos e rotacionamos o outro. Exemplo: Fmea
1 2 3 GRUPO A FORMAR 1 2 3 Macho 2 3 1
Para colnias em que o nmero de unidades reprodutivas superior a 100, o sistema recomendado o mtodo ao acaso. Os animais so escolhidos ao acaso, de toda a colnia, e seu parentesco no observado. A desvantagem que alguns animais aparentados podem ser acasalados, mas como a colnia muito grande, o seu ndice de homozigose no se eleva rapidamente.
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ACASALAMENTO CONSANGNEO
O sistema de acasalamento de irmos da mesma ninhada o mais fcil para a manuteno das caractersticas da linhagem consangnea. Entretanto, animais com caractersticas individuais podem ser selecionados para acasalamento, a fim de fixarmos essas caractersticas na linhagem, ou quando estamos desenvolvendo uma nova linhagem. Partindo-se de um nico casal, representante da linhagem escolhida, acasalamos todos os irmos, de todas as ninhadas. medida que a colnia cresce, comeamos a selecionar quais os melhores casais e passamos a s acasalar irmos de ninhadas provenientes desses casais. A colnia cresce at o mximo de 20 casais e, a partir da, s fazemos a reposio de casais quando ocorre descarte zootcnico ou morte. Aps trs geraes consecutivas, escolhe-se um novo casal para rederivar a colnia, de maneira que possamos traar uma nica linha no pedigree dos casais atuais at o casal ancestral comum. Com esse cuidado, evita-se o distanciamento dos animais em reproduo com o ancestral comum mais prximo e evita-se tambm que a colnia de fundao tenha animais de vrias geraes distintas concomitantemente. Como se pode concluir, aps o estabelecimento de uma linhagem consangnea, para que a homozigose continue atravs das geraes, os reprodutores devem ser acasalados indefinidamente, entre irmos ou pais e filhos, e essa a razo para que as colnias de fundao de uma linha consangnea tenham um reduzido nmero de casais, j que um maior nmero de reprodutores significaria maior chance de fixao de mutaes que porventura ocorressem durante a manuteno dessas colnias.
MUTANTES
As linhagens inbred podem se manter indefinidamente, desde que as regras de acasalamento entre irmos sejam seguidas. O nico problema so as mutaes naturais que ocorrem espontaneamente ao longo do genoma. Independentemente do background gentico onde a mutao tenha ocorrido, sempre interessante traz-la para uma linhagem consangnea, a fim de comparar os efeitos do alelo mutante sem a interferncia de outras combinaes gnicas. Isso pode ser feito por trs sistemas de acasalamento especficos: BACKCROSS se a mutao for dominante ou se a mutao for recessiva e o homozigoto recessivo for invivel ou infrtil. Seleciona-se uma linhagem inbred para onde se vai transferir a mutao. O animal mutante acasalado com um animal inbred e seu produto acasalado com a linhagem inbred. O produto desse acasalamento tambm acasalado com a linhagem inbred e assim se sucedem as geraes. Aps a stima ou oitava gerao, podemos comear o acasalamento entre irmos, at 20 geraes, para o estabelecimento de uma nova linhagem. Se a mutao recessiva for invivel, somente os heterozigotos sobrevivero e teremos de testar os animais para identificar quem homozigoto com o alelo vivel (linhagem inbred parental) e quem heterozigoto. Os acasalamentos podem ser feitos entre dois heterozigotos ou entre heterozigoto e a linhagem inbred parental. Se o homozigoto recessivo for infrtil, o procedimento de acasalamento o mesmo descrito anteriormente, somente tendo-se o cuidado de testar todos os trs tipos de animais produzidos para no perdermos tempo acasalando animais infrteis. Esses cuidados tornam-se necessrios quando no se consegue distinguir fenotipicamente os mutantes recessivos. CROSS-INTERCROSS se a mutao for recessiva. Os animais homozigotos recessivos mutantes so acasalados com um animal inbred de uma linhagem selecionada. Sua prognie, heterozigota, acasalada entre si para que possamos recuperar o mutante em
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homozigose. Esses mutantes homozigotos so usados para um novo acasalamento com um animal inbred da linhagem selecionada. Os ciclos de dois acasalamentos so realizados por oito vezes, quando ento o ndice de homozigose da nova linhagem formada estar em 99%, se houve um linkage fraco; ou 23 vezes, para alcanarmos 99% de homozigose na nova linhagem, se o linkage for forte. CROSS-BACKCROSS-INTERCROSS se a mutao for recessiva. Os animais homozigotos recessivos mutantes so acasalados com um animal inbred de uma linhagem selecionada e o produto acasalado com a linhagem inbred parental. Os produtos so acasalados entre si e o homozigoto recessivo mutante, depois de identificado, acasalado com a linhagem inbred parental. Quatro ciclos de trs acasalamentos so suficientes para elevar o ndice de homozigose da nova linhagem at 99% se o linkage for fraco, mas se o linkage for forte, sero necessrios 23 ciclos. As linhagens inbred tm contribudo sobremaneira no estudo da resposta humoral e na oncologia, assim como tm ajudado a elucidar o componente gentico de vrias doenas como a obesidade, o diabetes etc. Esses animais tiveram um incremento em sua criao a partir da Segunda Guerra Mundial, quando o estudo dos efeitos das radiaes passou a ser mais estudado. Muitos camundongos consangneos foram submetidos a irradiaes e depois acasalados. Os mutantes resultantes desses acasalamentos foram selecionados e reacasalados com representantes da linhagem parental ou de outras linhagens, constituindo as linhas congnicas, que, por definio, diferem da linhagem original apenas pelo par de genes introduzidos. Na realidade, o que introduzido no novo background uma pequena poro do cromossomo, onde se encontra o gene importado. Quando a mutao se d por processos de seleo natural, dizemos que a linhagem coisognica. Com isso, um enorme passo foi dado, pois alelos existentes em uma linhagem ou criados por mutagnese (irradiaes ou substncias qumicas) poderiam ser transferidos para todos os backgrounds existentes, o que permitiu estudar o efeito daquele alelo em diferentes ambientes gnicos. O estudo dos genes do complexo de histocompatibilidade, que regulam a resposta imune, muito se beneficiou e se desenvolveu com isso. Atualmente, a maioria das linhagens congnicas existentes tem sua origem em linhagens cujo gene importado pertencia a esse complexo.
HBRIDOS
So animais provenientes do acasalamento entre duas linhagens inbred. Isso feito quando se quer obter animais heterozigotos para determinado par de alelos que se quer estudar. Utiliza-se duas linhagens que sabidamente possuem alelos diferentes para o gene em questo. Os animais produzidos so mais vigorosos e a prole costuma ser mais numerosa. O inconveniente que esses animais s podem ser reproduzidos a partir do cruzamento de linhagens consangneas, o que nos obriga a mant-las para poder produzir os hbridos de interesse.
LINHAGENS INBRED RECOMBINANTES

So animais derivados pelo acasalamento ao acaso dos hbridos e, ento, continuamente acasalados entre irmos por 20 geraes consecutivas para a formao de novas linhagens consangneas.
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ANIMAIS TRANSGNICOS
Animais que carregam incorporado, em seu genoma, um segmento de DNA de outra espcie.
MTODOS DE ACASALAMENTO
A CASALAMENTO M ONOGMICO
Neste tipo de acasalamento, mantm-se um macho para uma fmea, na gaiola, em carter permanente. As vantagens desse mtodo so o aproveitamento do cio ps-parto, registros melhores e mais detalhados, levantamento de ndices mais acurados j que os animais so identificados individualmente e ninhadas mais homogneas. A principal desvantagem a necessidade de maior nmero de gaiolas e de espao para a produo dos animais.
A CASALAMENTO P OLIGMICO ( HARM )

Neste acasalamento, mantm-se um macho para duas ou mais fmeas. Pode ter carter permanente ou temporrio. No primeiro caso, as fmeas grvidas so retiradas para gaiolas-maternidade e aps o desmame da ninhada retornam para a gaiola do mesmo macho. Nesse sistema, precisamos de um grande nmero de gaiolas, j que as fmeas de um harm no podem ser misturadas com as de outro. No segundo caso, todas as fmeas grvidas so retiradas e colocadas em gaiolas-maternidade, independentemente da sua procedncia. Aps o desmame da ninhada, as fmeas retornam para harns onde haja disponibilidade de vagas. Nesse caso, o nmero de gaiolas-maternidade se reduz, mas os registros se tornam menos precisos.
BIBLIOGRAFIA
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Criao e manejo de cobaias
C riao e Manejo de Cobaias

ORIGEM
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A cobaia, coelhinho, porquinho da ndia ou Cavia porcellus, um animal muito verstil que tem servido ao homem de muitas maneiras (na alimentao e na pesquisa). Os antepassados desses animais, que so hoje utilizados no mundo inteiro com a finalidade de investigao e de domesticao, so provenientes da Amrica do Sul. No se sabe, porm, o perodo exato que esse roedor foi levado para a Europa e para todo o continente americano. Wagner & Manning (1976) descreveram e deram algumas referncias sobre a transformao desse roedor nativo em animal de laboratrio. De forma sucinta, tais animais foram vistos pela primeira vez pelos espanhis no Peru, no incio do sculo XVII, e levados por marinheiros para a Europa com o propsito de domesticao e exposio. Anos depois, sendo aproveitados como animais de laboratrio, foram os primeiros a ser utilizados na tentativa de obter animais livres de germes, por meio de cesrias asspticas, por Nuttal e Thierfelder (1895) na Alemanha. A escolha se deu em virtude da maturidade de seus filhotes ao nascer. Com o auxlio de um complicado isolador, conseguiram manter cobaias por mais de 10 dias livres de microorganismos, porm, no se desenvolveram. Reyniers (1946) obteve com sucesso a produo desses animais livres de germes em isoladores mais adequados. Cepas consangneas de cobaias foram obtidas a partir de 1906 e contriburam grandemente para a compreenso da gentica e da reproduo.
IMPORTNCIA NA EXPERIMENTAO BIOLGICA

A cobaia conhecida, por muitos, como smbolo representativo dos animais de laboratrio. As primeiras utilizaes, com fins experimentais, foram realizadas por Lavoiser, em 1790, em investigaes relacionadas ao calor. Atualmente, as cobaias so muito utilizadas em experimentaes ligadas nutrio, farmacologia, imunologia, alergia, radiologia etc. o animal de eleio para obter complemento necessrio em muitas reaes imunolgicas denominadas, em geral, de fixao do complemento, entre as quais se destaca a clssica reao de Wassermann, empregada para o diagnstico clnico e para isolar Mycobacterium tuberculosis, variedade hominis, e na demonstrao de carncia por vitamina C. Esses animais so bastante utilizados nos testes de reativos biolgicos.
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POSIO TAXONMICA
Classe:
Mamfera Rodentia Famlia: Cavidae Gnero: Cavia Espcie: Porcellus

Ordem:
Cavia porcellus. Variedade inglesa. Fonte: Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz.
Wagner & Manning (1976) descreveram as diferentes espcies do gnero Cavia que so encontrados predominantemente em determinadas regies da Amrica do Sul. Na Argentina, no Uruguai e no Brasil so encontrados Cavia aperea, enquanto no Peru encontrada Cavia cutleri. Festing (1976) considerou que Cavia porcellus derivada de Cavia aperea, e Cavia cutleri e Cavia rufescens so, na realidade, formas de Cavia aperea. As variedades de Cavia porcellus so identificadas pelo tamanho e pela direo dos plos. A variedade inglesa (Dunkin Hartley) apresenta plo curto (short hair), liso e macio. a variedade mais comum e aparentemente a mais bem adaptada e utilizada em pesquisas. A variedade abissnia, que apareceu na Inglaterra, uma mutante de plos curtos e speros que crescem em redemoinho ou rosetas, enquanto a variedade peruana uma mutante de plos longos e sedosos. Raramente so utilizadas em pesquisa e se mantiveram, quase exclusivamente, para fins de domesticao e de exposio. A cepa iniciada por Dunkin e Hartley, em 1926, a estirpe progenitora de muitas cobaias; deu grande contribuio para a compreenso da gentica e para a reproduo da espcie.
COMPORTAMENTO
As cobaias so animais sociais, tmidos, dceis e raramente mordem ou arranham. Assustam-se facilmente, defecam e urinam nos comedouros e derramam sua alimentao pelo piso da gaiola. Gritam de prazer antes de situaes gratificantes (alimentao) e ficam muito juntas ou em cima umas das outras durante o manejo da colnia pelo tcnico. Os animais adultos, freqentemente, mordem as orelhas dos jovens e os machos podem brigar violentamente, principalmente durante disputas por uma fmea em estro, at que se estabelea a hierarquia do grupo.
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Outra caracterstica marcante das cobaias a de que so extremamente susceptveis a estmulos estressantes, sobretudo a alteraes ambientais. Simples modificaes na rao, no comedouro, na gua e no bebedouro podem levar os animais a recusar o alimento. Alm disso, estmulos como barulho intenso ou movimentos bruscos assustam os animais, que passam a correr de um lado para o outro, provocando ferimentos entre eles. Ocasionalmente, durante a conteno para a troca de gaiolas, podemos observar paralisao do animal por vrios minutos e at mesmo a morte. Isso implica dizer que o trabalho com essa espcie deve ser realizado com muito cuidado, principalmente no que se refere s fmeas grvidas ou aos recm-nascidos, os quais podem ser pisoteados pelos outros animais do grupo. As cobaias so muito sensveis toxicidade por vrios antibiticos, tais como tetraciclina, penicilina e cloranfenicol.
PRINCIPAIS CARACTERSTICAS ANATMICAS E FISIOLGICAS

A cobaia um roedor de estatura baixa e com o corpo arredondado e sem cauda. So animais de olhos salientes, vivos, brilhantes, pretos ou transparentes (albinos) e de orelhas pequenas, largas e dobradas. Os machos so mais corpulentos que as fmeas, exceto durante a gravidez. Tanto os machos como as fmeas possuem um par de glndulas mamrias abdominais. A frmula dentria para animais adultos a seguinte: incisivos 1/1, caninos 0/0, pr-molares 1/1 e molares 3/3. Tm um total de 20 dentes permanentes sem raiz e com crescimento contnuo. Possuem quatro dedos nas patas anteriores e trs nas posteriores. Os eritrcitos das cobaias so menos frgeis em solues eletrolticas. A protrombina apresenta um longo tempo para sua converso em comparao com a maioria das espcies. Tem escassa produo de tromboplastina no pulmo. As fmeas de idade avanada so excelentes fontes de complemento, usado freqentemente para os ensaios sorolgicos. O sistema linftico bem desenvolvido e os gnglios da regio ventral da cabea e do pescoo so facilmente acessveis para fins exploratrios e tambm mais afetados por abscessos bacterianos. A temperatura retal situa-se, em mdia, em torno de 38,5 C.
NUTRIO
As cobaias so fundamentalmente herbvoras e comem a maioria dos tipos de gros, verduras e pasto. As raes comerciais so peletizadas, com dimetro recomendvel de no mximo de 50 mm, e devem ser administradas em comedouros adequados para minimizar o desperdcio, contaminao fecal e urinria. O consumo mdio dirio de rao comercial peletizada pelos animais adultos de 40 g. As cobaias, do mesmo modo que primatas no-humanos e o prprio homem, so dependentes de fontes exgenas de cido ascrbico. A deficincia de cido ascrbico na alimentao das cobaias responsvel pelo aparecimento de sinais e sintomas caractersticos que comeam com a reduo no consumo de alimento e perda de peso, seguidas por anemia e hemorragia generalizada. Em razo dessas alteraes, ou de infeces bacterianas secundrias, a morte sobrevm em 3 a 4 semanas (National Research Council, 1978). A incapacidade para sintetizar o cido ascrbico atribuda a uma deficincia, de origem gentica, da enzima heptica gluconolactona oxidase necessria para produzir cido L-ascrbico que, em outros animais, procede da D-glucosa. O contedo de vitamina C nos alimentos, em forma de pellets, reduz-se com o perodo de fabricao e armazenamento. As raes com mais de 90 dias de fabricao podem no conter quantidade suficiente de vitamina C para manter os animais em bom estado de sade. A suplementao de vitamina C, atravs de vegetais verdes, na
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quantidade de 50 a 100 g/dia/animal, tem sido bastante utilizada. Porm, essa suplementao deve ser vista com restries, em virtude de fatores desconhecidos que podem favorecer a contaminao dos animais pela dificuldade do controle da fonte produtora e da eliminao de agentes patognicos. Tem sido difcil determinar a quantidade de vitamina C exata por animal, pois dependem da sua condio fisiolgica. sugerida a quantidade diria de 10 mg/kg para manuteno de animais e de 30 mg/kg para fmeas grvidas. Recomendamos a suplementao de vitamina C em gua na proporo de 300 mg/litro. Deve ser preparada diariamente, por ser tratar de uma de vitamina termolbil. Os bebedouros, em geral, so fabricados de material plstico com capacidade de 1 litro, equipados com bicos de ao inox e colocados do lado de fora das gaiolas, evitando, assim, o derramamento de gua em seu interior. Tabela 1 Necessidades nutricionais para cobaias (concentrao na dieta)
NUTRIENTE Protena (cresc.) cido linoleico Energia Total Fibra MINERAIS Clcio Magnsio Fsforo Potssio Cobre Iodo Ferro Mangans Zinco Cromo Selnio VITAMINAS A D E K C Biotina Colina Acido Flico Niacina Pantotnico Riboflavina Tiamina Piridoxina Cianocobalamina Mg/kg UI/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Mg/kg Ug/kg 7.0 1000.0 50.0 5.0 200.0 0.3 1000.0 4.0 10.0 20.0 3.0 2.0 3.0 10.0 % % % % % % % % % % % 0.9 0.2 0.6 1.0 6.0 1.0 50.0 40.0 20.0 0.6 0.1 UNIDADE % % Kcal/g % NECESSIDADE 18 1 3 10
Fonte: Nutrient Requirements of Laboratory Animals (1978).
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SISTEMA DE REPRODUO
A cobaia um animal polistrico. O estro dura menos da metade de um dia e o ciclo estral completo tem a durao de 13 a 25 dias (em mdia 16 dias). O nmero mdio de filhotes por ninhada 2, variando de 1 a 8. Perodo de gestao: cerca de 59 a 72 dias ou mdia de 63 dias, ou seja, longo para um animal to pequeno. A ovulao espontnea e o corpo lteo funcional, em contraste com a condio encontrada em todos os outros roedores que foram investigados. , em condies normais de A poca da puberdade situa-se aproximadamente entre 55 e 70 dias de idade, manejo. Se alimentados com raes mais ricas do que a usual, h maior desenvolvimento do animal e a puberdade pode ocorrer entre 45 a 60 dias. Uma srie de trabalhos enuncia como idade mdia do aparecimento do primeiro cio aproximadamente 67,8 dias de idade, mais ou menos dois dias, com desvio-padro de 21,5 dias, com variao de 33 a 134 dias. A idade mdia da ruptura da membrana que fecha a vagina se d em torno de 58,2 dias. O intervalo entre a primeira ruptura e o primeiro cio vai de 0 a 4 dias. O cio comea freqentemente ao anoitecer. O proestro, onde se nota congesto e tumefao dos genitais externos e uma ligeira descarga serosa da vagina, usualmente dura 24 a 36 horas. O cio onde h receptividade sexual dura de 6 a 11 horas em 90% dos casos. A ovulao ocorre usualmente 10 horas aps o comeo do cio ou da receptividade sexual. Cerca de 64% de todos os perodos de cio comeam entre 18 horas a 6 horas. O cio ocorre imediatamente depois do parto em cerca 64% das fmeas. Usualmente, ele comea duas horas aps o fim do parto. Algumas fmeas apresentam ovulao aps o parto, sem sinais de cio. Uma fecundao bem-sucedida indicada pela expulso do tampo vaginal, uma substncia branca e serosa, com cerca de 2,5 cm de comprimento proveniente da coagulao do lquido seminal que aparece 2448 horas aps o acasalamento. O tampo escurece rapidamente e, ento, muitas vezes no possvel distinguilo no meio das fezes no fundo da gaiola. Ele pode nos indicar com preciso o tempo da gestao ou o momento prximo do parto, pois sua presena garante 80% da fecundao da fmea. Os filhotes j nascem recobertos de plos, com os olhos abertos e a dentio completa, o que lhes confere precocidade e auto-suficincia, uma vez que j podem consumir alimentos slidos (3-5 dias de idade). O leite materno ainda fundamental aos neonatos para a proteo contra doenas infecciosas. Desse modo, o desmame pode ser feito aos 14 dias, mas a melhor indicao de que ocorra quando os animais apresentem 21 dias de idade. O reconhecimento dos filhotes pela me pode ser feito a distncia, porm no deixam de amamentar os filhotes de outras fmeas, desde que sejam do mesmo grupo de convivncia. O peso dos filhotes ao nascer fica entre 80 a 100 gramas.
SISTEMA DE ACASALAMENTO
A escolha dos animais para acasalamento deve ser cuidadosa. Alm de selecionar machos e fmeas jovens, fortes e saudveis, devemos ter o cuidado de escolher criteriosamente pelos seus valores genticos (ver controle da consanginidade da colnia). O acasalamento pode ser realizado quando as fmeas tiverem aproximadamente trs meses de idade (400 g - 500 g) e os machos quatro meses (500 g - 600 g), mas acasalamentos frteis so observados entre animais de 8 a 10 semanas. O primeiro parto deve ocorrer antes dos 6 meses de idade. Depois desse tempo, a snfise pbica (articulaes da plvis-anel plvico) tende a se soldar mais firmemente por um processo de calcificao, produzindo estreitamento mecnico do canal de nascimento que resultar em partos distrcicos.
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Os acasalamentos podem ser monogmicos e poligmicos permanentes. O acasalamento monogmico um sistema que compreende um macho e uma fmea acasalados durante toda a vida reprodutiva. Tem a vantagem da fcil identificao dos filhotes e a manuteno de registro fidedigno, elevada porcentagem de cio frteis pspartos, de filhotes desmamados, maior controle das enfermidades, boa seleo dos reprodutores e amplamente utilizado em colnias consangneas onde empregam acasalamento entre irmos. As desvantagens so o aumento de mo-de-obra, necessidade de grande nmero de machos reprodutores, de espaos maiores e de mais pessoal. O acasalamento poligmico um sistema que compreende 1 macho para um grupo de 5 a 12 fmeas respeitando o espao mnimo por animal (1200 cm2). Recomendamos 1 macho para cada 5 fmeas com gaiolas de 100 cm de comprimento, 70 cm de largura e 30 cm de altura, fabricada em plstico e autoclavvel. Esse sistema o mais utilizado na maioria das colnias de grande produo. A vantagem dele consiste em ter o maior nmero de animais produzidos em menos espao. Tem como desvantagem a dificuldade para o registro dos animais e a identificao da fmea e do macho no-frteis. Os reprodutores so mantidos na colnia at a idade de 24 a 30 meses.
DESMAME E SEXAGEM
Independente do sistema de produo, os filhotes devem ser desmamados com trs semanas de idade. O melhor critrio quando no existe registro, provavelmente quando alcanam mais 180 g de peso. Os animais devem ser separados por sexo e tamanho. Tanto os machos quanto as fmeas apresentam o orifcio genital em igual distncia do nus. Nos machos, esta rea ligeiramente arredondada com sulco nico e contnuo entre a abertura da uretra e o nus, enquanto nas fmeas esse sulco interrompido pela membrana vaginal, exceto durante o estro ou no trmino da gravidez. Nos machos, os testculos podem ser palpados e o pnis pode ser exteriorizado facilmente mediante uma presso na regio inguinal.
CONTROLE DA CONSANGINIDADE NA COLNIA

ANIMAIS CONSANGNEOS INBRED so obtidos pelo acasalamento entre irmos, e/ou pais e filhos, durante 20 ou mais geraes consecutivas. Os estudos genticos em relao as cobaias foi iniciado em 1906 pela Animal Husbandry Division of the U.S. Bureau of Animal Industry. Este estudo foi complementado por Wright a partir de 1915. Desde ento, consta de 35 cepas inbred destinadas principalmente ao estudo do cncer. ANIMAIS NO-CONSANGNEOS OUTBRED so animais que apresentam constituio gentica variada, em estado de heterozigose, a qual deve ser conhecida e mantida. O emprego do sistema de acasalamento rotacional visa a manter animais heterozigotos, evitando o acasalamento de parentes prximos e assegurando que a gerao seguinte venha de um maior nmero de pais do que o que ocorreria se fosse ao acaso. Ao empregar esse sistema, a colnia se desenvolve em vrios grupos de igual nmero, de modo que a quantidade de fmeas e machos em todos os grupos sempre igual. O nmero de grupos de uma colnia est relacionado a seu tamanho (nmero de reprodutores). Quanto menor a colnia, maior o nmero de grupos. Em colnia de criao e produo de cobaias, utilizamos um sistema de acasalamento similar ao rotacional (Mtodo Poiley). Por exemplo: Suponhamos que a colnia consista de 510 fmeas e 102 machos, com gaiolas para cada unidade reprodutiva (5 fmeas x 1 macho), numeradas de forma que identifique os grupos e as unidades reprodutivas. E que essa colnia esteja dividida em 6 grupos, onde cada grupo constitudo de 85 fmeas e 17 machos. Recomendamos
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ainda, para cada grupo, reserva de animais jovens para substituio anual de 50% dos reprodutores da colnia, retirados de cada unidade reprodutiva trs meses antes, para crescimento e observao dos futuros reprodutores. Sabendo-se que o ciclo de acasalamento (perodo reprodutivo dos reprodutores) varia entre 2 a 3 anos de idade. Quadro 1 Esquema sobre como os acasalamentos sero efetuados
Formao do grupo 1 2 3 4 5 6 = = = = = = = Macho do grupo 3 6 5 1 2 4 x Fmea do grupo 6 1 2 3 4 5
PRODUO MENSAL ESTIMADA EM UMA COLNIA COM 510 FMEAS E 102 MACHOS REPRODUTORES
Sabendo-se: Perodo mdio de gestao = 63 dias Nmero mdio de filhotes/parto = 2,75 Taxa de mortalidade de lactente = 10% Nmero de filhotes desmamados/parto = 2,5 Desmame = 21 dias de idade Acasalamento = mdia de 90 dias de idade Intervalo entre partos = 63 dias de gestao 16 dias de ciclo estral 79 dias 365 dias (ano): 79 dias (intervalo) = 4,6 partos/ano. OBS.: aproximadamente 5 partos, devido a um nmero significativo de fmeas fecundadas imediatamente aps o parto. 5 partos x 2,5 filhotes = 12,5 filhotes desmamados/ano/fmea 12,5 desmamados/ano x 510 fmeas = 6.375 desmamados/ano ou seja, 531,25 desmamados/ms. Para fins de clculo de produo, consideramos o ndice reprodutivo igual a 1 filhote/fmea/ms. Dos filhotes nascidos e/ou desmamados, 50% so fmeas e 50% machos. Sabendo-se que em cada perodo de 24 meses o nmero de reprodutores (machos e fmeas) so substitudos em 100%. Mensalmente, so substitudos 1:24 fmeas = 21,25 e 1:24 machos = 4,25. Considerando que a taxa de mortalidade dos reprodutores e animais em crescimento seja 3%, necessitamos de reserva mensal de 22 fmeas e 5 machos de filhotes desmamados para futuros reprodutores.
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IDENTIFICAO DOS ANIMAIS E REGISTRO DA COLNIA DE COBAIA

necessrio contar com um bom mtodo de identificao dos animais para garantir um registro fidedigno da colnia. O mtodo mais satisfatrio mediante a tatuagem individual nas orelhas, usando uma pina de tamanho apropriado. E em cada orelha se pode ter trs letras ou nmeros. Aplicao de corantes tais como a soluo de cido pcrico (amarelo), embora eficiente, de curta durao e deve ser periodicamente renovada. Os registros dos eventos ocorridos com os animais, nas respectivas fichas de identificao da unidade reprodutiva ou em livro, devem conter informaes suficientes para que se tenha, a cada momento, uma posio exata de tudo o que acontece na colnia, como: data do acasalamento, nascimento, quantidade de filhotes nascidos, mortos, desmame, variaes ambientais etc.
CONTENO
O mtodo mais seguro para conter uma cobaia colocar uma mo sob o trax e com a outra apoiar a parte posterior, para suportar o peso do animal, permitindo que ele fique sentado sobre a palma da mo. Deve-se evitar apertar o trax pela sua fragilidade. Os anestsicos devem ser utilizados sempre que necessrio, obtendo-se maior facilidade e tempo de manipulao do animal. Quadro 2 Medicao pr-anestsica para cobaias
DROGA Atropina Diazepan Diazepan + Ketamina Ketamina DOSAGEM 0,03 0,05 mg/kg 5,0 mg/kg 0,1 mg 44 mg/kg 25 a 44 mg/kg VIA S.C. I.P . I.M. I.M EFEITO tranqilizante por 30 min. tranqilizante, mas no produz analgesia rpida imobilizao e bom relaxamento muscular Tranqilizante
Quadro 3 Anestsicos injetveis para cobaias (hipntico/sedativo)

DROGA Fentanyl/droperidol (innovar vet) Ketamina HCl + Promazine HCl + Aminopentamide Sulphate (Ketaset Plus-Bristol) Pentobarbital Thiopental DOSAGEM 22-88 ml / kg 100 mg / ml 7,5 mg / ml 0,0625 mg / ml 125 mg / kg 30 a 40 mg / kg 55 mg / kg VIA I.M. I.M. EFEITO Tranqilizante anestesia Anestesia
I.P. ou I.V. I.P. ou I.V.
Anestesia Anestesia
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Os anestsicos por inalao, em particular o metoxiflurano, so agentes de escolha para anestesia em cobaia. O ter , ainda, freqentemente usado como relaxante muscular e analgsico, sempre associado atropina para conter a excessiva salivao.
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Principais doenas das cobaias
Principais Doenas das Cobaias

DOENAS INFECCIOSAS DE ORIGEM BACTERIANA
L INFADENITE C ERVICAL E NZOTICA
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Andra Mendes Pereira
uma doena supurativa encontrada com certa freqncia em colnias de cobaias, cujo agente etiolgico Streptococcus zooepidemicus. uma zoonose. As fmeas parecem ser mais susceptveis que os machos, havendo aparentemente alguma diferena tambm entre as cepas. O agente invade o organismo atravs de soluo de continuidade na mucosa oral, e algumas enzootias foram atribudas a injrias orais durante a ingesto de forragem. Outras vias de infeco sugeridas compreendem: abrases de pele, atravs do trato respiratrio por secrees nasofarngeas, canal do parto e via conjuntival. A doena se manifesta clinicamente por leses supuradas ou em forma de tumoraes, localizadas inferiormente na mandbula ou na regio do pescoo. Ocorre aumento gradativo de tamanho e formao de abscessos nos linfonodos afetados e geralmente, mas nem sempre, h depreciao severa dos animais afetados. A ruptura ou drenagem cirrgica seguida de cicatrizao com formao de tecido de granulao, mas a forma septicmica da doena pode ocorrer em epizootias com alta mortalidade. Como seqela da doena aguda, podem suceder peritonite, necrose heptica focal, otite mdia purulenta, pericardite fibrinosa e pleuropneumonia. Na necropsia, os linfonodos afetados contm abscessos bem encapsulados, repletos de pus espesso, inodoro, de cor branca amarelada. Na forma disseminada, outros linfonodos esto afetados, assim como podem estar presentes pleuropneumonia, miocardite, pericardite e peritonite fibrinopurulenta. Relata-se tambm otite mdia, nefrite, artrite e celulite. Microscopicamente, observa-se inflamao supurativa necrtica com destruio do linfonodo, em cuja periferia so facilmente demonstrveis cadeias de cocos gram-positivos. O diagnstico definitivo depende do isolamento e identificao do germe. importante ressaltar que outros linfonodos podem estar afetados por este agente, assim como outros agentes podem causar tumefaes cervicais, tais como: Streptobacillus moniliformis, Yersinia pseudotuberculosis, Salmonella spp, Fusobacterium necrophorum, ficomicetas e vrus tipo C da leucemia de cobaia. Os animais doentes devem ser removidos da colnia e as carcaas devem ser destrudas ou tratadas separadamente, evitando-se assim a disseminao da doena. A antibioticoterapia geralmente no eficaz em virtude do padro encapsulado da leso. Os animais mais valiosos podem ser submetidos drenagem cirrgica com expectativa de xito, mas devem ser mantidos isolados.
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Nos casos de epizootias com processo pneumnico ou septicmico convm descartar toda a colnia. Por tratar-se de uma zoonose, as pessoas que manipulam os animais devem faz-lo utilizando equipamentos de proteo individual.
P NEUMONIAS B ACTERIANAS
Os agentes que mais comumente causam pneumonias bacterianas em cobaias so Bordetella bronchiseptica e Diplococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae ou Pneumococcus). No caso de Bordetella, necessrio um contato ntimo para que a doena se propague. As epizootias ocorrem geralmente depois de algum tipo de estresse, com 70% de morbidade e 30% a 40% de mortalidade. Ambos os sexos e todas as idades so susceptveis, porm os mais jovens so mais afetados. Na infeco por Bordetella, a necropsia revela pneumonia de severidade varivel, de multifocal a difusa, com zonas de condensao roxo-acinzentadas. Pode estar presente traquete com exudato sanguinolento, pericardite e pleurite com fluido seroso claro amarelado. Foram relatadas metrite e vaginite. Microscopicamente, encontra-se uma broncopneumonia circundante. Mais tardiamente pode-se encontrar um exudato fibrinoso e acmulo de clulas mononucleares e fibroblastos. Diplococcus um hspede natural dos animais e a doena induzida por estresse. Freqentemente ela se caracteriza por uma condio crnica. Na infeco por Diplococcus, os resultados da necropsia podem revelar pleurite fibrinopurulenta, pericardite, consolidao do pulmo, otite mdia, endometrite e meningite supurativa. Microscopicamente, h um edema marcante dos alvolos, os quais esto repletos de exudato fibrinoso. Os pneumococos so facilmente demonstrveis em esfregaos diretos das leses. Os animais doentes deixam de se alimentar, mostram-se prostrados e podem apresentar dispnia e descarga nasal. Alm da forma pneumnica, suspeita-se que a enfermidade possa estar associada a infeces uterinas e conseqentes problemas reprodutivos, podendo causar aborto em fmeas prenhes. Como em outras enfermidades bacterianas, o diagnstico positivo depende do isolamento e da identificao do germe, a partir de amostras obtidas das narinas, da traquia e dos pulmes. Boas prticas de cuidado e manejo que reduzam o estresse favorecem o controle da doena.
S ALMONELOSE
As enfermidades causadas por bactrias do gnero Salmonella so as mais freqentemente relatadas em cobaias. Em razo de sua letalidade e risco de transmisso ao homem e outros animais, a salmonelose talvez seja a doena infecciosa mais importante nas cobaias. Os sorotipos isolados com maior freqncia so S. typhimurium e S. enteritidis. Esses microorganismos podem se manter latentes nos animais da colnia, ou serem introduzidos por alimentos ou cama contaminados com excreta de roedores selvagens. A infeco geralmente resulta da ingesto de alimentos ou gua contaminada. Todas as idades, cepas e ambos os sexos so afetados. As fmeas em estado de prenhez avanada e as crias jovens so mais susceptveis. Os animais que se recuperam clinicamente da doena podem tornar-se portadores. A doena pode se apresentar de forma latente, aguda, subaguda ou crnica. As infeces latentes se manifestam em estados de estresse (frio, calor, mudana de dieta, uso experimental). Inicialmente, ocorre aumento da mortalidade, diminuio de consumo de rao, o que acarreta severas perdas de crias e fmeas prenhes e altas taxas de aborto. Em muitos animais, observa-se pelagem spera, anorexia, perda de peso, debilidade geral e conjuntivite. A diarria nem sempre est presente. A mortalidade pode variar de 50% a 100%. A patogenia geral da doena : ingesto do agente, excreo transitria nas fezes, invaso dos linfonodos,
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bacteremia, fagocitose no SMF, reinvaso da corrente sangnea, infeco generalizada, invaso secundria dos intestinos, enterite e, se o animal sobreviver, eliminao contnua nas fezes. Nos casos agudos geralmente no se observam leses. Nos casos subagudos e crnicos, comum a esplenomegalia visvel. No fgado e bao so vistos pequenos pontos e ndulos brancos, assim como em outros rgos da cavidade abdominal e torcica. A ruptura desses ndulos pode originar inflamaes purulentas nas membranas serosas. Microscopicamente v-se necrose com infiltrao de histicitos e neutrfilos. Tambm se formam leses granulomatosas e abscessos. O diagnstico positivo depende do isolamento e da identificao do agente. Nos casos agudos, o cultivo de sangue pode ser suficiente, mas o bao o rgo de eleio para o isolamento na necropsia. Devem ser usados meios de cultivo seletivos quando se quer recuperar o germe a partir de amostra fecal. O controle da salmonelose difcil em colnias convencionais. As vacinas autgenas protegem apenas contra um sorotipo. Os antibiticos controlam, mas no erradicam o agente. A preveno prejudicada pela extensa disseminao entre muitos animais. Em colnias com infeco estabelecida, a nica soluo conveniente a eliminao de todos os animais, sanitizao do ambiente e equipamentos e repovoamento com animais isentos de salmonelose. O uso de alimentos pasteurizados e de cama autoclavada, o controle freqente das fezes, a destruio de gaiolas contaminadas e a remoo de animais doentes ajudam a retardar a reinfeco.
Y ERSINIOSE
Yersinia pseudotuberculosis um agente patgeno comum dos roedores e causa sndromes especficas nas cobaias. A enfermidade tem sido relatada mais comumente na Europa do que em outras partes do mundo. Quase todos os animais submetidos prova se mostram susceptveis doena, e a forma septicmica pode ser fatal no homem. A infeco ocorre por meio da ingesto de alimentos contaminados, especialmente forragens precariamente sanitizadas. Na cobaia se conhecem trs formas clnicas. A mais comum a pseudotuberculose clssica, com leses caseosas nos gnglios mesentricos e colnicos, linfadenites, emaciao, diarria e conseqente morte em 3 a 4 semanas. Os recm-nascidos podem estar infectados antes ou logo aps o nascimento. Uma segunda forma reconhecida uma pneumonia septicmica aguda, na qual so observados acessos de tosse, taquipnia e morte em 24 horas. Uma terceira manifestao uma infeco crnica dos gnglios cervicais de curso fatal. No exame post mortem de casos tpicos, observam-se ndulos caseosos disseminados nas vsceras e nos gnglios linfticos. Nos pulmes, as leses, semelhantes a tubrculos, so geralmente subpleurais. s vezes, o tero e as glndulas mamrias esto afetados. Na forma pneumnica, os pulmes esto severamente congestionados. Microscopicamente, h uma necrose coagulativa central com infiltrao de neutrfilos e macrfagos circundantes. Os fibroblastos envolvem a leso, e as clulas epiteliides podem ser numerosas. No h formao de clulas gigantes nem calcificao. Dentro da massa necrtica podem ser vistos vasos sangneos obstrudos por mbolos bacterianos. O diagnstico positivo depende do isolamento e identificao do agente. O cultivo obtido facilmente do pus dos abscessos ou do sangue, em casos agudos. As medidas de controle incluem boas prticas de manejo, especialmente a proteo dos alimentos contra pssaros e roedores silvestres. A palpao regular em busca de linfonodos mesentricos aumentados pode detectar fases precoces, permitindo a remoo imediata do animal suspeito da colnia.
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DOENA DE TYZZER
causada por Bacillus piliformis, um microorganismo intracelular obrigatrio de classificao incerta. Todas as espcies comuns de animais de laboratrio so susceptveis, assim como os animais domsticos e silvestres. A cobaia foi um dos ltimos animais de laboratrio cuja infeco natural foi relatada. As crias jovens e os animais submetidos a estresse so os mais afetados. A doena se caracteriza por diarria, debilidade, pelagem spera e morte. Macroscopicamente, revelam-se emaciao e desidratao; a regio perineal e membros posteriores mostramse sujos de fezes diarricas. O ceco est distendido e repleto de lquido. Os linfonodos mesentricos e colnicos podem estar edemaciados. As leses microscpicas incluem edema na parede cecal e focos de necrose no clon. O agente revelado nas clulas epiteliais do leo, ceco e clon quando a amostra corada pelos mtodos de Warthin-Starry ou Gomori, aparecendo como aglomeraes de bacilos filamentosos no citoplasma das clulas infectadas. O agente no cultivado em meios artificiais isentos de clulas, porm pode ser propagado em ovos embrionados de galinha. As medidas de controle so incertas, visto que no se conhecem os meios de disseminao da doena e nem mesmo sua patogenia. Fica indicado o isolamento dos animais doentes, associado ao manejo correto. Ainda no ficou estabelecido o significado dessa doena em sade pblica, porm foram encontrados macacos rhesus infectados e j foram detectados anticorpos em mulheres grvidas.
P SEUDOMONAS
AERUGINOSA
um microorganismo amplamente distribudo e geralmente no-patognico, acarretando maiores problemas caso as condies de criao sejam insalubres. Em animais jovens pode determinar uma septicemia aguda, enquanto nos adultos podem aparecer abscessos subcutneos crnicos. Tambm foi relatada severa broncopneumonia com focos necrticos.
S TAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Este agente tem sido isolado de vrias infeces na cobaia, incluindo dermatites, pododermatites, pneumonia e artrites. S. aureus foi descrito como agente causador de uma pododermatite crnica com aumento das patas dianteiras de animais alojados em pisos precariamente higienizados. Uma enfermidade esfoliativa da pele que afeta a maioria das fmeas, caracterizada por eritema tracoabdominal ventral, com descamao, alopecia e cicatrizao, em duas semanas, revelou semelhana estreita com uma afeco de pele em humanos causada por uma toxina extracelular de S. aureus. Boas prticas de manejo e higiene no colaboram para o aparecimento desse tipo de infeco.
K LEBISIELLA
PNEUMONIAE
Tem sido isolada com pouca freqncia como causa de enfermidade em cobaias, causando epizootias caracterizadas por septicemias bastante rpidas, com isolamento do agente a partir de todos os rgos. O agente extensamente disseminado na natureza e o estresse pode precipitar os surtos.
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PASTEURELLA MULTOCIDA
um habitante comum do trato respiratrio superior de muitos animais. duvidosa sua real importncia como fonte de enfermidade para as cobaias, sendo necessrio o isolamento do agente, essencialmente no diagnstico diferencial da pseudotuberculose.
C ORYNEBACTERIUM
PYOGENES
So raros os relatos de isolamento de C. pyogenes e C. kutcheri, podendo no refletir a real incidncia da enfermidade.
L EPTOSPIRA
SPP
Apesar da leptospirose ter sido observada em cobaias silvestres na Argentina e no Brasil, raramente se tem informao da doena em cobaias de laboratrio. O nico caso relatado foi supostamente atribudo a uma estreita relao com ratos.
M YCOBACTERIUM
SPP
Os casos espontneos de tuberculose so aparentemente raros em cobaias, apesar de esses animais serem altamente susceptveis s infeces experimentais. As cobaias so eleitas para inoculao experimental de exudatos ou extratos de rgos suspeitos. Supe-se que os casos de infeces naturais tenham sido provenientes do contato com seres humanos infectados.
DOENAS INFECCIOSAS DE ORIGEM VIRAL E POR MICOPLASMA

O significado de muitas infeces virais em cobaias ainda indeterminado. Apesar de terem sido encontrados anticorpos contra alguns vrus, no foram descritos casos de enfermidades virais correspondentes. Sero aqui descritas apenas as infeces, de carter natural, com possvel significado para as colnias de produo.
CITOMEGALOVRUS (CMV)
OU
V RUS
DA
G LNDULA SALIVAR
DE
C OBAIA
Trata-se de um herpesvrus que normalmente est presente nas glndulas salivares de cobaia, causando uma infeco latente. Pode acometer 80% dos adultos da colnia com incluses nas glndulas salivares. O citomegalovrus humano causa em torno de 1% de infeco congnita, determinando enterites, pneumonias e danos ao SNC no recm-nascido. A infeco na cobaia pode ser um bom modelo para estudo da infeco transplacentria no homem, visto que esta via comum para ambas espcies, se a me se infectar primariamente durante a gestao. Parece haver um maior ndice de transmisso entre animais de sexos diferentes quando alojados juntos, sugerindo a transmisso sexual. O CMV raramente aparece como uma doena generalizada, e determina duas fases de infeco na cobaia. A primeira fase aguda dura em torno de 10 dias, ocorrendo viremia e presena do vrus em vrios tecidos, havendo mais tarde uma infeco crnica persistente com altos nveis de anticorpos. O vrus permanece nas glndulas salivares e pncreas.
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Observa-se hipertrofia das clulas epiteliais do ducto das glndulas salivares, com descentralizao da cromatina nuclear e grandes corpos de incluso intranucleares. As incluses citoplasmticas so raras e, quando presentes, esto acompanhadas de incluses intranucleares. Durante fase aguda da infeco, as incluses intranucleares podem ser vistas nos rins e fgado.
H ERPESVRUS -L IKE
DE
C OBAIA
um vrus relativamente comum em muitas linhagens de cobaia; est aparentemente presente como uma infeco latente nesses animais. Embora tenha sido inicialmente correlacionado com o vrus da leucemia de cobaia e com o CMV, ainda no foi determinado papel especfico para esse vrus em qualquer doena nessa espcie.
V RUS
DA
LEUCEMIA
DE
C OBAIAS
Este vrus produz uma leucemia linfoblstica, determinando inicialmente sintomas inespecficos, como pelagem spera, prostrao e inapetncia. Ao mesmo tempo, observa-se enfartamento dos linfonodos perifricos e mesentricos, paralisia posterior e ataxia terminal. A necropsia revela manchas de cor cinza claro e aumento da maioria dos gnglios linfticos e outros rgos internos. Microscopicamente, pode haver infiltrao linfoblstica em qualquer rgo. Os linfonodos, bao, medula ssea e placas de Peyer podem estar totalmente preenchidos por clulas leucmicas. A contagem de leuccitos pode chegar de 25.000/ml a 250.000/ml. No se conhece qualquer medida de controle.
C ORIOMENINGITE L INFOCTICA
Embora seja de ocorrncia incomum na cobaia, essa enfermidade de particular importncia como em outras espcies, visto que uma zoonose e a cobaia susceptvel. A infeco pode se dar por inalao, ingesto ou penetrao atravs da pele intacta. Na cobaia, a doena manifestada por sinais neurolgicos de meningite e paralisia do trem posterior. Geralmente, no h leses visveis; microscopicamente h uma notvel infiltrao linfocitria nas leptomeninges da base do crebro, nos plexos corides do 3o e 4o ventrculos e em torno dos vasos sangneos submenngeos. O camundongo selvagem considerado o reservatrio selvagem da doena, sendo o controle baseado em evitar o contato de animais de laboratrio com roedores selvagens. Alm de sua importncia para a sade pblica, o vrus tem causado interferncia nos trabalhos de transmisso de vrios vrus.
M ICOPLASMA
SPP
No se tem associado doenas graves ou mortais em cobaias determinadas por micoplasmas. J foram identificados vrios pontos de infeco, inclusive abscessos cervicais. Foi reconhecida uma espcie nesse hospedeiro, conhecida como Micoplasma caviae, embora outros tenham sido isolados mas no identificados.
DOENAS PARASITRIAS
ECTOPARASITAS
Piolhos
Gyropus ovalis e Gliricola porcelli
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caros
Chirodiscoides caviae
So considerados de baixa importncia clnica, sendo geralmente encontrados em colnias convencionais de cobaia, nas criaes comerciais e entre os animais silvestres. Mesmo assim as infestaes so brandas, o que torna rara qualquer sintomatologia. Nos casos extremos, podem ocorrer escoriaes por causa do prurido intenso; tambm pode haver alopecia. O diagnstico se baseia na identificao do parasita. O controle obtido mediante a aplicao direta de inseticidas no plo do animal (visto que o piolho no abandona o hospedeiro); utiliza-se talcos base de piretrina a 0,2% ou curtas exposies, ao vapor, de dichlorvos. O tratamento repetido semanalmente durante 3 semanas (ciclo vital completo dura de 2 a 3 semanas); ao mesmo tempo, todos os equipamentos devem ser higienizados. A quarentena de animais recm-introduzidos e o tratamento desses animais, se necessrio, tambm compe medidas de controle.
E NDOPARASITOS
Protozorios entricos
Eimeria caviae
Este protozorio responsvel pela endoparasitose mais significativa da cobaia e sua presena j foi relatada em todo o mundo. Apesar de geralmente no ser patognica, nas infestaes mais extremas podem ocorrer tiflite e colite, manifestadas por diarria, anorexia, letargia, o que pode acarretar at 40% de mortalidade. O diagnstico confirmado pela identificao dos oocistos nas fezes ou, no exame post mortem, pelos achados de necropsia que incluem hiperemia da parede do clon, petquias e ndulos brancos (que contm oocistos) na mucosa. Essa condio pode ser controlada com a adoo de prticas sanitrias corretas, adequao de tcnicas de criao e uso de coccidiostticos. Foi relatado que o uso de uma soluo de sulfametazina ou sulfametiltiazol a 0,2%, na gua de beber, teve xito no controle dessa condio. Vale ressaltar que o tratamento de colnias de animais destinados experimentao restrito, no devendo interferir nas respostas das pesquisas. aconselhvel o tratamento apenas das matrizes e dos animais destinados reposio das mesmas.
Cryptosporidium wrairi
encontrado comumente na mucosa do leo de cobaia. No considerado patognico, mas j foi responsabilizado por perda de peso e enterites crnicas sem diarria. O diagnstico efetuado pela visualizao dos diferentes estgios de desenvolvimento na mucosa intestinal. As medidas de controle so semelhantes quelas aplicadas para a eimeriose.
Balantidium caviae
encontrado normalmente no ceco e, geralmente, no considerado patognico. Pode tornar-se um invasor secundrio se a mucosa j tiver sido lesionada por uma infeco concorrente como salmonelose. Causa morte em cobaias imunodeficientes. Pode ser controlado com boas prticas de higiene e manejo.
Protozorios tissulares
Leishmania enrietti
espcie-especfico para a cobaia, sendo utilizado em pesquisa sobre leishmaniose cutnea nessa espcie. As leses mais freqentes so as lceras cutneas, principalmente nos dedos, orelhas e nariz. A medula ssea, gnglios linfticos e rgos genitais tambm so afetados em infeces experimentais.
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O diagnstico feito pela identificao do parasita visualizado em cortes de amostras coradas por Giemsa. No h tratamento e o controle feito impedindo-se a entrada de possveis vetores na colnia.
Klossiella cobayae
No considerado patognico, porm pode confundir investigaes relacionadas histopatologia renal. um parasita das clulas do epitlio renal e do endotlio glomerular. No h sintomatologia clnica e as leses macroscpicas so vistas apenas em infeces graves quando a superfcie renal est irregular. O diagnstico baseado na identificao microscpica das diferentes formas evolutivas do parasita no rim, devendo ser diferenciado de outros protozorios como Toxoplasma e Encephalitozoon. O controle baseado em boas prticas de manejo e higiene, que reduzem a possibilidade de contato com urina infectada.
Pneumocystis carinii
um parasita de pulmo, especfico dessa espcie, podendo causar pneumonia intersticial e morte em animais imunodeficientes. Na pneumonia, os pulmes esto consolidados com muitos alvolos repletos de lquido protico contendo o agente.
Toxoplasma gondii
Na cobaia, como na maioria dos mamferos, ocorre o ciclo assexuado (hospedeiro intermedirio). uma zoonose. As infeces naturais so geralmente assintomticas. O parasita pode ser identificado em preparaes de seces histolgicas de tecidos infectados, principalmente corao e crebro. O tratamento, base de um preparado de 60 ppm de sulfadiazina, recomendado apenas para animais de grande valor. Deve-se evitar a contaminao da rao por fezes de gatos e prevenir o canibalismo na colnia.
Sarcocystis caviae
relativamente no-patognico e freqentemente confundido com o toxoplasma quando encontrado no tecido muscular. A forma cstica se desenvolve no msculo cardaco e esqueltico. No h sintomatologia e o diagnstico depende da visualizao do microorganismo em cortes histolgicos de tecido muscular. O controle obtido pela higiene adequada, sobretudo em relao gua e rao.
Encephalitozoon cuniculi
Este protozorio causa doena apenas em coelhos, mas pode ser raramente encontrado em tecidos de vrias espcies, porm raro na cobaia. Deve ser ressaltado no diagnstico diferencial da toxoplasmose por meio de tcnicas de colorao: na hematoxilina-eosina, esse parasita precariamente corado, ao contrrio do toxoplasma, que bem corado; o toxoplasma gram-positivo, enquanto Encephalitozoon gram-negativo.
Trematdeos
Fasciola hepatica e Fasciola gigantica
As infestaes por estes parasitas no so freqentes. No ciclo de vida, o caracol hospedeiro intermedirio e a metacercria ingerida com a vegetao pelo mamfero, em cuja parede intestinal o parasita migra at chegar ao fgado, onde se aloja nos canais biliares.
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Os sintomas so inespecficos, porm associados aos danos no fgado: anorexia, ictercia, debilidade geral e morte. O diagnstico baseado na identificao do parasita adulto no fgado durante o exame post mortem ou pela identificao dos ovos nas fezes. O controle eficaz mediante tratamento com uma nica dose de hexacloroetano, por via oral, na dosagem de 0,3 g/kg de peso vivo. Se os animais forem alimentados com vegetais frescos, estes devem ser previamente lavados antes de ingeridos.
Nematdeos
Paraspidodera uncinata
Este parasita de ceco e clon o nico helminto que se encontra facilmente na cobaia. O ciclo de vida fecaloral direto. Geralmente ele no patognico, mas pode acarretar a perda de peso e diarrias nas infeces graves. O diagnstico confirmado pela identificao das formas adultas no ceco e clon durante o exame post mortem ou pela identificao dos ovos em amostras fecais. O tratamento com levamisol na dosagem de 25 mg/kg, por via subcutnea, seguro e eficiente. Medidas adequadas de higiene e manejo favorecem o controle da infeco.
DOENAS NO-INFECCIOSAS
T OXEMIA G RAVDICA
Esta sndrome ocorre com certa freqncia na cobaia durante a gestao avanada, sendo caracterizada por acidose, cetose, degenerao gordurosa heptica, culminando com a morte. considerada uma desordem metablica e, dessa forma, um conjunto de fatores parece determinar a causa da doena: obesidade, jejum, carga fetal e outros. Foi sugerido que a compresso da aorta pela massa fetal, prejudicando a circulao, pode favorecer a toxemia gravdica. Um componente gentico tambm j foi cogitado para tal condio. Os animais especialmente susceptveis so cobaias obesas, gestando trs ou mais fetos, a partir do 56o dia de gestao. Entretanto, a prenhez no uma condio essencial, visto que cobaias virgens e obesas podem vir a bito da mesma forma se forem submetidas a estresse. Evidncias experimentais indicam que a obesidade, somada ao estresse, principalmente em razo de jejum prolongado durante a fase final da gestao, pode induzir sndrome. Os sintomas iniciam em torno de 7 a 10 dias antes do parto, so de curso agudo caracterizados por hiporexia, perda de peso, pelagem spera, prostrao, dispnia e morte. O pH normal da urina de 9 vai a um pH cido de 5 a 6. Ocorre tambm proteinria e cetonria. No exame post mortem so observadas isquemia uteroplacentria, com hemorragia e necrose nos stios de unio placentria; fgado de cor amarelo-castanho com zonas necrticas; supra-renais aumentadas com hemorragias na cpsula e crtex, e hemorragia subcapsulares nos rins. Microscopicamente, revelam-se hemorragias, necrose e edema nas zonas de insero da placenta, pronunciada infiltrao adiposa no fgado, com necrose de coagulao periportal e degenerao. Notam-se hemorragias difusas nas supra-renais, necrose das clulas tubulares proximais do rim, com hemorragia e trombose na cpsula. Para efeito de controle, indicada qualquer medida para se estabelecer um bom manejo. Fica sugerida a limitao da ingesto de alimento a fim de se evitar a obesidade, acasalar fmeas primparas antes que pesem 500 g, controlando o peso das demais para que no sejam mantidas em produo com mais de 900 g.
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O emprego de sistemas de criao que demandem altas taxas de produo recomendado. Evitar o estresse, mudanas bruscas na dieta e outros fatores que determinem abstinncia desfavorecem a condio.
E SCORBUTO
Escorbuto a doena caracterizada pela deficincia de vitamina C (cido ascrbico), que acomete algumas espcies animais incapazes de sintetizar, por meios prprios, tal composto. Entre os mamferos, esto includos o homem, os primatas no-humanos, a cobaia e o morcego frutfero. A incapacidade de sintetizar a vitamina C de origem gentica. As espcies susceptveis a desenvolver a doena no possuem o gene que codifica a sntese da enzima heptica gulonolactona-oxidase, envolvida na sntese da vitamina C a partir da glicose. Portanto, nessas espcies, se a dieta no for suplementada com alguma fonte exgena de vitamina C, o escorbuto se estabelecer num prazo varivel para cada espcie. decorrente da ausncia da vitamina C em suas funes normais dentro do organismo. O efeito maior est relacionado com a sntese do colgeno, na qual o cido ascrbico essencial. A deficincia de colgeno provoca vrios sintomas de severidade varivel conforme o grau de deficincia, tais como: perda de peso, hiporexia, diarria, secreo nasal e ocular, tumefao das articulaes costocondrais e gengivite; o desempenho reprodutivo tambm pode estar prejudicado; a cicatrizao de feridas e a coagulao do sangue estaro comprometidas. So visveis as anormalidades relacionadas aos ossos e vasos sangneos. Comumente so observadas hemorragias subperisticas nos tecidos subcutneos, nos msculos esquelticos e intestinos. Outras leses secundrias podem estar presentes, visto que essa doena aumenta a susceptibilidade a outras enfermidades. Microscopicamente, o escorbuto determina hemorragias em diversos tecidos como peristio, subcutneo e epitlios. Ocorrem alteraes tpicas nas zonas de ossificao dos ossos longos, havendo diminuio da espessura das zonas de proliferao e maturao da cartilagem, com perda da disposio das trabculas cartilaginosas. A falha no desenvolvimento sseo favorece as fraturas, hemorragias e tumefaes, em decorrncia de prejuzo na proliferao de fibroblastos. Previne-se o escorbuto atravs da administrao de vitamina C na gua de beber ou na rao. Devido ao rpido consumo e ao limitado armazenamento no organismo, a vitamina C deve ser oferecida diariamente ou no mnimo a cada 3 dias, superando a perda diria do elemento. O requerimento exato varia com a condio fisiolgica. Sugere-se 10 mg/kg de peso vivo ao dia para manuteno e 30 mg/kg de peso vivo ao dia para fmeas prenhes. Na gua de beber pode ser adicionado no mnimo 200 mg/l, sendo a mesma trocada diariamente, pois o cido ascrbico degradado em torno de 50% a cada 24 horas.
ALOPCIA
Na fase final da gestao e no ps-parto, sobretudo nas linhagens albinas de cobaia, comum a ocorrncia de perda de plo de maneira uniforme. O crescimento do plo volta ao normal imediatamente aps o parto e a pelagem se normaliza em 3 a 4 semanas. A probabilidade de recidiva do quadro aumenta a cada gestao, havendo casos em que o animal se torna totalmente desprovido de plos. A ocorrncia desse tipo de alopcia no exclusiva de fmeas em gestao, podendo ocorrer tambm entre os animais submetidos ao estresse da experimentao. Os machos so raramente afetados. A etiologia da alopcia ainda no foi compreendida, embora no se questione que est relacionada ao estresse. Uma causa hereditria j foi cogitada. Entretanto, a seleo dos descendentes no mostrou xito na tentativa de eliminar a condio.
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CALCIFICAO DE TECIDOS MOLES

Trata-se de uma condio freqentemente encontrada nos exames post mortem de animais com mais de um ano de idade. Caracteriza-se pela deposio de clcio em rgos como fgado, corao, pulmes e rins. A doena pode ser causada por um desequilbrio diettico entre clcio, fosfato, magnsio e potssio. Tambm j foi sugerido que o excesso de ingesto de vitamina D pode contribuir para o aparecimento da leso. O controle cuidadoso de tais elementos na dieta imperativo na manuteno do equilbrio cido-base e na preveno da calcificao dos tecidos moles.
B ABEIRA
uma afeco descrita na cobaia, caracterizada por presena de contnua umidade ao redor da boca, regio mentoniana e regio ventral do pescoo. O quadro pode evoluir para inapetncia, perda de peso e morte. A etiologia desse quadro est envolvida com dieta inadequada e dentio defeituosa. As ocluses anormais da boca podem produzir um excessivo crescimento dos dentes, o que determina dificuldade para mastigar, beber e reter saliva. A predisposio gentica, excessos ou deficincia de alguns nutrientes e substncias txicas na dieta podem favorecer a m ocluso.
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to Use and Care of Experimental Animals. Otawa: Canadian Councial on Animal Care, 1984. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Temas Seleccionados sobre Medicina de Animales de Laboratrio: el cobayo. Rio de Janeiro: CPFA/OPS/OMS, 1976. (Serie de Monografias Cientificas y Tecnicas)
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Criao e manejo de coelhos
C riao e Manejo de Coelhos

ORIGEM
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O coelho proveniente da Pennsula Ibrica e do norte da frica. O coelho caseiro tem sua origem a partir da domesticao e criao de coelhos silvestres na Idade Mdia, principalmente em mosteiros franceses. Constitui uma das mais importantes fontes de protena animal para alimentao humana nos EUA e no continente europeu. Vrias caractersticas levaram os coelhos a serem considerados animais convencionais de laboratrio. Apesar de serem descendentes de coelhos naturalmente agressivos, os que atualmente so mantidos em biotrios diferem muito daqueles utilizados sculos atrs, pois, em virtude da seleo gentica e da convivncia com o homem, tornaram-se animais dceis e de fcil manejo. As modificaes induzidas nesses animais esto baseadas em um complexo trabalho de acasalamentos direcionados, que visa a manter nos filhotes algumas caractersticas dos pais, eliminando comportamento ou alteraes indesejveis.
IMPORTNCIA NA EXPERIMENTAO BIOLGICA

O coelho foi um dos primeiros animais utilizados na investigao biomdica. Pasteur, em 1884, demonstrou que os ces podiam ser protegidos contra o vrus da raiva, mediante a inoculao de suspenses da medula espinhal, dessecada, de coelhos infectados experimentalmente com o vrus dessa enfermidade. Em razo de sua hipersensibilidade, os coelhos so muito utilizados na prova de irritantes cutneos primrios, rubefacientes, fotossensibilizadores, irritantes dos olhos e outros alrgicos. a espcie de eleio para testar a capacidade pirgena de preparados farmacolgicos e biolgicos. As grandes veias marginais de sua orelha proporcionam um acesso fcil ao sistema circulatrio, constituindose um recurso valioso na investigao sorolgica e imunolgica. Em resumo, o coelho utilizado em quase todas as reas da investigao biomdica, contribuindo grandemente para inmeros estudos cientficos.
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POSIO TAXONMICA
Quadro 1 Ordem Lagomorpha
FAMILIA LEPORIDAE (COELHOS E LEBRES) Gneros de Coelhos 1. Oryctolagus (coelho domstico) O. cuniculus 2. Sylvilagus (coelho comum) 13 espcies 3. Pentalagus 1 espcie 4. Romeralagus 1 espcie 5. Pronolagus 4 espcies 6. Caprolagus 1 espcie Fonte: Temas Seleccionados sobre Medicina de Animales de Laboratrio: el conejo (1976). Gneros de Lebres 1. Lepus (lebre) 26 espcies 2. Poelagus 15 espcies 3. Nesolagus 1 espcie FAMILIA OCHOTONIDAE (PIKAS Y CONEY) Gneros 1. Ochotona 14 espcies
Figura 1 Oryctolagus cuniculus
O coelho de laboratrio (Oryctolagus cuniculus) esteve, durante muito tempo, includo na ordem Rodentia. Na atualidade, pertence ordem Lagomorpha, por causa da diferena anatmica de sua dentio. A presena de quatro incisivos na mandbula superior permite distinguir os lagomorfos dos roedores.
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Pelo fato desses animais serem explorados, sobretudo para produo de carne, os sistemas de criao e produo so amplamente estudados e difundidos em tratados especficos. O coelho de laboratrio um dos poucos animais que mantm o conceito de raa como unidade de manejo. Dentre as raas mais utilizadas para fins laboratoriais, destacamos as seguintes: NOVA ZELNDIA peso entre 4 kg a 6 kg, de reconhecida docilidade, fcil reproduo e manejo, e com uniformidade de reaes nas provas experimentais; GIGANTES DE FLANDES atinge mais de 6 kg, preferido para a obteno de soro imunolgico; CALIFRNIA peso de 3 kg a 5 kg, apresenta diversas zonas pigmentadas em negro sobre o fundo branco. Sua principal caracterstica a rusticidade; HOLANDS com menos de 2,5 kg, bastante utilizado como animal de experimentao em virtude de seu pequeno porte e resistncia s contaminaes ambientais.
COMPORTAMENTO
Os coelhos, de uma maneira geral, so dceis, podendo morder ou arranhar em razo da conteno incorreta. So susceptveis ao estresse, assustando-se facilmente. No se deve manter machos adultos em uma mesma gaiola para evitar brigas (disputa de territrio). As fmeas adultas tambm no devem ser mantidas na mesma gaiola por apresentarem pseudogestao. Esses animais so mais sensveis ao calor que ao frio. A temperatura recomendvel varia de 17 C a 21 C e a umidade relativa de 40% a 60%.
PRINCIPAIS CARACTERSTICAS ANATMICAS E FISIOLGICAS

Os coelhos tm corpo arredondado, cabea grande provida de largas orelhas, com audio e olfato bem desenvolvidos e amplo campo de viso. A frmula dentria dos coelhos adultos : incisivo 2/1, caninos 0/0, pr-molar 3/2, molar 3/3. Todos os dentes tm crescimento contnuo. O crescimento do incisivo particularmente rpido, de aproximadamente 0,5 cm por ano, motivo pelo qual o animal deve ter contato com materiais que possa roer. Apesar disso, no rara a observao de animais com crescimento excessivo dos incisivos, o que provoca m ocluso dentria. Esta determinada por hereditariedade e impede a continuidade do animal no plantel, pois poder passar tal caracterstica indesejvel aos seus descendentes. As patas posteriores so mais compridas que as anteriores, o corao se encontra situado na parte mdia da caixa torcica, ligeiramente desviado para a esquerda, e no tem a aorta anterior. A temperatura mdia do corpo 38,3 C, podendo chegar a 39 C quando submetido ao estresse. A urina do coelho normalmente muito alcalina, com alto teor de cristais de fosfato e carbonatos. Sua cor oscila de amarelo intenso ou turvo-pardo, que pode ser confundida com uma descarga purulenta. O sistema genital similar ao dos mamferos tpicos. A fmea tem dois cornos uterinos e ambos se comunicam, separadamente, com a vagina. A fmea possui de 3 a 5 pares de tetas. O macho no tem glande e nem vesculas seminais. A fmea polistrica, podendo ser coberta a qualquer poca do ano. Como a gata e a fmea do furo, a coelha est includa entre os animais de ovulao provocada, ovula somente aps a cpula e/ou uma forte excitao sexual, muito embora exista uma pequena porcentagem que pode ovular espontaneamente. Os coelhos so sensveis penicilina. Esta pode causar distrbio de sua flora intestinal e produzir diarria. A ampicilina particularmente txica para o coelho.
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NUTRIO
O coelho fundamentalmente herbvoro e come a maioria dos tipos de gros, verduras e pastos. Tem um ceco grande, o qual produz uma fermentao bacteriana considervel. Pratica a coprofagia noturna, coletando fezes diretamente do nus. Essas fezes so envolvidas por uma membrana mucosa. Se supe que a coprofagia, juntamente com a fermentao fecal, proporcionam as quantidades necessrias das vitaminas do grupo B, protegendo contra alguma deficincia de aminocidos essenciais, e facilitam a digesto adicional de fibra e outros nutrientes, por uma segunda passagem atravs do trato digestivo. A sntese da vitamina ocorre no ceco. As raes comerciais so peletizadas, com dimetro no mximo de 50 mm por 70 mm de comprimento, contendo todos os nutrientes necessrios, como: protenas, carboidrato, fibras, vitaminas e outros. Os coelhos da raa Nova Zelndia adultos consomem em mdia 100 g a 200 g de rao por dia. As fmeas com lactentes precisam quantidade maior de rao, aumentada gradualmente com o crescimento dos filhotes. Tabela 1 Necessidades nutricionais para coelhos (concentrao na dieta)
NUTRIENTE Protenas (Cresc.) Protena (Reprod.) Lipdios Fibra bruta Energia total AMINOCIDOS Arginina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina MINERAIS Clcio Magnsio Fsforo Potssio Sdio Cobre Iodo Mangans VITAMINAS A D E Biotina Colina UNIDADE % % % % kcal % % % % % % % % % % % ppm % % % ppm ppm ppm Unidade UI/kg UI//kg UI/kg mg/kg mg/kg
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NECESSIDADE 16,0 18,0 2,0 12, 2.500 0,6 0,3 1,6 1,1 0,65 0,6 1,1 0,6 0,2 0,7 0,4 350 0,22 0,60 0,20 3,0 0,2 8,5 Necessidades 580, 150, 40, 0,2 1.200
Tabela 1 Necessidades nutricionais para coelhos (concentrao na dieta)(continuao)

VITAMINAS Colina cido Flico Niacina Riboflavina Tiamina Piridoxina Cianocobalamina UNIDADE mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg ug/kg NECESSIDADE 1.200 0,5 180, 7,0 5,0 39,0 10,0
Fonte: Nutrient Requirements of Laboratory Animals (1978).
A quantidade de rao recomendada deve ser administrada uma vez por dia, evitando assim o aumento do consumo de alimento, o que propiciaria a engorda excessiva dos animais, prejudicando, principalmente, a capacidade reprodutiva. A gua dever ser providenciada diariamente e ad libitum. O consumo de gua normal de coelho de dois meses de idade de 120 ml/kg/dia, e de um coelho de 1 ano de idade de 64 ml/kg/dia. Os bebedouros (com capacidade de 1.000 ml) devem ser trocados, higienizados e esterilizados diariamente.
MANEJO DOS REPRODUTORES

Uma criao deve ser iniciada com animais comprovadamente puros, de pedigree e criteriosamente selecionados pelos valores genticos e estticos. Os animais escolhidos para futuros reprodutores devero ser alojados em gaiolas individuais, com dimenses mnimas de 45 x 60 x 40 cm, a partir dos 2 meses de idade. A puberdade ocorre entre 150 180 dias, com peso entre 3.000 g a 3.500 g. A relao entre macho e fmea, para acasalamento, de 1 macho para cada 10-12 fmeas reprodutoras. Porm, em se tratando de uma colnia fechada, a relao de macho e fmea passa a ser de 3 a 4 machos para 10 a 12 fmeas na tentativa de evitar o aumento da consanginidade da colnia (ver o tpico Controle da Consanginidade na Colnia). Para acasalamento, os machos e as fmeas devero ter, no mnimo, 6 meses de idade. Durante os 3 primeiros meses, o macho no dever fazer mais de duas coberturas por semana. Considerando-se um biotrio de criao, os coelhos com cerca de trs a quatro anos de idade so descartados, devido ao declnio de sua capacidade reprodutiva.
REPRODUO E ACASALAMENTO
A coelha deve ser levada gaiola do macho para facilitar o acasalamento, pois, caso contrrio, o macho, fora do seu territrio, passar a examinar o novo local, deixando de fazer a cobertura. Uma vez introduzida a fmea na gaiola do macho, dever ocorrer a cobertura aps alguns minutos. conveniente que o tcnico assista e constate a cobertura, observando o comportamento do macho (que se deixa cair de costas emitindo rudos guturais, ainda preso fmea) e/ou, por meio de um simples exame da vagina, observa-se a presena de lquido seminal. Se a coelha tenta fugir do macho, correndo em crculos, basta o tcnico colocar sua mo diante da cabea da fmea para det-la. Se o problema persistir, ser melhor levar a outro macho. Aps o acasalamento, a fmea ser levada a sua gaiola. Em nenhuma hiptese ela dever ser deixada com o macho.
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A retirada da coelha da gaiola deve ser feita com bastante calma e cuidado, impedindo que o animal d patadas com os membros posteriores. Para se evitar esse problema, recomenda-se devolv-la a sua gaiola com a introduo da parte posterior do animal em primeiro lugar. Ao contrrio da maioria dos mamferos, a coelha no tem ciclo estral regular. Ela poder ser fecundada durante 12 dos 16 dias de durao de seu ciclo ovariano. A ovulao ocorre, aproximadamente, 10 horas aps a cpula. O acasalamento (cpula), de modo geral, feito no 30o dia aps o parto. Porm, em se tratando de animais de laboratrio, est relacionado com o peso da fmea e da ninhada. Geralmente ocorre 40 dias aps o parto no momento do desmame. A fmea que apresentar abertura da vulva com uma cor vermelha escura poder proporcionar de 70% a 75% de fertilizao. Se a vulva de cor vermelha plida, a fmea estar na ltima etapa do estro e a fertilizao ocorrer em 30%. Apesar de tal mtodo de observao exigir maior tempo, o que proporciona melhores resultados. Tambm podemos verificar o comportamento da fmea diante do macho sugerindo ou no receptividade cobertura, tais como: inquieta, levantando o trem posterior, cabea baixa entre as patas dianteiras, esfregando-se nas paredes da gaiola, agitando a cauda com movimento nervoso etc. A fim de assegurar a fecundao, recomendamos duas a trs cpulas, sempre assistidas pelo tcnico.
PERODO DE GESTAO E DIAGNSTICO

A gestao tem durao de 30 a 32 dias. Com o propsito de evitar a manuteno de fmeas ociosas, o tcnico deve constatar a gravidez, depois da cobertura, palpando delicadamente a parte posterior do ventre da coelha (palpao abdominal), no 14o dia aps o acasalamento, para sentir os fetos. Caso no os encontre, dever ser coberta novamente. A palpao feita colocando-se a mo sobre o ventre da coelha, pressionando-se suavemente de trs para a frente e com o dedo polegar de um lado e o indicador e o mdio do outro.
PSEUDOGESTAO
Ocorre em virtude da presena do macho ou quando montada por outra fmea. Esses estmulos determinam a ovulao e o corpo lteo, que persiste de 18-21 dias, quando ento ocorre secreo de progesterona, a qual promove o aumento das mamas e o incio da retirada dos plos do abdmen para fazer o ninho.
PARTO E MANEJO DOS LPAROS

No perodo compreendido entre 2 a 3 dias antes do parto, o tcnico dever colocar na gaiola da fmea (com dimenses mnimas de 90 x 60 x 40 cm) o material necessrio para fazer o ninho (feno ou palha). A prpria fmea se encarregar de preparar o ninho, completando-o com os plos retirados do abdmen, que tambm facilitar o aleitamento e favorecer a transferncia de calor para os filhotes. Geralmente o parto ocorre noite e no requer nenhuma assistncia por parte do tcnico. O ninho deve ser manuseado com extrema delicadeza, caso contrrio a fmea poder vir a rejeitar seus filhotes. Os lparos nascem com 60 g a 80 g, com ausncia de plos, com olhos e orelhas fechados e com dentes incisivos. Os olhos so abertos no 10o dia e os filhotes iniciam sua alimentao slida 15 dias aps o nascimento.
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A mdia da ninhada de 6-8 lparos, excepcionalmente podendo chegar a 15. Quando ocorre parto com mais de 10 lparos, os excedentes devero ser transferidos para outra coelha que tenha menos de 8, e com 2 a 3 dias (no mximo) de diferena de idade. O tcnico deve verificar os ninhos, diariamente, retirando os lparos mortos, bem como os que esto muito fracos. Antes de colocar as mos nos filhotes, o tcnico deve esfreg-las no material do ninho para evitar rejeio da ninhada pela fmea ou o canibalismo. As principais causas da rejeio e do canibalismo esto relacionadas ao manejo inadequado, presena de lparos mortos ou deformados, fmeas do 1o parto, mamites, ninhos defeituosos e estresse. A coelha que abortar ou praticar o canibalismo em partos sucessivos deve ser descartada da colnia.
PROCEDIMENTO NO DESMAME
Os filhotes sero desmamados por volta dos 40 dias de idade, com peso entre 800-1.500 g. Deve-se retirar a me da gaiola e manter a ninhada por uma semana, evitando, assim, mudana brusca do seu hbitat e quebra do equilbrio, que, conseqentemente, causam problemas digestivos e diarria. Na segunda semana, aps o desmame, separa-se machos e fmeas, agrupando-os com outras ninhadas que tenham o mesmo tamanho.
SEXAGEM
A distncia ano-genital nos machos recm-nascidos visivelmente maior do que nas fmeas. A determinao do sexo se faz contendo-se adequadamente o animal, trazendo-o contra seu corpo, separando-se as patas posteriores com uma das mos e com o polegar vai-se empurrando ligeiramente para dentro os rgos genitais externos. Os machos apresentam o pnis com extremidade arredondada e as fmeas apresentam abertura vaginal e a vulva. Em algumas raas as caractersticas sexuais secundrias so aparentes. As fmeas podem apresentar papadas e os machos so mais gordos e tm a cabea quadrada.
CONTROLE DA CONSANGINIDADE NA COLNIA

Animais consangneos Inbred so obtidos pelo acasalamento entre irmos e/ou pais e filhos durante 20 ou mais geraes consecutivas. difcil de se obter homozigose total em razo do elevado nmero de genes letais presentes na constituio gentica dos coelhos. Uma lista de 19 variedades figuram em um trabalho publicado por Jay (apud OPS, 1976). Animais no-consangneos Outbred so os que apresentam constituio gentica variada, em estado de heterozigose, que deve ser conhecida e mantida. O emprego do sistema de acasalamento rotacional visa a manter animais heterozigotos, evitando-se o acasalamento de parentes prximos e assegurando-se que a gerao seguinte venha de um maior nmero de pais do que o que ocorreria se fosse feito ao acaso. Ao empregar esse sistema, a colnia se desenvolve em vrios grupos de igual nmero de modo que a quantidade de fmeas e machos em todos os grupos sempre igual. O nmero de grupo de uma colnia est relacionado ao seu tamanho (nmero de reprodutores). Quanto menor a colnia, maior o nmero de grupos. Em uma colnia de criao e produo de coelhos, utilizamos um sistema de acasalamento similar ao sistema rotacional (Mtodo Poiley).
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Suponhamos que a colnia consista de 120 fmeas e 36 machos, com gaiolas individuais para cada reprodutor, numeradas de forma que identifique os grupos, e que essa colnia esteja dividida em 6 grupos, onde cada um deles constitudo de 20 fmeas e 6 machos. Quadro 2 Esquema de acasalamento para cada gerao de coelhos
Formao do novo grupo 1 2 3 4 5 6 = = = = = = = Macho do grupo 3 6 5 1 2 4 x Fmea do grupo 6 1 2 3 4 5
A durao de ciclo de acasalamento (perodo reprodutivo) determinado pela biologia reprodutiva da espcie, que nos coelhos varia de 3 a 4 anos. A prxima gerao ser formada por fmeas filhas de cada reprodutora e machos filhos de cada reprodutor da colnia.
PRODUO MENSAL ESTIMADA EM UMA COLNIA COM 120 FMEAS E 36 MACHOS REPRODUTORES
Sabendo-se: Perodo mdio de gestao = 30 dias Nmero mdio de filhotes/parto = 6,67 Taxa de mortalidade de lactente = 10% Nmero de filhote/desmamados/partos = 6,0 Desmame = 42 dias de idade Acasalamento = 30O dia aps o parto e/ou no final do segundo ciclo ovariano Intervalo entre partos = 30 dias de gestao 30 dias aps o parto 30 dias de gestao 90 dias 365 dias (ano): 90 dias (intervalo) = 4 partos/ano 4 partos x 6 lparos = 24 lparos desmamados/ano/fmea 24 lparos (ano) x 120 fmeas = 2.880 lparos desmamados/ano, ou seja, 240 lparos desmamados/ms. Dos lparos nascidos e/ou desmamados, 50% so fmeas e 50% so machos. A cada perodo de 36 meses, o nmero de reprodutores (macho e fmea) substitudo em 100%. Mensalmente, so substitudos 1:36 das fmeas = 3,3 e 1:36 dos machos =1. Considerando que a taxa de mortalidade dos reprodutores e animais em crescimento seja 2,5%, necessitamos de uma reserva mensal de 4 fmeas e 2 machos para futuros reprodutores.
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IDENTIFICAO DOS ANIMAIS E REGISTRO DA COLNIA

Para um efetivo controle e conhecimento da colnia, necessrio que se faa a identificao individual dos animais e um adequado registro de todas as ocorrncias, que constituem parte fundamental do trabalho dirio do bioterista. No que se refere identificao dos animais, no existem normas rgidas a serem seguidas. O tcnico dever utilizar materiais disponveis em seu biotrio, porm existem mtodos que, pelo uso corrente, demonstram eficincia e servem como orientao ao tcnico, como:
PARA I DENTIFICAO
DOS
A NIMAIS
APLICAO DE CORANTES solues concentradas de cido pcrico (amarelo), de fucsina (roxo), de violeta de metila ou genciana (violeta) etc. Lembramos que esse tipo de identificao, embora eficiente, de curta durao e deve ser periodicamente renovada. TATUAGENS os aparelhos disponveis para essa finalidade, os tatuadores, so facilmente encontrados no mercado. Eles marcam diretamente nmeros ou letras com a utilizao de tinta preta para animais albinos, ou verde para animais com pelagem colorida. As tatuagens so feitas nas regies menos vascularizadas, na superfcie interna do pavilho auricular e indispensvel a assepsia e anestesia local. Trata-se de um processo de rpida visualizao e dura por toda a vida do animal. FICHAS DE IDENTIFICAO E LIVROS DE REGISTROS talvez o trabalho de maior responsabilidade a ser executado no biotrio seja o de anotar os eventos ocorridos com os animais nas respectivas fichas de identificao de gaiolas e em livros de registro. As fichas e os livros devem conter informaes suficientes para que se tenha, a cada momento, uma posio exata de tudo o que acontece na colnia, tais como: acasalamentos, datas de nascimento, quantidade de filhotes nascidos, de animais mortos, desmamados etc.
PARA F ACILITAR
REGISTRO
DA
C OLNIA
CONTENO a forma mais segura de conter um coelho pegando-se com uma das mos a pele do pescoo e com a outra as patas traseiras, segurando-o junto ao corpo. Para grandes trajetos, coloca-se o animal sobre o antebrao com a cabea dirigida para o corpo, segurando firmemente as patas traseiras. Nunca se deve levantar um coelho pelas patas ou pelas orelhas, pois so propensas a leses de coluna vertebral e freqentes fraturas. Os coelhos tambm podem ser controlados por uma forma de hipnose fsica, por meio de carcias muito delicadas, que permite sua tranqilidade por algum tempo. Para inoculao ou retirada de sangue da veia marginal da orelha, utilizamos caixa apropriada para conteno. ANESTESIA os anestsicos devem ser utilizados sempre que necessrio, obtendo-se maior facilidade e tempo de manipulao do animal. Os anestsicos por inalao, halotano e metoxiflurano, podem ser administrados com segurana, utilizandose equipamentos adequados. No entanto, seu uso no de rotina em animais de experimentao, em razo do custo e da necessidade de equipamento especial, bem como de tcnico especializado.
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Quadro 3 Medicao pr-anestsica para coelho
DROGA Sulfato de Atropina Acetil Promazina Clorpromazina Diazepan Propiopromezine Ketamina HCl Kylazina DOSAGEM 0,04 - 0,1 mg/kg 1,0 mg/kg 25 mg/kg 5-10 mg/kg 5-10 mg/kg 20-44 mg/kg 3-5 mg/kg VIA DE ADM. I.M e I.V. I.M I.M I.M. I.M. I.M. I.M. EFEITO tranqilizante por 30-60 min. Tranqilizante sedao 60-100 min. Tranqilizante Imobilizao Sedao
Quadro 4 Anestsicos injetveis para coelhos (hipnticos/sedativos)

DROGA Ketamina HCl + Xylazina Fentanyl / Droperidol (Innovar. vet) Fentanyl / Fluanisone Pentobarbital Thiopental Thiamylal DOSAGEM 35 mg/kg + 5 mg/kg 0,17 ml/kg 0,3 -0,5 mg/kg 20-40 mg/kg 50 mg/kg 22-54 mg/kg VIA DE ADM. I.M. I.M. I.M. I.V. I.V. I.V. EFEITO Sedao por 20-70 min. sedao Sedao anestesia anestesia anestesia por 5-10 min. anestesia por 5-10 min.
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. NATIONAL RESSEARCH COUNCIL. Nutrient Requirements of Laboratory & Animals. 3nd ed. Washington, D.C.: National Academy of Sciences, 1978. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Temas Seleccionados sobre Medicina de Animales de Laboratrio: el conejo. Rio de Janeiro: CPFA/OPS/OMS, 1976. (Serie de Monografias Cientificas y Tecnicas)
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POILEY, A. M. A Systemic Method of Breeder Rotation for Nom-Inbred Laboratory Animal Colonies. Proc. Anim. Care Pan., 10(4):159-166, 1960. SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratorio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias/Ministerio da Agricultura, Pesca y Alimentacion, 1983. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 5th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1976.
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Principais doenas dos coelhos
Principais Doenas dos Coelhos

INTRODUO
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Os coelhos so afetados por uma variedade de doenas que podem interferir na sua utilizao na experimentao, o que os torna, nesse caso, um elemento biolgico inferior, aumentando consideravelmente o custo da investigao. As doenas que mais comumente afetam os coelhos so as do trato respiratrio e as intestinais. Muitas dessas doenas esto presentes na colnia de forma subclnica e podem aparecer como surtos em conseqncia do estresse provocado por mudana de manejo, transporte ou pela manipulao durante a experimentao. Os animais portadores de agentes infecciosos, mesmo que de forma latente, constituem focos potenciais de infeco. O controle das enfermidades pode ser mais eficaz se forem adotadas prticas de manejo que desfavoream a transmisso direta dos agentes. Aconselha-se evitar a troca de comedouros e bebedouros, manuteno de nmero adequado de animais por gaiola e no manter animais de diferentes espcies na mesma sala. A quarentena dos animais recentemente introduzidos na colnia constitui medida indispensvel no controle de enfermidades. Esse perodo no deve ser menor que 14 dias e, nessa poca, os animais devem ser minuciosamente examinados diariamente em busca de sinais que apontem a presena de doena. O coelho saudvel alerta e bem provido de carne. As patas dianteiras so paralelas entre si, ao passo que as traseiras se flexionam sob o corpo. O metatarso que est em contato com o piso da gaiola, portanto, o que suporta boa parte do peso do animal. As orelhas so mveis, voluntria e independentemente, e alertas a qualquer rudo estranho.
DOENAS INFECCIOSAS DE ORIGEM BACTERIANA

P ASTEURELOSE
A pasteurelose uma doena respiratria contagiosa muito importante nos coelhos, caracterizada por infeco do trato respiratrio superior com rinite e conjuntivite crnicas e mucopurulentas. O agente etiolgico Pasteurella multocida, que tambm afeta outros animais domsticos e de laboratrio. Na cobaia, determina severa pneumonia. Bordetella bronchiseptica e Haemophilus sp podem estar associados como agentes secundrios.
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A transmisso ocorre por contato direto com animais infectados, ou indiretamente por intermdio de equipamentos contaminados, aerossis e pelo tcnico. H transmisso sexual. Os sintomas variam desde uma ligeira descarga nasal no-progressiva at uma septicemia aguda e morte. Geralmente as anormalidades das vias respiratrias superiores so os achados mais freqentes, sendo caracterstica a descarga nasal mucopurulenta acompanhada de espirros. A doena pode se sustentar com esse quadro por longos perodos, propagando-se rapidamente pela colnia. A evoluo para formas mais severas acontece quando a resistncia imunolgica do animal fica prejudicada. Nos casos mais severos, evidencia-se broncopneumonia com estertores audveis durante a conteno do animal. O quadro tem curso agudo e fatal. A conjuntivite um sintoma comum, proveniente da contaminao do ducto naso-lacrimal, mas geralmente benigna. A pasteurelose tambm pode causar otite mdia com desvio do pescoo. Ocasionalmente, ocorrem abscessos subcutneos que, mesmo encapsulados, podem causar septicemia. Nas infeces genitais resultantes de transmisso sexual, as fmeas desenvolvem metrites e piometra, ao passo que os machos apresentam orquites. As leses encontradas no exame post mortem variam desde ligeira inflamao dos condutos nasais at pneumonia severa. Os pulmes podem estar normais, firmes ou edemaciados de cor roxa escura a acinzentada, com abscessos disseminados ou focais. H acmulo de fibrina nas superfcies pleural e pericrdica. Microscopicamente, so vistos acmulos extensos de exudato purulento que, dependendo da severidade, podem obstruir completamente a rvore respiratria. Observam-se tambm reas focais ou disseminadas de necrose e hemorragia. O diagnstico confirmado pelos sintomas, pelas leses anatomopatolgicas e isolamento do agente. O tratamento baseado na antibioticoterapia de baixa eficcia. O nico mtodo eficaz de erradicao da doena o descarte de toda a colnia, esterilizao dos equipamentos e da sala, alm da obteno de animais isentos da infeco. A utilizao de vacinas preparadas com antgenos capsulares do agente demonstrou algum xito na preveno da doena. A criao de animais livres de patgenos especficos constitui o mtodo mais efetivo e prtico para se prevenir a instalao da pasteurelose na criao de coelhos.
D OENA
DE
T YZZER
Trata-se de uma enfermidade comum entre os camundongos e pode provocar surtos graves em colnias de coelhos. causada pelo Bacillus piliformis, transmitido por contato oral direto, mas necessria a ocorrncia de alguma condio debilitante para desencadear a doena. As idades de 3 a 12 semanas so as mais susceptveis. O quadro clnico caracterizado por diarria lquida a mucide, profusa e espontnea, seguida de morte num perodo que varia de 12 a 72 horas. No exame post mortem, observam-se leses necrticas no intestino, clon proximal, leo distal, fgado e , o agente invade outros miocrdio. Supe-se que o foco primrio da infeco seja o intestino e, a partir da, rgos atravs da via linftica. O diagnstico confirmado com base na visualizao do agente no citoplasma das clulas prximas s leses necrticas, utilizando coloraes especiais nas amostras (PAS, Giemsa, Warthin Starry, Leviditti). Como medida de controle, deve ser evitada qualquer condio que possa favorecer o estresse entre os animais.
S ALMONELOSE
uma doena zoontica que ocorre na maioria das espcies animais, sendo rara em colnia de coelhos. Os agentes etiolgicos, Salmonella typhimurium e Salmonella enteriditis, so transmitidos atravs de alimentos e gua contaminados por fezes de outros animais doentes ou portadores assintomticos.
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A doena no determina sintomas especficos. Os animais doentes se curvam, apresentam diarria e debilidade geral crescente. As leses incluem: esplenomegalia, congesto e petquias no bao, pequenos focos de necrose no fgado, ulcerao do intestino e enterite hemorrgica. O diagnstico concludo a partir do isolamento in vitro do agente e identificao do mesmo mediante provas bioqumicas. O tratamento no recomendado, visto que induz ao estado de portador, facilitando a disseminao da doena. O controle se baseia na utilizao de boas prticas de higiene e manejo, eliminao de animais doentes e portadores. A transmisso ao homem pode ser evitada com a adoo de hbitos de higiene pessoal adequados.
N ECROBACILOSE
uma doena pouco comum em coelhos, causada pelo Bacillus fusiformis, sendo a maioria dos animais susceptveis doena. O agente um habitante normal da pele e penetra no organismo atravs de soluo de continuidade. A enfermidade se caracteriza por ulceraes progressivas da pele e tumoraes subcutneas, sobretudo na face e na cavidade bucal. Pode ocorrer necrose local, edemas, crostas e abscessos. O quadro pode evoluir para linfadenite e pneumonia. O sintoma mais marcante a dificuldade para comer nos animais afetados. O diagnstico clnico e atravs do isolamento do agente. O tratamento fundamentado na drenagem cirrgica e antibioticoterapia com penicilina intramuscular. Geralmente, boas prticas de manejo e higiene ajudam a controlar essa enfermidade. O homem pode servir de fonte de infeco, quando no se adotam bons hbitos de higiene pessoal, visto que o agente tambm habita o organismo humano.
P SEUDOTUBERCULOSE
mais comum entre os coelhos selvagens. O agente etiolgico Yersinia pseudotuberculosis, transmitida por roedores selvagens, eliminada nas fezes, penetrando por via oral. Para os coelhos de laboratrio, a via de infeco a ingesto de gua e rao contaminada com fezes de roedores selvagens. Clinicamente, observa-se uma depreciao geral do estado fsico, inchao nas articulaes e, muitas vezes, ndulos abdominais tornam-se palpveis. Na fase terminal, nota-se emaciao, anorexia e dispnia. A doena se propaga lentamente atravs da colnia. Na necropsia, observam-se ndulos caseosos por todos os gnglios e rgos linfticos. Bao, fgado, pulmes e intestino esto quase sempre afetados. s vezes ocorrem leses articulares. As leses microscpicas so semelhantes s da tuberculose. O diagnstico baseado nas leses e no isolamento do agente. Nenhum tratamento recomendado, devendo-se sacrificar todos os animais doentes. A preveno da entrada de roedores selvagens na colnia e aquisio de cama, gua e rao de fontes confiveis so medidas indispensveis no controle dessa enfermidade.
E SPIROQUETOSE
Doena raramente diagnosticada em coelhos, especfica dessa espcie, causada por Treponema cuniculi, transmitida durante o coito. Essa enfermidade venrea se caracteriza pela presena de reas erosivas, ulceradas ou por pequenas ppulas nas reas desprovidas de plo da genitlia externa. As leses podem estender-se ao tarso, lbios, narinas, orelhas e conjuntivas. Microscopicamente, as leses se apresentam como ulcerao, edema, hiperqueratose e infiltrado inflamatrio ao redor das reas de necrose e dos folculos pilosos.
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O diagnstico diferencial para sarna e queimaduras deve ser providenciado. O agente pode ser revelado nas leses por coloraes por prata ou microscopia de campo escuro. O tratamento com penicilina permite manter os animais recuperados em reproduo.
T ULAREMIA
Apesar de ser uma enfermidade significante apenas entre os coelhos selvagens, trata-se de uma zoonose fatal para o homem. O agente etiolgico Francisella tularensis, transmitida por contato direto com animais doentes ou por picada de artrpodes hematfagos, podendo penetrar na pele intacta ou na conjuntiva. A doena determina o aparecimento de focos esbranquiados puntiformes espalhados por todo o fgado, bao e linfonodos. Microscopicamente, as leses tm aspecto caseoso no centro, circundadas por linfcitos, neutrfilos e macrfagos. O diagnstico confirmado pelo cultivo e isolamento do agente; no se recomenda qualquer tratamento. O controle est baseado na eliminao dos animais doentes, na preveno da entrada de animais selvagens e insetos vetores na colnia e no uso de equipamento de proteo individual pelos tcnicos de sala.
T UBERCULOSE
uma doena rara entre os coelhos, tendo sido constatados alguns casos isolados, em que a infeco foi adquirida atravs da ingesto de leite de vacas infectadas e de alimentos contaminados por fezes de aves infectadas. A enfermidade determina um quadro granulomatoso nos pulmes, fgado e bao. A prova intradrmica no confivel.
P SEUDOMONAS
Pseudomonas aeruginosa um agente etiolgico comum s diversas espcies animais, mas tem maior importncia para os ratos e camundongos. A doena se desenvolve a partir da exposio a animais portadores ou a fontes de gua contaminada. Os sintomas so debilidade geral, diarria, disfuno respiratria e morte sbita. As leses freqentemente encontradas so pneumonia e enterite, mas podem haver casos agudos sem leses em conseqncia de toxemia (o microorganismo produz uma exotoxina). O diagnstico feito pelo isolamento do germe a partir de secrees respiratrias, contedo intestinal ou das leses pulmonares. O controle da enfermidade promovido pelo tratamento adequado da gua (1,5 a 2 ppm de cloro livre e/ou acidificao at pH 2,5) e do equipamento provedor de gua, eliminao dos animais doentes, preveno e controle do estresse, principalmente durante a experimentao.
M ASTITE
Ocorre freqentemente em coelhas em lactao ou naquelas que desenvolvem pseudociese. Os agentes geralmente isolados da leso so Staphylococcus sp e Streptococcus sp. A causa primria dessa condio est, na maior parte das vezes, envolvida com traumatismo, porm alguns fatores, como grades da gaiola, cama suja, leses de mamilo, causadas pela prpria cria e reteno de leite, favorecem o aparecimento do quadro. A infeco pode se disseminar com os lparos. As fmeas acometidas apresentam anorexia, febre (> 40,5 C), sede acentuada e uma ou mais glndulas mamrias hipermicas, firmes, inchadas e de cor azulada.
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O tratamento consiste na administrao de penicilina por via intramuscular durante 7 dias. O controle se baseia na preveno dos fatores predisponentes.
DOENAS INFECCIOSAS DE ORIGEM VIRAL

V AROLA
DOS
C OELHOS
uma enfermidade altamente contagiosa, determinada por uma espcie de vrus do grupo da varola, adaptada ao coelho. Esse vrus pode ser transmitido por contato direto ou atravs de equipamentos/materiais e durante a manipulao de tratadores. A doena pode se manifestar de forma hiperaguda, sem o desenvolvimento de leses, ou como uma enfermidade menos aguda com formao de leses tpicas de varola. Na forma mais leve, h aumento dos linfonodos poplteos, erupo macular, seguida de ppulas por todo o corpo, mais acentuadamente na regio inguinal. Mais tarde formam-se crostas amarronzadas que se soltam das ppulas. Pode haver perda de dentes, leses nos lbios e palato. Quando o sistema nervoso central afetado, h paralisia dos esfncteres urinrio e anal. A pneumonia normalmente a causa mortis. Nas fmeas grvidas e em lactao a doena mais grave, sendo comum o aborto e anomalias neonatais. Na forma hiperaguda da doena, o nico achado na microscopia a broncopneumonia. Nas leses de pele, podem ser observados invaso mononuclear, necrose e edema. O diagnstico concludo pelos sintomas clnicos e pela sorologia. No existe tratamento, sendo a vacinao a medida de controle mais eficaz, alm da manuteno de boas prticas de manejo.
M IXOMATOSE
uma doena extremamente fatal (mortalidade 100%), causada por um vrus do grupo da varola, que tem um artrpode como vetor (mosquitos, caros, pulgas, piolhos e moscas). O perodo de incubao varia de 7 a 10 dias e os sintomas se iniciam com febre, descarga ocular serosa e blefaroconjuntivite, que culmina com descarga mucopurulenta e edema e pus nos olhos. Tumoraes subcutneas se desenvolvem no nariz, lbios, orelhas e aberturas genitais, em forma de ppulas vesiculadas e gelatinosas, que tendem a se generalizar. Aps 2 a 5 dias o animal vem a bito. As tumoraes esto freqentemente aderidas musculatura adjacente. Apresentam aspecto mucide, gelatinoso e cor avermelhada. Os linfonodos esto aumentados e hemorrgicos. H petquias na superfcie do bao e esplenomegalia. Broncopneumonia, orquite e epididimite so leses comuns. Microscopicamente, ocorre hipertrofia e hiperplasia das clulas epiteliais, cujo citoplasma est vacuolado com grnulos eosinoflicos. A derme mixomatosa e tem grandes clulas em fuso que representam fibroblastos hipertrofiados. O diagnstico concludo com base nos dados clnicos, epidemiolgicos e anatomopatolgicos. No h tratamento disponvel. O controle obtido pela preveno de insetos e sacrifcio dos animais doentes.
F IBROMA
DE
SHOPE
Esta enfermidade no comum entre os coelhos de laboratrio, porm sua importncia reside na antigenicidade cruzada do vrus do Fibroma de Shope com o vrus da Mixomatose, podendo o primeiro promover imunidade de at 6 meses para a mixomatose. O vrus do Fibroma de Shope, tambm pertencente ao grupo da varola, transmitido por mosquitos ou caros vetores.
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O quadro clnico da doena caracterizado por ndulos subcutneos nicos ou mltiplos, e os rgos genitais podem estar edemaciados. A doena tem curso fatal principalmente para os lparos, enquanto os adultos podem se recuperar espontaneamente dos tumores subcutneos. Na necropsia, as tumoraes podem estar presentes tambm nos rins, fgado, medula ssea e mesentrio. Microscopicamente, os tumores tm aspecto mixofibromatoso com incluses citoplasmticas eosinoflicas. O diagnstico definitivo obtido aps provas sorolgicas, porm o quadro clnico e epidemiolgico colaboram na elaborao da suspeita clnica. No h tratamento, restando a preveno dos vetores como medida de controle.
DOENAS INFECCIOSAS DE ORIGEM FNGICA DERMATOFITOSES

Tratam-se de doenas pouco comuns nos coelhos. Os agentes que podem estar envolvidos so: Trichophyton mentagraphytes, Microsporum canis e Trichophyton gypseum. A transmisso ocorre por contato direto com animais doentes. Clinicamente, observam-se leses inicialmente na pele da cabea ou orelhas, que se estendem para outras regies do corpo. O aspecto crostoso, hipermico, pruriginoso e sem plo. Os animais so geralmente acometidos isoladamente, e no em epizootias. Os cortes histolgicos das leses mostram espessamento da epiderme, hiperqueratose e infiltrado mononuclear na derme. Ressalta-se a necessidade de diagnstico diferencial para sarna, carncia gentica de plo, muda da pelagem, arrancamento da pelagem de ordem comportamental. O diagnstico definitivo se faz a partir de raspados de pele em torno da leso, tratada com KOH a 10%, revelando a presena de formas fngicas nas clulas epiteliais e plos. O agente pode ser isolado e cultivado em meios prprios para fungos. A administrao oral de griseofulvina (25 mg/kg/dia) durante 14 dias traz bons resultados no tratamento. Como medida de controle, resta isolar e tratar os animais doentes, alm de evitar contato com outros animais invasores. O homem pode servir de fonte de infeco como tambm pode se contaminar, sendo exigida adequada higienizao antes e depois de manipular os animais para efetivo controle da doena.
DOENAS PARASITRIAS
ECTOPARASITOS
Pediculose
Haemodipsus ventricosis um piolho sugador que raramente acomete os coelhos de laboratrio. A parasitose traz como maiores danos uma dermatite no local da picada e um quadro de anemia nas infestaes acentuadas. Confirmada a presena do piolho na base do plo durante o exame clnico, o tratamento indicado a aplicao de compostos inseticidas na pele e no plo do animal. A quarentena dos animais recentemente adquiridos permite prevenir a instalao da doena entre os animais.
Sarna de orelha
Psoroptes cuniculi um caro, parasita do conduto auditivo externo, comumente encontrado nas colnias de coelhos de laboratrio, que determina a presena de material crostoso, fibrinoso de cor amarronzada na base da orelha. Os caros so extremamente irritantes, causando prurido intenso. Os animais balanam intensamente a cabea, chegando a gerar perda de plo ao redor do pescoo e leses por traumatismo. Nos casos mais severos, a dor intensa e uma otite mdia pode se desenvolver.
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Os caros podem ser visualizados durante o exame otoscpico. O tratamento consiste na limpeza do conduto auditivo e na aplicao de leo mineral com princpio acaricida.
Sarna do corpo
uma condio rara, porm muito contagiosa, causada pelos caros Sarcoptes scabei (cuniculi) e Notoedrus cati (cuniculi). As leses so tipicamente pruriginosas, com reas hipermicas em forma de arranhes. O raspado de pele da leso revela a presena do caro. O tratamento nem sempre eficaz e consiste na aplicao tpica de solues acaricidas. Dessa forma, a medida de controle mais indicada a eliminao dos animais doentes.
E NDOPARASITOS
Nematdeos
Quadro 1 Nematdeos considerados incomuns nos coelhos de laboratrio
Obeliscoides cuniculi Graphidium strigosum Passalurus ambiguus Passalurus nonannulatus Dermatoys veligera Trichuris leporis Capillaria hepatica Ciclo vital direto Infeces severas gastrite hemorrgica, anemia e diarria Ciclo vital direto Irritao e prurido na regio anal Ciclo vital direto, habita a luz cecal Ciclo vital direto Hepatomegalia uma zoonose
Cestdeos
Raramente se observa parasitismo por esse tipo de helminto nos coelhos de laboratrio. Entretanto, vale ressaltar que no existe tratamento eficaz no controle desse tipo de parasitose, sendo o mesmo resultante do isolamento de outras espcies, da oferta de rao industrializada e da manuteno de gua e cama afastados de outros animais. Quadro 2 Cestdeos encontrados nos coelhos de laboratrio
Cittotanenia denticulata C. pectinata Cysticercus pisiformis Coenurus serialis Cysticercus fasciolaris Echinococcus granulosus Os coelhos so os hospedeiros definitivos e os caros so os intermedirios. Forma larval de Taenia pisiformis (co). Os cisticercos podem ser encontrados na cavidade peritoneal do coelho. Forma larval de tnia Multiceps serialis. Os cisticercos so encontrados na musculatura logo abaixo da pele. Forma larval de Taenia taeniaformis (gato). Os cisticercos se localizam no fgado e cavidade abdominal. Os coelhos e outros mamferos so hospedeiros intermedirios, o co o definitivo. Os cistos podem estar no fgado, pulmes, crebro e linfonodos.
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Protozorios
Encefalitozoonose
Doena amplamente distribuda entre os coelhos de laboratrio, causada pelo Encephalitozoon cuniculi. Tambm afeta outras espcies como ratos, camundongos, ces e o homem. A transmisso se d por contato direto, sendo a fonte de infeco a urina dos animais doentes. Nos coelhos j foi constatada a infeco transplacentria. O quadro clnico aparentemente assintomtico. Leses macroscpicas esto ausentes. Microscopicamente, evidenciam-se leses focais no crebro em forma de pequenos granulomas disseminados, com ou sem necrose. Os granulomas so compostos de clulas inflamatrias mononucleares com o parasita no seu centro, havendo infiltrado perivascular ao redor dos granulomas. Ocasionalmente, ocorre meningite no supurada. Nos rins, ocorre nefrite intersticial crnica, com fibrose inversamente proporcional ao infiltrado mononuclear. Os parasitas podem estar livres na luz dos tubos renais. O diagnstico geralmente confirmado pelos achados histopatolgicos e pela visualizao e identificao do parasita nas leses. O agente deve ser diferenciado de Toxoplasma gondii, por diferena de tamanho e por colorao. No h tratamento disponvel. O controle efetivo mediante a eliminao dos animais doentes. Apesar de se tratar de uma zoonose, poucos casos foram relatados em seres humanos.
Toxoplasmose
Toxoplasma gondii transmitido ao coelho por via oral, a partir do contato com fezes de gatos que estejam eliminando oocistos, ou atravs da transmisso vertical. A doena pode ter curso agudo, crnico ou ser clinicamente inaparente. Os sintomas, quando presentes, dependem da localizao das leses causadas pelo parasita. As leses, em geral, caracterizam-se por focos de necrose e edema em qualquer dos rgos afetados, sendo mais hiperplsicas nos casos crnicos. As localizaes mais freqentes so sistema nervoso central e bao. O diagnstico feito por intermdio de provas sorolgicas. No h tratamento disponvel. O controle baseado na eliminao dos animais doentes e na preveno de contato com fezes de gatos. Trata-se de uma zoonose de especial importncia para mulheres grvidas.
Coccidiose heptica
uma doena bastante prejudicial para colnias de produo de coelhos, sendo causada pela Eimeria stiedae. A via de infeco oral e a fonte so fezes de animais infectados. O quadro clnico pode ser agudo, crnico ou assintomtico. Os animais jovens so mais susceptveis. Os sintomas, quando presentes, so decorrentes de disfuno heptica. Na necropsia, so observados ndulos branco-amarelados espalhados pela superfcie do fgado, podendo haver fibrose extensa nas infeces severas. Microscopicamente, evidencia-se destruio e hiperplasia do epitlio ductal e dilatao dos canais biliares, com fibrose periductal. Os parasitas esto dentro das clulas epiteliais dos canais e no exudato cremoso na luz dos canais biliares. O diagnstico feito pela pesquisa dos oocistos nas fezes, mas a necropsia essencial para confirmao da doena, visto que no possvel diferenciar dos oocistos intestinais. Embora de baixa eficcia, o tratamento consiste na administrao oral (na gua ou na rao) de sulfonamidas de ao entrica (sulfaquinoxalina, sulfametacina e sulfadiacina), na dosagem de 100 mg/kg a cada 12 horas durante 2 semanas. Boas prticas de manejo e higiene, assim como a eliminao dos animais doentes, associada ao exame de fezes de animais em quarentena, favorecem o controle da doena.
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Coccidiose intestinal
Esta enfermidade apresenta carter misto, podendo estar associada a vrias espcies de Eimeria: E. magna, E. irresidua, E. perforans, E. media e E. neoleporis. Esses parasitas atacam a mucosa do duodeno e leo, determinando destruio do epitlio, necrose, edema e, dependendo da espcie, pode destruir glndulas da submucosa. Clinicamente, os animais apresentam diarria mucide, s vezes com perda de sangue, emagrecimento e desidratao. Como no h o desenvolvimento de imunidade permanente, a doena pode reaparecer em situaes de estresse. O diagnstico confirmado pela presena de oocistos nas fezes ou em raspados da mucosa intestinal. O tratamento e controle so semelhantes aos da coccidiose heptica.
DOENAS NO-INFECCIOSAS
M-OCLUSO DENTRIA
Defeitos de ocluso e crescimento exagerado dos incisivos tm etiologia gentica para os coelhos. Os reprodutores com tais ms-formaes devem ser eliminados da criao. Os animais apresentando crescimento exagerado devem ter seus incisivos cortados periodicamente para permitir a apreenso adequada do alimento. A falta de cuidado com esses animais no raro leva morte por inanio.
CALOS
DE
POSIO
A manuteno de animais pesados em pisos de arame favorece o desenvolvimento de leses nas superfcies plantares dos ps, por conta da presso do peso sobre o piso. Nesses casos, fica indicada a limpeza peridica da gaiola e utilizao de material macio sobre o piso a fim de promover um descanso para o animal.
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to Use and Care of Experimental Animals. Otawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Temas Seleccionados sobre Medicina de Animales de Laboratrio: el conejo. Rio de Janeiro: CPFA/OPS/OMS, 1976. (Serie Monografias Cientificas y Tecnicas)
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Criao e manejo de camundongos
C riao e Manejo de Camundongos

ORIGEM
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O camundongo acompanha o homem por vrios milnios; existem registros acerca desse animal com mais de 4 mil anos de idade e at mesmo na Bblia. Em algumas antigas civilizaes orientais chegou a ser adorado, embora, na maioria dos casos, tenha sempre sido associado a doenas e a suas atividades de invadir locais destinados estocagem de alimentos, notadamente gros. Sua introduo como animal de laboratrio se deveu ao fato de ser pequeno, muito prolfero, ter perodo de gestao curto, ser de fcil domesticao e manuteno. Por todas essas caractersticas, tornou-se o mamfero mais usado na experimentao mundial. Assim como o rato, sua origem parece ter sido o continente asitico, mas se difundiu por todo o planeta, acompanhando o homem em suas migraes, j que esse sempre lhe garantiu alimento e moradia. Por ser to prximo do homem, acabou por se tornar uma espcie de animal de estimao, no no sentido que empregamos para ces e gatos, mas passou a ser criado por exibir vrios fentipos interessantes. Assim, os camundongos albinos j eram conhecidos muito antes de serem introduzidos em biotrios, alm de variantes com coloraes inusitadas e distrbios neurolgicos. Essas qualidades atraram bilogos da poca, envolvidos na redescoberta dos trabalhos de Mendel e comeando os estudos em gentica. Tendo por base esses pesquisadores, o camundongo se tornou a ferramenta preferida para esses tipos de trabalho. Comearam, ento, as tentativas de estabelecimento das linhagens consangneas, que atualmente respondem pelo grande nmero de camundongos utilizados na pesquisa biomdica.
TAXONOMIA
Classe:
Mammalia Ordem: Rodentia Famlia: Muridae Gnero: Mus Espcie: Mus musculus Essa classificao a mais aceita, mas ainda h bastante controvrsia sobre as espcies e subespcies criadas em laboratrio, tendo em vista que, em conseqncia dos cruzamentos especiais, os animais apresentam
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alguns genes ou at mesmo cromossomos de espcies diferentes, sendo um exemplo disso a linhagem C57BL/6, em que 6,5% do genoma originrio de Mus spretus, e no de Mus musculus.
CARACTERSTICAS
O camundongo tem corpo fusiforme e cauda que pode atingir comprimento maior do que o corpo. Sua colorao natural marrom escura no dorso, com um ventre mais claro e cinzento. No possui glndulas sudorparas. Tanto as patas anteriores como posteriores possuem cinco dedos. Uma caracterstica interessante que todos os cromossomos do camundongo domstico so telocntricos.
REPRODUO
C ICLO E STRAL
Tem a durao de 4-5 dias e se divide em: proestro, estro, metaestro e diestro. O proestro comea com a fase folicular do ovrio, que culmina na ovulao, no estro (= cio). O metaestro e o diestro se caracterizam pela fase lutenica do ovrio. O ciclo estral do camundongo tambm pode ser afetado pelas condies de alojamento do animal. Fmeas alojadas em gaiolas, em regime de superpopulao, sem a presena de machos, exibiro uma fase chamada anestro, caracterizada pela ausncia de ciclos estrais. Quando expostas aos machos ou a seus feromnios, comeam a ciclar em 48 horas. A este fenmeno se d o nome de Efeito de Whitten. Quando as fmeas entram em gestao, se expostas a machos de outras linhagens ou seus feromnios durante as primeiras 24 horas, ocorre uma reabsoro em mais de 50% dos embries. Este o chamado Efeito de Bruce. O perodo de gestao vai de 19 a 21 dias; aps o dcimo dia, j se observa um aumento no abdmen. A mdia de filhotes/parto de 8-10 em linhagens outbred e em torno de 5 filhotes/parto em linhagens inbred.
DADOS BIOLGICOS
O camundongo nasce desprovido de plos, com exceo das vibrissas (plos tteis), com o corpo avermelhado, de olhos fechados, com o pavilho auricular fechado e aderido cabea e pesando, em mdia, 1 g. Aps o parto, a fmea amamenta a ninhada e pode-se visualizar o leite no estmago dos animais pela mancha branca nos seus abdomens. Se precisarmos fazer algum tipo de seleo ao nascimento, esse um fator importante, j que os animais que mamam, demonstram maior habilidade para sobreviver. Sua pele vai clareando ou escurecendo, de acordo com a colorao da linhagem, e os plos comeam a aparecer por volta do 3o ou 4o dias. Com uma semana de idade seus corpos j esto totalmente recobertos de plos e as tetas tornam-se visveis nas fmeas. As orelhas comeam a se afastar da cabea e a se abrir por volta do 3o dia de idade. Aos 10 dias de idade, os animais abrem os olhos e aos 15 dias j comeam a se alimentar de slidos (rao) que a me traz para o interior da gaiola. Esto aptos ao desmame a partir dos 18 dias, mas em muitas linhagens consangneas, por causa de seu pequeno tamanho, o desmame se d com 4 semanas de idade. No ato do desmame, so sexados, separados e pesados. O peso mdio aos 21 dias situa-se, em torno de 10-12 g, para camundongos outbred e 8-10 g, para camundongos inbred. A sexagem desses animais se baseia na distncia ano-genital e pela visualizao
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Criao e manejo de camundongos
da bolsa escrotal. A puberdade se d dos 30 aos 40 dias e a maturidade sexual por volta dos 50-60 dias. O acasalamento, geralmente, ocorre nesse perodo e os animais costumam pesar em torno de 18-20 g, para animais outbred e 15-18 g, para animais inbred. Os animais permanecem em reproduo por mais ou menos um ano e podem atingir pesos de 40 g para machos outbred e 30-35 g para fmeas outbred. Os animais inbred atingem pesos menores e dificilmente passam de 35 g.
MANEJO DE COLNIAS
O estabelecimento de uma colnia em um biotrio obedece a vrias consideraes. Se mantivermos colnias nicas ou pretendermos a auto-suficincia, teremos de estabelecer trs diferentes colnias para cada linhagem instalada.
COLNIA
DE
FUNDAO
OU
P RODUTORA
DE
M ATRIZES
OU
PILOTO
a primeira colnia que se estabelece e tem como finalidade se autoperpetuar (self-perpetuation), possibilitando sua prpria manuteno. Nela, todos os acasalamentos so monogmicos permanentes, com animais identificados individualmente e registrados, para que possamos determinar ndices reprodutivos e informaes que lhe conferiro um perfil nico. Isso nos ajudar na seleo dos futuros reprodutores, alm de estabelecer parmetros para a seleo e o descarte zootcnico, como intervalos entre partos, nmero de partos/ fmea, nmero de filhotes/ninhada/fmea etc. No caso do estabelecimento de uma colnia outbred, o nmero de casais dever ser relativamente grande, para que a heterozigose e a freqncia gnica possam ser asseguradas. A primeira dever ser alta e a segunda, constante. Para que isso ocorra, os acasalamentos so monogmicos e permanentes, e cada casal contribui somente com um novo casal para a gerao seguinte. Tal cuidado nos assegura a manuteno da freqncia gnica da colnia. Todos os casais tm fichas de registro. As colnias devem ser fechadas, isto , a introduo de novos animais deve ser evitada, depois da sua formao, uma vez que cada animal que se introduz modifica a freqncia gnica da colnia e pode aumentar ou diminuir a heterozigose. Esse fato, a longo prazo, aumenta a homozigose, que mantida no mnimo possvel pelos sistemas de acasalamento j descritos anteriormente. O grau de consanginidade ser diretamente proporcional ao nmero de casais cujos descendentes forem escolhidos para formar a gerao seguinte. Estudos tm mostrado que o tamanho da populao e o mtodo de reposio de reprodutores escolhidos so decisivos na manuteno da estrutura gentica da colnia outbred. Para assegurarmos que os futuros reprodutores sejam provenientes de toda a populao, vrios sistemas rotacionais so empregados atualmente. No estabelecimento de colnias inbred, estas possuem um pequeno nmero de casais (em torno de 15 a 20) e todos eles remontam a um ancestral comum. Os acasalamentos so sempre monogmicos permanentes e cada casal contribui com quantos casais forem necessrios para a prxima gerao. Todos os casais so registrados no pedigree da linhagem.
C OLNIA
DE
E XPANSO
a segunda colnia a ser formada, e somente no caso do estabelecimento de animais consangneos. Sua finalidade ampliar a produo de matrizes, j que as colnias de fundao consangneas tm reduzido nmero de casais. constituda por animais que vm da colnia de fundao, mas tambm pode produzir seus prprios casais para reposio. Os acasalamentos so sempre monogmicos permanentes. Os casais tm registro, mas no no pedigree da linhagem.
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C OLNIA
DE
P RODUO
a terceira colnia a ser formada e sua finalidade a de produzir animais suficientes para atender demanda dos usurios, de acordo com suas especificaes. Nela, podem conviver os vrios tipos de acasalamentos: monogmicos ou poligmicos, permanentes ou temporrios, dependendo dos animais a serem produzidos. Os casais e/ou harns vm das colnias de fundao (nas colnias outbred) ou das colnias de fundao e expanso (nas colnias inbred). Os acasalamentos so realizados ao acaso e os casais no tm registro completo, j que o que importa so a data de acasalamento e os dados das ninhadas, para o posterior descarte zootcnico. Nenhum animal originrio dessa colnia utilizado como reprodutor.
BIBLIOGRAFIA
FOSTER, H.; SMALL, D. & FOX, G. (Eds.). The Mouse in Biomedical Research. New York: Academic Press, 1983. GREEN, E. H. The Biology of Laboratory Mouse. 2nd ed. New York: McGraw-Hill, 1966. THE JACKSON LABORATORY. Handbook on Genetically Standardized JAX MICE. 5thed. Bar Harbor: The Jackson Laboratory, 1997. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.
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Criao e manejo de ratos
C riao e Manejo de Ratos

ORIGEM
15
O rato de laboratrio, Rattus norvegicus, usado atualmente na maioria dos biotrios e infectrios, deriva de colnias desses animais, originrias dos EUA. Embora seja originrio de regies da sia Central, acompanhou o homem em seu avano pelos continentes, sendo encontrado, hoje em dia, em praticamente todas as latitudes. Acredita-se que tenha sido a primeira espcie de mamfero domesticada para fins cientficos, pois desde o incio sculo XX j era usado em pesquisas nutricionais. A grande difuso desse animal na pesquisa se deu com Henry H. Donaldson. Ao aceitar uma posio no Wistar Institute, na Filadlfia, ele criou uma equipe que se dedicou a padronizar colnias de rato a partir de quatro casais de albinos, os quais ele trouxera de Chicago, e a elaborar tabelas com os dados e a biologia dos animais. Entre os seus trabalhos, merece meno The Rat: data and reference tables for the albino rat and the norway rat, publicado em 1915. Pela equipe do Dr. Donaldson, vrias linhas consangneas de ratos conhecidas atualmente se formaram, como o PA, Lewis, e o Brown Norway. Ao mesmo tempo que estas, a linhagem outbred Wistar tambm comeou a ser formada e a ser distribuda, no s para outros institutos americanos, mas tambm para outros pases. Entre outros pesquisadores importantes para a disseminao do rato como animal de laboratrio encontramos Osborne e Medel, que se dedicaram nutrio, em especial ao estudo dos aminocidos e das vitaminas. A colnia albina por eles estabelecida era mantida por acasalamentos ao acaso e os animais se caracterizavam pelo grande tamanho. Long e Evans estudaram o ciclo estral do rato e suas implicaes. Para tais estudos, desenvolveram uma linhagem obtida do cruzamento de ratas provenientes do Instituto Wistar com um macho cinzento silvestre que havia sido capturado.
TAXONOMIA
Classe:
Mammalia Rodentia Famlia: Muridae Gnero: Rattus Espcies: Rattus norvegicus Rattus rattus
Ordem:
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Embora o gnero Rattus compreenda 137 espcies, do ponto de vista de animais de laboratrio apenas duas tm importncia: R. norvegicus (rato domstico ou rato marrom) e o R. rattus (rato preto). O interesse na manuteno de ratos em cativeiro comeou com as lutas: os animais eram colocados em uma arena e ces da raa terrier eram treinados para mat-los, era considerado vencedor o co que conseguisse matar a maior quantidade de ratos no menor tempo. Desde ento, por serem considerados mais dceis e fceis de lidar, os exemplares albinos comearam a ser mantidos.
CARACTERSTICAS
O rato tem um corpo fusiforme e uma cauda que em muitas raas/linhagens pode chegar a medir mais em comprimento do que o prprio corpo. Tanto as patas anteriores como posteriores possuem cinco dedos. Assim como outros roedores, no possuem glndulas sudorparas. Em ambientes quentes, procuram locais com sombras ou cavam tocas que costumam ser mais frias do que a superfcie. Adaptam-se melhor ao frio. Tambm no possuem vescula biliar.
REPRODUO
CICLO ESTRAL
PROESTRO:
TEM A DURAO DE
4-5
DIAS E SE DIVIDE EM :
tem durao de 12 horas. Podemos observar uma pequena tumefao na vulva e a mucosa vaginal se apresenta ressecada; ESTRO: tem durao de 12 horas e a tumefao da vulva chega ao mximo; METAESTRO I: tem durao de 15 horas e, alm da tumefao da vulva comear a diminuir, podemos observar uma massa caseosa na vagina; METAESTRO II: tem durao de 6 horas e a vulva volta ao normal. A mucosa vaginal se apresenta mida; DIESTRO: tem durao de 57 horas e a vulva continua normal. A mucosa vaginal se apresenta mida. O perodo de gestao se estende de 19 a 22 dias. Aps o dcimo dia, j se pode observar o aumento de volume do abdmen. Casos de distorcias so raros e o parto dura, em mdia, de 1 a 2 horas. A mdia de filhotes/parto de 8, para o rato Wistar, mas podemos encontrar ninhadas com at 16 filhotes.
DADOS BIOLGICOS
O rato nasce desprovido de plos, com exceo das vibrissas (responsveis pelo tato), e com o corpo avermelhado; com os olhos fechados, o pavilho auricular tambm fechado e aderido cabea e pesando de 4 g a 6 g. Aps o parto, a fmea amamenta a ninhada. Esse fenmeno pode ser observado atravs da mancha branca no abdmen dos animais, que nada mais do que leite no estmago. Tal fato importante, j que os filhotes mais fracos no mamam e, portanto, em casos de seleo ao nascimento, este, alm da robustez do animal, um fator de descarte. A pele dos animais vai clareando ou escurecendo, de acordo com a colorao da linhagem, e os plos comeam a despontar por volta do 3o ao 4o dia de vida. Com sete dias o corpo est totalmente recoberto de plos, as tetas so visveis nas fmeas e as orelhas j comeam a se afastar da cabea e a se abrirem. Por volta do 10o dia os animais abrem os olhos. Aos 16 dias j comeam a se alimentar independentemente e dos 18 aos 24
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Criao e manejo de ratos
j esto aptos ao desmame. Nessa idade, so sexados, geralmente pesados e separados. O peso ao desmame varia de 35 g a 45 g e a sexagem feita baseada na distncia ano-genital, que no macho bem maior do que na fmea, alm da visualizao da bolsa escrotal. A puberdade se d aos 30 dias e a maturidade sexual, dos 50 aos 60 dias. Em geral, o acasalamento ocorre nesse perodo, quando os machos j pesam de 200 g a 250 g e as fmeas, de 150 g a 180 g. Os animais permanecem em reproduo at os 9 meses de idade. Os machos podem pesar de 500 g a 600 g e as fmeas, de 300 g a 400 g.
MANEJO DE COLNIAS
Para estabelecermos uma colnia em um biotrio de criao, devemos levar em considerao vrias questes. A mais importante: iremos nos tornar auto-suficientes na produo dos animais? Uma vez decidido que sim, comearemos a montar nossa colnia, constituda por duas ou trs, com finalidades diversas. So elas:
Colnia Colnia
de Fundao ou Produtora de Matrizes ou Piloto; de Expanso; Colnia de Produo. Essa descrio das colnias j foi feita no captulo referente criao de camundongos.
BIBLIOGRAFIA
BAKER, H.; LINDSEY J. & WEISBROTH, S. (Eds.). The Laboratory Rat. New York: Academic Press, 1979. UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986.
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Criao e manejo de hamsters
C riao e Manejo de Hamsters

ORIGEM
16
O hamster relativamente novo como animal de laboratrio. Os primeiros a serem usados foram os hamsters chineses. Em 1919, foi descrito, em um trabalho cientfico, sua susceptibilidade Leishmania, o agente do calazar. Entretanto, a manuteno desses animais era difcil e sua reproduo em cativeiro pouco satisfatria, o que implicava novas e sucessivas importaes da China. Alm disso, os animais no forneciam dados satisfatrios nos estudos da leishmaniose mediterrnea. A procura de um modelo mais adequado levou pesquisadores da Universidade de Jerusalm a irem em busca, no campo, de uma nova espcie de hamster. A Sria foi o territrio escolhido para essa procura. Dez jovens animais e sua me foram encontrados em uma toca, num campo de trigo, prxima a Aleppo. Um deles morreu e outros cinco conseguiram escapar antes do envio universidade. Os animais remanescentes se adaptaram bem ao cativeiro e se mostraram prolferos. Aps curto perodo, foi estabelecida uma colnia de laboratrio e vrios exemplares foram enviados a laboratrios na Europa e nos Estados Unidos, onde colnias foram formadas. Estima-se que o nmero de hamsters usados na pesquisa biomdica, atualmente, iguale ao de cobaias e coelhos. Esses animais foram denominados hamsters srios (Syrian hamsters), em virtude do local onde foram encontrados, e mais tarde, a esta, juntou-se a denominao dourado, devido a sua cor. Por esse histrico, nota-se que a maioria dos hamsters, mantidos em laboratrio ou como animais de estimao, descendem dessa ninhada, embora haja registros de capturas posteriores de animais na Sria, tais como o grupo de 12 animais que foram capturados, em 1971, e enviados ao Massachusetts Institute of Technology (MIT). Descendentes desses animais so mantidos nas colnias do National Institutes of Health (NIH) at os dias atuais. Apesar de o hamster srio ser denominado o hamster de laboratrio, outras espcies tambm foram e continuam a ser usadas. A eleio do hamster srio deve-se ao fato de que possui tamanho intermedirio, adapta-se muito bem ao cativeiro e tem um comportamento mais dcil do que outras espcies.
TAXONOMIA
A classificao do hamster tem sido um pouco conturbada; muitas vezes os nomes comuns no designam o animal a que nos referimos, pois, na Sria, vivem pelo menos trs espcies e, na China, mais de sete. Isso gerou muita discusso na sua taxonomia e at a suspeita de que esses animais fossem hbridos naturais, no espcies.
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Atualmente o hamster srio dourado se classifica como: Classe: Mammalia Ordem: Rodentia Famlia: Cricetidae Gnero: Mesocricetus Espcie: Mesocricetus auratus
CARACTERSTICAS
O hamster dourado, diferentemente de outros roedores, um animal de corpo compacto e cauda muito curta. Seu comprimento, quando adulto, situa-se em torno de 15 cm a 17 cm, e seu peso entre 85 g a 120 g. O plo curto e avermelhado no dorso da o nome dourado enquanto o ventre completamente cinzento; os olhos so escuros; a pele extremamente flcida e, como caracterstica mais marcante, possui bolsas laterais (bolsas guturais) no interior da boca, onde estoca alimentos, quando em suas buscas, geralmente por gros. O alimento, a estocado, no sofre processo digestivo e depois expelido no local onde ficar armazenado. sabido que mes com recm-natos, quando ameaadas, escondem seus filhotes nessas bolsas. So excelentes escavadores e vivem em tocas profundas, geralmente sozinhos, somente se encontrando no perodo de acasalamento. Tanto os machos quanto as fmeas so bastante agressivos. So animais noturnos e preferem temperaturas mais altas, podendo hibernar quando a temperatura cai. Sua rea de distribuio natural uma regio restrita a Aleppo e seus arredores. Tm tambm duas glndulas laterais no flanco, de colorao escura, bastante visveis no macho, menores e menos visveis na fmea. Estas so glndulas sebceas que esto associadas transformao de testosterona em dihidrotestosterona e tm sido consideradas como caractersticas sexuais secundrias nos machos. Na fmea, a uretra tem uma abertura separada e localizada na parte superior da abertura vaginal. A vagina apresenta duas pequenas bolsas laterais, nas quais clulas epiteliais e leuccitos se acumulam. Por essa razo, devemos ter bastante cuidado quando realizamos o esfregao vaginal, para evitar erros, por coleta incorreta de material, nas fases de ciclo. O estmago desses animais dividido em duas reas distintas: a rea pilrica e a rea glandular, separadas por uma constrio semelhante a um esfncter que regula o fluxo dos alimentos. A rea pilrica se assemelha histolgica e estruturalmente ao rumem, e a rea glandular ao estmago dos monogstricos.
REPRODUO
C ICLO E STRAL
PROESTRO:
tem durao de 3 horas. No esfregao vaginal, podemos notar raros ou total ausncia de
leuccitos. ESTRO: tem durao de 12 horas. A ovulao ocorre, geralmente, 8 horas aps o incio do estro. Durante essa fase, a fmea assume uma lordose caracterstica para aceitar o macho. METAESTRO: tem durao de 4 horas. Notamos a presena de secreo de colorao branco-opaco na vagina (secreo ps-ovulatria). DIESTRO: tem durao de 72 horas. No incio, observamos o surgimento de leuccitos no esfregao vaginal que se tornam abundantes na metade da fase desse estgio. A secreo vaginal se torna intensa e adquire aspecto seroso. No final desse estgio, os leuccitos comeam a desaparecer e a secreo vaginal termina.
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Criao e manejo de hamsters
O perodo de gestao de aproximadamente 16 dias; aconselhvel que fmeas prximas ao parto no sejam manuseadas, pois so extremamente irritadias e o manuseio pode levar ao canibalismo ou asfixia dos filhotes que so escondidos nas bolsas guturais. A mdia de filhotes/ninhada de 8, mas podemos encontrar ninhadas com at 16 filhotes. O nmero mdio de tetas, no hamster, de 14, mas recomendamos deixar somente at 10 animais com as mes para que haja menor desgaste e para que sejam mais robustos ao desmame.
DADOS BIOLGICOS
Ao nascimento, os animais so avermelhados, desprovidos de plos, com exceo das vibrissas (rgos do tato) possuem os olhos e o pavilho auricular fechados, sendo este aderido cabea. Pesam, em mdia, 3 g. J nascem com os dentes incisivos e ingerem alimentos slidos ao final da primeira semana de vida. Aps o parto, a fmea amamenta os filhotes e podemos observar o leite no estmago atravs de uma mancha branca no abdmen dos animais, que permanecem em reproduo at 1 ano de idade. Os animais podem ser sexados, ao nascer, pela distncia ano-genital, que maior nos machos. A pele vai escurecendo e aos trs dias de idade os plos comeam a nascer. Por volta de uma semana, j esto totalmente recobertos de plos, com a colorao da linhagem ou espcie, e possvel visualizarmos as tetas nas fmeas. As orelhas comeam a se abrir entre o 4o e o 5o dia. Os olhos se abrem entre o 10o e o 12o dia. Nessa fase, aconselhvel supri-los com gua, j que alm de mamarem, ingerem alimentos slidos. No Centro de Estudos de Criao de Animais de Laboratrio (CECAL), estamos experimentando um manejo diferente do que tem sido recomendado para hamsters. O desmame realizado aos 16 dias e toda a ninhada retirada, com ficha de registro, para uma gaiola de camundongo, onde o acesso rao mais fcil. Os animais recebem tambm, diariamente, uma papa feita de farelo da prpria rao e gua a partir dos 10 dias de idade, quando esto ainda com as mes, e continuam a receb-la at os 21 dias de idade, quando so sexados e colocados em gaiolas apropriadas aos hamsters. Nessa poca, pesam em torno de 25 g a 30 g. No CECAL, os acasalamentos so realizados ao desmame; com isso, temos evitado as brigas e o estresse dos animais. O hamster um animal muito precoce e h casos em que se reproduziram com apenas um ms de idade, mas, geralmente, a puberdade ocorre aos 28 dias de idade e a maturidade sexual, aos 42. Os animais costumam ser acasalados aos 2 meses, sendo o macho um pouco mais velho e pesado do que a fmea, que costuma ser bastante agressiva e pode chegar a castr-lo; eles pesam em torno de 100 g nessa fase.
MANEJO DAS COLNIAS

Quando pretendemos a auto-suficincia na produo de animais, devemos construir nossa colnia, subdividindo-a em outras duas ou trs menores. So elas:
Colnia Colnia
de Fundao ou Produtora de Matrizes ou Piloto. de Expanso. Colnia de Produo. Em se tratando de hamsters, praticamente todos os compndios nos ensinam que devemos formar acasalamentos em que as fmeas so levadas ao macho e, uma vez cobertas, retiradas para suas gaiolas isoladas. Os machos, conseqentemente, so usados para cobrir um nmero de fmeas que pode variar de 2 a 12. Nos animais outbred, esse tipo de esquema no altera o perfil gentico da colnia, desde que os registros sejam precisos e que todas as fmeas cobertas por um macho pertenam ao mesmo grupo. No CECAL, depois de vrias tentativas,
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conseguimos estabelecer acasalamentos monogmicos permanentes, nos quais os animais so acasalados aps o desmame, seguindo-se um mtodo rotacional, e o macho nunca retirado da gaiola da fmea. Temos conseguido, com isso, aumentar a produtividade das fmeas, como tambm tornar os animais mais dceis.
BIBLIOGRAFIA
UNIVERSITIES FEDERATION FOR ANIMAL WELFARE (UFAW). The Ufaw Handbook on the Care and Management of Laboratory Animals. 6th ed. London/New York: Churchill Livingstone, 1986. VAN HOOSIER JR., G. & MCPHERSON, C. (Eds.). The Laboratory Hamster. New York: Academic Press, 1987.
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Principais doenas dos camundongos, ratos e hamsters
Perincipais Doenas dos Camundongos, Ratos Hamsters

INTRODUO
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O progresso na cincia biomdica conduz, inevitavelmente, a uma grande sofisticao da metodologia cientfica. Nos ltimos anos, tem sido perceptvel o aumento da necessidade de refinamento na qualidade dos animais de laboratrio, principalmente dos camundongos e ratos. A comunidade cientfica reconhece, cada vez mais, que as doenas nessas espcies alteram enormemente os resultados experimentais. Alm disso, devemos considerar a grande variedade gentica determinada pelas inmeras linhagens existentes, o que estabelece extremos de susceptibilidade entre tais linhagens quando expostas aos mesmos agentes, sob as mesmas condies ambientais. Desse modo, prevenir e controlar a qualidade da sade dessas colnias tem sido uma das tarefas mais exploradas pela cincia de animais de laboratrio. O hamster, geralmente considerado como uma das espcies mais sadias e resistentes, um portador de diversos vrus e bactrias patognicas para outras espcies de animais de laboratrio e domsticas. Sendo assim, o controle sanitrio dessa espcie indispensvel, no s pela interferncia biolgica, como tambm por ser fonte de infeco para outros animais, sobretudo quando partilham o mesmo ambiente. O programa de preveno e controle sanitrio deve considerar trs aspectos altamente interligados: a preveno das condies que favorecem o estabelecimento das doenas atravs de manejo adequado dos animais na criao e experimentao, desfavorecendo o estresse; manuteno de barreiras sanitrias eficientes; higienizao adequada do ambiente, equipamentos e materiais; a deteco de infeces latentes por meio de uma avaliao sistemtica do estado sanitrio da colnia, esgotando os meios de diagnstico laboratorial desenvolvidos at o momento; o manejo da enfermidade nos casos de eventuais suspeitas de surtos, incluindo a identificao da doena, inibio de sua propagao e eliminao do agente causal.
SISTEMA RESPIRATRIO
As doenas do trato respiratrio esto entre os problemas de sade mais comuns no camundongo, rato e hamster. As condies envolvidas variam desde infeces inaparentes at aquelas causadas por agentes especficos, cujas patogenicidade e interferncia na experimentao so variveis. As formas subclnicas da doena so mais comuns, e o sinergismo de infeces concomitantes tem um efeito muito mais potente do que o realmente reconhecido.
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Os agentes geralmente envolvidos nas doenas respiratrias esto listados a seguir, em ordem decrescente de importncia. Quadro 1 Principais agentes patognicos que acometem o trato respiratrio de camundongos e ratos, agrupados em ordem decrescente de importncia
GRUPO I CAMUNDONGO Vrus Sendai Mycoplasma pulmonis RATO Mycoplasma pulmonis Vrus Sendai Bacilo clio associado Streptococcus pneumoniae Corynebacterium kutscheri Coronavrus do rato Vrus da sialodacrioadenite Vrus da pneumonia do camundongo Pneumocystis carinii Klebsiella pneumoniae Mycoplasma collis
II
Vrus da pneumonia do camundongo Pneumocystis carinii Mycobacterium avium-intracellulare Chlamydia trachomatis Streptococcus pyogenes Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma collis Vrus K Corynebacterium kutscheri Chlamydia psittaci Pasteurella pneumotropica Bordetella bronchiseptica Adenovrus
III
Pasteurella pneumotropica Bordetella bronchiseptica Adenovrus
Infeces por vrus Sendai associadas ao Mycoplasma pulmonis so bastante comuns tanto em camundongos quanto em ratos. No grupo II, esto includos agentes de pouca freqncia e importncia questionvel para esse sistema. No grupo III, esto patgenos que no so primariamente respiratrios. No hamster, as infeces respiratrias so geralmente causadas por bactrias dos gneros Pasteurella, Streptococcus e Salmonella. Muitos desses agentes podem ser habitantes naturais do trato respiratrio nessa espcie animal. A doena clnica pode ser manifestada por pneumonia, conjuntivite, otite mdia e interna e encefalite.
VRUS SENDAI
um Paramyxovirus classificado como vrus da parainfluenza tipo I, sendo antigenicamente relacionado a outros vrus parainfluenza. Possui envelope, o que o torna sensvel aos solventes orgnicos (ter, clorofrmio). O vrus j foi isolado em camundongo, rato e hamster. Na cobaia, j foi detectada evidncia sorolgica, mas o vrus ainda no foi isolado. A transmisso se d por contato direto e por aerossis. A via de infeco a nasal e o perodo de incubao de 9 a 14 dias. Quando a colnia infectada pela primeira vez, a doena se propaga por toda a populao de animais, determinando estertores e dispnia, gestao prolongada, morte neonatal, ps-desmame e menor ganho de peso dos animais em crescimento. Depois de instituda a imunidade, em dois meses, a colnia volta ao normal. Reinfeces posteriores passam a ser mantidas pela contnua oferta de animais jovens susceptveis. No rato, quando a infeco no est associada a outros agentes, no traz maiores transtornos alm de baixa fertilidade, reduo de peso da prole e da taxa de crescimento.
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A infeco geralmente assintomtica e com baixa mortalidade. Os animais mais susceptveis, como o camundongo 129/J (atmico), Swiss nude, DBA/1J e DBA/2J, podem apresentar sinais de doena respiratria ou morte sbita. necropsia, os pulmes esto consolidados com aspecto avermelhado e bordos demarcados entre as reas sadias e afetadas. Microscopicamente, observa-se pneumonia intersticial, freqentemente complicada por infeces bacterianas secundrias. O diagnstico confirmado atravs da sorologia ou do isolamento do vrus em ovo embrionado de pinto ou em culturas de clulas renais de macaco, onde se observa o efeito citoptico, ou se confirmam reaes sorolgicas 7 a 14 dias depois da inoculao com material coletado por swab nasofarngeo ou de tecido pulmonar. Como no se conhece a forma de transmisso do vrus, no existem meios especficos para evitar a propagao do mesmo. Prevenir a entrada do vrus na colnia a medida mais segura. A derivao cesariana previne e elimina infeces virais e a transferncia de embries de fmeas infectadas no contamina a me receptora. A infeco pelo vrus Sendai em camundongos altera os parmetros fisiolgicos. No rato, interfere na mitognese de clulas T e afeta estudos de carcinognese.
MYCOPLASMA
PULMONIS
Mycoplasma pulmonis o principal agente causador de infeces respiratrias crnicas no rato. Entretanto, outros agentes bacterianos e virais podem estar envolvidos simultaneamente. O agente tambm causa doena respiratria em camundongos, coelhos, cobaias e hamsters. A infeco subclnica ocorre em animais mantidos sob barreiras e obtidos por derivao cesariana. A transmisso se d por aerossis e atravs da placenta. A doena pode se apresentar com sinais isolados ou combinados, que podem estar descritos como entidades separadas: otite mdia/interna que induz a um comportamento de andar em crculo; rinite com espirros e descarga nasal mucosanguinolenta; pneumonia com dispnia e debilidade progressiva. Mycoplasma pulmonis tambm pode infectar o trato genital das fmeas, sendo capaz de determinar baixa fertilidade, reduo de peso da prole ou at infertilidade completa, quando esta forma est presente na colnia. O diagnstico confirmado aps a cultura e o isolamento do agente a partir de amostras de swabs nasofarngeos ou lavados traqueobrnquicos. Outros mtodos de diagnstico devem ser utilizados para excluir ou incriminar outros agentes. A derivao cesariana e o programa de barreiras podem reduzir a prevalncia da doena, mas no reduzem a prevalncia da infeco. Dessa forma, somente a seleo de animais livres de micoplasmas, identificados por monitoramento contnuo, pode permitir a obteno de estoques negativos.
SISTEMA DIGESTIVO
A enfermidade de maior significado no hamster uma doena entrica conhecida como ilete proliferativa, enterite do hamster ou hiperplasia ileal atpica, caracterizada por diarria ftida e aquosa (wet tail) e altas taxas de mortalidade entre os lactentes. O animal apresenta-se letrgico, irritado, anortico, com perda de peso e, finalmente, morre 48 horas aps o estabelecimento dos sintomas. A causa dessa condio ainda no completamente esclarecida. Na literatura, os casos de surtos em colnias de hamsters relatam o isolamento de diferentes espcies de bactrias. Escherichia coli a mais incriminada na enterite, ao passo que um organismo intracelular Corynebacterium-like parece estar envolvido nas leses hiperplsicas. Vrus e protozorios tambm foram encontrados em hamsters com ilete proliferativa, entretanto no foi comprovada sua relao com a doena. Essa condio favorecida pelo estresse do confinamento.
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O diagnstico baseado nos sintomas e nos achados histopatolgicos. As leses proliferativas no leo so consideradas patognomnicas para essa doena. A antibioticoterapia o nico tratamento disponvel, mas nem sempre efetiva. A preveno est envolvida com adequada higienizao do ambiente, reduo do estresse e adoo de quarentena para animais recm-adquiridos. A utilizao de top filters mostrou-se eficaz contra a transmisso de uma gaiola para outra. As doenas do sistema digestivo so comuns tanto no camundongo quanto no rato, tendo importncia comparvel s doenas respiratrias. Entretanto, os agentes patognicos determinam efeitos mais srios em neonatos e lactentes. Os sinais clnicos podem no estar evidentes quando o animal enviado experimentao ou, ainda, quando a diarria e o retardo no crescimento so sinais muitas vezes difceis de serem visualizados nessas espcies. As infeces naturais do trato digestivo so geralmente resultantes da combinao de diversos agentes, sendo complicado determinar qual deles o responsvel pelos sintomas. Sendo assim, indispensvel a utilizao de mtodos complementares de diagnstico, como a histopatologia do aparelho digestivo, inclusive das glndulas anexas. A seguir, esto listados os agentes infecciosos em ordem decrescente de importncia para infeces digestivas no camundongo e no rato. Quadro 2 Principais agentes patognicos que acometem o trato digestivo de camundongos e ratos
GRUPO I CAMUNDONGO Vrus da hepatite do camundongo Spironucleus muris Bacillus piliformis Salmonella enteriditis Citrobacter freundii Giardia muris Rotavrus de camundongo Reovrus 3 Pseudomonas aeruginosa Vampirolepys nana Syphacia spp Citomegalovrus do camundongo Vrus tmico do camundongo Adenovrus Aspiculuris tetraptera Entamoeba muris Tritrichomonas muris RATO Vrus da sialodacrioadenite Spironucleus muris Bacillus piliformis Giardia muris
II
Salmonella enteriditis Rotavrus-like do rato Pseudomonas aeruginosa Syphacia spp Citomegalovrus do rato Reovrus-3 Adenovrus Entamoeba muris Tritrichomonas muris
III
No grupo I, esto includos os agentes de maior importncia, mas devido alta prevalncia e os efeitos sobre a experimentao, sero discutidos mais detalhadamente o vrus da hepatite do camundongo, o vrus da sialodacrioadenite do rato e Spironucleus muris. No grupo II, esto reunidos os agentes de pouco significado, e no grupo III, esto aqueles de significado duvidoso.
VRUS DA HEPATITE DO CAMUNDONGO

Trata-se de um coronavrus, sensvel ao ter e ao clorofrmio e muito contagioso. antigenicamente relacionado ao vrus da sialodacrioadenite, alm de outros coronavrus.
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O camundongo considerado o hospedeiro natural. A susceptibilidade varia com a idade, a linhagem, o sexo e a virulncia da cepa viral. A diferena de susceptibilidade gentica se confirma entre as culturas de tecidos originados de linhagens resistentes e sensveis (NZB, PRI, C3H, A e VSBS). Comumente, as fmeas so mais afetadas do que os machos. Esse vrus pode interferir em estudos imunolgicos tanto em linhagens sensveis quanto em resistentes. A infeco determina ttulos baixos de anticorpos, o que explica o desenvolvimento de infeces inaparentes, mas que podem ser ativadas sob certas condies. Os adultos possuem imunidade adquirida na primoinfeco. Os neonatos esto protegidos pela imunidade passiva adquirida pelo colostro. A infeco se perpetua entre os animais recm-desmamados, com pouca ou nenhuma sintomatologia clnica, exceto quando esto imunologicamente comprometidos. Podem servir como fontes de infeco os materiais inoculados contaminados com o vrus, as fezes (mais provvel) e os aerossis. As vias de penetrao so a oral e a respiratria. Aparentemente no h infeco placentria. Nas linhagens susceptveis e em animais expostos ao vrus sem prvia aquisio de imunidade, a sintomatologia comea entre 4 a 7 dias aps a infeco. A urina se torna amarronzada e mancha a regio perineal, h ictercia e sinais neurolgicos como espasmos, incoordenao, tremores e morte. Os achados de necropsia so geralmente escassos, podendo incluir manchas plidas isoladas ou congruentes no fgado e esplenomegalia. Microscopicamente, h necrose no fgado, no crebro e em alguns rgos linfides. Ocorre tambm degenerao neuronal, encefalite no supurada e desmielinizao. Um achado patognomnico o de clulas multinucleadas que formam massas sinciciais a partir das clulas endoteliais de todos os rgos aps 24 horas de infeco. O diagnstico confirmado pela sintomatologia, pela visualizao das leses tpicas, no exame post mortem e pelo isolamento do vrus em cultivos primrios de camundongo. O ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) o teste de escolha para monitoramento sorolgico rotineiro. O fgado de camundongos atmicos expostos a animais suspeitos o rgo de eleio para isolamento do vrus. A derivao cesariana o mtodo mais prtico para eliminar o vrus de uma colnia de camundongos, mas somente animais soronegativos devem servir como progenitoras. Barreiras sanitrias eficientes asseguram a manuteno de colnias livres da infeco. O monitoramento sorolgico contnuo de subpopulaes, a quarentena de animais adquiridos e o uso de filtros nas caixas de transporte so medidas indispensveis na preveno dessa enfermidade.
VRUS DA SIALODACRIOADENITE
um coronavrus altamente contagioso, determinante de inflamao das glndulas salivares e lacrimais. Os sintomas so fotofobia, leses oculares, edema do globo ocular e aumento do lacrimejamento, que geralmente cedem em 1 ou 2 semanas. Quando a glndula salivar est afetada, ocorre edema na regio cervical. Apesar da alta morbidade, em alguns casos a doena no determina altas taxas de mortalidade. O rato considerado o hospedeiro natural. A doena propagada por contato direto e por aerossis. No h estado de portador: o vrus permanece no animal infectado apenas por sete dias. Os tecidos afetados so glndulas salivares, glndulas lacrimais, linfonodos cervicais, timo e mucosa do trato respiratrio. Os animais adultos tornam-se imunes aps a primoinfeco. Nos lactentes com uma semana ou menos de idade pode haver uma conjuntivite transiente com fotofobia e exudato ocular com aderncia dos bordos palpebrais, mas esses sintomas podem j ter desaparecido quando o animal desmamado e fornecido ao pesquisador. Surtos repentinos e de alta prevalncia podem ocorrer em colnias isentas de imunidade, afetando animais adultos e jovens. Nesses casos, os sintomas so mais severos como edema cervical, espirros, descarga nasal e ocular e lcera de crnea.
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A histopatologia das glndulas salivares e lacrimais revela necrose difusa do epitlio alveolar, acompanhada de infiltrado mononuclear e edema intersticial. No globo ocular, observam-se ceratite, lcera de crnea, sinquia, hifema e conjuntivite. Como seqela da infeco, pode haver degenerao lenticular e retinal. No timo e nos linfonodos cervicais, so vistos focos de necrose. O diagnstico presuntivo e baseado em achados histopatolgicos das glndulas salivares e lacrimais. Muitas vezes, as leses so encontradas uni ou bilateralmente em animais soronegativos. O vrus pode ser isolado em cultivos primrios de clulas de rim de rato ou por inoculao intracerebral em camundongos neonatos e ser demonstrado por imunofluorescncia sete dias aps a inoculao. Visto que no ocorre o estado de portador e no h infeces latentes, o vrus da sialodacrioadenite pode ser eliminado atravs da quarentena da sala afetada, com suspenso de acasalamentos e sacrifcio dos recm-nascidos durante 6 a 8 semanas. Reinfeces devem ser controladas por meio de quarentena dos animais adquiridos. A doena tem alto significado nas pesquisas que envolvem o globo ocular, glndulas salivares e lacrimais ou o trato respiratrio de ratos. Pode exacerbar as infeces por Mycoplasma pulmonis e reduzir a performance reprodutiva, o ganho de peso e o consumo de rao.
S PIRONUCLEUS
MURIS
um parasita intestinal comumente encontrado entre os roedores de laboratrio, mesmo que mantidos sob barreiras sanitrias eficientes; sua importncia est relacionada s alteraes que causa na resposta imunolgica. Trata-se de um protozorio flagelado, com ciclo vital direto, que afeta camundongos, ratos e hamsters. Os animais jovens so os mais susceptveis e se infectam devido ingesto de cistos altamente resistentes s condies ambientais (so inativados por alguns desinfetantes e altas temperaturas = 45 C por 30 min). Nos animais adultos, esto presentes poucos trofozotas, encontrados apenas nas glndulas do piloro. A infeco geralmente subclnica em animais imunocompetentes. Enterites crnicas graves so relatadas em camundongos atmicos ou irradiados. Os sintomas so diarria, desidratao, pelagem spera, perda de peso, apatia, postura arqueada, distenso abdominal e mortalidade espordica. Nos animais imunocompetentes, geralmente no h resposta inflamatria, porm os animais altamente parasitados desenvolvem enterites moderadas a severas, caracterizadas por hiperemia do intestino delgado, contendo fluido aquoso e gs. Esse contedo intestinal serve para demonstrao do parasita. A histopatologia do rgo revela distenso das criptas intestinais por aglomerados de trofozotas presentes no espao intervilosidades. H encurtamento das microvilosidades e aumento do turnover dos entercitos. O diagnstico confirmado pela demonstrao do parasita no contedo intestinal. Casos de infeces mais brandas podem ser confirmados pela histopatologia de sees intestinais e do piloro. Os procedimentos recomendados para o controle do S. muris so a derivao cesariana e a manuteno de barreiras sanitrias eficientes.
SISTEMA TEGUMENTAR
As doenas que afetam a pele e os anexos cutneos contribuem para muitas das anormalidades clnicas observadas no camundongo e no rato. O diagnstico definitivo de enfermidades do sistema tegumentar freqentemente difcil, mesmo que sejam utilizados mtodos laboratoriais apropriados, devido s complexas interaes entre os seguintes fatores: agentes patognicos, agentes oportunistas, resposta e variao gentica do hospedeiro, fatores ambientais, interaes sociais e outros desconhecidos.
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As dermatites/alopcias so as enfermidades freqentemente observadas. Os ectoparasitas e Staphylococcus aureus (um comensal da pele) lideram as causas de doenas de pele no camundongo, enquanto, no rato, este ltimo agente infeccioso o mais importante. O hamster tambm afetado por ectoparasitos, fungos dermatfitos e S. aureus.
ECTOPARASITOS
Os ectoparasitos tm maior importncia em colnias convencionais e so favorecidos pelo estresse da experimentao. Causam efeito mais evidente sobre o tegumento e o estado geral do animal, principalmente quando o agente hematfago, podendo depreciar a qualidade do animal para a experimentao. Os agentes mordedores alteram a integridade do tegumento, confundindo os resultados da pesquisa. Entre os parasitas mais comuns no camundongo e no rato esto trs caros: Myobia musculi, Myocoptes musculinus e Radfordia affinis. Demodex criceti e Demodex aurati so encontrados no hamster, mas no so considerados patognicos em condies naturais.
Myobia musculi, Myocoptes musculinus e Radfordia affinis

Myobia musculis considerado o caro mais patognico no camundongo, enquanto Myocoptes musculinus determina leses mais brandas e Radfordia affinis no reconhecido como um patgeno significante. O ciclo vital desses caros se completa entre 14 e 23 dias. A transmisso por contato direto, ou por equipamentos/materiais e correntes de ar (aderido aos plos). As infestaes so comumente subclnicas. Quando presentes, os sintomas so prurido, alopcia, traumatismo, ulcerao da pele e pioderma. As regies mais afetadas so o dorso, a cabea e os ombros. As leses so caracterizadas por hiperqueratose, inflamao e infeco bacteriana secundria. O diagnstico feito atravs da demonstrao e identificao dos caros na pele e na base dos plos, com o auxlio de um microscpio estereoscpio ou uma lupa. O controle mais efetivo a derivao cesariana e a manuteno de barreiras sanitrias. A aplicao de substncias acaricidas controla a infestao, mas no a erradica completamente, alm de interferir na experimentao.
S TAPHYLOCOCCUS
AUREUS
O microorganismo comumente isolado das leses de pele de ocorrncia natural, no camundongo, no rato e no hamster, Staphylococcus aureus. Trata-se de uma das bactrias no esporuladas mais resistentes e est presente na nasofaringe, trato digestivo posterior e no ambiente. O homem pode servir de fonte de infeco para o animal e vice-versa. A doena clnica depende da virulncia da bactria, das injrias traumticas, do hospedeiro e das condies de sanitizao do ambiente. As formas clnicas podem ser descritas como dermatites ulcerativas, abscessos e pododermatites. O diagnstico depende do isolamento e da identificao do agente a partir do material contido nas leses, excluindo outros possveis agentes. O controle obtido atravs de melhoria na sanitizao, esterilizao de gaiolas e equipamentos e da eliminao de equipamentos que possam causar traumatismos.
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SISTEMA HEMATOPOITICO
V RUS
DA
C ORIOMENINGITE L INFOCTICA (LCMV)
Embora o vrus da coriomeningite linfoctica tenha sido considerado um patgeno tradicionalmente do sistema nervoso central, a viremia e as respostas imunolgicas do hospedeiro tm participao central na patogenia, o que justifica seu reconhecimento como um patgeno do sistema hematopoitico. Trata-se de um arenavrus, com envelope (sensvel ao ter e formaldedo), tendo, ainda, grande significado zoontico para pessoas que trabalham com material biolgico extrado de camundongos e para proprietrios de hamsters de estimao. A forma latente da doena interfere em trabalhos experimentais com outros vrus neurotrpicos. O camundongo selvagem o reservatrio principal da doena, mas o camundongo de laboratrio e o hamster srio so considerados hospedeiros naturais. So susceptveis o homem, os primatas, os ces, os coelhos, as cobaias, os ratos e as galinhas. O LCMV tambm utiliza diversas linhagens de tumores transplantveis como hospedeiras em laboratrio. Apenas os camundongos e os hamsters so reconhecidamente transmissores da doena, podendo eliminar altas concentraes do vrus na urina, na saliva e no leite. A via de infeco , provavelmente, atravs de membrana mucosa e de soluo de continuidade da pele. A transmisso se d por contato direto ou por via placentria. A doena pode ocorrer de duas formas: INFECO TOLERANTE PERSISTENTE resultante de infeco adquirida no tero ou com alguns dias de idade. H uma viremia seguida de eliminao do vrus por toda a vida e, posteriormente, o animal desenvolve um quadro de glomerulonefrite com conseqente emaciao, postura arqueada, ascite e morte; INFECO NO TOLERANTE (AGUDA) resultante de infeces adquiridas aps uma semana de idade. H uma viremia sem eliminao do vrus. O curso pode ser fatal dentro de alguns dias ou semanas, ou haver uma recuperao com eliminao do vrus. Apesar de estar amplamente distribuda, a enfermidade clnica rara e depende do vrus, da linhagem do hospedeiro, via de inoculao e idade. Quando inoculado por via intracerebral, o vrus causa convulses e morte, porm quando inoculado por via intravenosa, produz baixa incidncia da doena com pelagem spera e letargia. As cepas viscerotrpicas causam incidncia e mortalidade mais baixas do que as neurotrpicas. As leses anatomopatolgicas do LCMV so congesto, infiltrao linfoctica das meninges, peritonite e proliferao do sistema monoctico fagocitrio. Como o vrus se replica primariamente nas clulas de Kupfer, a necrose heptica concomitante doena clnica. O diagnstico realizado por meio da sorologia (imunofluorescncia, ELISA) e da inoculao de animais com amostras do fgado de animais suspeitos. Por se tratar de enfermidade transmitida verticalmente, tanto pelas clulas germinais quanto pela placenta, a derivao cesariana deve partir de progenitoras livres da infeco. Depois da obteno de colnias livres do agente, barreiras sanitrias eficientes previnem a entrada do vrus. A forma latente da doena interfere em trabalhos experimentais com outros vrus neurotrpicos. O LCMV um contaminante comum de diferentes tipos celulares, desde clulas tumorais, clulas de mamferos, estoques de vrus e de protozorios. Interfere positivamente na induo de tumores por vrus e na ativao precoce de clulas natural killers. Alm disso, deprime a imunidade humoral e celular e retarda as reaes de rejeio de transplantes.
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VRUS DA DESIDROGENASE LCTICA

O vrus da desidrogenase lctica de grande significado na pesquisa, envolvendo tumores transplantveis, oncologia viral e imunologia. Alm disso, diminui a concentrao plasmtica de desidrogenase lctica. especfico de camundongos; tem tropismo por macrfagos. classificado como um togavrus, geralmente transmitido experimentalmente por uma variedade de vias. Sua eliminao por meio da urina, das fezes e da saliva diminui drasticamente logo aps a infeco, que determina uma viremia persistente. A via transplacentria possvel se a me for infectada durante a gestao. A infeco determina uma viremia persistente. A doena assintomtica. A suspeita da presena do vrus baseada em alteraes dos resultados da pesquisa. Na necropsia, o animal apresenta esplenomegalia e linfadenomegalia. Microscopicamente, h hiperplasia da polpa branca e vermelha no bao e hiperplasia medular nos linfonodos. O diagnstico confirmado com a inoculao de material suspeito em diversas diluies em camundongos e, aps quatro dias, a desidrogenase lctica plasmtica dosada. A concentrao normal da enzima de at 500 unidades por ml de plasma. A derivao cesariana de fmeas isentas de infeco ou infectadas cronicamente elimina o vrus das colnias, desde de que estas sejam mantidas sob barreiras sanitrias. A passagem de inculo em outros roedores no susceptveis elimina o vrus.
H AEMOBARTONELLA
MURIS E
E PERYTHROZOON
COCCOIDES
So parasitas sangneos com maior significado em trabalhos experimentais envolvendo passagem de material de rato para rato (H. muris) e de camundongo para camundongo (E. coccoides). Os agentes so classificados como riqutsias, obrigatoriamente intracelulares, que parasitam hemcias. So transmitidos por um piolho, Polyplax spinulosa, ou pela inoculao de materiais biolgicos. A infeco se mantm assintomtica por toda a vida do animal, a menos que seja ativada por uma imunossupresso natural ou experimental. Os sintomas incluem anemia, dispnia, perda de peso e hemoglobinria. Nas infeces naturais, no h leses visveis, e a parasitemia no detectada em esfregaos sangneos. Na doena ativa, so observadas a anemia, esplenomegalia, hemoglobinria e parasitemia. Esses parasitas reduzem a vida mdia das hemcias, atrapalham o curso experimental da malria, aumentam a atividade fagocitria e a rejeio de transplantes. O diagnstico consiste em ativar a infeco atravs de esplenectomia e diagnstico da infeco em cada indivduo. Os mais velhos so mais susceptveis a desenvolver a doena severa. O controle da infeco baseado na preveno do vetor, na derivao cesariana e na manuteno de barreiras sanitrias.
VRUS
DA
LEUCEMIA MURINA
O grande grupo de vrus geneticamente relacionados, conhecidos como vrus da leucemia murina, compreendem viroses endgenas encontradas em todas as clulas hospedeiras do camundongo. Causam neoplasias hematopoiticas sob condies apropriadas e so muito utilizados como modelo experimental para estudos de biologia molecular, virologia, gentica, patologia e quimioterapia experimental de leucemias. So classificados como oncovrus tipo C da famlia Retroviridae; tm como hospedeiros naturais o camundongo selvagem e de laboratrio. Ocorre transmisso vertical atravs dos gametas e horizontal atravs da saliva, da urina, das fezes, do leite ou da placenta. Existem duas fases distintas no ciclo vital do vrus. Em uma delas, o genoma viral (DNA), ou provrus, que est integrado ao genoma da clula hospedeira, replicado e transmitido s clulas filhas. Na segunda fase, o RNA complementar do vrus sintetizado e armazenado em partculas virais que infectaro novas
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clulas hospedeiras. Na clula hospedeira, o vrus usa a transcriptase reversa e transcreve o RNA viral em DNA para que seja integrado ao genoma da clula. Mesmo os animais germfree contm provrus integrados ao seu genoma. A infeco horizontal pouco significativa. Resta apenas o controle de animais inoculados com altas doses do vrus, que devem ser isolados do grupo controle no-infectado. A malignidade das infeces naturais decorrentes do vrus da leucemia murina rara. As leucemias se apresentam predominantemente na forma de linfomas. O diagnstico baseado nas leses histopatolgicas encontradas nas neoplasias hematopoiticas. O isolamento e a identificao requerem tcnicas especializadas de oncologia.
SISTEMA NERVOSO CENTRAL

Apenas dois agentes so considerados patgenos primrios do sistema nervoso central. O vrus da encefalomielite de Theiler raramente causa doena clnica em camundongos. Encephalitozoon cuniculi, um patgeno comum de coelhos, tem sido descrito no camundongo, no rato e no hamster, mas no foi observada doena clnica nessas espcies. Ambos os agentes tm sido encontrados como contaminantes de cultura de roedores.
VRUS DA ENCEFALOMIELITE DE THEILER

Este enterovrus causa, no camundongo e no rato de laboratrio, uma doena semelhante encefalomielite infantil humana. O agente est presente em baixas concentraes em animais infectados, geralmente com quadro clnico inaparente. O vrus encontrado no contedo e na mucosa intestinal e linfonodos mesentricos. A infeco ocorre entre a 3a e a 6a semana de idade e a transmisso se d por via oral-fecal. Quando ocorre viremia, o vrus se propaga do intestino para a medula espinhal, determinando um quadro clnico caracterizado por paralisia flcida de um ou ambos os membros posteriores. A leso tpica da doena a poliomielite no supurativa com necrose e neuronofagia. O diagnstico sorolgico, sendo mais definitivo a partir do isolamento do vrus, presente na medula espinhal e no crebro de animais doentes, em clulas BHK-21. Tambm possvel o isolamento a partir do contedo intestinal em animais assintomticos. O controle alcanado com a obteno de animais livres da infeco, mantidos sob barreiras e monitorados sorologicamente.
ENCEPHALITOZOON
CUNICULI
Trata-se de um protozorio intracelular obrigatrio, importante em estudos envolvendo passagem de material biolgico de camundongo para camundongo. Tem como hospedeiros o coelho, o camundongo, o rato, o hamster, o co, primatas no-humanos e outros mamferos, sendo o coelho considerado a principal fonte de infeco. O parasita eliminado na urina e a infeco ocorre por via oral (transmisso horizontal). No coelho, ocorre tambm a transmisso vertical. Essas infeces so geralmente inaparentes e a leso clssica uma meningoencefalite granulomatosa multifocal, com o centro necrtico ocupado pelo parasita, que tambm pode estar presente no epitlio tubular renal. O diagnstico sorolgico e suficiente para selecionar animais livres da infeco e para controlar a doena em camundongos e ratos.
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SISTEMA GENITURINRIO
Apenas trs agentes causam infeces primrias no trato geniturinrio de camundongos e ratos:
Leptospira
interrogans ballum, que causa infeco renal em camundongo; Mycoplasma muris, que j foi isolado do trato genital de ratas; Mycoplasma pulmonis, que capaz de causar infeco genital severa (assim como a respiratria) em ratos Lewis, caracterizada por piometra, salpingite e periooforite.
LEPTOSPIRA
INTERROGANS BALLUM
Este agente tem pouco significado como causador de infeces naturais, tendo baixa prevalncia nas colnias atuais de camundongos. Vrios casos clnicos de leptospirose j foram relatados em pessoas que trabalham com esses animais. A transmisso do agente depende da contaminao e sobrevivncia no meio ambiente. Os roedores silvestres, de modo geral, so considerados hospedeiros naturais do agente, sendo o camundongo o mais importante. O rato selvagem o reservatrio primrio da Leptospira interrogans icterohemorragiae. Os hamsters podem ser inadvertidamente infectados quando inoculados com material biolgico de camundongos inaparentemente infectados e, a partir da, costumam desenvolver a doena num curso fatal de 4 a 6 dias. A infeco apresenta duas fases: uma septicmica e uma leptospirrica; a eliminao pela urina ocorre na segunda fase. No camundongo, a doena subclnica. No h leses aparentes e o agente pode ser revelado em cortes histolgicos do tecido renal durante a fase leptospirrica. A sorologia o meio de diagnstico de eleio. A derivao cesariana e a manuteno de barreiras sanitrias eficientes favorecem o controle da doena.
BIBLIOGRAFIA
HOOSIER, G. L. & MCPHERSON, C. W. Laboratory Hamsters. Academic Press: London, 1987. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Infectious Diseases of Mice and Rats. National Academy Press: Washington, D.C., 1991. CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to Use and Care of Experimental Animals. Canadian Council on Animal Care: Otawa, 1984. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Temas Seleccionados sobre Medicina de Animales de Laboratrio: el raton. Rio de Janeiro: CPFA/OPS/OMS, 1976. (Serie de Monografias Cientificas y Tecnicas)
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Camundongos mutantes mais utlizados
C amundongos Mutantes mais Utilizados

BEIGE (LYST BG)
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um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 13, e os camundongos so modelos para o estudo da Sndrome de Chediak-Higashi. O acasalamento se faz entre bg/bg x bg/bg (tanto o macho quanto a fmea so homozigotos recessivos). Lisossomos so vesculas localizadas no citoplasma da clula que tm a funo de digerir organelas celulares envelhecidas e bactrias. No camundongo mutante beige e em portadores da Sndrome de Chediak-Higashi, vesculas gigantescas se originam nos lisossomos que se fundem uns aos outros e algumas enzimas se concentram em locais errneos, dentro da clula. Descobriu-se um gene que codifica uma protena que parece ser a responsvel por esse transporte de lisossomos. O gene foi designado lysosomal trafficking regulator. As anormalidades descritas nos camundongos so muito semelhantes s humanas e se acredita que os genes possuam homologia. A mutao original, no camundongo, deve ter sido induzida por radiao. Nos homozigotos, a cor dos olhos mais clara no nascimento, as orelhas e a cauda apresentam pigmentao reduzida e o plo mais claro do que a linhagem original. Eles tm uma severa deficincia de clulas natural killer (NK), defeitos de pigmentao e tambm lisossomos cujas funes esto alteradas. Outra caracterstica o baixo nmero de plaquetas apresentado, o que faz com que o tempo de sangramento nesses animais seja anormalmente longo. O pleno desenvolvimento dos alvolos pulmonares incompleto e eles se tornam muito grandes. Camundongos beige imunodeficientes tm sido acasalados com mutantes SCID para o estudo de transplantes e doenas. O duplo mutante altamente susceptvel a infeces, mesmo aquelas produzidas por microorganismos geralmente no-patognicos para camundongos; por isso, recomenda-se que eles sejam mantidos somente em condies SPF.
NUDE (HFH11 NU)

um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 11. O acasalamento se faz entre macho nu/nu x fmea nu/+ (as fmeas tm de ser heterozigotas, pois a ausncia de plos impede que mantenham os filhotes aquecidos e a produo de leite muito menor). Esse tipo de acasalamento produz 50% de heterozigotos e 50% de homozigotos recessivos. Os machos homozigotos e as fmeas heterozigotas so aproveitadas para os prximos acasalamentos e os outros animais so descartados.
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O Dr. Grist identificou um camundongo mutante sem plos no laboratrio de vrus do Ruchill Hospital, em Glasgow, e enviou-o ao Instituto de Gentica Animal para estudos. Os camundongos homozigotos apresentam, alm da falta de plos, um timo rudimentar ou a total ausncia dele, o que faz com que os animais tenham deficincia na produo de linfcitos T. Em animais com timo rudimentar, no se nota a diferenciao das regies cortical e medular. Em conseqncia da deficincia de linfcitos T, os animais no rejeitam transplantes de outras linhagens e sua susceptibilidade s infeces muito alta. Os animais so menores, crescem mais lentamente, apresentam defeitos de ossificao, so menos frteis e morrem mais facilmente. Os folculos pilosos so normais, mas a excessiva queratinizao da pele impede a sua erupo. Camundongos nude so bastante usados, como animais timectomizados naturalmente para o estudo do timo nas respostas imune. Devido a sua pouca resistncia s infeces, aconselha-se que esses animais sejam mantidos em condies SPF ou germfree.
DISTROFIA MUSCULAR (LAMA 2 DY)

um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 10. O acasalamento feito entre machos e fmeas heterozigotos: dy/+ x dy/+. As lamininas so uma famlia de matrizes glicoproticas extracelulares, componentes de membranas basais. Elas tm outras atividades como ajudar na adeso, migrao, proliferao e diferenciao celulares. As suas molculas consistem em uma cadeia pesada (alfa) e duas leves (beta e gama). A laminina alfa 2 tambm conhecida como merosina. Uma laminina alfa 2 defeituosa foi encontrada nos msculos cardaco e esqueltico e nos nervos perifricos de camundongos mutantes. Pacientes humanos com deficincia de merosina apresentam distrofia muscular congnita e so homozigotos para genes que causam uma cadeia alfa 2 truncada. No camundongo, no h a produo da cadeia alfa 2. Essa mutao ocorreu no The Jackson Laboratory, espontaneamente, na linhagem 129/Re, em 1951. Os camundongos homozigotos so caracterizados por progressiva fraqueza e a paralisia comea por volta das 3 e semanas de idade. Os msculos dos membros posteriores so os primeiros a ser afetados e depois vm os do esqueleto axial e os dos membros anteriores. A morte ocorre aos 6 meses de idade e os animais so geralmente estreis.
HAIRLESS (HR)
um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 14. O acasalamento feito entre macho hr/hr x fmea hr/+ (assim como as fmeas nude, as fmeas hairless no aquecem os filhotes e produzem pouco leite). A mutao original foi identificada em um camundongo capturado em um avirio, em Londres. Animais homozigotos desenvolvem pelagem normal, mas o plo comea a cair aos 10 dias de idade, podendo voltar a crescer em pequenos tufos que logo caem. O animal permanece pelado por toda a vida, mas no apresenta deficincias imunolgicas severas como as encontradas no camundongo nude. A sua baixa resposta imunolgica se deve deficincia de clulas T helper. As vibrissas crescem, caem e tornam a crescer, tornando-se anormais com a idade. As unhas crescem e se encurvam e, histologicamente, pode-se observar uma hiperqueratose do epitlio estratificado com desenvolvimento de cistos.
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Camundongos mutantes mais utlizados
DIABETES (LEPR DB)

um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 4. H indcios de que esteja em linkage com o gene misty. O acasalamento se faz entre macho db/+ x fmea db/+ (os machos e as fmeas homozigotos so estreis). A leptina um hormnio controlador do peso e foi descoberto que, no camundongo, o gene que a controla uma variao da mutao obesidade. A diabetes no camundongo foi proposta como uma mutao no gene que codifica o receptor da leptina, da a sua designao leptin receptor. A mutao original apareceu espontaneamente na linhagem C57BLKS. Os camundongos homozigotos so distinguidos dos normais por volta das 3 a 4 semanas de idade, devido a sua obesidade em comparao com seus irmos normais. A elevao da insulina plasmtica comea dos 10 aos 14 dias de idade e a elevao da glicose sangnea por volta da 4a semana. Os camundongos apresentam polifagia, polidipsia e poliria. O curso da doena influenciado pelo background gentico, no qual o gene mutante se encontra. No background C57BLKS ocorre um grande aumento na taxa de glicose, severa destruio das clulas secretoras de insulina no pncreas e morte aos 10 meses de idade. No background C57BL/6 existe uma hiperplasia compensatria nas clulas pancreticas e uma contnua hiperinsulinemia at a morte do animal, por volta dos 20 meses de idade.
OBESIDADE (LEP OB)

um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 6. O acasalamento se d pelo cruzamento de machos ob/+ x fmeas ob/+ (as fmeas homozigotas so estreis e a maioria dos machos que no esto em dietas especiais tambm). Os camundongos mutantes obesos no possuem a protena leptina, encontrada predominantemente nos tecidos adiposos de animais normais. O gene codificador da leptina foi identificado no locus da obesidade, o que ocasionou a mudana do nome de ob para Lep. Essa mutao ocorreu naturalmente, no The Jackson Laboratory, em algumas linhagens. Os mutantes podem ser identificados com 4 semanas de idade. Eles aumentam de peso rapidamente at atingir quase trs vezes o peso normal. Tambm exibem hiperfagia, hiperglicemia semelhante ao diabetes, intolerncia glicose, elevados nveis de insulina plasmtica, subfertilidade e aumento da produo hormonal das glndulas pituitria e adrenal. Apresentam, ainda, dificuldades em manter a temperatura corprea em baixas temperaturas. A obesidade caracterizada pelo aumento do nmero de adipcitos e pelo aumento das clulas em si. Essa caracterstica contrasta com outros camundongos obesos, nos quais a causa somente o aumento dos adipcitos, mas no o seu nmero.
SCID (PRKDC SCID)

um gene recessivo autossmico, situado no cromossomo 16. O acasalamento realizado entre machos scid/scid x fmeas scid/scid. Proteno-quinases ativadas por DNA funcionam reparando a cadeia dupla deste. O incio do processo de recombinao necessita de quebras precisas na cadeia de DNA. O ligamento dessas partes que foram separadas seguindo o molde da recombinao essencial para o processo. Os camundongos mutantes apresentam o processo de reparo defeituoso, fazendo com que os pedaos de DNA sejam ligados de forma errada. Apresentam,
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ainda, o processo de reparo de DNA quebrado por radiao ionizante defeituosa. Existe evidncia de que o defeito devido a uma mutao no gene que codifica a subunidade cataltica da proteno-quinase ativada por DNA. A mutao se deu na linhagem CB-17. A maioria dos homozigotos no possuem imunoglobulinas dos tipos IgA, IgM ou IgG, mas alguns animais tm baixssimos nveis de alguma ou das trs. Os rgos linfides desses animais se apresentam com um dcimo do seu tamanho normal. Timo, linfonodos e o bao esto completamente destitudos de linfcitos. Os animais homozigotos so totalmente deficientes de linfcitos T e B e suas clulas esplnicas no respondem a estmulos de mitose para clulas B ou T; por esta razo, no rejeitam transplantes. O defeito parece estar nas clulas precursoras do sistema linfide, j que transplantes de medula ssea restauram a capacidade de produo de clulas B e T funcionais. Embora a maioria dos homozigotos falhe em produzir imunoglobulinas e receptores para clulas T funcionais, alguns os produzem em baixos nveis e ocasionalmente um indivduo pode apresentar nveis quase normais de imunoglobulinas sricas. Esse fenmeno descrito como leakness. Os homozigotos so frteis e em condies SPF ou germfree podem viver por at 1 ano ou mais. Esses animais tm sido usados extensivamente no estudo do sistema imune e nas transplantaes, principalmente no estudo das metstases de tumores humanos.
BIBLIOGRAFIA
FOSTER, H.; SMALL, D. & FOX, G. (Eds.). The Mouse in Biomedical Research. New York: Academic Press, 1983. GREEN, E. H. The Biology of Laboratory Mouse. 2.ed. New York: McGraw-Hill, 1966. THE JACKSON LABORATORY. Handbook on Genetically Stardadized JAX Mice. Bar Harbor: The Jackson Laboratory, 1997.
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Criao e manejo de primatas no-humanos
C riao e Manejo de Primatas No-Humanos

INTRODUO
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Mrcia Cristina Ribeiro Andrade
Existem muitas controvrsias referentes classificao dos primatas no-humanos. Atualmente, existem 128 espcies, sendo 51 pertencentes ao Novo Mundo (Amrica) e 77 ao Velho Mundo (sia e frica) (Figs. 1 e 2). Os primatas do Velho Mundo pertencem infra-ordem Catarhini (kata = inferior; rhini = nariz); distinguem-se basicamente do grupo americano pela posio das aberturas nasais, voltadas para baixo, e pela presena de um septo nasal delgado (Fig. 3). Possuem 32 dentes; unhas achatadas (nunca em garras); algumas espcies apresentam calosidades citicas, de colorido vivo; a cauda, quando presente, no prensil. Os Platyrrhini (platy = largo, rhini = nariz) vivem exclusivamente no continente americano (Fig. 4). A sua origem e a histria de sua migrao para a Amrica do Sul so ainda discutidas em virtude da escassez de fsseis. Admite-se que os primatas tiveram origem na Amrica do Norte, h cerca de 60 milhes de anos, de onde migraram para o sul, para a Eursia e frica, evoluindo separadamente. Distinguem-se das espcies do Velho Mundo por terem o septo nasal largo, o polegar no completamente oponvel, a ausncia de calos citicos e de bolsas jugais, e a dentio, constituda por 32 ou 36 dentes, com 6 pr-molares superiores e 6 inferiores. No conjunto, so de porte menor. Um grupo de espcies possui a cauda prensil. Exclusivamente arborcolas, no existem espcies adaptadas vida terrcola. Em geral, habitam terrenos florestados e poucos descem ao solo em busca de gua ou alimento, que encontram com abundncia no alto das rvores.
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Figura 1 Distribuio mundial dos primatas no-humanos
Trpico de Cncer
CERCOPITHECIDAE
CERCOPITHECIDAE
Equador 0
o
PONGIDAE CALLITRICHIDAE CEBIDAE
LORISIDAE
PONGIDAE
Trpico de Capricrnio CHEIROGALEIDAE LEMURIDAE LEPILEMURIDAE INDRIIDAE DAUBENTONIIDAE
Fonte: Kavanagh (1984).
Figura 2 Classificao dos primatas
Primates
Prosimii
Lemuriformes Lorisiformes
Anthropoidea
Platyrrhini Catarrhini
Tarsiiformes
Cercopithecoidea Hominoidea Hylobatidae
Ceboidea
Callitrichidae
Cebidae
Cercopithecidae
Homenidae Pongidae
Cercopithecinae
Colobinae Homo
Pongo Gorilla Pan

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Os primatas compartilham uma vida social extremamente complexa. A composio das unidades sociais bastante varivel, abrangendo desde espcies solitrias a sociedades com organizaes de mltiplas famlias. Dessa forma, existem categorias distintas de criao animal com o intuito de respeitar tais peculiaridades. Quando os primatas no-humanos comearam a ser utilizados como animais de laboratrio, a partir dos anos 50, muitos fatores foram levados em considerao, visando manuteno efetiva desses animais em cativeiro. O sucesso da pesquisa em primatas encontra-se diretamente relacionado qualidade das tcnicas de manejo empregadas, incluindo alojamentos apropriados para cada espcie envolvida, conhecimento dos aspectos fisiolgicos, nutricionais e genticos, assim como a realizao de um controle sanitrio constante por meio de exames clnicos e laboratoriais complementares de rotina. Figura 3 Macaco rhesus (Macaca mulatta), primata do Velho Mundo pertencente famlia Cercopithecidae Figura 4 Mico-de-cheiro (Saimiri sciureus), primata do Novo Mundo
Fonte: Departamento de Primatologia do Centro de Criao de Animais de Laboratrio / Fiocruz.
NUTRIO
O status nutricional influencia diretamente no crescimento, na reproduo e na longevidade dos primatas, bem como na capacidade de resistncia aos patgenos. A dieta adequada essencial ao bem-estar animal e assegura resultados reprodutveis nas pesquisas biomdicas. A nutrio adequada dos primatas envolve aproximadamente 50 nutrientes essenciais. Alm das exigncias nutricionais a serem obedecidas, importante saber que existem fatores capazes de interferir
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na qualidade dos alimentos, tais como palatabilidade, transporte e estocagem do alimento, e concentrao de contaminantes qumicos e biolgicos. A boa palatabilidade alimentar favorece a aceitao do alimento pelo animal. Assim como nas outras espcies de mamferos, os requerimentos nutricionais dos primatas variam de acordo com estgios do ciclo de vida, como crescimento, reproduo e manuteno vital. No caso dos animais mais idosos, ocorre uma diminuio nesses requerimentos, resultando em obesidade se no forem fornecidas dietas especiais com baixa densidade calrica ou mesmo limitao do consumo alimentar. Fatores ambientais como o estresse provocado por procedimentos experimentais ou ps-cirrgicos, tipos de alojamento, bem como a estao do ano, podem interferir nos requerimentos nutricionais, ora aumentando ora diminuindo tais necessidades. Quando os animais so alojados em grupos, importante observar se os indivduos de menor grau de dominncia social tm acesso comida e gua. Na natureza, os primatas consomem grande variedade de alimentos de origem animal e vegetal. Entretanto, as propores relativas dos diferentes tipos de alimento como frutas, folhosos, ovos de pssaros e invertebrados podem diferir bastante entre as espcies. Em 1981, estudou-se dietas de espcies de primatas e constatou-se que 90% das espcies estudadas consomem frutas; 79% consomem gomas, brotos e flores; 69% consomem folhas maduras; 65% consomem invertebrados; 41% consomem sementes e 37% consomem alimentos de origem animal (incluindo ovos). Infelizmente, difcil mensurar as propores dessas dietas, e, conseqentemente, torna-se impossvel determinar a quantidade normal ingerida de fibra, protena, clcio, vitamina A e outros nutrientes. No mercado, existem raes peletizadas, desenvolvidas especialmente para a alimentao de primatas em cativeiro, que diferem em seus componentes nutricionais de acordo com a idade. A formulao da dieta obtida por meio da mistura de diversos alimentos, vrias vitaminas e suplementos minerais, obtendo-se, assim, um produto nutricionalmente adequado. Alguns centros fornecem aos animais do seu plantel apenas a rao peletizada, sendo esta balanceada e capaz de suprir todas as necessidades do animal. Nesse caso, frutas variadas, cereais, gros, sementes, legumes, verduras, entre outros, so fornecidos exporadicamente, com o intuito de minimizar o estresse. Ateno especial deve ser dada gua que fornecida a esses animais, devendo a mesma ser de boa qualidade e servida em abundncia, geralmente atravs de bebedouros automticos. Quanto rotina de alimentao, os animais devem ser alimentados no mnimo duas vezes ao dia, evitando-se, assim, variaes bruscas nos teores de glicose sangnea, estimulando-se os processos fisiolgicos e comportamentais e minimizando problemas com a possibilidade de dilatao gstrica. A parte da dieta com teores mais elevados de protenas, energia, gordura, vitaminas e minerais deve ser oferecida pela manh. Verduras, frutas, legumes e demais suplementos naturais devem ser sempre servidos tarde.
GENTICA
O estudo da gentica na rea da Primatologia vem crescendo amplamente, visto que um manejo gentico adequado constitui a base para um programa de criao duradouro efetivo, com a finalidade de evitar perdas de animais por causa de problemas de consanginidade, bem como de manter a diversidade gentica dentro da colnia. Para atingir esse objetivo, muitos Centros de Primatas formam o pedigree de suas colnias e fazem a anlise da variabilidade gentica atravs de marcadores genticos especficos.
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REPRODUO
Os estudos de campo so bastante teis para o estabelecimento das colnias de criao. A fisiologia reprodutiva da espcie envolvida constitui a base da manuteno efetiva de uma criao de primatas no-humanos. O sistema de acasalamento adotado de acordo com a espcie, j que existem exemplares monogmicos, poligmicos e promscuos. A vida reprodutiva inicia-se no perodo da puberdade, quando ocorrem alteraes dos hormnios sexuais. Nos macacos do Velho Mundo, a puberdade nas fmeas identificada com o incio da menstruao e da primeira ovulao, que normalmente no ocorre de forma simultnea (Tabela 1). No macho, essa fase notadamente marcada pelo aumento do dimetro testicular e pela espermatognese. As alteraes do peso e do tamanho corporal podem ocorrer antes, durante ou aps o incio desse ciclo reprodutivo, dependendo da espcie. Em muitos casos, principalmente nos primatas do Novo Mundo, o aumento do peso corporal constitui o nico mtodo para deteco do incio da puberdade, e est diretamente relacionado com a secreo hormonal. Em decorrncia do aumento dos nveis de hormnios sexuais, algumas espcies de primatas do Velho Mundo apresentam um fenmeno conhecido por sex skin (Fig. 5). Trata-se de alteraes morfolgicas externas, manifestadas, tanto nos machos quanto nas fmeas, por uma vermelhido que comea primeiramente na pele ao redor da linha pubiana, estendendo-se por debaixo da cauda, da parede abdominal, das ndegas, da poro caudal das costas e da parte interna das coxas, assumindo um formato aproximadamente simtrico, bilateral. O processo continua com inchaos germinados translcidos dos dois lados da pele ventral da linha pubiana. O primeiro inchao diminui e os subseqentes aparecem perifrica e progressivamente, desenvolvendose em uma inchada e edematosa fase, com rica proliferao vascular, conferindo forte colorao vermelha que, depois de algum tempo, adquire carter ciantico. Figura 5 Sex skin em uma fmea de macaco rhesus, com quatro anos de idade, procedente da colnia de primatas da Fiocruz
Em todos os primatas, o acasalamento ocorre de forma sazonal e se encontra associado a fatores ambientais, tais como: fotoperodo, temperatura, umidade e disponibilidade de alimento. Os macacos rhesus (Macaca mulatta), de acordo com esse fenmeno, apresentam sua poca de monta nos meses mais frios do ano estaes do inverno e do outono. Nessa poca, a espermatognese mais acentuada nos machos, assim como, nas fmeas, a frequncia de ciclos menstruais mais regular e com presena de ovulao.
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Tabela 1 Ciclos ovarianos de primatas do Velho Mundo
ESPCIE C. aethiops C. patas C. talapoin M. mulatta M. fascicularis M. arctoides M. cyclopis M. fuscata M. nemestrina M. radiata M. silenus M. sinica M. sylvana P . entellus P . troglodytes P . pygmaeus G. gorilla CICLO REPRODUTIVO (DIAS) 30-33 30-34 33 26-30 28-32 28-29 29 26-28 29-32 25-36 40 29 27-33 21-26 31-37 24-32 28 MENSTRUAO(DIAS) 1-2 Raro 2-6 4.6 2-7 np* 3.3 3.5 np 10 2.5 1-4 3-4 np 3 np np SEX SKIN + + + ? + + + + + + +
*np: no perceptvel; : ausente; + : presente. Fonte: Hendrickx & Dukelow (1995).
SISTEMAS DE CRIAO
Na tentativa de produzir populaes de primatas auto-sustentveis, trs mtodos de criao so adotados, obedecendo-se principalmente aos aspectos comportamentais, bem como s exigncias fisiolgicas de cada espcie estudada (Tabelas 2 e 3).
S EMINATURAL
Estabelecido em reas abertas cercadas, como ilhas naturais ou artificiais, sem que haja quebra do meio ambiente e com proviso de alimentos e gua. Como vantagens desse tipo de sistema de criao, podemos citar que o mesmo atende grande demanda de primatas usados em pesquisa, apresenta baixo custo de manuteno e pouco trabalho, alm de oferecer oportunidade de desenvolvimento de estudos de comportamento das populaes. As desvantagens incluem: custo inicial elevado (instalaes, equipamentos, embarcaes etc.); a distncia das reas urbanas grande; o entrosamento social entre os animais ocorre em um perodo longo (entre 1 a 2 anos); dificuldade de se fazer registro reprodutivo da colnia; dificuldade de reintroduo de animais e de observao; e captura de animais requeridos pela pesquisa.
C RIAO
EM GRUPO
Os animais poligmicos so alojados em gaiolas coletivas, em um sistema de harm, tanto em ambiente interno quanto externo. Pode-se adotar o sistema de mltiplos machos ou apenas um reprodutor, na proporo de um macho para 3 a 12 fmeas, obedecendo as necessidades de espao para a espcie considerada. As fmeas grvidas podem ser removidas na poca do parto ou serem mantidas no mesmo ambiente.
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Nesse sistema de criao, a higienizao e a alimentao so facilitadas, porm difcil realizar um eficiente controle de cruzamento entre fmeas e machos e, conseqentemente, h dificuldade de estabelecer dados precisos de concepo, principalmente no caso de um sistema de mltiplos machos. A harmonia social tambm comprometida, havendo muitos desentendimentos entre os animais, sendo, dessa forma, necessrias intervenes de tcnicos e veterinrios para tratamentos de animais que sofreram traumas por brigas.
C RIAO
INDIVIDUAL
Nesse sistema, as fmeas so alojadas em gaiolas individuais ou em pequenos grupos separadas dos machos, e apenas no perodo reprodutivo so colocadas junto a eles. Embora dispendioso, tal sistema permite fazer registros acurados de reproduo e de tempo de gestao. Alm disso, possvel realizar exames clnicos e laboratoriais mais facilmente, permitindo fazer descartes de reprodutores(as) com segurana. Tabela 2 Espaos recomendados para manuteno de primatas em laboratrio
PESO DO ANIMAL (kg) <1 1-3 3-10 10-15 15-25 > 25 Fonte: Kelley & Hall (1995). REA DO PISO/ANIMAL (m2) 0,15 0,28 0,40 0,56 0,74 2,33 ALTURA (cm) 50,8 76,2 76,2 81,28 91,44 213,36
Para os gneros Brachyteles, Hylobates, Symphalangus, Pongo e Pan, a altura da gaiola dever ser maior, de forma que o animal possa se pendurar no teto e se balanar livremente sem tocar os ps no piso da gaiola. Os animais que pesam acima de 50 kg devem ser alojados em gaiolas estacionrias, de alvenaria.
ENRIQUECIMENTO E CONTROLE AMBIENTAL

De acordo com comportamentos inerentes de cada espcie, o enriquecimento ambiental consiste em uma srie de medidas que modificam aspectos fsicos e sociais, aprimorando a qualidade de vida dos animais cativos. Os primatas so utilizados nas pesquisas em substituio ao homem, na busca de reproduzir as condies fisiolgicas e patolgicas que ocorrem nos humanos. Por uma questo humanitria, e na tentativa de proporcionar ao mximo o bem-estar animal, o trabalho de enriquecimento ambiental direcionado aos nossos primos ancestrais hoje reconhecido mundialmente, tornando-se atividade obrigatria em todos os centros de criao. Esse trabalho objetiva reduzir a condio estressante promovida pelo cativeiro, resultando em pesquisas de boa qualidade. Inmeros programas de enriquecimento ambiental so utilizados para buscar o equilbrio psicolgico dos primatas. Poleiros, balanos, tambores, brinquedos, msica ambiente, alimentos variados, fornecidos de forma no repetitiva, constituem algumas estratgias importantes para aguar a curiosidade desses animais sociveis, uma vez que esses recursos propiciam uma quebra na sua rotina diria to necessria para melhorar a condio vital, assim como ocorre com o prprio homem (Fig. 6).
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Figura 6 Curral destinado criao de macacos rhesus (Macaca mulatta), com poleiros, abrigos e tambores
Fonte: Centro de Primatas da Califrnia, EUA.
O controle do ambiente onde se encontra o animal tem grande importncia, devendo estar adequado a cada espcie de primata. Temperatura, umidade e iluminao so fatores que devem ser cuidadosamente observados, pois caso estejam inadequados, podem levar ao surgimento de doenas que comprometem toda a colnia em razo do estresse produzido. O alojamento do animal deve ser o mais protegido possvel de rudos, pois o excesso de barulho tambm trar danos sade do animal. Quanto temperatura, primatas do Velho Mundo podem se adaptar com facilidade a temperaturas de 19 C, excetuando-se os babunos e os macacos japoneses, que podem se adaptar a temperaturas mais baixas. Os primatas do Novo Mundo devem ser mantidos em temperatura entre 22 C e 26 C. aconselhvel que se diminua a temperatura durante a noite, reproduzindo o que ocorre no ambiente selvagem. A umidade relativa do ar deve ser mantida entre 45% e 60% para a maioria das espcies, devendo ser maior do que 60% para espcies neotropicais. A iluminao deve ser controlada em instalaes que no tm janelas exteriores, devendo haver um timer de controle do tempo de iluminao, promovendo, assim, um ciclo de luminosidade regular.
CONTENO ANIMAL
O manejo desses animais deve ser acompanhado de muita precauo, no devendo subestimar a sua fora e tenacidade, pois apresentam reaes imprevisveis, podendo ocasionar ferimentos graves aos tratadores. Sendo assim, no momento de lidar diretamente com os mesmos, o uso de roupas protetoras, botas e luvas torna-se estritamente necessrio.
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Quando se deseja capturar ou remover animais alojados em grupos, o pu um material de conteno eficaz, porm uma tcnica que estressa em demasia os animais. aconselhvel que o recinto tenha um tnel com uma gaiola de conteno em sua extremidade, induzindo-se a entrada do animal na mesma. A conteno animal pode ser realizada de duas formas: fsica e qumica. Na conteno fsica, o animal capturado com auxlio do pu e a partir da imobilizado por meio de procedimentos tcnicos padronizados de acordo com a espcie. Sempre que necessrio, a conteno qumica realizada, sendo o cloridrato de ketamina o anestsico dissociativo de eleio para a maioria dos primatas.
EXAME PERIDICO DO ANIMAL

A colnia freqentemente deve ser obser vada por tcnicos treinados e qualquer alterao de comportamento e surgimento de sintomas anormais tm de ser imediatamente relatados ao mdico veterinrio responsvel. Os animais devem ser pesados periodicamente, assim como devem passar por uma avaliao clnica freqente. A aplicao de tuberculina obrigatria e deve ser feita no mnimo uma vez por ano para deteco da tuberculose. Nos primatas, o procedimento de tuberculinizao realizado atravs da administrao intrapalpebral, e as reaes so observadas 24, 48 e 72 horas aps a inoculao do produto (Fig. 7). Figura 7 Aplicao de tuberculina em um primata no-humano
Em centros em que no h controle efetivo de parasitas, importante fazer vermifugao profiltica. Exames hematolgicos devem ser feitos quando h suspeitas de enfermidades diversas. O animal devidamente registrado, recebendo um nmero individual. Para identificao do animal, muito freqente adotar o sistema de tatuagem, feita em partes variadas do corpo, dependendo do porte do mesmo. Em animais grandes, geralmente a tatuagem feita na regio peitoral (Fig. 8), enquanto os pequenos recebem tatuagem na face interna da coxa e, eventualmente, adota-se o uso de colares. Em currais, onde se encontram vrias famlias, alm da identificao no peito, costuma-se pintar uma parte do corpo do animal, discriminando a gerao daquele indivduo.
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Figura 8 Identificao do animal atravs de tatuagem na regio peitoral
HIGIENIZAO
Para manter um nvel constante de higienizao adequado, a descontaminao de todas as instalaes e fmites de animais primordial para o bem-estar da colnia, especialmente quando diz respeito a primatas, a fim de prevenir a disseminao de doenas e de reduzir e controlar os helmintos. A prtica de higienizao deve ser feita diariamente. Recomenda-se a utilizao de soluo de hipoclorito de sdio na diluio de 1:100 ou produtos similares, que podem ser usados em todos os tipos de pisos, paredes, portas e outras superfcies. Para esterilizar o ambiente, a fumigao com paraformaldedo ou similares tambm aconselhvel aps o trmino de um programa de quarentena.
CUIDADOS NO MANUSEIO COM PRIMATAS

obrigatrio o estrito cumprimento das normas de higiene pessoal e coletiva, bem como o uso de calados e roupas protetoras. Para tanto, o local de trabalho deve fornecer todo o material necessrio em quantidades suficientes para o seu uso dirio, possibilitando a manuteno do asseio. Alm de chuveiros e armrios, as instituies devem fornecer servios de lavanderias, evitando assim um maior contato entre os funcionrios e as secrees e dejetos provenientes dos animais. A equipe tcnica deve ser submetida a exames mdicos peridicos, inclusive a testes de diagnsticos para a deteco de enfermidades transmissveis aos animais e ao homem. Os profissionais que trabalham diretamente com os primatas devem ser vacinados contra sarampo, ttano e devem fazer o teste de tuberculina anualmente.
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RECOMENDAES SOBRE O USO DE PRIMATAS

Cinco critrios bsicos devem ser seguidos quando se usam primatas em pesquisa: os primatas devem ser usados em pesquisa, apenas quando no possvel obter os mesmos resultados experimentais em outras espcies de animais; a espcie de primata, selecionada para uma determinada pesquisa, deve ser considerada ideal para a elaborao da mesma; o nmero de animais propostos deve ser o mnimo possvel capaz de garantir resultados cientficos confiveis; os primatas no sero sacrificados no curso ou no fim do experimento, a menos que esse procedimento faa parte da pesquisa; caso o sacrifcio seja necessrio, este deve ser feito com um encadeamento de aes, visando conservao e ao aproveitamento mximo da carcaa, para que ela possa ainda ser aproveitada em outros estudos.
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Principais doenas de primatas no-humanos
Principais Doenas de Primatas No-Humanos

INTRODUO
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Mrcia Cristina Ribeiro Andrade
Em virtude da proximidade evolutiva e das caractersticas filogenticas semelhantes ao homem, os primatas no-humanos constituem valiosos reagentes biolgicos nas pesquisas e a sua utilizao ocorre desde 1884, com os estudos de Pasteur. So considerados animais nobres (no-convencionais) em pesquisas, sendo o seu uso restrito e, portanto, utilizados apenas quando no h possibilidades de se obter resultados satisfatrios a partir de animais de laboratrio criados para essa finalidade, tais como os roedores e os lagomorfos. Os primatas no-humanos so transmissores em potencial de diversas doenas e o seu convvio com o ser humano extremamente arriscado, visto que albergam uma grande gama de vrus e bactrias e so altamente susceptveis a infeces comuns ao homem. Por esse motivo, os smios representam modelos adequados para experimentaes cientficas, simulando de forma satisfatria o curso patognico de diversas doenas que afetam o homem. Dessa forma, por serem animais considerados de alto risco biolgico, o controle ambiental do local onde se encontram os animais de grande importncia, devendo ser adequado a cada espcie de primata. Temperatura, umidade e iluminao so fatores que devem ser cuidadosamente observados. Alm disso, as medidas de biossegurana devem ser altamente rigorosas, j que o estresse do animal pode facilitar o surgimento de diversas doenas, comprometendo toda a colnia, assim como a sade dos seres humanos. A seguir, so apresentadas algumas doenas que acometem primatas no-humanos e descritas aquelas de maior relevncia, pelo fato de aparecerem com maior freqncia em um Centro de Criao e Produo.
DOENAS DE MAIOR RELEVNCIA PARA OS PRIMATAS NO-HUMANOS

D OENAS V IRAIS
Quadro 1 Doenas virais
Febres Hemorrgicas Herpesvrus Hepatites Virais Retrovrus Poxvrus Marburg, Ebola, Febre hemorrgica smia, Febre amarela, Dengue Herpes B, Herpesvirus saimiri, Epstein-barr, Cytomegalovirus Hepatites A, B, C, D, E e Hepatite em Callithrichidae Oncovrus tipos B, C e D, Lentivrus Monkey pox
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Quadro 1 Doenas virais (continuao)
Paramyxovirus Picornavrus Togavirus Rhabdovirus Sarampo, Influenza (gripe), SV5, SV41 Poliomielite, Coxsackie, Rhinoviruse Rubola Raiva, Estomatite vesicular
F EBRE H EMORRGICA S MIA

Etiologia: gnero Filovirus, famlia Filoviridae. Doena extremamente virulenta, 100% letal, que leva morte por coagulao intravascular disseminada em um perodo de trs dias aps o surgimento dos sintomas clnicos. Estes incluem epistaxe, ataxia, anorexia e letargia. Os surtos de febre hemorrgica smia no so freqentes. Diante de qualquer sintoma sugestivo da doena, o animal deve ser isolado dos demais e eliminado aps a confirmao, feita por meio de testes sorolgicos.
H EPATITE A
Etiologia: gnero Picornavirus, famlia Picornaviridae. Os smios so os nicos animais que se infectam de modo natural, principalmente os chimpanzs (Pan troglodytes). Aps o reconhecimento da transmisso natural de primatas no-humanos aos homens, renovaram-se esforos para utilizar esses animais como modelos. Os mais utilizados so os primatas da espcie Saguinus mystax, por serem os mais susceptveis. Geralmente, a infeco clinicamente inaparente. H casos de enfermidade clnica com insuficincia heptica aguda, mas normalmente os animais se recuperam. Para prevenir a transmisso da hepatite A dos primatas ao homem, recomenda-se fazer higiene pessoal e utilizar roupas protetoras adequadas, quando se for manejar primatas ou suas secrees naturais, alm de administrar doses profilticas de imunoglobulina s pessoas que esto em contnuo ou freqente contato com smios jovens recm-importados.
H ERPES B
Etiologia: Herpesvirus simiae, famlia Herpesviridae. A infeco ocorre de modo natural entre os primatas do gnero Macaca. Nos animais susceptveis, a enfermidade benigna, passando muitas vezes despercebida, semelhante enfermidade produzida por Hespervirus hominis no homem. A infeco primria ocorre em animais jovens. A leso mais comum se localiza na boca, sobre toda a lngua, podendo ocorrer tambm na borda mucocutnea dos lbios e na conjuntiva da pele, e consiste na presena de vescula que evolui para uma lcera. Todo o processo no dura mais do que 7 a 14 dias e no deixa cicatrizes nem afeta o estado geral. Muitos dos animais infectados podem ser portadores do vrus por toda a vida e eliminam o agente de forma intermitente pela saliva. No homem, Herpesvirus simiae produz uma enfermidade altamente letal. A infeco ocorre por meio de mordeduras ou arranhaduras. Pode haver formao de vescula no ponto da ferida, seguida de linfangite e linfadenite. A infeco generalizada manifesta-se com o aparecimento de febre, cefalia, nuseas, dores abdominais, diarria, faringite vesicular, reteno urinria e pneumonia. Os sintomas neurolgicos se iniciam por dores musculares, vestgios, espasmos diafragmticos, dificuldade de deglutio e dores abdominais.
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Posteriormente, ocorre paralisia flcida das extremidades inferiores, que se estende s extremidades superiores e ao trax, culminando em um colapso respiratrio. Um diagnstico sorolgico adequado de suma importncia para se estabelecer colnias de primatas nohumanos livres de Herpesvirus simiae. Todos os animais recm-importados devem ser mantidos em quarentena por 6 a 8 semanas e todos os que apresentem leses herpetiformes devem ser eliminados.
S ARAMPO
Etiologia: gnero Morbillivirus, famlia Paramyxoviridae. Grande parte das infeces se apresenta de forma subclnica. A maioria dos surtos de sarampo clnico ocorre em animais recm-importados; portanto, supe-se que o estresse de captura, confinamento e transporte constituem fatores importantes para que a infeco se manifeste clinicamente. A sintomatologia varivel, podendo-se apresentar ou no erupes cutneas, coriza mucopurulenta, rinite, conjuntivite, tosse seca, pneumonia e edema periorbital e facial. Todas as evidncias indicam que os primatas no-humanos adquirem a infeco por exposio ao homem.
D OENAS B ACTERIANAS
Quadro 2 Doenas bacterianas
Infeces sistmicas Infeces gastrointestinais Infeces respiratrias Tuberculose, Hansenase, Salmonelose, Ttano, Pseudomonose Shigelose, Campylobacteriose, Yersiniose Streptococcus pneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Hemophilus influenzae, Pseudomonas, Proteus, Corynebacterium
C AMPILOBACTERIOSE
Etiologia: Campylobacter jejuni. Importante zoonose cuja manifestao de moderada a severa enterocolite, caracterizada por febre, malestar, nuseas, mialgia, dor abdominal e diarria aquosa e ftida. A doena pode ser fatal em crianas e adultos imunodeprimidos. A transmisso, geralmente, ocorre por via oral e os animais podem ser portadores assintomticos. Por causa da alta incidncia de portadores sadios, o isolamento do agente no sangue e nas fezes no prova suficiente; por isso, convm comprovar por meio de provas sorolgicas o aumento do nmero de anticorpos. Uma vez comprovada a infeco, o animal deve ser isolado e devidamente tratado.
S ALMONELOSE
Etiologia: Salmonella enteritidis e S. typhimurium so as principais. uma das doenas de maior prevalncia. Consiste em uma infeco sistmica que pode ser encontrada no apenas nas fezes, como tambm no sangue e na urina. Animais aparentemente saudveis podem albergar o patgeno em seus gnglios ou podem ser portadores e eliminadores do agente pelas fezes, de forma transitria, intermitente ou persistente. Os sintomas principais so dores abdominais, nuseas, vmitos e diarria.
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A rao contaminada desempenha importante papel como veculo da infeco. A confirmao do diagnstico clnico ocorre por meio de tipificao sorolgica e do isolamento do agente etiolgico no material fecal.
S HIGELOSE
Etiologia: Shigella dysenteriae, S. flexneri e S. sonnei so as mais encontradas. Trata-se de uma importante zoonose que acomete os humanos e os smios, sendo responsvel pela maior causa de morbidade e mortalidade entre os smios durante o perodo de quarentena. O perodo de incubao, em geral, dura menos de quatro dias. A enfermidade se inicia com febre e dores abdominais, seguidas de diarria e desidratao, por 1 a 3 dias. Uma alta porcentagem (32% a 64%) de animais sobreviventes torna-se assintomtica e alberga a bactria nas fezes. A transmisso ocorre por meio da contaminao fecal dos alimentos, e o agente pode se multiplicar e sobreviver por um longo perodo em vegetais. A infeco se propaga com rapidez nas colnias em razo dos hbitos anti-higinicos dos animais, que defecam sobre o piso da gaiola, onde muitas vezes so depositados os seus alimentos. O diagnstico feito com o isolamento do agente etiolgico em meios seletivos e mediante identificao e tipificao sorolgica. Um controle eficaz inclui o isolamento e o tratamento dos animais afetados ou portadores, bem como a higienizao adequada dos fmites e gaiolas.
T TANO
Etiologia: Clostridium tetani. O ttano consiste em uma toxemia causada por neurotoxina especfica que se forma no tecido infectado por Clostridium tetani. Os esporos do bacilo se encontram sobre os solos cultivados, ricos em matria orgnica, sendo mais comum em climas tropicais. Portanto, o reservatrio e a fonte de infeco o solo que contm C. tetani. Na maioria dos casos, o agente introduzido nos tecidos por meio de ferimentos, particularmente nos de tipo pontiagudos e profundos. As condies favorveis para multiplicao ocorrem quando uma pequena quantidade de terra ou um objeto estranho causa necrose tecidual. A bactria permanece localizada no tecido necrtico do local original da infeco. medida que cessa a multiplicao, as clulas bacterianas sofrem autlise e a neurotoxina ento liberada, causando espasmos e contraes tnicas da musculatura voluntria pela irritao na clula nervosa. Recomenda-se que todas as pessoas que trabalham com os animais sejam vacinadas.
T UBERCULOSE
Etiologia: o agente etiolgico mais comum Mycobacterium tuberculosis, porm h relatos tambm de infeco por M. bovis, M. kansasii, M. scrofulaceum e M. intracellulare. uma doena comum em smios mantidos em cativeiro, podendo ser de curso crnico ou subagudo e o perodo de incubao, geralmente, de 1 a 3 meses. A infeco pode ser adquirida por meio de alimentos contaminados ou por contato com smios ou humanos infectados. A tuberculose a doena bacteriana mais importante dos primatas no-humanos em funo da sua capacidade de se disseminar rapidamente.
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A tuberculose ocorre em todas as espcies de primatas, mas a susceptibilidade varivel. Os macacos do Velho Mundo so mais susceptveis do que os do Novo Mundo. Os sinais clnicos da tuberculose no so evidentes at que o quadro esteja bastante avanado; os animais que aparentam estar em boas condies clnicas podem estar afetados severamente. Os sintomas mais comuns so tosse, perda progressiva de peso, fadiga e prostrao. O diagnstico da doena feito mediante sinais clnicos, teste de tuberculina, raios X e isolamento do agente. O teste de tuberculina vlido, mas podem ocorrer reaes de carter falso positivo e falso negativo. So observadas leses tpicas, principalmente nos pulmes e intestinos. Para o controle efetivo da doena, todos os animais que apresentam reaes positivas de tuberculina devem ser eliminados e todas as carcaas incineradas. Por se tratar de uma doena altamente transmissvel, todas as pessoas que trabalham diretamente com esses animais devem fazer exames peridicos, visando a eliminar a possibilidade de humanos transmitirem tuberculose aos animais e vice-versa.
D OENAS P ARASITRIAS
Quadro 3 Doenas parasitrias
Helmintos Cestdeos Trematdeos Protozorios caro Acantocefalose, Estrongiloidose, Enterobius spp, Esofagostomose, Ascaridiose, Trichuris trichura, Ancilostomose, Trichostrongylus spp Hymenolepis nana Esquistossomose, Fasciola sp Malria, Toxoplasmose, Tripanossomase, Leishmaniose, Pneumocystis carinii, Amebase, Balantidium coli, Trichomonas spp, Giardase, Criptosporidiose. Pneumonyssus simicola
A MEBASE
Etiologia: Entamoeba histolytica. A amebase uma protozoose de importncia que acomete os primatas no-humanos. As cepas de E. histolytica encontradas em primatas so idnticas s encontradas no homem, podendo ser transmitida a indivduos que lidam com uma grande populao, como no caso de pesquisas cientficas e criaes. A infeco por E. histolytica ocorre em muitas espcies de primatas no-humanos. Os macacos rhesus (Macaca mulatta) so geralmente resistentes, apresentando-se assintomticos. Com exceo dos sagis, no susceptveis amebase, os macacos do Novo Mundo so mais sensveis do que os do Velho Mundo. Os sintomas consistem em dor abdominal e evacuaes hemorrgicas. O reservatrio da E. histolytica o homem; a infeco se transmite por via fecal-oral. Os alimentos e a gua contaminados com fezes contendo os cistos do protozorio constituem as principais fontes de infeco. O diagnstico laboratorial feito por meio de exames parasitolgicos e provas sorolgicas. As medidas profilticas consistem em saneamento ambiental, proviso de gua potvel, eliminao sanitria das fezes, higiene pessoal e higiene dos alimentos.
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CARO PULMONAR
Etiologia : Pneumonyssus simicola. Pneumonyssus simicola ocorre com a alta incidncia em primatas no-humanos. Geralmente no h sinais clnicos. Em alguns casos, os animais podem apresentar lceras e diarrias. O isolamento do agente, tanto na forma larvar quanto na adulta, pode ser feito por meio de lavados pulmonares. necropsia so observadas pequenas leses pulmonares csticas e granulomatosas, variando em nmero e extenses, as quais muitas vezes podem ser confundidas com leses provocadas por tuberculose. Os animais infectados devem ser sacrificados. Um controle eficaz para a doena ainda desconhecido. importante esclarecer que algumas enfermidades supramencionadas so especficas de primatas nohumanos, outras ocorrem indistintamente.
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Criao e manejo de ces
C riao e Manejo de Ces

INTRODUO
21
Paulo Guilherme da Silva S
Todos os ces pertencem a uma s espcie (Canis familiaris), com mltiplas raas e variedades, descendendo provavelmente do lobo sul-americano (Canis lupus pallipes). Aps milhares de anos de domesticao, a espcie difundiu-se rapidamente pelo planeta, sendo encontrada desde as regies equatoriais e tropicais at o rtico (Hubrecht, 1995). J no antigo Egito, os ces vo surgir retratados em papiros e pinturas, como o caso das raas basenji e afghan-hound, contando j com aproximadamente 5 mil anos, como tambm em esculturas representando o deus Anbis (o guardio dos mortos). Essas duas raas no esto perfeitamente representadas nas atuais (Correa & Correa, 1982). Quando os exploradores chegaram ao continente americano, trouxeram seus ces, mas j encontraram aproximadamente 20 raas americanas, das quais hoje s restam duas: o co pelado mexicano, assim chamado por no possuir plos, e o co dos esquims. Na Austrlia restou o dingo, hoje selvagem e tambm semidomesticado pelos aborgenes. Em toda a frica restaram ces, dos quais o mais antigo o basenji, que se espalhou por esse continente, sul da sia e ndia; possivelmente foi esse co que chegou Austrlia e, atravs dos milnios, se transformou no dingo. Em toda a sia e ilhas do Pacfico, existiram outras raas de ces ancestrais (Correa & Correa, 1982). Atualmente, o homem seleciona os ces de acordo com as qualidades que lhe interessam, entre as quais podemos citar porte, beleza, agilidade, faro, pelagem e comportamento instintivo. Por meio de cruzamentos inter-raciais e seleo artificial tambm possvel criar novas raas que atendam a critrios especficos. Para fins experimentais, a raa mais utilizada o beagle, em razo de seu porte mdio (10 kg-25 kg), temperamento dcil e padronizao racial.
CONSIDERAES QUANTO UTILIZAO DE CES EM EXPERIMENTOS

O Projeto de Lei Federal no 3.964, de 05 de fevereiro de 1998, discorre sobre a criao e a utilizao de animais para ensino e pesquisa no Brasil, e revoga a Lei no 6.638, de 08 de maio de 1979. Entre as diversas disposies desse projeto de lei, esto a criao do Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA) e a obrigatoriedade da constituio de Comisses de tica no Uso de Animais (CEUA) para o credenciamento das instituies que realizam atividades de ensino e pesquisa com animais.
161
CONSIDERAES QUANTO AO ESPAO FSICO DESTINADO AOS CES DE LABORATRIO

Existem algumas especificaes relativas manuteno de ces em biotrios que devem ser seguidas a fim de facilitar o manejo dos animais, evitar estresses desnecessrios e prevenir enfermidades fsicas e emocionais dos ces. So elas:
os
boxes devem ser individuais ou duplos, a menos que se disponha de um sistema de monitoramento contnuo dos ces; a rea deve ser compatvel com o tamanho dos animais que abriga; considerando o co-padro para experimentos cientficos o beagle; a rea mnima deve ser de 4,5 m2. Restries quanto ao espao fsico afetam o bem-estar geral e o comportamento dos ces, podendo provocar esteretipos locomotores ou estresse; a altura deve ser suficiente para que os tratadores e pesquisadores se mantenham de p; as paredes devem ser lisas, impermeveis, de fcil higienizao e no podem apresentar rachaduras; os boxes devem ser divididos em uma rea coberta e outra descoberta para que o animal possa desfrutar de abrigo, ventilao e sol; a iluminao deve ser reduzida ao mnimo necessrio no perodo noturno, a fim de permitir o repouso do co; a temperatura deve ser mantida entre 15 oC e 24 oC, com umidade relativa de aproximadamente 55%. No caso de recm-nascidos, a temperatura deve ser mantida entre 26 oC e 28 oC durante as duas primeiras semanas (Hubrecht, 1995); os boxes-maternidade devem ser individuais, silenciosos e com espao fsico suficiente para possibilitar que a me amamente com tranqilidade os filhotes; o piso deve possuir caractersticas que facilitem o escoamento dos dejetos durante a limpeza, apresentando uma textura intermediria entre o liso e o spero; os boxes devem proteger o animal do frio, vento e calor excessivos, e possuir uma cama para seu descanso, que pode ser de madeira desde que evite o contato dele com o cho frio. O design dos boxes extremamente importante, uma vez que seu arranjo no biotrio deve possibilitar a transferncia temporria dos ces para outros boxes durante a limpeza dos mesmos, por exemplo. A intercomunicao entre os boxes (individuais ou duplos) tambm deve ser permitida quando desejado. Igualmente, o confinamento dos ces em boxes individuais e a aglomerao de mais de quatro animais em um mesmo boxe por perodos prolongados devem ser evitados para prevenir a ocorrncia de anomalias comportamentais como a apatia e a agressividade (Bebak & Beck, 1993).
REDUO DO ESTRESSE
O manejo de um co deve ser realizado, sempre que possvel, pelos mesmos tratadores e pesquisadores. Caso isso no seja vivel, as tcnicas de manejo devem ser padronizadas, o que torna imprescindvel o treinamento conjunto de toda a equipe diretamente envolvida com os ces no biotrio. Outro fator de estresse que pode ser reduzido o rudo, cujo controle deve ser considerado no design dos boxes e do biotrio como um todo. O uso de materiais abafadores de rudo e de portas acsticas, bem como de corredores amplos, permite minimizar o rudo a que ces, funcionrios e pesquisadores estaro sujeitos (Milligan, Sales & Khirnykh, 1993).
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ALIMENTAO
Como todos os carnvoros, o co precisa de alimentos bem absorvveis e balanceados; eles devem fornecer protenas para crescimento e vigor, representadas por carnes, ovos, leite e laticnios; carboidratos como o arroz, o trigo e outros; lipdios ou gorduras que tanto fornecem energia como do forma ao corpo; minerais como o clcio e o fsforo para os ossos, o ferro para evitar a anemia, favorecendo a formao de hemoglobina nos glbulos vermelhos do sangue; o sdio, o potssio e numerosos outros elementos (Correa & Correa, 1982). As vitaminas presentes nesse tipo de dieta estimulam as funes vitais, como a vitamina A, que favorece a absoro de alimentos; as vitaminas do grupo B, imprescindveis ao metabolismo e respirao celulares; a vitamina C, que estimula a reparao de feridas e leses e fortalece os vasos sangneos; a vitamina D, que comanda a calcificao dos ossos; a vitamina E, importante na reproduo e antioxidante biolgico, e a vitamina K, necessria para a coagulao do sangue (Correa & Correa, 1982). No caso da opo por raes comerciais, deve-se atentar para a especificidade envolvida na idade dos ces: h raes mais ricas em protenas e energia para filhotes em crescimento, at os seis meses de idade, e raes de manuteno, que devem ser oferecidas aps seis meses ou um ano de idade. Um problema potencial das raes comerciais a monotonia na alimentao, o que pode ser contornado oferecendo-se aos ces, eventualmente, alimentos preparados no biotrio.
NECESSIDADES ESPECIAIS DOS FILHOTES

Alm de uma alimentao especfica e bem balanceada, os ces mantidos em biotrios, quando filhotes, precisam de estmulos sociais e afetivos para se desenvolverem de forma saudvel. A chamada socializao primria dos filhotes ocorre naturalmente entre a terceira e a dcima segunda semana de vida, quando so estabelecidas as relaes com outros ces e com o homem. tambm durante esse perodo que os filhotes se acostumam com seu ambiente fsico. Por esses motivos, deve ser dada especial ateno aos estmulos recebidos pelos filhotes nessa fase, intensificando os contatos entre funcionrios, pesquisadores e os animais, e oferecendo a estes ltimos um ambiente agradvel e livre de fatores de estresse (Freedman, King & Elliot, 1961).
MANEJOS DE ROTINA
A BORDAGEM
DO
C O
Primeiramente, a postura do co deve ser observada o comportamento tpico de um co acuado o recuo at o fundo do boxe. Nesse caso, recomendvel que se adote um tom de voz suave e firme, e que a pessoa, ao efetuar a abordagem, abaixe-se at alcanar o mesmo nvel do co. Isso far com que o animal no se sinta ameaado. Movimentos bruscos podem estressar o co, fazendo com que este tome atitudes agressivas e tente morder. Se isso acontecer, tratadores experientes devem ser chamados para auxiliar nos trabalhos de conteno do animal.
CONTENO
DO
C O
Conteno Mecnica
A conteno em recumbncia esternal utilizada na ausncia de agressividade por parte do co, ainda que o uso da mordaa seja recomendvel para evitar acidentes. Um co em recumbncia esternal permanece
163
com o esterno apoiado sobre a mesa de manipulao, ao mesmo tempo em que o tratador coloca o brao sob seu pescoo a fim de controlar os movimentos da cabea, enquanto segura, com o outro brao, o dorso do animal, apoiando a mo sobre a nuca do co para evitar que o mesmo se levante. Essa posio facilita a puno de veias ceflicas e jugulares, a aplicao de injees e pequenos curativos. Para ces agressivos, no entanto, a forma mais usual de conteno a coleira-lao, constituda de haste de madeira com uma tira de couro regulvel presa na extremidade. Outro instrumento utilizado e que apresenta melhor eficincia o pu tranado com fios de nilon ou algodo.
Conteno Qumica
A aplicao combinada de sedativos e analgsicos utilizada para o transporte do co e procedimentos mais traumticos, durante os quais o co pode expressar reaes de defesa e tentar morder o tratador/pesquisador. Quando usados isoladamente, os sedativos tm um efeito tranqilizante que auxilia no manejo do animal. Alguns agentes tm tambm efeito analgsico. No entanto, nenhum analgsico pode ser empregado isoladamente para procedimentos dolorosos, como a cirurgia, atuando somente como pr-anestsico. Para a realizao da conteno qumica, indispensvel a presena de um veterinrio, que indicar o tipo de droga e a dosagem a ser empregada de acordo com o tipo de procedimento e as caractersticas do animal.
CALENDRIO DE PREVENO DE DOENAS

Cadelas selecionadas para reproduo devem ser vacinadas contra a cinomose cerca de um ms antes do perodo estral, para que, em caso de fecundao, os filhotes recebam anticorpos protetores contra essa doena, ao mamarem o colostro durante as primeiras 24 horas de nascidos. A vacina contra a parvovirose base de vrus morto, que tambm tem como objetivo proteger os filhotes ao mamarem o primeiro leite, pode, ainda, ser aplicada durante a gestao. A verminose nos recm-nascidos muito grave e responsvel por grande parte das mortes de filhotes com uma a quatro semanas de vida. Para evitar esse risco, entre 30 e 45 dias aps o cio e a cobertura pelo macho, recomendada a aplicao de vermfugo por via oral, a fim de matar larvas de vermes que podem atravessar a placenta e parasitar os filhotes antes de nascidos. De preferncia, deve ser escolhida uma marca comercial de tetramizol, administrada na base de 10 mg/kg. Se por qualquer motivo no for possvel imunizar a cadela-me antes do parto, ou em caso de morte da mesma ao dar luz, devem ser adotados os seguintes procedimentos:
aos
30 dias, vacinao dos filhotes contra a parvovirose, com vacina base de vrus morto; aos 45 dias, vacinao contra a cinomose; aos 60 dias, revacinao contra a parvovirose; aos 90 dias, vacinao com vacina trplice (cinomose, hepatite e leptospirose) e aplicao de droncit contra a dipilidiose. Se o parto for normal, se a cadela foi vacinada como exposto e os filhotes mamarem o colostro, devem ser adotados os seguintes procedimentos:
aos
30 dias, vacinao contra parvovirose, vacina base de vrus morto; 60 dias, revacinao contra parvovirose; aos 90 dias, vacinao contra cinomose e aplicao de droncit contra a dipilidiose; aos 120 dias, aplicao de vacina trplice (cinomose, hepatite e leptospirose); aps os seis meses de idade, vacinao anual contra a raiva.
aos
164
MEDICAMENTOS E MATERIAIS PARA EMERGNCIAS, ACIDENTES OU TRATAMENTOS DE ROTINA

M ATERIAL
DE
E NFERMAGEM
bandagens
e gaze; de 2 cm e 5 cm de largura; gua oxigenada a 10 volumes; estanca-sangue para conter pequenas hemorragias; algodo hidrfilo; sabonete e shampoo parasiticida; mercrio-cromo; repelente de insetos; lcool para aplicao de injees; bisturi de lmina descartvel; tesouras de pontas finas, retas, de 12 cm, para curativos; pinas de dentes de rato, retas, de 15 cm, para curativos e limpeza de orelhas; esterilizadores; seringas plsticas de 5 cm3 e 10 cm3 para aplicao de injees e medicamentos por via oral.
esparadrapo
M EDICAMENTOS
antibiticos
e antiinflamatrios; antidiarricos; vermfugos para vermes redondos e vermes chatos; vacinas de rotina; analgsicos e sedativos de administrao interna e externa; anestsicos locais e gerais.
BEBAK, J. & BECK, A. M. The effect of cage size on play and aggression between dogs in purpose-bred beagles. Laboratory Animal Science, 43:457-459, 1993. CORREA, W. M. & CORREA, C. N. M. A Sade do Co. Botucatu: J. M. Varela Editores Ltda., 1982. (Srie Sade Animal) FREEDMAN, D. G.; KING, J. A. & ELLIOT, O. Critical period in the social development of dogs. Science, 133:10161017, 1961. HUBRECHT, R. Dogs and dog housing. In: SMITH, C. P. & TAYLOR, V. (Eds.) Environmental Enrichment Information Resources for Laboratory Animals: 1965 - 1995: birds, cats, dogs, farm animals, ferrets, rabbits, and rodents. AWIC Resource Series n.2. Beltsville Potters Bar: U.S. Department of Agriculture MD and Universities Federation for Animal Welfare (Ufaw). p.49-62, 1995. MILLIGAN, S. R.; SALES, G. D. & KHIRNYKH, K. Sound levels in rooms housing laboratory animals: an uncontrolled daily variable. Physiology and Behaviour, 53:1067-1076, 1993.
165
Marsupiais didelfdeos
M arsupiais Didelfdeos:
gambs e cucas
INTRODUO
22
Ana Maria Jansen
Marsupiais tm despertado vivo interesse na cultura ocidental desde que Vicente Pinzn presenteou uma fmea de gamb aos reis catlicos da Espanha. O vocbulo gamb deriva do tupi-guarani e significa ventre aberto, ou seja, foi o modo de reproduo que chamou a ateno dos povos pr-coloniais. A ordem Marsupialia inclui aproximadamente 90 espcies em 11 famlias; predominam na Austrlia, onde o relativo isolamento permitiu que ocupassem os nichos ecolgicos que em outros continentes so ocupados por dezenas ou mais ordens de placentrios. Embora a bolsa marsupial seja o trao referido como caracterstico da ordem, o trato urogenital que distingue mais significativamente os marsupiais dos demais mamferos. Em todos os marsupiais, os dutos urinrios passam no meio dos dutos genitais, enquanto nos eutrios estes passam lateralmente. As fmeas marsupiais apresentam duas vaginas laterais que se unem formando uma vagina mediana. No parto, forma-se um canal de passagem para o feto no tecido conjuntivo entre a vagina mediana e o sinus urogenital. Na maioria dos marsupiais esse canal transitrio e ser novamente formado em cada novo parto. A taxa metablica dos marsupiais mais baixa em comparao com a dos placentrios e a temperatura corporal mdia de 35 C. Ao nascer, um feto marsupial no controla a temperatura corporal esta coincide com o incio da funo tireoidiana na metade do perodo de dependncia do marspio dos animais. A hibernao no observada em marsupiais e a resposta a temperaturas altas caracterizada por aumento da salivao e lambeo dos membros anteriores, transpirao abundante em algumas espcies, polipnia e aumento da ingesto de gua. A maioria dos marsupiais limita a atividade durante o dia.
A FAMLIA DIDELPHIDAE: O GAMB DIDELPHIS MARSUPIALIS

A famlia Didelphidae, de ampla distribuio nas Amricas e representante do grupo mais antigo de marsupiais (Cretceo superior), provavelmente autctone da Amrica do Sul (Reig, 1961). O gnero Didelphis ocorre desde o sudeste do Canad ao sudeste da Argentina, sendo o gnero Marsupial com maior disperso no mundo (Austad, 1988). As espcies D. marsupialis e D. aurita ocorrem em matas midas tropicais encontradas do sul do Mxico ao norte da Argentina.
167
At bem pouco tempo, os marsupiais eram tidos como mamferos inferiores, um elo evolutivo entre ovparos mamaliformes e vivparos placentrios. Atualmente, sabe-se que as semelhanas entre metatrios e eutrios muito grande, sendo a caracterstica diferencial seu modo de reproduo: o tempo de gerao mais curto 12 a 13 dias e a pario de indivduos quase em estgio embrionrio nos metatrios. Um filhote de marsupial pesa 0,01% a 0,05% do peso materno, em contraste com um filhote de placentrio que pesa 2% a 3%. Marsupiais podem ser considerados como um placentrio imaturo que depender, para o seu desenvolvimento, das condies de incubao do marspio. Os marsupiais so considerados amniotas, com saco vitelnico bem desenvolvido, formando, durante a gestao, um tipo de placenta crion-vitelnica coberta por uma membrana cornificada e avascular envoltrio significativamente diferente da placenta crion-alantide, caracterstica dos eutrios. A intimidade de um feto marsupial com os tecidos maternos , portanto, muito menor. Essa intimidade passa a ser importante durante o longo perodo de lactao. Os filhotes de gamb permanecem, durante os primeiros 55 dias de vida, ligados ao mamilo que alcana o estmago dos neonatos. Somente a partir de ento, os filhotes, agora com a boca inteiramente diferenciada, comeam a se soltar do mamilo por alguns momentos e a explorar o meio externo. Nessa poca, iniciam a experimentar os alimentos que se colocam nas gaiolas. O aleitamento prossegue at o centsimo dia, com a gradativa independncia dos filhotes. A pigmentao das orelhas em D. marsupialis um bom marcador dessa fase e mostra para o bioterista que est na hora de separar os filhotes da me, caso contrrio acabam por mat-la e devor-la. possvel deixar apenas um filhote com a me durante mais tempo. Um dos recursos comumente usado fazer rodzio dos filhotes: mantm-se um filhote, ou no mximo dois, por perodos de 24 horas. Esse um recurso que deve ser cuidadosamente acompanhado para evitar que os filhotes agridam a me, e utilizado quando as ninhadas so pouco robustas. Logo aps serem apartados da me, aconselhvel coloc-los individualmente em caixas para ratos contendo maravalha no fundo. Nessas caixas devem permanecer at atingirem o peso de, no mximo, 180 g - 200 g, quando ento devem ser colocados nas gaiolas mencionadas. A taxa de crescimento de um marsupial comparvel a dos placentrios se o primeiro perodo de evoluo no marspio for considerado como perodo fetal e no ps-natal. A maturidade sexual acontece aproximadamente aos oito meses e a expectativa de vida em cativeiro oscila entre 2 a 4 anos.
REPRODUO E MANUTENO EM CATIVEIRO

Didelfdeos devem ser mantidos em gaiolas individuais, salvo durante o curto perodo de corte e acasalamento, do contrrio brigam. Vale mencionar que gambs so nmades e solitrios. Didelphis marsupialis se mantm muito bem em gaiolas de 80 x 80 x 80 cm; Philander opossum pode ser mantido em gaiolas convencionais de coelhos. Caixas pequenas para abrigar os animais durante o dia so imprescindveis, assim como tambm os suportes para aumentar a rea de atividade. No biotrio de marsupiais do Instituto Oswaldo Cruz, da Fundao Oswaldo Cruz (IOC/FIOCRUZ), resolvemos esse tipo de problema colocando escadas de madeira dentro dos recintos. O fundo de um galo de plstico pode ser utilizado como abrigo, uma vez que resistente e facilmente lavvel. Caixas de papelo tambm so indicadas. Vale lembrar que gambs destroem rapidamente essas caixas, as quais tm de ser recicladas com freqncia. Sempre que possvel, deve-se pintar os abrigos de preto para bloquear melhor a incidncia de luz. O recinto deve ter ar-condicionado didelfdeos, sobretudo jovens recm-desmamados, suportam mal as altas temperaturas do vero. gua pode ser oferecida em mamadeiras convencionais, mas o ideal seria a colocao de vasilhames que devem ser limpos diariamente (o hbito de defecao em vasilhas de gua comum nos didelfdeos mantidos em gaiolas). O arame galvanizado a ser usado para a confeco das gaiolas deve ser grosso
168
e o cho da gaiola deve ser liso, para com isso evitar a formao de ulceraes nas patas e na cauda; as faces laterais devem ser forradas para evitar o contato direto entre animais contguos. As leses decorrentes de briga e/ou contato constante com malha de arame freqentemente infectam e se tornam, s vezes, difceis de tratar. Embora sejam poliestros, consideramos o perodo entre julho e janeiro a estao reprodutiva dos didelfdeos. O ciclo estral de aproximadamente 30 dias e a cpula restringe-se a 1 ou 2 dias antes da ovulao, mas o esperma no sobrevive mais do que um dia. Pareamento de espermatozides foi descrito no gnero Didelphis. A alta eficincia reprodutiva de gambs explicada, entre outros, pela capacidade de controlar o sexo da prole. Essa caracterstica poderia esclarecer a sua adaptao s diferentes condies ecolgicas, bem como as adaptaes necessrias para a eficiente competio com os placentrios. O perodo de gestao nos didelfdeos de aproximadamente 13 dias e problemas obsttricos no so relatados. Ao nascer, os gambs no apresentam imunoglobulinas estas, de origem materna, aparecem a partir das primeiras horas ps-parto. Um filhote marsupial surdo e cego; suas patas traseiras e cauda so vestigiais. As patas dianteiras, precocemente desenvolvidas, so equipadas de unhas decduas que auxiliam o neonato em sua escalada para o marspio, o que acontece sem o auxlio materno. Normalmente nasce um nmero bem maior de filhotes (aproximadamente 22) do que o de tetas (13), porm, no mximo 10 sobrevivem. Durante os primeiros 55 dias de vida, a boca ainda indiferenciada dos filhotes est selada ao mamilo. A partir de ento, comeam a se tornar independentes, passando perodos cada vez maiores fora do marspio. Com 80 dias, o sistema imune est maduro e com 100 dias os filhotes devem ser separados em gaiolas individuais, do contrrio, devoraro a me. A pigmentao da orelha, no caso de D. marsupialis, um bom marcador para tal. Uma fmea Didelphidae investe cerca de 112 dias para criar uma ninhada da concepo ao desmame. Embora esse perodo parea muito longo, vale lembrar que aps o desmame os filhotes so inteiramente independentes, o que permitir duas ou at trs ninhadas anuais. Em nosso biotrio, iniciamos o acasalamento no ms de julho. Uma fmea ladeada por dois machos colocada individualmente em recintos especialmente destinado a corte e acasalamento dos animais. Tais recintos medem 1,5 m x 1,5 m e so interconectveis por portinholas, de modo a permitir o livre trnsito dos animais. Aparentemente a fmea faz sua escolha, que pode ser comprovada pelo fato de o casal passar a usar o mesmo abrigo para dormir durante o dia. Normalmente, permitimos que o par permanea no mesmo recinto por trs dias. O pareamento, portanto, deve ser testado pela observao cuidadosa. Nunca observamos resposta do tipo afetiva em marsupiais, mas se mantidos em boas condies, aps a adaptao em cativeiro, tendem a ser pouco agressivos e facilmente manejveis.
TRANSPORTE
Marsupiais devem ser transportados individualmente, ao abrigo da luz, com ventilao e protegidos de rudos o quanto possvel.
NUTRIO
Didelfdeos apresentam uma dentio no especializada, o que lhes confere extrema versatilidade alimentar. Aceitam frutas, pequenos vertebrados, ovos, rao industrializada, insetos, entre outros. As necessidades nutricionais exatas nunca foram estabelecidas para esse modelo animal; Jurgelski (1974) preconiza oferecer 180 g/animal de uma mistura resultante da homogeneizao de 5 kg de rao seca para gatos + 1,5 kg de fgado
169
bovino em 10 litros de gua. Fmeas com filhotes e animais recm-desmamados devem receber o dobro, enquanto aos demais no deve ser permitido alimentar-se ad libitum, para evitar a obesidade. Em nosso biotrio, oferecemos uma laranja, duas bananas, 80 g de rao seca para ces/animal adultos. Fmeas com filhotes e animais recmdesmamados recebem uma suplementao de 100 g de rao mida (prensado de carne de aves).
MANEJO
CONTENO MECNICA como os didelfdeos procuram abrigo durante o dia, em cativeiro, facilmente podem ser capturados pela cauda e imobilizados pela nuca aps permitir que eles se fixem com as unhas sobre algum substrato. Mant-los ligeiramente contidos evita unhadas na mo que est imobilizando a nuca. CONTENO QUMICA 20 mg/kg - 30 mg/kg de peso de cloridrato de ketamina permitem 20 minutos de conteno segura. Anestesias freqentes resultam na necessidade do aumento da droga. COLETA DE SANGUE pela veia marginal da cauda e femural. A puno intracardaca permite a coleta de uma amostra maior de sangue.
DOENAS
Os seguintes parasitas podem ser encontrados em gambs: Trypanosoma cruzi, T. rangeli, T. freitasi, Leishmania chagasi, L. brasiliensis, Babesia sp, Physaloptera sp, Capillaria sp, Gnathostoma sp, Acantocephala sp, Paragonimus sp. Destes, Phisaloptera sp considerado o nico potencialmente virulento, sendo recomendvel a vermifugao dos animais infectados. Gambs e cucas so extremamente resistentes ao veneno das cobras do Novo Mundo, o que significa, alm de mecanismo de escape de um predador, uma fonte alimentar alternativa. Mais ainda, suportam o parasitismo por protozorios dos gneros Leishmania e Trypanosoma, sem danos importantes. So capazes de responder com altos ttulos sorolgicos aos antgenos de T. cruzi vale mencionar que gambs mantm os dois ciclos de multiplicao do T. cruzi: o parasita se multiplica na forma epimastigota na luz das glndulas de cheiro e tambm como amastigota intracelular em diversos tecidos. Isso quer dizer que o gamb pode, ao mesmo tempo, ser reservatrio e vetor do T. cruzi. A enorme distribuio dos didelfdeos nas Amricas se deve principalmente a sua impressionante adaptabilidade. A resistncia ao endocruzamento outro fator favorvel disperso da espcie, na medida em que apenas um pequeno nmero de animais necessrio para fundar uma colnia. Apesar de portarem um crebro descrito como menor do que o dos mamferos placentrios, quando testados comparativamente a ces, gatos, coelhos e cabras, quanto capacidade de memorizar locais onde podiam encontrar alimentos, os gambs apresentaram o desempenho mais alto. A divergncia entre marsupiais e placentrios data de, aproximadamente, 100 milhes de anos. A origem dos marsupiais discutvel. Alguns grupos postulam sua origem na Amrica do Norte, onde teriam sido extintos h 15 milhes de anos enquanto continuavam a se dispersar na Amrica do Sul, chegando at a Austrlia, onde, por falta de competidores, aconteceu sua enorme diversificao. A famlia Didelphidae conta, atualmente, com mais de 70 espcies distribudas pelas Amricas. O gnero Didelphis, encontrado desde o Canad at a Argentina, um dos gneros de mamferos de mais ampla distribuio nas Amricas e inclui quatro espcies: D. marsupialis, D. aurita, D. albiventris e D. virginiana, possivelmente a espcie mais recente e encontrada apenas nos Estados Unidos. Os registros fsseis mais antigos do gnero datam de 4 milhes de anos. Sugere-se, tambm, que o ressurgimento da ponte terrestre que liga as Amricas resultou na colonizao do Mxico pelo D. marsupialis.
170
A interao do homem com gambs antiga: de fato, esses animais resistem bem ao antrpica no meio ambiente, adaptam-se aos forros das casas, ocos de rvores e outros abrigos; sobrevivem bem pilhando restos alimentares do homem. Este, freqentemente os utiliza como fonte de protenas. Atualmente, a tendncia de consider-los como sinantrpicos. E mais, so os nicos mamferos que permanecem em reas muito devastadas. Popularmente bastante desconsiderados na atualidade, os didelfdeos, por suas peculiaridades, oferecem possibilidades nicas de estudos ecolgicos, evolutivos e biolgicos, sendo, portanto, um interessante modelo animal. Quadro 1 Principais marsupiais do Brasil com suas caractersticas, nomes populares e localizao
FAMLIA DIDELPHIDAE Taxa
Caluromys C. lanatus (Olfers, 1818) C. philander (Linnaeus, 1758) Caluromysiops C. irrupta Sanborn, 1951 Glironia G. venusta Thomas, 1912
Bioma(s)
Am, Ce, MA, Pa Am, Ce, MA, Pa Am Am
Peso (G) Dieta

356 170 250 150 665 1250 985 1200 30 20 31 537 10 52 41 64 60 41 21 42 280 FO FO FO IO PS FO FO FO IO IO IO PS IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO
Locomoo
AR AR AR AR SC SC SC SC AR AR AR TE SC SC SC SC SC SC SC SC TE AR AR AR
Nome(s) Vulgar(es)
cuca-lanosa cuca-lanosa cuca cuca cuca-dgua gamb, saru gamb, mucura gamb, mucura catita, guaiquica catita, guaiquica catita, guaiquica cuca catita, guaiquica catita, guaiquica cuca cuca cuca cuca cuca cuca cuca-de-quatro-olhos, jupati catita, guaiquica catita, cuca catita, cuca
Chironectes C. minimus (Zimmermann, 1780) Am, Ce, MA, Pa Didelphis D. albiventris Lund, 1840 D. aurita Wied-Neuwied, 1826 D. marsupialis Linnaeus, 1758 Gracilinanus G. agilis (Burmeister, 1854) G. emiliae (Thomas, 1909) G. microtarsus (Wagner, 1842) Am, Ca, Ce, Pa, Cs MA Am Ca, Ce, MA, Pa Am MA
Lutreolina L. crassicaudata (Desmarest, 1804) Am, Ce, MA, Pa Marmosa M. lepida (Thomas, 1888) M. murina (Linnaeus, 1758) Marmosops M. impavidus (Tschudi, 1844) M. incanus (Lund, 1840) M. noctivagus (Tschudi, 1845) M. neblina (Gardner, 1989) M. parvidens (Tate, 1931) M. paulensis (Tate, 1931) Metachirus M. nudicaudatus (Desmarest, 1817) Micoureus M. constantiae (Thomas, 1904) M. demerarae (Thomas, 1905) M. regina (Thomas, 1898) Am Am, Ce, MA, Pa Am MA Am Am Am MA Am, Ce, MA, Pa
Am, Pa 90 Am, Ca, Ce, MA, Pa 105 Am 100
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Quadro 1 Principais marsupiais do Brasil com suas caractersticas, nomes populares e localizao (continuao)
FAMLIA DIDELPHIDAE Taxa
Monodelphis M. americana (Mller, 1776) M. brevicaudata (Erxleben, 1777) M. dimidiata (Wagner, 1847) M. domestica (Wagner, 1842) M. emiliae (Ihomas, 1912) M. iheringi (Thomas, 1888) M. kunsi (Pine, 1975) M. maraxina (Thomas, 1923) M. rubida (Thomas, 1899) M. scalops (Thomas, 1888) M. sorex (Hensel, 1872) M. theresa (Thomas, 1921) M. unistriata (Wagner, 1842)
Bioma(s)
MA, Cs Am, Pa MA, Cs Ca, Ce, Pa Am MA, Cs Ce Am CE, MA MA MA, Cs MA MA
Peso (G) Dieta

29 84 52 67 60 20 45 74 48 25 50 400 400 360 360 54 18 IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO IO
Locomoo
TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE TE SC SC SC SC SC SC
Nome(s) Vulgar(es)
cuca-de-trs-listras catita catita catita catita catita catita catita catita catita catita catita catita cuca, mucura-de-quatro-olhos cuca, mucura-de-quatro-olhos cuca, mucura-de-quatro-olhos cuca, mucura-de-quatro-olhos cuca cuca
Philander P . andersoni (Osgood, 1913) Am P . mcilhennyi(Gardner & Patton, 1972) Am P . opossum (Linnaeus, 1758) Am, Ce, Pa P . frenata (Olfers, 1818) MA, Cs Thylamys T. macrura (Olfers, 1818) T. pusilla (Desmarest, 1804) MA Ce
Fonte: Ordem Didelphimorphia (Occasional Papers in Conservation Biology Conservation International & Fundao Biodiversitas occasional paper no 4/1996). Legenda: FO= Frugvoro/Onvoro IO=Insetvoro/Onvoro PS=Piscvoro AR= Arborcola SC=Escansorial TE=Terrestre MA= Mata Atlntica Am= Amaznia Ce= Cerrado Ca= Caatinga Pa= Pantanal Cs=Campos do Sul
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173
Criao e manejo de serpentes
C riao e Manejo de Serpentes

INTRODUO
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Anbal Rafael Melgarejo-Gimnez
Muito diferente do que ocorre com as espcies de mamferos e de aves, tradicionalmente criados tanto para pesquisa laboratorial quanto para produo de peles, carnes e outros subprodutos, as serpentes ainda no tm o status de animais de laboratrio ou de produo. Isso se deve, em parte, ao fato de terem sido consideradas tradicionalmente animais prejudiciais e foi a muito custo que se conseguiu evitar a sua matana, para que estas fossem levadas aos serpentrios e utilizadas como fornecedoras de veneno. A experincia do Brasil, nesse sentido, pioneira, e remonta aos primeiros anos do sculo XX, no Instituto Butantan de So Paulo. Ali, desde sua fundao, em 1901, at 1977, foram recebidas cerca de 1,1 milho de serpentes, 80% delas de espcies venenosas (Belluomini, 1984). Essa abundncia impressionante, com uma mdia de quase 15 mil serpentes recebidas por ano, explica a demora no desenvolvimento de tcnicas mais aprimoradas para sua reproduo e criao em cativeiro. Passado um sculo desde aquelas experincias pioneiras, muitos aspectos mudaram significativamente e, na atualidade, manter um serpentrio de produo de venenos significa ter de administrar um complexo conjunto de fatores ticos, biolgicos, sanitrios e tecnolgicos, entre outros. Neste captulo, sero abordados aspectos gerais de biologia e de identificao de serpentes, e aspectos especficos de estrutura, organizao e rotinas de um serpentrio. Pelo fato de os venenos apresentarem uma razovel variao intra-especfica, individual (Willemse, 1978), ontogentica (Gutirrez et al., 1990) e geogrfica (Glenn & Straight, 1978), e significativas diferenas entre as espcies, os laboratrios produtores de soros so exigidos a obter uma boa representatividade de venenos no pool de imunizao dos eqdeos para produo dos soros (OPS, 1977; WHO, 1981). Isso significa contar com serpentrios que abriguem centenas de serpentes, pelo menos das principais espcies e provenientes de uma rea geogrfica o mais ampla possvel. Em um pas de dimenses continentais como o Brasil, isso representa um desafio singular, pois significa um esforo para a captura, o acondicionamento e o transporte seguros, o recebimento e a adaptao ao meio artificial no serpentrio. Torna-se necessrio, antes de iniciarmos as consideraes tcnicas deste captulo, esclarecer expressamente o entorno legal em que se inscreve esse assunto. As serpentes, como todos os animais da nossa fauna silvestre, encontram-se no Brasil protegidas por legislao especfica (Lei no 5.197, de 3 de janeiro de 1967). Sua captura e criao so apenas permitidas sob determinadas condies, que esto regulamentadas pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA).
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A captura e o transporte para fins cientficos s so permitidos por meio de licena especfica (Portaria IBAMA no 332, de 13 maro de 1990). Existem disposies para sua criao tanto em instituies cientficas (Portaria IBAMA no 016, de 4 de maro de 1994) como tambm em criadouros com finalidade comercial (Portaria IBAMA no 118-N, de 15 de outubro de 1997). Existe tambm a possibilidade de estabelecimento de criadouros de fauna silvestre extica, como consta na Portaria IBAMA no 102/98, de 15 de julho de 1998. Sendo as serpentes animais ectotrmicos (de temperatura corporal varivel), a situao geogrfica dos serpentrios tem papel fundamental no sucesso da criao e manejo desses animais. Isso exige, por um lado, um certo grau de climatizao dos criadouros, e, por outro, um conhecimento mnimo das condies ambientais bsicas de cada espcie em particular. Torna-se, ento, complexo o desafio dos serpentrios que necessitam manter um considervel nmero de gneros e espcies diferentes, como o caso dos institutos produtores de soros. Iniciaremos este captulo abordando uma srie de aspectos biolgicos relevantes das serpentes, como algumas de suas caractersticas morfolgicas, seus hbitos e referncias bsicas para sua identificao. Posteriormente, analisaremos os aspectos mais especficos, relativos aos tipos de serpentrios, sua organizao, funcionamento e os principais problemas que costumam aparecer para quem deve criar e manter serpentes em cativeiro.
ORIGEM, EVOLUO E GRANDES GRUPOS DE SERPENTES

As serpentes ou ofdios so popularmente conhecidos no Brasil como cobras. Cientificamente, so agrupadas dentro da subordem Serpentes, que junto com Suria (lagartos e lagartixas) e Amphisbaenia (cobrasde-duas-cabeas), formam a ordem Squamata, o principal, mais numeroso e mais moderno grupo dos rpteis viventes (Classe: Reptilia; subclasse: Diapsida; infraclasse: Lepidosauria). Foram descritas cerca de 3 mil espcies de lagartos, 130 de anfisbendeos e aproximadamente 2.300 espcies de serpentes. A origem desse grupo provavelmente remonta ao Perodo Cretceo (h cerca de 125 milhes de anos) e o desenvolvimento da maior parte das serpentes deve ter ocorrido no Cenozico. So, portanto, relativamente recentes, sobretudo levando-se em conta que os primeiros rpteis datam de 260 milhes de anos atrs. Parece que surgiram de algum grupo de lagartos (animais mais antigos e aqueles com que tm maior semelhana) e admite-se que possam ter derivado de lagartos de vida subterrnea, que, por adaptao, apresentassem corpo extremamente alongado, reduo das patas e olhos semi-atrofiados. As serpentes so encontradas em quase todo o mundo, mas habitam principalmente as regies temperadas e tropicais, em especial em razo de sua dependncia do calor externo , para efetuar, por mecanismos comportamentais (e no metablicos), sua termorregulao. Como os demais rpteis, so animais ectotrmicos, diferenciando-se de aves e mamferos (endotrmicos). As grandes famlias de serpentes ocuparam praticamente todos os ambientes disponveis, desde os terrestres, subterrneos e arbreos, at as guas continentais e ocenicas, diversificando-se notavelmente para se adaptar a exigncias to dspares. Apesar de terem sofrido uma radiao adaptativa surpreendente, conservaram um padro morfolgico bastante homogneo, mesmo que as menores espcies (leptotyphlopidae) possam ter apenas 10 cm de comprimento e as maiores ( boidae) cheguem, eventualmente, a atingir um tamanho prximo aos 10 metros.
CARACTERSTICAS E BIOLOGIA DAS SERPENTES

Alm da forma extremamente alongada do corpo, da falta de membros locomotores, e da posse de escamas epidrmicas cobrindo todo o corpo, as serpentes so caracterizadas pela ausncia de plpebras mveis e de ouvido externo. Caracterizam-se tambm por apresentarem grande elasticidade nos movimentos cranianos, em
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especial nas articulaes das mandbulas, unidas entre si apenas por um ligamento elstico, e com o crnio pelos ossos mveis quadrado e supratemporal. Nas vrtebras, existem articulaes adicionais, zygosphena e zygantra, que limitam a mobilidade entre uma vrtebra e outra, diminuindo o ngulo articular, o que compensado pelo alto nmero de vrtebras (entre 180 e 400). No conjunto, a elasticidade e a flexibilidade dos movimentos necessrios para a locomoo so preservadas e at aumentadas. Tais articulaes se tornaram necessrias para garantir o suporte a uma coluna vertebral extremamente longa. A pele trocada periodicamente em um processo chamado de muda, que, geralmente, desprende-se inteira, comeando pela borda dos lbios. Alguns dias antes da muda, as serpentes ficam com a pele esbranquiada, pela interposio de lquido entre a velha e a nova camada epidrmica, e diminuem bastante a atividade, recolhendo-se a cantos tranqilos. Logo depois da muda, ficam novamente muito ativas, com um aspecto renovado e cores mais vivas. As escamas so crneas e apresentam alfa-queratina, enquanto os espaos entre elas, que devem ser muito elsticos, esto compostos por beta-queratina. Existem escamas de diversas formas, texturas e tamanhos, muitas vezes fruto de adaptao para funes especficas. Uma das mais notveis adaptaes observada nas cascavis, que apresentam um apndice caudal o chocalho constitudo por modificao de escamas, mas que tambm envolve a fuso das ltimas vrtebras caudais, formando uma pea nica o estilo no qual se inserem os msculos que movimentam esse rgo. Os segmentos crneos do chocalho se articulam frouxamente entre si, por sua forma peculiar, e cada um representa uma poro remanescente da muda de pele. A organizao interna das serpentes, apesar do alongamento do corpo, detm um padro semelhante ao dos outros rpteis, com algumas modificaes. No sistema circulatrio, o corao no apresenta particularidades, mas existem diferenas como um maior nmero de vasos sangneos, para garantir uma boa irrigao orgnica. Nos rgos pares aparecem algumas modificaes; nos pulmes, enquanto o direito sofre uma hipertrofia, estendendo-se pelos dois teros iniciais do corpo, como um grande reservatrio de ar, o esquerdo no existe na maioria das espcies, e nas que existe, est praticamente atrofiado. O intercmbio gasoso realiza-se principalmente por meio de um pulmo traqueal e pela poro anterior do pulmo funcional. Os outros rgos pares, como rins, supra-renais, testculos e ovrios, alm de alongados, tm uma disposio assimtrica: os do lado direito, na frente dos do lado esquerdo. O tubo digestivo caracteriza-se, sobretudo, por sua capacidade de distenso, que muito grande no esfago e estmago, e pela simplicidade do intestino, curto e sem dobras. O fgado, bem desenvolvido, alongado, com a vescula biliar separada, em posio posterior, junto ao pncreas e bao, que so estruturas pequenas. O sistema excretor, sem bexiga, junto com o intestino e os rgos genitais, desemboca numa cavidade comum, a cloaca, que se abre ao exterior numa fenda anal transversal. Os rgos copuladores dos machos so pares, denominados de hemipnis, e encontram-se invaginados na cauda. So rgos esponjosos que, para a ereo, enchem-se de sangue e linfa, e apresentam estruturas peculiares, como espinhos e outras macro e microornamentaes, de reconhecida importncia taxonmica. Os rgos sensoriais tm permitido s serpentes explorar de forma surpreendente as potencialidades dos ecossistemas de que fazem parte. A viso apresenta diversos graus de desenvolvimento nos diferentes grupos, mas, em geral so mopes e a acomodao visual ineficiente, estando esse sentido muito mais vinculado deteco de movimentos do que de formas. Os olhos, sem plpebras, esto protegidos por uma escama semelhante a uma lente de contato, a qual trocada junto com a pele. O olfato bastante desenvolvido nesses animais, mas no est associado ao epitlio das fossas nasais, que parecem ser responsveis principalmente pelo acondicionamento e conduo do ar para a respirao. Os movimentos vibratrios da lngua, fina, comprida e bifurcada, permitem serpente fazer uma varredura de partculas do ar, que a extremidade se encarrega de conduzir para o rgo de Jacobson, um quimiorreceptor especializado, revestido por epitlio sensorial, o qual se abre por dois orifcios na mucosa bucal superior logo atrs da escama rostral.
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A audio de sons transmitidos pelo ar praticamente inexiste, em virtude da falta de ouvido externo e mdio. O ouvido interno est conectado ao osso quadrado, que se articula com a mandbula por uma delicada estrutura ssea, a columela, o que confere s serpentes uma particular sensibilidade s vibraes do substrato. A termorrecepo uma adaptao presente em duas famlias de serpentes (Boidae e Viperidae), o que permite a esses animais uma maior facilidade na deteco, aproximao e captura do alimento, constitudo de pequenas aves e mamferos, emissores de radiao infravermelha. Os bodeos apresentam adaptaes sensitivas nas escamas supra e infralabiais que, em alguns casos, formam fileiras de fossetas. Os rgos existentes nos Viperdeos, as fossetas loreais, caractersticas da subfamlia Crotalinae, so importantes para uma rpida identificao das serpentes, que causam 99% dos acidentes no Brasil e em outros pases da Amrica Latina. A fosseta loreal localiza-se entre o olho e a narina, a cada lado do rosto. Cada fosseta consta de uma abertura estreita que se comunica com uma ampla cmara interna, dividida em dois compartimentos por uma membrana de 15 micra de espessura, o componente sensorial do rgo. As terminaes nervosas so semelhantes aos receptores de calor da pele dos mamferos, com a diferena de sensibilidade dada por dois fatores importantes. Em primeiro lugar, as terminaes da pele do mamfero se encontram a uma profundidade de 300 micra, ao passo que, na fosseta, as mesmas esto a apenas duas micra da superfcie. A segunda diferena que a fosseta consegue concentrar toda a energia que incide sobre a membrana, pelo fato desta se encontrar estendida entre duas camadas de ar, evitando, assim, a perda de calor por difuso nos tecidos adjacentes, o que ocorre na pele. O resultado que essas serpentes tm uma capacidade surpreendente para localizar seu alimento num amplo espectro de situaes, tanto em pleno dia, ao crepsculo ou na noite mais escura. A reproduo envolve fenmenos biolgicos muito interessantes, que vo desde peculiaridades no comportamento, como os combates ritualizados entre machos, at adaptaes ecolgicas, como os ciclos sexuais com periodicidades adaptadas a cada clima. As serpentes podem botar ovos (as chamadas espcies ovparas) ou parir filhotes prontos, como os mamferos (espcies vivparas). Em quase todas as famlias de serpentes existe um predomnio de uma ou outra modalidade, mas as espcies ovparas so maioria. No que se refere a nossas espcies peonhentas, so ovparas as cobras corais (gneros Micrurus e Leptomicrurus) e, um caso excepcional entre os Viperdeos, a surucucu (Lachesis muta). Os demais Viperdeos, dos gneros Bothrops, Bothriopsis, Bothrocophias e Crotalus, so todos vivparos. As espcies ovparas fazem a postura em troncos ocos em decomposio, em tocas no cho, sob pedras ou em formigueiros de formigas cultivadoras, todos ambientes com alto teor de umidade e mnima variao de temperatura. Esses dois requisitos so fundamentais, em parte porque os ovos tm a casca apergaminhada (no calcificada), desidratam e contaminam com facilidade, e demoram entre 40 e 70 dias para eclodir. As serpentes vivparas apresentam um perodo de gestao varivel entre as diversas espcies, mas que, em nossos Viperdeos, est em torno dos 4 a 5 meses. Os filhotes das serpentes, seja qual for a forma de nascimento, so dotados de autonomia para sobreviver, o que significa que, nas espcies peonhentas, j nascem com seus aparelhos secretor e inoculador de veneno funcionais. Com referncia alimentao, podemos dizer que todas as serpentes so carnvoras e engolem o alimento inteiro, j que seus dentes agudos e recurvados no lhes permitem parti-lo. Os dentes das serpentes no possuem raiz e encontram-se cimentados em depresses superficiais dos ossos dentrios. Como so agudos e delicados, costumam danificar-se, existindo um mecanismo pelo qual periodicamente so trocados por outros novos, que se formam em locais prximos aos de sua implantao. Essa renovao ocorre durante toda a vida da serpente. O tipo de alimento, que inclui desde lesmas e outros moluscos gastrpodes, artrpodes (como insetos e miripodes), peixes, anfbios, rpteis (inclusive outras serpentes), aves e mamferos, e a estratgia de captura, que apresenta desde espcies constritoras at envenenadoras, variam muito dentro da subordem das serpentes (Amaral, 1927).
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EVOLUO DA FUNO VENENOSA

Poderia parecer fcil distinguir as serpentes inofensivas, sem glndulas de veneno nem presas inoculadoras, daquelas espcies caracteristicamente peonhentas, com um aparelho extremamente desenvolvido para produo e rpida injeo da peonha. Entretanto, essa facilidade se observa apenas nessas duas situaes que, na verdade, so os extremos de um processo evolutivo complexo e altamente especializado, o qual espera ainda respostas para muitas interrogaes. Mltiplos estudos da morfologia craniana e das denties de espcies viventes tm tentado explicar como se operou esse processo evolutivo, que partiu das formas consideradas mais primitivas, no venenosas, para chegar aos estgios mais modernos, possuidores de glndulas venenosas com msculos compressores e presas com um canal interno fechado, que conduzem as secrees txicas at o interior dos tecidos das vtimas, produzindo morte rpida. Tradicionalmente, so caracterizados quatro estgios evolutivos bem marcados nas serpentes, que representam com simplicidade o universo complexo de adaptaes morfolgicas da especializao peonhenta, levando-se em conta principalmente a dentio (Fig. 1): GLIFA (Fig. 1 A) a dentio que, como a etimologia do termo indica, no possui presas, dentes especializados na inoculao de saliva txica ou veneno. Nesse estgio, a glndula supralabial produz uma secreo destinada a lubrificar o alimento. Dentro dessa categoria distinguem-se variadas condies, como homodonte (com todos os dentes iguais) e heterodonte (com alguns dentes alongados). OPISTGLIFA (Fig. 1 B) dentio com um ou mais dentes modificados na parte posterior da maxila. Essas presas possuem sulcos longitudinais, dos quais, por capilaridade, escorre o produto de uma glndula especializada na secreo de substncias ativas, a glndula de Duvernoy. PROTERGLIFA (Fig. 1 C) dentio em que presas anteriores, no maxilar, geralmente com canal de veneno no completamente fechado, esto conectadas glndula venenosa. Alguns gneros conservam dentes posteriores presa, mas em Micrurus a presa o nico dente maxilar. SOLENGLIFA (Fig. 1 D) dentio com uma condio muito especializada em que um nico dente funcional em cada maxila, a presa, extremamente grande, agudo e oco, e permanece paralelo ao crnio quando em repouso, mas gira 90, no momento do ataque, para injetar o veneno.
ESPCIES PEONHENTAS DA FAUNA BRASILEIRA

O Brasil tem uma riqussima fauna de serpentes, composta por cerca de 265 espcies, classificadas dentro de aproximadamente 73 gneros, reunidos em 9 famlias. De todo esse elenco, vimos que apenas duas famlias (Elapidae e Viperidae) congregam as espcies que chamamos de peonhentas, isto , aquelas que produzem toxinas em glndulas especializadas e tm aparelhos apropriados para inocul-las, ocasionando intoxicaes srias no homem e em animais domsticos. Esse conceito tem, para ns, um carter pragmtico, apenas para cumprir um objetivo prtico dentro da rea mdica, pois sabido que diversas espcies de colubrdeos (famlia Colubridae), habitualmente tratadas como no-peonhentas, possuem glndulas ceflicas (em particular a glndula de Duvernoy) que fornecem substncias qumicas para ajudar na ingesto e digesto do alimento, e que podem, muitas vezes, ser txicas tambm para o ser humano.
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Figura 1 Representao do provvel processo de especializao peonhenta das serpentes (A) dentio glifa; (B) opistglifa; (C) proterglifa; (D) solenglifa. gsl glndula supralabial, gD glndula de Duvernoy, gv glndula venenosa
gv
gv
D C
gD
gsl
A
Fonte: adaptado de Kardong (1983).
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Figura 2a As Micrurus, como esta M. corallinus, tm o corpo com anis completos de cor preta, vermelha e amarela ou branca
Figura 2b A espcie mais tpica do gnero Bothrops no Brasil a jararaca, B. jararaca
Figura 2c A surucucu, Lachesis muta, a maior de nossas serpentes peonhentas, com at mais de trs metros de comprimento
Figura 2d A cascavel, Crotalus durissus, inconfundvel pelo chocalho na cauda
FAMLIA ELAPIDAE
A famlia Elapidae composta, como j visto, por serpentes dotadas de um aparelho inoculador do tipo proterglifo (Fig. 1c), e encontra-se amplamente distribuda pelo mundo, com aproximadamente 240 espcies. Muito bem conhecidos na sia, frica, e particularmente diversificados na Austrlia, os elapdeos contm espcies famosas, como as najas asiticas e africanas, e as temidas mambas do continente africano. Nas Amricas, a famlia est representada pelas chamadas cobras corais, das quais, na fauna brasileira, so reconhecidas umas 25 a 30 espcies e subespcies, a maioria pertencendo ao gnero Micrurus (Fig. 2a) e apenas trs ao gnero Leptomicrurus (Da Silva Jr., 1997; Roze, 1996).
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Essas serpentes apresentam a cabea oval, recoberta por grandes placas simtricas, no possuem fossetas loreais como nossos Viperdeos, e os olhos so pequenos e pretos, com pupila elptica vertical (Fig. 3). O pescoo no bem pronunciado, por causa do desenvolvimento da musculatura cervical, adaptada para a escavao, bem como os ossos cranianos, estes muito fortes. O corpo, cilndrico, recoberto por escamas lisas, e a cauda, curta e rolia, d nome ao principal gnero, Micrurus (termo de origem grega que significa cauda pequena). A maioria das espcies possui a colorao tpica de cobra coral, com anis completos em torno do corpo, de cores vivas e contrastantes vermelho, amarelo (ou branco) e preto , em arranjos caractersticos, com os anis pretos dispostos isoladamente ou em trades. Exceo a essa regra so as espcies de Leptomicrurus, de cor preta uniforme no dorso, sem anis, e com manchas amareladas na regio ventral. Da mesma forma, Micrurus annellatus no apresenta anis vermelhos. As corais so animais de hbitos fossoriais ou subfossoriais, habitando principalmente a camada superficial do solo, ou sob o colcho de folhas que cobre o cho das matas. Eventualmente, saem superfcie procura do alimento, ou para acasalar, ou ainda depois de chuvas fortes. A alimentao geralmente composta por pequenas serpentes e anfisbendeos. So animais ovparos. As fmeas pem, geralmente, entre 2 e 10 ovos, em buracos no cho, formigueiro ou dentro de troncos em decomposio. Aps um perodo de aproximadamente dois meses de incubao, conforme as condies ambientais, nascem os filhotes, medindo em torno de 17 cm de comprimento. Figura 3 Representao da cabea de uma cobra coral, mostrando sua forma oval, recoberta por placas grandes e simtricas
A abertura bucal, conforme nossas medies, no ultrapassa um ngulo de 30 e repercute diretamente no tamanho das presas inoculadoras de veneno, que alcanam apenas um comprimento aproximado de 2,5 mm numa coral de 90 cm. A injeo de veneno , portanto, superficial, o que compensado por um fator agravante, j que as corais mordem e no soltam, de forma que o perodo de inoculao costuma ser prolongado. O conjunto de limitaes anatmicas e funcionais, associado pouca agressividade dessas serpentes, explica a baixssima incidncia de acidentes humanos por corais, em torno de 0,5%, de acordo com a estatstica do Ministrio da Sade, restritos principalmente a pessoas que manipulam esses animais. Uma caracterstica saliente na biologia das cobras corais est associada com o colorido vivo e contrastante, aposemtico, que certamente faz parte de um repertrio de adaptaes para a defesa, entre as quais o comportamento de bruscamente contorcer o corpo, escondendo a cabea e levantando a cauda enrolada. Essas caractersticas tambm envolvem um complexo de espcies mimticas, sobretudo da famlia Colubridae, as chamadas falsas corais. Algumas espcies so extremamente raras e pouco conhecidas, s vezes confinadas a reas geogrficas muito restritas; outras, pelo contrrio, so bem comuns, disseminadas por extensas reas do territrio nacional e tradicionalmente reconhecidas; certamente so as mais importantes do ponto de vista da sade pblica.
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FAMLIA VIPERIDAE
A famlia Viperidae, com cerca de 170 espcies distribudas pelo mundo, formada por serpentes com aparelho inoculador do tipo solenglifo (Fig. 1 D), facilmente identificadas pela cabea triangular, recoberta por pequenas escamas de aspecto similar s do corpo. Para caracterizar a subfamlia Crotalinae, devemos somar a esses atributos a presena de fosseta loreal entre o olho e a narina (Fig. 4), como dito anteriormente. Os Viperdeos compreendem, sem dvida, o grupo de serpentes mais importantes para a sade pblica, pois so responsveis pela enorme maioria dos acidentes ofdicos por serpentes peonhentas registrados, no s no Brasil, mas tambm nos outros pases das Amricas. A fauna do Brasil inclui 5 gneros que somam 23 espcies e, se contarmos as subespcies, o nmero chega a 39. A lista que apresentamos no final do captulo tem como base os trabalhos clssicos utilizados como referncias (Hoge & Romano, 1971; Hoge & RomanoHoge, 1981) e inclui as recentes mudanas taxonmicas que afetaram, principalmente, o gnero Bothrops (Campbell & Lamar, 1989), com seu desdobramento em diversos gneros, dos quais, no Brasil, esto representados Bothriopsis e Porthidium. A identificao dos principais gneros de Viperdeos pode ser feita com uma certa facilidade, utilizando caracteres morfolgicos externos, somados aos j mencionados (cabea triangular recoberta por escamas pequenas e presena de fosseta loreal). As serpentes do gnero Bothrops (Fig. 2b) so caracterizadas por possurem a cauda sem maiores modificaes, geralmente com escamas subcaudais em pares (Fig. 5 A). O gnero Lachesis (Fig. 2c) apresenta a cauda com as ltimas fileiras de subcaudais modificadas e eriadas, terminando num espinho (Fig. 5 B). Finalmente, o gnero Crotalus (Fig. 2d) tem a cauda terminada em um apndice articulado, o chocalho (Fig. 5 C).
CRIAO E MANEJO EM CATIVEIRO

Tanto por simples curiosidade, por uma finalidade didtica de se mostrar esses animais em zoolgicos e museus, ou pela necessidade de obteno de seus venenos para pesquisa e produo de medicamentos, desde tempos imemoriais, mas em especial desde o fim do sculo XIX, comeou-se a manter, reproduzir e criar serpentes. No incio, de uma forma intuitiva e, posteriormente, de forma cada vez mais tcnica, tentando reproduzir da melhor forma possvel as condies ambientais necessrias, os serpentrios vm enfrentando o desafio de aprimorar a criao desses animais, possibilitando, cada vez mais, uma maior independncia de sua captura nos ambientes naturais. Grande nmero de pessoas no mundo, especialmente na Europa e nos Estados Unidos, criam serpentes como animais de estimao, em terrrios, e h uma grande quantidade de manuais e revistas especializadas no assunto. Alm disso, eleva-se o nmero de sociedades e lojas especializadas nos mais diversos pases. Atualmente, a Internet revela inmeras pginas que tratam da criao de rpteis como mascotes (pets). Zoolgicos e museus, incumbidos por seus fins didticos, sempre expem serpentes como uma de suas principais atraes. Embora todo esse universo seja fascinante, representa uma realidade muito diferente do que particularmente nos interessa aqui abordar, ou seja, a criao e manuteno de serpentes peonhentas para produo de venenos. Contrastando com a realidade acima citada, apenas um reduzido nmero de autores tem abordado cientificamente a montagem de serpentrios para produo de venenos (Belluomini & Kemenes, 1967; Ashley & Burchfield, 1968; Leloup, 1973, 1975, 1984; Getreyer, 1985). A manuteno de centenas ou at de milhares de serpentes peonhentas envolve uma estrutura e funcionamento razoavelmente complexos e diferenciados, pessoal altamente qualificado e programas permanentes de vigilncia, reviso e aperfeioamento do sistema. Muito diferente, portanto, da criao de uns poucos animais de exposio ou de estimao.
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O primeiro serpentrio, com essa finalidade especfica, foi provavelmente iniciado com o Instituto Butantan, em So Paulo, em 1901, pela necessidade de se obter venenos para a produo dos primeiros soros antipeonhentos das Amricas. No comeo, as serpentes eram mantidas em compartimentos de alvenaria com tampas na parte de cima (Brazil, 1905) (Fig. 6). Figura 4 Cabea de Viperdeo crotalneo, mostrando as escamas pequenas, semelhantes s do corpo, e a presena da fosseta loreal, entre o olho e a narina
Figura 5 Regio caudal dos principais gneros de Viperidae, mostrando: (A) cauda de Bothrops (vista ventral, com subcaudais duplas, normais); (B) cauda de Lachesis (mostrando as ltimas fileiras de subcaudais quilhadas e eriadas, e o espinho terminal); (C) cauda de Crotalus, mostrando o apndice apical, o chocalho
Figura 6 Primeiro serpentrio do Instituto Butantan

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Fonte: Brazil (1905). Numeradas de 1 a 6, diversas espcies de serpentes; ao fundo, sobre as caixas de serpentes, o lao, 7.
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Posteriormente, em 1911, foi construdo talvez o mais famoso serpentrio, idealizado por Vital Brazil, que tentou recriar nele as condies ecolgicas do hbitat das serpentes para que elas sofressem menos no cativeiro. Ali encontravam gua, espaos abertos para insolao, alm de sombra e proteo nos cupinzeiros, num parque de cerca de 500 m2 (Fig. 7). Alm das extraes de veneno, o serpentrio servia tambm para demonstraes diversas sobre o manuseio das cobras e a preveno de acidentes, o que at os dias de hoje torna a Instituio um ponto de visitao turstica clssico da cidade de So Paulo. Apesar do capricho na sua concepo, esse serpentrio no propiciava s serpentes uma boa sobrevivncia. Assim, a partir de janeiro de 1963 a maior parte das serpentes do Instituto Butantan foram transferidas para um biotrio experimental aquecido, onde as mesmas eram mantidas sob observao, tanto em gaiolas de madeira (de 58 x 40 x 30 cm) com frente telada, quanto soltas nas salas (Belluomini, 1964; Belluomini & Kemenes, 1967). Esse trabalho pioneiro permitiu verificar uma sensvel melhoria tanto para a sobrevivncia das serpentes quanto para a produo de venenos. Figura 7 Serpentrio do Instituto Butantan, o famoso jardim das serpentes
Fonte: Brazil (1914).
Podemos dizer, portanto, que so possveis dois tipos principais de serpentrios, um semi-extensivo, onde os ofdios so mantidos em parques coletivos, manejados em reas abertas limitadas, e um intensivo, onde os animais ficam confinados em caixas individuais. Ambos os tipos apresentam vantagens e desvantagens, e a opo por um ou outro depender de diversos fatores relacionados aos objetivos da criao, sua localizao geogrfica, dentre outros.
S ERPENTRIO S EMI-E XTENSIVO

Embora, como se procurou demonstrar, o parque aberto do Butantan apresentasse altos nveis de mortalidade das serpentes, esse tipo de serpentrio e pode ser utilizado com sucesso em determinadas circunstncias. Tal o que se demonstra, por exemplo, na Pentapharma do Brasil, serpentrio mantido no municpio de Uberlndia, Minas Gerais, conforme mostrou Leloup (1984). O autor descreve esse serpentrio, que mantm grupos de criao apenas da espcie Bothrops moojeni em parques de 40 m2, em terreno levemente inclinado, com gua, amplo gramado e rea de insolao, alm de um
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esconderijo subterrneo com abertura tambm para uma sala onde se faz parte do manejo. A construo desses parques baseou-se em extenso trabalho de campo sobre a ecologia da espcie, determinando suas necessidades bsicas, as quais foram otimizadas no modelo. Desvantagens desse tipo de manuteno so apontadas pelo autor e esto relacionadas com o clima, que deve ser o mesmo ou muito semelhante com aquele nativo das serpentes a serem criadas, e isto envolve tambm a acessibilidade da rea, a existncia de um centro hospitalar prximo (para o caso de ocorrerem acidentes), de gua potvel, energia eltrica e comunicaes, alm de caractersticas geolgicas do terreno que permitam a instalao como sua inclinao, a permeabilidade do solo etc. Outras desvantagens existentes so a necessidade de um grande terreno, a dificuldade criada para garantir uma alimentao racionalmente distribuda entre as serpentes e a impossibilidade de estabelecer a origem dos filhotes encontrados nos parques. As vantagens, contudo, esto representadas pelos amplos espaos que permitem s cobras se movimentarem entre a fonte de gua, num extremo, e os abrigos, no outro, aproveitando ao mximo elementos naturais como banhos de sol, chuvas e ventos. possvel, assim, efetuar uma autotermorregulao, o que muito importante para as serpentes. A convivncia em grupos densos benfica, mas requer vigilncia especialmente por rivalidade alimentar ou durante o perodo de acasalamento. Esse tipo de serpentrio, ento, apropriado para estabelecer o manejo de monoculturas de serpentes por perodos longos, quando se dispe de uma rea extensa, situada dentro da distribuio da espcie em questo, da qual se deva obter grandes quantidades de veneno de qualidade homognea.
SERPENTRIO INTENSIVO
A maior parte dos serpentrios, entretanto, realizam manejo intensivo, pois devem criar um variado nmero de espcies, provenientes de diversos climas, em uma rea bastante reduzida. Esse tipo de serpentrio proporciona uma forma simples de manuteno, com facilidade para a vigilncia dos animais, em relao alimentao e reproduo, e para o controle dos fatores ambientais como temperatura e umidade. Esse sistema tambm apresenta desvantagens, como a impossibilidade das serpentes realizarem termorregulao apropriada, obrigando a uma climatizao em parmetros que nem sempre so adequados para todos os espcimes. O espao reduzido causa, ao longo dos anos, uma certa atrofia muscular por falta de exerccio, o que muitas vezes leva as serpentes obesidade. A falta de contato com elementos naturais no permite um perfeito equilbrio fisiolgico das serpentes. Isso se torna evidente pela facilidade com que os animais adoecem; e particularmente arriscado por facilitar o surgimento de enfermidades contagiosas que, s vezes, so difceis de controlar. A descrio da estrutura e funcionamento desse tipo de serpentrio tem como base nossa experincia no Instituto Vital Brazil (IVB), em Niteri, estado do Rio de Janeiro. Desde sua fundao, em 1919, o Instituto vem mantendo animais peonhentos em cativeiro para pesquisas biolgicas e produo de imunobiolgicos e outros medicamentos. Atualmente, so mantidas na Diviso de Animais Peonhentos aproximadamente 300 serpentes e centenas de aranhas e escorpies, a fim de, alm de obter os venenos que serviro de antgenos na produo de soros, estudar, entre outros assuntos, a ecologia, a biologia reprodutiva e alimentar, a distribuio geogrfica, o manejo e controle, a epidemiologia e os aspectos bioqumicos, imunolgicos e farmacolgicos dos venenos de algumas das espcies que consideramos mais significativas. O prdio, de forma circular, ocupa uma rea construda de aproximadamente 150 m2, divididos em uma sala de recepo, uma sala de apoio e quarentena, trs salas de criao e manuteno de serpentes (uma delas com sistema de climatizao central), uma sala de criao de artrpodes e um laboratrio de pesquisas e processamento de venenos.
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RECURSOS HUMANOS E SEGURANA NO SERPENTRIO

Somente pessoas bem treinadas devem realizar o trabalho de um serpentrio. fundamental promover a familiarizao dos tcnicos e profissionais da equipe com os comportamentos e as necessidades bsicas das serpentes, evitando assim atitudes que produzam reaes agressivas ou defensivas que ponham em risco o bom andamento dos trabalhos. essencial que se estabeleam rotinas de trabalho a serem rigorosamente seguidas, havendo, a nosso ver, tendncia, depois do perodo de treinamento bsico, ao descuido ou relaxamento dos procedimentos em conseqncia de um excesso de confiana no trabalho realizado de forma freqente. Isso deve ser especialmente evitado, insistindo-se na necessidade da atividade padronizada e do trabalho de equipe para a preveno de acidentes. As recomendaes a seguir podem contribuir para o estabelecimento de bons hbitos das equipes, sobretudo para realizar tarefas que envolvam manipulao dos animais e das caixas: realizar atividades de manuseio, quando estritamente necessrio, devidamente planejadas, com reserva de dias e horrios para a realizao das tarefas de maior risco, pois essas atividades exigem sempre extrema ateno e bons reflexos; deve-se promover o aprimoramento dos hbitos higinicos e indicar o uso de equipamentos de proteo individual, como luvas de borracha ou cirrgicas, mscaras e outros, uma vez que diversos agentes infecciosos e parasitrios podem ser transmitidos das serpentes ao homem, principalmente por meio das fezes (Belluomini, 1984); importante evitar o uso de relgios, pulseiras e outros elementos da indumentria pessoal que possam vir a se enganchar nas caixas ou prateleiras, aumentando o risco de acidentes; no se deve permitir a presena de estranhos no local, tendo em vista que representam elemento de distrao; levar sempre em conta o comportamento das serpentes, em especial a distncia que podem atingir no bote, que varia com os gneros e espcies, sendo cerca de 30% do comprimento corporal em Crotalus, cerca de 50% em Bothrops e superior a este percentual em Lachesis; para o caso de ocorrncia de acidentes, envolvendo ou no envenenamento, todos os membros da equipe devem saber como se conduzir de forma rpida e precisa. Isso inclui a suspenso imediata da atividade, a identificao do animal agressor e o encaminhamento urgente do acidentado ao centro de sade apropriado. A segurana contra fuga de animais e ocorrncia de acidentes de trabalho garantida pelo conjunto de barreiras fsicas e procedimentos que envolvem o desenho de caixas e tampas, estantes, sistemas de vedao de portas e demais aberturas; a padronizao dos instrumentos de trabalho e dos equipamentos de proteo individuais (EPIs) e o rigoroso treinamento dos membros da equipe do serpentrio. Caso existam no local os soros apropriados, instrumentos, produtos e frmacos de primeiros socorros, devem ser verificados regularmente o estado e os prazos de validade dos mesmos. Embora as portarias do IBAMA recomendem a posse de soros apropriados em caso de manuteno de espcies peonhentas nos criadouros, preferencialmente, os mesmos devem ser aplicados em centros hospitalares e sob superviso mdica, dada a ocorrncia de reaes adversas muitas vezes graves, que podem exigir a imediata interveno do profissional habilitado. Nunca devem ser realizados preventivamente testes de sensibilidade ao soro nos membros da equipe, j que os prprios testes podem sensibilizar e induzir reao alrgica.
deve-se
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AMBIENTE E DISTRIBUIO
Salas
A sala de um serpentrio dever ter algumas caractersticas indispensveis para permitir tanto o conforto dos animais quanto a segurana e o conforto da equipe de tratadores. A rea fsica ideal depende do tipo de caixas e do nmero de animais a serem criados. Nossas salas (Fig. 8) tm cerca de 20 m2, piso no poroso e sem rodaps, portas com visor e fechamento com boa vedao. Uma boa iluminao ambiental essencial. Estantes lavveis e com o mnimo de dobras ou frestas, preferivelmente com rodzios desde que no alterada sua estabilidade para permitir seu deslocamento e uma melhor limpeza e desinfeco das mesmas e das paredes. O nmero de caixas por sala deve ser limitado, tentando assim evitar doenas transmissveis com perda de muitos animais. Leloup (1973) aconselha no ultrapassar o nmero de 50 serpentes por sala. Nosso serpentrio pode comportar normalmente entre 80 e 100 serpentes por sala. A acomodao das caixas nas prateleiras deve permitir um manuseio confortvel, evitando, se possvel, ultrapassar a altura dos membros da equipe; e a primeira fileira deve ter um vo considervel acima do piso. O ideal seriam trs ou quatro fileiras horizontais de caixas, dependendo do tamanho das mesmas. A temperatura ambiente geralmente deve oscilar entre 25 oC e 28 oC. Algumas espcies ou circunstncias que requeiram condies especiais podem ser atendidas na prpria caixa, graas existncia de diversos tipos de aquecedores no mercado (de cermica, pedra aquecedora, placa, cabo, lmpadas especiais). A umidade ambiente depende da necessidade de cada espcie. Algumas, como as do gnero Crotalus, preferem ambientes secos, e as do gnero Bothrops, ao contrrio, podem requerer ambientes com mais de 90% de umidade. Pode-se preconizar uma umidade confortvel para o trabalho (cerca de 60%) e promover, dentro das caixas de manuteno, um aumento da mesma por meio de recipientes de gua porosos, como os potes de barro. Figura 8 Vista parcial de uma sala de manuteno intensiva de serpentes, observando-se caixas de polipropileno, grandes abaixo e mdias acima. A caixa aberta pelo operador alberga uma serpente
DOS
ESPAOS
Fonte: serpentrio do Instituto Vital Brazil.

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A iluminao nas salas deve ser adequada s atividades da equipe de tratadores. Dado que a maioria das espcies peonhentas noturna, deve ser, sempre que possvel, respeitado o fotoperodo natural, desligando a iluminao noite. Estados especiais, como a prenhez em espcies vivparas, podem necessitar de cuidado particular. Existem no mercado atualmente diversos tipos especiais de iluminao artificial, como lmpadas fluorescentes e incandescentes.
Caixas
Uma caixa para manuteno de serpentes deve reunir uma srie de condies gerais, independente de peculiaridades, tais como o tipo e o tamanho da serpente a ser mantida. Em primeiro lugar, esto as caractersticas referentes a sua confiabilidade, no sentido de ter uma construo slida, em material resistente (inclusive a eventuais quedas), com acesso amplo, sistema de fechamento fcil e vedao total, alm de um travamento seguro. A caixa deve, dentro do possvel, possuir um visor para permitir uma fcil e rpida vistoria diria, alm de se observar o posicionamento e atitudes da serpente antes de sua abertura para atividades de rotina e manuseio. Se possvel, deve-se evitar o uso de vidro, pois este, quando quebrado, pode ferir tanto o tratador quanto a serpente, e tambm facilitar a fuga da mesma. Em segundo lugar, a caixa deve ser prtica no manejo leve, sem bordas cortantes ou quinas acentuadas, e com algum sistema de ala que facilite o uso , alm da necessria estabilidade e acomodao nas prateleiras ou suportes da sala. Finalmente, deve ser higinica, permitindo limpeza e desinfeco rotineiras e ser dotada de um bom sistema de ventilao. Figura 9 Vista de caixa de manuteno de polipropileno com tampa de ao inox e acrlico, na qual se observa a ficha de identificao do animal e, no interior, a cama de papelo ondulado e a serpente enrodilhada
Com referncia aos materiais, no Brasil leia-se Instituto Butantan, Instituto Vital Brazil (IVB) e Fundao Ezequiel Dias (FUNEB) , tradicionalmente foram usadas caixas de madeira em diversos modelos e tamanhos, com pelo menos um visor frontal de tela, vidro ou acrlico.
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Outros serpentrios utilizaram caixas de acrlico abertas acima, com tampa de grade metlica (Centro de Zoologia Aplicada, Crdoba, Argentina) ou caixas de fibrocimento com armao metlica (Instituto Clodomiro Picado, San Jos, Costa Rica). Atualmente, no Brasil, os serpentrios inicialmente mencionados tm adotado caixas de acrlico especialmente desenvolvidas (Butantan, FUNED) ou caixas de polipropileno, originalmente desenhadas para roedores (camundongos, ratos, cobaias) com sistemas de tampas adaptados (IVB) (Fig. 9). Em zoolgicos, como o de So Paulo, freqente a utilizao de caixas de fibra de vidro com frente de acrlico, prprias para exposio. Contudo, ainda so usadas caixas de madeira em situaes especiais. Embora nas caixas de madeira a higiene e desinfeco estejam bastante comprometidas, por sua porosidade e por se tratar de matria orgnica que se decompe com a umidade, as serpentes se adaptam muito bem a esse material, j que comum encontr-las, na natureza, dentro de buracos e troncos. Com referncia aos tamanhos, geralmente so utilizados trs ou quatro tamanhos de caixas, dependendo do porte e tipo de serpente que ser mantida. Caixas pequenas (aproximadamente 30 x 20 x 12 cm fundo x largura x altura) so apropriadas para filhotes em geral e espcies de pequeno porte, como as corais (Micrurus sp) e pequenas jararacas (Bothrops neuwiedi, B. erythromelas, B. itapetiningae e B. bilineatus). As caixas para corais devem ser especialmente desenhadas, pois essas serpentes possuem especial habilidade para fugir por qualquer fresta. As caixas mdias (aproximadamente 50 x 35 x 16 cm) representam a maioria em nosso serpentrio e albergam os adultos da maior parte das espcies mantidas (gneros Bothrops e Crotalus). Caixas grandes (aproximadamente 60 x 45 x 24 cm) so teis para algumas espcies de porte mais avantajado, como jararacuus (B. jararacussu), caiacas (B. moojeni), surucucus (Lachesis muta) e grandes cascavis (Crotalus durissus cascavella). Caixas de tamanhos especiais (1 metro ou mais) podem ser necessrias para acasalamento ou procedimentos especficos, como estudo de comportamento ou filmagens. Existem no mercado diversos tipos de recipientes, de materiais variados (plsticos, em grande parte), que podem ser adaptados para as necessidades de manuteno e experimentao com serpentes. Deve-se procurar materiais de cores apropriadas, as quais evitem o estresse dos animais e permitam certa visualizao por parte dos tratadores. As tampas ou as prprias caixas devem contar com um sistema de ventilao eficiente, geralmente mediante o uso de telas apropriadas (evitar as metlicas, que enferrujam e acabam machucando os animais) ou furos de um dimetro apropriado para evitar a fuga, especialmente de filhotes.
G UA
Alguns autores recomendam manter permanentemente um recipiente com gua limpa em cada caixa (Organizacin Panamericana de la Salud, 1977). Entretanto, dependendo da espcie, isso no necessrio, j que, em geral, as serpentes bebem muito pouca gua, eventualmente derrubando os bebedouros e encharcando a caixa, que acaba se tornando imprpria para a permanncia do animal. A permanncia do recipiente com gua (principalmente se poroso, como os de barro) pode ajudar nas mudas de pele, no s pela umidade, como pelo fato de representar um substrato rgido e rugoso para o animal se esfregar nesse processo. Tambm ocorre de as serpentes eventualmente entrarem no recipiente da gua, o que as auxilia, livrando-as de alguns ectoparasitos, como os caros.
S UBSTRATO
Um substrato apropriado forrando o piso da caixa muito importante para o conforto do animal. No nosso serpentrio utilizamos papelo ondulado, para evitar o apoio de todo o ventre do animal sobre a cama. Outros serpentrios utilizam substratos diversos, como maravalha ou papel de jornal. Um refgio, que pode ser um tijolo oco, um vaso de planta furado e invertido, um tronco oco ou um canudo de papel,
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dar conforto ao animal e evitar estresse excessivo. Isso fundamental para algumas serpentes como as corais, e para filhotes em geral.
I NSTRUMENTAL
LAO DE LUTZ muito conhecido o primeiro instrumento confeccionado no Brasil para captura de serpentes, assim chamado em homenagem ao seu inventor, o cientista Adolfo Lutz. Na poca da inveno (fim do sculo XIX), o ento diretor do Instituto Bacteriolgico de So Paulo, com quem Vital Brazil trabalhava, idealizou-o para capturar e conter a serpente para a extrao de veneno. O Instituto Butantan oferece at hoje esses instrumentos para seus fornecedores de serpentes. Trata-se de uma pea de madeira em cujo extremo se fixa uma tira de couro, de uns 50 cm de comprimento, que forma o lao ao passar por anel de metal fixado tambm na extremidade, e preso por seu extremo livre a uma corda fina para puxar e, assim, capturar a serpente (Fig. 10). Esse sistema seguro, mas no laboratrio pouco prtico, prestando-se mais ao trabalho de campo por leigos. Existem fabricantes nacionais de laos de alumnio e cabos de ao revestido de plstico flexvel. Figura 10 Lao de Lutz. (a) instrumento pronto para a captura; (b) a serpente presa um pouco atrs da cabea Figura 11 Diversos instrumentos para conteno e captura de serpentes, utilizados no serpentrio do IVB. (a), (d), (e), (f), (g): ganchos de diversos tamanhos e utilidades; (b): tubo de acrlico para conteno segura de serpente; (c): pina longa de ao; (h): garra para captura

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GANCHOS o manuseio normal das serpentes requer o uso de ganchos (Figs. 11 a, d, e, f, g), instrumentos tambm de uso tradicional. Eles permitem levantar e transportar a serpente ou imobiliz-la com muita praticidade. Os ganchos podem ser confeccionados com certa facilidade, utilizando como haste um cabo de vassoura ou de bambu, ao qual se fixa numa extremidade um gancho metlico em L. Este pode ser de alumnio, ao ou ferro. O comprimento deve ser apropriado para o tamanho da serpente e o conforto do operador, e deve estar de acordo com a rea disponvel na sala. Ganchos muito compridos (mais de 1 m) podem atrapalhar o servio em um local apertado, ao passo que um gancho muito curto pode expor o tratador a acidente. Para a maior parte dos servios, um gancho de 60 cm a 90 cm suficiente. muito importante lembrar que esse instrumento representa a defesa do tratador, e, portanto, deve ser construdo com materiais resistentes e leves para ser confivel. A fixao da parte metlica haste deve ser muito segura e firme. Nos Estados Unidos, existem fabricantes de ganchos de alta qualidade e confiabilidade, geralmente construdos com tacos de golfe, em fibra de carbono ou titnio. Alguns importadores e lojas especializadas no Brasil j dispem desses produtos, embora a um custo bastante elevado. GARRAS (Fig. 11 h) geralmente construdas em alumnio, so um sistema mecnico muito til para imobilizao de serpentes, em especial as grandes. Seu uso requer certa habilidade e treinamento, pois s vezes o animal pode se debater ao ser capturado, e isto pode machuc-lo. TUBOS DE PLSTICO TRANSPARENTE (Fig. 11 b; Fig. 12) feitos de diversos dimetros e comprimentos podem ser utilizados para conter as serpentes, fazendo-as introduzir a cabea e o pescoo por uma extremidade, evitando assim uma conteno mais traumtica ao animal e conferindo segurana total ao tratador. Figura 12 Utilizao de um tubo transparente de acrlico para conter um grande exemplar de serpente. O animal sofre muito menos estresse e traumatismo, e o operador tem absoluta segurana

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PINAS ANATMICAS DE AO INOX, DE PONTA ROMBA (Fig. 11 c) de diversos tamanhos, so teis para abrir a boca das serpentes, expor as presas venenosas, fazer curativos e eventualmente at para introduzir alimentao forada. As maiores, de 60 cm, permitem (dependendo da habilidade do tratador) at capturar com segurana pequenas serpentes. SEXADORES so estiletes de ao inox e ponta romba (Fig. 13). Pelo fato de os hemipnis das serpentes serem ocos e estarem invaginados na cauda, com acesso pela parte posterior e lateral da fenda anal, a intromisso dos estiletes possvel apenas nos machos, o que representa uma forma segura e pouco traumtica de se averiguar o sexo, at em filhotes. So fabricados e comercializados nos Estados Unidos. Figura 13 Sexadores para serpentes. O jogo permite o uso numa ampla gama de tamanhos, desde filhotes a grandes serpentes
LUVAS CIRRGICAS so teis para usar durante a conteno, extrao de veneno e procedimentos que envolvam o manuseio de serpentes, pois ajudam a evitar o contgio de eventuais doenas das serpentes (principalmente parasitrias) ao mesmo tempo que preservam bastante o tato e a sensibilidade manual do tratador, importantes nos momentos de conteno e soltura dos animais. CULOS E MSCARAS FACIAIS podem ser instrumentos importantes na preveno de respingos de veneno nos olhos durante o manuseio, a extrao, ou a inalao de veneno j liofilizado, por ocasio do seu processamento ou pesagem.
SISTEMAS DE IDENTIFICAO DE SERPENTES

Como muitos outros animais, as serpentes apresentam uma individualidade que permite muitas vezes a sua identificao por marcas naturais. Sazima (1988) utilizou um sistema de identificao de Bothrops jararaca por suas manchas dorsais em estudos de campo. A tcnica envolve o registro fotogrfico das serpentes e dentro
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de certos limites razoavelmente prtica, segundo pudemos verificar no incio dos anos 90 em nosso serpentrio. Por serem animais cobertos por escamas epidrmicas, de forma e distribuio bastante constantes para cada espcie, algum sistema de marcao tipo tatuagem individual pode ser aplicada s serpentes. Tradicionalmente foram utilizados cortes com retirada de fragmentos das escamas ventrais (gastrotegos). Como a maior parte das espcies possui bem mais de 100 placas ventrais, esse sistema permite identificar plantis de animais razoavelmente grandes, embora com muita mo-de-obra, tanto para a marcao quanto para a leitura. Tambm foram descritas tcnicas utilizando pequenos brincos plsticos coloridos atravs das escamas (Pough, 1970) ou, ainda, praticando queimaduras com gelo seco nas laterais do corpo (Lewke & Stroud, 1974). Recentemente, uma Instruo Normativa do IBAMA (02/2001) estabeleceu a obrigatoriedade de se identificar os animais em criadouros por sistema eletrnico, consistente na utilizao de microchips (transponders). Estes so implantados subcutaneamente, um pouco frente da fenda anal, em posio dorso lateral esquerda. Um leitor especial permite identificar, a cerca de 30 cm, o cdigo do transponder, que, aplicado corretamente, bem tolerado e no produz inflamao nem sofre migraes dentro do corpo do animal. Tal sistema muito prtico e aparentemente infalvel. Internacionalmente provado, talvez tenha um nico inconveniente: o custo elevado.
A R OTINA
NO
S ERPENTRIO
OBTENO DOS ANIMAIS captura, desastres naturais, obras de impacto (hidreltricas, desmatamentos, assentamentos), aquisio ou intercmbio com outros criadouros. RECEPO E TRIAGEM as serpentes de nosso serpentrio so obtidas de duas formas principais:
animais
provenientes da natureza: atualmente representam em torno de 60% do plantel. So sobretudo doadas por particulares, corporaes militares ou empresas, ou capturadas por nossos tcnicos em domiclios urbanos; animais nascidos em cativeiro: representam os 40% restantes do plantel. Nesse contingente, temos empenhado grande esforo, j que se trata de animais com maior potencialidade adaptativa e melhor sade, alm do que representam provavelmente o caminho futuro, embora ainda no tenhamos concluses definitivas sobre a equivalncia imunolgica e bioqumica do seu veneno com referncia ao dos exemplares oriundos da natureza. Os animais que ingressam em nosso plantel recebem um nmero de cadastro, que os identificar a partir desse momento, e em cuja ficha sero anotados o nome da espcie, o sexo, a procedncia, a data da captura e o coletor. Eventualmente, so anotados tamanho e peso, alm de detalhes caractersticos do animal. ACONDICIONAMENTO E QUARENTENA o animal j identificado e registrado recebe um tratamento profiltico com vermfugo e eventualmente (caso haja ferimentos) os cuidados complementares necessrios (curativos, hidratao, antibioticoterapia etc.). Passa ento por um perodo de quarentena, sendo observado do ponto de vista sanitrio e de sua adaptao ao cativeiro. Durante a quarentena oferecida a primeira alimentao, pois a aceitao da mesma representa um bom sinal para a integrao ao plantel. Geralmente, a no aceitao do alimento deve-se ao estresse, mas tambm pode ser por ferimentos internos ou qualquer patologia, nem sempre detectvel. Sero necessrios ainda muitos estudos at que tenhamos uma idia mais aprimorada do diagnstico e clnica desses animais. Entretanto, colocamos, a seguir, uma sntese dos principais problemas de sade que temos encontrado no serpentrio do IVB. Alm das leses traumticas, s vezes de bastante gravidade, produzidas freqentemente no ato da captura, as serpentes apresentam grande variedade de doenas, sendo comum as infecciosas e as parasitrias, agravadas pelo estresse e pelos longos perodos de permanncia em condies artificiais e submetidos a manipulao para extraes de veneno.
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Em geral, quando se percebe qualquer transtorno no comportamento da serpente, a molstia j se encontra estabelecida. Portanto, imprescindvel, na rotina de trabalho, prestar ateno at mesmo a pequenas alteraes dos hbitos dos animais. Dessa forma, ser possvel agir prontamente, evitando-se a morte do animal ou a propagao de uma epidemia de conseqncias imprevisveis no serpentrio. Dependendo dos cuidados no manuseio e das condies de assepsia durante a manipulao dos animais, alm da estrutura e higiene dos viveiros de manuteno, podero ocorrer leses. razoavelmente freqente a ocorrncia de ferimentos no focinho ou na mucosa bucal, j que, mesmo condicionadas ao cativeiro, as serpentes tentam a fuga com bastante assiduidade ou do botes contra as paredes dos viveiros. Essas leses iniciais podem facilmente virar abscessos. s vezes, as serpentes so feridas pelos animais oferecidos como alimento no momento da captura. No inverno o problema das doenas infecciosas torna-se mais crtico, o que induz um aumento na mortalidade. No nosso serpentrio, nessa poca, costuma ocorrer casos de pneumonia, em particular nas cascavis, mas tambm em jararacas. Dentre os endoparasitas, foram mais freqentemente observados protozorios flagelados no intestino, mais raramente platelmintos (Trematdeos e Cestdeos). Nos exames coproparasitrios aparecem ovos de Nematdeos (Rhabdias e Kallicephalus). Achamos interessante relatar nossa experincia com Linguatuldeos (ou Pentastomdeos) da espcie Porocephalus stilesi em Lachesis muta (Aguiar et al., 1999). A infestao por Porocephalus stilesi de Lachesis muta rhombeata procedentes da natureza foi de 50% dos exemplares. A infestao possivelmente produzida, algum tempo depois do nascimento, pela ingesto do hospedeiro intermedirio, dado o fato de que serpentes neonatas oriundas da natureza estavam isentas desse parasitismo. O fato de todas as Lachesis nascidas em cativeiro no terem sido infestadas ressalta a importncia de se implementar um programa de reproduo e criao em laboratrio, propiciando um plantel saudvel de serpentes para obteno de veneno para pesquisa e produo de antiveneno. Um dos problemas mais freqentes no serpentrio a infestao por ectoparasitos, dentre os quais se destacam os caros e os carrapatos. Em 1985, tivemos no serpentrio uma infestao gravssima por caros, que s nos meses de janeiro-fevereiro matou cerca de 200 jararacas (80% do plantel de serpentes, na poca). Os mesmos foram identificados como Ophionyssus natricis. Esse episdio atingiu essa gravidade porque, naquele tempo, o manejo no serpentrio era feito em ptios comunitrios de 20 m2, que podiam conter at mais de 100 serpentes cada. Os carrapatos (Amblyoma sp) so freqentemente observados em serpentes provenientes da natureza. Dessa forma, recomenda-se tomar os devidos cuidados teraputicos e profilticos (vermifugao e controle de ectoparasitos) durante o perodo de quarentena dos animais recm-chegados. O acondicionamento dos animais feito nas caixas individuais, como visto oportunamente. MANUTENO Passado o perodo de quarentena, o animal encaminhado a uma sala de manuteno, onde entrar, conforme a espcie, idade etc., num esquema de rotina que envolve, principalmente, as alimentaes, cuidados com a higiene e extraes de veneno. Com referncia periodicidade dos eventos, existe uma rotina semanal para limpeza e troca de caixas, substituio de substrato, troca da gua e eventual anotao de fatos relevantes, como mudas de pele, fezes, observao de parasitos, ou comportamento anormal que justifique uma observao mais atenta, feita por clnico veterinrio, para avaliar a necessidade de um tratamento especializado. Medidas profilticas nas salas, como limpeza e desinfeco de pisos, paredes e prateleiras, tambm so realizados semanalmente. ALIMENTAO a freqncia da alimentao varia com a idade dos animais: para a maior parte das espcies, semanal nos neonatos at 1 ou 1 ano e meio de vida, quinzenal em animais jovens, entre 1 ano
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e meio e 3 anos de idade, e mensal nos animais adultos. A alimentao consiste habitualmente de camundongos albinos, cujo tamanho, peso e quantidade so determinados conforme as necessidades de cada serpente. No caso dos adultos do plantel de produo de veneno, a alimentao oferecida uma semana aps a extrao, tempo suficiente para as serpentes se recuperarem do estresse e terem produzido um mnimo de veneno, necessrio para a captura e correta digesto do alimento. Quando uma serpente no aceita alimento de forma espontnea, e uma observao clnica no detecta qualquer patologia, procede-se alimentao forada, sobretudo em exemplares que por sua importncia justifiquem essa ateno especial. Nas regies tropicais e em serpentrios climatizados, geralmente a freqncia alimentar se mantm durante todo o ano, mas eventualmente ocorre rejeio, regurgitaes e aumento de mortalidade durante o inverno. Fmeas prenhes podem ter sua freqncia alimentar alterada, muitas vezes recusando qualquer alimento durante alguns meses. Legislao sobre proteo dos animais (no Brasil, Decreto no 24.645, de 10 de julho de 1934, Art. 3) impede muitas vezes a alimentao de animais com outros animais vivos. Isso, no caso das serpentes, cria um impasse, uma vez que o movimento e o calor corporal costumam ser fatores essenciais para a deteco do alimento. Alguns criadores, no exterior, utilizam com sucesso um artifcio que consiste em congelar os camundongos e armazen-los no freezer at o momento da alimentao das serpentes, sendo ofertados s mesmas depois de aquecidos em forno de microondas. Essa tcnica apresenta algumas vantagens adicionais ao fato humanitrio de evitar a dor do envenenamento aos camundongos, tais como a economia de espao nos biotrios de criao desses mamferos, possibilitando, por um lado, grandes estoques de alimento em momentos de abundncia para serem consumidos oportunamente e, por outro, a eliminao, pelo congelamento, de alguns germes e outros organismos patognicos, diminuindo assim a possibilidade de contaminao das serpentes. Outra possibilidade a utilizao de raes pastosas aplicadas diretamente no estmago das serpentes por meio de uma sonda. Vantagens dessa tcnica estariam representadas pelo menor gasto de veneno da serpente para se alimentar (pois no h necessidade de injet-lo na presa), e por evitar o risco de eventuais ataques dos roedores que s vezes ferem gravemente as serpentes, alm do que esses alimentos so estreis, totalmente livres de patgenos e balanceados nutricionalmente. As desvantagens decorrem da falta, no mercado, de raes e sondas apropriadas para essa finalidade, obrigando os interessados a improvisos. importante lembrar que o esfago dessas serpentes bastante delicado e pode ser ferido e at perfurado pela sonda se a operao no feita com suficiente cuidado. Outras desvantagens so o aumento significativo do trabalho em grandes plantis ou, ainda, a exposio dos tratadores a acidentes. REPRODUO o sucesso reprodutivo no nosso serpentrio muito maior entre as espcies vivparas, ou seja, todas as viperdeas com exceo de Lachesis muta. Nossa prtica nos mostra que essas espcies apresentam poucos problemas durante a gestao. Entretanto, cabe ressaltar que em vrias espcies de nossa fauna temos observado fmeas prenhes tomando banhos de sol na natureza, o que pode ser muito importante para otimizar o metabolismo da me e dos embries durante a gestao. Essa prtica, contudo, muito dificilmente pode ser facilitada no cativeiro, embora possa ser fornecida iluminao artificial mais especfica. Nas nossas condies ambientais, a gestao dura em torno de 5 a 7 meses. Temos registros de partos de 3 a 35 filhotes, em B. jararaca; de 25 a 59 filhotes, em B. jararacussu; e de 6 a 22 filhotes em Crotalus durissus. Os partos ocorrem, em sua maioria, entre fevereiro e maro em Bothrops, e entre dezembro e fevereiro em Crotalus. A incubao dos ovos no laboratrio envolve condies higinicas rigorosas, alm de temperatura e umidade controladas e constantes. dificultada pela contaminao principalmente por fungos, os quais acabam matando os embries. Essa contaminao se deve, especialmente, permanncia dos ovos na caixa onde se encontra a me, que, dependendo das circunstncias, pode ser de algumas horas at dias.
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Nesse perodo, os ovos desidratam e se contaminam at mesmo com as fezes eventualmente eliminadas pela serpente adulta logo aps a postura. Os ovos devem, ento, ser limpos com escova ou pincel suave e gua destilada, e colocados em caixas contendo um substrato apropriado. No caso, utilizamos vermiculita autoclavada e umedecida com gua destilada, numa mistura de pesos iguais de cada elemento. importante, alm dessas condies referidas, que a temperatura permanea estvel durante o perodo de incubao, j que a submisso a variaes aumenta a mortalidade e, em certos casos, causa malformaes. Uma perspectiva interessante para a reproduo em cativeiro est representada pelo desenvolvimento de tcnicas de inseminao artificial. Diversos trabalhos relacionados inseminao em Crotalus foram elaborados desde a dcada de 70 por Langlada e colaboradores (Langlada, 1972, 1975; Langlada & Belluomini, 1972; Langlada, Gonalves & Rodrigues, 1973; Langlada, Ferreira, & Santos, 1991; Langlada, Santos & Ferreira, 1994).
UM SERPENTRIO EXPERIMENTAL PARA LACHESIS MUTA NO IVB

O sucesso na manuteno da surucucu (Lachesis muta) dificultado por diversas causas, como ferimentos e estresse do animal durante a captura e transporte, e falta de condies apropriadas no cativeiro. A maior das Viperdeas, chegando a 3,5 m de comprimento, uma raridade nos serpentrios, e existe grande dificuldade de captura na natureza. Tentando aprimorar as tcnicas de manejo em cativeiro, desenvolvemos um projeto visando ao trabalho de campo e de laboratrio, o que forneceu o embasamento necessrio para a concepo de uma sala climatizada para estudo e criao da surucucu. O desafio principal radicou no desconhecimento quase total dos hbitos dessas serpentes e tambm pelo fato de habitarem matas primrias, onde a umidade sempre muito alta (acima de 70%) e a temperatura ambiente pouco varivel, mantendo-se geralmente entre 24 C e 28 C, condies muito difceis de serem reproduzidas no serpentrio, onde as temperaturas oscilam bastante diria e sazonalmente. Em nosso serpentrio, durante o vero, a temperatura chega a picos superiores aos 35 C, e pode atingir, ocasionalmente, menos de 14 C durante o inverno. Assim, foi instalado um sistema de climatizao central, que permite manter os dois fatores ambientais mencionados dentro dos parmetros adequados. O sistema monitora a temperatura e a umidade relativa do ar em trs pontos diferentes da sala por meio de sensores remotos e permite seu ajuste por termostato e umidostato independentes. No recinto principal, de aproximadamente 15 m2, delimitado por tela adequada para evitar a fuga das serpentes e possibilitar a livre circulao do ar, reproduziram-se as principais condies paisagsticas de uma floresta tropical habitada por Lachesis muta. Construiu-se um sistema de circulao de gua que forma uma cachoeira entre pedras, comum nos ambientes de mata de encosta onde habitam essas serpentes. Existem diversas opes de substratos (serapilheira, terra, troncos e pedras de diversos tamanhos), bem como um sistema de escoamento da gua no cho, com desnvel direcionado para um dreno lateral, o qual permite simulaes de chuvas sem causar o alagamento do recinto. A ambientao foi completada com a contribuio de um paisagista experiente, especializado em espcies vegetais nativas. Ele selecionou mais de 30 variedades de diversas famlias, desde arbreas a epfitas, criando uma comunidade vegetal harmoniosa e representativa da biodiversidade botnica nessas florestas. As alternativas oferecidas objetivam estabelecer as preferncias das serpentes, nas diferentes idades, sazonalmente ou nas diversas fases de vrios ciclos vitais, como reprodutivo e alimentar. Esse recinto representa, assim, um instrumento fundamental para nossas pesquisas biolgicas em relao a essa serpente, bem como para otimizar a obteno de veneno, o que garantir a produo do soro especfico, antilaqutico. Alm disso, os experimentos e resultados at agora alcanados tambm colocam nosso serpentrio num patamar de desenvolvimento s encontrado nos Zoos de San Diego e Dallas, nos Estados Unidos instituies pioneiras na reproduo e criao de serpentes do gnero Lachesis.
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Principais zoonoses
Principais Zoonoses
INTRODUO
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Leda Maria Silva Kimura
Zoonoses so enfermidades transmitidas naturalmente dos animais ao homem. Apesar dos avanos verificados no seu controle, a incidncia de zoonoses permanece alta em todos os pases em desenvolvimento. Zoonoses emergentes aparecem constantemente como resultado de troca de comportamento de algumas doenas e podem se transformar em ameaas, como a hantavirose. Mais de 200 zoonoses so conhecidas, sendo causa de considerveis morbidade e mortalidade em grupos demogrficos vulnerveis, especialmente crianas, idosos e trabalhadores ligados s reas da sade pblica e veterinria. A sade humana e a animal esto indissoluvelmente ligadas. Os seres humanos dependem dos animais para sua nutrio, companhia, desenvolvimento tecnolgico, socioeconmico e cientfico. Sendo os animais de laboratrio essenciais para o desenvolvimento e testes de vacinas, controle da qualidade de inmeros medicamentos, ensino e pesquisas de diferentes enfermidades, sero abordadas a seguir algumas zoonoses que podem representar perigo aos profissionais que lidam nessa rea.
CORIOMENINGITE LINFOCITRIA
ETIOLOGIA: vrus ARN, gnero Arenavirus; famlia Arenaviridae. TRANSMISSO: o reservatrio principal, e provavelmente o nico, o camundongo, fonte de infeco para as demais espcies animais, incluindo o homem. Nesses animais, a infeco persistente, ao passo que para o homem e outros animais apresenta durao limitada. Os camundongos eliminam o vrus por secrees nasais, urina, smen, leite e fezes. A infeco congnita e neonatal muito importante para essa espcie. O vrus se transmite tanto vertical como horizontalmente. A infeco pode ser adquirida pelo homem atravs de aerossis, por via conjuntival, pela pele, ou simplesmente ao se visitar uma colnia. SINTOMAS NOS ANIMAIS: os camundongos infectados naturalmente raramente apresentam sintomas clnicos. A doena apresenta baixa mortalidade, porm os animais jovens que se recuperam sofrem atrasos no desenvolvimento. Durante a enfermidade, o animal apresenta um ataque convulsivo caracterstico e quase sempre fatal. A doena pode evoluir para a morte ou apresenta completa recuperao com resposta imune normal e eliminao do vrus. Os animais que se contaminam por via uterina mantm o vrus durante toda a vida.
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SINTOMAS NO HOMEM: a infeco tem um curso varivel, desde clinicamente inaparente a mortal, em alguns casos raros. Em geral, uma enfermidade benigna, apresentando sintomatologia similar da influenza. O perodo de incubao dura de 1 a 2 semanas. A forma clnica similar influenza pode ser resolvida em poucos dias ou o paciente pode sofrer uma recada com sintomas menngeos. A meningite tambm pode se apresentar desde o incio sem estar antecedida por outros sintomas, porm, nesse caso, a incubao mais longa, de 2 a 3 semanas. Os sintomas consistem em rigidez da nuca, febre, dores musculares. Em raras ocasies pode haver meningoencefalite, com alterao dos reflexos profundos, paralisia, anestesia cutnea e sonolncia, podendo levar morte. A infeco pode interferir na gestao causando danos ao feto (encefalites, hidrocefalia, coriorretinites). DIAGNSTICO: provas sorolgicas: fixao de complemento; soroneutralizao; imunofluorescncia indireta. isolamento do vrus: inoculao de camundongos por via intracerebral (sangue e lquido cefalorraquidiano dos pacientes suspeitos). CONTROLE: quarentena dos animais recm-adquiridos; em colnias de camundongos, deve-se efetuar vigilncia peridica mediante provas sorolgicas; impedir a presena de roedores silvestres nos biotrios; evitar a presena de mulheres gestantes em biotrios sem a proteo adequada; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.). TRATAMENTO: sintomatolgico. ANIMAIS PARA EXPERIMENTAO AFETADOS: hamsters, ratos, camundongos.
HANTAVIROSE
ETIOLOGIA: vrus RNA; famlia Bunyaviridae. TRANSMISSO: os ratos silvestres so os hospedeiros naturais do Hantavrus. O homem infectado ao inalar a poeira formada a partir do ressecamento da urina e das fezes dos roedores. SINTOMAS NOS ANIMAIS: os ratos silvestres so portadores assintomticos, podendo apresentar perigo emergente caso haja contaminao principalmente em colnias de ratos e camundongos. SINTOMAS NO HOMEM: os primeiros sintomas da infeco por Hantavrus se assemelham aos da influenza: febre, dores musculares, cefalia, nuseas, vmitos, calafrios e tonturas. Nos casos mais graves, o doente sofre hemorragia e insuficincia renal ou pulmonar. Em cerca de 5 dias, mais de 50% das vtimas morrem. DIAGNSTICO: isolamento do vrus. CONTROLE: impedir a presena de roedores silvestres nos biotrios; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.).
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Principais zoonoses
HERPESVIRUS SIMIAE
ETIOLOGIA : Herpesvirus simiae (herpesvirus B); vrus DNA; famlia Herpesviridae; subfamlia Alphaherpesvirinae. TRANSMISSO: o principal reservatrio natural o macaco rhesus (Macaca mulatta.) Outros primatas nohumanos podem ser fontes de infeco para o homem. A infeco transmitida dentro de uma colnia de primatas por contato direto, contaminao de alimentos e gua com saliva, mordeduras, arranhes e aerossis. O homem contrai a infeco por mordeduras ou leses da pele contaminadas com saliva de primatas e tambm por aerossis atravs da conjuntiva, nariz e faringe. H descrito caso de infeco acidental em laboratrio por ruptura de frasco com cultivo de rim de macaco. SINTOMAS NOS ANIMAIS: nos primatas, as infeces so subclnicas e resultam em infeces latentes que persistem por toda a vida do animal. Ocasionalmente, os animais so observados com ulceraes labiais ou linguais (semelhante s leses de Herpesvirus simplex no homem). Essas leses orais so fonte de grande quantidade de vrus e representam perigo para as pessoas que trabalham com primatas, uma vez que o vrus B causa encefalomielite fatal no homem. SINTOMAS NO HOMEM: o homem um hospedeiro acidental. Herpesvirus simiae no se transmite de homem para homem. A infeco humana depende sempre da fonte animal. O perodo de incubao estimado entre 1 a 5 semanas a partir da exposio. Se a infeco produzida por mordedura ou arranho, pode haver formao de vescula no ponto da ferida, seguida de linfangites e linfadenites. A enfermidade generalizada se manifesta por febre, cefalia, nuseas, dor abdominal e diarria, podendo apresentar faringite vesicular, reteno urinria e pneumonia. Os sintomas neurolgicos apresentam, inicialmente, dores musculares, vertigens, espasmos diafragmticos, dificuldade de deglutio e dores abdominais. Depois, h paralisia flcida das extremidades inferiores que se estende s extremidades superiores e ao trax at terminar com colapso respiratrio. As manifestaes de encefalite ou encefalomielite podem durar de 3 a 21 dias. DIAGNSTICO: em humanos com sinais de encefalite e histrico de contato com primatas, deve-se considerar a possibilidade de infeco por Herpesvirus simiae. A maior parte dos casos humanos se confirmou post mortem, por isolamento do vrus do crebro ou da medula. Quando a durao da enfermidade permite a apario de anticorpos, pode-se efetuar o diagnstico mediante a prova de soroneutralizao, assim como nos primatas no-humanos. CONTROLE: quarentena de 6 a 8 semanas para animais introduzidos na colnia; sacrifcio de animais com leses orais sugestivas de vrus B ou sorologia positiva; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.). ANIMAIS
PARA EXPERIMENTAO AFETADOS:
primatas no-humanos.
RAIVA
ETIOLOGIA: vrus RNA; gnero Lyssavirus; famlia Rhabdiviridae. TRANSMISSO: os hospedeiros que mantm o vrus rbico na natureza so os carnvoros e os quirpteros. A transmisso se d atravs de solues de continuidade.
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SINTOMAS NOS ANIMAIS: nos ces, distinguem-se duas formas, a raiva furiosa e a paraltica ou muda; segue a sintomatologia nervosa predominante: o perodo de incubao varia de 10 dias a 2 meses ou mais. Na fase prodrmica, os ces manifestam mudana de conduta, escondem-se em lugares escuros ou demonstram grande agitao. A excitabilidade reflexa exaltada e o animal se sobressalta ao menor estmulo. Apresenta anorexia, irritao na regio da mordedura, estimulao das vias geniturinria e um ligeiro aumento da temperatura corporal. Depois de 1 a 3 dias, acentuam-se, de forma notria os sintomas de excitao e agitao. O co se torna perigosamente agressivo, com tendncia a morder objetos, animais e o homem, inclusive seu prprio dono; muitas vezes morde a si mesmo, infligindo-se graves feridas. A salivao abundante, uma vez que o animal no deglute a saliva em conseqncia da paralisia dos msculos da deglutio. H alteraes no latido por causa da paralisia parcial das cordas vocais. Na fase terminal da enfermidade, pode-se observar convulses generalizadas, incoordenao muscular e paralisia dos msculos do tronco e das extremidades. A forma muda caracteriza-se pelo predomnio de sintomas paralticos, de maneira que a fase de excitao muito curta ou no est presente. A paralisia comea pelos msculos da cabea e do pescoo, o animal tem dificuldade na deglutio e geralmente h suspeitas de que o co esteja engasgado com osso. O tratador, ao socorr-lo, expe-se infeco. Logo, sobrevm paralisia das extremidades, paralisia geral e morte. O curso da enfermidade dura de 1 a 11 dias. SINTOMAS NO HOMEM: a enfermidade comea com uma sensao de angstia, cefalia, elevao da temperatura corporal, mal-estar, anorexia, nuseas, irritabilidade, alteraes sensoriais imprecisas, e o paciente se queixa de hiperestesia e parestesia no local da inoculao. Na fase seguinte da excitao, h hiperestesia e uma extrema sensibilidade luz, ao som e ao vento, alm de midrase e aumento da salivao. Com a evoluo da doena, h espasmos nos msculos da deglutio e os lquidos so vigorosamente recusados, embora os pacientes sintam sede e at manifestem o desejo de beber. Essa disfuno da deglutio comum na maioria dos enfermos. Muitos deles experimentam contraes espasmdicas laringofarngeas simples viso de um lquido (hidrofobia) e se recusam a engolir a sua prpria saliva. Pode-se tambm observar espasmos dos msculos respiratrios, ansiedade, delrio e convulses generalizadas. Os sintomas de hiperatividade podem ser predominantes at a morte ou substitudos por uma fase de paralisia generalizada. Em alguns casos, a hiperatividade muito curta e em quase todo o decorrer da doena predomina a sintomatologia paraltica. A enfermidade dura de 2 a 6 dias ou mais e, de modo invarivel, termina com a morte. DIAGNSTICO: coleta de crebro de animais suspeitos imunofluorescncia direta; prova biolgica (inoculao em camundongos); exame histopatolgico. CONTROLE: vacinao dos animais; vacinao preventiva dos funcionrios envolvidos em experimentos que utilizem animais susceptveis; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.). TRATAMENTO: no h. ANIMAIS PARA EXPERIMENTAO AFETADOS: ces e primatas no-humanos.
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Principais zoonoses
FEBRE POR MORDEDURA DE RATO

ETIOLOGIA: Streptobacillus moniliformis e Spirillum minus.
I NFECO
POR
S TREPTOBACILLUS
MONILIFORMIS
TRANSMISSO: os reservatrios da infeco so os ratos que albergam o agente etiolgico na nasofaringe e so transmitidos, por mordedura, ao homem. A infeco dos camundongos de laboratrio pode ser produzida por via aergena quando so alojados no mesmo ambiente com ratos. SINTOMAS NOS ANIMAIS: os ratos so portadores sadios. s vezes, so observadas leses purulentas nesses animais. S. moneliformes patognico para camundongos e em algumas epizootias se registrou alta morbidade e mortalidade com sintomas como poliartrite, gangrena e amputao espontnea dos membros. Em cobaias, pode produzir uma linfadenite cervical com grandes abscessos nos gnglios linfticos regionais. SINTOMAS NO HOMEM: o perodo de incubao dura de 2 a 14 dias. A enfermidade se inicia com uma sintomatologia similar da influenza. A ferida da mordedura curada de modo espontneo e sem complicaes. comum o exantema, a linfadenopatia regional, as artralgias migratrias e as mialgias. Em alguns casos mais severos, observa-se poliartrite e endocardite. Nos casos no tratados a mortalidade chega a 10%. DIAGNSTICO: isolamento de S. moniliformes (em meios enriquecidos com soro e sangue) de material proveniente das leses articulares ou de amostras de sangue. CONTROLE: os camundongos, ratos e cobaias de laboratrio devem se alojar em diferentes ambientes, e os funcionrios do biotrio devem ser instrudos sobre o manejo apropriado. TRATAMENTO: penicilina e estreptomicina de 7 a 10 dias. ANIMAIS PARA
EXPERIMENTAO AFETADOS:
ratos, camundongos.
I NFECO
POR
S PIRILLUM
MINUS
TRANSMISSO: o reservatrio so os ratos e outros roedores. A saliva fonte de infeco para o homem e a transmisso por mordedura. SINTOMAS NOS ANIMAIS: a infeco nos ratos inaparente. SINTOMAS NO HOMEM: o perodo de incubao de 1 semana a 2 meses. A febre comea bruscamente e tarda a desaparecer, porm recorre em vrias ocasies durante 1 a 3 meses. Observa-se uma erupo exantemtica generalizada que pode aparecer em cada ataque febril. A ferida apresenta infiltrao edematosa e ulcerao, e gnglios linfticos hipertrofiados. DIAGNSTICO: a bactria no se desenvolve em meios de cultivo de laboratrio. O diagnstico se realiza base de exame microscpio em campo escuro do infiltrado da ferida. CONTROLE: igual infeco por S. moniliformes. ANIMAIS PARA
ratos, camundongos.
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LEPTOSPIROSE
ETIOLOGIA: Leptospira interrogans. Quadro 1 Principais sorogrupos de L. interrogans de interesse veterinrio
SOROGRUPO Ballum Icterohaemorrhagiae Canicola SOROTIPO Ballum icterohaemorrhagiae Canicola ESPCIE roedores ces ces
TRANSMISSO: o animal reservatrio (roedores, especialmente ratos) excreta leptospiras na urina. Nas colnias de animais de laboratrio, onde a infeco penetra, podem ser afetados 80% de ratos e camundongos. A infeco do homem e de outros animais se produz por via direta ou indireta atravs da pele e das mucosas nasal, bucal e conjuntival. A via mais comum a indireta, atravs de guas, solo e alimentos contaminados por urina de animais infectados. Grande variedade de sorotipos foi isolada de camundongos de todo o mundo, predominando, entretanto, L. ballum em colnias de albinos suos. Os camundongos infectados podem superar a infeco aguda e se tornarem disseminadores crnicos. Concentraes de leptospira podem ser demonstradas agrupadas nos tbulos renais de camundongos assintomticos, tornando-os reservatrios permanentes. Alguns ces excretam sorotipos na urina continuamente por meses e at anos aps a infeco. SINTOMAS NOS ANIMAIS: em roedores, a doena dificilmente apresenta sintomas. Em ces, a infeco pode variar de forma assintomtica a quadros clnicos graves. A forma mais grave a hemorrgica, que se instala repentinamente com febre por 3 a 4 dias, seguida por rigidez e mialgias nos membros posteriores, hemorragias na cavidade bucal com tendncia a necrose e faringite. Em uma etapa posterior, pode haver gastroenterite hemorrgica e nefrite aguda. Tanto na infeco por canicola quanto por icterohaemorragiae pode haver ictercia e principalmente na infeco por este ltimo sorovar. SINTOMAS NO HOMEM: o perodo de incubao da enfermidade dura de 1 a 2 semanas. A sintomatologia humana muito varivel, desde casos leves, praticamente assintomticos, at outros com cefalia, febre, vmitos, mal-estar geral, petquias cutneas, conjuntivite, s vezes ictercia, meningite, encefalite e, em casos raros, at a morte se a doena progredir sem diagnstico. DIAGNSTICO: imunofluorescncia; Enzyme-Linked Immune Serum Asssay (ELISA). CONTROLE: quarentena dos animais recm-adquiridos; impedir o acesso de roedores silvestres aos biotrios e estoques de rao; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.); em ces a imunizao tem sido eficaz na reduo da incidncia e severidade da leptospirose canina, mas no previne o estado de portador, podendo levar a infeco ao homem. ANIMAIS PARA EXPERIMENTAO AFETADOS: ratos, camundongos, cobaias, gambs, ces, primatas no-humanos.
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Principais zoonoses
LISTERIOSE
ETIOLOGIA: Listeria monocytogenes. TRANSMISSO: a bactria pode ser eliminada pelas fezes e se encontra presente nos fetos abortados e na placenta; a infeco se d por contato. A doena pode ser observada sobretudo em coelhos, cobaias, caninos e no homem. SINTOMAS NOS ANIMAIS: a enfermidade afeta as fmeas gestantes. Os machos e as fmeas no-prenhes oferecem grande resistncia. produzida septicemia com leses no tero que conduzem ao aborto. Pode ser observado meningoencefalite em lparos. Nos casos septicmicos, so encontrados focos de necrose no fgado e no bao, infiltrados por clulas mononucleares. Em ces, a enfermidade pode se confundida com a raiva por causa dos sintomas de encefalite. H casos de surtos em coelhos e cobaias. SINTOMAS NO HOMEM: o aborto por listria, na mulher, produzido na segunda metade da gestao. Os sintomas que precedem alguns dias ou semanas do aborto consistem em calafrios, febre, cefalia e tonteira. Eles podem se repetir ou no antes do aborto ou do feto a termo enfermo. Depois do parto, a me no apresenta sintomas da enfermidade, porm a bactria pode ser isolada da vagina, do colo uterino e da urina por perodos de alguns dias at vrias semanas. Se a criana nasce viva, morre pouco tempo depois de septicemia por essa bactria. Algumas crianas nascem aparentemente ss e apresentam meningite aproximadamente 3 semanas aps o parto. A hidrocefalia uma seqela comum da meningite neonatal. H descries de veterinrios com erupo cutnea aps manejo de fetos infectados. DIAGNSTICO: o diagnstico pode efetuar-se por isolamento do agente. Em casos de septicemia, deve-se coletar sangue. Nas fmeas, deve-se cultivar secrees vaginais e fezes. Nos fetos septicmicos, a listria pode ser isolada de qualquer rgo, e nos casos de meningoencefalite ou meningite, do lquido encfaloraquidiano. CONTROLE: quarentena dos animais recm-adquiridos; incinerao das placentas e fetos abortados; em coelhos: sacrifcio dos animais infectados; mulheres grvidas que trabalham em biotrios: exames peridicos principalmente aps sintomatologia semelhante da influenza; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.). ANIMAIS PARA
cobaias, coelhos, ces.
SALMONELOSE
ETIOLOGIA: Salmonella enterica. T RANSMISSO : os camundongos de laboratrio podem eliminar vrias espcies de Salmonella simultaneamente, sem mostrar nenhum sinal clnico da enfermidade. As formas de transmisso geralmente so pela ingesto de gua ou alimentos contaminados com fezes de animais infectados ou portadores. O co pode contrair a infeco por coprofagia de outros ces e de outros animais. Podem se infectar tambm por alimentos contaminados.
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SINTOMAS NOS ANIMAIS: apesar de os camundongos serem portadores assintomticos, podem apresentar sintomatologia quando submetidos a estresse. Apresentam, ento, postura encurvada com distenso abdominal, lerdeza, pelagem spera, perda de peso, fezes brancas ou de colorao clara e diarria. Podem apresentar conjuntivite e respirao acelerada. A morte pode sobrevir em 1 semana. Em ces, podemos observar gastroenterite. Em serpentes, faz parte da flora intestinal, podendo apresentar patogenicidade para o homem. SINTOMAS NO HOMEM: todas as infeces por Salmonella, excluindo S. tiphi (especfica do homem), podem ser consideradas zoonoses. A Salmonelose talvez seja a zoonose mais difundida no mundo. Causa no homem uma infeco intestinal que se caracteriza por um perodo de incubao de 6 a 72 horas aps a contaminao. Caracteriza-se por sintomas de gastroenterite grave: nuseas, vmitos, diarria, dores abdominais e febre. DIAGNSTICO: isolamento do agente etiolgico das fezes. CONTROLE: quarentena nos animais recm-adquiridos; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.); sacrifcio dos animais portadores. ANIMAIS PARA EXPERIMENTAO AFETADOS: camundongos, cobaias, ratos, ces, serpentes, gambs, primatas no-humanos.
DERMATOMICOSES
ETIOLOGIA: diversas espcies de Microsporum e Trichophyton. TRANSMISSO: os reservatrios naturais dos dermatfitos zofilos so os animais. A transmisso se faz por contato com o animal infectado (enfermo ou portador) ou por esporos contidos nos plos e escamas drmicas desprendidos do animal. Os dermatfitos permanecem viveis no epitlio descamado por muitos meses. A transmisso de animal a animal se produz pelas mesmas vias. SINTOMAS NOS ANIMAIS: nos camundongos e cobaias de laboratrio, a doena se manifesta geralmente sem leses aparentes; sua presena se detecta muitas vezes pelo contgio humano. Nos ces, as leses so freqentes e aparentes e podem se apresentar em qualquer parte do corpo em forma de tinha arredondada. SINTOMAS NO HOMEM: a dermatofitose uma infeco superficial da camada crnea da pele ou dos plos e unhas. As espcies de Microsporum causam grande parte das dermatofitoses da cabea e do corpo, porm, raramente so responsveis pelas infeces das unhas. As espcies de Trichophyton podem invadir a pele de qualquer parte do corpo. DIAGNSTICO: isolamento do agente em meios de cultivo. CONTROLE: quarentena nos animais recm-adquiridos; utilizao, por parte dos funcionrios, de proteo adequada (gorros, mscaras, luvas, macaces, botas etc.). TRATAMENTO: antimicticos de aplicao local e/ou griseofulvina por via oral. ANIMAIS PARA EXPERIMENTAO AFETADOS: camundongos, ratos, cobaias, ces.
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Principais zoonoses
BIBLIOGRAFIA
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Gnotobiologia
G notobiologia
INTRODUO
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Delma Pegolo Alves Luiz Augusto Corra Passos Ana Maria Aparecida Guaraldo Marcos Zanfolin
A evoluo do conhecimento na rea biomdica exigiu que os ensaios passassem a ser realizados de forma totalmente controlada. Para tanto, foi necessrio o aprofundamento das atividades de vrias reas como aquelas relacionadas s drogas, reagentes e equipamentos, entre outros. Entre essas reas, destaca-se a cincia em animais de laboratrio, que passa a apresentar dois objetivos principais: a produo de animais j estabelecidos para a pesquisa biomdica e o desenvolvimento de novos modelos. Esses novos modelos seriam utilizados para responder a perguntas especficas, e por esta razo a sua constituio gentica, o seu status sanitrio e o ambiente no qual so produzidos passam a ser determinantes. Nesse contexto, surgem os animais gnotobiticos. Palavra de origem grega, gnotos significa bem conhecida e biota forma de vida associada. Assim, o modelo gnotobitico constitudo de um animal criado em ambiente controlado e portador de uma flora associada totalmente conhecida. Os primeiros estudos na rea da gnotobiologia foram iniciados com Luis Pasteur, que investigou a sobrevivncia de organismos superiores na ausncia de bactrias. Entretanto, obstculos como a manuteno dos animais em um ambiente isento de germes dificultavam a realizao desses testes. A soluo surgiu com o desenvolvimento de equipamentos capazes de criar um ambiente que, embora artificial, permitisse o alojamento dos animais e o estudo das relaes entre eles e a microbiota. As diversas aplicaes cientficas desses animais sero discutidas no decorrer deste captulo. Antes, porm, apresentamos, a seguir, uma pequena reviso histrica dos pontos de maior relevncia dessa nova cincia. 1895 Nuttall & Thierfelder conservam a vida de uma cobaia por 15 dias, na ausncia de bactrias, porm sem crescimento. 1914 Kuster mantm uma cabra por 1 ms com crescimento normal e sem contaminao bacteriana. 1930 Reyners relata seus esforos para obter a primeira cobaia germfree em ambiente estril. 1930-1933 Reyners desenvolve projeto para o estudo da variao bacteriana em organismos superiores. 1934 Reyners & Trexler introduzem a tecnologia para a manuteno de animais axnicos e para a construo de um novo modelo de isolador. 1936 Uso de isoladores na histerectomia de macacos e cobaias e desenvolvimento de isoladores para galinhas. 1939 Simpsio na Universidade de Notre Dame: Micrurgical and Germfree Methods. 1943 First Symposium on Gnotobiotic Technology e desmame do primeiro rato axnico. 1948 Gustafsson: desenvolve isolador rgido em ao inox. 1951-1956 Reyners mantm em uso, por cinco anos, um isolador em ao inox. Assim, foram produzidos 286 ratos e registradas 10 contaminaes.
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1956 National Meeting of the Animal Care Panel. Reyners prope o uso de colnias de animais Specific Pathogen Free (SPF) como modelo para pesquisa biomdica, em decorrncia da qualidade do animal derivado das colnias de unidades isoladoras. 1957 Trexler & Reynolds: desenvolvem o primeiro isolador flexvel com baixo custo. 1959 Second Symposium on Gnotobiotic Technology, abordando a importncia dos animais SPF e da Flora Definida no desenvolvimento da cincia. 1960 Utilizao de animais germfree na rederivao de estoques de animais de empresas privadas e comercializao dos primeiros animais germfree para pesquisa. 1962 Third Symposium on Gnotobiotic Technology. Do evento participaram 110 pesquisadores em apresentao de trabalhos, mesa-redonda e discusso sobre animais gnotobiticos. Nessa dcada, mais de 40 laboratrios j estavam utilizando isoladores flexveis e 4 empresas privadas comercializavam roedores gnotobiticos. 1962 Trexler: deixa o Albert Einstein College of Medicine para desenvolver isoladores hospitalares. 1966 Trexler e o Staff da Royal Veterinary College desenvolvem isoladores para animais de grande porte.
A GNOTOBIOLOGIA NO BRASIL
No Brasil, em 1961, as pesquisas em gnotobiologia foram iniciadas pelo professor Dr. Enio Cardillo Vieira, na Universidade Federal de Minas Gerais, com projeto sobre crescimento e reproduo de caramujo Biompharia glabrata em condies axnicas, criados em tubos de ensaio. Posteriormente, os caramujos axnicos foram cultivados em isoladores de plstico flexvel. Em 1979, o pesquisador importou uma colnia de camundongos axnicos da Universidade de Notre Dame (EUA) e, desde ento, diversos trabalhos tm sido realizados utilizando esses animais.
CLASSIFICAO SANITRIA DOS ANIMAIS

A classificao dos animais de laboratrio est relacionada ao tipo de biotrio: aberto (animais sanitariamente no definidos) ou fechado (com uma complexidade varivel do sistema de barreiras, capaz de manter colnias sanitariamente definidas). AXNICO (GERMFREE): totalmente livres de flora microbiana associada, mantidos em unidade isoladora. GNOTOBITICO: com flora microbiana associada definida. SPF: livres de patgenos especficos. COBS: Cesarian Obtained Barrier System. So animais derivados de cesariana e mantidos sob sistema de barreiras. VAF: Virus Antibody Free. So animais que no possuem anticorpos virais sorologicamente demonstrveis.
OBJETIVOS DA GNOTOBIOLOGIA
A gnotobiologia apresenta uma vasta aplicao, possibilitando a elaborao de ensaios experimentais multidisciplinares. Entretanto, alguns dos objetivos podem ser claramente evidenciados. Dentre eles destacamos: obteno de matrizes livres de patgenos na derivao de novas colnias de animais em biotrio para pesquisa biolgica;
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Gnotobiologia
elucidao
das inter-relaes entre o hospedeiro e sua flora microbiana associada; eliminao da interferncia dessa flora no estudo de fenmenos biolgicos.
COMPARAO ENTRE ANIMAIS CONVENCIONAIS E GERMFREE

A utilizao e a comparao entre animais convencionais e germfree mostram a influncia e o papel da flora quanto s modificaes qualitativas do contedo gstrico, anatomia do tubo digestivo, fisiologia digestiva e geral, modificao do sistema imunitrio do tubo digestivo, alm do efeito barreira. Essas modificaes envolvem o tubo digestivo e o trato intestinal, exposto ao da microflora. A seguir, destacaremos os efeitos importantes em nvel de fisiologia geral e o efeito barreira.
F ISIOLOGIA G ERAL
Os animais germfree apresentam crescimento, peso e temperatura corporal iguais aos animais convencionais. No animal germfree, o corao menor, e como conseqncia tambm o so o funcionamento cardaco, o fluxo de sangue para a pele, fgado e intestino e o consumo de oxignio. Conforme descrito por Gordon (1965), os animais germfree apresentam paredes capilares e alveolares no pulmo menos espessas. A maturao sexual no germfree mais lenta.
A LTERAES
DO
T UBO D IGESTIVO
Nos animais axnicos, o contedo cecal tem um pH maior, em virtude da ausncia dos cidos graxos volteis produzidos pelo metabolismo fermentativo da microflora intestinal. No h diferena histolgica estomacal entre o germfree e o convencional. A ausncia de microflora no causa modificaes de peso e da estrutura histolgica do pncreas. A morfologia do intestino delgado no rato e na cobaia axnicos difere pelo peso menor, mucosa mais lisa e uma populao menor de clulas reticuloendoteliais; a superfcie da mucosa intestinal, no rato axnico, 30% menor, sendo maior nas partes mdia e inferior do intestino delgado. As vilosidades so maiores na parte proximal e menores na parte distal do intestino delgado. Estudos de micrografia eletrnica mostraram que as microvilosidades apresentam comprimento menor na presena da microflora. O decrscimo em relao ao axnico de 5% no duodeno, 9% no jejuno e 18% no leo. No animal axnico, o trnsito intestinal lento. Os animais axnicos ainda apresentam nmeros reduzidos de placas de Peyer e de plasmcitos.
E FEITO B ARREIRA
A flora bacteriana intestinal normal protege o hospedeiro contra a instalao de agentes patognicos. Esse fenmeno de rejeio dos microorganismos exgenos denominado efeito de eliminao ou de barreira.
DESCRIO DO ISOLADOR EQUIPAMENTO

A PRESENTAO
DOS
COMPONENTES BSICOS
DO
I SOLADOR
Para que haja eficincia no isolamento do animal durante o ensaio experimental, o equipamento deve apresentar as seguintes estruturas fundamentais.
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ESTRUTURA PRINCIPAL, CORPO OU ENVELOPE deve ser, do ponto de vista ptico, transparente para melhor visualizao dos animais no interior do equipamento. Nos equipamentos flexveis, utiliza-se uma grande variedade de material plstico como polietileno, polipropileno, poliuretano; no entanto, o polyvinycloride (PVC) o material mais comum para a confeco do equipamento. Os isoladores precisam ter PVC de espessura fina, resistncia ruptura e carter atxico. Devem tambm apresentar a vantagem de ajustar-se facilmente presso durante o manejo. Os isoladores rgidos so confeccionados em ao inox, PVC rgido, fibra de vidro, sendo assim fortes e resistentes. Apresentam inconveniente em relao restrio aos movimentos do operador. Para determinadas espcies de animais (por exemplo, as aves), adota-se isoladores rgidos ou semi-rgidos. PORTO DE PASSAGEM o local atravs do qual os materiais so introduzidos e retirados do isolador. O porto deve possuir dimetro e localizao, de acordo com as necessidades do ensaio experimental. As extremidades externa e interna do porto de passagem so revestidas por membranas plsticas denominadas capas, sendo removidas para a introduo ou retirada dos materiais. Esse tipo de porto de passagem denominado de convencional. LUVAS DE MANUSEIO as luvas podem ser de cano curto ou longo. O tipo de luva a ser adotado depender das atividades que sero desenvolvidas. Nos trabalhos que envolvem agentes qumicos, as luvas devem ser avaliadas freqentemente. Com o decorrer do tempo, as luvas de borracha podem apresentar microfissuras que, apesar de imperceptveis, oferecem risco potencial de contaminao. Nesse contexto, a adoo de luvas de cano curto se torna mais adequada por assegurar a sua reposio mesmo com o equipamento em uso. FILTROS DE AR a estrutura do filtro cilndrica, de forma a possibilitar maior superfcie de contato com o ar e permitir a deposio do material filtrado. O elemento filtrante deve ser preferencialmente hidrfobo e apresentar atividade high efficiency in pore activity (HEPA), retendo assim 99,99% de partculas com o dimetro superior a 0,3 m. O conjunto deve ser esterilizado no forno Pasteur a uma temperatura de 180 C durante 120 minutos, ou autoclavados a 121 C por 30 minutos. MOTOR DE INSUFLAO o ar insuflado no equipamento por meio de um motor, permitindo um volume mdio de 16 a 18 trocas de ar por hora. Alguns equipamentos podem oferecer motores para exausto. So os isoladores de presso negativa. Figura 1 Unidades isoladoras flexveis
Fonte: Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica (CEMIB/UNICAMP).

214
Gnotobiologia
Nos protocolos experimentais, onde h risco de contaminao para o pesquisador e para o meio ambiente em virtude da manipulao de agentes zoonticos, adota-se isoladores com presso negativa. Nesse modelo de equipamento, caso ocorra um acidente, h entrada de ar externo, impedindo o comprometimento do meio ambiente. J nos casos nos quais os ensaios experimentais so realizados com animais livres de zoonoses, a escolha deve ser de isoladores com presso positiva (Fig. 1), pois no caso de um eventual acidente que comprometa o corpo principal do equipamento, o ar sai, salvaguardando a integridade dos animais mantidos em seu interior. Em ambos os modelos, a presso final mdia de 2 mm a 4 mm de coluna de gua abaixo ou acima da presso atmosfrica normal.
A CESSRIOS B SICOS
A manuteno da rotina exige a utilizao de alguns acessrios essenciais: o cilindro de esterilizao e a luva de transferncia. CILINDRO DE ESTERILIZAO acessrio confeccionado em ao inoxidvel com perfuraes na poro mediana que sero cobertas por trs camadas de elemento filtrante com atividade HEPA. Uma de suas extremidades aberta, possibilitando o alojamento dos insumos bsicos (rao, maravalha etc.). Aps a colocao desses materiais, a extremidade selada com uma membrana termorresistente e fixada com fita resistente a altas temperaturas. O cilindro ento introduzido na autoclave para ser esterilizado. LUVA DE TRANSFERNCIA permite a conexo entre o cilindro e o porto de passagem. A luva apresenta dois orifcios, nos quais so pulverizadas/vaporizadas as solues germicidas utilizadas na esterilizao.
A CESSRIOS E SPECIAIS
Tanto a manuteno de colnias de animais em centros de bioterismo como o desenvolvimento de alguns protocolos experimentais, algumas vezes, exigem acessrios especiais. Dentre esses, destacamos: MANMETRO DIFERENCIAL fornece indicaes da presso no interior do isolador quando em uso, indicando tambm o momento de troca dos filtros. SISTEMA NO BREAK acionado quando ocorre interrupo de energia eltrica, mantendo o isolador inflado. particularmente importante nas instituies que no tm sistema central de segurana (grupo gerador). VLVULA NA SADA DE AR permite rpida compensao das oscilaes na presso oriundas do manuseio. , portanto, um acessrio que possibilita um controle rpido da presso no interior do equipamento. CONTROLADOR DE TEMPERATURA E UMIDADE torna possvel o registro das temperaturas mnimas e mximas no perodo. Quando a temperatura ultrapassa a faixa do bem-estar animal, o organismo sofre alteraes, principalmente aumentando a freqncia respiratria, cardaca e elevando a temperatura.
P REPARO
DE
U NIDADES I SOLADORAS
A montagem dos isoladores, com seus respectivos acessrios, necessita de cuidados que possam assegurar a integridade do equipamento e a manuteno do status microbiolgico das colnias. Antes de efetuar a lavagem, desinfeco e esterilizao, o isolador deve ser montado, inflado e avaliado quanto a sua integridade; para essa avaliao, pode ser usado o gs Freon 12.
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Antes da ocupao do equipamento, recomenda-se a adoo dos seguintes procedimentos:
Lavar todos os componentes do equipamento separadamente (corpo plstico ou envelope, luvas e punhos,
chapus interno e externo, tapetes, suportes e capas dos filtros, rolhas de borracha) com detergente para retirada de sujeira e gordura. Montar o equipamento e proceder a lavagem e desinfeco interna do corpo com detergente comum ou, preferencialmente, com soluo detergente de amnia quaternria 0,5%. Enxaguar com gua destilada/filtrada e enxugar. Aplicar lcool 70% com pulverizador. Introduzir os materiais que podem ser expostos a solues qumicas (tapete, gaiolas, pinas, rolhas de borracha, chapu interno) e pulverizar toda a superfcie interna e materiais com um poderoso germicida como o cido peractico diludo 1:2. Deixar todos esses materiais expostos durante um perodo de 48 horas. Em seguida, romper o lacre dos filtros e proceder a ventilao at a completa retirada de resduos do produto qumico utilizado (por exemplo, o cido peractico). Os filtros de ar montados com manta de l de vidro em estruturas metlicas de ao inoxidvel devem ser previamente esterilizados pelo calor seco a 180 C durante 120 minutos. A autoclavagem a 121 C por 30 minutos pode ser utilizada, porm, os filtros devem ser colocados em estufa para secagem aps o processo. OBS.: em isoladores utilizados para manuteno de colnias axnicas e gnotobiticas, alguns procedimentos adicionais so indispensveis. Indicamos, a seguir, alguns desses procedimentos. 1o Durante a montagem do equipamento, deve-se assegurar que as superfcies de contato nas diferentes junes entre as partes estejam embebidas com a soluo esterilizante. Os principais locais so: corpo principal e porto; corpo principal e chapu externo; anis e luva; anis e punho; corpo principal e filtros de ar. 2o Recomenda-se uma segunda esterilizao aps 48 horas de ventilao da primeira. 3o Em conseqncia do desgaste natural dos componentes plsticos do equipamento, com surgimento de microfissuras e tambm a possibilidade de acidentes no percebidos, recomenda-se que a cada 3 a 6 meses novas colnias sejam formadas em outros equipamentos. Tal procedimento permite que as unidades em uso possam ser novamente avaliadas quanto a sua integridade estrutural. Aps a limpeza e desinfeco do equipamento, deve-se iniciar o preparo dos materiais que sero introduzidos no isolador e que serviro tanto na manuteno dos animais quanto para a avaliao sanitria do ambiente de seu interior. Para tanto, o cilindro de esterilizao dever ser montado com os seguintes itens: rao e maravalha: ambos colocados em sacos de algodo, de fcil manipulao e permeveis ao vapor; toalhas para manter a limpeza da parede interna, possibilitando uma boa viso; frascos/tubos de ensaio para coleta de material para testes de esterilidade; swabs, meios de cultura para a realizao dos testes; indicadores biolgicos: tiras impregnadas com 106 esporos de Bacillus stearothermophylus (microorganismo resistente a altas temperaturas); indicadores fsico-qumicos: fita com indicador de autoclave 3M e anidrido succnio em p, que apresenta um ponto de fuso cuja temperatura conhecida; gaiolas e tampas, frascos de bebedouros. Com exceo dos bebedouros, os outros materiais podem tambm ser introduzidos aps desinfeco qumica no porto de passagem. Aps o preparo, o cilindro deve ser autoclavado a uma temperatura de 125 C por um perodo de 30 minutos.
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Gnotobiologia
VALIDAO DO EQUIPAMENTO E MATERIAIS

A ocupao do isolador somente poder ser feita aps a certificao de que o equipamento est pronto, tanto do ponto de vista fsico (integridade quanto a rupturas no corpo principal e vazamentos provenientes de falhas na montagem, entre outros) quanto do ponto de vista sanitrio. Tais cuidados so mais necessrios quando o objetivo a manuteno de animais germfree e gnotobiticos. Por essa razo, recomenda-se a coleta de amostras de swabs embebidos em meio de cultura de enriquecimento (BHI/TPB). A poro do equipamento a ser investigada a superfcie interna. Aps o teste, o swab dever ser semeado em caldo BHI, Tioglicolato e Sabouraud. Paralelamente, devero ser retiradas amostras da rao e maravalha que sero igualmente semeadas nos mesmos meios de cultivo (caldo BHI, Tioglicolato e Sabouraud). As tiras contendo Bacillus stearothermophylus, introduzidas no preparo de materiais, tambm devero ser retiradas e cultivadas a fim de se avaliar a eficincia do processo de esterilizao. Todas as amostras devero ser incubadas temperatura ambiente (25 C), 37 C e a 55 C, de 5 a 7 dias.
A UTILIZAO DE TCNICAS GNOTOBITICAS NA CINCIA DE ANIMAIS DE EXPERIMENTAO, NA PESQUISA E NA INDSTRIA

C ENTROS
DE
B IOTERISMO (A NIMAIS
DE
L ABORATRIO )
Conforme ser observado em outros pontos, vrias so as tecnologias originadas com o bioterismo e que so essenciais em centros dessa rea. Em centros de bioterismo, os isoladores so utilizados para realizar a preservao, manuteno de colnias de fundao de linhagens SPF, axnicas, gnotobiticas ou germfree, assegurando o padro sanitrio das colnias. indicado para a manuteno de animais provenientes de outras instituies em unidades isoladoras, visando ao estabelecimento de quarentena, at a certificao do padro sanitrio dos animais (Fig. 2). Auxlio na tcnica de derivao cesariana para obteno de animais livres de contaminaes (Sebesteny & Lee, 1973). A histerectomia adotada como tcnica simples para eliminar a maioria dos patgenos de animais que apresentam transmisso horizontal, sendo realizada, em condies totalmente asspticas, em unidades isoladoras construdas especialmente para essa finalidade. Figura 2 Apresentao esquemtica do uso de unidades isoladoras em biotrios
Fonte: Manual para Tcnicos em Bioterismo (1996).

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USO DE TCNICAS GNOTOBITICAS NA DERIVAO CESARIANA COMO FERRAMENTA PARA A DESCONTAMINAO DE COLNIAS
Em virtude da sua simplicidade, a derivao cesariana j h muito tempo utilizada em centros de bioterismo dos pases do primeiro mundo, bem como rotineiramente nas empresas produtoras de animais, como a Iffa Credo, Charles Rivers, Taconic, Olac, entre outras. Com essa tcnica, possvel a eliminao da maioria dos patgenos de animais que apresentam transmisso horizontal, sendo, portanto, til para obteno de colnias SPF livres de vrus, bactrias e parasitas. A tcnica deve ser realizada em condies asspticas dentro de unidades isoladoras especialmente construdas para essa finalidade. Uma maior eficincia observada desde que a sua realizao acontea dentro das condies abaixo indicadas: acasalamento programado das fmeas receptoras SPF e doadoras convencionais, mediante sincronismo do ciclo estral; preparo do isolador de histerectomia especialmente construdo para essa finalidade; conexo entre o isolador de histerectomia e isolador com fmea receptora; sacrifcio da fmea doadora por deslocamento cervical; preparo do abdmen para retirada do tero; isolamento do crvix e dos cornos uterinos por amarrao e retirada assptica do tero (nos casos em que a tcnica esteja sendo realizada em equipamento apropriado, essa retirada deve ser feita no primeiro compartimento do isolador de histerectomia); passagem do tero para o segundo compartimento do isolador de histerectomia atravs de um tanque de imerso com soluo anti-sptica (amnia quaternria a 0,5% oC a 37 oC); retirada e reanimao dos neonatos; transferncia dos neonatos reanimados para o isolador com a fmea receptora. OBS.: a derivao cesariana deve ter incio 12 horas antes do parto normal.
POR QUE UTILIZAMOS A DERIVAO CESARIANA?

Infelizmente, o carter epidemiolgico em colnias fechadas (closed colony) extremamente elevado. Por essa razo, a introduo de animais contaminados nas colnias desencadear uma rpida disseminao e em pouco tempo acabaro por compromet-las de diferentes maneiras. Alm dos prejuzos que sero impostos comunidade usuria, os patgenos comprometero tambm as colnias instaladas no prprio biotrio. Dentre os prejuzos que sero observados com os agentes mais comumente encontrados destacamos: Interferncia na reproduo diminuindo a fertilidade e causando a morte de animais: Vrus de hepatite do camundongo (MHV) Vrus Sendai Vrus Sialodacrioadenite (SDAV) do rato
Alta mortalidade de neonatos, anormalidades nos hormnios sexuais, alteraes patolgicas no trato reprodutivo, infeco em embries causando alta taxa de aborto: Cryptosporidium sp Rotavrus
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Gnotobiologia
Alterao
de vrios parmetros reprodutivos: motilidade dos espermatozides, implantao de embrio, ossificao do esqueleto do feto, alterao da citologia vaginal, prejuzos nos testes de fertilizao in vitro, reduo da fertilidade em at 50% e distrbio na transferncia de embries, alm de teratologia. Mycoplasma pulmonis
Embora a placenta e o sistema imunolgico da me constituam uma importante barreira, existem patgenos capazes de contaminar os animais ainda durante a gestao, quer por rompimento da barreira placentria, quer por serem residentes da cavidade uterina. Dentre eles, destacamos:
Agentes
que atravessam a barreira placentria: Retrovrus murino (leucemia, tumor mamrio) Vrus da coriomeningite linfocitria (LCM) Vrus da ectromlia (poxvrus) Parvovrus (Kilhan rat- KRV, toolan-H1, MVM) Clostridium piliforme uterina (provavelmente sem passar a barreira placentria): Pasteurella pneumotrpica Salmonella sp Mycoplasma pulmonis Escherichia coli (fase progestacional)
Infeco
A tcnica de derivao cesariana realizada sistematicamente (e em alguns casos mais de uma vez em geraes sucessivas), mostra-se bastante eficiente na erradicao desses patgenos.
A UTILIZAO DE UNIDADES ISOLADORAS EM ENSAIOS EXPERIMENTAIS

Atualmente, diversos modelos de isoladores so confeccionados e utilizados para fins de experimentao. Nos pases do primeiro mundo, a aplicao dessa tecnologia bastante comum. Em alguns pases em desenvolvimento, como o Brasil, a utilizao desse equipamento na pesquisa tem se acentuado de maneira significativa. A principal razo para essa mudana a segurana que o equipamento oferece. Dentre as inmeras aplicaes que justificam sua utilizao, podemos citar:
Os isoladores
possibilitam a realizao de experimentos com animais imunodeficientes como SCID, XID, NOD, NUDE e outros, obtidos por meio de manipulao gentica como o knockout, assegurando qualidade e reprodutibilidade aos resultados. Essa tecnologia oferece segurana ao estudo com agentes zoonticos. A produo de anticorpos em camundongos ou ratos tendo em vista a realizao de Map Test (Mouse Antibody Production Test) ou Rat Test (Rat Antibody Production Test). Esses testes consistem na inoculao de animais SPF, VAF (Virus Antibody Free) imunocompetentes, com amostras de material biolgico especfico. Aps quatro semanas, avalia-se a produo de anticorpos contra agentes infecciosos que pudessem estar presentes nas amostras. A tcnica somente pode ser realizada em isoladores onde as condies so controladas, impedindo a ocorrncia de interferncias na produo dessas molculas.
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A APLICAO
DE
UNIDADES ISOLADORAS NA INDSTRIA
Com o advento dos isoladores, no apenas os laboratrios de pesquisa ou os centros de bioterismo se beneficiaram. Na indstria farmacutica, por exemplo, os isoladores so utilizados em diversas etapas, estendendo-se desde a pesquisa de um novo frmaco at o seu envase. Alm disso, o preparo de solues, os testes de esterilidade e a manipulao de drogas txicas, entre outras rotinas, so realizados com o auxlio dessa tecnologia. Nos pases desenvolvidos, as indstrias farmacuticas investem milhes de dlares em isoladores, uma vez que imprescindvel a qualidade dos processos na aprovao de novos princpios ativos. Atualmente, o nvel de exigncia dos processos instalados nessas indstrias estimulou o surgimento de empresas cuja atividade principal desenvolver novos modelos de isoladores. Entretanto, no apenas na produo de frmacos que essa tecnologia se faz presente. A indstria eletrnica, por exemplo, tambm se beneficia da segurana oriunda das unidades isoladoras. Para elas, a produo e o armazenamento de componentes microeletrnicos, de forma que os mesmos fiquem protegidos da interferncia de poeiras txicas, um importante fator de qualidade no processo de fabricao. Tillett (1999) descreveu o uso dos isoladores na indstria como uma alternativa para manter a sala limpa, pois possvel o preparo de produtos com nveis de riscos 2 e 3. O equipamento utilizado em produtos com nvel de risco 2 apresentava paredes rgidas em acrlico e policarbonato. O equipamento para manipulao de produtos com nvel de risco 3, por envolver a manipulao de patgenos perigosos e agentes citotxicos, possua um desenho capaz de prevenir a contaminao cruzada entre o operador e os produtos, bem como entre estes e o meio ambiente externo.
APLICAO
DAS
T CNICAS G NOTOBITICAS
E DOS I SOLADORES EM
HUMANOS:
IMUNODEFICINCIA E CIRURGIAS
O comprometimento imunolgico descrito como deficincia imune severa combinada ou SCID (Severe Combined Imune Deficiency) uma sndrome rara, congnita, que resulta na ausncia da imunidade por clulas B e T. A doena foi identificada pela primeira vez em crianas, por volta de 1950 (Glanzmann & Riniker, 1950; Hitzig et al., 1958). Os portadores dessa sndrome morriam antes de completarem um ano de idade. Embora alguns pacientes SCID possam ser tratados atravs de transplante de medula ssea, quase sempre os doentes so notavelmente susceptveis a infeces por uma srie de agentes, e a maioria s sobrevive quando completamente isolados do ambiente exterior. Essa condio mpar somente pode ser oferecida com unidades isoladoras, tais como a descrita por Travnicek et al. (1977). O equipamento idealizado por esse autor possibilitou a manuteno de um beb em condies estreis e controladas aps a realizao da cesariana. Travnicek & Mandel (1987) relataram um caso com pressuposio de imunodeficincia anterior ao nascimento. A partir dessas consideraes, foi possvel realizar a cesariana em isolador com condies totalmente asspticas. Durante um ms, o beb foi mantido no equipamento e nesse perodo foi possvel investigar sua condio imunolgica e realizar a colonizao com bactrias de linhagens selecionadas, preparando-o para a repopulao da microbiota. Tanto as experincias quanto as tecnologias realizadas em gnotobiologia tm beneficiado o homem de diferentes maneiras. Um exemplo a influncia nos cuidados com nascimentos prematuros e com neonatos de alto risco, observado na pediatria contempornea. Pacientes so mantidos em unidades isoladoras para preveno de infeces ps-operatrias, tratamento de queimaduras e de sistema imunolgico imunossuprimido (Cohn Jr. & Heneghan, 1991), alm de tratamento de pacientes com leucemia aguda (Trexler, Spears & Gaya, 1975).
220
Gnotobiologia
Em cirurgias ortopdicas, o isolador desempenha um importante papel na preveno de infeces psoperatrias (Zucman & Benichou, 1978). Hirsch, Renier & Pierre-Kahn (1978) mostraram a eficincia do isolador em cirurgias e a reduo das infeces em pacientes que estavam em tratamento de hidrocefalia. Essa eficincia foi atribuda eliminao de agentes contaminantes provenientes do ar (airborn) e manipulao assptica. Trexler, Emond & Evans (1977) descreveram o uso de isoladores de plstico com presso negativa para a manuteno de pacientes com suspeitas de infeces de risco como lassa, marburg e vrus ebola. Com esse equipamento, pacientes foram mantidos por 32 dias, assegurando a integridade do ambiente hospitalar e eliminando os riscos para a equipe mdica. Doena como a leucemia freqentemente acompanhada pela imunodeficincia clnica, aps o transplante de medula ssea. Pacientes mantidos em isoladores e sob sistema de barreiras apresentam menor incidncia de doena GVHD (enxerto versus hospedeiro) aps o transplante (Mahmoud et al., 1984).
A INFLUNCIA DA G NOTOBIOLOGIA NA INFRA -ESTRUTURA DESENVOLVIMENTO DE NOVOS MODELOS
EM
PESQUISA
PARA O
De certa forma, os isoladores permitem a manipulao do sistema imunolgico, uma vez que, experimentalmente, camundongos imunodeficientes SCID/SCID (homozigotos) so utilizados como receptores de clulas derivadas do sistema imunolgico do homem. Esses camundongos no possuem linfcitos T e B, embora tenham clulas hematopoticas normais. Quando os camundongos CB17 SCID/SCID so inoculados com linfcitos humanos, os linfcitos sobrevivem e funcionam durante vrios meses no animal, produzindo anticorpos e clulas T imunes. Esse sistema imunolgico humano pode ser testado quanto a sua capacidade de compor resposta a uma vacina em experimentao, por exemplo, contra o HIV. Entretanto, os camundongos SCID somente podem ser criados no interior de unidades isoladoras. uma condio estrita, pois em ambiente aberto, mesmo que sanitariamente controlado, esses modelos podem reverter para a forma Scid leaky, imunologicamente anormal e descaracterizada por apresentar baixo ttulo de imunoglobulinas. Portanto, os equipamentos asseguram que os animais manipulados possam permitir o estudo de doenas como a AIDS sob condies definidas e adequadas, bem como endossam qualificao de protocolos teraputicos em condies apropriadas e isentas de riscos para o homem. A introduo de genes exgenos em organismos vem sendo progressivamente utilizada em diversas reas da biologia dos mamferos. A maior parte desse trabalho tem sido realizada com camundongos, embora os mesmos princpios sejam aplicveis a outros animais, como porcos, coelhos, ovelhas. Por essa razo, os camundongos transgnicos so animais modificados, possibilitam a expresso de genes in vivo e devem ser isolados de outros de forma a se evitar a disseminao gentica na natureza oriunda, por exemplo, da fuga do animal manipulado. Outro caso no qual o animal geneticamente modificado residente obrigatrio desses equipamentos na produo de animais knockouts. Estes tm, em sua maioria, comprometimento do sistema imune e, por isso, necessitam de tratamento diferenciado para que seu uso seja vivel, quer seja para programas de reproduo, quer seja para a experimentao. Em pases desenvolvidos, comum a utilizao desses equipamentos e de suas tecnologias. Porm, em pases da Amrica Latina como o Brasil, a carncia de programas que promovam a divulgao de seu uso notria. Apenas algumas instituies e centros de pesquisa presentes na regio Sudeste do Pas os utilizam e mantm programas de formao de recursos humanos especializados em sua operao.
221
OUTROS EQUIPAMENTOS ORIGINADOS A PARTIR DESSAS TECNOLOGIAS

Nos pases desenvolvidos, muito grande a utilizao de equipamentos oriundos da otimizao das condies de ambiente. Essas novas tecnologias no apenas reduzem os custos da construo ou da adequao fsica para biotrios de porte mdio, mas principalmente permitem a instalao de biotrios experimentais com excelente nvel de segurana e dentro das necessidades de cada espcie animal. Em pases como Frana, Alemanha, Inglaterra e Estados Unidos comum considerar esses equipamentos nos projetos de pesquisa ou de adequao fsica de biotrios de centros de pesquisa ou de produo animal. Dentre esses equipamentos, destacam-se as estantes ou armrios ventilados (Fig. 3). Figura 3 Estantes ventiladas para camundongos e ratos. rea instalada no Instituto de Pesquisas Energticas (IPEN-SP)
Foto: Alesco Indstria e Comrcio Ltda.
E STANTES
OU
A RMRIOS V ENTILADOS
Atualmente, existem vrios tipos de estantes que podem ser adotadas para a manuteno dos animais utilizados em experimentao, como camundongos, ratos, coelhos e outros. Assim como os isoladores, as estantes ventiladas aumentam a segurana sanitria, reduzindo o risco de infeces que poderiam interferir nas pesquisas. So adequadas para laboratrios em funo da otimizao do espao aliada ao manejo simples dos animais. possvel a manuteno de camundongos e ratos na mesma estante, pois o equipamento possui compartimentos independentes. Normalmente, esse equipamento confeccionado em material resistente s exigncias das rotinas e tem capacidade para alojar uma razovel quantidade de animais. O sistema de insuflamento do equipamento
222
Gnotobiologia
possibilita o deslocamento de ar nos diversos nveis sobre as gaiolas, portanto a retirada de amnia e CO2 contnua. Assim, h eliminao dos odores provenientes das excretas dos animais, bem como dos poluentes por eles gerados. No Brasil, diversas instituies de pesquisa possuem esses equipamentos, demonstrando que o uso dessa tecnologia tem crescido nos ltimos anos, em virtude, sobretudo, da praticidade do equipamento, mas tambm graas conscientizao, por parte da comunidade, da influncia das condies ambientais na obteno de resultados reprodutveis e universais.
M ICROISOL ADORES
OU
T OP F ILTERS
Existem divergncias para a definio e utilizao desses equipamentos. A experincia nos permite inserir a observao de que a manuteno de colnias de camundongos e ratos em isoladores pressupe uso contnuo e prolongado com total segurana. Nesse contexto, os microisoladores ou top filters no oferecem a mesma proteo aos animais. Os microisoladores ou top filters so utilizados para a manuteno de ensaios experimentais (sem risco de zoonoses). Procedimentos especiais devem ser adotados, tais como troca de gaiolas em fluxo laminar, entre outros.
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Criopreservao de embries murinos em biotrios
C Biotrios riopreservao de Embries Murinos em

INTRODUO
26
Luiz Augusto Corra Passos Ana Maria Aparecida Guaraldo Delma Pegolo Alves Luiz Afonso Pires Thiago Marinho Santana Thiago Henrique Cimadon Dini
O desenvolvimento cientfico e tecnolgico influi diretamente na qualidade de vida da populao humana. Novas tcnicas, pesquisas e tendncias so assimiladas diariamente pela sociedade, tornando-se, rapidamente, eventos corriqueiros. Na verdade, estamos de tal modo acostumados com certos avanos que sequer pensamos no quo difcil era, h alguns anos, executar certas tarefas, curar certos males ou mesmo escrever um texto de fcil entendimento. Particularmente nas cincias biomdicas, os avanos nos propiciaram um melhor entendimento da natureza da qual fazemos parte. Palavras como DNA, clonagem, ecossistema e genoma j fazem parte do vocabulrio de pessoas que no esto envolvidas com a execuo direta da cincia, mas que so diretamente influenciadas por ela. O sucesso da pesquisa cientfica no pode ser negado. O fato de hoje confiarmos nos servios mdicos, abandonando tcnicas de curandeirismo, e dispormos de um arsenal cada vez mais completo de vacinas, drogas e tcnicas cirrgicas se deve a esse avano tecnolgico. Entretanto, um resultado cientfico somente vlido se possuir reprodutibilidade. Com isso, fez-se necessrio o surgimento de um outro ramo da cincia, capaz de fornecer modelos animais adequados s necessidades dos pesquisadores e que, acima de tudo, pudessem garantir tal reprodutibilidade. Alm disso, com o surgimento desse novo ramo e de modelos animais, a interferncia nos resultados foi sendo sistematicamente reduzida, garantindo um dinamismo cada vez maior pesquisa cientfica. Assim, o estabelecimento da cincia e tecnologia em animais de laboratrio possibilitou a padronizao dos modelos tanto do ponto de vista de seus aspectos biolgicos e de sade quanto das condies de ambiente, nas quais os mesmos devem ser mantidos. Entre essas novas exigncias, destacam-se a adequao do espao fsico, a qualidade do modelo animal e o controle dos materiais em insumos necessrios manuteno das colnias. Como conseqncia dessa padronizao sanitria, gentica e ambiental, passamos a observar uma reduo no nmero de animais utilizados, assegurando a universalidade e a reprodutibilidade experimentais, bem como o desenvolvimento de novas tecnologias (Fig. 1). Figura 1 Algumas das conseqncias da padronizao dos modelos animais
reagentes biolgicos medicamentos, vacinas etc. melhora na qualidade de vida eliminao de fatores de interferncia Cincia de animais de experimentao Importncia dos modelos animais ambiental Animais padronizados gentico
Reprodutibilidade/universalidade Diferentes linhagens Reduo no no de animais utilizados
sanitrio
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Entre as tecnologias desenvolvidas, destaca-se a criopreservao de embries murinos, assunto que ser discutido no decorrer deste captulo.
HISTRICO DA MANIPULAO DE EMBRIES

No fim do sculo XIX, cientistas interessados no estudo de aspectos relacionados reproduo e ao desenvolvimento de organismos superiores iniciaram os primeiros ensaios com a finalidade de estabelecer metodologias que permitissem a manipulao de embries. Inicialmente, o coelho foi o modelo experimental adotado, tendo em vista suas caractersticas biolgicas favorveis, como o tamanho relativamente grande do ovo (o que facilitava a manipulao) e a ovulao induzida pelo acasalamento, fato de elevada convenincia para a definio precisa da idade dos embries. Entretanto, os resultados obtidos no foram totalmente satisfatrios. As dificuldades relativas compreenso das necessidades nutricionais e as limitaes impostas pelas caractersticas fsico-qumicas dos meios de coleta e cultivo at ento utilizados consistiam em barreiras tcnicas a serem rompidas. No princpio do sculo XX, juntamente com o desenvolvimento da qumica fina responsvel pela obteno de reagentes livres de impurezas, que poderiam ser crticas do ponto de vista toxicolgico, a embriologia passou por progressos significativos com profundos reflexos no sucesso de coleta e cultivo de embries no estgio de pr-implantao. Assim, apenas na dcada de 40 do sculo XX, com Hammond, o cultivo de embries pde ser conduzido de maneira sistemtica at a fase de blastocisto. Todavia, estgios de desenvolvimento mais precoces ainda careciam de ajustes na formulao dos meios. Conseqentemente, tornou-se impossvel que os embries se enquadrassem em ndices de qualidade, possibilitando maiores avanos, embora certas barreiras tcnicas tivessem sido rompidas (vias de acesso para implante, instrumental bsico adequado etc.). Finalmente, em meados da dcada de 50, Withen props uma nova formulao, que passaria a ser utilizada tanto na coleta quanto no cultivo de embries. Essa nova formulao se mostrou bastante eficiente, ampliando significativamente o nmero de embries implantados com sucesso. Posteriormente, outros fatores relacionados importncia das condies de cultivo para o sucesso do implante seriam apontadas por Anne MacLaren. Com isso, estavam solucionados os aspectos bsicos, porm essenciais, das etapas de coleta, congelamento, descongelamento e implante de embries. A dcada de 60 foi de grande importncia para tal desenvolvimento. Esforos foram realizados de forma a esclarecer tanto as necessidades nutricionais dos embries quanto os mecanismos envolvidos na cintica da gua em clulas submetidas a temperaturas abaixo de zero, e sua influncia na viabilidade dos embries congelados. Agora j possvel o estabelecimento de bancos de embries local onde podem ser armazenadas grandes quantidades de linhagens (elevado estoque potencial) por um perodo indeterminado , nos quais estes podem estar protegidos tanto de contaminaes sanitrias quanto de uma deriva gentica. Quadro 1 Histrico resumido da embriologia experimental
im do sculo XIX: XIX Uso de coelhos para estudos de embriologia (primrdios da embriologia experimental); F Fim 1875 1875: Van Beneden descrio dos estgios de pr-implantao; 1890 1890: Heape anlise e manipulao do oviduto (primeiros esforos visando ao implante); 1929 1929: Lewis & Gregory estudo de mrulas em cultura; 1949 1949: Hammond cultivo de embries de camundongos de 8 clulas at a fase de blastocisto; 1951 1951: Beathy implante de embries de camundongos;
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Quadro 1 Histrico resumido da embriologia experimental (continuao)

1956 1956: Withen sucesso no cultivo de embries de camundongos de uma clula at blastocisto; 1958 1958: Anne MacLaren demonstra que as condies de cultivo interferem no sucesso do implante; 1963 1963: Mazur diminuio de energia cintica da gua em clulas submetidas a temperaturas abaixo de zero e a probabilidade de congelamento intracelular; 1965 1965: Brinster nutrio de embries na fase de pr-implantao e tcnica de cultivo em microgota; Dcada de 70 70: Brinster banco de embries; 1971 1971: Cultivo sistemtico ps-descongelamento de embries de camundongos (estudos de viabilidade); 1974 1974: Banco de embries influenciando o futuro desenvolvimento gentico; 1975 1975: Sobrevida de embries de ratos ps-congelamento.
CRIOPRESERVAO E TECNOLOGIA DE MANIPULAO DE EMBRIES

IMPORTNCIA E ASPECTOS BSICOS
A criopreservao de embries, tanto em biotrios quanto em instituies de pesquisa, uma poderosa ferramenta. Por meio da manipulao de embries (em todos os seus nveis), pode-se interferir em diversos protocolos experimentais, sendo que em alguns deles esta tecnologia absolutamente indispensvel. Alm desses aspectos, em nosso dia-a-dia nos deparamos, sem nos darmos conta, com outros benefcios advindos dessa tecnologia. Vejamos alguns exemplos:
Testes de Toxicidade (Efeitos Embriotxicos) Consiste na utilizao de embries para a observao do carter toxicolgico de diferentes drogas. Um exemplo seu emprego no teste de produtos (novos ou no) que sero utilizados na agricultura.
Toxicolgica de Frmacos (Teratognicos) Certas drogas podem alterar o desenvolvimento normal de organismos. Tais drogas so chamadas teratognicas e a importncia de seu reconhecimento se evidencia ainda mais quando de seu uso em gestantes. Utilizando a tecnologia de manipulao de embries, pode-se prevenir efeitos indesejveis de uma droga, primeiramente no embrio e, posteriormente, no prprio feto. Humana Aliada Reproduo Ensaios com embries, utilizando diferentes protocolos, podem auxiliar em programas de reproduo humana como a fertilizao in vitro, bem como na anlise embrionria de distrbios fetais, entre outros.
Medicina
Caracterizao
A TECNOLOGIA DE MANIPULAO DE EMBRIES ALIADA PRODUO DE TRANSGNICOS E QUIMERAS

ALGUMAS CONSIDERAES HISTRICAS
Na dcada de 60 do sculo XX, Kristof Tarkowski utilizou blastmeros para a quebra da zona pelcida, visando ao desenvolvimento da primeira quimera. Beatrice Mintz props um novo processo e obteve sucesso na digesto da zona pelcida de um embrio. Finalmente, Gardner conseguiu injetar clulas isoladas de embries doadores em blastocistos hospedeiros (quimera). Rudolf Jaenich e Beatrice Mintz, na dcada de 70, executaram a primeira introduo direta de material gentico em embries de camundongos, munindo-se do DNA do vrus SV-40. Paralelamente, ocorreu a
227
diversificao no uso das quimeras, sendo que essa utilizao se estendia a estudos imunolgicos, padres de pigmentao, diferenciao sexual e estudos de diferenciao celular, entre outros. A dcada de 80 foi marcada pela microinjeo de gene clonado (no caso o gene tk do vrus da herpes simplex) em fibroblasto cultivado, possibilitando, assim, a manipulao de material para introduo posterior e influenciando na concepo do transgnico. Ainda nesse perodo, Gordon executou a microinjeo do gene clonado em pr-ncleo de embries de uma clula, aproximando-se da transgnese como estabelecida atualmente.
MATRIA-PRIMA PARA O DESENVOLVIMENTO DE MODELOS ESPECIAIS

A abordagem da utilizao de tecnologias de manipulao de embries em pesquisa deveras ampla. Com elas, podem ser manipulados desde embries de uma clula at indivduos em estgio de blastocisto, permitindo, dessa forma, a produo de transgnicos, knockouts e quimeras, entre outros. A transgenia uma ferramenta cientfica que possibilita a criao de novos modelos. Esse processo se d tanto pela microinjeo de fragmentos de DNA em um dos pr-ncleos (Fig. 2) quanto pela produo de quimeras formadas a partir da incorporao de clulas de uma outra linhagem no blastocisto, de uma linhagem receptora. As clulas em questo pertencem massa celular interna (MCI) de um embrio da linhagem doadora e sero introduzidas na blastocele do embrio receptor. Aps serem incorporadas, as caractersticas da linhagem doadora sero manifestadas na linhagem receptora. Assim sendo, indivduos originados por essa tcnica tero informaes genticas das duas linhagens. possvel, portanto, que o animal apresente em seu tecido somtico heranas de duas origens genticas diferentes (Fig. 3). H ainda uma tcnica que consiste na fuso das duas tcnicas anteriores para a obteno de transgnicos. Por meio dessa tcnica os animais quimricos sero selecionados aps a diferenciao celular, sendo o enfoque principal destinado queles cuja caracterstica desejada esteja presente nas clulas reprodutivas (gametas) (Fig. 4). Figura 2 Desenho da transgnese por microinjeo
228
Figura 3 Confeco da quimera

MASSA CELULAR INTERNA
BLASTOCELE
EMBRIO A EMBRIO B
INSERO DE CLULAS DO EMBRIO B NA BLASTOCELE DO EMBRIO A
EXTRAO DE CLULAS-TRONCO
INCORPORAO DAS CLULAS DO EMBRIO B INDIVDUO QUIMRICO
Figura 4 Confeco de uma quimera utilizando a transgnese para a obteno de animais com clulas germinativas geneticamente alteradas Blastocisto
Blastocisto
Passo I
Passo I Retirada de clulas da Retirada de clulas da M.C.I. .
M.C.I
Blastocele Blastocele
Passo III Passo III Injeo na blastocele Injeo na blastocele Passo IV Migrao
Passo Passo II II Eletroporao Eletroporao
Celular Interna
ular Interna
Passo IV Migrao
Clulas tronco
Clulas-tronco
com o novo DNA com novo DNA inserido
inserido
Passo V Passo V Diferenciao
Diferenciao
musculos
msculos rins etc. rins, etc rgos reprodutores rgos
Animal produzindo gametas

Animal produzindo gametas com inserido o DNA inserido com o DNA
reprodutores
229
A TECNOLOGIA DE MANIPULAO DE EMBRIES E A PRODUO MODIFICADOS: QUIMERAS, TRANSGNICOS E KNOCKOUTS
DE
MODELOS ANIMAIS GENETICAMENTE
A instalao de laboratrios de manipulao de embries em Centros produtores de modelos animais, alm de possibilitar importantes vantagens como o banco de embries (perpetuao dos padres sanitrios e genticos originais dos animais) e a descontaminao para agentes de transmisso vertical (como no caso de alguns vrus), tambm se mostra essencial nas etapas de produo de animais de laboratrio geneticamente modificados. Esses animais geneticamente modificados podem nos fornecer modelos especiais para pesquisas especficas, permitindo, por exemplo, que se estude os efeitos funcionais do produto de um gene especfico. Isso possvel uma vez que um camundongo transgnico pode apresentar diferentes caractersticas, como super expressar o gene em um tecido especfico (permitindo a sua anlise in vivo), ou at mesmo impedir que um determinado gene se expresse constituindo-se em um modelo knockout para um outro. Nessa parte do captulo, iremos discutir objetivamente a aplicao da tecnologia de manipulao de embries na obteno de modelos. Para se criar um camundongo transgnico, uma seqncia de DNA, diferente daquela j existente na clula, introduzida. Esta nova seqncia conhecida como estrangeira, e pode ser de diferentes origens. A introduo pode ser realizada por diferentes mtodos, dependendo dos objetivos. A mais divulgada e conhecida a utilizao de um micromanipulador que permite uma microinjeo em um dos proncleos de vulos fertilizados (ovos). (Fig. 2). Aps essa injeo, os ovos so implantados em ovidutos de fmeas receptoras pseudoprenhas, de forma que se desenvolva uma gestao normal. Normalmente, a taxa de sucesso muito baixa, mesmo com a injeo de algumas centenas de cpias de um determinado gene. A literatura registra o ndice mximo de 25% dos animais nascidos serem transgnicos para as cpias inseridas. As cpias do transgene, na quase totalidade das vezes, so inseridas em stios aleatrios de cromossomos e transmitidas como uma herana mendeliana simples. O fato da integrao usualmente ocorrer antes da replicao do DNA permite que cerca de 75% dos neonatos transgnicos portem o transgene em todas as suas clulas, incluindo as clulas germinativas (reprodutoras). Dessa forma, os camundongos fundadores, que carregam o transgene em heterozigose, podem ser programadamente acasalados, segundo a convenincia dos pesquisadores. Talvez a maior contribuio dos animais transgnicos seja o fato de que a tecnologia de transgnese permite que se estude a expresso de genes em um tecido especfico. Isto factvel, uma vez que se pode ligar seqncias codificadoras do gene, que se pretende estudar, a seqncias regulatrias responsveis por sua expresso em um tecido (do rgo a ser pesquisado). Atualmente, os transgenes podem tambm ser expressos segundo um estmulo externo causado, por exemplo, por uma droga ou por hormnios. Nesse caso, utilizam-se promotores capazes de responder a esses agentes. Outro mtodo muito poderoso na produo de modelos animais geneticamente modificados a manipulao de genes visando produo de animais knockouts (os animais recebem esse nome em virtude de terem um gene inativado, nocauteado). O animal knockout possui um gene alterado intencionalmente, de forma que ele no funcione (em decorrncia a uma disruptura), ou o produto de sua expresso que est muito diferente e por esta razo tambm no funciona (alterao na sequncia do gene mutao). Em ambos os casos, o animal no apresentar um padro de normalidade para o gene, permitindo estudos mais detalhados de sua funo in vivo. Uma tcnica muito utilizada na produo de animais knockout a recombinao homloga.
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RECOMBINAO HOMLOGA
Por meio dessa tcnica, a integrao de uma determinada seqncia introduzida na clula passa a ser parcialmente dirigida. Isso possvel sempre que se conhea a seqncia de bases do gene que se quer inativar na clula receptora. Para tanto, a seqncia do DNA que ser introduzida sofre modificaes em laboratrio (conhecidas como construo), que permitem sua recombinao, por homologia, seqncia presente no gene-alvo endgeno, podendo substitu-lo. Os materiais utilizados, nesse protocolo, so as clulas-tronco (ou clulas embrionrias pluripotentes, tambm conhecidas como stem cells), normalmente extradas de embries na fase de blastocisto. Essas clulas so manipuladas para a insero da seqncia de DNA, e uma das metodologias muito utilizada a eletroporao. O eletroporador um aparelho que abre minsculos poros na membrana celular, permitindo a entrada do fragmento de DNA. Aps a introduo do DNA, as clulas tratadas so selecionadas com o intuito de separar aquelas que sofreram recombinao homloga. O pesquisador Mario Capecchi e seus colaboradores, da Universidade de Utah, nos Estados Unidos, descreveram, em 1986, um mtodo bastante eficiente e ainda muito utilizado para a identificao e seleo das clulas recombinantes. Esse mtodo conhecido como dupla seleo e se fundamenta na expresso de genes reprter dentro e ao lado da construo gnica. O mtodo se baseia no fato da construo apresentar seqncias homlogas quelas presentes no genoma receptor nos dois lados do gene que se quer inativar (por exemplo, o gene K). Dentro das seqncias homlogas, ligada ao gene K e tambm a um gene que d resistncia ao antibitico, a neomicina (gene Neo). No lado de fora dessa regio, que contm as seqncias de homologia e tambm o gene Neo, colocado um outro gene, o gene da timidina quinase (gene tk). Aps a transfeco em um eletroporador (conforme escrito acima), as clulas so cultivadas em meio de cultura. Nesse meio, colocado o antibitico neomicina (ou um anlogo dele, o G418) para que as clulas possam ser selecionadas. Das clulas colocadas no meio, apenas aquelas que integraram o gene Neo de forma estvel em seu genoma sobrevivero, pois sero resistentes ao antibitico. As demais clulas morrero. Esse processo conhecido como seleo positiva. As clulas sobreviventes so ento cultivadas em outro meio que contm uma droga denominada ganciclovir, cuja funo matar as clulas nas quais o gene tk est se expressando. Esse processo conhecido como seleo negativa, e se baseia no fato de que quando a recombinao ocorreu ao acaso (e por esta razo no homloga), o gene tk permaneceu ligado ao gene K, e as clulas puderam, ento, ser selecionadas. As clulas que sofreram recombinao homloga perdem o gene tk, pois ele no est na regio de homologia. As clulas sem o gene tk no morrem na presena de ganciclovir, podendo ser cultivadas, antes de serem introduzidas, no embrio (quimrico) que ser implantado nas fmeas receptoras pseudoprenhes (Fig. 5).
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Figura 5 Esquema para a produo de modelos por recombinao homloga
G e n o m a ( r e c e p to r ) A K R e g i e s d e h o m o lo g ia ( A e B ) C o n stru o B
A K
N eo
B
TK
E le t r o p o r a o C lu la s - tr o n c o
+ -
E le t r o p o r a d o r
R e c o m b in a o h o m lo g a ( g e n e - a lv o )
R e c o m b in a o a o a c a s o ( o u tr o p o n t o d o g e n o m a)
Clulas-tronco com insero correta
Clulas-tronco sem insero
Clulas-tronco com insero aleatria
Perda de TK
A K
Neo
A K
Neo
B
TK
Seleo positiva com Neomicina (morte das clulas sem insero)
Seleo negativa com Ganciclovir (morte das clulas com insero aleatria) Clulas com insero correta sobrevivem Injeo no Blastocisto
Implante em fmeas pseudoprenhes
Seleo da prole e acasalamento programado
Obteno de animais homozigotos
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BANCO DE EMBRIES
REPOSIO IMEDIATA DAS LINHAGENS
O banco de embries j uma realidade em alguns biotrios e, dada a sua simplicidade, deveria ser de uso rotineiro em todas as instituies. Com essa ferramenta, pode-se oferecer toda a segurana s colnias, uma vez que possibilita a reposio imediata das linhagens. As colnias de fundao esto sujeitas a acidentes que no podem ser totalmente evitados, mesmo com programas de preveno. Assim sendo, faz-se necessria uma tcnica que permita a sua reposio. Na dcada de 80, no The Jackson Laboratory, localizado em Bar Harbor, Maine, nos Estados Unidos, um incndio acabou por dizimar uma grande parte das matrizes l existentes. Porm, devido a um banco de embries completo e funcional, os pesquisadores puderam restabelecer as colnias sem maiores conseqncias para o funcionamento do centro. Alm do prejuzo decorrente da perda de matrizes, os acidentes em biotrios podem comprometer as atividades de pesquisa que utilizam os modelos fornecidos por eles, gerando graves conseqncias. Por essa razo, a reposio imediata das colnias muitas vezes a nica alternativa para minimizar tais efeitos negativos. Com o auxlio de um banco de embries funcional e operante, possvel o repovoamento rpido e eficiente das colnias.
PERPETUAO DE PADRES GENTICOS E SANITRIOS

Uma outra grande vantagem no estabelecimento de um banco de embries a perpetuao dos padres sanitrios e genticos. Atravs desse banco, linhagens podem ser conservadas em nitrognio lquido, preservando, assim, suas caractersticas originais sem que haja perigo de interferncia por contaminaes genticas ou sanitrias. A contaminao gentica ocorre por meio da propagao de um gene no original dentro de uma linhagem mantida no biotrio. Isso pode ser conseqncia de falhas humanas ou materiais, que permitem o escape de um animal de sua gaiola e sua entrada em outra com animais de linhagem diferente. A ocorrncia da cpula ir certamente definir uma prognie geneticamente contaminada. Isso ainda mais grave nos casos em que duas linhagens de constituio gentica diferente, mas de mesma aparncia (fentipo), so mantidas juntas em uma mesma sala. Nesse caso, a prognie no poder ser diferenciada pela colorao e, portanto, a contaminao ter grande chance de se incorporar na colnia, descaracterizando-a. Do mesmo modo, uma contaminao sanitria (por vrus, fungos, bactrias, protozorios, por exemplo) tambm ir causar a descaracterizao da linhagem. Ambas as contaminaes comprometem a reprodutibilidade e a universalidade experimentais. A universalidade define a propriedade de um resultado obtido ser vlido em qualquer centro de pesquisa, desde que realizado com o mesmo modelo animal e nas mesmas condies. J a reprodutibilidade representa a garantia de que o resultado experimental ser o mesmo se repetido em pocas diferentes, utilizando o mesmo modelo nas mesmas condies. O advento do banco de embries viabilizou essas metas.
ESTOQUE POTENCIAL DE LINHAGENS

A manuteno de diversas linhagens em um biotrio , muitas vezes, um desejo justificvel da comunidade cientfica, uma vez que permite o desenvolvimento de vrios ensaios experimentais. Entretanto, isso muito caro e exige a adoo de diversas outras providncias, tais como capacitao de recursos humanos, alm da adequao dos espaos fsicos (algumas vezes por exigncia tcnica da prpria linhagem) e dos insumos bsicos para a manuteno dos animais. Os embries do banco no possuem tamanhas necessidades, bastandolhes um suprimento de nitrognio lquido para que permaneam congelados.
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Assim, o estabelecimento do banco permite ao biotrio a manuteno de um grande nmero de linhagens a baixo custo. Alm disso, pode-se otimizar a programao de entrega de animais comunidade usuria. Certas linhagens, por permanecerem durante muito tempo sem solicitao de uso, so criopreservadas, podendo ser descongeladas e reimplantadas no Centro, caso haja a necessidade.
DESCONTAMINAO
AUXLIO TCNICA DE DERIVAO CESARIANA
A tcnica de derivao cesariana vem sendo amplamente utilizada como forma de suporte a programas de erradicao de patgenos em colnias contaminadas de camundongos e ratos. Tambm chamada de histerectomia (Fig. 6), um procedimento bastante simples, porm de relativa eficincia, uma vez que nos casos de contaminao por patgenos de transmisso vertical (como alguns vrus e micoplasma, por exemplo), o sucesso na eliminao total do agente pode ser comprometido. Isso ocorre porque alguns patgenos atravessam a barreira placentria e contaminam o feto ainda em desenvolvimento no tero materno. Quando associada a programas de coleta, lavagem e transferncia de embries, o nmero de casos bemsucedidos de descontaminao por esses agentes aumenta significativamente. A zona pelcida do embrio uma barreira de proteo deveras eficiente e, durante a execuo do protocolo, as repetidas lavagens, as quais os embries so submetidos, retiram por arraste os contaminantes aderidos a ela. Assim, a obteno de colnias virus-free e axnicas assegurada com a execuo de uma ou duas histerectomias, seguida de acasalamentos programados para a coleta e transferncia de embries em fmeas receptoras, comprovadamente livres de patgenos. Figura 6 A tcnica de histerectomia ou derivao cesariana
F M E A D O AD O R A
FMEA RECEPTORA
C O R N O S U T E R IN O S C O M NEONATOS R E T IR A D A D O S N E O N A T O S DO TERO
TRANSPORTE FACILITADO
Pode-se, com o apoio dessa tecnologia, transportar com segurana e facilidade um grande nmero de embries de diferentes linhagens e espcies de animais reduzindo-se, portanto, custos e problemas relacionados ao transporte de animais em maior volume ou de grande porte.
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REDUO DE CUSTO DAS COLNIAS DE FUNDAO

Em centros que produzem animais sanitria e geneticamente certificados, o custo da manuteno das colnias de fundao muito elevado. Esse fato decorrente dos cuidados necessrios para a manuteno desses animais (acasalamentos, isolamento, alimentao, controle de qualidade etc.). Por meio do estabelecimento do banco de embries, o nmero de casais necessrios nas colnias de fundao drasticamente reduzido, acarretando uma reduo nos custos dessas matrizes.
TREINAMENTO DE PESSOAL
Finalmente, uma considerao cabvel a importante contribuio dessa tecnologia para a equipe de tcnicos. O contato com esse trabalho, aparentemente sofisticado, tem efeito estimulante sobre a equipe, que se sente muito valorizada.
PRINCIPAIS ETAPAS DA TECNOLOGIA DE CRIOPRESERVAO

O estabelecimento de uma rotina para o congelamento de embries acontece em vrias etapas e apresenta diferentes necessidades. Para melhor compreenso, ns as separamos em duas partes.
PARTE 1
Necessidades Gerais (preparo dos materiais, drogas e animais) Para a realizao da tcnica, indispensvel o preparo de alguns itens. Dentre eles destacam-se os seguintes materiais: meios de coleta e cultivo (Brinster, PB1, M16, Whiten etc.) machos vasectomizados fmeas doadoras (superovulao e acasalamento normal); hormnios (estimulante de folculos e luteinizante) drogas e anestsicos materiais cirrgicos
PARTE 2
Coleta de Embries Os embries so a matria-prima utilizada para a formao do banco. Sua obteno o princpio de todo o processo e exige os seguintes materiais: preparo do meio de coleta (podem ser utilizados diferentes meios, como PB1 e Han F10) preparo dos capilares de manipulao seringa e agulha para a lavagem do oviduto placas de Petri descartveis tesouras de ponta romba e fina pinas fmeas doadoras (acasaladas de forma programada com ou sem superovulao) Congelamento A etapa de congelamento dos embries , a despeito da simplicidade, extremamente crtica. A qualidade do meio utilizado, associada ao preparo dos materiais, determina o sucesso no congelamento, preservando a viabilidade dos embries. Nessa etapa, a ateno deve ser para os seguintes materiais:
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dos meios de congelamento. Esses meios so obtidos a partir da solubilizao de substncias crioprotetoras no meio de coleta (podem ser utilizadas diferentes substncias para a proteo dos embries, como DMSO, propileno glicol etc.); preparo de micro capilares de manipulao; preparo dos minitubos para acondicionamento dos embries em meio a soluo crioprotetora (existem diversos modelos disponveis; fundamental que possam ser rotulados); disposio dos embries nos minitubos e transferncia destes para o banho refrigerado; transferncia dos minitubos para os reservatrios (contineres) com nitrognio lquido. Descongelamento De certa forma, juntamente com o cultivo, esta etapa monitora as anteriores. No descongelamento, os embries receberam um tratamento que permitira o retorno a mesma situao biolgica que se encontravam logo aps a sua retirada do interior do oviduto da fmea doadora. Esse tratamento consiste na colocao de um mesmo volume de um meio, sem crioprotetor (isotnico), ao meio recm-extrado do minitubo e que contm os embries. Esse procedimento visa a diluir o crioprotetor, pois, na temperatura ambiente, o mesmo txico e compromete a viabilidade dos embries. Aps trs diluies seriadas, os embries podem ser transferidos para um meio de cultivo isotnico. retirada dos minitubos do reservatrio: para descongelamento dos embries; deposio dos embries em meio de cultura (reidratao); cultivo de embries em estufa de CO2, pelo perodo de 12h a 14h, na temperatura de 37 C e percentual de 4,5% de CO2; observao dos embries descongelados; transferncia de embries para as fmeas receptoras pseudoprenhes. Implante Aps o descongelamento, o cultivo ou mesmo quando se deseja realizar uma transferncia a fresco para descontaminao, os embries devero ser introduzidos na fmea receptora preparada para receb-los. Este preparo a induo de uma pseudoprenhez na fmea receptora, obtida a partir de sua colocao junto a um macho vasectomizado. Isto possibilita que a fmea desenvolva uma fisiologia similar quela obser vada na gestao normal, garantindo aos embries um ambiente prximo ao obser vado nesse tipo de gestao. O local onde os embries sero introduzidos o mesmo de onde eles foram retirados: o oviduto. Nessa etapa da tcnica, devem ser adotadas as seguintes providncias: anestesia da fmea receptora (preferencialmente hbrida) previamente acasalada com o macho vasectomizado; inciso para a exposio do corno uterino, com posterior apresentao do oviduto; ruptura da bolsa ovariana e introduo dos embries via infundibulum; retorno do corno uterino e do oviduto cavidade peritonial; suturas no peritnio e pele; acompanhamento ps-cirrgico e posterior deteco de prenhez. OBS.: Os processos anteriormente citados fazem parte de um protocolo que deve ser fielmente seguido, sob pena de no se evitar fatores de interferncia, que podem comprometer a eficcia da tcnica.
preparo
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O DETALHAMENTO DAS ETAPAS UTILIZANDO COMO EXEMPLO O CAMUNDONGO

PREPARO DE MACHOS VASECTOMIZADOS
Para descrever o processo de vasectomia, inicialmente devemos apresentar os materiais utilizados. Empregaremos o camundongo como modelo.
INSTRUMENTAL CIRRGICO composto
de tesoura de ponta romba, tesoura de ponta fina, pinas relojoeiro e de ponta romba, bisturi, tesouras porta-agulha, agulhas para sutura, linha de algodo para sutura, linha absorvvel para sutura do peritnio, agulhas e seringas para anestesia; pode variar de acordo com a espcie animal com a qual se est trabalhando. Para camundongos, utiliza-se preferencialmente o Avertin (2-2-2-tribromoetanol diludo em lcool amyl tercirio); composto por uma pina relojoeiro e uma lamparina;
SUBSTNCIA ANESTSICA
MATERIAL PARA CAUTERIZAO DO DEFERENTE MATERIAL PS-OPERATRIO
consiste de uma fonte de calor (podendo ser uma lmpada incandescente) e de uma caixa individual, para o animal, com comida e gua. A cama utilizada dever ser de papel ou material similar para o aumentar o conforto do animal e reduzir o estresse ps-cirrgico.
Desse modo, munindo-se do material acima citado, pode-se partir para a cirurgia. Inicialmente, administrase o anestsico no animal via intraperitonial, a fim de sed-lo. Faz-se ento uma inciso no abdmen, a aproximadamente 1 cm acima do pnis. Utilizando as pinas de ponta romba, resgata-se o ducto deferente e, com a pina relojoeiro, previamente aquecida, procede-se com a cauterizao. O testculo ento forado a retornar posio anatmica, fazendo-se uma pequena presso com os dedos indicadores sobre o abdmen, de forma a permitir que o testculo retorne bolsa escrotal. O mesmo procedimento utilizado no outro deferente. Finalmente, sutura-se o peritnio e a pele, e o animal transferido para uma gaiola prxima a uma fonte de calor. O camundongo ento acompanhado em seu ps-operatrio pelo perodo mnimo de dois dias (Fig. 7). Figura 7 Desenho esquemtico da cauterizao do deferente
INCISO E EXPOSIO DOS DUCTOS DEFERENTES
PINA AQUECIDA
DUCTOS CAUTERIZADOS
PREPARO DA FMEA DOADORA

A fmea doadora de embries geralmente oriunda das colnias de fundao e por esta razo apresenta um custo elevado. A otimizao de seu acasalamento , portanto, bastante desejvel. Para atingir um grau mximo de aproveitamento reprodutivo, so utilizados hormnios sexuais que induzem a fmea a um ciclo exgeno.
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Sob o efeito dos hormnios folculo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), um nmero bastante elevado de vulos produzido e liberado para estarem disponveis fecundao. Normalmente, a dose de 5 UI suficiente para a produo de um elevado nmero de embries. Entretanto, em virtude da constituio gentica do camundongo (linhagem), certos ajustes se fazem necessrios. Essa etapa do processo (estimulao da fmea via hormnios), tambm chamada superovulao, apresentada na figura seguinte. Figura 8 Etapas do processo de superovulao
Dia 1 44 46 hs Administrao de PM SG s 1 8:00 h Dia 3 Administrao de HCG s 16 :0 0 e acasala mento Dia 4 Verificao de Plug (tampo) vag inal pela musculao s 8:00 *
Dia 5 Embries em estg io de 2 clula s
Dia 6 Embri es em estg ios de 4 ou 8 clula s
Dia 7 Embri es em est gio de M rula
(*) No caso de ratos, a confirmao da cpula se d pela procura de espermatozides em lavagem da vagina da fmea com soluo PBS e observao em microscpio.
COLETA DE EMBRIES
Aps o processo de superovulao, a fmea colocada na presena do macho para que a cpula se processe e os embries possam ser coletados. Diferentes estgios de desenvolvimento embrionrio podem ser utilizados. Porm, os mais utilizados, tanto para congelamento quanto para o implante, so os embries de 2 a 8 clulas. Esses estgios so conhecidos como pr-implantao e esto ainda no interior do oviduto, migrando em direo ao tero onde a gestao se desenvolveria (Figs. 9 e 10). Figura 9 Estgios de pr-implantao na embriognese de camundongo
1 clula 2 clulas 3 clulas
4 clulas
8 clulas
16 clulas
mrula
blastocisto
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Figura 10 Estgios de desenvolvimento de embries no oviduto

INFUNDIBULUM OVRIO
BOLSA OVARIANA
FECUNDAO 2 CLULAS 4 CLULAS 5 A 8 CLULAS MRULA BLASTOCISTO
Para a coleta dos embries presentes no interior do oviduto, so necessrios os seguintes materiais: INSTRUMENTAL CIRRGICO tesouras ponta romba e ponta fina, pinas ponta romba e relojoeiro, seringa e agulhas especiais para a lavagem do oviduto a partir do infundbulo com injeo de meio de cultura; INSTRUMENTAL DE COLETA capilares de manipulao, placas de Petri estreis, meio de coleta. A tcnica de coleta (Fig. 11) acontece como se segue: sacrifcio da fmea normalmente executado por deslocamento cervical, uma vez que esse mtodo rpido e indolor, alm de no causar maiores danos aos embries. Certas drogas, uma vez presentes na circulao, podem atravessar a barreira placentria e causar danos aos embries, comprometendo a sua viabilidade; abertura da pele e do peritnio para o resgate dos cornos uterinos, em cuja extremidade se encontra o oviduto; retirada do oviduto com um tesoura de ponta fina; lavagem do oviduto com o meio de coleta. Figura 11 Diagrama esquemtico das etapas de coleta
FMEA SUPEROVULADA DOADORA DE EMBRIES RIM
GORDURA OVIDUTO OVRIO TERO OVIDUTO CORNO UTERINO
RETIRADA DOS OVIDUTOS
VAGINA
SEPARAO DO OVIDUTO LAVAGEM DO OVIDUTO COM MEIO DE CULTURA DEPOSIO DOS EMBRIES EM PLACA COM MEIO DE CULTURA
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Terminado o processo acima descrito, os embries coletados so avaliados quanto as suas caractersticas morfolgicas e separados para um dos trs procedimentos: transferncia a fresco, congelamento e cultivo de embries.
TRANSFERNCIA A FRESCO
a tcnica recomendada para substituir a histerectomia tanto para a obteno de animais axnicos quanto para a descontaminao de colnias comprometidas. Em ambos os casos, os embries coletados so transferidos para diferentes placas com meio de coleta. Essa transferncia seriada, constituindo-se de passagens sucessivas de uma placa a outra. A tcnica permite que a superfcie do embrio (zona pelcida), seja lavada, retirando-se, por arraste mecnico, patgenos que estejam em sua superfcie. Aps a terceira passagem, e uma vez limpos, os mesmos so recolhidos e implantados em fmeas receptoras isentas de patgenos.
CULTIVO DE EMBRIES
O cultivo feito por meio da seleo de embries e da sua posterior transferncia para uma placa contendo meio apropriado. A placa com os embries colocada em uma estufa de CO2 com os seguintes parmetros de ambiente: 4% a 5% de CO2 temperatura de 37 oC umidade relativa de 90% Os embries sero observados por um perodo de 12 a 14 horas para que seu desenvolvimento possa ser acompanhado. Desse modo, pode-se obter a certificao das rotinas adotadas, da qualidade dos meios de cultura etc. Pode-se tambm fazer anlises dos ajustes na tcnica de acordo com as exigncias das diferentes linhagens. Um dos maiores indicadores da eficincia da rotina utilizada a porcentagem de embries que conseguem se desenvolver. Entretanto, para essa anlise, devem ser utilizados embries de 2 ou 4 clulas, preferencialmente oriundos de linhagens, cujos resultados anteriores sejam bem estabelecidos e sirvam como controle.
CONGELAMENTO DE EMBRIES (Fig. 12)

Os embries coletados so submetidos ao processo de congelamento para que possam ser estocados em botijes com nitrognio lquido (contineres), constituindo assim o banco de embries. Como j foi discutido, os representantes das linhagens estaro com sua condio original preservada, ou seja, livres de patgenos, contaminaes ou de deriva gentica. Em condies normais de estocagem, o nitrognio lquido do botijo atinge uma temperatura de -196 oC. Nessa temperatura, qualquer atividade metablica do embrio ou de eventuais patgenos cessada, fazendo com que o banco seja o local mais seguro para a proteo das linhagens. Para que o congelamento de embries seja bem-sucedido, necessrio que o meio utilizado os desidrate gradualmente, evitando que a gua em seu interior se cristalize (devido as suas pontes de hidrognio), o que poderia causar a ruptura da zona pelcida e, conseqentemente, sua morte. Assim sendo, no processo de congelamento, o embrio colocado em um meio levemente hipertnico, o qual promover uma retirada parcial da gua de seu interior em decorrncia da diferena no potencial osmtico (a membrana semipermevel) entre o meio intra e extracelular. A substncia adicionada ao meio de cultura do embrio para que esse fenmeno ocorra chamada de substncia crioprotetora. Diferentes substncias crioprotetoras podem ser utilizadas, dependendo da espcie animal com que se est trabalhando. Para embries bovinos, por exemplo, o crioprotetor ideal o glicerol. J para embries humanos e de camundongos, o mais utilizado o propileno glicol.
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H, basicamente, duas metodologias de congelamento. A primeira delas compreende o congelamento rpido com a colocao dos minitubos nos quais os embries esto acondicionados em contato direto com o nitrognio lquido. Esse processo conhecido como vitrificao. Porm, apesar de apresentar bons resultados no caso de embries bovinos, a vitrificao pode causar danos a embries cujas caractersticas lhes conferem uma menor resistncia (em murinos, por exemplo). Assim, pode-se utilizar uma segunda metodologia, conhecida como congelamento gradual, que proporcionar melhores resultados. No congelamento gradual, tambm conhecido como por etapas, embries cuja zona pelcida menos resistente tero tempo de perder temperatura sem que ocorra uma ruptura de sua cpsula. Na verdade, no processo gradual, ocorre a perda de gua por parte do embrio juntamente com o decrscimo de sua temperatura. Uma vez coletados os embries, o material necessrio para o congelamento gradual o seguinte: consiste de capilares de manipulao de embries (confeccionados por meio do alongamento de pipetas Pasteur previamente aquecidas, de modo a formar um capilar de vidro com dimetro aproximado de 120 micrmetros), placas de Petri (plsticas descartveis); MATERIAL DE ACONDICIONAMENTO minitubos prprios para guardar os embries, botijo com nitrognio lquido, magazines para o armazenamento de minitubos no interior do botijo; MATERIAL QUMICO soluo crioprotetora (de concentrao conhecida) adequada espcie utilizada; MATERIAL DE CONGELAMENTO banho refrigerado com controle de temperatura. Os banhos devem ser programveis e permitir um decrscimo controlado.
MATERIAL DE MANIPULAO
O processo de congelamento em etapas (Grfico 1) inicia-se com a adio da soluo crioprotetora ao meio e este ao minitubo. A partir da, os embries so retirados da placa contendo meio de cultura e, com o auxlio de um capilar, colocados no interior do minitubo. Este, ento, levado ao banho refrigerado que executar a diminuio gradual da temperatura. Logo, o minitubo estar congelado e poder ento ser colocado no reservatrio de nitrognio lquido, onde poder ser mantido por tempo indeterminado, desde que o nvel de nitrognio seja periodicamente acompanhado e completado quando necessrio. Grfico 1 Temperatura em razo do tempo no congelamento gradual
T oC
0 C - 6 C
EMBRIES EM MEIO DE CULTURA SEM CRIOPROTETOR
Figura 12 Esquema da rotina de congelamento de embries realizada em criopreservao para a formao do banco de embries
CAPILAR DE COLETA DE EMBRIES
EMBRIES NO CAPILAR
- 32 C
tem po
EMBRIES NO MINITUBO COM CRIOPROTETOR
MINITUBOS COM EMBRIES COLOCADOS NO BANCO RESERVATRIO DE N2 LQUIDO
MAGAZINES CONTENDO MINITUBOS COM EMBRIES
CANISTER PARA ARMAZENAR MAGAZINES COM MINITUBOS
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DESCONGELAMENTO DE EMBRIES
O processo de descongelamento deve ser realizado com cuidados, para no danificar os embries. O crioprotetor deve ser retirado para que o embrio seja hidratado novamente. Porm, essa reidratao deve acontecer tambm de uma forma gradual, com o intuito de se evitar que o embrio absorva gua em excesso e se rompa. Para tanto, retira-se o minitubo do reservatrio de nitrognio lquido, esperando at seu descongelamento total (pode-se utilizar uma simples frico manual para acelerar o processo). Coloca-se o contedo do minitubo em uma placa estril. Finalmente, inicia-se a diluio do crioprotetor em meio de cultura para a restaurao do potencial osmtico original do embrio (Fig. 13). Executado o descongelamento, os embries podero ser cultivados ou diretamente implantados em fmeas receptoras programadas, como ser descrito a seguir. Figura 13 Procedimento para descongelamento de embries
BANCO DE EMBRIES RESERVATRIO COM NITROGNIO LQUIDO
CANISTER
MAGAZINE COM MINITUBOS MINITUBOS COM EMBRIES MEIO COM EMBRIES E CRIOPROTETOR
MEIO SEM CRIOPROTETOR
DILUIO CRIOPROTETOR DILUIODO DO CRIOPROTETOR BALANO OSMTICO OSMTICO BALANO EMBRIES REHIDRATADOS EMBRIES REIDRATADOS
IMPLANTE DE EMBRIES
Uma das possibilidades de utilizao dos embries descongelados o implante. Por meio dele, uma fmea receptora pseudoprenhe recebe embries de uma doadora. A pseudoprenhez alcanada com a colocao da fmea receptora para que acasale com um macho vasectomizado, conforme j descrito acima. Esse procedimento promove alteraes fisiolgicas que aumentam o sucesso da tcnica. O implante um processo cirrgico bastante delicado e exige os seguintes materiais: pinas relojoeiro e de ponta romba, tesouras de pontas romba e fina, tesoura porta-agulha, agulha para sutura, linha de algodo para sutura da pele, bisturi, agulha e seringa para administrao de anestsico, gaze e filtros de papel;
MATERIAL CIRRGICO
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preferencialmente deve-se utilizar para camundongos o 2-2-2-tribromoetanol (Avertim) diludo em lcool isoamil tercirio, injetado intraperitonialmente; MATERIAL PARA MANIPULAO E IMPLANTE DE EMBRIES placas de Petri plsticas estreis e descartveis, capilar de implante (que deve ser mais curto e delgado do que o utilizado para a manipulao); MATERIAL PS - OPERATRIO fonte de calor (lmpada incandescente) para o ps-operatrio. Acompanhamento da prenhez.
SUBSTNCIA ANESTSICA
Para a execuo do implante (Fig. 14), anestesia-se a fmea e, ento, se faz uma pequena inciso dorsal na altura correspondente aos rins. Utilizando a pina de ponta romba, aps a abertura do peritnio, resgata-se o oviduto, puxando-o pela gordura adjacente. Com as pinas relojoeiro, rompe-se cuidadosamente a bolsa ovariana, expondo o ovrio e o infundbulo. Introduz-se o capilar de implante no incio do oviduto (infundbulo), e se injeta os embries. Aps a devoluo da estrutura a sua posio anatmica inicial, a pele deve ento ser suturada. O animal mantido sob observao em separado de outros para a deteco da prenhez. A tcnica do implante precisa o passo final para o repovoamento de uma colnia de animais que tenha sido exterminada ou contaminada por um patgeno qualquer. Assim, os embries a serem implantados devem, antes, passar por um processo de anlise e seleo, de modo a diminuir insucessos. Alm disso, deve-se observar se o embrio a ser implantado apresenta caractersticas condizentes com seu estgio de desenvolvimento. A aparncia da zona pelcida, a posio e o tamanho dos blastmeros e a presena ou no de atividade celular so excelentes indicadores de qualidade embrionria. Figura 14 O procedimento de implante de embries em camundongos
FMEA RECEPTORA DE EMBRIES
INCISO DORSAL
AR
EMBRIES
AR
CAPILAR DE MANIPULAO E IMPLANTE DE EMBRIES
PINA GORDURA
OVRIO CAPILAR DE IMPLANTE COM EMBRIES OVIDUTO TERO CORNO UTERINO DA FMEA RECEPTORA
INFUNDIBULUM INCISO
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PRINCIPAIS FATORES LIMITANTES DA CRIOPRESERVAO

Por se tratar de um processo que exige preciso e delicadeza, a criopreservao de embries est sujeita a fatores de interferncia. Os mais importantes so: QUALIDADE DOS MEIOS UTILIZADOS deve-se ter um forte controle sobre os meios de cultura e coleta. Assim, a qualidade dos reagentes utilizados determinante para o sucesso de qualquer tcnica que envolva a manipulao direta de embries. necessrio tambm um conhecimento das caractersticas qumicas e biolgicas dos meios (pH, osmolaridade, temperatura de acondicionamento etc.); ESTOCAGEM os meios devem ser preferencialmente recm-preparados. Nos casos em que isso no possvel, os mesmos devero ser conservados em freezer e em frascos estreis. Entretanto, sempre se deve considerar a sua idade como um fator de interferncia; ADEQUAO DO MEIO o meio de cultura deve ser adequado a espcie de embries a serem cultivados, bem como ao seu estgio de desenvolvimento. Quando no h conhecimento prvio da eficcia do meio, recomenda-se a execuo de ensaios e testes; IDADE DAS FMEAS fmeas doadoras e receptoras podem ser utilizadas em diferentes idades, dependendo da linhagem ou espcie. Deve-se, porm, ter um conhecimento da fisiologia do animal com que se est trabalhando para adequar a idade sua utilizao; CONDIES DE SUPEROVULAO fatores como peso e estresse devem ser considerados no momento da superovulao. A superovulao uma etapa muito crtica para o sucesso da tcnica. Sua resposta diferente entre espcies e muitas vezes dentro da mesma espcie. Como exemplo destacamos a variao no nmero de embries, observada entre camundongos isognicos, porm de linhagens diferentes; ESCOLHA DO CRIOPROTETOR como j foi dito anteriormente, diferentes espcies respondem de maneiras particulares ao de um determinado crioprotetor. Cuidados devem ser tomados e protocolos j existentes devem ser consultados; METODOLOGIA tanto no congelamento quanto no descongelamento, a metodologia aplicada fundamental para a determinao da viabilidade embrionria. Alguns embries respondem melhor a certas tcnicas de congelamento que outros. Assim sendo, deve-se pesquisar em bibliografias adequadas qual a melhor metodologia a ser aplicada espcie que se deseja criopreservar; VIA DE IMPLANTAO o embrio tem um caminho natural no interior do trato reprodutivo da fmea. Assim, o local onde o mesmo ser implantado depender de seu estgio de desenvolvimento. As duas possibilidades so: implante no oviduto ou diretamente no tero; FMEAS RECEPTORAS algumas linhagens respondem melhor ao implante de embries do que outras. Logo, a seleo das linhagens mais propcias a receber embries desejvel. Via de regra, a utilizao de fmeas hbridas reduz a interferncia do background gentico, aumentando sensivelmente o nmero de sucessos.
A MANIPULAO DE EMBRIES E O FUTURO

O futuro da manipulao de embries bastante promissor, em todos os aspectos. Por se tratar de um ramo da cincia em pleno desenvolvimento, novas tecnologias vo surgindo a cada dia, e com elas surgem tambm novas perguntas que exigem respostas. Atualmente, a manipulao de embries est amplamente difundida em diversos ramos da economia, como a pecuria, a indstria farmacutica e nas clnicas de reproduo humana. Com o advento de novas descobertas e tecnologias, a tendncia de uma maior propagao e utilizao dos processos de criopreservao e de manipulao embrionria inegvel. Ainda assim, h muito o que ser descoberto na rea.
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A utilizao de embries para a criao de modelos experimentais transgnicos ganha fora a cada dia, sendo que o mesmo pode-se dizer no que tange aos processos de clonagem, fertilizao etc. Deste modo, o futuro reserva muitos avanos aos bioteristas que escolhem esta rea. Porm, deve-se possuir a tica e o discernimento necessrios a fim de julgar o impacto das descobertas vindouras para a humanidade. A cincia a ferramenta maior de avanos para o ser humano. a maior geradora de conhecimento de nossa civilizao. Porm, esta mesma cincia que salva tambm pode ser usada para destruir. Ser que todos aqueles que estudaram as propriedades do tomo imaginavam que um dia esse conhecimento seria utilizado para a destruio em massa de seres humanos? Da a necessidade de um julgamento lcido e tico acerca das necessidades de nosso mundo. A manipulao de embries pode ser utilizada um dia para salvar espcies ameaadas de extino, para a multiplicao de rebanhos a fim de suprir o crescente aumento populacional e at mesmo para curar doenas. Porm, necessrio tica. Caso contrrio, podemos correr o risco de novamente a cincia criar algo do qual posteriormente se arrepender.
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Analgesia em animais de experimentao
A nalgesia em Animais de Experimentao

INTRODUO
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O termo analgesia , na acepo da palavra, ausncia de dor. No homem, dor e analgesia podem ser avaliadas por meio de relatos verbais sobre a sensao sentida; nos animais, estas s podem ser avaliadas indiretamente, por meio de atitudes comportamentais ou de dados fisiolgicos. Para relacionar a dor nos animais com o que sentido pelo homem, essencial um pouco de antropomorfismo. Como o termo dor se refere a um estado subjetivo, ele s poderia ser aplicado quando se referisse ao homem. Porm, como o homem e o animal apresentam em comum estruturas neurolgicas e processos fisiolgicos, e em virtude da existncia, em animais, de manifestaes comportamentais comparveis quelas observadas no homem quando em estado de dor, tornou-se, no mnimo, eticamente prudente aceitar que o sofrimento animal equivalente ao sofrimento humano quando ambos forem sujeitos a um mesmo fator que induza dor. Por isso, essencial que, na ausncia ou evidncia da dor, se pressuponha que qualquer estmulo ou experincia produtora de dor e desconforto em humanos tambm cause o mesmo efeito nos animais. Esse postulado de analogia deve ser aceito, a menos que sua invalidade seja provada em casos especficos (Lasa, 1990). Seria bem melhor se pudssemos avaliar, com segurana, a dor que sente um animal pelos sinais comportamentais e fisiolgicos apresentados. No h garantias de que se possa reconhecer a dor por meio de comportamentos anlogos, porque avaliar a intensidade de estados subjetivos pode no ser o meio mais correto, em razo das diferenas interespecficas nas relaes entre o estado de dor e as manifestaes comportamentais influenciadas por vrios fatores. No se pode afirmar que um porco que grita quando contido fisicamente sofre mais do que um animal que morre atropelado, porm calado. Se formos comparar mamferos com outros vertebrados, como o peixe, ou com invertebrados, as concluses sobre dor se tornam ainda mais problemticas. A reduo ou alvio da dor considerado, por Flecknell (1994), como um aprimoramento no cuidado dos animais. Devemos saber como avaliar e monitorar a dor, se quisermos que os animais sejam tratados humanitariamente e com tica. Alm das preocupaes ticas, a dor acarreta variveis indesejveis pesquisa, que podem interferir significativamente na interpretao dos estudos. Os pesquisadores e os tratadores de animais devem conhecer o comportamento normal dos animais de experimentao, pois o sucesso ou o fracasso do estudo pode depender da experincia do tcnico em observar os animais para poder minimizar a dor (Montgomery Jr., 1987). Mas, o que a dor? Todos sabemos o que , mas achamos difcil defini-la. A dor definida (Wolfenhson & Lloyd, 1994) como uma experincia emocional e sensitiva desagradvel associada com leso de tecido, potencial ou real. Outros autores dividem a dor em fsica e emocional, definindo a primeira como uma percepo evocada por estmulos que lesionam ou que tm a potencialidade de lesar tecidos, excitando nervos especficos um exemplo a dor causada por intervenes cirrgicas, mesmo quando bem conduzidas. A dor emocional em animais pode ser definida como uma reao emocional
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desagradvel a estmulos internos ou externos que resultam em estado de ansiedade ou frustrao, como, por exemplo, nveis de rudos, incapacidade para controlar seu meio ambiente. Tambm no h palavra para diferenciar a dor tolervel da intolervel. difcil determinar exatamente quando atingido um nvel mximo de dor. O nvel de intolerncia dor aquele em que o animal, se possvel, tenta eliminar ou reduzir o estmulo que a causa. Em lugar de se tentar exaustivamente um conceito indefinvel de dor, deve-se simplesmente estudar os esforos do animal para equilibrar seu ambiente interno e, ento, ajud-lo ou pelo menos no nos intrometermos nesses esforos sem razo plausvel. H vrias respostas estereotipadas dor nos animais, principalmente nos mamferos. As respostas dor variam no s entre as espcies, mas tambm entre indivduos da mesma espcie. As respostas dor se manifestam quando o animal: modifica o comportamento consciente para evitar a situao dolorosa (requer funo de alto nvel do SNC); responde automaticamente para se proteger, ou parte de si mesmo, por exemplo, pelo reflexo de retrao ou de imobilidade; passa a experincia para outros do grupo assegurando, assim, a sobrevivncia de alguns indivduos da populao. Isso pode ocorrer por meio de vocalizao ou da liberao de feromnios, e pode causar estresse aos outros animais prximos, especialmente se estes no puderem reagir como exigido por seu comportamento normal. H vrios fatores que modificam a resposta dor. Estes devem ser considerados quando a dor for avaliada qualitativamente. Dentre outros fatores, podem ser mencionados: Dados individuais do animal, tais como espcie, idade e origem. Eles iro influenciar a resposta do animal aos estmulos dolorosos. Histrico do animal e do estabelecimento. Considere problemas prvios encontrados, o curso dos problemas atuais, o ambiente onde o animal est alojado, os procedimentos que esto sendo executados e os problemas de doenas. Exame clnico do animal para avaliar sua condio atual, devendo ser observado com ateno: os sintomas fisiolgicos, tais como batimentos cardacos, freqncia respiratria, temperatura corporal, tonicidade muscular; os sintomas bioqumicos, tais como nveis de ACTH e endorfinas; os padres de alimentao, por exemplo, quantidade ingerida.
mental: observe se o animal est aptico, deprimido, agressivo ou hiperexcitado, principalmente se tais traos so variveis de seu comportamento habitual. O tcnico encarregado do cuidado do animal , em geral, a melhor pessoa para observar essas alteraes no comportamento. A atividade do animal pode variar desde a inatividade total at a hiperatividade. Observe se h alteraes no andar, na postura ou expresso facial. A vocalizao vai depender da espcie, e h uma grande variedade de sons produzidos por cada uma. O som produzido pode estar fora do alcance da audio humana (ultra ou infra-som) e, portanto, passar despercebido, ao mesmo tempo que causa desconforto a outros animais da mesma espcie. Resposta aos analgsicos: se for administrada uma droga analgsica, e a condio e o comportamento do animal melhorarem, este pode, ento, ser um diagnstico til para constatar que havia dor. Essa somente uma descrio geral de como avaliar a dor qualitativamente; necessrio considerar como quantific-la para poder julgar se necessrio alivi-la, ou se o grau de dor est dentro dos limites aceitveis. Wolfenhson & Lloyd (1994) propem que sejam observados vrios sintomas clnicos para a avaliao da dor, o que ajudaria a indicar se o animal est ou no sofrendo. Esses sintomas so:
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Estado
aparncia; consumo
de gua e alimento; sintomas clnicos; comportamento normal; comportamento provocado. So atribudas notas de 0 a 4, dependendo da intensidade dos sintomas, e a soma total dos pontos de cada sintoma indica a intensidade da dor do animal. O uso desse sistema permite que o animal seja observado mais de perto, e isto faz com que sejam melhores os padres de cuidado com os animais. Lembre-se que, no caso de dvida, em relao a se acabar ou no o experimento, o bem-estar do animal deve vir sempre em primeiro lugar. condio indispensvel que as pessoas envolvidas com o experimento a ser realizado, ou com a criao dos animais, conheam bem o comportamento normal da espcie com a qual esto trabalhando, para que possam avaliar a dor quando esta afetar os animais. Soma (1987) relaciona uma srie de sintomas clnicos e comportamentais que os animais podem apresentar em caso de dor. Quando a dor for aguda podemos ter: tentativa de se proteger, fugir ou morder; GRITOS movimentos; MUTILAO lamber, morder, coar, tremer; INQUIETAO caminhar, deitar e levantar, peso de um lado s; SUDORESE no cavalo; DEITADO perodo de tempo no-usual; CAMINHAR relutncia em se mover, dificuldade para levantar; POSIES ANORMAIS cabea para baixo, abdmen contrado.
POSTURA DE GUARDA
A dor crnica a mais difcil de ser avaliada, e os seguintes comportamentos devem ser observados:
reduo
da atividade; perda do apetite; alteraes da personalidade; esconder-se em um canto; recusa em se movimentar; alteraes na urina; alteraes na consistncia das fezes; falta de higiene pessoal; automutilao. No caso de dor crnica, pode haver um ciclo de dor leso dor difcil de controlar. H uma grande variao nas respostas comportamentais entre espcies e entre indivduos da mesma espcie. Os animais endogmicos (inbred) possuem menor variabilidade individual.
SINTOMAS DE DOR ESPECFICOS DAS ESPCIES
CAMUNDONGO varia entre as diferentes linhagens aumento do tempo de sono; perda de peso/desidratao; piloereo e postura encurvada; isolados do resto do grupo; gritam ao serem tocados.
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RATO
vocalizao; perda
de peso; piloereo/postura encurvada; hipotermia; descarga ocular (cromodacriorria); ato de lamber-se; maior agressividade.
COBAIA
vocalizao; no
resistem quando segurados; no respondem aos estmulos; em geral, sonolentos e sem agressividade.
COELHO diminuio do consumo de gua e alimento; olham para a parte de trs da gaiola; movimentos limitados; fotossensibilidade; acima de tudo, esticos. HAMSTER perda de peso; perodo maior de sono; aumento da agressividade ou depresso; diarria. GATO
perda
do apetite; falta de higiene pessoal; aparncia de demncia; ronronar; vocalizao varivel.
CO
mais
quietos e menos alertas; inapetncia, tremores e respirao difcil; morder o local afetado.
RUMINANTES deprimidos, inapetncia; ranger de dentes; reduo na ruminao e eructao. PORCOS comportamento anti-social; vocalizao.
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RPTEIS contrao dos msculos; perda de peso, anorexia. PRIMATAS NO-HUMANOS pouca reao dor; aparncia miservel, postura encolhida; expresso triste/evitam a companhia; falta de higiene pessoal; inapetncia. PEIXES
movimentos
musculares fortes; comportamento natatrio anormal. Considerando o que foi dito anteriormente sobre dor em animais de laboratrio, h necessidade de evitla e de control-la. A dor , em geral, desnecessria na maioria dos procedimentos cientficos. O uso de analgsicos durante ou aps intervenes dolorosas deve fazer parte integrante dos protocolos de experimentao. Em caso de intervenes cirrgicas, a dor dever ser avaliada para saber da necessidade ou no de se administrar analgsicos. A questo no s a de se administrar um analgsico, preciso reavaliar o quadro para saber se a dor foi controlada. Em certos casos, pode ser que um tipo de analgsico seja contra-indicado, porm difcil no haver nenhum outro vivel para o caso especfico. de grande importncia lembrar e salientar que a dor produz alteraes fisiolgicas que no s dificultam a recuperao do animal como podem tambm afetar seu experimento e bem-estar. Os analgsicos utilizados so de duas categorias: opiides e esterides no-esteroidais (NSAIDS). Quando na avaliao a dor for considerada de moderada a severa, os opiides so as drogas de eleio para produzir o alvio da dor. O perodo de durao de seu efeito , em geral, de quatro horas e h uma grande variedade de opiides disponveis. Estes provocam efeitos hipnticos e analgsicos e tambm depresso significativa nos sistemas respiratrio e cardiovascular, bem como alteraes no sistema termorregulador. Entretanto, os efeitos colaterais no devem ser usados como desculpa para no aliviar a dor, pois estes tm sido evitados utilizando-se uma dosagem menor (Green, 1982). Os opiides mais utilizados em medicina veterinria incluem, mas no se limitam, a (o): droga mais usada. Possui at quatro horas de durao de alvio da dor. Em ces, causa problemas gastrointestinais. Ao contrrio do que se acredita, pode ser usada com segurana em gatos; MEPERIDINE efeito semelhante ao da morfina. usado em ces por no apresentar complicaes gastrointestinais. til em cavalos; FENTANIL combinado com droperidol produz analgesia profunda. Tem curta durao e apresenta menos efeitos colaterais; OXIMORFONE mais potente que a morfina, estabilidade cardiovascular maior que os outros opiides. Muito usado combinado com diazepam ou acepromazina em animais velhos e doentes; ETORFINA mais usado em flechas para imobilizar animais selvagens e de zoolgico. extremamente potente. Tambm usado com sucesso em alguns animais de sangue frio. Esse opiide perigoso para humanos. Reversor: diprenorfina (M5050); CARFENTANIL preferido pelos veterinrios de zoolgicos por sua alta potncia. Pode ser administrado por meio de spray na mucosa nasal ou bucal. Reversor: ciprenorfina (M 285) ou diprenorfina. Fatal para o homem se injetado acidentalmente.
MORFINA
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A maior preocupao com os analgsicos citados antes so os efeitos colaterais: s ocorre nas espcies que vomitam no o caso dos sunos, ovinos, roedores e coelhos; no to significativa em animais quanto no homem; HIPOTENSO.
VMITOS DEPRESSO RESPIRATRIA
Outra contra-indicao o uso de opiides em traumatismo craniano. Os opiides aumentam a presso intracraniana e o fluxo sangneo cerebral em virtude do aumento da tenso de CO 2 como conseqncia de seu efeito depressivo na ventilao. A procura por analgsicos com menos efeitos colaterais do que os agonistas m puros levou ao desenvolvimento de agonistas m parciais e agonistas kappa, como: analgsico sinttico com potncia cinco vezes maior que a da morfina. O grau de sedao ocorre e a depresso respiratria atinge um efeito mximo que no aumenta com o aumento das doses. A analgesia dura de 2 a 5 horas; BUPRENORFINA o analgsico de escolha para os animais de laboratrio. Ao: de 8 a 12 horas. Antagoniza os efeitos depressores dos agonistas opiides.
BUTORFANOL
ANTAGONISTAS OPIIDES
reverte os efeitos dos opiides (isto inclui a analgesia). No produz depresso respiratria ou cardiovascular; NALONORFINE e DIPRENORFINE.
HIDROCLORETO DE NALOXONE
ANTIINFLAMATRIOS NO-ESTEROIDAIS (NSAIDS)

Os antiinflamatrios no-esteroidais so usados no controle da dor de intensidade leve a moderada e so muito teis quando o uso de opiides no possvel. Eles no possuem seno pequena ao analgsica central. A ao dessas drogas reduz a inflamao e, assim, a sensibilidade perifrica.
EFEITOS C OLATERAIS A LTERAM FUNO R ENAL
U LCERAO G STRICA
Os gatos metabolizam esses agentes lentamente e, portanto, no devem ser tratados com freqncia.
Ao de Alguns Analgsicos:
ineficaz para dores viscerais; NAPROXEN usada quando a aspirina no faz efeito; FLUNIXIN maior efeito analgsico, usado para dores osteoartrticas. Causa grandes problemas gastrointestinais no co; DIPIRONA analgsico, antipirtico, antiinflamatrio. Pode acarretar discrasia sangnea; KETOPROFEN e CARPROFEN 30 vezes mais potente que a aspirina. No produzem ulcerao gastrointestinal e so de longa durao (at 24 horas).
ASPIRINA
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CONSIDERAES ADICIONAIS SOBRE O MANEJO DA DOR

importante reconhecer que a dor tem um componente emocional e que sua intensidade est associada presena de outras emoes como, por exemplo, o medo. O uso de analgsicos no dever se limitar somente quando de intervenes cirrgicas ou traumatismos, mas tambm dever ser includo no plano de cuidados com o animal para prover o seu bem-estar.
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Anestesia em animais de experimentao
A nestesia em Animais de Experimentao

INTRODUO
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A principal razo para o uso de anestsicos a de prover a conteno humanitria do animal, visando, tambm, a atingir um grau razovel de relaxamento muscular para facilitar a cirurgia e, principalmente, produzir analgesia suficiente a fim de que o animal no sofra. O sucesso da anestesia no depende somente do tipo de droga, das doses ou das vias de administrao utilizadas. Para que a anestesia se realize de maneira satisfatria, necessrio ter um bom nvel de zelo com o animal, tanto no pr quanto no ps-operatrio, cuidando, inclusive, da reduo do estresse e do controle da dor. Os efeitos de um anestsico devem ser consistentes e passveis de serem repetidos. Alm disso, o anestsico deve oferecer grande margem de segurana tanto para o animal quanto para o operador. Uma anestesia bem conduzida de fundamental importncia para a validade cientfica de qualquer estudo que utilize animais. No caso de um estudo em que o animal tenha de se recuperar da anestesia, este deve retornar a sua normalidade fisiolgica to rapidamente quanto possvel. No poderemos ter, por exemplo, um animal sofrendo de dor, medo, inapetncia, desconforto, hipotermia, hipxia ou acidose respiratria, pois todos estes itens so indicativos de uma anestesia mal conduzida. A anestesia deve interferir o menos possvel com o experimento que est sendo realizado, e no deve alterar os dados que estiverem sendo registrados. Porm, caso haja qualquer alterao, esta deve ser avaliada. Os equipamentos empregados para a anestesia devero ser sempre os mais adequados para a espcie animal a ser tratada.
CUIDADOS PR-OPERATRIOS
Os animais devero ser submetidos a exame clnico meticuloso antes de serem anestesiados. Um animal saudvel e livre de infeces (clnicas ou subclnicas), sobretudo aquelas do trato respiratrio, ter menos problemas durante a anestesia. importante lembrar da sensibilidade individual do animal e de que alguns reagem melhor do que outros anestesia. No necessrio o jejum prvio em coelhos e roedores antes da anestesia, pois esses animais no vomitam; alm disso, os roedores se tornam hipoglicmicos muito rapidamente quando em jejum. necessrio o jejum quando da cirurgia gastrointestinal superior, mas o estmago s ficar completamente vazio se conseguirmos evitar a coprofagia. importante o manuseio cuidadoso do animal, e deve ser feito por pessoa treinada para que o mesmo no sinta medo ou estresse ao ser levado de sua sala para o local de cirurgia.
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MEDICAO PR-ANESTSICA
As finalidades da pr-medicao so:
reduzir
o medo e a apreenso e, com isto, obter uma induo livre de estresse; reduzir as quantidades de outros anestsicos necessrios para induzir a anestesia geral, diminuindo, assim, os efeitos colaterais indesejveis; facilitar a recuperao da anestesia; reduzir a salivao e as secrees brnquicas e bloquear o reflexo vaso vagal, onde ocorre a bradicardia devido intubao endotraqueal e ao manejo das vsceras; reduzir a dor ps-operatria. As drogas utilizadas na pr-anestesia so as anticolinrgicas, os tranqilizantes e os sedativos. Os anticolinrgicos bloqueiam o estmulo parassimptico e diminuem a salivao e as secrees brnquicas; tambm protegem o corao da inibio vagal que ocorre quando as vsceras so manuseadas. A droga de escolha o sulfato de atropina na concentrao de 600 mg por ml. Os tranqilizantes e sedativos produzem efeito calmante sem causar sedao, e no possuem ao analgsica. H grande variao entre as espcies quanto ao efeito dessas drogas. Dentre as mais usadas, temos:
FENOTIAZINAS,
por exemplo, acepromazina e cloropromazina podem causar hipotenso e queda da temperatura corporal; BUTIROFENONAS, por exemplo, fluanisona mais potentes que as fenotiazinas e menos hipotensoras; BENZODIAZEPINAS, por exemplo, diazepam, midazolam excelente sedao, bom relaxamento muscular e potentes anticonvulsivantes; METEDOMIDINA droga relativamente nova. Sua maior vantagem ser rapidamente reversvel, fazendo com que o animal retorne normalidade muito mais rapidamente.
ANESTESIA GERAL
A anestesia uma combinao de narcose, relaxamento e analgesia; sua escolha depende de vrios fatores. Qualquer que seja a droga utilizada, esta afetar a fisiologia do animal de alguma maneira. Em uma anestesia bem balanceada, as drogas so administradas em combinao, incluindo a pr-medicao, os anestsicos e os analgsicos, para poder se chegar a uma melhor estabilidade fisiolgica do animal e, assim, reduzir os efeitos colaterais indesejveis. Diferentes drogas induzem a diferentes estgios em diferentes graus. Deve-se tirar vantagem da grande variedade de drogas anestsicas e das combinaes disponveis, e no se limitar a um ou outro mtodo que pode no ser o melhor para todos os tipos de protocolo experimental, j que diferentes procedimentos exigem diferentes tipos de profundidade e de durao de anestesia. A anestesia dever ser escolhida somente quando todos os fatores que potencialmente podem influenciar o protocolo forem considerados. Em geral, o primeiro passo a ser dado por um anestesiologista saber se o anestsico a ser utilizado dever ser inalvel ou injetvel. H a possibilidade de se usar os dois mtodos: os agentes injetados so usados para a induo e os inalados para a manuteno da anestesia. Quando os agentes so inalados, a anestesia maior. Os agentes inalados so eliminados, principalmente, pelos pulmes, ao passo que os injetados precisam ser metabolizados pelo fgado e excretados pelos rins. Esse processo mais demorado, portanto, mais lenta a volta fisiologia normal, ao controle da hipotermia e ao equilbrio eletroltico. Porm, as novas drogas injetveis tm agentes reversores especficos que apressam a recuperao.
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melhor se ter uma recuperao rpida e prover analgesia ps-operatria adequada do que se ter uma anestesia prolongada. Outros fatores que influem na escolha do anestsico incluem a espcie utilizada, a durao do procedimento, a profundidade da anestesia exigida e a natureza do procedimento.
ANESTSICOS INALATRIOS
A tcnica mais utilizada para anestesiar um pequeno roedor a de coloc-lo em um recipiente contendo algodo embebido no anestsico. Nada menos indicado. Alm do contato direto com o anestsico ser altamente irritante para as mucosas do animal, a concentrao da droga no pode ser medida. Esse modo de conduzir uma anestesia perigoso para o anestesiologista e para as outras pessoas, pois h probabilidade no s de que estes inalem grandes quantidades da droga, mas tambm de perigos de exploso e de fogo, principalmente com o ter. Os agentes volteis devem ser administrados para os animais por meio de um aparelho para anestesia, usando oxignio e xido de nitrognio como transportadores. O laboratrio dever dispor de mquina para anestesia com os seguintes componentes bsicos: cilindros de gs, vlvula de reduo, medidor de fluxo, vaporizador. Essas mquinas podem ser feitas no prprio laboratrio, caso as comerciais sejam muito caras. OBS.: a concentrao do agente voltil no depende do peso do animal, mas do prprio agente. Assim, animais maiores no necessitam de concentraes maiores de anestsico. H vrios agentes volteis disponveis. Dentre esses, os mais comuns so:
METOXIFLURANO produz induo e recuperao lentas. Isso significa grande segurana com boa atividade
analgsica, que se prolonga pelo perodo ps-operatrio; largamente empregado. um lquido no-inflamvel, muito potente, com alto ndice teraputico, sendo, portanto, muito seguro. No irritante para as membranas, o mais barato. Podem ser notados tremores durante a recuperao. Isso se deve a seu efeito depressor cardaco, que reduz a presso sangnea, sensibilizando o corao para os efeitos arrtmicos das catecolaminas; ISOFLURANO mais seguro que o halotano, com pouco efeito nas enzimas hepticas, porm, bem mais caro.
HALOTANO
Outros agentes semelhantes ao isoflurano so o enflurano, desflurano e sevoflurano. Qualquer que seja o agente escolhido, este dever ser usado juntamente com o xido nitroso. Como o xido nitroso possui efeitos cardiovasculares e respiratrios mnimos, usado com o agente voltil para reduzir as concentraes dos agentes, diminuindo assim seus efeitos colaterais. comum utiliz-lo nas concentraes de 60:40 ou de 50:50 com o oxignio para liberar o agente voltil. Aps uma anestesia prolongada, dever ser dado oxignio puro por 5 a 10 minutos, caso contrrio o oxignio poder ser deslocado dos pulmes pelo xido, causando hipxia, abrindo a possibilidade de desencadear um colapso respiratrio. Devemos mencionar o ter, que foi muito utilizado, mas que possui muitos problemas associados ao seu uso: muito irritante para as membranas mucosas, pode exacerbar doenas respiratrias preexistentes, causar perodos de excitao involuntria antes da anestesia, aumentar os nveis de catecolaminas, causando hiperglicemia, e afetar as enzimas hepticas; extremamente explosivo, o que faz com que seja proibido por medidas de segurana.
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AGENTES INJETVEIS
CONSIDERAES GERAIS
Os agentes injetveis so administrados ou por via endovenosa ou outra via parenteral. Em animais de experimentao, o tamanho ou a difcil conteno de alguns faz com que as vias mais utilizadas sejam a intramuscular e a intraperitoneal. Essas vias exigem doses mais altas da droga. necessrio pesar o animal, pois a estimativa de peso em geral pouco precisa. Tambm importante que as drogas usadas em animais de experimentao tenham ampla margem de segurana, no sejam irritantes e possam ser administradas em pequeno volume por meio de seringa com agulha fina (25-27). Em virtude da grande variao na resposta s drogas entre as espcies, linhagens, sexos e indivduos, melhor usar uma droga, ou combinao de drogas, que fornea ampla margem de segurana. A maioria dos agentes injetveis produz pobre analgesia e so insuficientes para cirurgias maiores. A absoro pelas vias intraperitoneal, subcutnea e intramuscular pode ser lenta. Tambm a recuperao lenta e, portanto, os efeitos residuais da droga podem persistir por longos perodos. H tambm um lapso de tempo entre a injeo da droga e a profundidade da anestesia. necessrio, portanto, uma boa avaliao da profundidade desta. Para facilitar a aplicao da injeo em animais mais nervosos, pode ser usado um creme anestsico local (Eutectic Mixture of Local Anesthetics EMLA ou ASTRA), que deve ser aplicado 30-60 minutos antes para dessensibilizar a pele. Dentre os anestsicos injetveis, os barbitricos foram largamente usados, e dentre estes citamos o pentobarbital, tiopental, methohexitono, thiamylal e inactin. Os barbitricos produzem depresso do Sistema Nervoso Central (SNC) e depresso cardiovascular e respiratria acentuadas. O efeito analgsico fraco, exigindo grandes doses. Em geral, a dose letal ligeiramente maior do que a dose clnica. A recuperao tambm lenta e pode estar associada a movimentos convulsivos. So mais usados em concentraes altas para eutansia. Agentes no barbitricos foram desenvolvidos como o propofol, que administrado endovenosamente, age rapidamente, induzindo anestesia suavemente, sem efeitos colaterais e com recuperao rpida; pode ser usado em infuso continuada para cirurgias de longa durao. Pode, ainda, ser empregado com segurana em ratos, gatos, ces, primatas, porcos e coelhos e h possibilidade de ser combinado com uma grande variedade de pr-medicamentos, analgsicos e agentes inalveis. Outro agente injetvel dessa mesma classe que bastante popular o saffan, uma mistura de alfaxalona, esterides e alfadolona. usado em quase todas as espcies animais, menos no co, porque h um componente nessa mistura que causa liberao de histamina e conseqente anafilaxia. o anestsico de eleio para primatas. Dentre os agentes dissociativos, citamos a ketamina, que pode ser administrada em injeo intramuscular ou endovenosa. Em geral, usada em combinao com outros agentes, como a xilazina ou o diazepam, para evitar os efeitos colaterais como tremores musculares. Os analgsicos narcticos so muito potentes, mas podem provocar depresso respiratria. O fentanil tem efeito sedativo em ratos, ces e primatas, mas em camundongos, gatos e cavalos causa excitao. Os analgsicos neurolpticos so combinados com um neurolptico (tranqilizante) ou com um analgsico narctico. Se utilizados sozinhos, produzem depresso respiratria e pouco relaxamento muscular. Porm, se combinados com os benzodiazepnicos, esses efeitos colaterais diminuem sensivelmente. Uma excelente opo de anestesia para roedores e coelhos a combinao de fentanil/fluanisona com midazolam ou diazepam. Os efeitos dos neurolpticos podem ser revertidos por meio de antagonistas como naloxona ou agonistas parciais, como buprenorfina.
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ANESTESIA NO REVERSVEL
Os animais que sero submetidos a procedimentos terminais devero ter os mesmos cuidados que os animais que recebem anestesia para procedimentos cirrgicos com recuperao. Muitas vezes, os procedimentos terminais so mais invasivos e o animal necessita de maiores cuidados. Alguns anestsicos, como o pentobarbital e o hidrato de cloral, somente deveriam ser usados para procedimentos terminais.
ANESTESIA DE LONGA DURAO

Quando for necessria uma anestesia prolongada, temos quatro opes:
dose
nica, com um anestsico de longa durao, como alfa-clorosa; injees intermitentes essencial um bom monitoramento; infuso continuada, via endovenosa, como o fentanil/midazolam; agentes inalatrios com induo anterior.
TCNICAS COMBINADAS
A finalidade do equilbrio anestsico o de minimizar a interferncia causada pelas drogas com a fisiologia animal e de prover uma recuperao suave, rpida e livre de dor. Isso possvel combinando vrios anestsicos como, por exemplo, administrando sedativos antes da induo com um agente inalvel.
ANESTESIA LOCAL
Esta uma outra opo de anestesia, muito utilizada em animais de fazenda. Pode ser feita por meio de infiltrao ao redor da rea da cirurgia proposta ou por meio de bloqueio dos nervos especficos do campo cirrgico. Se for feita injeo epidural ou subdural, a rea de anestesia pode ser bastante extensa. Qualquer que seja o mtodo de anestesia escolhido, essencial manter um alto padro de cuidado com os animais, se quisermos obter dados de pesquisa significativos.
MANEJO ANESTSICO
Quando administradas doses elevadas de anestesia, ocorre a morte do animal. Contudo, se as doses forem insuficientes, o animal sofrer dor. Para evitar que esses dois extremos ocorram, deve-se monitorar as funes respiratria e circulatria, a temperatura corporal e a profundidade da anestesia.
PROFUNDIDADE DA ANESTESIA
O animal anestesiado no est simplesmente dormindo ou morto. Portanto, os animais devem ser monitorados freqentemente, pelo menos a cada 5 minutos ou mais, at que seja atingida a profundidade certa da anestesia. No se pode monitorar somente um sinal isoladamente do resto do animal. O reflexo podal
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o mais comumente usado, alm do da cauda ou da orelha. Essas respostas podem ocorrer se tivermos atingido a anestesia, porm, no indicam a profundidade da mesma. Nesse estado, o animal poder estar em perigo e morrer de colapso respiratrio ou cardiovascular. O monitoramento dos sinais vitais indicar essas alteraes logo de incio, e aes preventivas podero ser tomadas.
RESPIRAO
Devem ser monitorados o padro, a profundidade e o ritmo. O movimento do peito um bom indicador. A cor das membranas mucosas mostra a efetividade das trocas de gases pulmonares. Virtualmente, todo anestsico causa alguma depresso respiratria, que leva hipxia e hipercapnia. possvel haver depresso do ritmo e isso no significa que o animal esteja profundamente anestesiado, mas sim prendendo a respirao. Deve-se verificar sempre se no h obstruo do esfago devido ao acmulo de secrees ou sangue.
SINTOMAS CARDIOVASCULARES
O mtodo mais simples de monitoramento a qualidade e o ritmo do pulso. Um bom teste apertar um pouco a membrana mucosa at que fique plida e verificar o tempo necessrio para voltar ao normal. Se o animal estiver bem, a volta da tonalidade natural da mucosa deve acontecer em 2 a 3 segundos. O colapso cardaco pode ocorrer subitamente, mas em geral ele gradual, devido hipotenso. A perda de sangue e de lquidos pode causar choque hipovolmico e parada cardaca. Em pequenos roedores, a perda de sangue em geral leva morte, j que representa alta proporo em relao quantidade total de sangue do animal. Poder ser feita transfuso sangnea, pois reaes transfuso so raras na primeira vez, e nunca ocorrero se os animais doadores e receptores forem da mesma linhagem endogmica.
TEMPERATURA CORPORAL
Toda anestesia afeta a termorregulao em pequenos animais. Com isso, a temperatura corporal sofre reduo, a menos que sejam tomadas medidas preventivas. A queda exacerbada pelo fluxo de ar frio da mquina de anestesia, pela depilao do animal, pelo uso de preparados frios na pele, pela mesa operatria fria, pela exposio das vsceras durante a cirurgia e pela administrao de fluidos frios. Animais menores tm uma superfcie maior em relao ao volume, e so, portanto, muito susceptveis ao frio. Essa perda de calor pode ser minimizada por meio de insulao com algodo ou l, cama aquecida como Vetbed, ou qualquer outro artefato para reter calor. Lmpadas de calor ou cobertores aquecidos so boas fontes de calor, mas deve-se tomar cuidado para no queimar o animal. importante garantir a manuteno das medidas para prevenir a hipotermia durante todo o perodo de recuperao. Podem ser usadas incubadoras e uma boa cama tambm ajuda; por exemplo, uma feita de papel toalha, Vetbed etc. No deve ser usada serragem de madeira, pois esta pode aderir ao nariz e boca dos animais ou s feridas. A hipotermia a causa mais comum de mortalidade em pequenos roedores, por isso, monitorar a temperatura corporal e tomar as medidas necessrias para prevenir a hipotermia so de vital importncia. Os reflexos oculares so maus indicadores da profundidade da anestesia. Muitas vezes, dependendo da espcie, o reflexo palpebral inexistente em roedores, difcil avaliar, e, em coelhos, ele pode existir at quando a anestesia j est demasiadamente profunda.
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EMERGNCIAS
NA
ANESTESIA
Medidas a serem tomadas em caso de colapso cardiorrespiratrio: limp-las e mant-las livres; ventilar com oxignio 20 vezes por minuto. Se necessrio, usar doxapram; CIRCULAO massagem cardaca.
PASSAGENS AREAS RESPIRAO
Em seguida:
administre
fluidos para recuperar a circulao (lquidos mornos); restaure o ritmo cardaco: para assstole, administre adrenalina, soluo de 1 ml/kg de 1:10000 endovenosa iv; repita aos 10 minutos se necessrio; para fibrilao, administre lignocaina, 1-2 mg/kg, injeo intracardaca. quando o animal estiver estabilizado, continue a ventilao e mantenha a circulao (fluidos e adrenalina).
CUIDADO
COM A
H IPOTERMIA
Trate a acidose ou o edema cerebral, se necessrio. Para a acidose, bicarbonato a 1.5 ml/kg de soluo a 5 por cento, lentamente, por via endovenosa. Para reduzir o edema, utilize corticosterides ou diurticos.
C UIDADOS P S -O PERATRIOS
Todos os parmetros monitorados durante a cirurgia devem continuar a ser monitorados no perodo psoperatrio. O ideal ter uma rea especfica para a recuperao, onde possa ser feito acompanhamento individual. Na rea de recuperao, drogas e equipamentos de emergncia devem estar disponveis. Verificar periodicamente:
calor
e conforto; respiratria; equilbrio de fluidos; perda sangnea cuidado com perdas internas, podem passar despercebidas; perda plasmtica principalmente quando de cirurgias abdominais; diminuio dos fluidos extracelulares por evaporao; urina reduo do volume da urina pode ser causado por desidratao, leso do trato urinrio, ou dor; fezes se o animal no defecar, pode ser devido ausncia de fezes, ou paralisia do leo (hidrato de cloral no rato); peso corporal excelente indicador da recuperao da cirurgia, bem como o consumo de gua e alimento.
depresso
A ateno individual que deve ser dispensada a cada animal depende da espcie. Animais de estimao reagem bem ao contato pessoal, ao passo que ratos e coelhos podem ficar estressados com o contato. A rea de recuperao deve levar em considerao a espcie animal. Luz, temperatura, rudo devem ser adequados. Gaiolas e camas devem prover conforto e manter o animal limpo e seco. Quando o procedimento exigir a imobilizao do animal, ele dever ser mudado de posio periodicamente para evitar a formao de lceras de decbito. Todos os dados devero ser registrados, bem como as drogas que sero administradas. Esses registros devem estar disponveis e so de grande importncia.
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BIBLIOGRAFIA
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E stresse em Animais de Laboratrio

INTRODUO
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Existem vrias definies de estresse: Selye (1976); Ewbank (1973) Fraser, Ritchie & Fraser (1975); Moberg (1985); Broom (1988); Manser (1992). Porm, todos concordam em que o estresse ocorre quando condies adversas produzem respostas fisiolgicas no indivduo. Essa resposta uma tentativa do animal de manter a sua homeostase, ou seja, o equilbrio fisiolgico normal do corpo. Algumas definies incluem certos padres comportamentais que podem ajudar a restaurar a homeostase e, assim, facilitar as adaptaes fisiolgicas ao estresse. Deve-se sempre lembrar que estresse um estado, e que estressor a causa. Em animais de experimentao, o estresse , primariamente, de natureza emocional ou psicolgica. Muitas situaes, que parecem comuns para o homem, so estressantes para animais de experimentao como, por exemplo, a exposio luz muito clara ou a espaos muito amplos. Vrias condies podem causar estresse psicolgico. Entre elas, cabe salientar:
novidade;
estmulos
indutores de medo; fatores sociais; incapacidade de realizar padres normais de comportamento; causas de dor, desconforto e doena; antecipao de dor e desconforto; manejos que levem frustrao ou ao conflito; procedimentos que causem doenas ou indisposio. O estresse inevitvel. O conceito popular diz que o estresse inerente e ruim e que deve ser evitado a todo custo. Entretanto, este parte da vida, e os sistemas biolgicos sofisticados sofreram evoluo para ajudar a conviver com ele. O segredo para proteger o bem-estar animal est em minimizar os custos biolgicos de um estresse indesejvel (Moberg, 1985). Em estresse, h dois termos muito importantes: controle e previso. Dependendo do grau em que o estressor pode ser controlado ou previsto, teremos maior ou menor gravidade dos sintomas de estresse, portanto a gravidade no depende somente do estressor. O estresse pode ser dividido em: o estado em que um organismo se apresenta aps uma diminuio sbita na previso e/ou controle de alteraes relevantes. Nesse caso, os conflitos so curtos e de intensidade exagerada. CRNICO o estado de um organismo quando alteraes relevantes tm baixa previso e/ou no so muito bem controladas por um longo perodo de tempo. Em geral, desenvolvem-se quando os conflitos no podem ser resolvidos e so de natureza mais constante.
AGUDO
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Poder controlar ou no a situao de estresse depende dos mecanismos dos quais o animal dispe para lidar com o desafio, e da atitude que cada indivduo tem sobre a situao. Quando a situao for considerada de perigo para a homeostase, so ativados mecanismos para controlar ou conviver com a mesma. Os mecanismos de adaptao so vrios e no s a reao a um estressor pode variar, como tambm o tipo de reao pode diferir entre indivduos. H dois tipos de reao:
ATIVA PASSIVA
caracterizada por tentar controlar ativamente a situao; caracterizada por uma aceitao passiva da situao.
Em algumas ocasies, podem se apresentar os dois tipos de reao.
CAUSAS DO ESTRESSE
No possvel listar todos os provveis estressores, pois as causas que so estressantes para alguns indivduos no so para outros. Com certeza a dor um dos principais estressores. A funo biolgica primria da dor a de sinalizar leso potencial ou existente de tecidos. O animal, ao sentir dor, tenta elimin-la por meio de posturas ou comportamentos diversos. Porm, quando, apesar de tudo, no consegue, pode apresentar respostas de m adaptao, e estar no s estressado, como tambm em distresse. Alm da dor, h uma gama enorme de fatores que demonstraram ser importantes no desencadeamento do estresse. As causas do estresse no originadas da dor podem ser agrupadas em trs categorias:
mtodos causas
experimentais; ambientais ou ecolgicas; causas internas ou fisiolgicas. Essas categorias so usadas para facilitar a sua interpretao e auxiliar na sua preveno, porm uma no exclui a outra. Por exemplo, o estresse experimental pode se somar a um ambiente inadequado, causando alteraes fisiolgicas ao animal. Os animais de experimentao no vivem em seu hbitat natural e devemos lembrar que, apesar de este ser determinado pelo homem, temos de considerar que tipo de ecologia esse hbitat prov. Deve ser dada ateno natureza de relaes que o animal estabelece com o seu meio ambiente. O animal e o ambiente so entidades organizadas, dinmicas e devem ser vistas em virtude de suas necessidades e objetivos. Com isto, h uma srie de interesses que se mesclam e que nem sempre so compatveis, pois h choques entre os interesses dos animais e os interesses do homem. Por um lado, h uma combinao de preocupaes econmicas e de propsitos da instituio (pesquisa, produo ou exibio), e por outro, o desejo de manter os animais em condies de boa sade, sem estresse, provendo bem-estar aos mesmos. Dentro dessa preocupao humanitria de prover bem-estar animal e de evitar o estresse, a ecologia do animal utilizado deve ser considerada. Como avaliar o ambiente em que est alojado o animal sob a perspectiva ecolgica do mesmo? O julgamento profissional, a empatia e a intuio so indispensveis, mas h normas que nos do informaes objetivas e confiveis a serem seguidas. Em primeira instncia, todos os animais possuem necessidades bsicas quanto a nutrientes, gua, temperatura ambiental, umidade, iluminao, barulho e ciclos de luz e escuro. A importncia desses itens para o bem-estar animal reconhecida e so consideradas como requerimentos para um bom manejo. Outras caractersticas ecolgicas so tambm importantes no estresse. Com base em consideraes ecolgicas, podem ser mencionados seis tpicos considerados mais relevantes para o desencadeamento do estresse:
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Relaes Relaes
com os co-especficos presa/predador
Ninho Arquitetura espacial Alimentao Acontecimentos ambientais
RELAES COM OS CO-ESPECFICOS

ESPAO SOCIAL: o espao que o animal mantm, entre si mesmo e os outros animais, o seu espao pessoal, e ele no tolera intromisso nessa rea, o que o leva agresso contra o intruso. A rea de espao pessoal varia entre as espcies, e o animal , em geral, mais tolerante com o sexo oposto. A tolerncia parece ser menor entre animais do mesmo sexo, animais desconhecidos e animais em idade de reproduo; SUPERPOPULAO: quando o nmero de animais excede o ponto crtico, a interao social atingida, dando incio a agresses e diminuio da reproduo com causas fisiolgicas; ISOLAMENTO: nesse caso, os fatores mais importantes so os que esto relacionados com a idade em que o isolamento ocorre e com experincias sociais anteriores. incontestvel que os animais jovens necessitam do calor e do alimento providos pela me. Tambm necessitam de estmulo de outros animais adultos para que aprendam a desenvolver um comportamento social normal. O comportamento de animais, quando separados desde o seu nascimento, atpico, porm no h trabalhos indicando que esses animais fiquem estressados cronicamente. Entretanto, eles desenvolvem comportamentos de m adaptao, como a automutilao, a timidez ou a agressividade excessiva, a inabilidade de se acasalar normalmente, dentre outros. A separao de recm-nascidos de seus pais faz com que estes procurem substitutos para os mesmos. Se no conseguirem, surgem repostas que indicam estresse. Nos primatas, as mes demonstram reaes emocionais quando separadas de seus filhotes. Tambm h problemas quando da separao entre animais adultos, ainda que estes tenham sido menos estudados do que as relaes filhos/pais. ESTIMULAO SOCIAL POSITIVA: o fato de brincar, fazer a higiene pessoal, ou simplesmente de ficar quieto, quando em contato com outros animais da mesma espcie, so atividades normais de animais sociveis, e possuem efeitos imediatos no aparecimento de emoes. Por exemplo, o ato de limpar um ao outro, ou de se acariciar, pode reduzir rapidamente os sinais de estresse. Apesar de se pressupor que privar os animais do contato com os outros ou de estmulos sociais seja uma grave fonte de estresse, isto no se aplica a todos os animais. O estresse ser menos severo, ou mesmo ausente, se os animais forem pouco gregrios, altamente agressivos, velhos ou acostumados a ter pouco contato com os demais.
RELAO PRESA/PREDADOR
A predao no um problema comum em animais de laboratrio, porm podem surgir comportamentos de presa/predador nas relaes do tratador/animal, e destes com membros de sua prpria espcie. Por isso, de suma importncia o modo como o tratador lida com os animais. Movimentos bruscos podem fazer com que o animal, antes dcil, se torne agressivo e ataque o tratador, alterando as relaes entre ambos. Esse tipo de reao defensiva e comum em animais em cativeiro, ocorrendo geralmente quando o animal est assustado ou com medo. Essa situao pode se tornar causa de estresse. Um caso comum de atitude defensiva a da fmea com filhotes pequenos.
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N INHO
Para que algumas espcies desenvolvam suas funes biolgicas satisfatoriamente, essencial que haja disponibilidade de materiais para camas e ninhos. A presena ou a ausncia dos mesmos pode desencadear o estresse, como, por exemplo, ratos que tm lugares onde se esconder so mais agressivos do que os criados em caixas abertas.
ARQUITETURA ESPACIAL
O espao em que os animais se encontram, a distribuio das atividades em uma rea definida e os tipos de atividade variam com as diferentes espcies. comum se pensar que as gaiolas onde se encontram os animais impedem os mesmos de exercer as atividades tpicas da espcie, por isso, so estressantes e levam ao desenvolvimento de anomalias estereotipadas. Isso possvel, porm um problema que bem mais complexo no pode ser abordado de modo to simplista. Devemos prover um ambiente o mais semelhante possvel quele em que o animal encontra na natureza. Entretanto, em funo da dificuldade de se propiciar ambiente semelhante, devemos considerar benefcios versus custos de construo, de instalao, de higiene, entre outros parmetros, que podem tornar invivel o uso de tais instalaes.
ALIMENTAO
As dietas utilizadas para animais de experimentao so, sem dvida alguma, bem balanceadas, porm no podem ser esquecidos os padres de comportamento alimentar dos animais. O fato de no ter de procurar comida, as preferncias e averses, a freqncia e quantidade das dietas levam a uma monotonia na forma de se alimentar com raes que so oferecidas nas gaiolas. O rato noruegus, por exemplo, onvoro, e em cativeiro s come rao peletizada. Alguns pontos devem ser considerados no quesito alimentao: ADAPTAO: muitas espcies se adaptam com facilidade s alimentaes oferecidas em cativeiro e, desde que adequadamente administradas, tanto qualitativa quanto quantitativamente, no devero ser causa de estresse. RESPOSTA A NOVOS ALIMENTOS: algumas espcies so muito sensveis s mudanas na cor, textura, odor e aparncia dos alimentos. Se forem administrados alimentos novos, estes devero ser introduzidos gradativamente. NECESSIDADE DE VARIAO: a monotonia de comer o mesmo alimento pode levar reduo na ingesto deste e, conseqentemente, ao estresse e perda de peso. Para algumas espcies animais, a variao da dieta pode ser estimulante. TRANSIO DO LEITE PARA O ALIMENTO SLIDO: o desmame e a transio para o alimento slido pode ser muito estressante tanto para a me quanto para os filhotes. A transio dever ser feita pouco a pouco, at que o animal seja capaz de se manter somente com alimentos slidos. PROCURA DE ALIMENTOS: a procura por alimentos parte integrante do comportamento animal e parece independer da necessidade imediata de comer. Porm, poucos estudos tm sido realizados para saber se a privao desse comportamento causa estresse. ESQUEMA DE ALIMENTAO: os animais que estiverem acostumados a receber alimento em horrios predeterminados, quando sofrem mudanas substanciais desses horrios, ficam frustrados e aumentam sua atividade em tpica resposta fisiolgica de estresse.
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CAUSAS AMBIENTAIS
Na sua maioria, os animais em cativeiro esto em posio passiva com relao a acontecimentos ambientais. Os procedimentos de manejo podem ser estabelecidos de modo a minimizar o estresse dos animais, porm estes no tm ou tm pouca influncia sobre como esses procedimentos sero executados. Isso contrasta enormemente com a situao na natureza, onde os animais tm a responsabilidade da manuteno de seu bem-estar. Algumas situaes que demonstraram ser estressantes para os animais de experimentao so, muitas vezes, prticas comuns de manejo. A troca de caixas, conteno fsica, injees, modificaes na rotina so acontecimentos que confrontam o animal com a novidade, a imprevisibilidade e a perda do controle, que so potencialmente estressantes. O transporte conhecido como causador de estresse em animais. Se esse estresse se deve a alteraes no ritmo circadiano, troca de ambiente familiar, barulho e vibrao, temperatura extrema, desidratao ou outro fator, a causa no conhecida. Alm da dor e de doenas, h uma srie de fatores que podem induzir os animais ao estresse. Foram listados apenas aqueles mais freqentes, ressalvando que h necessidade de mais pesquisas na rea.
RESPOSTAS AO ESTRESSE
Manser (1992) sugere que a resposta emocional ao estresse fsico que leva a uma resposta fisiolgica, mais do que o estressor fsico por si s. Quanto menor for o controle sobre a situao que est causando o estresse, mais intensa ser a resposta a este. Como j citado anteriormente, a mesma situao pode dar lugar a diferentes respostas, dependendo do acontecimento poder ou no ser previsto. Principais fatores que influenciam a resposta ao estresse:
meio
ambiente; gentica; sensibilidade individual.

predisposio
Ao se tentar diagnosticar o estresse, bvio que deve-se primeiramente estudar um dos trs meios que o animal possui para responder a uma situao estressante: comportamental, ativao do sistema nervoso autnomo e ativao do sistema neuroendcrino (Moberg, 1985). A resposta comportamental a mais simples e, provavelmente, a reao biolgica mais econmica ao estresse. Um animal pode se livrar de uma situao estressante simplesmente trocando de lugar. Se no for suficiente, ele pode apresentar outros tipos de comportamento, desde a vocalizao at a expresso de comportamentos estereotipados. Certamente que alteraes comportamentais so sugestivas de que est ocorrendo estresse, mas isso no significa que esse estresse seja prejudicial, com exceo de casos extremos, como o de automutilao. Quando a resposta comportamental no alivia o estresse, o animal necessita, ento, alterar seu estado biolgico, evocando os dois sistemas que respondem ao estresse, sistema nervoso autnomo e sistema neuroendcrino. O sistema nervoso autnomo possui respostas rpidas e especficas a muitos estressores, como aumento do batimento cardaco, da respirao, e da secreo de catecolaminas. Muitos estressores alteram a secreo dos hormnios da pituitria, que regulam diretamente a reproduo, resistncia a doenas, desenvolvimento normal e crescimento, todos indicadores de bem-estar. De todas as partes do sistema neuroendcrino, o sistema corticoadrenal tem sido o favorito para monitorar o estresse, pois os glicocorticides (cortisol e corticosterona) so secretados em resposta a uma grande variedade de estressores fsicos e emocionais.
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A resposta ao estresse deve ser considerada segundo as conseqncias do mesmo, isto , o custo que compromete o bem-estar animal. Quadro 1 Modelo para a resposta biolgica dos animais durante o estresse
ESTMULO SNC Percepo do estressor Organizao da defesa biolgica Resposta biolgica (Comportamental, autonmica, neuroendcrina) Alteraes na funo biolgica Estado pr-patolgico Desenvolvimento da patologia
1o Reconhecimento do perigo homeostase
2o Resposta ao estresse
3o Conseqncias do estresse
Fonte: Moberg (1985).
No importa qual o tipo de resposta o animal utilize, sempre ocorre uma alterao na funo biolgica, o que impe um custo, seja este eficiente ou no para ajudar o animal a lidar com o estressor. Um estressor no um risco para o bem-estar s porque evoca um comportamento ou porque o sistema adrenocortical responde. o terceiro componente que conta para efeitos adversos do estresse no animal, e este o verdadeiro perigo para seu bem-estar. a mudana na funo biolgica que ocorre durante o estresse que determina o custo biolgico para o animal. Um estressor somente causa perigo ao bem-estar quando retira recursos biolgicos do animal que o colocam em perigo de desenvolvimento de patologias. A doena no o nico estado patolgico vivel. O animal estar em condies patolgicas se perder sua habilidade de manter suas funes normais, por exemplo, a capacidade de reproduo. Em resumo, podemos dizer que as respostas fisiolgicas agudas possuem duas funes:
estruturar
o organismo de modo que este possa lidar de forma comportamental e fisiolgica com
o desafio;
facilitar o aprendizado e a memria, o que permitir ao animal reagir mais adequadamente a um estressor
semelhante em uma prxima ocasio. De fato, os mecanismos fisiolgicos e neuroendcrinos podem ser considerados como mecanismos bsicos de todos os tipos de comportamento. Portanto, s podem ser usados como parmetros indicativos de distrbios do bem-estar do organismo quando apresentarem desvios, a longo prazo, dos valores normais.
MEDIDAS DO ESTRESSE
A medida a ser utilizada deve ser uma resposta biolgica que tenha um impacto significativo no bem-estar animal. Antes que qualquer medida biolgica (comportamental, autonmica ou neuroendcrina) possa ser usada para medir o estresse, deve ser estabelecido que a alterao causada pelo estresse naquela medida tenha correlao com alterao significativa no bem-estar animal (Moberg, 1985). Apesar de que as alteraes patolgicas podem ser usadas como medida do estresse, esperar para que tais patologias se desenvolvam no representa uma abordagem humanitria para avaliar as condies potenciais do
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estresse. O desenvolvimento de um estado pr-patolgico pode ser o melhor indicador de estresse. Indica que o animal est comeando a sofrer de estresse e que est agora em desconforto. As tcnicas necessrias para medir estados pr-patolgicos existem. So elas: funo imune, sistema reprodutor e alguns tipos de comportamento (Moberg, 1985). Para medir o estresse, devem ser usados mtodos que no causem distrbios ao animal, sempre que possvel, mtodos no-invasivos. Mesmo no havendo manifestaes clnicas de doena, este no um indicador vlido de sade e bem-estar, quando a doena subclnica pode ser demonstrada no post mortem, quando h imunossupresso e quando h sinais de comportamento alterado, frustrao e desconforto. Ao se medir o estresse, melhor usar sempre mais do que um tipo de medida: Alteraes comportamentais Sintomas clnicos Parmetros fisiolgicos Indicadores bioqumicos Achados patolgicos Indicadores imunolgicos
A LTERAES C OMPORTAMENTAIS
Para poder avaliar alteraes de comportamento, necessrio conhecer bem o etograma, o tipo de comportamento normal da espcie com a qual voc vai trabalhar, bem como o comportamento individual do animal. Por exemplo, ratos e camundongos gritam ao serem manuseados, e podem se tornar mais dceis ou mais agressivos quando estiverem sentindo alguma dor. um mtodo no-invasivo de avaliar o estresse. Exige um mnimo de manuseio e de familiarizao com a pessoa que vai tomar conta dos animais. s vezes, conveniente que mais de uma pessoa avalie as alteraes. Uma cmara de vdeo colocada acima da gaiola pode ser muito til na avaliao do comportamento. Alguns parmetros comportamentais que podem ser medidos:
higiene
pessoal; apetite consumo de gua e de alimento; atividade; agressividade; expresso facial; vocalizao; aparncia; postura; resposta ao manejo.
SINAIS FISIOLGICOS
temperatura
corporal afetada pelo estresse, pode ser medida por radiotelemetria;
pulso;
respirao; perda
de peso bom indicador de estresse crnico; contagem de clulas sangneas no um bom indicador; estrutura de clulas sangneas; ritmo cardaco/presso arterial; fluxo sangneo.
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A tabela de Morton & Griffiths (1985) lista alguns sintomas que podem ser medidos:
Cardiovascular
ritmo
cardaco
pulso
diminuio
da circulao perifrica extremidades azuis e frias
Respiratrio
padro
de respirao anormal ofegante secreo nasal

respirao
Digestivo
fezes
alteradas em volume, cor, consistncia vmitos ictercia salivao
Nervoso ou musculoesqueltico
tremores,
convulses paralisia, pupila dilatada reflexos lentos ou ausentes etc.
Miscelnea
edema,
protuses na urina olhos afundados etc.

alteraes
As medidas de ritmo cardaco e de presso arterial so muito teis. Estas podem ser persistentes e se apresentarem elevadas em situaes cronicamente estressantes. Telemetria excelente mtodo no-invasivo, porm caro. Cateteres intra-arteriais tambm so usados.
I NDICADORES B IOQUMICOS
Os parmetros bioqumicos mais utilizados para medir estresse so:
corticosterides
glucocorticides; catecolaminas adrenalina, noradrenalina; tiroxina; prolactna; endorfina peptdeos opiides; hormnios da pituitria anterior; glucagon e glicose;
270
insulina;
vasopressina
hormnios da pituitria posterior; substncia P; atividade da renina plasmtica indicador sensitivo do estresse repetitivo; enzimas plasmticas; neuroqumica; sistema imunolgico; enzimas hepticas e musculares; peptdeo atrio-natriurtico necessita de mais estudos; fator de crescimento neural; lipdeos no muito sensitivo; hormnio de crescimento.
L ESES P ATOLGICAS
So timos indicadores de estresse. Geralmente, essas alteraes ocorrem como conseqncia de persistentes nveis elevados de hormnios de estresse, como catecolaminas e glicocorticosterides. Muitas leses esto associadas ao estresse e devem ser levadas em considerao ao se avaliar o mesmo. tambm um indicador de estresse no-invasivo. H outros parmetros que tambm podem ser medidos no post mortem:
peso
das glndulas adrenais, timo e bao; sangneas; urina; alteraes neuroqumicas no crebro; contedo de catecolamina e enzimas nas glndulas adrenais.
amostras
Alguns achados em virtude do estresse:

ulcerao
gstrica; leses cardiovasculares; leses renais; amiloidose; hipertrofia e hemorragia das adrenais; alteraes msculoesquelticas; acelerao das alteraes retina por causa da idade; alteraes de peso de alguns rgos.
S INAIS C LNICOS
um mtodo no-invasivo de medir o estresse, mas necessita de pessoa capacitada para faz-lo, geralmente um mdico veterinrio. Beynen et al. (1987) mediram os seguintes sinais em vrios trabalhos sobre estresse: atividade exploratria; postura corporal; aparncia do plo; aparncia dos olhos;

271
secreo higiene
de olhos e nariz; do orifcio anal; aparncia da cauda; aparncia das orelhas e patas; resposta palpao do hipocndrio direito (pedras na vescula biliar).
AVALIAO DO ESTRESSE
Ao usarmos os diferentes tipos de medida de estresse, h vrios pontos a serem considerados e que, se negligenciados, podem anular os resultados. Citaremos, apenas para exemplificar, um dos parmetros que podem ser medidos: os glicocorticides. Nas avaliaes bioqumicas, os glicocorticides so muito utilizados, porm somente para estresse agudo; no caso de estresse crnico, a avaliao no vlida porque os nveis de glucocorticides decrescem rapidamente aps elevao inicial. Tambm os glicocorticides no indicam a gravidade do estresse, nem se este de adaptao ou no. Ele afetado pela variao diurna, diferena de sexos, de linhagem e de espcies, e depende de experincias anteriores. medido por meio dos testes: RIA para o plasma, e ELISA para a saliva e a urina. Os nveis de glicocorticides se elevam com o simples manejo. Essa possvel elevao evitada com o manejo adequado. H inmeros parmetros que podem ser medidos, como catecolaminas, hormnios, contagem de clulas sangneas etc., e no nos possvel descrev-los todos aqui. Mas, em todos os casos, h que se ter cuidado ao coletar dados imediatamente aps a ao do estressor, pois sero diferentes daqueles que se apresentarem minutos aps se bem que alguns sintomas de estresse podem levar anos para se desenvolverem. Tambm, dependendo da natureza do estressor, sero ativados diferentes ativadores de estresse, principalmente porque a resposta se adapta funo desejada. Por exemplo: s vezes mais sensato secretar hormnios catablicos (glicocortocides) do que aumentar a atividade. No nada simples avaliar estresse, e h dois problemas bsicos:
as
medidas obtidas so difceis de interpretar; a repetio do estudo leva a diferentes resultados. Ainda h muito por fazer para que possam ser utilizados animais em experimentao sem causar estresse aos mesmos, no s para que no haja variveis nos resultados de nossos estudos, mas principalmente para que possamos prover bem-estar e considerao aos animais que utilizamos.
BEYNEN, A. C. et al. Assessment of discomfort in gallstone-bearing mice: a parctical example of the problems encounterd in an attempt to recognise discomfort in laboratory animals. Laboratory Animals, 21:35-42, 1987. BROOM, D. Needs, freedoms and the assessment of welfare. Applied Animal Behaviour Science, 19:384-386, 1988. FRASER, D.; RITCHIE, J. S. D. & FRASER, A. F. Stress in a veterinary context. British Veterinary Journal, 131:635-662, 1975. MANSER, C. The Assessment of Stress in Laboratory Animals. Hertfordshire: Ed. RSPCA, 1992.
272
MOBERG, G. P. Animal Stress: biological response to stress: key to assessment of animal well being. USA: Ed. G. Moberg, 1985. MORTON, D. B. & GRIFFITHS, P. H. M. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Veterinary Record, 116:431-436, 1985. SELYE, H. The Stress of Life. UK: McGraw-Hill Book Co., 1976.
BIBLIOGRAFIA
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273
Eutansia
E utansia
INTRODUO
serem
30
Por definio, eutansia significa morte sem dor ou sofrimento (do grego euthanasia a morte bela ou feliz). Diversas tcnicas so preconizadas com tal objetivo. Elas devem preencher, sempre que possvel, os seguintes requisitos: humanitrias, no causando terror ou sofrimento ao animal; no impressionar ou sensibilizar as pessoas que assistem ao ato; ter um tempo mnimo para a perda da conscincia; no produzir alteraes que prejudiquem a interpretao das leses; ser um mtodo de fcil aplicao, ao rpida e baixo custo; no ocorrer de o sangue se espalhar pelo local, evitando-se, dessa forma, contaminaes que possam propiciar disseminao de doenas infecto-contagiosas; no oferecer perigo ao profissional que o execute. Seja qual for o mtodo eleito para se praticar a eutansia, ele deve sempre ser executado por profissional habilitado ou por tcnicos treinados e sob superviso. O local onde se realizar a eutansia deve ser afastado e separado de salas ou alojamentos de outros animais. Outro procedimento importante a avaliao da dor e do estresse a que o animal est submetido. Para isso, indispensvel que o profissional responsvel pela eutansia conhea o comportamento do animal e suas respostas fisiolgicas. Sintomas de ansiedade e medo no animal consciente podem ser expressos da seguinte forma: vocalizao angustiada; agitao; aes defensivas; tentativas de fuga; tremores musculares; dilatao da pupila; salivao intensa; mico e defecao involuntrias; sudorese e aumento das freqncias respiratria e cardaca. Porm, nos processos de eutansia, esses sintomas podero estar associados queles produzidos pela induo de anestsicos, quando so observados o delrio, a excitao ou a inibio de atividades. Assim, necessrio medirmos o grau de inconscincia do animal por meio da ausncia dos reflexos palpebrais ou por meio do eletroencefalograma. Considerando a condio dos biotrios, onde se busca uma maior produtividade com menor custo possvel, o descarte de animais indesejveis ao plantel necessrio. A eutansia empregada nos animais doentes, fora do padro gentico e/ou sanitrio, mutilados devido a brigas, com defeitos fsicos, em fase final da vida reprodutiva, idosos ou, ainda, quando proliferam em excesso.
275
MTODOS PARA EUTANSIA

F SICOS
Utilizados quando outros mtodos podem invalidar uma determinada informao ou pesquisa, principalmente aquelas relacionadas com a bioqumica do animal. Para animais de laboratrio convencionais, os mtodos fsicos mais indicados so: DESLOCAMENTO CERVICAL praticados em camundongos, ratos e outras espcies pequenas. um procedimento rpido que consiste no rompimento da medula espinhal do animal e conseqente perda total de sensibilidade e morte. A tcnica se resume em segurar a cauda do animal com uma das mos e com a outra apoiar uma pina de disseco, ou objeto similar, transversalmente sobre sua regio cervical (pescoo). A seguir, pressiona-se firmemente a pina para baixo e para frente, empurrando a cabea do animal, enquanto, simultaneamente, traciona-se a cauda em sentido oposto para trs. Um espaamento de 2 mm a 4 mm entre o cndilo occipital e a primeira vrtebra cervical torna-se palpvel aps o descolamento. Ainda podemos observar alguma atividade muscular, por alguns segundos, mas trata-se apenas de movimentos reflexos, pois a perda total de sensao dolorosa e a morte so imediatas. TRAUMATISMO CRANIANO praticado principalmente em coelhos, cobaias e ratos. uma prtica esteticamente desagradvel e deve ser evitada diante de observadores casuais. Consiste em aplicar um golpe na base do crnio com fora suficiente para produzir depresso do sistema nervoso central. Esse procedimento deve ser realizado por profissionais capacitados, de modo a propiciar a imediata e total perda da conscincia e a insensibilidade dor. Subseqentemente, os principais vasos sangneos devem ser seccionados, o trax aberto e o msculo cardaco incisado. Quando utilizarmos esse mtodo em coelhos, o golpe deve ser aplicado com o auxlio de um basto de madeira e o animal deve estar suspenso pelos membros posteriores e com o corpo distendido. DECAPITAO praticado em camundongos, ratos e outras espcies pequenas. tambm uma prtica esteticamente desagradvel, mas tem efeito similar a uma injeo intravenosa de barbitrico. Pode ser realizada com o auxlio de tesoura ou de equipamento mais apropriado, a guilhotina. Provoca a morte instantnea com imediata perda de reflexos e nivelamento da eletroencefalografia. Vale salientar que o sangue coletado aps a decapitao apresenta-se freqentemente contaminado por secrees salivares e respiratrias. EXANGUINAO praticado em todos os roedores e nos coelhos. Freqentemente utilizado para obteno de soro hiperimune. Os animais devem ser previamente sedados ou anestesiados, pois pode se observar inquietao associada hipovolemia. Caso no seja possvel esse procedimento prvio, devido interferncia indesejveis das drogas, a eutansia deve ser realizada por profissionais bem treinados. A tcnica consiste em realizar uma puno cardaca ou de vasos sangneos de grande calibre at se obter a sangria total. Para animais no-convencionais de laboratrio, vale ressaltar que recomendado a administrao de tranqilizantes em espcies como: ces, gatos, primatas no-humanos e outras, de mdio e grande porte, antes da aplicao de qualquer mtodo de eutansia. Para esses tipos de animais, os mtodos fsicos mais indicados so: TIRO POR ARMA DE FOGO o mtodo exige, por motivos bvios, cuidados por parte do profissional responsvel. indicado apenas para grandes animais. O tiro deve ser dado com armas de calibre 20 ou 22 e desfechado na regio frontal, linha compreendida entre os olhos e a base das orelhas, circunstncia em que o projtil atinge diretamente o encfalo e provoca imediata insensibilidade e morte do animal. A colocao de vendas em cavalos proporciona melhor imobilidade da cabea do animal.
276
Eutansia
ELETROCUSSO uma prtica de pouca aplicabilidade por exigir o emprego de equipamento especial. Deve ser acentuado, no entanto, que a corrente comum de 110 volts se presta bem para a eutansia. Geralmente, esse mtodo utilizado para sacrifcio de peixes e rpteis, no sendo recomendado para gatos. O processo ocorre em duas fases: a administrao do primeiro choque, que passa atravs do crebro e produz a depresso do sistema nervoso central, e o segundo choque, que provoca a fibrilao do corao e o conseqente bloqueio do suprimento de sangue (O2) para o crebro.
Q UMICOS
So os mtodos de melhor resoluo e mais estticos, no causando traumas aparentes ao animal. Podem ser utilizados atravs de agentes farmacolgicos inalantes e no-inalantes. Dentre eles, os mais recomendados esto descritos a seguir.
AGENTES FARMACOLGICOS INALANTES

ANESTSICOS INALANTES incluem o ter, o clorofrmio, o halotano e o metoxiflurano. O ter provoca irritao de mucosas das vias respiratrias, induz salivao excessiva e aumenta a secreo brnquica. Ele determina parada respiratria e o animal deve ser mantido sob o efeito anestsico por mais alguns minutos para confirmao de sua morte. Por ser altamente inflamvel, a utilizao do ter requer cuidados especiais quando do destino da carcaa animal, pois ele continua se volatilizando, podendo causar algum acidente. O clorofrmio no deve mais ser utilizado, j que esto comprovados os seus efeitos txicos sobre o fgado, rins e gnadas masculinas dos animais, e ainda pelo fato de ser carcinognico para o homem. O halotano e o metoxiflurano so muito caros e exigem equipamento apropriado na sua aplicao para evitar desperdcio e contaminao do ambiente, alm da necessidade de um tempo mais prolongado para realizao da eutansia. GASES NO-ANESTSICOS incluem o monxido e o dixido de carbono, o nitrognio e o cianeto. Dos quatro gases o dixido de carbono o mais utilizado e o cianeto extremamente txico e fatal, no sendo recomendado o seu uso em laboratrios. O CO2 no inflamvel nem explosivo e por isso se torna mais seguro, desde que aplicado com equipamento apropriado; de baixo custo e deve ser utilizado preferencialmente com a adio de 30% de oxignio (O2) para reduzir a ansiedade decorrente do desconforto da hipoxia, durante a fase de induo da eutansia nos animais. A utilizao de uma cmara hermeticamente fechada, com a entrada do gs localizada na parte superior, facilita o sacrifcio, principalmente porque o CO2 uma vez e meia mais pesado do que o ar e se concentra na parte inferior do ambiente. A ao do CO2 rpida e tem ao letal por provocar depresso no sistema nervoso central. Como no uso do ter, o animal deve ser mantido por mais alguns minutos na cmara para confirmao de sua morte.
AGENTES FARMACOLGICOS NO-INALANTES

PENTOBARBITAL SDICO E DERIVADOS so os mais utilizados e constituem o melhor mtodo de eutansia. A via de administrao de eleio a endovenosa porque proporciona a morte do animal mais rapidamente. Caso outras vias sejam utilizadas, verifica-se um retardo de tempo do efeito anestsico da droga e, conseqentemente, do tempo para realizao da eutansia. Recomenda-se o dobro ou o triplo da dose anestsica para se obter xito total na prtica. Depois do sacrifcio, que dura em mdia 15 minutos, devese realizar um exame cuidadoso do animal para constatar a sua total parada respiratria e morte.
277
HIDRATO DE CLORAL E CETAMINA ambos so anestsicos dissociativos e, por isso, quando administrados, e j no estado de anestesia, so mantidos os reflexos oculares. A cetamina tem ainda excelente resultado quando combinada com outras drogas, tais como a xilazina e os benzodiazepnicos. Como no uso dos barbitricos, aps a sua aplicao em overdose, deve-se constatar a morte do animal. Quadro 1 Eutansia: mtodos fsicos
ANIMAL Camundongo Rato Hamster Cobaia Coelho Gerbil Gato Co Ovino Caprino Suno Macaco Pombo Aves Domsticas DESLOCAMENTO TRAUMATISMO DECAPITAO TIRO DE ARMA ELETROCUSSO EXANGUINAO CERVICAL CRANIANO DE FOGO A A A A NR A NR NR NR NR NR A* A A NR A NR A A NR NR NR A A NR NR NR NR A A A NR A A NR NR NR NR NR A* A A NR NR NR NR NR NR NR A A A A NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR A A A A NR NR A A A A A A NR A A A A A A NR A
A aceitvel NR no recomendado * Espcies de macaco de pequeno porte. Ex.: calithrix, saimiri.
Quadro 2 Eutansia: mtodos qumicos gases inalantes*

ANIMAL Camundongo Rato Hamster Cobaia Coelho Gerbil Gato Co Ovino Caprino Suno Macaco Pombo Aves domsticas MONXIDO DE CARBONO A A A A A A A A NR NR NR A NR NR DIXIDO DE CARBONO A A A A A A A NR NR NR A NR A A
A aceitvel NR no recomendado * Empregado com o auxlio de uma cmara hermeticamente fechada para que o operador no corra perigo.
278
Eutansia
Quadro 3 Eutansia: mtodos qumicos agentes farmacolgicos no-inalantes

ANIMAL Camundongo Rato Hamster Cobaia Coelho IP Gerbil Gato IP Co IP Ovino Caprino Suno Macaco IP Pombo Aves domsticas A aceitvel OV overdose EV endovenosa BARBITRICOS (OV) A A A A A A A A A A A A A A A A A A VIA IP IP IP IP EV EV IP EV EV EV EV EV EV EV EV EV IP IP HIDRATO DE CLORAL (OV) NR NR NR NR A NR A A A A A A A A IM A IM IM EV EV EV IM IP IP IM VIA CETAMINA (OV) A A A A VIA IM IM IM IM
A A A
IM IM IM
A A
IM IM
NR no recomendado IP intraperitonial IM intramuscular
BIBLIOGRAFIA
ANIMAL WELFARE INSTITUTE. Basic Care of Experimental Animals. New York: Academic Press, 1968. CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Canadian Council on Animal Care: Ottawa, 1984. DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Tcnicos em Bioterismo. So Paulo: Winner Graph, 1996. ORGANIZACIN PANAMERICANA DE LA SALUD (OPS). Animales de Laboratorio: guia para instalaciones y cuidado de animales de laboratrio. Washington, D.C.: OPS, 1965. FUNDAO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ). Departamento de Biotrios/Bio-Manguinhos. Manual para Tcnicos em Animais de Laboratrio. Rio de Janeiro: Setor de Multimeios/Fiocruz, 1994. SANTOS, J. A. & MELLO, M. R. Diagnstico Mdico Veterinrio: colheita de material. So Paulo: Nobel, 1976.
279
Descarte de carcaas
D escarte de Carcaas
INTRODUO
31
Em biossegurana, o descarte de carcaas um ato que requer grande senso de responsabilidade por parte do profissional que o est executando. Isso porque toda e qualquer carcaa, esteja ela contaminada por agentes patognicos ou no, considerada resduo slido, classificado como Grupo A, de acordo com a legislao em vigor em nosso pas, expressa atravs da Resoluo no 5, de agosto de 1993, do Conselho Nacional do Meio Ambiente, que se encontra em anexo no final deste captulo (Anexo 1). Resduos slidos do Grupo A (Anexo 2) so, por definio, aqueles que apresentam risco potencial sade pblica e ao meio ambiente devido presena de agentes biolgicos. Mais especificamente, as carcaas de animais, mortos por morte natural ou sacrificados, devem ser destrudas o mais rpido possvel, aps a devida necropsia e colheita de material indicada, evitando-se assim o risco de contaminao do ambiente, por meio dos fluidos e das secrees excretados pelos cadveres, que se transformam em excelentes meios de cultura. O armazenamento de carcaas requer cuidados especiais. essencial o uso de sacos plsticos, com capacidade e resistncia compatveis com o peso das carcaas, devidamente identificados de acordo com a simbologia adotada internacionalmente (Anexo 3). Depois de acondicionadas em sacos plsticos, as carcaas devem ser mantidas em cmaras frias, por no mximo 24 horas, ou em freezers a -18 C, caso no sejam levadas ao seu destino final. A proteo pessoal do profissional que manuseia carcaas de animais fundamental. Uniformes adequados, com luvas e mscara, so recomendveis. A conscincia de que existe risco potencial de contaminao deve estar sempre presente na conduta dos tcnicos. O transporte das carcaas deve ser em sacos plsticos ou caixas hermeticamente fechadas, de forma rpida e segura, evitando-se a contaminao do ambiente atravs de possveis vazamentos de sangue ou outros excrementos do cadver do animal. Quanto ao destino das carcaas, este pode ser de trs formas: aterro sanitrio, autoclavao e incinerao.
ATERRO SANITRIO
Antes de se optar pelo uso de um aterro sanitrio na cidade onde est localizado o biotrio ou o laboratrio de onde proviro as carcaas de animais, devemos nos certificar de que o aterro sanitrio foi construdo dentro de normas preestabelecidas que garantam a qualidade do meio ambiente, no danificando o solo ou poluindo o ar. Dessa forma, no se correr o risco de disseminar doenas e, sim, evit-las.
281
Caso haja possibilidade de construo de um aterro sanitrio no prprio local de origem das carcaas, alguns cuidados devero ser tomados. A rea aberta no deve ser de grande circulao de pessoal nem prxima de outros laboratrios. O buraco cavado na terra dever ter no mnimo 50 cm de profundidade. Deve-se pr uma camada de cal, com 2 cm de espessura, no fundo do buraco. Depois, coloca-se o cadver e se faz uma nova cobertura com a cal. A quantidade de cal utilizada no dever ser menos de 1 kg para cada 10 kg de matria a destruir. Por ltimo, fecha-se o buraco com terra.
AUTOCLAVAO
Neste caso, a carcaa esterilizada e deixa de ser um risco de contaminao e pode-se descart-la em um lixo comum. Quando a carcaa est, sabidamente, contaminada por agentes patognicos, a autoclavao obrigatria antes do seu transporte do laboratrio para o local de descarte. Esse procedimento pode ser dispensado apenas quando existe um incinerador no prprio laboratrio. Dois problemas srios so enfrentados na prtica da autoclavao de carcaas. O primeiro est relacionado com a capacidade limitada das autoclaves, que, geralmente, no suportam um volume muito grande de animais mortos, principalmente quando se trata de espcies de porte mdio ou grande. Nesse caso, uma sada pode ser a autoclavao por etapas, dividindo-se a carcaa em partes, autoclavando primeiro as mais implicadas na contaminao e mantendo-se as demais em freezer at a ltima autoclavao. Outro problema o forte odor produzido durante o processo. Sugere-se, ento, que seja eleito um dia e um horrio na semana para se autoclavar as carcaas, de preferncia, prximo ao horrio de sada do pessoal e/ou na vspera de folgas ou fins de semana. Se necessrio, as carcaas podem ser acumuladas no freezer durante a semana para serem autoclavadas de uma s vez.
INCINERAO
Este o melhor destino para as carcaas. eficiente, seguro e, dependendo do seu modelo, pode servir ainda de fonte de calor para alimentar caldeiras. O local de instalao deve ser de fcil acesso e prximo aos laboratrios que faro uso dele. Requer estudos prvios sobre sua capacidade, ndice de poluio, tipo de combustvel e mtodos de seleo do material a ser incinerado. Vale ressaltar que, por razes bvias, vidrarias, produtos qumicos e inflamveis no podem ser incinerados. O sistema mais moderno de incinerao conta com uma dupla cmara e recuperao de calor. Est provido, tambm, de filtros de manga em sua chamin, que filtra toda a fumaa, evitando a poluio do ar e diminuindo, consideravelmente, o odor. Durante o processo, atinge a calcinao (cinzas) de qualquer matria orgnica, destruindo todos os agentes patognicos possveis, chegando a atingir temperaturas de at 1.200 oC.
282
Descarte de carcaas
BIBLIOGRAFIA
ASSOCIAO BRASILEIRA 1987.
DE
NORMAS TCNICAS (ABNT). Resduos Slidos; Nbr 10004. Rio de Janeiro: ABNT,
CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE (CONAMA). Resoluo no 5. Ministrio do Meio Ambiente. Braslia, Dirio Oficial da Unio, 1993. MONREAL, J. & ZEPEDA, F. Consideraciones sobre el Manejo de Residuos de Hospitales en America Latina. Washington, D.C.: Opas, 1991. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Urban Solid Waste Management. Copenhagen: WHO, 1991-1993.
283
ANEXO I
Ministrio do Meio Ambiente Conselho Nacional do Meio Ambiente Resoluo No 5, de 5 de agosto de 1993 O CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE CONAMA, no uso das atribuies previstas na Lei no 6.938, de 31 de agosto de 1981, alterada pelas Leis no 7.804, de 18 de julho de 1989, e no 8.028, de 12 de abril de 1990, e regulamentada pelo decreto no 99.274, de 6 de junho de 1990, e no regimento Interno aprovado pela resoluo/CONAMA/no 025, de 3 de dezembro de 1986, Considerando a determinao contida no art. 3 da Resoluo/CONAMA no 006, de 19 de setembro de 1991, relativa definio de normas mnimas para tratamento de resduos slidos oriundos de servios de sade, portos e aeroportos, bem como a necessidade de estender tais exigncias aos terminais ferrovirios e rodovirios; Considerando a necessidade de definir procedimentos mnimos para o gerenciamento desses resduos, com vistas a preservar a sade pblica e a qualidade do meio ambiente; e, Considerando, finalmente, que as aes preventivas so menos onerosas e minimizam os danos sade pblica e ao meio ambiente, resolve: Art. 1o Para os efeitos desta Resoluo definem-se: I - Resduos Slidos: conforme a NBR no 10.004, da Associao Brasileira de Normas Tcnicas ABNT Resduos nos estados slido e semi-slido, que resultam de atividades da comunidade de origem: industrial, domstica, hospitalar, comercial, agrcola, de servios e de varrio. Ficam includos nesta definio os lodos provenientes de sistemas de tratamento de gua, aqueles gerados em equipamentos e instalaes de controle de poluio, bem como determinados lquidos cujas particularidades tornem invivel seu lanamento na rede pblica de esgotos ou corpos dgua, ou exijam para isso solues tcnica e economicamente inviveis, em face melhor tecnologia disponvel. II - Plano de Gerenciamento de Resduos Slidos: documento integrante do processo de licenciamento ambiental, que aponta e descreve as aes relativas ao manejo de resduos slidos, no mbito dos estabelecimentos mencionados no art. 2 desta Resoluo, contemplando os aspectos referentes gerao, segregao, acondicionamento, coleta, armazenamento, transporte, tratamento e disposio final, bem como a proteo sade pblica; III - Sistema de Tratamento de Resduos Slidos: conjunto de unidades, processos e procedimentos que alteram as caractersticas fsicas, qumicas ou biolgicas dos resduos e conduzem minimizao do risco sade pblica e qualidade do meio ambiente; IV - Sistema de Disposio Final de Resduos Slidos: conjunto de unidades, processos e procedimentos que visam ao lanamento de resduos no solo, garantindo-se a proteo da sade pblica e a qualidade do meio ambiente. Art. 2o Esta Resoluo aplica-se aos resduos slidos gerados nos portos, aeroportos, terminais ferrovirios e rodovirios e estabelecimentos prestadores de servios de sade. Art. 3o Para efeitos desta Resoluo, os resduos slidos gerados nos estabelecimentos, a que se refere o art. 2o, so classificados de acordo com o Anexo I desta Resoluo. Art. 4o Caber aos estabelecimentos j referidos o gerenciamento de seus resduos slidos, desde a gerao at a disposio final, de forma a tender aos requisitos ambientais e de sade pblica. Art. 5o A administrao dos estabelecimentos citados no art. 2o, em operao ou a serem implantados, dever apresentar o Plano de Gerenciamento de Resduos Slidos, a ser submetido aprovao pelos rgos de meio ambiente e de sade, dentro de suas respectivas esferas de competncia, de acordo com a legislao vigente.
284
Descarte de carcaas
1o Na elaborao do Plano de Gerenciamento de Resduos Slidos, devem ser considerados princpios que conduzam reciclagem, bem como a solues integradas ou consorciadas, para os sistemas de tratamento e disposio final, de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos rgos de meio ambiente e de sade competentes. 2o Os rgos de meio ambiente e de sade definiro, em conjunto, critrios para determinar quais os estabelecimentos esto obrigados a apresentar o plano requerido neste artigo. 3o Os rgos integrantes do Sistema Nacional do Meio Ambiente SISNAMA , definiro e estabelecero, em suas respectivas esferas de competncia, os meios e os procedimentos operacionais a serem utilizados para o adequado gerenciamento dos resduos a que se refere esta Resoluo. Art. 6o Os estabelecimentos listados no art. 2o tero um responsvel tcnico, devidamente registrado em conselho profissional, para o correto gerenciamento dos resduos slidos gerados em decorrncia de suas atividades. Art. 7o Os resduos slidos sero acondicionados adequadamente, atendendo s normas aplicveis da ABNT e demais disposies legais vigentes. 1o Os resduos slidos pertencentes ao grupo A do Anexo I desta Resoluo, sero acondicionados em sacos plsticos com a simbologia de substncia infectante. 2o Havendo, dentre os resduos mencionados no pargrafo anterior, outros perfurantes ou cortantes estes sero acondicionados previamente em recipiente rgido, estanque, vedado e identificado pela simbologia de substncia infectante. Art. 8o O transporte dos resduos slidos, objeto desta Resoluo, ser feito em veculos apropriados, compatveis com as caractersticas dos resduos, atendendo s condicionantes de proteo ao meio ambiente e sade pblica. Art. 9o A implantao de sistemas de tratamento e disposio final de resduos slidos fica condicionada ao licenciamento, pelo rgo ambiental competente em conformidade com as normas em vigor. Art. 10. Os resduos slidos pertencentes ao grupo A no podero ser dispostos no meio ambiente sem tratamento prvio que assegure: a) a eliminao das caractersticas de periculosidade do resduo; b) a preservao dos recursos naturais; e, c) o atendimento aos padres de qualidade ambiental e de sade pblica. Pargrafo nico. Aterros sanitrios implantados e operados conforme normas tcnicas vigentes devero ter previstos em seus licenciamentos ambientais sistemas especficos que possibilitem a disposio de resduos slidos pertencentes ao grupo A. Art. 11. Dentre as alternativas passveis de serem utilizadas no tratamento dos resduos slidos, pertencentes ao grupo A, ressalvadas as condies particulares de emprego e operao de cada tecnologia, bem como considerando-se o atual estgio de desenvolvimento tecnolgico, recomenda-se a esterilizao a vapor ou incinerao. 1o Outros processos de tratamento podero ser adotados, desde que obedecido o disposto no art. 10 desta Resoluo e com prvia aprovao pelo rgo de meio ambiente e de sade competentes. 2o Aps tratamento, os resduos slidos pertencentes ao grupo A sero considerados resduos comuns (grupo D), para fins de disposio final. 3o Os resduos slidos pertencentes ao grupo A no podero ser reciclados. Art. 12. Os resduos slidos pertencentes ao grupo B devero ser submetidos a tratamento e disposio final especficos, de acordo com as caractersticas de toxicidade, inflamabilidade, corrosividade e reatividade, segundo exigncias do rgo ambiental competente. Art. 13. Os resduos slidos classificados e enquadrados como rejeitos radioativos pertencentes ao grupo C, do Anexo I, desta Resoluo, obedecero s exigncias definidas pela Comisso Nacional de Energia Nuclear CNEM.
285
Art. 14. Os resduos slidos pertencentes ao grupo D sero coletados pelo rgo municipal de limpeza urbana e recebero tratamento e disposio final semelhante aos determinados para os resduos domiciliares, desde que resguardadas as condies de proteo ao meio ambiente e sade pblica. Art. 15. Quando no assegurada a devida segregao dos resduos slidos, estes considerados, na sua totalidade, como pertencentes ao grupo A, salvo os resduos slidos pertencentes aos grupos B e C que, por suas peculiaridades, devero ser sempre separados dos resduos com outras qualificaes. Art. 16. Os resduos comuns (grupo D) gerados nos estabelecimentos explicitados no art. 2, provenientes de reas endmicas definidas pelas autoridades de sade pblica competentes, sero considerados, com vistas ao manejo e tratamento, como pertencentes ao grupo A. Art. 17. O tratamento e a disposio final dos resduos gerados sero controlados e fiscalizados pelos rgos de meio ambiente, de sade pblica e de vigilncia sanitria competentes, de acordo com a legislao vigente. Art. 18. Os restos alimentares IN NATURA no podero ser encaminhados para a alimentao de animais, se provenientes dos estabelecimentos elencados no art. 2o, ou das reas endmicas a que se refere o art. 16 desta Resoluo. Art. 19. Os padres de emisso atmosfrica de processos de tratamento dos resduos slidos, objeto desta Resoluo, sero definidos no mbito do PRONAR Programa Nacional de Controle e qualidade do Ar , no prazo de 180 (cento e oitenta) dias, a contar da data de publicao desta Resoluo, mantendo-se aqueles j estabelecidos e em vigncia. Art. 20. As cargas em perdimento consideradas como resduos, para fins de tratamento e disposio final, presentes nos terminais pblicos e privados, obedecero ao disposto na Resoluo do CONAMA no 002, de 22 de agosto de 1991. Art. 21. Aos rgos de controle ambiental e de sade competentes, mormente os partcipes do SISNAMA Sistema Nacional do Meio Ambiente , incumbe a aplicao desta Resoluo, cabendo-lhes a fiscalizao, bem como a imposio das penalidades previstas na legislao pertinente, inclusive a medida de interdio de atividades. Art. 22. Os rgos estaduais do meio ambiente com a participao das Secretarias Estaduais de Sade e demais instituies interessadas, inclusive organizaes no-governamentais, coordenaro programas, objetivando a aplicao desta Resoluo e garantir o seu integral cumprimento. Art. 23. Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao. Art. 24. Revogam-se as disposies em contrrio, especialmente os itens I, V, VI, VII e VIII, da Portaria/ MINTER/no 053, de 01 de maro de 1979.
Humberto Cavalcante Lacerda

Secretrio-Executivo em exerccio
Fernando Coutinho Jorge

Presidente
286
Descarte de carcaas
ANEXO II
CLASSIFICAO DOS RESDUOS SLIDOS
GRUPO A: resduos que apresentam risco potencial sade pblica e ao meio ambiente devido presena de agentes biolgicos. Enquadram-se neste grupo, dentre outros: sangue e hemoderivados; animais usados em experimentao, bem como os materiais que tenham entrado em contato com os mesmos; excrees, secrees e lquidos orgnicos; meios de cultura; tecidos, rgos, fetos e peas anatmicas; filtros de gases aspirados de rea contaminada; resduos advindos de rea de isolamento; restos alimentares de unidade de isolamento; resduos de laboratrios de anlises clnicas; resduos de unidades de atendimento ambulatorial; resduos de sanitrios de unidade de internao e de enfermaria e animais mortos a bordo dos meios de transporte, objeto desta Resoluo. Neste grupo incluem-se, dentre outros, os objetos perfurantes ou cortantes, capazes de causar punctura ou corte, tais como lminas de barbear, bisturi, agulhas, escalpes, vidros quebrados etc., provenientes de estabelecimentos prestadores de servios de sade. GRUPO B: resduos que apresentam risco potencial sade pblica e ao meio ambiente devido as suas caractersticas qumicas. Enquadram-se neste grupo, dentre outros: a) drogas quimioterpicas e produtos por elas contaminados; b) resduos farmacuticos (medicamentos vencidos, contaminados, interditados ou no utilizados); e, c) demais produtos considerados perigosos, conforme classificao da NBR 10001 da ABNT (txicos, corrosivos, inflamveis e reativos). GRUPO C: rejeitos radioativos: enquadram-se neste grupo os materiais radioativos ou contaminados com radionucldeos, provenientes de laboratrios de anlises clnicas, servios de medicina nuclear e radioterapia, segundo Resoluo CENEN 6.05. GRUPO D: resduos comuns so todos os demais que no se enquadram nos grupos descritos anteriormente. (Of. No 338/93) Tera-feira, 31 AGO 1993 No 166 12994 12997 12998 DIRIO OFICIAL SEO I
287
ANEXO III
S MBOLOS INTERNACIONAIS DE S ADE
DE
M ATERIAIS P ERIGOSOS
PARA
E MBALAGENS
DE
R ESDUOS
DE
S ERVIO
Smbolo Indicativo de Material Infeccioso (Risco Biolgico)
Smbolo Indicativo de Material Radioativo
Smbolo Indicativo de Substncia Txica
Smbolo Indicativo de Materiais ou Substncias Inflamveis
Smbolo Indicativo de Substncia Corrosiva

288
Smbolo Indicativo de Material Explosivo
Fatores que influenciam no resultado do experimento animal
F atores que Influenciam no Resultado do Experimento Animal

INTRODUO
32
Antenor Andrade
A notria contribuio dos animais de laboratrio pesquisa atestada atravs dos grandes avanos na medicina e biologia. Antes de 1900, algumas espcies animais, como ces, coelhos, ovinos e aves, contriburam para as pesquisas na busca do tratamento da raiva, varola, do beribri e outras. A partir de 1900, diversas espcies animais prestaram valiosa contribuio para o tratamento de doenas, desenvolvimento de drogas (anestsicas, antidepressivas, tranqilizantes), desenvolvimento e produo de vacinas e soros, desenvolvimento de tcnicas cirrgicas e de transplantes, descoberta de hormnios (insulina, tiroxina), descoberta do fator Rh, desenvolvimento da quimioterapia do cncer etc. Desde 1980, a contribuio foi marcante na produo de anticorpos monoclonais, na terapia gentica e no desenvolvimento de tcnicas de transplantes de rgos, assim como nas pesquisas em habilidades de comunicao e de comportamento, e na busca da cura da AIDS e da doena de Alzheimer. Na maioria dos pases do mundo, a produo e padronizao dos animais de laboratrio mais utilizados em pesquisas encontram-se em pleno aperfeioamento. Tudo converge para a aquisio de modelos genticos ecolgica e sanitariamente definidos solicitados para a realizao dos trabalhos dos pesquisadores. As tcnicas atuais de engenharia gentica e biologia molecular abriram muitos caminhos para a criao e produo desses animais. A rea dos transplantes de rgos e tecidos evolui a cada dia, bem como a produo de derivados biolgicos para uso em humanos com base na obteno de animais transgnicos. O controle das doenas hereditrias tambm se desenvolve dia a dia. Os animais de laboratrio so utilizados como instrumentos de medida, porm no funcionam como tais, pois possuem sistemas biolgicos sensitivos afetados por fatores internos e externos. Dessa forma, quando realizamos pesquisas em animais, devemos levar em considerao esses fatores, a fim de minimizar a variabilidade e obtermos resultados reproduzveis. Por que os animais de laboratrio so extremamente sensveis influncia externa? Esses animais so mamferos homeotrmicos e realizam grande mudana no metabolismo para compensar as variaes do meio ambiente externo. Essa adaptao provoca alteraes na fisiologia do animal, influenciando diretamente no resultado do experimento. Assim, o pesquisador deve ter sempre em mente esses fatores e controlar todo o meio ambiente externo (macroambiente), tanto quanto possvel.
289
FATORES AMBIENTAIS EXTERNOS

TEMPERATURA
DAS
SALAS
Em se tratando de animais homeotrmicos, eles tentam manter sua temperatura corporal constante. Dessa maneira, trocas da temperatura ambiental resultam em alteraes que afetam o ndice metablico, a circulao sangnea e o comportamento animal. Conseqentemente, a atividade das drogas pode ser influenciada, aumentando ou diminuindo a sua toxicidade. Convm lembrar que a temperatura dentro da gaiola (microambiente) , normalmente, mais alta que a temperatura da sala, de acordo com o tamanho da gaiola e o nmero de animais no seu interior.
T ROCAS
DE
AR
Os animais de laboratrio realizam uma contnua troca de gua, de nutrientes e de oxignio. Perdem, constantemente, calor, umidade, dixido de carbono e outros produtos de metabolismo, que se acumulam no ambiente se no houver ventilao adequada. A principal preocupao com a concentrao de amnia, que afeta o sistema respiratrio, causando infeces e inibindo a atividade das enzimas hepticas. Dessa forma, devemos considerar, tambm, que o nvel de amnia dentro da gaiola mais alto que no meio ambiente da sala.
U MIDADE R ELATIVA
Uma vez que as espcies animais criadas e mantidas em biotrios no transpiram, elas aumentam sua mdia de movimentos respiratrios, perdendo calor. Entretanto, se o ar inspirado pelo animal tem umidade relativa alta, esta prejudica a habilidade do animal em ajustar a sua temperatura corporal. Alm disso, a umidade elevada estimula a produo de amnia na gaiola e, em seu interior, ela cerca de 10% mais alta que na sala.
D IETA
A dieta constitui um fator de grande importncia no experimento, uma vez que a quantidade dos nutrientes aqum ou alm do requerido poder influenciar na resposta animal. Portanto, a dieta deve ser balanceada e padronizada de acordo com a espcie animal. Alm disso, deve ser isenta de contaminantes, pesticidas, herbicidas e qualquer outra substncia qumica, assim como de metais pesados. Porm, no somente a qualidade da dieta importante. No podemos esquecer da quantidade, que precisa ser fornecida ad libitum. Devemos atentar para o fato de que a rao mantida em um depsito no ventilado e, conseqentemente, sob temperatura alta, estocada por longo tempo, poder perder seus componentes essenciais, especialmente vitaminas e determinados aminocidos.
C AMA
O material mais utilizado a maravalha (raspa de madeira); no entanto, quando feita de madeira verde, contm substncia aromtica que pode induzir a produo de enzimas hepticas microssomiais em ratos e camundongos, interferindo em estudos de toxicologia. Alm disso, a madeira pode conter substncias qumicas como inseticidas e fungicidas (agrotxicos), que afetam o animal, comprometendo o seu sistema imune.
290
Algumas madeiras contm, tambm, uma alta atividade de urase, a qual promove a produo de amnia. Desse modo, a esterilizao da cama altamente recomendada, uma vez que o calor destri a urase, mata os germes e reduz o contedo de resinas e leos volteis.
RUDO
O barulho exerce efeito negativo na criao, produo e manuteno de animais de laboratrio. Barulhos altos geram ultra-som, muitas vezes inaudveis para a espcie humana, porm captados pelos roedores. Nas salas de animais, existem vrias fontes de ultra-som, como gua corrente, ranger de rodas dos carrinhos, de portas e cadeiras e de ar-condicionado, que geram presses sonoras consideravelmente altas e irritantes para os animais.
LUZ
Os animais que tm atividade noturna so sensveis luz de alta intensidade. Ratos albinos podem ter suas retinas danificadas e ficarem cegos quando submetidos a uma luminosidade muito intensa. Devemos considerar, tambm, que existem diferenas significativas de intensidade de luz entre a gaiola e a sala de animais, bem como o tipo de gaiola utilizado (se transparente ou opaca). No podemos esquecer que experimentos realizados no perodo da noite no devem ser interrompidos com luz, uma vez que podem apresentar efeito adverso.
AMBIENTE SOCIAL
B IOTERISTA
Observaes de comportamento animal indicam que eles conhecem seu tratador pelo cheiro. Dessa forma, no devemos trocar o bioterista prximo do incio ou durante o experimento. Est comprovado, tambm, que pessoas estranhas equipe, quando presentes no interior da sala, podem causar alteraes fisiolgicas significativas nos animais. Por exemplo: animais submetidos a testes de substncias pirognicas podem ter sua temperatura elevada, independente da substncia em teste.
G RUPO S OCIAL
Os roedores so animais que vivem em grupo social e estabelecem grupos estveis que no devem ser dissociados prximo ou durante o experimento. Qualquer troca dentro do grupo determina um esforo para a formao de novos grupos.
T AMANHO
DO
G RUPO
O tamanho do grupo tambm muito importante e precisa estar relacionado rea disponvel. Assim, o espao requerido por diferentes espcies deve ser respeitado, uma vez que, em casos de superpopulao, haver competio, estresse e at morte, prejudicando o resultado do experimento.
291
AMBIENTE BIOLGICO
I NFECES V IRAIS
Infeces por microorganismos patgenos exercem forte influncia em muitos experimentos. Infeces virais so de especial importncia, uma vez que so difundidas e, freqentemente, no identificadas; influenciam no sistema imune do animal, prejudicando a sua resposta.
I NFECES B ACTERIANAS
As infeces bacterianas, com freqncia, causam a morte dos animais, porm existem infeces crnicas causadas por Pseudomonas ou Bordetella que interferem, sobretudo, em pesquisas respiratrias.
I NFECES P ARASITRIAS
As infeces parasitrias (verminoses) podem causar alteraes imunolgicas e metablicas no hospedeiro. Em conseqncia disso, os animais devem ser criados e mantidos sob barreiras sanitrias, com monitoramento peridico para esses organismos, a fim de se obter resultados satisfatrios.
INFLUNCIA DO EXPERIMENTO
MEDO
No podemos esquecer que os animais so usados como instrumentos, mas no so. Seu sistema sensitivo faz com que reajam ao manuseio, ao transporte ou a qualquer mudana que lhes seja imposta, uma vez que no sabem o que realmente est ocorrendo. Dessa forma, reagem com ansiedade, pnico e at mordida se so agarrados e imobilizados. Embora o medo provoque mudanas nos parmetros fisiolgicos, incluindo presso sangnea e freqncia respiratria, tais reaes so causadas pelo estresse hormonal, a catecolamina. A fim de reduzir o medo, deve-se propiciar uma gradual adaptao do animal em benefcio dos resultados do experimento.
T CNICA
DO
E XPERIMENTO
Diferentes tcnicas induzem o animal a diferentes reaes. Os resultados tero variaes conforme a tcnica utilizada e o tempo de exposio do animal, o que provocar maior ou menor estresse.
T RANSPORTE
Qualquer transporte causa estresse ao animal, o que significa mudanas de seus dados fisiolgicos. Portanto, deve ser feito nas melhores condies e no menor tempo possvel.
292
FATORES AMBIENTAIS INTERNOS

P ADRO G ENTICO
O resultado do experimento depende da linhagem utilizada. Assim, deve-se obedecer ao padro gentico especfico para determinado trabalho. Alguns trabalhos exigem animais consangneos e outros no-consangneos, o que definido por meio de protocolos experimentais.
S EXO
Machos e fmeas reagem de forma diferente em presena de determinadas drogas. Entretanto, testes de toxicidade podem ser feitos em ambos os sexos sem problema. As fmeas necessitam de mais tempo que os machos para se recuperar aps a aplicao de pentobarbital sdico. O ciclo estral pode influenciar no resultado dos testes, uma vez que nessa fase a fmea libera grande quantidade de hormnios.
I DADE
A atividade das drogas no organismo varia conforme a idade do animal. A atividade das enzimas hepticas decresce em animais mais velhos. Dessa forma, a idade um fator preponderante que deve ser levado em considerao de acordo com o trabalho a ser realizado.
V ARIAES C IRCADIANAS
Presume-se que exista uma estrutura ou funo no corpo do animal que esteja estreitamente ligada ao ritmo circadiano; quando este sofre variaes, h uma sria interferncia no experimento. Sabemos que o estmulo da luz produz variaes nos nveis hormonais dos animais; assim, o ciclo reprodutivo de muitas espcies controlado pelo ritmo circadiano (durao do dia) que lhe imposto. Trabalhos comprovam que a mesma dosagem de uma determinada droga aplicada na mesma espcie animal em horas diferentes tem efeito desigual. Portanto, em pesquisas, a hora de um experimento deve ser especificada, e, caso inoculaes sejam feitas repetidamente, estas devem ocorrer sempre na mesma hora do dia.
CONCLUSO
Os animais de laboratrio no podem escapar das condies que lhes oferecemos, no que se refere aos fatores aqui abordados. Assim, sabedores de que eles reagem diferentemente a cada estmulo e necessitam de determinado tempo para adaptao s variaes que lhes so impostas, devemos levar em considerao o quanto so sensveis e o quanto devemos manuse-los cuidadosamente para assegurar a sua sade e a experimentao.
293
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. STEPHENS, U. K. & PATON, N. M. (Eds.). Manual for Laboratory Animal Technicians. USA: Ed. The American Association for Laboratory Animal Science, 1984. SAIZ MORENO, L.; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratorio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto Nacional de Investigaes Agrrias/Ministrio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1983.
294
Tcnicas de risco desenvolvidas na experimentao com roedores
T Experimentao cnicas de Risco Desenvolvidas na com Roedores

INTRODUO
33
Octavio Augusto Frana Presgrave
A maioria dos desenhos experimentais, sejam eles utilizados no desenvolvimento de novas drogas, sejam no controle da qualidade de produtos acabados, utiliza animais de laboratrio, sendo os mais comuns os roedores (ratos, camundongos etc.) e os lagomorfos (coelhos). Quando lidamos com esses animais, temos de ter em mente no apenas a proteo dos mesmos como tambm a nossa prpria proteo, e ainda, os resultados a serem obtidos. Os requisitos dessa proteo independem do padro sanitrio dos animais utilizados nos experimentos; todos os procedimentos e cuidados que se seguem devem, obrigatoriamente, ser usados em qualquer tipo e etapa do manuseio com os animais. s vezes, torna-se muito repetitivo quando se fala em biossegurana, medidas de proteo etc., tendo em vista que, quase sempre, essas regras, normas e conceitos se aplicam em vrios casos, sempre da mesma forma. At mesmo porque muitas das medidas de proteo no se referem somente ao uso desses animais ou de quaisquer outros e, sim, tratam de medidas que se devem tomar para qualquer tipo de trabalho no laboratrio. Os principais riscos que corremos quando trabalhamos com roedores e lagomorfos, reside na possibilidade de ocorrncia de mordidas e arranhes. Obviamente que, como conseqncia disso, podemos sofrer algum tipo de contaminao, dependendo do material com que estamos administrando os animais. Apesar de geralmente estarmos trabalhando com animais convencionais controlados ou outro padro sanitrio superior, no podemos afastar o risco de uma contaminao veiculada pelo prprio animal. Isso se torna mais claro no trabalho com animais silvestres. Todo trabalho conduzido com animais de laboratrio deve ser feito com o uso obrigatrio de EPIs (Equipamentos de Proteo Individual) e, sempre que exigido, EPCs (Equipamentos de Proteo Coletiva), conforme descrito a seguir.
EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL

LUVAS
essenciais para a proteo das mos, evitando o contato com urina e fezes desses animais, excretas essas que podem ser carreadoras de microorganismos provenientes da administrao ou metablitos de substncias injetadas, com potencial risco de danos sade do manipulador ou de quem lida com este diretamente, sejam colegas de trabalho, sejam familiares. O uso de luvas impede a disseminao de contaminantes, uma vez que as mesmas devem ser retiradas e descartadas quando no se est em operao com os animais, evitando assim que portas, maanetas e diversos outros objetos sejam contaminados. As luvas normais (de ltex) podem no ser uma boa proteo contra mordeduras de roedores maiores ou arranhaduras de lagomorfos. Para tal, existe um tipo de luva, confeccionada de nitrila, que mais resistente,
295
principalmente quando trabalhamos com coelhos. Uma alternativa, na falta das luvas de nitrila, pode ser o uso de duas luvas sobrepostas. Em alguns casos, pode-se utilizar luvas mais grossas para manusear os animais. O importante que elas mantenham o tato a fim de evitar que se machuquem os animais, quando da sua conteno.
CULOS DE PROTEO OU PROTETOR FACIAL
muito til para se evitar respingos de urina, sangue ou at mesmo de microorganismo ou substncias que estejam sendo manipuladas. existem diversos tipos: normal, classe 100, para pessoas com barba, de pano, descartveis etc. Cada uma se destina a um tipo de situao distinta, embora a finalidade de proteo quanto inalao de partculas seja essencialmente a mesma.
MSCARA CIRRGICA
GORROS tambm existem alguns tipos distintos: masculino, feminino, tipo escafandro etc. til para evitar carrear qualquer tipo de contaminao pelos cabelos, alm de evitar que a possvel queda de cabelos venha a contaminar o experimento. SAPATILHAS servem tanto para impedir que sujidades e contaminantes sejam carreados pelos sapatos para
dentro da sala de experimentao quanto para fora dela. Existem sapatilhas de diversos materiais (de pano ou descartveis) e tipos (desde as que cobrem somente os sapatos at as do tipo botas).
JALECO E AVENTAL CIRRGICO
teis na proteo geral das roupas, membros, trax etc. Existem aventais cirrgicos de diversos materiais: tecido, descartveis, autoclavveis (por certo nmero de vezes e depois descartados) etc. importante que o avental seja descartado (lixo ou lavanderia) ao sair da rea de experimentao. Em alguns casos, pode ser necessrio o uso de uniforme completo, composto de cala, camisa etc., podendo ser inteirios ou no, dependendo da atividade executada.
EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA

Alm dos EPCs de uso geral (extintores de incndio, chuveiros etc.) cuja aplicao no se detm somente ao uso com animais, existem alguns que podem (e devem) ser utilizados na experimentao.
CAPELA DE FLUXO LAMINAR especialmente til para o uso na experimentao com animais SPF (Specific Pathogen Free). Aps a retirada da caixa com os animais do microisolador, procede-se ao manejo experimental dentro da capela de fluxo laminar. Esse procedimento garante o ambiente de proteo para os animais. Esse EPC de grande utilidade na realizao de necropsias e manipulao de animais contaminados e/ou de procedncia desconhecida.
recomendada para o uso no sacrifcio de animais quando do fim da utilizao dos mesmos na experimentao, seja com a utilizao de anestsicos volteis (ter, clorofrmio), seja com CO2 (mais recomendado atualmente). Em ambos os casos, os animais so sacrificados em uma cmara situada dentro da capela.
CAPELA DE EXAUSTO OU CAPELA QUMICA
EQUIPAMENTOS/DISPOSITIVOS ADICIONAIS
so caixas especiais, em papelo resistente, com smbolos e avisos, prpria para o descarte de agulhas, seringas, vidros, lminas etc., com abertura que somente permite a entrada do material. Aps atingirem uma determinada marca, so lacradas e autoclavadas.
CAIXA PARA DESCARTE DE MATERIAL PERFUROCORTANTE
296
Tcnicas de risco desenvolvidas na experimentao com roedores
PULVERIZADOR DE AGULHAS transforma a agulha em minsculas partculas (limalha), quando esta colocada em contato com a placa eletrificada no aparelho. Equipamento extremamente polmico, uma vez que no ato da pulverizao produz aerossis.
RECOMENDAES IMPORTANTES
jamais
trabalhe sozinho no laboratrio; jamais trabalhe com roedores e lagomorfos (ou outros animais) em situaes de debilidade de sade, cortes nas mos, rosto ou qualquer outra rea exposta; sempre lave e desinfete as mos e antebraos aps o trabalho com animais (mesmo com a utilizao de luvas e demais EPIs); sempre limpe e desinfete a bancada de trabalho aps o trmino do experimento; sempre trabalhe com tica.
BIBLIOGRAFIA
GRIST, N. R. Manual de Biossegurana para o Laboratrio. So Paulo: Livraria Editora Santos, 1997. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Biosafety in the Laboratory. Washington, D.C.: National Academy Press, 1989. TEIXEIRA, P. & VALLE, S. Biossegurana: uma abordagem multidisciplinar. Rio de Janeiro: Ed. Fiocruz, 1996.
297
Controle da qualidade de animais de laboratrio
C ontrole da Qualidade de Animais de Laboratrio

INTRODUO
34
H mais de 50 anos foram reconhecidos os agentes infecciosos que davam origem s doenas dos animais de laboratrio e interferiam em suas respostas biolgicas. Surgiram, ento, as tcnicas de barreiras nas instalaes e o incio da criao de animais livres de microorganismos indesejveis. Junto com essa evoluo apareceram, tambm, outras necessidades como a igualdade de condies na manuteno dos animais de um biotrio para outro e a elaborao de um programa de monitorizao da sade para confirmao da presena ou no de certos agentes. Antes de tratarmos do programa de monitorizao da sade, que se constitui no controle da qualidade sanitria dos animais de laboratrio, importante conhecermos a classificao dos agentes infecciosos, baseada na sua probabilidade de deteco ou prevalncia. AGENTES INFECCIOSOS PRIMRIOS so aqueles com significante potencial de causador de doenas, conhecida interferncia na pesquisa, alta probabilidade de deteco ou prevalncia e bom potencial para excluso atravs de tcnicas de produo de barreiras. Exemplo: vrus da hepatite murina (MHV); vrus Sendai; Salmonella sp etc. AGENTES INFECCIOSOS OPORTUNISTAS so aqueles comuns no meio ambiente dos animais de laboratrio e/ou do homem e tem baixa probabilidade clnica como causador de doenas. Geralmente, tm um alto potencial de latncia e so carreados pelo homem. Exemplo: Klebsiella pulmoniae, Pasteurella pneumotropica, Staphylococcus aureus etc. AGENTES INFECCIOSOS inexistente.
MISTOS
so aqueles cujo papel como oportunista ou patgeno limitado ou
A realizao do controle da qualidade sanitria limitante quando se trata de animais de laboratrio convencionais ou holoxnicos, ou seja, aqueles que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitrias rigorosas. A monitorizao gentica e o controle sanitrio e fsico-qumico do meio ambiente tambm so aes imprescindveis na realizao do controle da qualidade dos animais de laboratrio.
PROGRAMA DE MONITORIZAO DA SADE

O primeiro passo estabelecer uma rotina de monitorizao. Amostragens regulares ajudam a provar a existncia de um agente em pelo menos um animal.
299
A confirmao de um resultado positivo deve ocorrer com a repetio do exame e o emprego de mtodos diferentes. A freqncia da amostragem varia de acordo com vrios fatores, tais como importncia do agente, confiabilidade nos vrios processos empregados, tipo de instalaes onde os animais so mantidos, tipos de equipamentos e pessoal, introduo de materiais e/ou animal e produo de anticorpos (de 10 a 14 dias no animal). O tamanho da amostra de uma populao, com mais de cem animais e onde se pode estimar um percentual de infeco, determinado pela seguinte frmula: LOG 0,05 = nmero da amostra LOG N Onde N = percentagem de animais no-infectados na populao. Log 0,05 = 95% de nvel confivel. Em mdia, nas produes fechadas, as doenas virais produzem morbidade de 30% a 35%. A seguir, temos uma tabela que indica o tamanho da amostra que devemos utilizar em virtude da incidncia de infeco na populao. Tabela 1 Tamanho da amostra requerida para detectar pelo menos um animal positivo com 95% de confiabilidade
EXPECTATIVA DA INCIDNCIA DE INFECO NA POPULAO (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 1 Fonte: De Luca et al. (1996). TAMANHO DA AMOSTRA 2 2 3 4 5 6 9 14 29 298
Segundo recomendaes da Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), pode-se empregar tambm os seguintes esquemas em colnias microbiologicamente controladas: Quadro 1 Colnias de camundongos, ratos, hamsters e cobaias
FREQNCIA DA AMOSTRAGEM TAMANHO DA AMOSTRA Idade Recm-desmamado A cada 3 meses 10-14 semanas (adulto jovem) > 6 meses (descarte) no de animais >2 >4 >4 TESTE/ANIMAL Sorologia Bacteriologia Parasitologia Patologia + + + + + + + + + + +
Fonte: Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA).

300
Controle da qualidade de animais de laboratrio
Quadro 2 Colnias de coelhos

FREQNCIA DA AMOSTRAGEM A cada 6 meses TAMANHO DA AMOSTRA Idade 12-14 semanas (adulto jovem) > 6 meses (descarte) no de animais Sorologia >4 >4 + + TESTE/ANIMAL Bacteriologia + + Parasilogia + + Patologia + +
Fonte: Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), 1994/1996.
O emprego de animais-sentinela muito eficaz e traz excelentes resultados, principalmente quando utilizado nas salas de animais em experimentao. Eles so imunocompetentes criados, direta ou indiretamente, com a populao de animais a ser monitorada. Diretamente, junto com o animal na mesma gaiola e indiretamente e mais usado em gaiolas com a cama usada por outro animal. Os animais-sentinela devem ser testados antes para confirmao da ausncia dos agentes em questo. O controle mais eficaz usando-se animais de mesma espcie e cepa da populao residente; devem ter pelo menos dez semanas de idade e ser mantidos dentro da sala por, no mnimo, quatro semanas. O diagnstico para determinao do status sanitrio, da causa de uma doena clnica ou da morte do animal se obtm mediante o emprego da parasitologia, da bacteriologia, da micologia, da virologia, do estudo do micoplasma, das rickttsias e da patologia. Devemos enfatizar que os resultados negativos significam apenas que o microorganismo monitorado no foi demonstrado nos animais utilizados para o teste. Os resultados no so, necessariamente, reflexo do status de todos os animais de uma unidade de criao. Um agente infeccioso deve ser declarado como presente se ele identificado ou anticorpos para ele so detectados em um ou mais animais testados. Os resultados devem continuar sendo reportados como positivo nos testes subseqentes at que o organismo tenha sido erradicado da colnia por meios de derivao ou reposio de animais de origem externa. Os procedimentos laboratoriais para obteno do diagnstico devem seguir os princpios da GLP (Good Laboratory Practice), onde couber, e participar de um Programa de Garantia da Qualidade. O resultado final dos testes de parasitologia, bacteriologia, micologia, micoplasma e virologia deve mencionar os organismos de importncia de cada um deles e indicar, de acordo com cada espcie dos animais de laboratrio, aqueles que foram detectados ou no (nmero de animais positivos), ou se no foram testados (NT). O resultado final dos testes de patologia deve complementar a monitorizao da sade dos animais de laboratrio.
PROGRAMA DE MONITORIZAO GENTICA

O controle gentico fundamental na definio do status gentico de uma colnia de animais de laboratrio e faz parte do controle da qualidade da colnia como um todo. Por se tratar de um tema com muitas peculiaridades, este livro dedica um captulo exclusivamente sobre ele.
301
CONTROLE SANITRIO E FSICO-QUMICO DO MEIO AMBIENTE

Todo e qualquer biotrio deve manter as condies mnimas de higiene em seu meio ambiente. Porm, os biotrios destinados manuteno de animais SPF ou gnotobiticos so obrigados a cumprir essa exigncia sob pena de invalidar todo o trabalho nele desenvolvido. Para se certificar do pleno cumprimento dessa obrigao, so realizados os testes de controle sanitrio e fsico-qumico do meio ambiente dos biotrios. O controle de vetores uma providncia importante, j que todo biotrio possui o que h de mais atraente para roedores selvagens, que a presena de rao (em alguns casos, em abundncia) com odores bastante caractersticos. Da mesma forma, os insetos, rasteiros ou no, so uma ameaa e, por conta disso, um bom programa de desratizao e desinsetizao deve ser adotado para eficincia do sistema. Alguns cuidados devem ser observados nessa prtica, uma vez que as iscas ou produtos inseticidas tm cheiros que podem vir a atrair (e intoxicar) os prprios animais do biotrio, principalmente aqueles que se mantm em reas abertas (nos gaioles, piquetes ou canis). Deve-se sempre manter uma boa distncia entre as iscas e o acesso dos animais, para se evitar problemas. Nas reas de estoque de rao e maravalha, o uso de inseticidas por pulverizao desaconselhvel. As salas de animais tambm devem ser excludas do programa. Os testes microbiolgicos se limitam, sobretudo, aos de bacteriologia e micologia. Eles so adotados em todo o meio ambiente, envolvendo as salas (parede, teto, piso, ar filtrado, estante, mesa de servio, luminrias, maanetas etc.), salas de estoque de material limpo, equipamentos e insumos. O material coletado atravs de swabs e/ou placas com meios de cultura e so cultivados at a obteno do diagnstico final. A freqncia desses testes de quinze dias para um ambiente SPF e de uma semana para o gnotobitico. Em um ambiente de biotrio convencional, essa prtica adotada apenas quando se faz a desinfeco do ambiente das salas de animais, com o intuito de avaliar a eficcia do desinfetante utilizado. E isso acontece, desejavelmente, a cada trs meses. Os testes fsico-qumicos so destinados, basicamente, aos desinfetantes, detergentes, produtos qumicos e raes utilizados nos biotrios. Na aquisio dos desinfetantes, detergentes e produtos qumicos, os testes fsico-qumicos devem ser realizados para se certificar da qualidade dos produtos. Da mesma forma, a cada partida de rao recebida pelo biotrio, no s os testes fsico-qumicos, como tambm os microbiolgicos, devem ser realizados.
DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Tcnicos em Bioterismo. So Paulo: Winner Graph, 1996. FEDERATION OF EUROPEAN LABORATORY ANIMAL SCIENCE ASSOCIATIONS (FELASA). Recommendations for the Health Monitoring Mouse, Rat, Hamster, Guineapig and Rabbit Breeding Colonies. London: Felasa, 1994/1996.
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984.JALMES, C. A. C. et al. Control de Calidad de Animales de Laboratorio. Caracas: INHRR, 1997.
302
Controle parasitolgico
C ontrole Parasitolgico
INTRODUO
35
Marcos Antnio Pereira Marques
Nas colnias de animais de laboratrio convencionais, a incidncia de parasitas constante, provocando vrias alteraes nutricionais. Isso interfere no desenvolvimento do animal e pode, em casos especiais, at alterar bruscamente a fisiologia animal. Hoje em dia, as colnias convencionais utilizam drogas antiparasitrias para o controle e a erradicao de parasitas. As tcnicas de cesariana e histerectomia tm auxiliado na obteno de animais sanitariamente definidos. Os animais devem ser escolhidos aleatria e periodicamente, e com uma amostragem no inferior a dez animais por sala de criao, variando as idades. A escolha dos mtodos parasitolgicos de fundamental importncia no diagnstico das principais parasitoses de roedores. Para a confirmao de endoparasitos, alm do exame parasitolgico das fezes, atravs de mtodos clssicos, tambm deve ser feita a investigao direta da mucosa intestinal, aps o sacrifcio animal, na qual os parasitos so investigados diretamente na regio do ceco, jejuno e leo. O exame parasitolgico compreende duas etapas distintas: pesquisa de ecto e de endoparasitos.
EXAME PARASITOLGICO DAS FEZES

Tem como objetivo a pesquisa de ovos, larvas e cistos de protozorios. As fezes devem ser coletadas diretamente da mucosa anal, estando assim livres de impurezas, e devem ser manipuladas num perodo mximo de 4 horas, aps o qual ser necessrio o uso de conservantes para a preservao do material (MIF 1:2). O exame parasitolgico, bem como a investigao direta da mucosa intestinal, deve ser realizado em trs etapas: EXAME MACROSCPICO visualizao a olho nu, em fundo preto, observando a presena de larvas de helmintos, proglotes de cestdeos. Nesse exame tambm observamos a colorao e a consistncia das fezes; EXAME MICROSCPICO realizado atravs de mtodos especficos que determinam, com maior preciso, a realidade da infeco, dando uma viso mais ampla do parasito; EXAME DIRETO DA MUCOSA INTESTINAL uma prtica realizada em nosso Servio de Controle da Qualidade Animal, que vem apresentando resultados satisfatrios, visando pesquisa do parasito no seu hbitat natural. Aps o sacrifcio do animal, retirado o intestino, sendo colocado em duas placas de Petri (ceco/ jejuno/leo) com salina fisiolgica. O material examinado primeiramente a olho nu, contra um fundo negro e, posteriormente, uma pequena amostra examinada ao microscpico para pesquisa de ovos e cistos de protozorios.
303
PRINCIPAIS HELMINTOS ENCONTRADOS EM COLNIAS CONVENCIONAIS

SYPHACIA
OBVELATA
Endoparasito pertencente famlia Oxyuridae, presente em quase todas as criaes convencionais de camundongos, ratos e hamsters. Esse nematdeo habita o ceco, apresentando ciclo biolgico direto, que se completa a cada 15 dias. A fmea grvida migra at a regio perianal, onde deposita ovos que se tornam infectantes aps 6 horas. A ingesto por outros animais ou a migrao da prpria larva para o ceco inicia um novo ciclo biolgico. Seus ovos apresentam aspecto reniforme. A infeco causada por Syphacia obvelata (Fig. 1.2) considerada subclnica; porm, de importncia vital registrar que, quando a infestao de uma colnia por S. obvelata for grande, geralmente aumenta o nmero de animais apresentando prolapso de reto. A cesariana e a histerectomia so mtodos eficazes na erradicao desse parasito nas colnias de roedores. A transmisso pode ser reduzida com a utilizao de filtros de caixa. A larva de Syphacia muris semelhante a S. obvelata , ocorrendo freqentemente em colnias convencionais de ratos.
ASPICULURIS
TETRAPTERA
Endoparasito pertencente ordem Ascarida, famlia Oxyuridae, amplamente distribudo em colnias de roedores convencionais, parasitando o ceco de camundongos e, raramente, ratos. Aspiculuris tretaptera (Fig. 1.3) considerado um parasito no-patognico. Apresenta ciclo biolgico direto. Os ovos so eliminados com as fezes e requerem de 6 a 8 dias de incubao, em temperatura ambiente, antes de se tornarem infectantes. A transmisso ocorre quando ovos embrionados so ingeridos. Os ovos eclodem no intestino, liberando as larvas que, em torno de 25 dias, tornam-se adultas, reiniciando o ciclo biolgico. Os ovos de Aspiculuris tretaptera apresentam simetria elipsoidal com parede fina e so resistentes ao frio.
NIPPOSTRONGYLUS
BRASILIENSIS
Nematdeo pertencente famlia Trichostrongylidae (Fig. 1.1). Raramente encontrado no intestino delgado de camundongos e ratos de laboratrio, mas, freqentemente, em roedores silvestres. Os vermes adultos apresentam aspecto filiforme com colorao avermelhada, medindo os machos 5mm e 6 mm de comprimento e as fmeas, um pouco maiores, 8mm a 9 mm. O ovo apresenta forma elipside. Apresenta ciclo biolgico direto e, 24 horas aps a ecloso dos ovos, a larva se torna infectante. A transmisso pode ocorrer pela ingesto de ovos embrionados, sendo mais comum a penetrao atravs da pele do animal. As larvas circulam pelos pulmes, passando para os brnquios, de onde so expelidas pela tosse e deglutidas; passam para o aparelho digestivo (ciclo de Loss) no qual, aps 4 a 6 dias, tornam-se adultas e reiniciam o ciclo biolgico. O manejo adequado com freqentes trocas de caixa um meio eficaz para interromper o ciclo desse parasito.
HYMENOLEPIS
NANA
Tambm designada como Vampirolepis nana (Fig. 1.4), cestdeo pertencente famlia Hymenolepideae, normalmente encontrada em colnias convencionais de camundongos, ratos e, sobretudo, hamsters. Considerado um parasito no-patognico, podendo ocasionalmente causar doena no hospedeiro, de acordo
304
com o grau de infestao. Quando o animal apresenta alto grau de infestao, podemos observar perda de peso e, em conseqncia, baixa absoro nutricional. Esse parasito pode apresentar ciclo direto e indireto. O ciclo indireto exige um inseto, no qual ocorre o desenvolvimento de cisticercos. O ciclo direto ocorre atravs das proglotes maduras eliminadas pelo animal. No ciclo direto, os cistercercides podem ser encontrados no animal, aps 14 dias, na mucosa intestinal, de onde migram para o jejuno e leo. Os ovos apresentam, em seu interior, um embrio resistente, podendo sobreviver meses nas fezes do hospedeiro. Levando-se em considerao o tempo, o ciclo biolgico indireto completa-se em 25 a 30 dias, ao passo que para o ciclo biolgico direto so necessrios apenas 16 dias.
T AENIA
TAENIAFORMIS E
T AENIA
PSIFORMIS
Estes cestdeos pertencentes espcie Taenia taeniaformis (Fig. 1.5) tm como hospedeiros intermedirios ratos, camundongos e hamsters, e a espcie Taenia psiformis, os coelhos. As larvas se instalam no fgado, onde se desenvolvem.
PASSALURUS
AMBIGUUS
Endoparasito pertencente famlia Oxyuridae comumente encontrado em colnias convencionais, parasitando o ceco e o colo de coelhos. Esse nematdeo apresenta ciclo direto, dando-se a transmisso por meio da ingesto de ovos embrionados. O Passarulus ambiguus (Fig. 1.6) um parasito no-patognico, no sendo atribudo a ele distrbios intestinais, tais como diarria e enterite.
PARASPIDODERA
UNCINATA
Este helminto o nico nematdeo de importncia presente em colnias convencionais de cobaia. A larva de Paraspidodera uncinata (Fig. 1.7) habita o ceco e o colo de cobaias, eliminando seus ovos pelas fezes, que necessitam de 3 a 5 dias para se tornarem infestantes. Quando ingeridos, os ovos eclodem e as larvas migram at o ceco e colo, tornando-se adultas em 45 dias, reiniciando o ciclo. Esse nematdeo considerado nopatognico; porm, a perda de peso e o retardamento do desenvolvimento do animal tm sido atribudos alta infestao desse parasito.
PRINCIPAIS PROTOZORIOS ENCONTRADOS EM COLNIAS CONVENCIONAIS

GIARDIA
MURIS
Protozorio flagelado, pertencente famlia Hexamitidae, subfamlia Giardinae. As formas trofozotas desse gnero (Fig. 1.8) apresentam aspecto periforme, dois ncleos, quatro pares de flagelos e habitam o intestino delgado de vrias espcies de animais convencionais. O parasito se liga s clulas epiteliais da mucosa intestinal atravs de um disco suctorial. O protozorio Giardia muris pode infectar camundongos, ratos e hamsters. A infeco geralmente subclnica; entretanto, podemos observar que os animais apresentam perda de peso, plos eriados e distenso abdominal com intensa produo de gases. O trofozoto de G. muris apresenta ciclo biolgico direto e a transmisso se d por ingesto dos cistos. O protozorio se reproduz por diviso longitudinal. A dose mnima infectante para um camundongo de aproximadamente dez cistos.
305
HEXAMITA
MURIS
Protozorio flagelado, pertencente famlia Hexamitidae, finalmente chamado de Hexamita muris (conhecido tambm por Spironucleus muris) (Fig. 1.9). Encontrado no intestino delgado, principalmente no duodeno de camundongos, ratos e hamsters. Apresenta aspecto periforme com simetria bilateral, contendo dois grupos de flagelos na regio anterior e dois flagelos na extremidade inferior. O trofozoto de Hexamita muris apresenta ciclo biolgico direto e a reproduo se d por diviso longitudinal binria. Esse parasito ocasiona uma enfermidade aguda e crnica. A forma mais grave ocorre em camundongos lactentes, podendo lev-los morte. A fase inicial aguda da enfermidade se manifesta por diarria e perda de peso. Essa conduz a uma enfermidade crnica, com persistente perda de peso e desenvolvimento. Em ambas as formas, aguda e crnica, os cistos aderidos s criptas da mucosa duodenal ocasionam uma forte resposta inflamatria (enterite).
TRITRICHOMONAS
MURIS
Protozorio flagelado, no-patognico, pertencente classe Mastigophora, habitante comum do ceco e colo de camundongos, ratos e hamsters. Apresentam aspecto piriforme, com um nico ncleo, trs flagelos na regio apical e uma membrana ondularmente que percorre a extenso longitudinal do parasito, exteriorizandose como flagelo livre (Fig. 2.0). Seu ciclo biolgico simples e direto. O trofozoto eliminado com as fezes, dificilmente formando cisto. Apresenta reproduo por diviso longitudinal binria. Quando em grande quantidade pode ocasionar diarria no hospedeiro.
ENTAMOEBA
MURIS
Protozorio pertencente classe Sarcodina, famlia Entamoebidae. Parasito de distribuio cosmopolita, semelhante a Entamoeba coli do homem (Fig. 2.3). Reproduzem-se por diviso binria, sendo os cistos a forma infectante do parasito. Apresenta forma esfrica, contendo oito ncleos e ciclo biolgico direto, pela ingesto de cistos, que se rompem no duodeno. Finalmente, as amebas colonizam o ceco e colo, onde levam uma existncia parasitria no-patognica. As vrias espcies so:
E. E.
muris ceco e cisto de camundongo. caviae ceco e colo de cobaias. E. cuniculi ceco e colo de coelhos.
BALANTIDIUM
CAVIAE
Parasita pertencente classe Ciliata, aparentemente no-patognico, habita o ceco e colo de cobaias mantidas em colnias convencionais. Esse parasita apresenta duas formas bsicas: trofozoto e cisto (Fig. 2.2). O trofozoto tem o corpo recoberto por clios, com vrias organelas, vacolos digestivos e dois ncleos: o macro e o microncleo. A transmisso se d pela ingesto de cistos que contaminam alimentos e gua. Divide-se por fisso binria ou conjugao. normalmente um protozorio comensal do intestino, alimentando-se de amido e bactrias.
E IMERIA
SP
um coccdeo patognico que pode infectar o intestino delgado e o ceco de camundongos, ratos, cobaias e coelhos. Os oocistos esporulados podem ser de formas variadas: elipsides, esfricos, ovides, de tamanho
306
varivel segundo a espcie parasitada. Os oocistos apresentam 4 esporocistos contendo 2 esporozotos cada um e uma abertura anterior denominada micrpila. Quando em grandes quantidades, produzem uma infeco grave com comprometimento do epitlio intestinal com perda de sangue e gua, levando o animal desidratao e posteriormente morte. As eimerias possuem vrias espcies:
E. E.
separata (Fig. 2.1 a) habita o intestino do rato. caviae (Fig. 2.1 b) habita o intestino da cobaia. E. falciformis (Fig. 2.1 c) habita o intestino do camundongo. E. stiedai (Fig. 2.1 d) habita o intestino do coelho.
ECTOPARASITOS
A pesquisa de ectoparasitos, na pelagem do animal, de fundamental importncia na criao, visto que podem atuar como vetores de microorganismos patognicos, desencadeando processos infecciosos diversos. Algumas espcies so hematfagas, outras so esfoliadoras e podem causar srios problemas na epiderme. Em ambos os casos ocorrem alteraes nos resultados da pesquisa, seja pelo efeito do parasitismo, que pode ser confundido com os resultados dos experimentos, seja porque o estresse, provocado pelo experimento, pode intensificar os efeitos da parasitose. Portanto, as ectoparasitoses devem ser diferenciadas de outras infeces com possibilidade de ocasionar leses epidrmicas similares.
PESQUISA DE ECTOPARASITOS
Utilizando-se de microscpio entomolgico, deve-se examinar a pelagem do animal, visando procura de parasitos de maior tamanho (piolhos) e de caros menores (sarnas). Aps o sacrifcio, o animal deve ser colocado sobre um fundo preto, com bordas revestidas e fitas adesivas (para cima) para fixar os parasitos que migram do corpo do animal. Em nosso Servio de Controle da Qualidade, aps a eutansia, a carcaa do animal colocada diretamente sob focos de luz, durante 60 minutos, aps o qual pode-se observar a migrao dos parasitos atravs da lupa ou do microscpico entomolgico. Pode-se tambm diminuir esse tempo para 30 minutos, colocando-se a carcaa do animal dentro de um refrigerador. Com o frio, os parasitos migram para a superfcie dos plos na tentativa de encontrar outro hospedeiro, sendo facilmente observados a olho nu contra fundo negro ou com ajuda da lupa.
PRINCIPAIS ECTOPARASITOS DE COLNIAS CONVENCIONAIS

P IOLHOS
Poliplax serrata
um piolho de camundongos que pode ser visto a olho nu. Apresenta colorao amarelada com traos de marrom. Seus ovos so fixados na base dos plos do abdmen e do colo. Seu ciclo biolgico pode completar-se em 13 dias. O piolho Poliplax serrata (Fig. 2.4) transmite, diretamente ou mediante traumatismos da pele que o prprio camundongo faz ao coar-se, um protozorio parasita do sangue, Eperythozoon coccoides.
307
Gliricola porcelli e Gyropus ovalis
Ectoparasitos comumente encontrados em colnias convencionais de cobaias. Quando em grande quantidade podem ser observados nas cobaias a olho nu, dando a impresso de sujeiras no plo, principalmente no dorso do animal. No so patognicos; porm, quando em grande quantidade, o animal pode apresentar esfoliaes na epiderme e alopcia. Geralmente quando uma colnia est parasitada, encontramos as duas espcies de piolhos. Podemos diferenci-las pelas seguintes observaes: Gliricola porcelli (Fig. 2.6) patas curtas com corpo alongado, apresentando colorao amarelada ou ocre. Gyropus ovalis (Fig. 2.5) possui colorao clara, apresenta abdmen arredondado com finos plos dorsais.
Haemodipsus ventricosus
Raramente encontrado em colnias convencionais de coelhos, o piolho Haemodipsus venticosus (Fig. 2.7) localiza-se preferencialmente no dorso e na regio plvica do animal. Tem colorao castanha, apresentando cabea e patas pequenas, enorme abdmen oval e plos na regio ventral e dorsal.
CAROS
Myobia musculi
Ectoparasita geralmente encontrado em colnias convencionais de camundongos, sendo principal ectoparasito dos camundongos e o mais difcil de se eliminar. Myobia musculi (Fig. 2.8) vive na superfcie cutnea e nos plos da regio da cabea, pescoo e nuca. Apresenta o primeiro par de patas pequeno e especialmente modificado para fixao ao plo. Quando em grandes quantidades, podem ocorrer pruridos e escoriaes da epiderme resultantes de infeces secundrias, provocados pelo prprio animal ao coar-se.
Myocoptes musculinus
Parasita cosmopolita de camundongos mantido em colnias convencionais. Aparentemente no-patognico; porm, quando h grandes infestaes, podemos observar alopcia e prurido, geralmente na regio do pescoo e da nuca, e em alguns casos podemos encontr-lo em toda a superfcie do corpo. A transmisso de Myocoptes musculinus (Fig. 2.9) se d por contato direto, e seu ciclo biolgico ocorre totalmente na pelagem, num perodo de 14 dias.
Notoedres muris
Responsvel pela sarna auricular de ratos (especfico do gnero Rattus). A infestao por Notoedres muris (Fig. 3.0) caracterizada pelo aparecimento de leses na orelha e no focinho do animal. As fmeas liberam seus ovos em galerias no extrato crneo. O ciclo biolgico se completa com 19 dias, sendo a transmisso realizada por contacto direto.
Psoroptes cuniculli
Ectoparasito encontrado comumente em criaes de coelhos convencionais, conhecido tambm por sarna auricular dos coelhos, visto que o stio de infestaes localiza-se na base das crostas, onde se passa todo o ciclo biolgico do parasito com durao de 21 dias. Os ovos de Psoroptes cuniculli (Fig. 3.1) liberados permanecem viveis pelo menos por um ms em temperatura ambiente. Para um tratamento eficiente, necessria a remoo da crosta, seguida de limpeza da rea, sendo ento aplicados os medicamentos tpicos, com intervalos de 3 a 5 dias. Podemos tambm encontrar esse tipo de sarna no focinho e nas patas do animal. A fmea relativamente grande em relao ao macho, apresentando nas regies laterais e terminais um longo par de espinhos e quatro pares de patas.
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Chirosdicoides caviae
Ectoparasito geralmente encontrado em colnias convencionais de cobaias, parasitando geralmente a regio dorsal do hospedeiro, podendo ser encontrado por todo o corpo do animal. Em casos de grandes infestaes por Chirosdicoides caviae (Fig. 3.2), podemos encontrar alopcia e prurido. As fmeas e os machos apresentam corpos alongados com o primeiro par de patas modificados para fixar-se ao plo.
FIGURAS
Figura 1.1
c a b
e
250 m 150 m 25 m
500 m
20 m
Figura 1.2
b
500 m
Figura 1.3
b
200 m 30 m
a
309
Figura 1.4
Figura 1.5
Figura 1.6 Figura 1.7
310
Figura 1.8
3 m
Figura 1.9
Figura 2.0
3 m
5 m
311
Figura 2.1
Figura 2.2
25 m
25 m
Figura 2.3
b c
10 m 10 m
d
20 m
312
Figura 2.4
Figura 2.5
1000 m
Figura 2.6
Figura 2.7
1000 m
1000 m
313
1000 m
Figura 2.8 Figura 2.9
100 m
100 m
Figura 3.0
Figura 3.1
200 m 100 m
314
Figura 3.2
75 m
Fonte: Manual para Tcnicos em Bioterismo (1996).
BIBLIOGRAFIA
BORCHET, A. Parasitologia Veterinria. Espanha: Acribia, 1975. DE LUCA, R. R. et al. (Orgs.). Manual para Tcnicos em Bioterismo. So Paulo: Winner Graph, 1996. FLYNN, R. J. Parasites of Laboratory Animals. Iwoa: Iwoa State University Press, 1973. SMITH, A. W. El Raton. Rio de Janeiro: Centro Panamericano de Febre Aftosa, 1976. MENENDEZ, R. C. Animales de Labortrio en las Investigaciones Biomedicas. Cuba: Cincias Mdicas, 1985. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Companion Guide to Infectious Diseases of Mice and Rats. Washington, D.C.: National Academy Press, 1991. JALMES, C. A. C. et al. Control de Calidad de Animales de Laboratorio. Caracas: INHRR, 1997.
315
Controle sorolgico de viroses murinas
C ontrole Sorolgico de Viroses Murinas

INTRODUO
36
A deteco de vrus nas colnias de animais de laboratrio importante no s para o biotrio que mantm colnias de criao de camundongos e ratos, mas para o pesquisador que utiliza o animal como reativo biolgico ou derivado orgnico para produo e controle de imunobiolgicos. Devido resistncia inata ou adquirida, a maioria dos animais contaminados no apresenta sinais evidentes de doena, podendo esta passar despercebida pelos tcnicos que manipulam os animais dentro dos biotrios e nos laboratrios, ocasionando alteraes de resultados experimentais, erros de interpretao dos mesmos, alteraes dos parmetros fisiolgicos, contaminao de materiais biolgicos como soros, vacinas e anticorpos monoclonais, e interferindo nos estudos, isolamentos e ao de outros microorganismos de interesse da pesquisa. Entretanto, quando camundongos naturalmente infectados so imunossuprimidos quimicamente por inoculao, irradiao, ou submetidos ao estresse, por longos perodos, podem ocorrer manifestaes clnicas caractersticas da infeco natural. Hoje em dia, os grandes centros de pesquisas utilizam animais de laboratrio sanitariamente definidos e livres de microorganismos especficos pesquisa a ser realizada, bem como na produo e no controle de imunobiolgicos. Em razo do grande avano biotecnolgico, a utilizao de animais com padres sanitrios definidos atende aos requisitos das pesquisas biomdicas, tendo como objetivo a aquisio de resultados experimentais precisos e a utilizao de quantidade mnima de animais.
PERIODICIDADE DO CONTROLE SOROLGICO

Controle sorolgico a realizao de testes repetitivos padronizados e previamente programados para detectar a presena de anticorpos ou de agentes infecciosos no soro de animais de laboratrio. O controle sorolgico deve levar em considerao o padro sanitrio da colnia e o objetivo do experimento ao qual os animais sero submetidos. A questo das viroses especficas deve ser levada em considerao, e nas espcies que possuem mais de uma linhagem cada uma dever ser analisada periodicamente. A freqncia na realizao de exames sorolgicos em colnias de camundongos e ratos dever ser realizada com intervalos de trs meses nas colnias de fundao e de expanso de matrizes, j nas colnias de produo o perodo de intervalo poder chegar a seis meses. Nos biotrios de animais SPF (Specific Pathogen Free), gnotobiticos e axnicos, onde as salas de criao so independentes, o intervalo entre as monitorizaes microbiolgicas no deve ser muito grande, tendo em vista que quanto mais cedo for detectada uma possvel contaminao numa sala, maiores sero as chances de isol-la e de evitar a disseminao do agente infeccioso para as outras.
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O padro sanitrio da colnia resultado direto das prticas de manejo de uma colnia. Nas colnias convencionais sem barreiras sanitrias, a monitorizao deve ter como objetivo os microorganismos de interesse do usurio, ou limitada a microorganismos altamente patognicos para espcie animal, e obrigatoriamente os zoonticos. Quando os animais apresentam sinais clnicos de doena ou achados de necropsia, necessrio fazer exames especficos, visando identificao dos agentes com maior probabilidade de causar alteraes clnicas e leses observadas; esses exames devem ser realizados o mais rpido possvel nos animais doentes, utilizando todos os mtodos necessrios ao diagnstico da enfermidade, independentes dos testes realizados no controle sorolgico.
ESCOLHA DA AMOSTRA PARA O CONTROLE SOROLGICO

A amostra utilizada para detectar a presena de um agente infeccioso depende do grau de infeco da populao animal e do limite de confiana desejado. O grau de infeco influenciado por diversos fatores: linhagem, idade do animal, densidade populacional e a patogenicidade do microorganismo. Os animais devem ser escolhidos de forma aleatria de cada sala de criao. Os testes sorolgicos para deteco de anticorpos devem ser realizados em animais adultos imunocompetentes com mais de doze semanas (adultos jovens) e animais com mais de vinte semanas (adultos velhos) que tenham estado na colnia o tempo suficiente para manter contato com os agentes infecciosos e desenvolver anticorpos. Todos os animais retirados das colnias de fundao e expanso de matrizes devem ser examinados. A frmula abaixo permite calcular o tamanho da amostra numa determinada populao: log a A = log (1-N) Onde: A o nmero de animais a serem examinados; a o limite de confiana desejado, e N o grau de infeco na colnia (porcentagem de animais doentes). Tabela 1 - Tamanho mnimo da amostra para deteco de uma infeco numa colnia
GRAU DE INFECO (0%) LIMITE DE CONFIANA 99% (a=0,01) no de animais 0,1 (10) 0,2 (20) 0,3 (30) 0,4 (40) 0,5 (50) 0,6 (60) 0,7 (70) 0,8 (80) 0,9 (90) 44 21 13 9 7 5 4 3 2 95% (a=0,05) no de animais 29 14 9 6 5 4 3 2 2
Fonte: Institute of Laboratory Animal Ressources (Ilar) (1976); Hsu, New & Mayo (1980); Small (1984).
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DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES MURINAS

Tendo em vista que as infeces virais nas colnias de roedores so, em sua maioria, enzoticas e subclnicas, deve-se escolher mtodos de diagnsticos com alto ndice da especificidade e sensibilidade que possam assegurar a presena desses agentes na colnia. O exame laboratorial de uma virose serve, no s para confirmar uma dada infeco, ou uma suspeita clnica, mas tambm para identificar o tipo de agente causal na diferenciao de um quadro clnico de outro e durante surtos epidmicos para que se adotem as precaues profilticas ou vacinais necessrias. Por isso, o diagnstico hoje dividido em: clssico e rpido.
DIAGNSTICO CLSSICO
DAS
VIROSES
O diagnstico laboratorial clssico de uma virose compreende duas etapas: isolamento e identificao de vrus; inoculao em animais de laboratrio para reproduo dos aspectos clnicos. O simples isolamento de um vrus, a partir de material clnico, no significa, necessariamente, que aquele vrus seja o agente causal da infeco.
DIAGNSTICO RPIDO DAS VIROSES

O diagnstico rpido das viroses nasce da necessidade de se ter um resultado imediato que reconhea o agente viral causal. Alguns vrus podem ser detectados no ncleo ou no citoplasma das clulas dos rgos-alvo, fezes, urinas, secrees e lquidos biolgicos. A coleta e a conservao desses materiais biolgicos de extrema importncia para o diagnstico laboratorial. Para o diagnstico rpido, tem-se utilizado o microscpio eletrnico, na observao morfolgica do vrus, podendo tambm ser utilizada a imunoeletromicroscopia, utilizando-se soros padres. Hoje em dia, uma srie de testes imunolgicos utilizada para detectar protenas virais diretamente de secrees orgnicas, tais como imunohistoqumica, imunoperoxidase e imunofluorescncia direta. O diagnstico sorolgico baseia-se na pesquisa de anticorpos srios formados pela estimulao do sistema imunolgico dos animais que entraram em contato com o vrus. Entre as tcnicas mais utilizadas, encontramos a reao de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), que muito sensvel e tem boa especificidade, permitindo realizar a pesquisa de grandes quantidades de amostras sorolgicas em um perodo de tempo relativamente curto. A reao de imunofluorescncia evidencia a reao antgeno-anticorpo atravs de um fluorocromo ligado ao anticorpo; apresenta alta especificidade e sensibilidade, sendo muito utilizada para sorodiagnstico virolgico. A reao de imunofluorescncia pode ser: MTODO INDIRETO utilizado para detectar o anticorpo vrus-especfico, servindo tambm para classificar o antgeno viral por meio de um anti-soro especfico. Realizado em duas etapas. MTODO DIRETO utilizado para identificar o antgeno viral atravs dos anticorpos especficos marcados, sendo realizado numa nica etapa. A Reao de Inibio da Hemaglutinao (IHA) utilizada para vrus que possuem hemaglutininas, protenas virais com capacidade de aglutinar hemcias. Em condies especiais, a hemaglutinao pode ser inibida por anticorpos especficos contra o vrus. Na reao de imunodifuso, o antgeno e o anticorpo difundem-se em meio slido, formando linhas de precipitao na zona de equivalncia (propores ideais de Ag e Ac); esta reao usada para caracterizar antgenos virais por soros especficos conhecidos.
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MEDIDAS PROFILTICAS NAS COLNIAS DE CRIAO

Os animais de laboratrio mantidos em colnia de criao em biotrios convencionais podem ser contaminados de vrias formas: objetos contaminados que entram na sala de criao (gaiolas, tampas, maravalha etc.); mediante vetores biolgicos, tais como insetos, roedores silvestres, ou mesmo pela introduo de animais provenientes de outra sala de criao. Porm, nos biotrios com barreiras de proteo, a contaminao dos animais se d por falhas tcnicas que levam quebra das barreiras de proteo, por veiculao ou desateno do bioterista. As medidas profilticas adotadas em biotrios com barreiras sanitrias devem incluir: tcnicas de manejo adequadas para a espcie em criao, de acordo com os padres sanitrios da colnia (convencional/SPF etc.); rotina peridica de desinfeco do ambiente; programa de controle microbiolgico permanente, diagnsticos rpidos e precisos; capacitao de recursos humanos com orientao sanitria. Partindo-se do princpio de que os vrus so altamente contagiosos, e muito prevalentes nas colnias sem barreiras sanitrias (convencionais), uma vez diagnosticados na colnia, dificilmente se conseguir elimin-los. A exterminao da colnia e a descontaminao do ambiente, com a posterior introduo de animais limpos, a implantao de sistemas de barreiras sanitrias, tm sido a conduta mais eficiente na erradicao de agentes infecciosos. Porm, quando a eliminao da colnia for impossvel, as tcnicas de histerectomia e transferncia de embries so os procedimentos recomendados.
PRINCIPAIS VRUS MURINOS

VRUS
DA
HEPATITE MURINA (MHV)
um vrus RNA pertencente famlia Coronaviridae, enquadrando-se no gnero Coronavirus; possui a estrutura do capsdeo com forma helicoidal e presena de envelope. O dimetro do vrus mede 80nm-130 nm. sensvel ao ter e ao clorofrmio, termolbil, e produz antgeno fixador do complemento. Desde de 1949, cerca de 12 vrus diferentes tm sido descritos e colocados no grupo do MHV. Apesar de que esses vrus variam em sua patogenicidade e em seu tropismo tecidual, todas as cepas tm em comum a fixao do complemento. A cepa MHV-1 relativamente avirulenta. Todas as cepas produzem hepatite, porm a cepa MHV-4 mais encefalognica, ao passo que a cepa MHV-3 produz ascite.
TRANSMISSO: a transmisso se faz pela via oral-fecal. A infeco natural produz ttulos baixos de anticorpos. O vrus excretado pelas fezes, sendo raramente encontrado no fgado. A baixa imunidade e a localizao do vrus explica porque o MHV produz infeces inaparentes que podem ser ativadas sob certas condies. A resistncia enfermidade aumenta com a idade, sendo somente os vrus mais virulentos responsveis por graves quadros clnicos e morte do animal.
Experimentalmente, o vrus MHV pode ser transmitido facilmente por via intraperitoneal, oral, subcutnea e por exposio a aerossol. Ocasionalmente, o MHV aparece como um contaminante de material, que se est utilizando em passagens seriadas, como ocorre com o tumor asctico. As fezes infectadas so as principais fontes de contaminao, com vias de entrada tanto oral como respiratria. Aparentemente no ocorre transmisso placentria. a rederivao cesariana oferece o mtodo mais seguro para eliminar o MHV de uma colnia. Devido a sua natureza altamente contagiosa e sua prevalncia nas colnias de camundongos, so necessrias
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CONTROLE:
barreiras de proteo e medidas de proteo no manejo, bem como na higienizao dos materiais que entram na colnia.
VRUS
DA
PNEUMONIA MURINA (PVM)
Este vrus foi descoberto em 1939 em experincias destinadas a isolar vrus respiratrios humanos. O material foi obtido de pulmes de camundongos e ratos em passagens seriadas por via intranasal. Em camundongos aparentemente sadios produzia uma enfermidade pulmonar. O vrus da pneumonia murina um paramixovirus, com RNA de fita simples, termolbil, sensvel ao ter, e apresenta afinidade pelo tecido pulmonar de uma variedade de espcies mamferas.
TRANSMISSO:
o PVM um vrus estritamente pneumotrpico, no se disseminando facilmente por contato direto, e s transmitido experimentalmente por instilao nasal de homogenato pulmonar. O vrus no atravessa a placenta, no sobrevive na presena de anticorpos (neutralizantes) em camundongos jovens; entretanto, ocasiona uma infeco aguda, assintomtica e enzotica. As infeces agudas que se observam como enzootinas focais so testemunho da escassa contagiosidade do vrus. O vrus tem sido isolado de camundongos, ratos e hamsters, sendo achados anticorpos neutralizantes em outras espcies de mamferos, inclusive no homem.
A enfermidade clnica raramente aparente, porm em necropsia podemos encontrar pulmes difusamente congestionados de colorao vermelha escura. Microscopicamente, observa-se edema pulmonar e focos de pneumonia intersticial com infiltrao de mononucleares. O diagnstico de laboratrio se baseia na demonstrao da presena de anticorpos de inibio da hemaglutinao (HI), anticorpos fixadores do complemento (FC) e passagens seriadas em camundongos de 7 a 9 dias, com o aparecimento de sinais tpicos da infeco e o isolamento do vrus (clulas BHK-21).
CONTROLE: a presena da enfermidade pode ser demonstrada sorologicamente e em razo da incapacidade
do vrus de atravessar a barreira placentria; a derivao cesariana mantm a colnia livre de PVM e, quando combinada com exames sorolgicos peridicos, constitui um mtodo prtico e efetivo para eliminar a pneumonia viral do camundongo.
VRUS
DA
ENCEFALOMIELITE MURINA
DE
THEILER (TMEV/GDVII)
Em 1933, Max Theiler preparou uma suspenso de crebro e medula espinhal de camundongo albino jovem que havia apresentado paralisia flcida das patas traseiras. A preparao foi inoculada por via intracerebral em outros camundongos que desenvolveram a enfermidade paraltica similar. Posteriormente, a enfermidade recebeu considervel ateno devido a sua semelhana com a poliomielite humana. Esta infeco predominantemente latente pode ser desencadeada como uma enfermidade clnica por meio de estresse experimental, podendo, por conseguinte, interferir ativamente com interpretaes de resultados. O vrus classificado como picornavrus de 15nm a 30 nm de dimetro; possui RNA de cadeia simples; termolbil, sem envelope e resistente ao ter.
TRANSMISSO: a infeco se d atravs do contato com as fezes da me, porm so protegidos dos efeitos da
infeco devido presena de anticorpos maternos, passados por intermdio da lactao. Os camundongos jovens geralmente so positivos para anticorpos anti-GDVII, pouco aps amamentar. Em camundongos com anticorpos positivos, a infeco persiste por longos perodos com eliminao de vrus pelas fezes. Clinicamente, o nico sintoma de infeco natural uma paralisia flcida dos membros posteriores que pode ser progressiva. Pode-se observar, tambm, plos eriados, circling e rolling, particularmente nas cepas com tropismos mais encefalognicas, como a GDVII e Fa.
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CONTROLE:
existem evidncias de que a derivao cesariana proporciona um mtodo adequado para limpar a colnia infectada por TMEV.
VRUS DA ECTROMLIA
O vrus da Ectromlia pertence famlia Poxviridae, gnero Orthopoxivirus, e apresenta simetria complexa, medindo 175 x 290 nm, sendo morfologicamente indistinguvel do vacnia vrus e so os nicos vrus com DNA de fita dupla que replicam no citoplasma da clula. Apresentam envelope, sendo sensveis aos solventes de lipdios. Por seu avano insidioso e devastador em colnias suscetveis, a ectromlia considerada como uma das mais importantes viroses do camundongo. Pouco se sabe de tais ocorrncias, porm pode-se presumir que a ectromlia, quando transmitida como vrus latente, capaz de alterar resultados experimentais.
TRANSMISSO: a enfermidade pode existir em trs formas: aguda, crnica e latente. A forma aguda rapidamente letal, podendo matar mais de 90% da colnia. A forma crnica se desenvolve com leses tpicas na epiderme do camundongo. A forma latente pode ser totalmente inaparente, no entanto, os camundongos podem transmitir a enfermidade sem apresentar ttulos de anticorpos.
As vias de infeces podem ser por escoriaes na pele, inalao ou por ingesto. A ingesto pode ser considerada como a mais importante nas infeces latentes, nas quais os anticorpos maternos passam para os filhotes juntamente com os vrus ingeridos durante a lactao. Os filhotes sobrevivem, porm ficam infectados e posteriormente atuam como disseminadores de vrus. O gentipo do camundongo infectado pode influenciar profundamente a natureza e a disseminao da ectromlia numa colnia de camundongos. Por exemplo, as linhagens DBA/1 e C3H so extremamente suscetveis infeco e apresentam alto ndice de mortalidade (85%), e as linhagens BALB/c, C57BL/6 e AKR so resistentes, apresentando um ndice de letalidade de 1%. No caso do C57BL/6, sua resistncia de natureza gentica e se deve a uma rpida e eficiente resposta imunolgica ps-infeco. Assim sendo, os camundongos C57BL/6 e outras linhagens de camundongos resistentes podem ser portadores assintomticos, parcialmente imunes a enfermidade, servindo como fonte de infeco para camundongos suscetveis. O vrus eliminado pelas fezes e pelas escoriaes epidrmicas muito estvel, podendo permanecer infeccioso por vrias semanas no ambiente. A patogenia consecutiva infeco viral segue o seguinte trajeto: a enfermidade se incuba por sete dias, e nesse perodo o vrus se multiplica no local da entrada, disseminando para os linfonodos regionais, seguindose de uma multiplicao viral no fgado e no bao e, finalmente, ocorrem infeces focais na pele, com o aparecimento de leses cutneas.
CONTROLE: o controle dos focos pode ser feito por sacrifcio dos camundongos da colnia. A derivao cesariana pode ser utilizada, visto que esta virose no se transmite verticalmente.
ROTAVRUS (EDIM)
O rotavrus um vrus RNA fita dupla, pertencente famlia Reoviridae, gnero Rotavirus, grupo A, possui de 65nm a 80nm, apresentando simetria esfrica, resistente ao ter, com a especificidade pelo citoplasma das clulas do epitlio intestinal. A diarria epizotica do recm-nascido uma infeco transmitida pelo ar e, quando endmica na colnia, ataca principalmente as fmeas primparas. O perodo de incubao depende da dose infectante e da idade do camundongo. Todos os camundongos de trs dias de idade infectados experimentalmente por via oral mostram sintomas no perodo de uma semana; entretanto, os camundongos de duas semanas de idade dificilmente
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manifestam enfermidade clnica. As fmeas multparas desenvolvem anticorpos neutralizantes quando expostas ao vrus e infectam sua primeira ninhada; no entanto, oferecem considervel proteo passiva s ninhadas seguintes.
TRANSMISSO:
em camundongos infectados com menos de duas semanas de idade, desenvolve-se uma viremia que persiste por dois dias. O vrus pode ser achado em vrios rgos, alcanando ttulos elevados no intestino e no contedo intestinal. As fmeas infectadas, quando adultas, apresentam viremia e vrus no intestino, e os machos adultos s apresentam infeco intestinal.
O vrus eliminado continuamente do intestino durante 17 dias depois da infeco, porm alguns camundongos podem apresentar anticorpos neutralizantes e continuar eliminado vrus pelas fezes. Clinicamente, a enfermidade afeta camundongos lactentes de 7 a 17 dias de idade e no se tem visto em camundongos com mais de 21 dias. O exame macroscpico dos lactentes infectados mostra fezes lquidas, de cor amarela, com presena de gases. O exame microscpico revela leses no intestino delgado que consistem no desprendimento das clulas das microvilosidades. A inflamao no uma caracterstica sempre presente nessas leses. Os camundongos adultos infectados no apresentam leses, ainda que estejam disseminando vrus. O diagnstico de laboratrio pode basear-se no isolamento do vrus e na produo de enfermidade tpica em camundongos jovens. Os anticorpos fixadores de complemento, especficos para a diarria epizotica (Edim), podem ser detectados no soro hiperimune, porm ausentes no soro convalescente. No entanto, a reao de imunofluorescncia especfica e muito sensvel, demonstrando a presena de antgeno no citoplasma das clulas epiteliais entricas tanto de infeces naturais como experimentais. A diferenciao entre o vrus da diarria epizotica e o vrus intestinal letal dos camundongos jovens deve ser levada em considerao, no s pelo curso da infeco, mas tambm pelo diagnstico e as medidas profilticas adotadas na colnia.
CONTROLE:
algumas colnias de camundongos portadoras dessa enfermidade tm sido tratadas com antibiticos, com alguns resultados positivos, porm esta no uma medida satisfatria. O controle eficaz feito atravs da derivao cesariana. A utilizao de gaiolas com filho na tampa constitui outro meio eficaz de controlar a enfermidade e prevenir sua disseminao.
INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES (ILAR). Long-term holding of laboratory rodents: a report of the Committee on long-term holding of laboratory rodents. Ilar News, 19:L1:L25, 1976. HSU, C. K.; NEW, A. E. & MAYO, J. G. Quality assurance of rodents models. In: SPIEGEL, A.; ERICHSEN, S. & SLLEVELD, H. A. (Eds.). Animal Quality and Models in Biomedical Ressarch. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1980. SMALL, J. D. Rodent and lagomorph health surveillance-quality assurance. In: FOX, J. G.; COHEN, B. J. & LOEW, F. M. (Eds.) Laboratory Animal Medicine. New York: Academic Press, 1984.
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323
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Controle bacteriolgico, micolgico e micoplasma
C ontrole Bacteriolgico, Micolgico e Micoplasma:

animal e ambiental
INTRODUO MICROBIOTA NORMAL
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Alexandre de Oliveira Saisse
Sade o resultado do equilbrio entre um ser vivo, seu meio ambiente e os diversos agentes que possam produzir doenas. O estado de sade de um ser vivo envolve as condies de bem-estar fsico, mental ou psicolgico e social.
importante saber, na microbiologia clnica, que os animais possuem espcies de microorganismos comuns em sua microbiota. Por isso h necessidade de um perfeito conhecimento direcionado para o modelo animal a ser trabalhado.
O ESTADO DE SADE
A exteriorizao do estado de sade se d pelo comportamento dos indivduos de uma colnia quando se encontram isolados ou em grupos. Conhecer as caractersticas de comportamento das diferentes espcies utilizadas em trabalhos experimentais de grande importncia para as avaliaes dirias das colnias de animais. Em geral, esses animais apresentam um comportamento social bem-definido, ajudando no estabelecimento de normas para o reconhecimento de animais-problema. Os mtodos clnicos usuais para avaliar as condies de sade de um animal ou de grupos de animais em biotrio se resumem em inspeo, palpao e auscultao. Nas rotinas dirias, a inspeo o mtodo mais utilizado, oferecendo dados importantes na orientao de mtodos de trabalho. A atuao dos tcnicos, com os grupos de animais, constitui um dos principais fatores para o sucesso de um exame laboratorial, pois ele se encarregar de visualizar, avaliar e encaminhar ao laboratrio de controle todos os animais que apresentem alguma anormalidade, fazendo constar os dados do animal (idade, sexo, comportamento etc.). Alguns fatores que podem interferir na sade dos animais de laboratrio:
ALOJAMENTO
densidade populacional, tipo de gaiola e freqncia de troca (gaiolas ou caixas). O elevado nmero de habitantes, a propagao de ectoparasitos e endoparasitos, bem como a disseminao de doenas respiratrias e de pele (fungos, abscessos etc.) tende a se elevar, principalmente pelo aumento da umidade e temperatura microambiente.
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OPERADOR um dos principais carreadores de contaminao para uma rea de criao, por isso h necessidade
de uma perfeita conscientizao quanto s normas de higienizao inerentes a sua rea de atuao. AMBIENTE dever ser desinfectado freqentemente com solues que tenham poder bactericida, fungicida e esporocida comprovados. TRNSITO DE PESSOAL deve ser restrito aos tcnicos que trabalham nas dependncias da rea de criao para evitar contaminaes externas. RAO constitui um potencial veculo de contaminao para os animais, pois pode conter bactrias e fungos. A carncia de vitaminas e de sais minerais, essenciais dieta alimentar, propicia o aparecimento de doenas. Devemos observar sua qualidade e o prazo de validade, bem como realizar exames peridicos (anlise centesimal e microbiolgica). como a rao, necessita ser trocada constantemente, pois no ato de o animal beber ocorre uma lavagem da parte bucal (refluxo) que volta ao frasco, contaminando assim a gua existente no bebedouro e podendo causar srios problemas. ANIMAIS a prtica da quarentena e a realizao dos exames (bactrias, fungos, vrus, micoplasma, ecto e endoparasitos) so indispensveis para garantir o seu status sanitrio.
GUA
Cada espcie animal criada em sala prpria, com tratadores especficos, evita a disseminao de microorganismos, por vezes presentes em vrias espcies.
CARACTERSTICAS SANITRIAS DOS ANIMAIS DE LABORATRIO

PELE E PLOS
CONDIES NORMAIS plos homogneos, brilhantes e sedosos com insero firme; pele elstica, hidratada
(mida), cor rsea, ou caracterstica da espcie ou linhagem. ALTERAES deficincia alimentar, desidratao, anemias, alergias, infeces, tumores, abscessos e ectoparasitoses. Dependendo da espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: Straphylococcus aureus, Dermatophytes (fungos) e Pasteurella pneumotropia.
MUCOSAS
midas, brilhantes e rseas. ALTERAES desidratao, anemias, deficincia nutricional, verminoses, infeces, hemorragia e tumores.
CONDIES NORMAIS
Dependendo da espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: bactrias e fungos.
OLHOS
CONDIES NORMAIS ALTERAES
brilhantes, midos e vivazes. inflamaes, enfiaes, carncia nutricional, alergias e irritao.
De acordo com a espcie, podemos encontrar, como causadores dessas afeces, os seguintes microorganismos: Pasteurella pneumotropica, Salmonela enteritidis, Staphylococcus aureus e Streptococcus moniliformis.
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APARELHO AUDITIVO
CONDIES NORMAIS ALTERAES
sensveis a estmulos sonoros de intensidade varivel conforme a espcie. inflamaes, infeces, distrbios neurolgicos ou circulatrios.
De acordo com a espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: Otites interna: Mycoplasma pulmonis, Pseudomonas aeruginosa e Streptobacillus moniliformis. Otites mdia: cilia associado a Bacillus respiratrio , Mycoplasma pulmonis, Pasteurella pneumotropica, Pseudomonas aeroginosa, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes.
APARELHO DIGESTIVO
boca e dentio normais, lbios ntegros e midos, mucosa bucal e gengiva midas e colorao compatvel com a espcie, esfago, estmago, intestino, fgado e pncreas sem alteraes. ALTERAES disfunes hormonais, avitaminoses, estresse, densidade populacional, infeces e tumores so alguns fatores que podem provocar distrbios do trato digestivo, causando leses na cavidade bucal, presena de diarria ressecamento de mucosas e edemas.
CONDIES NORMAIS
De acordo com a espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: Corynebacterium kutscheri, klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pulmonis, Estreptobacillus piliformis e Staphylococcus aureus. Existe uma grande variedade de microorganismos patognicos causadores de patologias no trato digestivo. De acordo com a espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces:
Laringe, faringe e traquia: Mycolplasma pulmonis Staphylococcus Streptococcus
spp pneumoniae Corynebacterium kutscheri Escherichia coli Proteus spp

Fgado: Bacillus
piliformis kutscheri Klebsiella pneumoniae Salmonella spp Streptococcus monilifomis

Corynebacterium
Intestino: Bacillus
piliformis spp Escherichia coli

Salmonella
APARELHO GENITURINRIO
CONDIES NORMAIS
Fmeas: aspecto morfolgico das glndulas mamrias normais, vagina mida com caractersticas prprias, sem presena de corrimento. Machos: com aspecto caracterstico sem presena de corrimento no trato urinrio.
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ALTERAES disfunes hormonais, avitaminoses, estresse, densidade populacional, infeces e tumores
so alguns fatores que podem provocar alteraes do trato geniturinrio. De acordo com a espcie, podemos encontrar como causadores dessas afeces, os seguintes microorganismos: Corynebcterium kutscheri, Klebisiella pneumoniae, Mycoplasma pulmonis, Estreptobacillus piliformis e Staphylococcus aureus.
APARELHO RESPIRATRIO
freqncia caracterstica da espcie, ausncia de rudos anormais (ronqueira ou chiado), espirros, tosse e corrimento nasal. ALTERAES irritao causada por poeira ou gases, infeces, pneumonia, bronquites, verminoses, alterao na capacidade respiratria, espirros, tosse e presena de corrimento nasal.
CONDIES NORMAIS
De acordo com a espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: Cilia associado a Bacillus respiratrio , Corynebacterium kutscheri, Mycolplasma pulmonis, Streptococcus pneumoniae, Bordetella sp e Pasteurella sp.
APARELHO CIRCULATRIO
freqncia caracterstica da espcie, colorao normal de mucosas, ausncia de edemas, sobretudo nas extremidades. ALTERAES desidratao, hemorragia, verminoses, malformao, infeces por vezes generalizadas, dificuldades de respirao, alterao da freqncia respiratria e edemas.
CONDIES NORMAIS
De acordo com a espcie, podemos encontrar como microorganismos causadores dessas afeces: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus spp, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pulmonis e Bacillus piliformis.
SISTEMA NERVOSO
crebro, cerebelo, medula, gnglios e nervos sem alteraes morfolgicas. ALTERAES provocadas por bactria ou vrus que comprometem direta ou indiretamente o sistema nervoso. Determinam incoordenao de movimentos, dificuldade visual, febre, apatia, perda de conscincia, convulses, paralisia, processos dolorosos ou parestesias, coma e morte. Podemos tambm constatar o aparecimento de clulas tumorais e verminoses com comprometimento do sistema nervoso.
CONDIES NORMAIS
De acordo com a espcie, podemos encontrar, como causadores dessas afeces, os seguintes microorganismos: Streptococcus pneumoniae, klebsiella pneumoneae e uma variedade de viroses. Como a relao dos sistemas ou aparelhos referidos no isolada existindo uma inter-relao fisiolgica entre eles , as diversas patologias se refletem de uns aos outros, evidenciando manifestaes associadas. Como rotina, so realizados exames de monitoramento, tais como: necropsia; histopatologia das leses; levantamento de ectoparasitos; levantamento de endoparasitos; sorologia; levantamento bacteriolgico.
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Em pesquisa bacteriolgica:
Coelhos: Salmonella Bordetella Pasteurella Cobaia: Salmonella Bordetella Hamster: Salmonella Rato: Bordetella Pasteurella Mycoplasma Camundongo: Mycoplasma Salmonella
CONTROLE DE REAS BIOLIMPAS

O controle de reas biolimpas comea com princpios que propiciam condies favorveis para manuteno dessas reas, onde so criados e mantidos os animais de laboratrio. Para que tal processo seja eficiente, necessrio que todas as etapas sejam normatizadas, para um melhor acompanhamento dos responsveis tcnicos, uma vez que o controle de tais reas depende de um trabalho conjunto (envolvendo os tcnicos da criao e os do laboratrio de controle da qualidade animal). Uma vez traadas as diretrizes, a operacionalizao imediata. O principal objetivo identificar pontos de possveis veculos de contaminao, que podem ser carreados para o interior das reas limpas. Com base nessa etapa, avaliar qual o melhor mtodo de verificao e acompanhamento desses pontos. Coletamos amostras em pontos de difcil limpeza, como tambm dos tratadores (tcnicos) e ainda de todos os locais de maior atuao dos mesmos. O tratador um dos principais agentes veiculadores de contaminao, caso no sejam cumpridas as normas de higiene estabelecidas. Como exemplo, temos: canto das paredes; lmpadas; maanetas; estantes; roupas; parede; luvas; dutos de ar (filtros). Os materiais so coletados com swabs estreis e enviados ao laboratrio e acondicionados em caldo nutriente. Posteriormente, so plaqueados em agar sangue e agar Mac Conkey. Em determinadas ocasies, quando necessitamos obter informaes sobre a eficincia da lavagem das salas, realizada pelo tcnico, bem como da eficcia do desinfetante, coletamos amostras (swabs) dos pontos onde foram lavados. Na prxima etapa, introduziremos os swabs em caldo Letheen, que se encarregar de inativar o poder residual do desinfetante e o conseqente crescimento de microorganismos que, provavelmente, permanecem na forma de esporo. Por fim, plaquear nos meios de phenil ethil e Mac Conkey.
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A manuteno das rotinas de higiene nas colnias de criao de animais de laboratrio , sem dvida, um dos pontos de maior importncia para o sucesso de uma criao ou de um experimento. Deve-se cuidar de todos os materiais que entram na colnia, alm da rao e gua, para que o trabalho no seja perdido em qualquer etapa. Todos os estgios de limpeza em um biotrio, como troca de gaiolas, limpeza de estantes etc., geram aerossis que podem conter bactrias; por isso, todo material deve ser limpo fora da rea bioprotegida.
BIBLIOGRAFIA
CARTER, G. R. & COLE JNIOR, J. R. Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Micology. 5th ed. San Diego: Academic Press, 1990. DE LUCA, R. R. et al. Manual para Tcnicos em Bioterismo. 2.ed. So Paulo: Winner Graph, 1996. NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Companion Guide to Infectious Diseases of Mice and Rats. Washington, D.C.: National Academy Press, 1991. WAGGIE, K. et al. Manual of Microbiologic Monitoring of Laboratory Animals. Washington, D.C.: NIH Publication, 1994.
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Tcnica de necropsia
T cnica de Necropsia
INTRODUO
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Por definio, necropsia (do grego nekros = cadver; opsis = vista) significa a abertura e a inspeo detalhada e metdica das cavidades e rgos do animal morto com o objetivo de determinar a respectiva causa mortis. A morte se caracteriza por fenmenos orgnicos que se exteriorizam rapidamente. A cessao dos movimentos respiratrios, a parada do corao, a perda da conscincia e da mobilidade voluntria, bem como o desaparecimento da reao reflexa de estmulos, so sinais imediatos da morte. O algor mortis, o rigor mortis, o livor mortis, as alteraes oculares, a coagulao do sangue, a autlise e a putrefao so modificaes que aparecem no corpo do animal, algum tempo aps a sua morte, e so denominados de alteraes cadavricas. Esses processos so esquematizados nas seguintes fases: fase da rigidez cadavrica; fase dos livores ou manchas cadavricas; fase gasosa; fase da coliquao; fase da esqueletizao. As trs ltimas j so de carter putrefativo. O algor mortis, isto , o esfriamento do cadver, se instala 1 a 24 horas aps a morte; o rigor mortis aparece mais ou menos 3 a 6 horas depois da morte e dura aproximadamente 24 horas, desaparecendo quando surgem os primeiros sinais de putrefao. Esse fenmeno surge primeiro nas plpebras, depois nos maxilares, logo aps no pescoo e finalmente nos demais msculos do corpo. O desaparecimento da rigidez se d na mesma ordem em que se instala; o livor mortis se caracteriza pelo surgimento de manchas violceas que se localizam nas regies de declive e faltam nas regies em que o corpo se apia. So de forma e tamanho variveis e bem perceptveis. Os rgos comprometidos por essa alterao cadavrica so, em geral, aqueles que ficam do lado em que o animal jaz. A opacidade da crnea, a retrao do globo ocular, por evaporao de lquidos, e o seu fechamento, pela rigidez nos msculos palpebrais, so as alteraes do olho que ocorrem aps a morte. A decomposio cadavrica caracterizada por uma srie de fenmenos, tais como manchas da putrefao, timpanismo ou meteorismo da putrefao, enfisema da putrefao, macerao e odor. Todos decorrentes da invaso e da difuso de germes (bactrias) da putrefao pelo corpo, quase sempre de origem intestinal; da o incio dos processos putrefativos na cavidade abdominal. As manchas da putrefao so de cor verde ou azuladas e irregulares; aparecem na pele e nos rgos em contato com os intestinos. A cor verde devida sulfametaemoglobina, formada pela ao do cido sulfrico, que surge das fermentaes bacterianas sobre a hemoglobina.
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O timpanismo da putrefao uma distenso por gases que ocorre nas cavidades gastrointestinais e responsvel pelo crescimento do abdmen e pela abertura dos membros, observados nos cadveres, muitas horas aps a morte. O enfisema cadavrico o aparecimento de pequenas bolhas gasosas no tecido conjuntivo subcutneo, sob as cpsulas do fgado, do bao e de outros rgos. A macerao da mucosa digestiva um desprendimento das respectivas mucosas e o pseudoprolapso retal. O odor da putrefao por ao da cadaverina e mais um sinal de decomposio cadavrica.
MATERIAL
Nunca se deve utilizar um nmero excessivo de instrumentos nas necropsias. Usar, apenas, os estritamente necessrios. Tratando-se de necropsia de animais de laboratrio convencionais (pequenos roedores e coelho), o material geralmente indispensvel o seguinte: cabo de bisturi; lmina de bisturi; tesoura reta e ponta fina; pina de disseco dente-de-rato; pina de disseco lisa; gaze em compressas. O tamanho dos instrumentos varia de acordo com o tamanho da espcie. Quando fazemos uma necropsia em espcies de mdio e grande porte, a esses instrumentos, devem ser juntadas as seguintes peas: faca de aougue, em nmero de duas; fuzil, a ser utilizado no afiamento das facas; martelo com cabo em gancho; serra eltrica ou articulada; tbua retangular ou quadrada, com 80 cm aproximadamente, para se colocar as vsceras e facilitar o exame das mesmas. Uma bandeja deve ser utilizada para se colocar os instrumentos empregados na necropsia, tomando-se cuidado para no deix-los dentro ou sobre o animal e, assim, provocar acidentes. fundamental que o operador, como tambm o seu auxiliar, estejam devidamente paramentados, usando jaleco, mscara, gorro e luvas cirrgicas descartveis. O emprego de luvas grossas de borracha mais recomendado quando so necropsias dos animais de mdio e grande porte para evitar que se rasguem com facilidade. Alm disso, elas devem, sempre que possvel, ser revestidas de luvas de linho ou algodo, cuja finalidade tornar os rgos e o instrumental menos escorregadio e proteger, as de borracha, contra eventuais cortes. O local da realizao da necropsia deve ser, preferencialmente, em uma sala prpria para esse fim, devidamente iluminada e ventilada. Quando se trata da necropsia de primatas no-humanos do Velho Mundo, ou de qualquer outra espcie que potencialmente possua risco de contaminao para o operador ou para o meio ambiente, a mesma deve ser realizada em uma capela de fluxo laminar.
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Tcnica de necropsia
METODOLOGIA
fundamental que um mdico veterinrio seja responsvel pelas necropsias, embora um tcnico bem treinado possa tambm realiz-las sob a superviso do primeiro. Da mesma forma, essencial ter conhecimento do histrico do animal antes de iniciar uma necropsia. Evidente que informaes sobre o animal, como espcie, linhagem, sexo, idade, peso, cor da pelagem, nmero e setor de origem ou experimento em que foi utilizado, so importantes e devem ser registradas em formulrio prprio. Esse histrico consiste basicamente dos dados relativos ao seu comportamento, sintomatologia, caractersticas ambientais do local onde era mantido e do experimento em que foi utilizado. Muitas vezes, em virtude da comparao do histrico do animal com os achados de necropsia se consegue estabelecer um diagnstico. Deve-se sempre ter em mente que exames complementares podem ser necessrios, uma vez que a avaliao macroscpica, muitas vezes, incapaz de detectar todas as leses. Para isso, recomenda-se que estejam disposio, durante uma necropsia, os materiais utilizados para exames histopatolgico, bacteriolgico, parasitolgico e bioqumico. Iniciamos a prtica da necropsia com o exame externo do cadver. Nesse exame, so observadas as alteraes cadavricas, o estado de nutrio do animal e as alteraes encontradas na pele e nos orifcios naturais. A observao das alteraes cadavricas nos permite estimar o tempo entre a morte e a necropsia; o estado de nutrio do cadver d indicaes muito teis ao diagnstico anatomopatolgico; um bom estado nutricional sugere uma morte por doena infecciosa aguda, intoxicao aguda ou traumatismo; os estados caquticos indicam doenas infecciosas crnicas, certas verminoses, senilidade, doenas orgnicas de evoluo lenta (cncer etc.). A pele e os plos devem ser examinados em toda a superfcie cutnea. Pele plida indica anemias, ao passo que amarelada indica ictercias. Hemorragias e ulceraes devem ser investigadas. Plos luzidios indicam doenas agudas enquanto os opacos indicam doenas crnicas. Presena de alopcia localizada comum em processos cicatriciais; quando difusa, sugere sarna, e circular, tinhas. A boca o primeiro orifcio natural a ser examinado. So inspecionados as gengivas, os lbios, a mucosa das bochechas, o cu da boca e a lngua. Segue-se com a cavidade nasal, os olhos, o conduto auditivo, o orifcio anal, o aparelho genital masculino e feminino e as mamas. Todas as alteraes encontradas, tais como ictercia, aftas, tumoraes, corrimentos, secrees, dentre outras, devem ser registradas e devidamente investigadas. O prximo passo a abertura propriamente dita do cadver. Dependendo do porte do animal, pode-se fix-lo mesa de necropsia adequada espcie. Em decbito dorsal e distendido, expe-se toda a regio ventral do animal. Promove-se a inciso longitudinal da pele sobre a linha mediana, desde a regio mandibular at a snfise pubiana. A pele rebatida aps divulso e sua textura, quantidade de tecido adiposo subcutneo e a cor dos tecidos so relevantes dados a serem registrados. A partir desse momento, deve-se optar pela abertura inicial da cavidade abdominal ou da cavidade torcica e nunca das duas simultaneamente. Isso porque, na eventualidade da existncia de lquido, seja em uma, seja em outra cavidade, o mesmo pode transvazar de uma cavidade para outra, confundindo o operador sob a real origem do lquido. Ao se optar pela cavidade abdominal, a musculatura abdominal incisada, tambm sobre a linha mdia, ou linha alba, desde a altura da cartilagem xifide at a snfise pubiana. A seguir, a mesma seccionada ao longo da linha da ltima vrtebra, tomando-se cuidado para no lesar os rgos abdominais. Desse modo, a musculatura abdominal pode ser rebatida lateralmente e podem ser observados a cor e a posio dos rgos abdominais, distenso intestinal, quantidade e caractersticas do fluido peritoneal. Por sua vez, a exposio dos rgos torcicos possvel, com a abertura da cavidade, sendo promovida por seces laterais do gradil costal, sobre as articulaes costocondrais e, aps seco do diafragma, pode-se rebater ou retirar o plastro. Junto do plastro esternal, observa-se o timo, localizado prximo base do corao.
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Descreveremos agora como remover as vsceras, porm no faremos descries dos mtodos de exame dos aparelhos e sistemas, pois fogem ao objetivo deste captulo. Deve-se iniciar a remoo das vsceras, seccionando-se o pavimento da cavidade bucal junto da face interna da asa da mandbula. Aps desarticulao dos ossos hiides, a lngua exposta para que, com o auxlio de uma pina, seja removida no conjunto lngua-esfago-traquia-pulmo-corao. O diafragma seccionado, circundando-se toda sua periferia. A disseco para retirada dos rgos completada pela seco dos ligamentos mediastnicos e dorsais do abdmen at as proximidades da pelve, e a remoo do conjunto de rgos obtida aps seco do reto. Os rgos do sistema urogenital so ento seccionados separadamente. A inspeo do sistema nervoso central no uma conduta comum durante a necropsia de animais de laboratrio. Porm, se h histria clnica que sugira qualquer anormalidade nessa rea, ela deve ser inspecionada. As pequenas espcies de roedores permitem que, aps o rebatimento da pele da cabea, o crnio seja seccionado com o auxlio de tesoura. Dessa forma, e aps inciso de sua parte posterior e de ligamentos da base da cavidade cranial, o crebro pode ser facilmente removido. Para colheita da medula espinhal, o animal deve ser mantido em decbito ventral e em seguida faz-se a disseco da pele e musculatura dorsais, desde a regio occipital at o osso sacro; da, seccionam-se as razes espinhais e as duas extremidades do arco neural, o que permite sua retirada por trao. Da mesma forma, o sistema msculo-esqueltico, assim como outros rgos, s examinado detalhadamente se apresentar alguma anomalia.
COLHEITA DE MATERIAL
Vrias tcnicas so empregadas para colheita de material em uma necropsia, dependendo do objetivo da investigao. As mais comuns so:
COLHEITA DE MATERIAL PARA EXAME ANATOMOPATOLGICO

O fragmento do espcime a ser coletado deve ter de 0,5 cm a 1,0 cm de espessura e contemplar o seio de leso, os limites das mesmas com o tecido normal e as reas aparentemente normais, circunvizinhas leso. A soluo fixadora , geralmente, a formalina constituda de soluo de formol a 10% ou 20%. Porm, como o cido frmico uma impureza nociva fixao dos tecidos, sugere-se a neutralizao do mesmo, atravs do uso de carbonato de clcio ou da formalina tamponada (pH 7), cuja frmula a seguinte: Formaldedo 100 ml gua Destilada 900 ml Fosfato Sdio Monobsico 4,0 g Fosfato Sdio Dibsico 12,3 g O frasco receptor dever ser de boca larga, para evitar eventuais compresses dos tecidos, e de tamanho suficiente para acondicionar a pea e a quantidade de soluo fixadora que de, aproximadamente, 15 vezes superior ao volume da pea. Alguns tecidos podem flutuar no fixador (pulmes normais e medula ssea normal, por exemplo); nesses casos, coloca-se um chumao de algodo ou gaze sobre os mesmos, de modo que haja sua imerso na soluo fixadora. A identificao do material deve estar rotulada no frasco e o seu transporte deve ser com cuidado para evitar o extravio ou a quebra do mesmo.
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Tcnica de necropsia
COLHEITA DE MATERIAL PARA EXAME PARASITOLGICO

No exame de ectoparasitos as sarnas so as mais comuns nos animais de laboratrio , procede-se da seguinte forma: com uma cureta ou um escalpelo, raspam-se at sangrarem (sem chegar hemorragia franca) os bordos de diversos pontos cutneos afetados; se possvel, os recentemente inflamados. Os raspados so recolhidos em tubo de hemlise ou em outro recipiente que possa ser fechado hermeticamente. Em seguida, remeter o espcime ao laboratrio, sendo dispensado qualquer conservador. Pode-se, ainda, obter um fragmento representativo da leso e envi-lo, em soluo fixadora de formol, para anlise. No exame de endoparasitos, o material pode ser coletado diretamente dos intestinos do animal durante a necropsia, colocados em frascos ou placas de Petri com soluo de salina e encaminhados imediatamente para o laboratrio. Os cuidados com a identificao e o transporte do material tambm devem ser observados.
COLHEITA DE MATERIAL PARA EXAME BACTERIOLGICO

Este procedimento deve ser feito antes de qualquer interferncia sobre o rgo e sob condies de total assepsia, para a qual utiliza-se lcool 70, ou outra soluo anti-sptica, e todos os instrumentos necessrios devero estar estreis. Sangue, tecidos e tambm secrees so utilizados para identificao de bactrias. O material deve ser remetido rapidamente ao laboratrio, acondicionado de maneira a conserv-lo fresco, ou seja, refrigerado.
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Alternativas para animais de laboratrio: sistemas in vitro
A lternativas para Animais de Laboratrio:

sistemas in vitro
HISTRICO
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Maria das Graas Mller de Oliveira Henriques Andr Luiz Franco Sampaio
H muitos anos os seres humanos tm utilizado animais para melhor compreender a anatomia, fisiologia e os mecanismos envolvidos no desenvolvimento das doenas. O trabalho mdico mais antigo que se tem conhecimento, o Corpus Hippocraticum (cerca de 350 a.C.), j contm descries de experimentos com porcos. No entanto, a partir de meados do sculo XIX, a experimentao animal ganhou um novo mpeto, principalmente, devido aos avanos nas cincias bsicas da medicina, tais como a anatomia e fisiologia, e no como se imagina, pelo desenvolvimento de novas terapias e imunoprofilaxias. A primeira tentativa para vacinao foi feita na China, logo no incio do sculo VI d. C., baseada em observaes em seres humanos. Um dos primeiros textos sobre medicina chinesa, The golden mirror of medicine, lista diversas formas de inoculao contra varola, tais como inalao de raspas de escaras de varola e a introduo de um pedao de algodo com contedos da vescula da varola no nariz (Plotkin & Plotkin, 1988).
UMA ABORDAGEM CIENTFICA PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINAS E MEDICAMENTOS

A primeira tentativa cientfica para controlar uma doena infecciosa atravs de inoculao sistemtica atribuda a Edward Jenner. Aps 25 anos de estudos, Jenner publicou seus achados sobre varola e varicela em 1798 (Jenner, 1798). Esta publicao tambm contm resultados de seu experimento realizado em 1796, no qual um menino de oito anos de idade, chamado James Phipps, foi inoculado com material de varicela e, em seguida, inoculado com o vrus da varola. Tal como diversos outros desenvolvimentos da medicina, a introduo da vacinao contra a varicela encontrou muito ceticismo. Porm, com o passar dos anos, esse mtodo encontrou ampla aplicao. interessante notar que o estudo de Jenner foi completamente baseado em observaes em seres humanos e experimentos envolvendo animais no contriburam de forma alguma nesses resultados. Passaram-se 84 anos entre a proposta de Jenner para vacinao de varola e o desenvolvimento de uma primeira vacina baseada em pesquisa cientfica, a vacina contra clera, desenvolvida por Pasteur em 1880. Durante esse tempo, o campo da pesquisa no estava parado. No geral, a maior ateno era dedicada ao desenvolvimento de estudos comparativos de patologia e a tentativa de compreenso da etiologia de doenas. A crena inicial de que um miasma (uma emanao malvola) era o causador das doenas foi substituda pela compreenso de que as infeces poderiam ser causadas por organismos vivos. Em 1840, o patologista e anatomista alemo Jacob Henle (1809-1885) publicou seu trabalho sobre doenas contagiosas, no qual demonstrava que organismos vivos, e no miasmas, eram os causadores de doenas.
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Ele concluiu que, para estabelecer a associao entre o agente causal e a infeco, essencial cultivar o microorganismo fora do agente hospedeiro (apud Brown, Cussler & Hendriksen, 1996). O postulado de Koch, publicado em 1884, tem importncia histrica com relao ao papel de animais de experimentao no estudo de doenas infecciosas; ele estabelece o critrio para co-relacionar um microorganismo com uma infeco e inclui o isolamento do microorganismo em cultura pura, a partir de material coletado de um paciente, seguido pela introduo da cultura em um animal experimental apropriado. O postulado de Koch ganhou uma aceitao geral na microbiologia e ajudou a estabelecer as bases para o intenso uso dos animais de laboratrio. O uso de animais de experimentao assumiu ento, a partir dessa data, uma posio-chave na clnica e na patologia experimental. A necessidade de bons modelos experimentais utilizando animais aumentou quando se descobriu que nem todas as espcies so igualmente sensveis aos microorganismos patognicos. Por exemplo, Koch utilizou camundongos, cobaias e coelhos em seus estudos sobre carbnculo maligno, levando rapidamente ao desenvolvimento de uma vacina. Nos casos em que foi difcil encontrar um modelo animal adequado, como no caso da poliomielite, as investigaes estagnaram durante muitos anos. Entretanto, resultados rpidos tambm foram obtidos na pesquisa com a difteria, quando encontrou-se um modelo relativamente simples em cobaias (Hendriksen, 1988). No Quadro 1, podemos observar a intensificao das descobertas a partir da introduo da experimentao em animais de laboratrio. Quadro 1 Fatos importantes no estudo de doenas infecto-contagiosas
ANO 1796 1840 1880 1881 1884 1894 1928 1949 DESCOBERTA Edward Jenner descreve a vacina contra varola atravs de observaes e experimentaes em seres humanos Jacob Henle descreve o microorganismo como agente causal das doenas Pasteur desenvolve a vacina contra clera Pasteur desenvolve a vacina anti-rbica Koch isola o agente causador da tuberculose e publica o postulado de Koch Roux e Martin desenvolvem a vacina contra difteria Fleming descobre a penicilina Enders, Weller e Robbins descrevem a primeira vacina contra poliomielite
BEM-ESTAR DOS ANIMAIS E O INTERESSE EM ALTERNATIVAS PARA OS TESTES EM ANIMAIS DE LABORATRIO

As implicaes ticas da experimentao animal foram debatidas violentamente desde o incio. Em 1760, o fisiologista ingls Ferguson (1710-1776) descreveu o tratamento brbaro a que animais eram submetidos em alguns experimentos. As reflexes sobre relao entre homem e animal foram grandemente influenciadas pelos conceitos ticos formulados por Jeremy Bentham (1748-1832). Bentham considerava a capacidade de sofrer dos animais como uma caracterstica essencial para que fossem tratados com benevolncia. A Inglaterra era o centro da oposio aos animais de experimentao e, em 1842, foi criada a Sociedade Britnica para Preveno da Crueldade com Animais, considerada a primeira sociedade mundial protetora de animais. No entanto, o desenvolvimento da cincia mdica e, sobretudo, a descoberta da vacina contra difteria, causaram profundo impacto na opinio pblica. O fato de que pesquisas envolvendo animais levaram
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preveno de uma doena que vitimava milhares de crianas anualmente, convenceu at mesmo os crticos mais aficcionados da necessidade de tais estudos. Apesar disso, a oposio ao uso de animais de experimentao sempre esteve presente, com perodos de declnio e reincidncia. Porm, com o advento do desenvolvimento de vacinas e dos primeiros antibiticos, teve incio um uso muito mais intenso e sistemtico de animais de experimentao. Estes passaram a ser utilizados em ensaios para o desenvolvimento de novas vacinas, na busca de novos medicamentos eficazes contra dezenas de doenas e, tambm, no controle de qualidade das vacinas e dos medicamentos j desenvolvidos. A sociedade passou a ficar preocupada, ento, com a quantidade de animais e o tipo de tratamento recebido por eles durante esses ensaios.
TRATAMENTO HUMANITRIO
Os pesquisadores ingleses Russel & Burch (1959) publicaram O Princpio da Tcnica Experimental Humanitria e introduziram o conceito dos 3Rs. Replacement substituio de espcie por outra mais abaixo na escala zoolgica ou para microorganismos, ou, se possvel, para material no biolgico; Reduction reduo do nmero de animais utilizados; Refinement refinamento das tcnicas para minimizar o nvel de estresse e dor causada ao animal durante a experimentao. Esse trabalho de conscientizao teve grande repercusso em diversos pases do mundo e em diversos estratos da sociedade, mudando a viso das pessoas sobre o uso dos animais e levando a uma reflexo se o uso de animais de laboratrios poderia ser minimizado. No apenas a pesquisa cientfica bsica que faz uso de animais de experimentao. Os maiores usurios so as indstrias farmacuticas e de cosmticos. Essas indstrias demandam milhares de animais anualmente, que so utilizados nos diversos testes solicitados por organismos mundiais para a investigao da segurana de uso e validao dos produtos fabricados. A utilizao dos animais para os testes toxicolgicos de novos produtos farmacuticos e cosmticos tem sido alvo de grandes protestos mundiais. De um lado esto as sociedades protetoras, contra os testes; de outro, a indstria e at mesmo alguns rgos governamentais, defensores da necessidade dos testes para garantir a segurana e a eficcia dos produtos fabricados. Atualmente, h um grande movimento internacional, baseado nos 3Rs, para a validao e a aplicao de novas tcnicas, especialmente in vitro, para o desenvolvimento de novos produtos farmacuticos, cosmticos e imunobiolgicos. Atendendo a presses de organismos internacionais, as indstrias farmacuticas e de cosmticos tm sistematicamente adotado metodologias mais modernas que atendam aos 3Rs para o desenvolvimento de seus produtos.
OS 3RS NO DESENVOLVIMENTO DE IMUNOBIOLGICOS E FRMACOS

A indstria de imunobiolgicos tambm uma grande usuria de animais na produo de vacinas, alm dos testes de eficcia e segurana. Hoje, com a adoo de sistemas in vitro de cultura de clulas, pode-se substituir completamente o uso de animais ou seus derivados para as fases de produo e testes de algumas vacinas. O Quadro 2 ilustra alguns casos nos quais mtodos alternativos podem ser utilizados para a substituio, ou pelo menos reduo do uso de animais, na produo de vacinas.
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Quadro 2 Mtodos alternativos para a substituio ou reduo do uso de animais na produo ou teste de vacinas
ANIMAL OU MTODO VACINA Adenovrus Difteria Catapora Plio Raiva Rubola Varola Ttano Febre Amarela Macaco Cachorro Coelho Camundongo Clulas humanas Ovos com embrio Teste de de galinha Floculao P P PT P P P P T T T PT T P P PT P P PT P P P PT T
P Produo; T Teste.
Na indstria farmacutica, o uso de animais permitiu o desenvolvimento de medicamentos para as mais diversas enfermidades e doenas durante muitos anos. Entretanto, novos mtodos tm sido aplicados no desenvolvimento de novos frmacos, especialmente na fase de descobrimento e, em alguns casos, nos estudos toxicolgicos. Na indstria farmacutica, e tambm de cosmticos, um dos grandes viles o teste de Draize, amplamente utilizado e recomendado por organismos internacionais para a determinao do potencial irritante de produtos nos olhos. Atualmente, alguns mtodos in vitro tentam minimizar o teste de Draize mediante a avaliao dos produtos em sistemas de cultura de tecidos ou clulas (fibroblastos). Esses testes podem detectar o grau de irritabilidade dos produtos, servindo como um pr-teste, evitando assim o uso excessivo de animais. Entretanto, o uso mais amplo dessas metodologias ou a substituio do teste de Draize ainda so motivos de acirrados debates no meio cientfico. Uma das reas que mais obteve sucesso na utilizao dos 3Rs foi a pesquisa de novos frmacos. A indstria farmacutica conta hoje com sistemas robotizados capazes de processar milhares de amostras por dia, sendo capazes de testar essas amostras em diversos alvos moleculares ou celulares para o desenvolvimento de novos frmacos. Os modelos utilizados para os ensaios podem compreender sistemas enzimticos, essenciais para o desenvolvimento de algumas doenas ou para a sobrevivncia de parasitas vrus, ou ainda sistemas de culturas de clulas, em particular as tumorais, para o desenvolvimento de novos quimioterpicos. Esses ensaios permitem a avaliao de grande quantidade de amostras em curto prazo e, apesar de no serem definitivos, podem orientar a continuidade da pesquisa. Na seqncia, so realizados ainda ensaios in vitro mais sofisticados e, s ento, iniciam-se os estudos com animais de laboratrio comeando-se sempre com animais de pequeno porte como camundongos, ratos e cobaias.
A VALIAO F ARMACOLGICA P RIMRIA E NSAIOS IN V ITRO

Na busca de produtos naturais ou sintticos com atividade antiinflamatria, imunomoduladora, antineoplsica ou contra parasitos protozorios, pode-se utilizar diferentes ensaios in vitro para a determinao da atividade biolgica dessas molculas.
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AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATRIA OU IMUNORREGULADORA

Na avaliao primria de compostos com atividade antiinflamatria ou imunorreguladora, podem ser feitos ensaios utilizando linhagem de clulas mantidas em cultura, substituindo por completo o uso de animais neste passo, avaliando-se a produo de xido ntrico, proliferao de linfcitos e produo de citocinas. Esses ensaios so bastante informativos j que tanto o xido ntrico como as citocinas possuem uma participao, seja em processos inflamatrios, seja em respostas imunes.
P RODUO
DE
XIDO N TRICO
O xido ntrico (NO) um mediador inflamatrio produzido quando macrfagos, entre outras clulas, so ativados (Fig. 1). O NO pode atuar tanto no desenvolvimento de reaes inflamatrias quanto na atividade bactericida ou antiparasitria dessas clulas. Quando alguma substncia consegue inibir a sua produo, isso indica um potencial papel antiinflamatrio. No entanto, se alguma substncia for capaz de aumentar a sua produo, isso pode ser um indicativo de uma potencial atividade estimuladora das atividades antiparasitria ou bactericida dos macrfagos. Figura 1 Ensaios que podem ser utilizados na descoberta de novos frmacos como alternativa ao uso de animais
DOSAGEM DE CITOCINAS Induo da produo de citocinas na presena das amostras
PRODUO DE XIDO NTRICO Induo da produo de xido ntrico na presena das amostras
LINFOPROLIFERAO Estimulao dos linfcitos com mitgeno na presena das amostras
Recolhimento do sobrenadante 24 a 72 horas 24 horas
Recolhimento do sobrenadante 72 horas
3H
Adio de -Timidina
Determinao da produo de citocinas pelo mtodo de ELISA Elaborao: Andr L. F. Sampaio
Reao de Griess para dosagem de nitrito Leitura da D.O. em leitor de ELISA a 540nm
Transferncia das clulas para papel e aquisio dos resultados em cintilador
P RODUO
DE
C ITOCINAS
As citocinas constituem uma famlia de peptdeos com diversas atividades biolgicas e so produzidas, principalmente, por linfcitos e macrfagos. A regulao da produo de diferentes citocinas pode desempenhar um papel tanto antiinflamatrio como imunomodulador. Na Fig. 1 est representada uma metodologia que pode ser utilizada para se avaliar o efeito de novos compostos sobre a produo de citocinas. Entre as citocinas que podem ser avaliadas, podemos citar: interleucina (IL)-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, o fator de necrose tumoral e o interferon-g.
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PROLIFERAO DE LINFCITOS
A avaliao da capacidade de um composto em inibir a proliferao de linfcito fornece uma informao fundamental para o desenvolvimento de novos frmacos imunossupressores. Esses frmacos tm aplicao fundamental no tratamento de doenas auto-imunes e na rejeio de transplantes. Nessas situaes, ocorre uma multiplicao e ativao exagerada dos linfcitos que passam a ter uma atuao nociva ao organismo. Nesses experimentos, os animais servem de fonte de clulas para os ensaios.
A VALIAO
DA
A TIVIDADE ANTINEOPLSICA
Na busca de novos medicamentos contra neoplasias, pode-se iniciar os testes com ensaios sobre alvos moleculares, relacionados com a resistncia das clulas tumorais quimioterapia convencional, ou com linhagens de clulas tumorais em cultura. Existem diversas linhagens desenvolvidas a partir de tumores malignos de camundongos, macacos e seres humanos que hoje so mantidas exclusivamente em cultura, muitas delas resistentes a mltiplas drogas antitumorais. A proliferao dessas clulas pode ser avaliada frente a diferentes concentraes da amostra que se pretende testar, monitorando a sobrevida e a taxa de multiplicao celular. Quanto mais eficaz for uma substncia em matar a clula em cultura ou impedir sua proliferao, maior ser seu potencial como frmaco contra neoplasias. A grande vantagem do uso dessa metodologia reside na diminuio do nmero de substncias para testes posteriores em animais, j que tais testes podem ser extremamente agressivos, dependendo da linhagem tumoral inoculada nos animais.
ATIVIDADE
CONTRA
PARASITAS
Pode-se tambm testar amostras contra o crescimento de parasitas in vitro. Esses testes podem ser feitos tanto em culturas puras dos parasitas como em cultura de clulas infectadas. Em tais experimentos, avalia-se a capacidade da amostra em matar o parasito diretamente, ou aps a interao do parasito e as clulas em uma cultura mista. Caso uma amostra mostre-se capaz de matar o parasito nessas condies, a ela atribuda uma atividade farmacolgica que permite o prosseguimento dos estudos.
HOME PAGES DE INTERESSE

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Criao e produo de animais transgnicos e nocautes
C riao e Produo de Animais Transgnicos e Nocautes

INTRODUO
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Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay
Animais transgnicos so aqueles cujo genoma foi modificado pela introduo de seqncias de DNA de outro organismo. Muitas vezes tais seqncias so manipuladas por engenharia gentica de tal forma que constituem uma mistura de pedaos de DNA vindo de diversas origens. No caso de animais nocautes, a modificao gentica introduzida capaz de interromper ou anular um gene que, ento, no mais se expressa, sendo denominado de nocauteado. A idia de se introduzir material gentico em um embrio data da dcada de 70 do sculo XX quando a tecnologia de DNA recombinante se tornou uma realidade. As primeiras tentativas se valeram da infeco por vrus que carreavam em seu interior pedaos de DNA exgenos, mas logo as tcnicas de microinjeo revolucionaram a capacidade de se introduzir um gene clonado no interior do ncleo do embrio. Hoje em dia algumas metodologias so utilizadas na produo de um camundongo transgnico, como:
MICROINJEO
NO
PR-NUCLEO MASCULINO
A microinjeo no pr-nucleo consiste na introduo de uma soluo de DNA diretamente no prnucleo de um ocito recm-fecundado. Em cerca de 30% dos ocitos assim manipulados, o DNA exgeno vai se integrar no genoma e embries transgnicos sero produzidos. OBS.: animal nocaute um animal que nulo para um determinado gene, ou seja, esse gene teve seus alelos modificados geneticamente de modo a no mais produzirem uma protena ativa. Figura 1 Esquema de microinjeo pr-nuclear
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A) Introduo da agulha de microinjeo no pr-ncleo masculino do ovo fertilizado. B) Aps a injeo, verifica-se o aumento do pr-ncleo. Em ambos os casos o ovo est mantido em posio por uma pipeta de sustentao (Hogan et al., 1994).
TRANSGNESE MEDIADA POR CLULAS ES

Uma maneira diferente de se introduzir genes exgenos em uma linhagem de camundongo pela transformao inicial de clulas-tronco embrionrias e posterior introduo dessas clulas no embrio em fase de mrula ou blastocisto. As clulas totipotentes utilizadas nesses experimentos so as clulas ES (Embryonic Stem Cell). Clulas ES so clulas obtidas da massa interna de um blastocisto e que so mantidas em sua forma indiferenciada, podendo gerar toda e qualquer clula do organismo. Em geral o transgene contm, alm do DNA a ser estudado, um gene de resistncia a drogas (neomicina) e um gene-reprter como o gene Lac Z de Escherichia coli ou GFP. Esse transgene transferido para as clulas ES por eletroporao e 1% destas tero de uma a vrias cpias do DNA exgeno integrado. Aps a eletroporao, aquelas que contm o transgene sero selecionadas pela presena do antibitico no meio de cultura. As clulas transformadas sero ento injetadas para a formao de um embrio quimrico, isto , formado por clulas ES transformadas e clulas do embrio recipiente. Essa tcnica a nica que pode ser utilizada para fazer o nocaute de um gene, uma vez que a troca do gene normal pelo DNA exgeno que ir anular o gene ocorre por recombinao homloga e esse fenmeno acontece em maior freqncia nas clulas ES. Figura 2 Modificao gentica introduzida em um lcus
Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).
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A) Modificao por troca do DNA no lcus. B) Modificao do lcus pela insero de um fragmento de DNA.
INFECO POR RETROVRUS

Neste caso, o DNA exgeno deve ser inserido num vetor retroviral que ser, ento, injetado diretamente no ocito fertilizado. Figura 3 Construo retroviral para transferncia de um transgene
SEQNCIAS VIRAIS
Outras metodologias tm sido tentadas alternativamente, mas com menor eficincia. Em todos os casos o primeiro passo dessa tecnologia consiste na obteno de ocitos fertilizados ou embries no incio do desenvolvimento. Tendo em vista que cada fmea de camundongo produz, por ciclo, cerca de 8 a 12 ovos que sero liberados naturalmente, torna-se necessrio encontrar maneiras de se aumentar o nmero de ovos obtidos. Isso possvel estimulando as fmeas com um regime hormonal; este consiste na injeo de 5UI de PMS (pregnant mare serum) e 46 horas aps 5UI de HCG (human chorionic gonadotrophin). O acasalamento das fmeas logo aps a ltima injeo pode levar obteno de 30 a 60 ovos de cada fmea dependendo da linhagem utilizada. Desses ovos, aqueles que estiverem fertilizados podero ser, ento, utilizados para microinjeo. No caso de se estar trabalhando com a transgnese via clulas ES, os ovos s devero ser recuperados nos estgios de mrula ou blastocisto (2,5 ou 3,5 dias ps-coito) quando sero injetados com as clulas ES transgnicas. Nos dois casos, os ovos ou embries injetados devero ser reimplantados em camundongas barriga de aluguel. Estas so pseudogrvidas obtidas pelo cruzamento de fmeas no perodo de estrus com machos vasectomizados. A implantao se dar na ampola do oviduto, para os ocitos fertilizados; no oviduto para as mrulas, e no tero para os blastocistos.
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Figura 4 Esquema geral da obteno de um fundador portando um transgene
PSEUDOGRVIDA
Portanto, um aspecto importante para se produzir animais transgnicos o acesso a um biotrio de qualidade que fornea uma quantidade razovel de camundongos de idades e linhagens determinadas.
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O BIOTRIO IDEAL PARA SE CRIAR ANIMAIS TRANSGNICOS

Idealmente todo animal de experimentao deve ser mantido num ambiente livre de patgenos como vrus, bactrias e parasitas que podem alterar os resultados de um experimento. No caso de animais transgnicos ainda mais importante a qualidade do biotrio, tendo em vista que eles so mais frgeis devido manipulao gentica. Portanto, um biotrio projetado especialmente o ideal quando se deseja produzir ou criar animais transgnicos. Nos casos mais restritos, como quando se estabelecem colnias de camundongos nocautes para genes imunolgicos, barreiras devem ser criadas para se aumentar o isolamento da colnia. Nesses casos, os bioteristas e pesquisadores devem tomar uma ducha e trocarem toda a vestimenta ao entrar no biotrio. Todo o material de consumo como gua, comida, maravalha, suplementos, gaiolas etc. devem ser autoclavados antes de penetrar no ambiente. Os animais vindos de outros laboratrios ou fornecedores devem passar por uma quarentena e serem testados para diferentes patgenos. Em casos em que a imunidade dos animais no est em questo, barreiras menos rgidas so exigidas. Por exemplo, o banho dos que adentram o biotrio pode ser eliminado. No entanto, quando os animais so extremamente frgeis, o melhor manter a colnia pequena e dentro de isoladores. O mesmo deve ser feito quando o problema for a sade do experimentador e no a do animal. Um aspecto importante a climatizao do biotrio. Biotrios com patgenos controlados, geralmente, tm de manter as salas de animais com presso positiva para que os germes tenham dificuldade de entrar. Porm, biotrios que mantenham animais geneticamente modificados devem, por lei, manter uma presso negativa em relao ao meio ambiente, uma vez que o que deseja conter so os animais modificados. Assim sendo, num projeto de biotrio em que se mantenham animais do tipo selvagem e aqueles geneticamente modificados deve-se pensar em ter salas com presso positiva e filtros esterilizantes para se manter as colnias selvagens e os animais imunologicamente deficientes. Entretanto, animais modificados que possam representar um risco para o meio ambiente ou para o homem devem ser mantidos em salas com presso negativa. O biotrio como um todo por sua vez deve ser mantido em presso negativa em relao ao meio externo. Um desenho que pode ser tomado como modelo para um biotrio desse tipo pode ser visto na figura a seguir. Figura 5 Planta de um biotrio de transgnicos
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QUE ANIMAIS DEVEM SER UTILIZADOS NA PRODUO DE TRANSGNICOS

O background gentico parece ter influncia na penetrao de um fentipo nocauteado; portanto, muitas vezes linhagens especficas tm de ser utilizadas. Em princpio, qualquer linhagem de camundongo pode ser modificada geneticamente, mas algumas apresentam vantagens experimentais. Linhagens inbred ou hbridas F1 variam em relao ao nmero de ovos que produzem aps superovulao. Geralmente, elas podem ser divididas em duas categorias, as que so boas superovuladoras (colocam 40 a 60 ovos por camundonga) e aquelas que superovulam mal (15 ou menos ovos por camundonga). Como o nmero de ovos obtidos sempre um fator limitante num experimento de transgnese, deve-se escolher uma linhagem boa superovuladora para trabalhar. Entre estas podemos citar a C57BL/6J, a BALB/cByJ, a 129/SvJ ou ainda hbridas de C57BL/6J com CBA/CaJ, DBA/2J ou BALB/cByJ. A deciso de qual dessas linhagens utilizar levam em conta se a cor do plo ser um indicador da transgnese. Isso ocorre nos experimentos de nocaute em que o camundongo gerado uma quimera formada por clulas do blastocisto e por clulas ES transformadas. Para se ter uma noo de quanto as clulas ES transgnicas contriburam no desenvolvimento do animal, basta utilizar, por exemplo, clulas de um camundongo de plo marrom num blastocisto obtido de camundongo de plo preto. A quimera resultante apresentar o plo de duas cores, como pode ser visto na figura a seguir. Figura 6 Esquema geral de obteno de quimeras
OBTENO DE BLASTOCISTO 3,5 dias aps a cpula, por lavagem dos teros da fmea de plo branco
Blastocistos so colocados em cultura para gerar linhagens ES
As clulas manipuladas so injetadas de volta em novos blastocistos, agora obtidos de fmea de plo preto implantao do blastocisto
Prole quimrica com plos de duas cores
camundongo selvagem
Na F1 verificamos que filhotes transmitiram a modificao gentica
Fonte: modificado de Stephane Viville em Houdebine (1997).

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Para se maximizar o nmero de ovos obtidos de camundonga superovulada, deve-se cruz-la com machos que tenham uma alta contagem de esperma e uma boa capacidade de cpula. Esses machos so mantidos em gaiolas separadamente. Portanto, o biotrio de transgnicos dever manter camundongos, para diversas finalidades, que podem ser de linhagens diferentes como listado a seguir:
FMEAS JOVENS PARA PRODUO DE OVOS FERTILIZADOS

Como dissemos anteriormente, vrias linhagens inbred ou hbridas podem ser utilizadas nessa etapa. Para se produzir o nmero necessrio de fmeas jovens ( 3 semanas) para superovulao, necessrio um nmero de 20 gaiolas contendo um macho e uma fmea que iro produzir uma prognie de cerca de 20 fmeas por semana para experimentao.
MACHOS FRTEIS
Cerca de 20 gaiolas contendo machos jovens e frteis de pelo menos 8 semanas devem ser mantidas no biotrio de transgnese. Esses machos sero utilizados para cpula com as camundongas superovuladas. Eles podem ser hbridos como estas ou inbred de uma das linhagens utilizadas para a produo das hbridas.
MACHOS V ASECTOMIZADOS
Machos estreis so necessrios para gerao de camundongas pseudogrvidas. Eles so vasectomizados e qualquer linhagem com boa capacidade de cpula pode ser utilizada. Aps a vasectomia, eles devem ser testados para sua esterilidade antes de serem utilizados para experimentos. Para se obter 4 a 8 fmeas pseudogrvidas 5 dias por semana, so necessrios cerca de 20 machos estreis a serem mantidos em gaiolas separadas.
FMEAS
PARA
SERVIREM
COMO
RECIPIENTES
Fmeas pseudogrvidas so preparadas pelo acoplamento de fmeas em estrus natural com machos vasectomizados. As fmeas devem ter, no mnimo, 6 semanas e pesar ao menos 20 g sem serem muito gordas. Fmeas de algumas linhagens apresentam vantagens como recipientes. Por exemplo, camundongos CD1 (Charles River Laboratories) tm ampolas muito largas que ajudam na transferncia para os ovidutos e hbridas F1 (B6x x CBA) so timas mes e so capazes de manter ninhadas to pequenas como dois filhotes. Como, em geral, cada fmea entra em estrus e ovula a cada 4 a 5 dias, numa colnia 20% a 25% das fmeas estar em estrus a cada dia. Desse modo, so necessrias pelo menos 50 fmeas de idade entre 2 a 5 meses para a produo de cerca de 20 plugs por semana.
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HOGAN, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. HOUDEBINE, L. M. (Ed.). Transgenic Animals generation and use. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 1997.
BIBLIOGRAFIA
JOYNER, A. L. Gene Targeting a pratical approach. Oxford: IRL Press, 1995. (The Pratical Approach Series)
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Alternativas para animais de laboratrio: uso de...

INTRODUO
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uso de animais no-convencionais roedores silvestres

Paulo Sergio DAndrea Andr Luiz Rodrigues Roque Bernardo Rodrigues Teixeira
Os animais silvestres e seus parasitos tm recebido, recentemente, especial ateno por causa do surgimento de novas doenas humanas, conhecidas por doenas infecciosas emergentes, ou no caso de enfermidades consideradas anteriormente controladas no meio urbano, re-emergentes (Spear, 2000; Daszak, Cunningham & Hyatt, 2000, 2001). A expanso desordenada das fronteiras agrcolas, a fragmentao de hbitats naturais e a popularizao do ecoturismo tm levado o homem a um maior contato com ciclos j estabelecidos entre animais silvestres e seus parasitas, permitindo a formao de um gradiente contnuo de transmisso entre esses trs segmentos (Deem et al., 2000; Fayer, 2000). Apesar de importantes, so raros os estudos de interao parasito-hospedeiro que empregam como modelo experimental os reservatrios naturais (Bastos et al., 1984; Scott & Lewis, 1987; Machado e Silva et al., 1991; Souza et al., 1992; Maldonado et al., 1994; Ribeiro et al., 1998). Isso se deve, certamente, s dificuldades de se padronizar, em condies de laboratrio, o manejo adequado para a manuteno de colnias e produo de animais para experimentao. Desse modo, essas resultam, quase que invariavelmente, em colnias efmeras, mantidas somente durante o perodo de experimentao sem que se disponibilize, para o meio cientfico, as informaes sobre a criao dos animais. O conhecimento sobre a biologia dos hospedeiros fundamental antes de se iniciar os estudos sobre o parasitismo. Como exemplo, citamos os estudos da interao de Didelphis marsupialis com Trypanosoma cruzi, que esclareceram numerosos aspectos, ainda inditos, da biologia desse marsupial (Deane, Lenzi & Jansen, 1984; Motta, 1988; Jansen et al., 1991, 1997). Tais parmetros biolgicos so bsicos nos estudos epidemiolgicos que envolvam a ecologia de populaes de reservatrios (Bonvicino et al., 1996; Gentile et al., 2000; DAndrea, Gentile & Cerqueira, 1999; DAndrea et al., 1999, 2000). O objetivo deste captulo abordar, de forma sinttica e pedaggica, a questo da utilizao de roedores silvestres como modelos experimentais alternativos, principalmente para estudos sobre parasitos que afetam o homem.
POR QUE UTILIZAR ROEDORES SILVESTRES

A utilizao experimental de reservatrios silvestres permite abordar o fenmeno do parasitismo de maneira mais prxima s condies em que ele ocorre na natureza, permitindo a avaliao da patogenicidade de um agente no seu microambiente natural (roedor silvestre). Evita-se, assim, a artificialidade dos estudos que empregam os modelos tradicionais. Aspectos essenciais a serem obtidos, nesse tipo de estudo, incluem a
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ecologia do agente, a susceptibilidade ou resistncia do organismo, bem como os mecanismos moleculares dessa interao. Um melhor entendimento das relaes entre parasito-hospedeiros pode fornecer, ainda, subsdios para o controle mais efetivo de endemias que afetam o homem. Roedores so modelos adequados se considerarmos as facilidades de criao e manuteno em condies de biotrio (pequeno porte, tempo de gerao curto, fcil manuseio e boa adaptabilidade ao cativeiro). Alm disso, so encontrados nos ambientes de interface domstico/silvestre e, freqentemente, so apontados como hospedeiros de diversos patgenos de carter zoontico (Cordeiro, Sulzer & Ramos, 1981; Rodrigues e Silva et al., 1992; Pinho et al., 2000). Outro ponto que deve ser enfocado e que refora a necessidade desses estudos se refere ao parasitismo como regulador de populaes de animais silvestres e seu papel na conservao das espcies (Grenfell & Gulland, 1995; Koella, Agnew & Michalakis, 1998; Thomas et al., 2000; Agnew, Koella & Michalakis, 2000). O manejo para conservao da fauna silvestre freqentemente inclui introduo, retirada e translocao de animais, desconsiderando os parasitas destes, bem como as peculiaridades dessa interao.
DESAFIOS E DIFICULDADES
IDENTIFICAO TAXONMICA
A diversidade de espcies dos roedores silvestres ainda pouco conhecida e a sistemtica apresenta-se, para muitos grupos, bastante confusa. O primeiro passo na utilizao de animais silvestres determinar seu status taxonmico correto, a fim de se evitar que animais de espcies diferentes sejam criados como espcie nica. No caso de roedores faz-se necessria a utilizao de tcnicas citogenticas (cariotipagem), pois a identificao especfica considerando-se somente os caracteres morfolgicos e morfomtricos nem sempre possvel. Tais procedimentos tm-se apresentado fundamentais para identificao mais precisa de vrias espcies (Barros, Reig & Perez-Zapata, 1992; Bonvicino et al., 1996; Silva & Yonenaga-Yassuda, 1998).
O BTENO
DE
M ATRIZES
Uma vez selecionada a espcie-alvo, necessria a formao do plantel de matrizes reprodutoras que dar origem colnia a partir de animais capturados no campo. A fim de preservar a heterogeneidade gentica da colnia, deve-se viabilizar a captura de um plantel mnimo vivel de ambos os sexos. Sugerem-se, ainda, coletas peridicas para reforo do plantel, evitando, desse modo, o envelhecimento da colnia e o conseqente declnio do sucesso reprodutivo. Vale ressaltar que a homogeneidade gentica pode levar seleo de animais mais resistentes ou susceptveis a determinado agente, mascarando, dessa forma, o fenmeno que ocorre na natureza. Essa etapa do trabalho exigir colaborao de mastozologos, dada a demanda de conhecimentos bsicos de ecologia, biologia e distribuio geogrfica da espcie-alvo, alm de equipe especializada, infra-estrutura e material adequado para o trabalho de campo.
Q UARENTENA
Aps a captura no campo, os animais devem passar por um perodo de quarentena em recinto apropriado e separado das salas de criao. O perodo de quarentena permite um acompanhamento da sade dos animais, a fim de se detectar alguma anormalidade ou alterao clnica, por meio de exames parasitolgicos e sorolgicos, que indiquem infeces preexistentes por microorganismos (incluindo bactrias, fungos, vrus, clamdias, riqutsias, microplasmas) e/ou parasitos (endo e ecto).
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importante ressaltar que algumas viroses podem ficar incubadas nos animais e s se manifestarem tardiamente. Infeces desse tipo poderiam levar contaminao ou mesmo extino de toda uma colnia. O cuidado se estende tambm aos manipuladores dos animais e, at os resultados finais dos exames diagnsticos, todos os procedimentos com animais silvestres devem ser considerados potencialmente contaminantes e perigosos, requerendo, assim, procedimentos especiais de preveno e biossegurana. Aps o perodo de quarentena, o animal deve ser transportado at a rea do biotrio. Para roedores, recomendado que o transporte seja feito nas suas prprias gaiolas de criao, observando-se os cuidados com segurana e ventilao.
B IOSSEGURANA
NA
Q UARENTENA
As informaes que se seguem foram extradas do Manual de Procedimentos para a Manipulao de Microorganismos Patognicos e/ou Recombinantes na Fiocruz (CTBio/FIOCRUZ, 1998). A biossegurana na quarentena deve ser encarada como a etapa mais importante do trabalho. Existem quatro nveis de biossegurana: NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, crescentes no maior grau de conteno e complexidade do nvel de proteo. O nvel de biossegurana de um experimento ser determinado segundo o organismo de maior classe de risco envolvido no experimento. Em virtude, principalmente, do risco de infeco por hantavrus, recomenda-se a construo de uma quarentena com nvel se biossegurana NB-3. Esse nvel permite procedimentos com exposio a microorganismos que geralmente causam doenas em seres humanos ou em animais e podem representar um risco se disseminados na comunidade. O hantavrus um vrus pertencente famlia Bunyaviridae e seu potencial zoontico o classifica como o agente mais perigoso transmitido por roedores. Os hantavrus so transmitidos aos humanos atravs da aerolizao de excretas de roedores e, recentemente, foi descrita tambm a transmisso inter-humana. No velho continente, os hantavrus so agentes etiolgicos da febre hemorrgica com sndrome renal e nefropatia epidmica e, nas Amricas, da sndrome pulmonar por hantavrus. Aps a primeira descrio da sndrome pulmonar, em 1993, diversos casos vm sendo descritos em diferentes regies com letalidade superior a 50%. No h vacinas, entretanto a terapia antiviral com ribavirina pode reduzir a letalidade quando feita precocemente. O cuidado deve ser redobrado durante coletas de sangue e necropsia dos roedores. Para todos os procedimentos, o uso de equipamentos de proteo individual, tais como jalecos de manga comprida, luvas e mscara, so indispensveis. Esses equipamentos devem ser distribudos gratuitamente, cabendo aos trabalhadores utiliz-los e conserv-los. Para procedimentos de eutansia recomenda-se a utilizao de gelo seco, que deve ser colocado em um recipiente fechado junto ao animal. Os animais mortos e a maravalha usada so considerados resduos slidos de risco biolgico potencialmente contaminados e devem ter como destino a incinerao (ABNT, 1987). Antes de serem incinerados, a maravalha deve ser ensacada e autoclavada, bem como os animais mortos e os materiais de maior volume. As caixas devem ser imersas em gua sanitria por pelo menos quatro horas, lavadas com detergente e banhadas em soluo de hipoclorito de sdio a 1%. Caso no seja vivel a autoclave, faz-se a descontaminao qumica. Nesse caso, deve-se imergir todo o animal, com todos os seus rgos e membros, em soluo desinfetante; deixar um mnimo de 2 horas para, ento, inciner-lo. Em caso de acidentes importantes, comunicar ao rgo responsvel de cada instituio e procurar o posto de sade mais prximo, por mais simples que possa parecer o acidente (por exemplo, mordidas e arranhes).
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IMPLANTAO E MANUTENO DA COLNIA
As condies do biotrio de roedores silvestres no necessitam seguir a mesma rigidez de normas de biossegurana empregadas na quarentena, uma vez que somente animais no-infectados sero incorporados colnia. Alguns pontos, entretanto, devem ser ressaltados, tais como: assegurar-se de que todos os que tm contato com esses animais e seus descartes estejam familiarizados com os procedimentos e cuidados necessrios. Quando possvel, os indivduos que trabalham com animais de experimentao devem receber imunizao com as vacinas apropriadas; acondicionar animais em caixas com tampas, certificando-se de que no h espao para fugas; sacrificar roedores encontrados fora das caixas, autoclavando e incinerando suas carcaas. Na eventualidade de o animal fugir do laboratrio, as autoridades devem ser notificadas prontamente. As condies ambientais do biotrio devem ser estabilizadas e monitoradas, considerando-se exausto, refrigerao, iluminao e desumidificao do ar. A adaptao ao cativeiro e a manuteno do roedor silvestre saudvel requerem estudos sobre as melhores condies de alojamento (tamanho e tipo de caixa, gaiola ou cama e controle do fotoperodo) e dieta adequada para cada espcie. O controle do fotoperodo de extrema importncia, pois pode influenciar o ciclo reprodutivo do roedor. Muitas espcies apresentam em seu hbitat natural reproduo estacional e controlada pelo padro de luminosidade (Hasbrouck, Servello & Kirkpatrick, 1986), sendo necessrio reproduzir-se em cativeiro esse padro luminoso, para se obter reproduo ao longo do ano. Quanto dieta, podemos constatar que, apesar de cada espcie ter hbitos alimentares especficos na natureza (frugvoros, granvoros, insetvoros e at onvoros), a rao padro balanceada para roedores de laboratrio tem-se mostrado eficiente para suprir as necessidades nutricionais desses animais. Como cama, o uso de maravalha tambm vem sendo adotado com sucesso. Estabelecidas as condies de manuteno da colnia, o prximo passo ser tentar a reproduo da espcie em condies de laboratrio evitando-se, sempre que possvel, a consanginidade. Os parmetros da biologia reprodutiva de quase todas as espcies de pequenos mamferos silvestres so completamente desconhecidos. A determinao de informaes bsicas como idade na maturao sexual, poca reprodutiva, tempo de gestao, tamanho da ninhada, crescimento e longevidade, ser o desafio anterior produo de animais para experimentao (Roberts, Thompson & Cranford, 1988; Hodara et al., 1989; DAndrea, Cerqueira & Hingst, 1994; DAndrea et al., 1996; Hingst, DAndrea & Cerqueira, 1998). Os testes sorolgicos e parasitolgicos devem ser realizados periodicamente para avaliao das condies sanitrias do biotrio. Alm disso, a avaliao clnica e comportamental dos animais imprescindvel para a manuteno da sade dos mesmos e da colnia. A fim de se atender s normas para criadouros cientficos, segundo Portaria no 016, de 4 de maro de 1994, do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (IBAMA), todos os animais devem ser identificados por microchips e, aps a morte, os animais provenientes do campo devem ser taxidermizados, seu esqueleto preparado, e depositados em uma coleo cientfica.
P RODUO
DE
A NIMAIS
A utilizao experimental de qualquer espcie exige a produo regular de animais. Para obter-se sucesso na reproduo, um aspecto importante a eliminao das possveis fontes de estresse, principalmente se considerarmos as maiores exigncias para a adaptao de animais silvestres ao novo ambiente. Os rudos so de grande importncia no estresse animal, causado muitas vezes em razo das diferenas na faixa de sensibilidade auditiva de homens e roedores. As principais fontes de rudos em biotrios so as atividades de rotina (operaes de alimentao e limpeza), o barulho de portas e de equipamentos. Rudos agudos ou estridentes so particularmente mais estressantes para os animais por causa de sua alta freqncia (Merusse & Lapichik, 1996).
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O animal estressado permanece inquieto, agressivo, no se reproduz, promove movimentos estereotipados, podendo, inclusive, se automutilar. Os resultados obtidos nos experimentos certamente no sero satisfatrios nessas condies. O planejamento de produo e criao de animais silvestres deve ser individualizado para cada espcie e at mesmo para animais de uma mesma espcie provenientes de diferentes localidades. A baixa produtividade, sazonalidade da reproduo e peculiaridades da estratgia de vida das espcies so fatores complicadores na produo regular de filhotes. O pesquisador deve ter conscincia dessas dificuldades e adaptar o seu experimento para a provvel utilizao de amostras pouco numerosas. Colnias auto-sustentveis so possveis, desde que tomados os cuidados citados anteriormente, como evitar a homozigose, estresse, a seleo de indivduos resistentes ou susceptveis, entre outros.
P ESSOAL E SPECIALIZADO
O gerenciamento da colnia e a manipulao de animais recm-introduzidos ao cativeiro dependem de treinamento especfico de bioteristas nem sempre preparados para essa misso. O baixo nvel de formao do pessoal tcnico disponvel na maioria das instituies pblicas brasileiras, como universidades e centros de pesquisa, que utilizam experimentao animal mais um fator complicador. Apesar do interesse crescente na utilizao desses modelos, h uma carncia na unio de esforos para a soluo de problemas comuns, troca de informaes e padronizao de mtodos. Na maioria dos casos, especialistas em reas diversas, motivados pela necessidade, atuam como bioteristas improvisados e de maneira precria obtm animais para sua experimentao. Cursos especficos de criao de animais silvestres so imprescindveis para a formao de um bom profissional. importante, tambm, manter a participao e a informao entre todas as pessoas ligadas ao experimento, como pesquisadores, estagirios e outros tcnicos.
EXPERINCIAS BEM-SUCEDIDAS
Algumas espcies da fauna brasileira tm sido utilizadas como modelos experimentais alternativos para estudos diversos. Podemos destacar os marsupiais Didelphis, Philander e Monodelphis e os roedores Nectomys, Calomys, Akodon e Thrichomys, como os mais citados (DAndrea, Cerqueira & Hingst, 1994; De Villafae, 1981; Mello & Mathias, 1987; Roberts, Thompson & Cranford, 1988; Periss, Fonseca & Cerqueira, 1989; Horta & DAndrea, 1994; Green, Krause & Newgrain, 1996; Gonzalez & Claramunt, 2000).
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Alternativas para animais de laboratrio: do animal ao...

do animal ao computador
INTRODUO
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Octavio Augusto Frana Presgrave
Embora as manifestaes em defesa dos animais de laboratrio e contra sua utilizao em experimentos tenham crescido nos ltimos anos e tomado mais espao na mdia, essa idia muito mais antiga do que se imagina. Em 1760, Fergusson j demonstrava preocupao com os mtodos brbaros em testes animais. No sculo XIX, Jeremy Benthan lanou a mxima a questo no se os animais raciocinam, ou se eles podem falar, mas se eles sofrem. A primeira tentativa de propor um cdigo de tica na prtica da pesquisa partiu do ingls Marshall Hall, tambm no sculo XIX. Nesse cdigo, ele props que a dor imposta aos animais fosse diminuda, alm de fazer aluso substituio dos grandes animais por animais inferiores na escala zoolgica. Tambm fazia referncia necessidade de se evitar repeties desnecessrias para a obteno de resultados. Em 1842, foi fundada o que podemos chamar de primeira sociedade protetora dos animais, a British Society for the Prevention of Cruelty to Animals (Sociedade Britnica para a Preveno da Crueldade aos Animais), mais tarde chamada de Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals. Mas foi em 1959, com a publicao do livro Principles of Humane Experimental Technique (Princpios da Tcnica Experimental Humana), que Russel e Burch lanaram o conceito dos 3Rs Replacement, Reduction and Refinement (Substituio, Reduo e Refinamento). Cabe ressaltar que, sem desmerecer o trabalho desses dois cientistas, tais idias j estavam contidas na idia do cdigo proposto por Hall. Russel e Burch, certamente, clarificaram esses conceitos de forma que os mesmos se tornaram mais populares e disseminados no meio cientfico. Em 1978, defensores europeus dos direitos dos animais iniciaram a campanha para a retirada do mtodo de irritao ocular em produtos cosmticos. Esse mtodo foi descrito por Draize, em 1944, e sofreu diversas alteraes ao longo dos anos; entretanto, continua sendo utilizado oficialmente por diversos rgos oficiais, bem como pelas indstrias no desenvolvimento de novas frmulas de forma a avaliar a segurana de seus produtos.
EXPERIMENTAO ANIMAL
Antes de falarmos sobre as alternativas, vale a pena recordar alguns conceitos sobre a experimentao animal, que auxiliam, at certo modo, na compreenso e estruturao de uma metodologia alternativa. As metodologias farmacolgica e toxicolgica (a experimentao animal, propriamente dita) se baseiam na observao dos efeitos de substncias sobre organismos vivos, para a qual o experimentador se vale de tcnicas fisiolgicas ou bioqumicas. Por meio dessas observaes, podem ser obtidos dados qualitativos ou quantitativos sobre a ao de medicamentos ou substncias.
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De forma geral, qualquer animal pode ser utilizado em experimentao; entretanto, procura-se um modelo especfico para cada ao estudada. Como exemplo, podemos citar o uso do gato para estudos do sistema circulatrio, a utilizao do co como modelo para estudo geniturinrio e os pequenos roedores, para avaliaes do sistema respiratrio, entre outros. A experimentao animal j constava descrita no Corpus Hipocraticum (c. 350 a.C.). Nele eram citados experimentos com porcos. Muitos outros fatos tiveram importante contribuio para o desenvolvimento dos ensaios biolgicos. Entre os quais, podemos destacar a padronizao da antitoxina diftrica por Erlich (fim do sculo XIX), a padronizao da insulina (dcada de 20) e a mudana no conceito de unidade, com a introduo da preparao-padro. Outro fato importante, que muito contribui para o refinamento dos experimentos, a introduo de mtodos estatsticos, os quais fizeram com que se estabelecesse o nvel de significncia de um resultado, o que permitiu a extrapolao de dados de uma pequena amostra para uma populao, indicando, ainda, a probabilidade de ocorrncia desse fenmeno. Tais fatos, em conjunto com outros, contriburam e continuam contribuindo para a racionalizao no uso de animais de laboratrio. Independentemente de estarmos trabalhando com animais ou clulas, a estrutura de um ensaio biolgico se baseia em trs pilares fundamentais: o estmulo, o substrato e a resposta. O estmulo a substncia ou o produto que ser administrado ao substrato, seja ele um animal, seja uma clula. Esse conjunto ir fornecer a resposta que pode ser, por exemplo, aumento de presso arterial ou morte celular.
MTODOS ALTERNATIVOS
Mtodos alternativos so procedimentos que podem substituir o uso de animais em experimentos, reduzir o nmero de animais necessrios, ou refinar a metodologia de forma a diminuir a dor ou o desconforto sofrido pelos animais. So alguns exemplos de substituio no uso de animais: USO DE INFORMAO OBTIDA NO PASSADO em virtude da coleta de dados histricos em experimentao animal ou mesmo de ocorrncias em seres humanos, determinados experimentos podem no ter necessidade de serem repetidos. USO DE TCNICAS FSICO-QUMICAS com o aumento do conhecimento na rea qumica, bem como por meio do desenvolvimento de mtodos e equipamentos sofisticados, algumas substncias que s antigamente poderiam ser testadas em animais podem ser ensaiadas por mtodos qumicos ou fsico-qumicos. Um dos exemplos a citar refere-se ao ensaio de potncia de insulina. Anteriormente, trs mtodos eram utilizados: glicemia em camundongos, glicemia em coelhos ou convulso em camundongos. Hoje em dia, para produtos acabados (para matria-prima ainda se utiliza um dos mtodos em animais), j se pode utilizar a determinao da potncia por HPLC (Cromatografia Lquida de Alta Resoluo). USO DE MODELOS MATEMTICOS OU COMPUTACIONAIS recurso em que se utiliza um banco de dados que pode predizer determinadas aes de substncias no organismo. O banco formado por meio de informaes obtidas no passado. Esse assunto ser melhor abordado no item Sistemas Tcnicos para a Predio de Toxicidade. USO DE ORGANISMOS INFERIORES NO CLASSIFICADOS COMO ANIMAIS PROTEGIDOS no deixa de ser algo polmico, pois, quando pensamos sobre o prisma tico, ser vivo ser vivo em qualquer situao, no importando se ele um inseto ou um macaco. Entretanto, a utilizao de larvas de camaro (Artemia salina)
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ou o uso de pulga dgua (Daphnia pulgans) so considerados como possibilidades de substituio ao uso de animais de laboratrio. Em geral, esses invertebrados so muito utilizados em experimentos de ecotoxicologia, mas alguns trabalhos apresentam a sua utilizao como proposta de alternativas ao teste de irritao em coelhos. USO DE ESTGIOS INICIAIS DO DESENVOLVIMENTO DE ESPCIES ANIMAIS PROTEGIDAS o caso, por exemplo, do teste da HET-CAM (membrana crio-alantide de ovo de galinha embrionado), no qual se utiliza o ovo embrionado aos 9 dias, tempo este em que no h o desenvolvimento do sistema nervoso do embrio, o que, teoricamente, no causaria a ele dor ou sofrimento. Tal ensaio tem sido apontado como um bom substituto ao teste de irritao ocular em coelhos. USO DE SISTEMAS IN VITRO o sistema in vitro, como veremos adiante, pode ser considerado como uma substituio total ou parcial, sendo algumas vezes tambm classificado como uma reduo. VIGILNCIA PS-MERCADO E ESTUDOS EPIDEMIOLGICOS os dados obtidos nessas situaes iro compor o conjunto de informaes, que podero subsidiar os bancos de dados, e as demais, que podero ser utilizadas para se evitar a experimentao em animais. USO DE VOLUNTRIOS HUMANOS outra questo polmica que deve ser encarada com muito cuidado. importante frisar que a utilizao de humanos no se destina a estudar a toxicidade, mas, sim, a demonstrar a ausncia da mesma. Isso quer dizer que no se deve utilizar seres humanos em estudos de toxicidade de produtos ou substncias somente depois que estas j passaram por toda uma bateria de testes, envolvendo os mtodos in vitro e os testes em animais, cujos resultados j foram negativos. Dessa forma, a utilizao de seres humanos j parte do pressuposto de que as possibilidades de toxicidade so mnimas e a sua utilizao se faz necessria para a demonstrao de ausncia de efeitos txicos. Cabe ressaltar a necessidade de uma ampla discusso tica quando da utilizao de seres humanos em experimentao. Algumas classificaes didticas podem ser utilizadas para um melhor entendimento do conceito dos 3Rs. Por exemplo, a substituio pode ser direta ou indireta, total ou parcial. SUBSTITUIO DIRETA aquela em que se utiliza um sistema visando fornecer respostas o mais prximo possvel do modelo animal. Por exemplo: pele in vitro de animais ou voluntrios humanos. Na realidade, existem diversas formas de obter essa pele in vitro, mas, de qualquer forma, o objetivo , dentro desse sistema, obter um resultado muito prximo ou igual ao que se teria fazendo um ensaio de irritao cutnea em coelhos. SUBSTITUIO INDIRETA nela se utiliza um sistema que fornece um resultado, no por ao no mesmo substrato, mas, sim, por dosagem ou reao de algum mediador que produz a resposta no sistema in vivo. Por exemplo: o teste de LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) substitui o ensaio de pirognio em coelhos pela determinao qualitativa ou quantitativa da presena de endotoxinas numa soluo. Em animais, essa presena se manifesta pela ocorrncia de febre; no caso do mtodo in vitro, o fenmeno medido de forma indireta (ou seja, se h endotoxina em uma determinada quantidade, o efeito nos animais seria a febre). SUBSTITUIO TOTAL aquela em que a informao necessria pode ser obtida sem o uso de animais de experimentao. Por exemplo: potncia de insulina ou somatotropina por HPLC. Nesse caso, os animais so substitudos pela determinao da potncia por mtodos fsico-qumicos. Outro exemplo a produo de anticorpos monoclonais em sistemas in vitro. SUBSTITUIO PARCIAL aquela em que se substitui, parcialmente, a utilizao de animais. Por exemplo: tcnicas que utilizam cultura de clulas, rgos isolados ou uso de preparaes subcelulares (receptores isolados). Pode-se notar que alguns conceitos se confundem entre si. Na realidade, essa diviso muito mais didtica do que outra coisa. Um exemplo disso o conceito que trata do cultivo celular. Se a clula for de origem humana (por exemplo, um carcinoma), podemos interpretar como uma substituio total, mesmo
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sendo uma clula de linhagem; se for de origem animal, certo que para a sua obteno foram utilizados vrios animais, por mais que essas clulas sejam utilizadas e fornecidas por muito tempo, mas alguma vez foi necessria a utilizao de animais para a sua obteno. Esse caso pode ser interpretado como substituio parcial ou mesmo uma reduo. O mesmo raciocnio vale para o caso dos rgos isolados, uma tcnica muito utilizada em farmacologia. Por exemplo, a tcnica de leo isolado. Uma cobaia sacrificada e com o fragmento de leo que retirado podem ser feitos vrios experimentos. Pode-se, dentro desse raciocnio, considerar essa tcnica como uma reduo, j que se utilizam vrios fragmentos de um nico animal, e, conseqentemente, vrios experimentos, em vez de vrios animais. Entretanto, a tcnica pode ser entendida como substituio, uma vez que se utiliza uma parte de um animal para se estudar um fenmeno, no em vrios animais inteiros, mas em partes do animal. Como se pode observar, devemos nos deter na filosofia do princpio dos 3Rs sem nos preocupar com as divises tericas do mesmo. Um dos progressos que os pesquisadores vm alcanando na rea da reduo consiste no procedimento de screening, no qual a integrao de ensaios in vitro com sistemas computacionais e a hierarquizao de mtodos podem fazer com que no exista a necessidade de se utilizar animais, pois, se no decorrer desse procedimento algum indcio de toxicidade for verificado, os animais no so utilizados. Um exemplo de hierarquizao pode ser, antes de se passar a fazer a experimentao em animais, o de verificar a medida de pH da substncia ou produto; dependendo da faixa em que este se encontra (abaixo de 2,0 ou acima de 11,5) j pode ser considerado como corrosivo. Neste caso, interrompe-se o procedimento, do contrrio pode-se seguir a aplicao. Outro exemplo, admitindo se ter chegado ao uso de animais, fazer primeiramente o teste de irritao cutnea para, caso esta seja negativa, em seguida, fazer o teste de irritao ocular, caso contrrio, este no deve ser realizado. O refinamento obtido por meio do uso de anestsicos (quando estes no interferem nos resultados experimentais) pela melhoria do desenho experimental e, conseqentemente, pela utilizao de mtodos estatsticos que configuram uma melhor confiabilidade nos resultados.
EXPERT SYSTEMS SISTEMAS TCNICOS PARA PREDIO DE TOXICIDADE

Um sistema tcnico para a predio de toxicidade considerado como sendo qualquer sistema formal, no necessariamente computacional, que permite que um usurio obtenha predio racional sobre a toxicidade de substncias qumicas. Todos os sistemas tcnicos so construdos sobre dados experimentais representando uma ou mais manifestaes txicas de substncias em sistemas biolgicos (banco de dados) e/ou regras derivadas desses dados. Exemplos de sistemas tcnicos:
QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship
Phisiologically Based Pharmaco-Kinetic Derek Deductive Estimation of Risk from Existing Knowledge Compact Computer-Optimised Molecular Parametric Analysis of Chemical Toxicity Topkat Toxicity Prediction by Computer Assisted Technology Harzardexpert Metaboloexpert OncoLogic StAR Standardised Argument Report
PBPK
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Cada um desses sistemas se destina a um fim especfico. Os mais conhecidos so o QSAR e o PBPK. O primeiro prediz os efeitos txicos com base na comparao estrutura-atividade das substncias, e o segundo prediz as aes farmacocinticas (absoro, metabolismo, eliminao etc.).
A BUSCA PELOS MTODOS ALTERNATIVOS

Hoje em dia, buscamos alternativas tanto na rea experimental quanto na educacional. Basicamente, em termos de ensino, a experimentao animal j pode ser substituda, praticamente, sem causar prejuzos muito srios ao aprendizado. Na rea de educao veterinria, j contamos com diversos modelos para o ensino e o treinamento de cirurgias, suturas e demais procedimentos. So modelos de ces e gatos, de diversos tamanhos, simulando, inclusive, respirao e outros parmetros fisiolgicos. Muitas pessoas combatem esse tipo de tcnica, afirmando que elas no reproduzem inteiramente os aspectos e as condies encontrados na utilizao de um animal verdadeiro. Realmente nada se compara ao organismo real, entretanto, o aprendizado nesses modelos nos fornece uma boa viso dos procedimentos e tcnicas, possibilitando uma segurana maior quando diante de uma situao real. Cabe ressaltar que a utilizao de bonecos j prtica na medicina humana e em treinamentos de primeiros socorros, simulando diversos tipos de queimaduras, forma correta de respirao artificial etc. No treinamento em tcnicas de experimentao animal existe um modelo de rato em silicone, no qual se pode treinar administrao oral, intravenosa e intraperitoneal, simulando a textura e a resistncia normais, alm de apresentar tubos na cauda, simulando veias, contendo um lquido mimetizando sangue. Um outro recurso, muito utilizado na rea da farmacologia, so os simuladores em CD-ROM. Com eles, podemos administrar diversos agonistas e antagonistas e visualizar seus efeitos em diversos parmetros fisiolgicos, tais como respirao ou presso arterial. Hoje em dia, existem alguns vdeos que detalham mtodos de vias de administrao, cirurgia, anestesia, enfim, diversos exemplos de manejo e experimentao animal. Na rea experimental, muitos ensaios tm sido propostos. Alguns deles j esto em estgio avanado de validao, enquanto outros esto ainda sendo muito estudados para se verificar as possibilidades de substituir ou reduzir o uso de animais em experimentao. Alguns exemplos de tcnicas alternativas:
LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) substitui o ensaio de pirognio em coelhos. Baseia-se na reao entre
a endotoxina e substrato LAL. Dependendo do mtodo, a presena de endotoxina pode ser constatada por meio da coagulao (mtodo gel-clot) ou da liberao de cor (mtodo cromognico). HET-CAM (membrana crio-alantide de embrio de galinha) forte candidato para a substituio do teste de irritao ocular e de mucosas. Baseia-se na alterao dos vasos da membrana crio-alantide, por meio da observao do tempo do surgimento de congesto, hemorragia e coagulao. Citotoxicidade compreende diversas tcnicas usando parmetros de morte ou alteraes fisiolgicas de diferentes linhagens celulares. Entre os mtodos mais utilizados, esto a difuso em agarose (clulas L929), captao de vermelho neutro ou MTT (Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolium), ambos utilizando clulas 3T3 ou SIRC. Pele reconstituda utilizao de fragmentos de pele humana (a partir de circunciso ou sobras de cirurgia plstica). Observao de alteraes histolgicas e/ou liberao de mediadores inflamatrios. RBC (Red Blood Cell Assay) baseia-se na avaliao da hemlise e na desnaturao causadas por produtos (cosmticos) e/ou substncias (tensoativos) perante um controle conhecido, geralmente, Lauril Sulfato de Sdio.
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(Whole Blood Assay) possvel substituto para o ensaio de deteco de pirognio em coelhos, por meio da liberao de mediadores inflamatrios quando um produto injetvel colocado em contato com sangue total humano. Kits comerciais Corrositex, Skintex, Eyetex, Episkin, entre outros, so exemplos de kits utilizados para determinar grau de corroso, potencial de irritao cutnea ou ocular.
WBC
PRESENTE E FUTURO
Conforme j dito, esses mtodos se encontram em distintos estgios de desenvolvimento e validao. Esse processo bastante rduo, podendo atingir 10 anos ou mais. Qualquer mtodo, para ser validado, tem de passar por estudos colaborativos, realizados por vrios laboratrios, em que so analisadas as variaes inter e intralaboratoriais. No podemos pensar que seja possvel a substituio de todos os ensaios que utilizam animais. Por exemplo, experimentos que envolvem aprendizagem e memria ainda no apresentam propostas de substituio, o que no quer dizer que daqui a 10, 20 ou 50 anos isso no seja possvel. O avano do conhecimento cientfico humano e o desenvolvimento de mtodos imunolgicos, qumicos e genmicos podero contribuir muito para o futuro dos mtodos alternativos. importante ressaltar que no cabem discusses por parte de protecionistas e cientistas sobre quem tem razo em sua forma de pensar, ou seja, se deve-se parar com os experimentos ou continuar. necessrio que ambas as partes se juntem e discutam seus pontos de vista e possibilidades de estudos. preciso que cada um compreenda e respeite o prisma com que o outro olha e entende o tema. Essas discusses tm de ocorrer sob atmosfera tcnica e cientfica, jamais em clima fundamentalista ou radical. At a dcada de 60, ningum poderia imaginar que seria possvel detectar pirognio sem ser em coelhos; entretanto, em 1964, Levin e Bang descreveram o que seria a base do mtodo de LAL e, hoje, j falamos em quantificar a liberao dos mediadores envolvidos na febre. importante entender que no devemos deixar de usar os animais somente porque assim queremos, sem que estejamos certos de que os ensaios utilizados nessa substituio refletem os efeitos que realmente estamos estudando. Devemos ter certeza de que o mtodo alternativo suficientemente capaz de indicar, o mais precisamente possvel, as condies de eficcia e segurana de uma substncia ou produto. Devemos ter a conscincia de que podemos substituir o uso de animais em alguns experimentos, desde que as alternativas estejam bem definidas e validadas. Assim, temos a obrigao de continuar a estudar e a desenvolver mtodos visando a substituies futuras.
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Sade e bem-estar social
S ade e Bem-Estar Social

INTRODUO
43
mais fcil sentir do que definir sade. Autores e organizaes cientficas tm procurado faz-lo das maneiras mais diversas. A carta da Organizao Mundial da Sade (OMS), aprovada em 1948, diz que a sade um estado de completo bem-estar fsico, mental e social e no apenas a ausncia de doena ou enfermidade. A sade pode ser considerada como a condio em que se encontra o organismo quando reage satisfatoriamente s exigncias do meio, o que alarga o conceito a todos os seres vivos. Em relao ao homem, pode-se considerar a sade como a condio de bem-estar consciente em que se encontra o indivduo em plena atividade fisiolgica e psquica, reagindo ao seu meio fsico, biolgico e social, sem dor, sem leso, sem fadiga e sem tristeza.
HIGIENE
A higiene cuida da sade, ensinando a proteg-la. Seu nome se originou da raiz grega hygies, que quer dizer sadio. Segundo a mitologia grega, higiene deriva de Hygeia, deusa grega que era tida como protetora da sade e do bem-estar orgnico, exercendo a funo de conselheira na preservao da sade.
P OSIO C IENTFICA
DA
H IGIENE
Pode-se dizer que, desde a mais remota antigidade, o homem cuidou de sua prpria sade, preocupandose apenas quando a doena apresentava sua sintomatologia. Os sacerdotes eram os disseminadores dos dogmas relativos sade, numa forma de medicina muito primitiva, utilizando-se de oraes, exorcismos, conjuraes e encantamentos, para expulsar o esprito do mal (causa da doena). Com o passar do tempo, as descobertas sobre a fisiologia humana, os microorganismos e as doenas inspiraram, em meados do sculo XIX, a idia de reunir os conhecimentos vantajosos para a conservao do homem e de sua sade, tendo sido escolhido, para individualizar esses princpios, o termo higiene, j empregado por Galeno para caracterizar a conservao da sade. Desse modo, completou-se toda uma organizao de princpios, corporificando o fundamento cientfico dos trabalhos que visam combater a causa e a disseminao das doenas transmissveis, preparando os homens, por meio da medicina preventiva e da higiene, para lutar pela proteo da sade, evitando, assim, a doena.
369
HIGIENE E EDUCAO
Inicialmente, a ao da higiene era imposta por meio de leis, regulamentos e penalidades, causando, muitas vezes, a oposio popular (Revolta da Vacina no Rio de Janeiro 1900). Atualmente, a educao passou a ser o centro do esforo sanitrio, esclarecendo toda a populao, desde a mais tenra idade, por meio da divulgao e conscientizao preventiva, sobre o significado e a importncia de hbitos higinicos.
D IVISES
DA
H IGIENE
Considerando-se a relao entre o indivduo e o meio em que vive e a relao entre os vrios indivduos que formam a coletividade, a higiene pode ser estudada em trs reas bsicas: AMBIENTAL estuda o solo, a gua, o ar e a habitao (saneamento bsico); FSICA OU INDIVIDUAL estuda a evoluo do indivduo, analisando as questes que se prendem aos cuidados corporais, ao vesturio, alimentao e ao trabalho fsico e mental; COLETIVA OU PBLICA estuda a populao, visando melhoria das condies especiais da vida urbana, rural e profissional no contexto da sade pblica.
H IGIENE
B IOTERISMO
Atualmente, o animal de laboratrio prioritrio no campo da experimentao. Assim, os centros da criao desses animais tm grande preocupao com sua produo e manejo. A necessidade dos experimentos biomdicos e biotecnolgicos impe a produo e manuteno de animais com alto padro sanitrio e gentico. Esse objetivo s conseguido quando medidas de higiene so adotadas em todas as reas do biotrio, por meio das chamadas barreiras sanitrias. importante salientar que, para as barreiras sanitrias atingirem seus objetivos, h toda uma equipe tcnica, consciente de seus procedimentos operacionais, atuando nas reas especficas do biotrio, tais como sala de criao, rea de desinfeco e higienizao, controle da qualidade (laboratrio de apoio). Em razo da multiplicidade de tarefas desenvolvidas na reutilizao de materiais que entraro nas salas de criao, devemos estar mais atentos s reas de desinfeco e higienizao. O bioterista responsvel por essa rea dever ser treinado especificamente em processos de desinfeco e esterilizao (fsicos e qumicos), alm de ter conhecimentos especficos na rea da higiene. Dessa forma, na contratao de profissionais para o biotrio, deve ser levado em considerao o grau de escolaridade do candidato, bem como a observao de padres higinicos pessoais (unhas, cabelos, pele e vestimenta).
H IGIENE I NDIVIDUAL
o conjunto de mtodos de limpeza e asseio adotados para preservar a sade pessoal. As rotinas de higiene so estabelecidas visando segurana do profissional e dos animais, cuja sade depende da observao rgida das rotinas estabelecidas no uso de uniformes e equipamentos de proteo. importante salientar: MOS antes e depois de qualquer rotina ou atividade devem ser lavadas, visto que mos e unhas so fonte de microorganismos. Deve-se usar sabo neutro e escova; PS em biotrios, o trnsito em reas com diferentes nveis sanitrios dever ser feito aps a troca de calados ou com uso de sapatilhas descartveis. Pode-se utilizar o pedilvio (bandeja com gua e desinfetante) como auxlio no controle de microorganismos;
370
BOCA E NARIZ o uso de mscara previne a transmisso de agentes existentes no ar; BANHO ao entrar no biotrio, o funcionrio dever banhar-se antes do seu trabalho de rotina, seja em rea limpa, rea de desinfeco e esterilizao ou de preparo de materiais. O banho tem por finalidade limpar a pele, eliminando a poeira do meio externo.
HIGIENE AMBIENTAL
O propsito da limpeza remover sujeiras da superfcie e no redistribu-las. Dessa forma, as varreduras a seco devem ser evitadas, por provocar aerossis. Os utenslios empregados, como baldes, vassouras e panos de limpeza, devem ser desinfetados regularmente. A boa limpeza um processo em etapas e tambm uma combinao de mtodos que devem ser utilizados, dependendo do tipo de superfcie a ser limpa. Limpar um ambiente no biotrio uma prtica adotada no sentido de manter a sade e a segurana dos homens e dos animais.
HIGIENE
NA
S ALA
DE
C RIAO
Para que o trabalho no seja prejudicado na colnia, deve-se cuidar de todos os materiais que entraro na sala de criao. A limpeza das gaiolas e das estantes geram aerossis com alta quantidade de microorganismos; portanto, essa atividade deve ser realizada em reas separadas das salas de criao. O microambiente do animal de extrema importncia, devendo-se promover a maior limpeza e higiene possvel para que ele fique confortvel nas gaiolas.
IMPORTNCIA DE UMA BOA EQUIPE

R EQUISITOS E XIGIDOS :
INDUMENTRIA E RESPONSABILIDADE TCNICA
As atividades de um biotrio, por serem bastante diferenciadas, exigem pessoal qualificado. No basta, simplesmente, a pessoa gostar de animais para manuse-los; necessrio que apresente determinadas condies, conforme o estabelecimento de rotinas, para a organizao das tarefas de um biotrio. As responsabilidades tcnicas devem ser bem especificadas e divididas por setores. Os programas de trabalho e distribuio das atividades devem ser fixados em locais visveis e cada bioterista deve ter em seu poder uma cpia de suas atividades. A definio das rotinas pode ser diria, semanal ou mensal, devendo ser observadas as condies das instalaes, dos equipamentos, da produo animal e do nmero de funcionrios, que varia de acordo com a necessidade e o tamanho de cada colnia. Na seleo de pessoal para trabalhar em biotrios, devero ser realizados exames mdicos. Pessoas com alergias (respiratrias e de contato), doenas de pele, ou doenas respiratrias crnicas devero ser excludas. Devido aos estados fisiolgicos e psicolgicos dos animais de laboratrio serem desconhecidos, o bioterista dever trat-los com respeito, proporcionando-lhes bem-estar e evitando o estresse, pois o seu comportamento poder interferir nos resultados das pesquisas e nas aplicaes biomdicas ou biotecnolgicas. Alm dessas condies, necessrio que qualquer pessoa que trabalhe com animais tenha treinamento adequado, incluindo noes de biologia, comportamento animal, nutrio, reproduo e manejo das espcies.
I NDUMENTRIA
Certas regras podem parecer excessivamente rgidas, porm so fundamentais na rotina dos biotrios. O funcionrio, ao chegar ao seu local de trabalho, deve se dirigir ao vestirio, retirar toda sua roupa e se banhar abundantemente. O uso de jias e bijuterias deve ser proibido no interior das salas de criao, visto que certos
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materiais no suportam a desinfeco. Os objetos realmente necessrios, como os culos, devem ser borrifados com desinfetantes antes de entrarem na rea limpa. O uniforme deve ser utilizado somente na rea limpa, no devendo irritar e nem comprimir a pele. Alm do uniforme, necessrio o uso de luvas, mscara e gorros (protetor para os cabelos). Aps o trmino das atividades, ou na hora do almoo, o funcionrio dever retirar o uniforme. Os cosmticos devem ter uso restrito, pois alm de alojar microorganismos, o odor pode excitar e confundir o animal.
R ESPONSABILIDADE T CNICA
SETOR DE CRIAO
O responsvel pela sala de criao tem como atividade principal o manejo dos animais. Suas atividades comeam pelo controle dos padres ambientais, temperatura, umidade relativa do ar e iluminao, que devem ser registrados diariamente em formulrios prprios. O nmero de trocas semanais das gaiolas depender do padro sanitrio da colnia, da quantidade de animais por gaiola e das trocas de ar da sala de criao. A rotina de limpeza se inicia pela retirada dos bebedouros, seguida pela troca das gaiolas, nas quais devem ser observados o nmero de animais e seu estado geral, bem como as condies de pelagem, presena de leses, aspectos das fezes e comportamento em grupo. Os animais que apresentarem alteraes devem ser separados e encaminhados ao setor de controle sanitrio para a realizao de exames laboratoriais. Aps as trocas das gaiolas, devem ser registrados, na ficha de identificao, o nmero total de nascidos, de mortos e de desmamados. Para sair da rea, o responsvel pela sala deve sempre utilizar a antecmara (air lock) que o leva pelo corredor de acesso rea de lavagem. Sua circulao, quando dentro da rea, deve obedecer a um nico fluxo: banheiro, sala de animais, rea de lavagem e banheiro.
SETOR DE DESINFECO E ESTERILIZAO
No setor de higienizao e preparo de materiais, processado todo o equipamento e material utilizado para a manuteno dos animais de rea de criao. Na rea de lavagem, as caixas so raspadas e os bebedouros esvaziados. Em seguida, as caixas so lavadas manualmente ou em mquinas apropriadas, devendo ficar imersas em tanques com soluo desinfetante, ou autoclavadas. Os bicos dos bebedouros devem ficar imersos em gua quente, sendo posteriormente lavados em equipamentos providos de jato de ar comprimido. A maravalha, utilizada como cama do animal, deve ter boa procedncia, ser isenta de p ou eventuais pedaos de madeira. Deve ser observada a origem da madeira, visto que pode exalar odores ou pigmentos (cedro). A maravalha acondicionada em sacos e esterilizada antes do uso.
SETOR DE CONTROLE SANITRIO
O controle sanitrio formado pelos laboratrios de microbiologia, gentica e anlises clnicas voltados ao diagnstico e ao controle microbiolgico das diversas espcies e linhagens mantidas na rea de criao ou na rea de isoladores. Assim, no desenvolvimento das atividades de um biotrio, de fundamental importncia a formao de equipes de trabalho. Todos tm papel importante e indispensvel. A interao dessas equipes tem como objetivo a melhoria das condies de criao e manuteno dos animais, refletindo diretamente na quantidade e qualidade dos mesmos.
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Sade do trabalhador
S ade do Trabalhador
INTRODUO
44
Marcia Agostini
H muito tempo se sabe que o trabalho, quando executado sob determinadas condies, pode causar doenas, encurtar a vida, ou mesmo matar os trabalhadores. histrico o nexo entre trabalho e sade, enfocado desde Hipcrates (400 a.C.) at Ramazzihi (1633-1714), considerados, respectivamente, precursores da medicina e da medicina do trabalho. Pensar o lado mais dramtico da viso do trabalho leva-nos a pensar no mandato bblico da mensagem ganhars o po com o suor do teu rosto. Esta expresso nos remete a uma compreenso do trabalho como esforo, risco e sofrimento psquico. Contudo, devemos pensar o trabalho como uma atividade de transformao da natureza, empreendida socialmente pelos homens, no devendo denotar marca de sofrimento. Pelo contrrio, dada a essencialidade do trabalho para a vida dos humanos e de toda a coletividade, sua realizao deveria se efetivar nos mais altos imperativos ticos, tais como a participao e a solidariedade dos trabalhadores na sua execuo e na diviso do valor e dos frutos desse trabalho no desenvolvimento da sociedade. Ter sade e bem-estar no trabalho necessariamente compreender a noo de sujeito e ator de sua vida e de sua vida no trabalho, numa relao social de troca com os outros trabalhadores, numa busca constante de conhecimento e de luta contra os mecanismos de desvalorizao e de precariedade do trabalho, o que implica um processo de construo e um avano das condies de trabalho e da qualidade de vida e de sade dos trabalhadores. No entanto, a sade do trabalhador se coloca dentro da rea do conhecimento tcnico-cientfico como um instrumento que possibilita o controle social do processo produtivo, tendo por base os critrios de sade. Ao tentar analisar os problemas de sade relacionados ao processo de trabalho, temos a compreenso da sua dimenso social e poltica, o que possibilita entender a sade dos trabalhadores como a expresso de foras e de formas de organizaes de um movimento histrico e dinmico da classe trabalhadora.
AGENTES DE RISCO PARA A SADE NO PROCESSO DE TRABALHO

Todo o processo de trabalho envolve situaes de risco, de acidentes e de formas de adoecimento, segundo as condies de gnero e de qualidade de vida no trabalho. Os riscos no interior do processo de trabalho se concretizam nos chamados agentes de risco. O agente deve ser entendido, no sentido literal, como aquilo que pratica a ao, provocando a reao sobre o outro. No caso, um agente de risco atua direta ou indiretamente no corpo de trabalhador, sendo esse corpo entendido no somente no seu aspecto fsico, mas sim de forma integral, incluindo as instncias fisiolgicas, psicolgicas, emocionais etc.
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A ao direta ocorre quando o prprio agente de risco entra em contato com o trabalhador, como no caso de substncias qumicas inaladas. J a ao indireta ocorre quando o agente desencadeia transformaes no ambiente e estas agem sobre o trabalhador. Esse o caso das substncias qumicas inflamveis que geram incndios ou exploses. O agente uma caracterstica do ambiente de trabalho e nele est presente. Ambiente, aqui, utilizado referindo-se no somente ao ambiente fsico, mas tambm forma como esses fatores fsicos so intermediados pelo trabalho, ou seja, inclui tambm as caractersticas de organizao do trabalho. Um agente de risco possui a probabilidade de, ao atuar sobre o trabalhador, prejudicar sua sade. Para isso, ele deve concentrar caractersticas potencialmente danosas para a sade. Por exemplo, ferramentas cortantes e engrenagens de mquinas so agentes de risco em potencial, pois, ao entrar em contato com o corpo humano, podem lesion-lo de diversas formas. O mesmo podemos dizer de diversas substncias qumicas ou caractersticas fsicas do ambiente como as temperaturas, vibraes e radiaes presentes em um determinado processo de trabalho. Cabe, aqui, fazer uma importante observao. Diversos agentes, adiante mencionados, esto presentes na natureza sem atuar de forma negativa sobre a sade do homem. Quando vamos praia, por exemplo, estamos sujeitos a elevadas temperaturas e s radiaes ultravioleta e infravermelha. Contudo, ir praia pode ser muito agradvel e saudvel. O que faz um agente ser de risco a concentrao e a forma de atuao sobre o homem. Se ir praia deixa de ser um eventual prazer para se tornar obrigao diria, como no caso dos vendedores ambulantes, a radiao solar tropical pode vir a representar um agente de risco potencial causador, a curto ou longo prazo, de leses e at mesmo de cncer de pele. Ou seja, a repetio da ao do agente, ao longo do tempo, pode fazer deste um risco para a sade.
A RELAO ENTRE AGENTES DE RISCO E OS ACIDENTES E DOENAS DO TRABALHO

Muitas vezes os agentes de risco possuem baixos nveis de concentrao, compelindo para que sejam imperceptveis ou com que as pessoas se acostumem a eles. De uma forma ou de outra, tornam-se invisveis e posteriormente no so associados, nem pelo trabalhador nem pelos mdicos, como responsveis por determinados problemas de sade. Alm disso, ainda h muito a se conhecer sobre os efeitos danosos para a sade de diversos agentes de risco que surgem e se expandem com o desenvolvimento tecnolgico e industrial. Essa ltima observao ressalta a importncia de contextualizar os agentes de risco no interior dos processos de trabalho. Como o prprio nome revela, um processo de trabalho envolve todo um dinamismo associado s transformaes sobre o objeto de trabalho. O trabalhador manipula e controla diversos instrumentos, realizando um conjunto de operaes. Para analisarmos a presena e a forma de ao dos agentes de risco, precisamos atentar para as diversas fases e operaes que caracterizam um processo de trabalho. Existem operaes em que a possibilidade de atuao de certos agentes de risco maior do que outras. Cabe s pessoas que esto levantando condies de trabalho delimitar essas situaes, o que s possvel mediante a compreenso do processo de trabalho dentro de uma dimenso tcnica. Em outras palavras, s possvel percebermos a presena de agentes de risco se os analisarmos e contextualizarmos dentro do processo de trabalho, entendendo suas transformaes, operaes e a forma como os trabalhadores as realizam.
A CLASSIFICAO DOS AGENTES DE RISCO

Antes de apresentar a classificao dos agentes, teceremos um rpido comentrio sobre a ao simultnea de mais de um agente de risco no ambiente de trabalho.
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Sade do trabalhador
Apesar da fragmentao realizada na classificao, consideramos ser de fundamental importncia entender que raramente um agente de risco atua de forma dissociada ou desarticulada com outros agentes. Poucos estudos vm sendo feitos levando em considerao essa realidade, porm podemos supor que a atuao conjunta de diversos agentes sobre o trabalhador forma efeitos distintos e em muitos casos mais funestos do que quando atuando isoladamente. Exemplificando: um trabalhador que simultaneamente respira em um ambiente txico, com um nvel de rudo elevado e num sistema de organizao altamente coercitivo, deve sofrer reaes distintas do que se fosse afetado por esses mesmos agentes de forma isolada. Sempre que possvel, um levantamento de condies de trabalho e a sua anlise deve se pautar na tentativa de articular a atuao dos diversos agentes em um dado ambiente de trabalho. A seguir, apresentamos a classificao dos agentes de risco para a sade, presentes nos processos de trabalho. Figura 1 Agentes de risco para a sade presentes no processo de trabalho
Fsicos Qumicos Processos de Trabalho Trabalhador Biolgicos Organizacionais Ergonmicos Mecnicos
FSICOS
ambiente
trmico; rudo; radiaes ionizantes; ambiente mal iluminado; presses anormais; vibraes; eletricidade.
QUMICOS
slidos
poeiras, fumos; vapores, gases; irritantes asfixiantes; anestsicos narcticos; sistmicos carcinognicos; inflamveis explosivos; corrosivos.
lquidos
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ERGONMICOS
postura
(fadiga e problemas osteoarticulares); esforos fsicos e mentais (fadiga).
MECNICOS
quedas; leses no manuseio de mquinas e instrumentos; rebarbas, cavacos, fagulhas; choque de veculos; outros impactos mecnicos.
BIOLGICOS
contato contato
com animais peonhentos (cobras, escorpies, aranhas etc.); ou manuseio com microorganismos patognicos (laboratrios, hospitais etc.); contato com vetores de doenas infecto-contagiosas.
ORGANIZACIONAIS
trabalho
em turnos alternados e noturnos; trabalho repetitivo e montono; jornadas, pausas, horas extras; ritmo de trabalho, cobrana e produtividade; mecanismos de coero e punio.
PONTOS A DESTACAR
Alinhavando as questes fundamentais da relao trabalho e sade, podemos caminhar na direo de um objetivo: o de trabalhar sem necessariamente adoecer ou morrer em decorrncia do trabalho. Com essa compreenso, uma heterognea combinao de profissionais filsofos, telogos, cientistas sociais, polticos, planejadores, engenheiros, profissionais da sade e outros, juntamente com os trabalhadores e suas organizaes j est engajada na transformao progressiva da organizao do trabalho, das suas condies e de seus processos, bem como das respectivas tecnologias e do meio ambiente, na tentativa de resgate do sentido maior do trabalho: o trabalho sem sofrimento, dor, doena ou morte. Para ampliar esse olhar sobre o trabalho e a sade, estudiosos dessa rea do conhecimento o professor Ren Mendes, professor da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), por exemplo apontam como uma das expresses desse processo de mudana que vem ocorrendo nos ltimos 20 anos, sobretudo no mundo ocidental, a compreenso da sade do trabalhador como um importante campo de estudos, cujas caractersticas bsicas compreendem: a busca da compreenso das relaes (do nexo) entre o trabalho e a sade-doena dos trabalhadores, que se refletem sobre a ateno sade prestada; a possibilidade/necessidade de mudana dos processos das condies e dos ambientes de trabalho em direo humanizao do trabalho;
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Sade do trabalhador
o exerccio de uma abordagem multidisciplinar e intersetorial das aes na perspectiva da totalidade, buscando a superao de atitudes improfcuas sobre a questo; a participao de trabalhadores, como sujeitos de sua vida e de sua sade, capazes de contribuir, com seu conhecimento, para o avano da compreenso do impacto do trabalho sobre o processo sade-doena e de intervir politicamente para transformar essa realidade.
A sade do trabalhador, como um processo em instituio, aparece sob prticas diferenciadas em diferentes momentos e regies, dentro de um mesmo pas, mantendo os mesmos princpios: trabalhadores buscam ser reconhecidos em seu saber, questionam as alteraes nos processos de trabalho, particularmente a adoo de novas tecnologias, exercitam o direito informao e recusa ao trabalho perigoso ou arriscado sade, tendo como meta a humanizao do trabalho. A emergncia da sade do trabalhador, em nosso pas, deu-se a partir da dcada de 80 do sculo XX, no contexto da transio democrtica e em sintonia com o que ocorreu no mundo ocidental. Entre suas caractersticas bsicas, destacam-se:
um
novo pensar sobre o processo sade-doena e o papel exercido pelo trabalho na sua determinao;
o desvelamento circunscrito, porm inquestionvel, de um adoecer e morrer dos trabalhadores caracterizado
por verdadeiras epidemias tanto de doenas profissionais clssicas quanto de novas doenas relacionadas ao trabalho; a denncia das polticas pblicas e do sistema de sade, incapazes de dar respostas s necessidades de sade da populao e dos trabalhadores, em especial; novas prticas sindicais em sade, traduzidas em reivindicaes de melhores condies de trabalho, mediante a ampliao do debate, circulao de informaes, incluso de pautas especficas nas negociaes coletivas, da reformulao do trabalho da Comisso Interna de Preveno de Acidentes (CIPAS) no mbito da emergncia do novo sindicalismo. Esse processo social se desdobrou em uma srie de iniciativas e se expressou nas discusses da VII Conferncia Nacional de Sade e na realizao da I Conferncia Nacional de Sade dos Trabalhadores, sendo decisivo para a mudana de enfoque estabelecida na nova Constituio Federal de 1988. Mais recentemente, a denominao sade do trabalhador aparece incorporada na nova Lei Orgnica da Sade, que estabelece sua conceituao e define as competncias do Sistema nico de Sade (SUS) nesse campo. Na implementao desse novo modo de lidar com as questes de sade relacionadas ao trabalho, em nosso pas, foi fundamental o papel desempenhado pelas assessorias tcnicas sindicais, estudando os ambientes e as condies de trabalho; levantando riscos e constatando danos para a sade; decodificando o saber acumulado em processo contnuo de socializao da informao; resgatando e sistematizando, enfim, o saber operrio vivenciado na relao educador-educando e tentando construir, ao longo da histria, o valor do trabalho e de seus resultados como uma das formas de riqueza da vida humana.
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Biossegurana em biotrios
B iossegurana em Biotrios
INTRODUO
45
Antenor Andrade
Ter segurana significa poder confiar. Assim, para se trabalhar com segurana e evitar acidentes, devem ser observadas e respeitadas as regras e os procedimentos de trabalho formulados para eliminar prticas perigosas e evitar riscos desnecessrios. Os animais de laboratrio representam um risco para quem os maneja, pois, mesmo que no experimentalmente infectados, podem estar carreando agentes patognicos, inclusive zoonticos. Dessa forma, o risco de se adquirir infeces em biotrios nos quais as doenas infecciosas esto sendo estudadas, isto , em infectrios, muito grande. Desse modo, um rgido controle nos protocolos experimentais deve ser associado a estritos procedimentos de segurana e no somente os tcnicos devem ter conscincia dos perigos existentes, alguns dos quais especficos para cada rea, mas tambm os pesquisadores e o pessoal de apoio que tm acesso ao biotrio. Os estudos de longa durao em animais esto associados, freqentemente, a estudos de carcinognese, oncognese viral, teratognese, avaliao de compostos potencialmente txicos e radioistopos, entre outros. Por esse motivo, a manipulao e administrao de drogas, o contato com tecidos animais, inclusive soro, bem como alguns dos componentes das madeiras, cuja maravalha se usa para as camas dos animais, constituem motivo de preocupao para aqueles que trabalham com animais de laboratrio.
O AMBIENTE DE TRABALHO
Em biotrios, existe uma variedade muito grande de salas para animais, envolvendo salas para criao e produo, para manuteno, para cirurgias, quarentena ou ainda para manipulao de animais em experimentao, que podem estar expostos a materiais carcinognicos, infecciosos ou alrgicos. Alguns odores animais so agressivos para os seres humanos. Grande parte deles produzida pela decomposio bacteriana dos excrementos, porm no se deve usar produtos que os mascarem, pois podem ser nocivos aos animais. Esses odores podem ser controlados por procedimentos de limpeza e ventilao adequados. Quando se analisa o ambiente, deve-se testar tanto o macro quanto o microambiente (gaiolas dos animais), pois podem ser muito diferentes. O mais comum e mais srio dos contaminantes ambientais dos biotrios o amonaco (NH3), que se forma pela ao das bactrias (urease positiva) sobre os excrementos. A concentrao do amonaco influenciada por muitos fatores, como: ventilao, umidade relativa, desenho das gaiolas, nmero e sexo dos animais nas mesmas, estado sanitrio dos animais, alimentao etc.
381
Nas salas de cirurgia e de inoculao de animais de laboratrio comum o uso de anestsicos volteis; entre eles, o ter o mais utilizado em nosso meio. Esse composto, alm de produzir sintomas como dor de cabea, cansao e irritabilidade, pode apresentar perxidos altamente explosivos que j foram responsveis por graves acidentes nos laboratrios onde se realizavam experincias em animais. Para outros anestsicos volteis tambm usados e que constituem riscos potenciais para a sade, devem ser introduzidas medidas preventivas nas salas de cirurgia, para minimizar a exposio a esses tipos de anestsicos. Normalmente, os tcnicos so responsveis por duas ou mais diferentes espcies animais e em alguns casos at por ces e primatas no-humanos. Dessa forma, o desempenho de qualquer atividade em um biotrio pressupe um treinamento especfico, no qual o tcnico ser informado sobre todos os riscos a que est sujeito, bem como as maneiras de se proteger e evit-los. Os infectrios esto classificados em grupos de risco, segundo o tipo de atividade desenvolvida, no que se refere biossegurana animal. Assim, definem-se as instalaes e as prticas aplicveis para trabalhar com animais infectados com agentes patognicos, correspondentes aos nveis de biossegurana 1 a 4. Quadro 1 Nveis de biossegurana recomendados no uso de animais infectados
NVEL
DE
BIOSSEGURANA
PRTICAS E TCNICAS
EQUIPAMENTOS DE SEGURANA
INSTALAES
1 Baixo risco no causa doena ao homem ou ao animal.
Manejo-padro para colnias convencionais.
_________
Bsicas
2 Moderado risco individual Uso obrigatrio de jaleco e comunitrio causa e luvas; descontaminao doena ao homem ou ao dos dejetos infectados e das animal. gaiolas dos animais antes da higienizao; acesso limitado e sinalizao para alerta de riscos. 3 Elevado risco individual e Prticas do nvel 2, mais baixo risco comunitrio uniforme especial e acesso causa doena grave ao controlado. homem ou ao animal. 4 Elevado risco individual e comunitrio causa doena incurvel ao homem ou ao animal. Prtica do nvel 3 mais troca de roupa de rua por uniforme especial em vestirio; ducha na sada; descontaminao de todos os dejetos antes de sua retirada do infectrio.
Barreira parcial (guich de desinfeco); uso de dispositivo de proteo para o pessoal Bsicas (mscara, respiradouro etc.) para a manipulao de agentes ou animais infectados que produzem aerossis. Os do nvel 2, porm, devem ser usados para todos os tipos de manipulaes com animais infectados. Barreiras mximas, isto , nvel 3 de segurana biolgica ou barreira parcial em combinao com: proteo total do corpo com uma pea nica dotada de ventilao e presso positiva, gaiolas dotadas de filtros, estantes com fluxo laminar etc.
Alta segurana
Segurana mxima
382
PROTEO DA SADE
Como do conhecimento de todos, doenas podem ser transmitidas do homem para os animais e viceversa (zoonoses). Essa transmisso pode ser evitada por monitoramento cuidadoso da sade dos animais e dos tcnicos. A higiene pessoal constitui uma importante barreira contra infeces. O hbito de lavar as mos antes e aps manipular qualquer animal reduz o risco de disseminar doenas, bem como o de autoinfeco. Para facilitar esses procedimentos, cada sala de animal deveria ser provida de uma pia, sabo e toalha de papel. Fumar, comer ou beber no deve ser permitido em qualquer sala de animal ou em outra rea em que existam microorganismos patognicos ou que tenham sido manipulados recentemente. Da mesma forma, pessoas com ferimentos abertos no devem ter permisso para trabalhar onde haja a possibilidade de ter contato com microorganismos patognicos, a no ser que os ferimentos possam ser satisfatoriamente protegidos. As roupas de laboratrio usadas em reas de risco devem ser autoclavadas antes de serem lavadas. Sapatos descartveis ou protetores de sapatos devem ser usados como barreira em reas de alto risco e se houver necessidade de manipular material contaminado, deve-se usar luvas de borracha. Animais experimentalmente infectados com microorganismos patognicos so mais seguramente mantidos em gaiolas protegidas no fundo e dos lados, em vez de gaiolas de arame/tela. Essas gaiolas devem ser manuseadas adequadamente e os tcnicos devem usar luvas protetoras, at mesmo quando fornecem alimentos a esses animais. Se agentes altamente infecciosos ou nocivos so usados, o animal deve ser isolado em unidade de fluxo laminar ou mesmo em isoladores, nos quais o ar que entra e sai convenientemente filtrado, por meio de filtros absolutos (filtro HEPA). O manuseio de primatas no-humanos requer especiais precaues, alm do uso de roupas protetoras apropriadas e materiais de uso especfico para esses animais. Necropsias de animais infectados com organismos altamente contagiosos devem ser feitas em gabinetes ventilados que ofeream a devida segurana, isto , que permitam a filtragem do ar. O material de necropsia a ser descartado, deve ser lacrado em sacos plsticos, adequadamente identificado, autoclavado, se infeccioso, e incinerado. A sala de necropsia deve ser refrigerada adequadamente e possuir instalaes para higienizao (lavagem e desinfeco).
ZOONOSES
As infeces transmitidas naturalmente entre animais vertebrados e o homem so denominadas zoonoses. Os animais devem ser considerados como transmissores potenciais, pois, embora no apresentem sinais aparentes de doena, podem carrear agentes causadores. No entanto, o risco da ocorrncia de zoonose varia muito em virtude da espcie animal envolvida. De todas as espcies utilizadas para fins experimentais, os primatas no-humanos constituem fontes mais perigosas de zoonose, no s por abrigarem uma grande gama de bactrias e vrus, mas tambm por serem uma espcie altamente susceptvel a infeces comuns ao homem. A transmisso de infeces do animal ao homem geralmente pode ser evitada por meio de cuidados veterinrios adequados e do cumprimento de normas e procedimentos preestabelecidos na criao e experimentao animal.
383
SEGURANA PESSOAL
Alm dos perigos de doenas infecciosas transmissveis dos animais para o homem, existem muitos riscos para o pessoal que trabalha em biotrios, incluindo danos causados por animais e produtos qumicos, bem como materiais e equipamentos manuseados rotineiramente. Como em outros laboratrios, os biotrios devem ter um programa de segurana que inclui equipamentos de combate a incndio, instrues para o seu correto uso e treinamento de primeiros socorros. Todas as pessoas que trabalham em biotrios devem estar familiarizadas com as exigncias da instituio ou com o programa de segurana em casos de ferimento acidental. Responsabilidades devem ser imputadas para assegurar que todo o pessoal que trabalha com animais aprenda como manipular corretamente as espcies envolvidas, para a segurana e sade deles prprios, bem como dos animais. Quando o trabalho envolve a manipulao de camas contaminadas, o uso de aparelhagem porttil para a sua eliminao, equipada com fluxo de ar negativo ou a utilizao de sistemas de vcuo, reduz a exposio dos tcnicos durante a troca das gaiolas. Enfim, todo trabalho com animais deveria se efetuar cumprindo as normas de boas prticas de laboratrio, destinadas a salvaguardar os prprios animais, os resultados dos experimentos, as pessoas envolvidas e as instalaes.
TRAUMAS FSICOS E RISCOS POR SUBSTNCIAS QUMICAS

Os acidentes que geralmente ocorrem em biotrios esto includos em uma das cinco categorias a seguir:
ferimentos
causados por animais (arranho, mordedura, coice etc.); cortes causados pelas gaiolas, tampas ou outros materiais; quedas causadas por pisos escorregadios ou degraus; tores causadas por objetos pesados, levantados incorretamente; ferimentos nos olhos e pele, quando da utilizao incorreta de agentes qumicos. Todos eles podem ser prevenidos com total esclarecimento dos tcnicos sobre o uso de roupas e equipamentos de proteo; a inspeo regular das gaiolas, tampas e demais materiais; a opo por pisos no escorregadios e a aquisio de escadinhas de altura adequada e degraus seguros para evitar que os tcnicos utilizem objetos inadequados quando precisarem manusear as gaiolas do topo das prateleiras/estantes.
MATERIAL RADIOATIVO
Os materiais radioativos apresentam riscos especiais e os tcnicos que trabalham com esses materiais devem conhecer as propriedades de cada um e estar familiarizados com as tcnicas de manuseio seguras e com as regulamentaes de sua instituio. No se deve esquecer, tambm, que os animais podem eliminar material radioativo em seus excrementos. Os olhos e a pele so reas crticas quando expostos ao de raios ultravioleta, particularmente os olhos podem ser seriamente afetados. Dessa forma, se lmpadas UV so usadas durante as tarefas, os tcnicos devem usar roupas e culos protetores. A intensidade mxima tolerada durante sete horas por dia , em mdia, de 1,0 a 1,5 miliwatt por p quadrado de rea.
384
EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA (EPC) E DE PROTEO INDIVIDUAL (EPI)

Em virtude dos riscos a que esto sujeitas as pessoas que trabalham em biotrios, o uso de proteo coletiva e/ou individual adequada no pode ser descuidado, tendo em vista a variedade de ambientes de trabalho, as espcies animais envolvidas e a gama de agentes fsicos, qumicos e biolgicos com que essas pessoas tm contato.
P RINCIPAIS EPC E EPI UTILIZADOS

CAPELAS DE FLUXO LAMINAR
EM
B IOTRIOS
Equipamentos de Proteo Coletiva (EPC)

equipamentos exaustores; caixas
de socorro imediato (chuveiro, lava-olhos, pia, sabo, escova etc.);
com luvas; portteis de oxignio; extintores de incndio; condicionador de ar; desumidificador de ambiente; circulador de ar/ventilador; autoclave; microincinerador; barreiras (sanitria, acstica, trmica e radioativa); recipientes para rejeitos; recipientes especiais para transporte de material contaminado e/ou animais; pipetas mecnicas; dispositivos de segurana em mquinas e equipamentos.
equipamentos
EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL (EPI)

protetor ocular; protetor auricular; protetor facial; respiradores; mscaras; luvas; mangas; aventais; jaquetas; calados.
REGRAS DE SEGURANA DE CARTER GERAL

conhecer conhecer
o seu trabalho e os materiais que utiliza; todas as sadas de emergncia;

385
saber
onde esto localizados os extintores e as mangueiras de incndio, bem como saber utiliz-los; proteo apropriada; observar as indicaes de no fumar em local no permitido; seguir todas as regras de segurana referentes ao seu trabalho; no operar, desmontar ou reparar equipamentos que no esteja qualificado a manusear; avisar imediatamente ao responsvel qualquer situao de risco; conhecer as regras de primeiros socorros.
utilizar
REGRAS DE SEGURANA LIGADAS DIRETAMENTE AO TRABALHO

no
manusear espcie animal sem que esteja habilitado para tal; usar roupas e materiais de conteno de animais, conforme a espcie; informar imediatamente ao responsvel as mordeduras, arranhes ou qualquer trauma fsico que tenha sofrido; manter em ordem sua rea de trabalho; no fumar, beber ou comer na rea de materiais oriundos das criaes; separar os materiais defeituosos ou em ms condies, visando a sua recuperao; no colocar material que prejudique a visibilidade nos carros de transporte de materiais; manter as mos limpas e as unhas aparadas; materiais de vidro, ao se quebrarem, devem ser recolhidos com p e vassoura.
CONCLUSO
O trabalho com animais de laboratrio requer a utilizao e o contato com substncias qumicas e alrgenos potencialmente perigosos para a sade do pessoal envolvido, as instalaes e os prprios animais. Esses perigos podem ser minimizados ou eliminados com o estrito cumprimento de procedimentos operacionais padronizados destinados a garantir a segurana. O estabelecimento e a validao desses procedimentos uma responsabilidade intransfervel da gerncia do biotrio ou laboratrio, e estes devem ser escritos e explicados ao pessoal envolvido por meio de cursos e treinamento permanente. Medidas preventivas devem ser tomadas j durante a elaborao do projeto de construo civil, especialmente com relao ao tipo de piso, tamanho das salas, localizao de sadas de emergncia e posio de extintores. Essas medidas devem possibilitar tambm o estabelecimento de uma ventilao unidirecional, evitando assim a disseminao dos contaminantes pelo ar turbulento. A recirculao do ar deve ser evitada, principalmente quando se trata de infectrios. A seleo do pessoal para trabalhar em biotrios deve ser rigorosa. obrigatria a realizao de exame mdico antes de assumir o emprego e deve-se excluir as pessoas com alergias respiratrias, ou de pele, ou com doenas respiratrias crnicas. Deve-se exigir tambm boa viso, olfato e audio satisfatrios, bem como um elevado padro de higiene pessoal, permitindo assim trabalhar com segurana em biotrios ou laboratrios que utilizam animais. Em alguns pases, a cincia e a tecnologia em animais de laboratrio infelizmente ainda no esto bem desenvolvidas; dessa forma, os procedimentos utilizados no correspondem nem s necessidades cientficas, nem aos conceitos internacionalmente recomendados de segurana.
386
BIBLIOGRAFIA
CANADIAN COUNCIL ON ANIMAL CARE (CCAC). Guide to the Care and Use of Experimental Animals. Ottawa: Canadian Council on Animal Care, 1984. CLOUGH, G. Environmental effects on animals used in biomedical research. Biol. Rev., p.487-523, 1982. GAMBLE, M. R. & CLOUGH, G. Ammonia building in animal boxes and its effect on rat tracheal epithelium. Laboratory Animal, p.10-93, 1976. GRIST, N. R. Manual de Biossegurana para o Laboratrio. So Paulo: Livraria Santos Ed., 1995. NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH). Biosafety Awareness Occupational safety and health branch. NIH Manual. Washington, D.C.: National Institutes of Health, Division of Safety, 1987. NATIONAL RESEARCH COUNCIL (NRC). Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Research Council. Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. PHILIPS, G. B. & JEMISKI, J. V. Biological Safety in the Animal House. Laboratory Animal Care, 13:13, 1963. SAIZ MORENO, L; GARCIA DE OSMA, J. L. & COMPAIRE FERNANDEZ, C. Animales de Laboratorio: produccin, manejo y control sanitario. Madrid: Instituto Nacional de Investigaciones Agrrias. Ministrio de Agricultura, Pesca y Alimentacin, 1983. SEAMER, J. H. & WOOD, M. Safety in the Animal House. 2nd revised edition. In: ___. SEAMER, J. H. & WOOD, M. (Eds.). London: Laboratory Animal Ltda., 1981.
387
Formato: 21 x 28 cm Tipologia: Bulmer BT Alexei Copperplate Papel: Print Max 90g/m2 (miolo) Carto Supremo 250g/m2 (capa) Fotolitos: Engenho & Arte Grfica Ltda. (capa e miolo) Impresso e acabamento: Millennium Print Comunicao Visual Ltda. Rio de Janeiro, outubro de 2002. No encontrando nossos ttulos em livrarias, contactar a EDITORA FIOCRUZ: Av. Brasil, 4036 1o andar sala 112 Manguinhos 21040-361 Rio de Janeiro RJ Tel.: (21) 3882-9039 e 3882-9041 Telefax: (21) 3882-9007 http://www.fiocruz.br/editora e-mail: editora@fiocruz.br
388

Animais de Laboratorio Criaçao e Experimentacao

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Animais de laboratrio

Antenor Andrade Sergio Correia Pinto Rosilene Santos de Oliveira Orgs.

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Antenor Andrade Sergio Correia Pinto Rosilene Santos de Oliveira

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LUIZ FRANCO SAMPAIO

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SAUL FURQUIM WERNECK ABDELHAY

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Bilogo, Laboratrio de Criobiologia da Universidade Estadual de Campinas [afonso@cemib.unicamp.br]

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GRAAS MLLER DE OLIVEIRA HENRIQUES

AUGUSTO FRANA PRESGRAVE

ENES REIS COUTO

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Bilogo, Laboratrio de Criopreservao de Embries, Universidade Estadual de Campinas [dini@cemib.unicamp.br]

Bilogo, Laboratrio de Criopreservao de Embries, Universidade Estadual de Campinas [santana@cemib.unicamp.br]

2. Modelo Animal ........................................................................................................................... 23

3. tica na Experimentao Animal ................................................................................................ 25

13. Principais Doenas dos Coelhos ............................................................................................... 105

14. Criao e Manejo de Camundongos .......................................................................................... 115

19. Criao e Manejo de Primatas No-Humanos ........................................................................... 143

24. Principais Zoonoses .................................................................................................................. 201 25. Gnotobiologia ........................................................................................................................... 211

26. Criopreservao de Embries Murinos em Biotrios ................................................................. 225

32. Fatores que Influenciam no Resultado do Experimento Animal ................................................ 289

33. Tcnicas de Risco Desenvolvidas na Experimentao com Roedores ........................................ 295

39. Alternativas para Animais de Laboratrio: sistemas in vitro ......................................................... 337

Estresse em animais de laboratrio

Estresse em animais de laboratrio

NECESSIDADES BSICAS DE UM BIOTRIO

manejo; prolificidade; docilidade;

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TICA NO USO DE ANIMAIS

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Classificao de biotrios quanto finalidade

C lassificao de Biotrios quanto Finalidade

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QUANTO FINALIDADE A QUE SE DESTINAM

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Este tipo de biotrio tem duas finalidades especficas:

Adaptao do animal ao cativeiro

Produo de sangue animal e fornecimento de rgos

Classificao de biotrios quanto finalidade

Instalaes e barreiras sanitrias

I nstalaes e Barreiras Sanitrias

Sebastio Enes Reis Couto

Instalaes e barreiras sanitrias

Figura 2 Estrutura fsica e equipamentos

Corredor de Distribuio rea de E stoque

Mquina de lavar gaiolas Autoclave Guich Cmara de xido de etileno

Air lock ou autoclave T anque de imerso Tanque Sanitrio Box de higienizao

Instalaes e barreiras sanitrias

Para roedores e lagomorfos, os seguintes padres so recomendados:

Instalaes e barreiras sanitrias

Figura 3 Tanque de imerso

PRINCIPAIS COMPOSTOS QUMICOS UTILIZADOS EM DESINFECO E ESTERILIZAO