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APONTAMENTOS

TOXICOLOGIA E ANLISES TOXICOLGICAS


- Aulas Laboratoriais -

FACULDADE DE FARMCIA
UNIVERSIDADE DE COIMBRA

I- EXTRACO E IDENTIFICAO DE TXICOS


1 - Generalidades
No meio em que actualmente vivemos somos confrontados com uma vastido de
produtos qumicos e biolgicos que, pela sua natureza, concentrao, modo de
administrao, emprego, entre outros, podem desencadear reaces adversas ou
txicas. Para contrariar essa toxicidade necessrio conhecer a natureza do
composto txico, os seus efeitos e o seu antdoto.
A pesquisa de um txico num meio compreende a sua extraco do meio e a sua
identificao.

2 - Extraco
2.1. Introduo
Para promover um correcto isolamento de um veneno necessrio conhecer
previamente a sua natureza, nomeadamente as suas propriedades fsico-qumicas
(solubilidade e ionizao), grupos funcionais, etc.
Um txico de natureza mineral isola-se destruindo o substrato orgnico que o
acompanha por um processo de mineralizao.
Se o txico de natureza complexa, orgnica ou mineral, deve-se ter em conta a sua
solubilidade (ou dos seus derivados) em diferentes solventes, relativamente a outras
substncias que o acompanham, bem como a polaridade da sua molcula sob a
influncia de um campo elctrico.
Txicos volteis, ou volatilizveis, so facilmente extrados do meio em que se
encontram, por este ser normalmente fixo.
2.2. Separao de venenos volteis
A separao deste tipo de venenos das amostras de tecidos normalmente efectuada
por destilao por arrastamento de vapor, substituda, na prtica, por uma destilao
simples.
O tecido, triturado e homogeneizado em gua destilada. A mistura acidificada
com cido tartrico e colocada num aparelho de destilao pelo vapor. O destilado
recolhido em 5 fraces (50 ml). Este mtodo permite isolar dos tecidos, lcoois,
aldedos, teres, acetona, fenis, sulfureto de carbono, leos e hidrocarbonetos
volteis, clorofrmio, cido ciandrico, entre outros.

Aps a recolha destas fraces (que vo sendo analisadas) deixa-se arrefecer o


aparelho, alcaliniza-se o meio com magnsia e recomea-se a destilao recolhendo,
pelo menos, mais duas fraces. Obtm-se, neste destilado, amnia, anilina, nicotina
e outras bases volteis presentes nos tecidos.
2.3. Separao de venenos minerais
O resduo que permanece no balo de destilao aps a separao dos venenos
volteis usado para a pesquisa de venenos metlicos. O primeiro passo a efectuar
implica a destruio da matria orgnica por oxidao com cloro, cido ntrico, cido
perclrico, entre outros. O tecido aquecido com o agente oxidante at a mistura
ficar com uma consistncia fluida, cor amarela uniforme e sem partculas de matria
orgnica. A mistura filtrada a quente e o resduo lavado com gua. O resduo
apresenta prata, sob a forma de cloretos insolveis, chumbo, brio e estrncio sob a
forma de sulfatos insolveis.
O filtrado, que contm os restantes metais presumivelmente existentes na amostra,
aquecido e o excesso de cloro removido por passagem atravs da soluo duma
corrente de anidrido carbnico. A adio de sulfito de sdio, em quantidade
suficiente para produzir um cheiro a anidrido sulfuroso, vai converter o arsnio
pentavalente em arsnio trivalente.
A mistura aquecida at que desaparea o cheiro a anidrido sulfuroso. Neutraliza-se
o excesso de cido (caso exista) com carbonato de sdio, para no impedir a
precipitao do antimnio e do estanho com uma corrente de gs sulfdrico.
Coloca-se o filtrado num banho de gua mantendo-se a temperatura a cerca de 70 C.
Faz-se passar pela soluo e durante pelo menos uma hora uma corrente de gs
sulfdrico e deixa-se em repouso durante a noite. Este processo permite a
precipitao do arsnio, antimnio, estanho, mercrio, chumbo, cobre, bismuto e
cdmio, sob a forma de sulfuretos.
O filtrado conter todos os restantes metais, todos os vestgios de chumbo e qualquer
poro de brio e estrncio que no tenha sido retido no filtro sob a forma de sal
insolvel. A separao e identificao dos vrios metais pode ser efectuada por
mtodos qualitativos e quantitativos especficos.
Em casos de suspeita de envenenamento por metais existem testes qualitativos
extremamente rpidos e que podem servir para despiste. O Teste de Reinsch,
aplicado em amostras contendo matria orgnica, permite a identificao dos
venenos metlicos mais comuns e mais txicos: Hg, As, Sb, Bi. O Teste de Gutzeit
um mtodo qualitativo bastante eficaz na pesquisa do arsnio e baseia-se no facto da
arsina decompor o nitrato de prata com formao de prata metlica.

Outro processo de destruio da matria orgnica o da mineralizao por via seca


(incinerao e calcinao). Este mtodo tem a vantagem de levar a uma concentrao
mxima do txico e obteno de cinzas isentas de compostos orgnicos, com os
metais sob a forma de carbonatos, no entanto, alm de ser moroso, pode ocasionar
perdas importantes por volatilidade de alguns metais (Hg, Zn, Cd) e dos seus
derivados (xidos de arsnio e cloretos de antimnio).
2.4. Separao de venenos orgnicos no volteis
Para a separao da maioria destes venenos necessrio preparar um extracto
relativamente puro. Usa-se normalmente o mtodo de Stas-Otto-Ogier, com algumas
modificaes, e que se fundamenta na solubilidade destes compostos em gua e no
lcool absoluto em presena de uma pequena quantidade de cido. O lcool tem a
vantagem de ser praticamente inerte quimicamente, apresentar uma grande pureza e
uma miscibilidade total com a gua. Alm disso relativamente voltil, o que facilita
a sua eliminao posterior, tem um fraco poder dissolvente em relao aos txicos,
floculando as protenas e as gorduras. Este processo permite extrair os alcalides e
outras substncias bsicas, os glucsidos e outros princpios neutros, os cidos
orgnicos e os leos, gomas e resinas.
A amostra dividida, to finamente quanto possvel, por triturao ou
homogeneizao, acidificada e extrada com lcool a quente. O extracto alcolico
concentrado at pequeno volume e diludo com gua, eliminando-se, por filtrao, a
maior parte da matria gorda. O filtrado de novo concentrado at pequeno volume e
extrado com etanol absoluto eliminando a maior parte dos constituintes dos tecidos,
de modo que o novo filtrado, livre de protenas, hidratos de carbono, gorduras e sais
minerais, possa ser novamente concentrado e fraccionado.
As fraces, concentradas, so acidificadas e extradas com ter. O extracto etreo
(ter cido) poder conter glicsidos, leos, pirotoxina, cido pcrico, cido
saliclico, acetanilina, derivados do cido barbitrico e outros compostos de
solubilidade semelhante.
A soluo aquosa agora alcalinizada com hidrxido de sdio e de novo extrada
com ter. O extracto etreo (ter alcalino) contm alcalides livres.
No entanto, os alcalides que contm o grupo hidroxilo fenlico (como a morfina)
no so extrados por este mtodo. necessrio acidificar novamente a fase aquosa,
alcaliniz-la com amnia e extra-la com clorofrmio.
Concluda esta fase, pode-se efectuar os mtodos de anlise qualitativa apropriados.
Para a anlise quantitativa deve-se, se possvel, efectuar o ensaio directamente nos
tecidos, ou tratar padres nas mesmas condies, uma vez que estes mtodos de
extraco originam perdas de produto.

3 - Identificao
3.1. Ensaios prvios
Em Toxicologia no existe um s mtodo para proceder identificao primria e
rpida de um txico desconhecido. O nmero de molculas de tal modo elevado
que necessrio fazer uma pesquisa prvia de modo a prever o tipo de substncia em
causa. O exame do local do acidente, a recolha de recipientes e de informaes
relativas pessoa e ao local, entre outros, so dados que no podem ser descurados
para um procedimento que se quer correcto e rpido, com resultados fiveis.
A ausncia completa de dados prvios levaria a equacionar a possibilidade de um to
grande nmero de substncias, que tornaria a sua identificao impossvel, pelo
menos em tempo til. No entanto, por vezes necessrio efectuar um elevado
nmero de anlises para se tentar encontrar a identidade da substncia em causa.
Uma fonte principalmente eleita para efectuar essas anlises, nomeadamente pela
quantidade disponvel, a urina.
Outro factor a ter em conta o tempo que medeia a recolha da amostra e a sua
anlise efectiva. Devem estas amostras serem correctamente armazenadas, nas
condies de conservao ideais e que no permitam ou provoquem qualquer
alterao das substncias.
As amostras recolhidas, nomeadamente amostras de tecido, devem ser separadas em
vrias fraces, de acordo com o tipo de testes a efectuar e de modo a manter pelo
menos uma fraco de reserva, para prevenir qualquer anomalia ou confirmao dos
resultados.
3.2. Identificao especfica
Aps conhecer, de um modo mais ou menos seguro, a substncia em causa, est-se
em condies de recorrer a tcnicas emanadas das diversas reas cientficas: qumica
analtica, farmacodinamia, etc.
A escolha do mtodo ter de se basear nas caractersticas do prprio mtodo
(reprodutibilidade, proporcionalidade, etc.), da disponibilidade do laboratrio que vai
proceder anlise e do tempo que se dispe para a obteno dos resultados.
Ter tambm de se ter em conta as caractersticas da prpria substncia, no que
concerne ao seu comportamento farmacocintico.
3.3. Anlise de cidos e bases corrosivos
A identificao deste tipo de compostos vem muitas vezes dificultada pelo anterior
uso de antdotos e pela sua instabilidade nos tecidos animais. Alm disso, a

concentrao de alguns ies, tais como o sdio, o potssio, os cloretos e os sulfatos,


normalmente bastante elevada nas amostras biolgicas.
O cido sulfrico pode ser detectado pela acidez invulgar, bem como com ensaios
especficos para o io sulfato. Os cidos ntricos e clordricos podem ser
concentrados por destilao. Os hidrxidos alcalinos e os carbonatos podem ser
detectados por determinao do excesso de alcalinidade e pela presena de
quantidades invulgares de sdio e potssio.

BARBITRICOS
1 - Introduo
O diagnstico desta intoxicao, quando no evidente, pode ser feito graas s
pesquisas toxicolgicas no sangue e na urina. Embora os barbitricos no circulem
livremente no plasma, a sua concentrao no sangue, pelo menos no incio da
intoxicao, muito maior do que na urina, uma vez que a eliminao urinria
fraca no incio da intoxicao; s depois da alcalinizao do organismo que a
concentrao aumenta. O lquido de lavagem gstrico pode ser usado se no tiverem
passado mais de 1-2 horas entre a ingesto da droga e a recolha do lquido.
A escolha dos vrios mtodos a usar depende essencialmente do equipamento
existente no laboratrio. A extraco pelo mtodo de Griffon e Le Breton, tanto para
o sangue como para a urina, seguida de identificao do barbitrico em causa por
cromatografia em camada fina (CCF) e a dosagem espectofotomtrica de UV esto
ao alcance de qualquer laboratrio e so tcnicas rpidas e precisas.
1.1. Extraco e Purificao pelo Mtodo de Griffon e Le Breton
No almofariz, adicionar:
1 - Amostra: 20 ml de urina
2 - cido actico puro: V a X gotas (insolubiliza os barbitricos e evita a
passagem dos alcalides para o solvente orgnico. Tem o inconveniente de
favorecer a passagem dos cidos gordos fisiolgicos e sobretudo dos cidos
orgnicos medicamentosos cujos ies H+ podero ulteriormente interferir na
espectroscopia no UV)
3 - Sulfato de sdio anidro: 35 g (promove a desidratao)
Triturar lenta e progressivamente at obteno de uma mistura pulverulenta.
Preparar uma coluna de vidro introduzindo sucessivamente atravs
de um tubo de vidro :
1 - Carvo vegetal activado pulverizado: 0,2 g
(adsorve as impurezas e no os barbitricos)
2 - Magnsia calcinada: 0,2 g
(neutraliza algum cido)
3 - Sulfato de sdio anidro: 2 g
(desidratante)

4 - Mistura pulverulenta
5 - Sulfato de sdio anidro: 2 g
(promove a desidratao, eliminando a fase aquosa
e as impurezas que ela contm)

6 - Clorofrmio: o suficiente para impregnar toda a massa.


7 - Extrair com 30 ml de clorofrmio (gota-a-gota) de modo a que o solvente fique
sempre 2 cm acima da massa.
Recolher o clorofrmio num matraz.
Nota
O clorofrmio o solvente classicamente utilizado. O inconveniente que possui em
formar emulses muito estveis em mtodos de extraco por agitao aqui
anulado. Prefere-se ao ter (uma vez que este retm muita gua) e ao diclorometano
(porque necessria uma grande quantidade).
1.2. Identificao por TLC
Aps extrair a amostra pelo mtodo de Griffon e Le Breton, evaporar o clorofrmio a
presso reduzida e retomar o resduo em 0,5 ml de clorofrmio. Aplicar na placa
(adsorvente: silica-gel com 0,25 mm de espessura) 3 manchas diferentes correspondentes a
20, 100 e 200 l da soluo clorofrmica (as concentraes ptimas de barbitricos
para uma boa separao situam-se entre os 100 e os 200 mg). Ao lados das manchas
que contm o produto a identificar, colocar depsitos de 40 l das solues padro
(solues de 5 mg de barbitrico por ml de clorofrmio ou gua no caso de no serem solveis).
Proceder ao desenvolvimento (eluente: clorofrmio 90 ml; acetona 10 ml) at o eluente ter
migrado 15 cm. Marcar imediatamente a frente do solvente.
Revelao - pulverizar as placas uniformemente com soluo de sulfato de mercrio
(xido amarelo de mercrio 5 g, gua destilada 100 ml, cido sulfrico concentrado 20 ml, quando
todo o xido de mercrio estiver dissolvido, completar para 250 ml; este reagente mantm-se 15 dias).
Os barbitricos aparecem sob a forma de manchas brancas sobre um fundo cinzento
claro. Uma segunda revelao, efectuada sobre o mesmo cromatograma, com soluo
de difenilcarbazona (dissolver 10 mg de difenilcarbazona em 100 ml de clorofrmio; mantm-se
15 dias ao abrigo da luz), cora os barbitricos de azul ou violeta. Marcar o contorno das
manchas e determinar os valores de Rf a partir do centro da mancha observada. Fazer
a identificao, por comparao com os valores de Rf dos padres e com o tipo de
mancha.

1.3. Dosagem dos barbitricos


Fundamento
A dosagem efectuada pela medida de absoro diferencial a 260 nm para cada uma
das duas formas ionizadas.
A simples medida de intensidade de absoro a 260 nm num resduo de extraco a
pH 13 proporcional ao teor em barbitricos, mas tem um erro por excesso devido
presena de impurezas extradas conjuntamente. Eliminam-se estas interferncias
operando por uma dupla medida a pH 10.
Nestas condies a absoro devida aos barbitricos no a mesma, enquanto que a
absoro de base dos extractos biolgicos idntica. Elimina-se esta interferncia
fazendo a diferena entre os dois valores de pH.
Tcnica
A extraco feita pelo mtodo de Griffon e Le Breton.
Retoma-se o resduo com 2 x 25 ml de clorofrmio e rene-se o total numa ampola
de decantao.
Lava-se a fase orgnica com 2 x 5 ml de tampo fosfato pH 7,4 rejeitar de cada vez a
fase aquosa superior.
Juntar soluo clorofrmica contida na ampola, 5 ml de soda 0,45 N. Agita-se
vigorosamente durante 5 minutos e recolhe-se a fase aquosa (superior) para tubo de
centrfuga de 20 ml. Repetir o processo de extraco por mais duas vezes.
Centrifugar os 15 ml de soluo sdica (indispensvel para impedir a absoro de
vestgios de emulso do clorofrmio, que absorve no UV a 239 nm).
Tomar 2 ml desta soluo, juntar 2 ml de soda 0,45 N (2 ionizao a pH 13-14) e
agitar.
Medir a absorvncia entre 230 e 270 nm contra um testemunho de soda 0,45 N. Este
espectro deve apresentar um mximo a 252-255 nm e um mnimo 234-237 nm.
Tomar mais 2 ml da soluo centrifugada, adicionar 2 ml de cido brico 0,6 M (1
ionizao a pH 9,8-10,5) e agitar.
Medir a absorvncia entre 230 e 270 nm, contra um testemunho constitudo por 2 ml
de soda 0,45 N e 2 ml de cido brico 0,6 M. Este espectro deve apresentar um
mximo a 238-240nm e no deve ter um mnimo entre 240 e 270 nm.
Os dois espectros devem apresentar 2 pontos de intercepo a cerca de 230 e 250 nm.
Estes 5 pontos atrs referidos so caractersticos dos diversos barbitricos
dissubstitudos.

Padronizao
Fazer as seguintes diluies em tubo de ensaio:
Sol. de Barbitrico a 500 mg/l (ml)

0,8

0,4

0,2

Sangue heparinado proveniente dum indivduo que

9,2

9,6

9,8

10

100

50

40

20

10

no recebeu qualquer teraputica (ml)


Concentrao de barbitrico no sangue (mg/l)

Medir a absoro diferencial a 260 nm, como para a dosagem partindo de 10 ml das
diversas diluies.
Traar a curva padro em - mg de barbitrico / litro.
Resultados
As doses teraputicas variam entre 1 e 10 mg de barbitrico por litro de sangue.
As doses txicas, variam com o tipo de barbitrico (tanto maior quanto mais lenta for
a sua aco) so geralmente 10 vezes a dose teraputica.
A eliminao urinria depende do pH.
Valores inferiores a 50 mg/l podem, por alcalinizao, ser aumentadas para 300 mg/l.

Notas
- As propriedades espectrais dos barbitricos dependem dos 2 grupos NH, entre os 3
grupos C=O. Os barbitricos substitudos no azoto no possuem, logicamente, 2
ionizao.
- A extraco em meio cido impede a extraco de aminas, como a fenotiazina, mas
faculta a extraco dos cidos orgnicos, como o saliclico que possui um espectro de
UV intenso entre 230 e 260 nm. Os cidos so, no entanto, eliminados lavando a fase
orgnica com tampo fosfato.

CIDO CIA NDRICO E CIANETOS


1 - O cido ciandrico e cianetos
O cido ciandrico (cido prssico) , de entre todos os venenos, o mais rpido e
mais violento devido ao efeito do io cianeto, extremamente txico. Os cianetos so
facilmente hidrolizveis (formao de hidrxidos mais ou menos custicos) e
facilmente decomponveis pelos cidos (mesmo pelos mais fracos como o
carbnico). Assim, os cianetos conservam-se mal ao ar ocorrendo:
a) libertao de HCN gasoso,
b) alcalinizao e carbonatao de onde vem a aco custica e a perda de
toxicidade ao longo do tempo.
Os cianetos mais importantes so os de potssio e de sdio (solveis em gua) e os
de zinco, chumbo, cobre e prata (insolveis), e o cianeto de mercrio (muito txico).
Os cianetos complexos so numerosos. O agrupamento CN- satura com uma grande
afinidade as valncias de coordenao dos metais com formao de complexos
metlicos sendo assim dissimulado. Os complexos tm uma toxicidade relativamente
baixa.

2 - Introduo
O odor ciandrico (amndoas amargas) facilmente notado em amostras que contm
estes compostos. No entanto, este odor pode desaparecer por hidrlise ou oxidao
do cido ciandrico em amostras expostas ao ar. Pode tambm no ser detectado, uma
vez que uma em cada quatro pessoas devido a um defeito gentico, no detecta o
cheiro. Nestes casos, a amostra deve ser extrada com gua destilada e o extracto
verificado com papel de tornassol. Se a reaco for alcalina (positiva) deve ser
confirmada com o teste do azul da Prssia. As amostras devem ser colocadas, pelo
mdico que realiza a autpsia, em frascos de vidro devidamente selados e enviadas
ao laboratrio sem demora. Se possvel os exames devem fazer-se imediatamente,
uma vez que as possibilidades de identificao diminuem com o tempo, devido
volatilidade do cido ciandrico, possibilidade de combinao com outros
compostos e ainda facilidade com que se hidroliza.
Como as doses letais so mnimas, e o tempo que medeia entre a ingesto e a morte
curto, no vulgar fazer anlises em produtos excretados. Pelo contrrio, no
estmago e na primeira parte do intestino que se encontra a maior parte do veneno
aps a morte. Alm do estmago e duodeno, as anlises podem ser feitas no sangue,
nos rgos ricos em sangue e, em casos de suspeita de intoxicao por inalao, nos

pulmes. frequente ainda fazer as anlises em produtos alimentares suspeitos (o


caso desta aula, em que se analisa uma farinha) que permite a identificao correcta e
definitiva da substncia em causa.

3 - Ensaios prvios
3.1. Pesquisa de ferricianetos alcalinos
Fundamento
Em meio cido, o ferricianeto alcalino liberta o anio que, com o sulfato ferroso,
origina o azul de Turnbull (ferricianeto ferroso), mais ntido em meio clordrico.
K3Fe(CN)6

------> [Fe(CN)63- + 3K+

Fe(CN)63- + Fe2+ ------> Fe3[Fe(CN)6]2


(Azul de Turnbull)

Tcnica
1- Num tubo de ensaio adicionar um pouco de amostra lquida.
2- Adicionar alguns cristais de sulfato ferroso, aquecer ligeiramente e juntar umas
gotas de HCl.
A formao de uma cor azul esverdeada traduz a presena de ferricianetos alcalinos
3.2. Pesquisa de ferrocianetos alcalinos
Fundamento
Em meio cido, o ferrocianeto alcalino liberta o anio que, com o cloreto frrico
origina o azul da Prssia (ferrocianeto frrico), mais ntido em meio clordrico.
K4Fe(CN)6 ------> [Fe(CN)64- + 4 K+
Fe(CN)64- + Fe3+ -----> Fe4[Fe(CN)6]3
(Azul da Prssia)

Tcnica
1- Num tubo de ensaio deitar um pouco de amostra lquida.
2- Adicionar uns cristais de cloreto frrico, aquecer ligeiramente e juntar umas gotas
de HCl.

A formao de uma cor azul traduz a presena de ferrocianetos alcalinos. Por vezes
forma-se uma cor esverdeada que resulta da mistura da cor azul do precipitado com
a cor amarela da soluo. Por filtrao pode ver-se o precipitado azul.
3.3. Pesquisa de cianeto de mercrio
Fundamento
O cianeto de mercrio solvel em gua quente. Por aco do gs sulfdrico d um
precipitado branco de sulfureto de mercrio que imediatamente passa a negro e que
insolvel em cido aztico e solvel em gua-rgia.
Hg(CN)2 + H2S

-----> HgS + 2 HCN

Tcnica
1- Tomar um pouco de amostra lquida para um tubo de ensaio e aquecer.
2- Fazer borbulhar atravs da amostra uma corrente de gs sulfdrico.
FeS + 2HCl -----> FeCl2 + H2S
Se o cianeto de mercrio estiver presente, forma-se um precipitado branco que
enegrece rapidamente passando por amarelo.
3- Confirmar a insolubilidade do precipitado em HNO3 e a solubilidade em guargia (HCl conc. + HNO3 conc. 1:1).
Em amostras que contm cianeto de mercrio, o uso de gs sulfdrico permite libertar
o HCN.

4 - Destilao (Isolamento do cido ciandrico)


4.1. Notas
Para a determinao qualitativa e quantitativa do cido ciandrico e cianetos tem
de se proceder ao seu isolamento, por destilao simples. Esta destilao, que se
deve efectuar logo que se receba a amostra, pode ter trs causas de erro que, no
entanto, podem ser eliminadas.

1- Se existirem ferri ou ferrocianetos alcalinos, estes, por aco do cido tartrico,


libertam HCN que recolhido no destilado. Como estes compostos so pouco ou
nada txicos, o resultado viria assim alterado por excesso.
2- Se a amostra possuir cianeto de mercrio, que duplamente txico (cianeto e
mercrio), mas como no se decompe pelo cido tartrico, somos levados a
concluir que o produto no txico.
3- Pelos motivos apresentados, muito importante fazer as anlises de pesquisa atrs
referidas.
Se a amostra tiver ferro ou ferricianetos, e para os fixar segundo as reaces atrs
descritas, deve juntar-se respectivamente sal frrico ou ferroso antes da destilao.
Se a amostra tiver cianeto de mercrio, adicionar alguns mililitros de gua
sulfdrica recentemente preparada. O cianeto decompor-se- totalmente e passa
para o destilado sob a forma de cido ciandrico
4- Por vezes os ensaios prvios so positivos e os resultados dos testes no destilado
so negativos. Pode-se admitir a hiptese de ter havido uma grande diluio.
Deve-se fazer nova destilao (a partir do destilado inicial) num aparelho
rectificador.

4.2. Destilao
Fundamento
O cido ciandrico, em soluo cida, arrastado pelo vapor de gua. O cido
tartrico que tem por fim acidificar o meio, usa-se por ser um cido fixo no
passando para o destilado. Alm disso, ao contrrio de outros cidos minerais fortes,
no decompe os txicos.
Tcnica
1- Tomar um pouco de amostra (4 g) para um balo, adicionar gua destilada,
suficiente para evitar ebulio tumultuosa e carbonizao da amostra (200ml) e
cido tartrico a 5%, suficiente para acidular.
2- Fazer a destilao, recolhendo o destilado num balo, onde se coloca previamente
gua destilada e onde se mergulha o tubo de recolha, de modo a evitar que se percam
as primeiras pores de HCN. Destilar cerca de metade do volume.
3- Com a gua de lavagem do condensador e da alonga, completar o volume de 200
ml e proceder aos ensaios qualitativos e de dosagem.

Para evitar qualquer perda de HCN, o destilado deve ser recolhido em banho de gelo
ou mesmo em NaOH 10%.

5 - Ensaios de pesquisa do cido ciandrico e cianetos no destilado


5.1. Reaco do azul da Prssia
Fundamento
Em presena de hidrxido de potssio o cido ciandrico transforma-se em cianeto de
potssio. O cianeto formado, reagindo com o sulfato ferroso d origem ao
ferrocianeto de potssio e este, por aco do cloreto frrico, origina o azul da Prssia.
HCN + KOH --------> KCN + H2O
6 CN- + Fe2+ -------> Fe(CN)644 K4Fe(CN)6 + 4 Fe3+

-------->

Fe4[Fe(CN)6]3
(Azul da Prssia)

Como se junta ao destilado um excesso de KOH, os sais de ferro precipitam sob a


forma de xidos de ferro de cor esverdeada o que dificulta a observao do azul da
Prssia. Para facilitar a observao, adiciona-se cido clordrico, que dissolve os
xidos. No entanto, a adio de muito cido pode levar a que a soluo fique
amarela.
Tcnica
1 - Ao destilado, juntar soluo de KOH 50% em excesso para tornar a soluo
alcalina.
2 - Juntar 0,5 ml de soluo recente de sulfato ferroso a 10% e 0,5 ml de soluo de
cloreto frrico a 10%. Agitar e aquecer suavemente. Arrefecer.
3 - Juntar HCl conc. gota-a-gota at dissolver o pp. castanho que se forma.
Se estiver presente HCN formar-se- um precipitado de azul da Prssia.
Se o HCN estiver muito diludo, a cor azul apenas se observa ao fim de 1-2 horas.

5.2. Reaco do azul da Prssia modificada por Cheele


Fundamento
Anlogo ao ensaio anterior, mas a sensibilidade muito aumentada por controlo dos
valores de pH. A alcalinidade em vez de ser conferida pelo KOH, dada pelo
carbonato de sdio, evitando assim a formao de xidos de ferro.
Tcnica
1 - Ao destilado, juntar I gota de soluo alcolica de fenolfetalena a 1% (Incolor
em soluo cida e rosa em soluo alcalina).
2 - Juntar cido sulfrico a 5% at que o lquido fique incolor.
3 - Alcalinizar a soluo por adio dum excesso de carbonato de sdio a 10%, at
que a cor vire de novo para rosa.
4 - Juntar III a IV gotas de soluo recente de sulfato ferroso a 10%, misturar bem e
deixar em repouso durante alguns minutos. Juntar I-II gotas de cloreto frrico a 10%.
5 - Misturar e acidificar com HCl conc. At tornar a soluo lmpida (dissolve alguns
xidos formados).

A cor azul, em caso de solues diludas pode demorar um pouco a aparecer.


A sensibilidade pode ser aumentada adicionando I gota de cloreto de brio a 10%. O
cloreto de brio separa-se imediatamente e adsorve o azul da Prssia que, depois de
alguns minutos, aparece no fundo do tubo sob a forma dum precipitado branco
azulado.
5.3. Teste com acetato de cobre-acetato de benzidina

Fundamento
Os sais de cobre reagem com a benzidina, em presena de cianetos e halogenetos,
para dar azul de benzidina.
A reaco tem lugar porque o potencial de oxidao dos ies de cobre II aumenta
quando os ies de cobre I resultantes so gastos na formao do cianeto cuproso
insolvel.
Consequentemente, fazendo actuar o cido ciandrico sobre uma soluo de acetato
de cobre - acetato de benzidina, h desenvolvimento instantneo de cor azul.

Tcnica
1- Misturar I gota de soluo em ensaio com I gota de reagente (sol. de acetato de cobre/
acetato de benzidina ) numa placa de reaco.

H formao instantnea de cor azul.


5.4. Teste com iodo
Fundamento
O cido ciandrico combina-se com o iodo para formar o iodeto de cianognio,
incolor:
HCN + I2

-------->

HI + CNI

Consequentemente, quando o cido se liberta dos cianetos e actua sobre o papel de


amido iodetado, azul, a cor desaparece.

Tcnica
1- Deitar I gota de soluo em ensaio numa tira de papel de amido iodetado (mergulhar
as tiras de papel de amido numa soluo de iodo N/100).

A cor azul do papel desaparece.

6 - Dosagem do cido ciandrico no destilado


6.1. Mtodo ciano-argentimtrico de Denigs
Fundamento
Ao juntar AgNO3 a uma soluo aquosa de cianeto, forma-se quantitativamente o
complexo argentocinico:
2 CN- + Ag+

--------> Ag(CN)2-

que solvel em amnia com formao de argentocianato de amnio.


2 CN- + NH4+ + Ag+

-------> Ag(CN)2NH4

Por sua vez, o iodeto de prata precipita em meio amoniacal. O ponto termo ento
dado pela turvao devida formao duma nuvem opalescente branco azulada de
iodeto de prata:

AgNO3 + KI

--------> AgI + KNO3

Tcnica
1 - Tomar 25 ml de destilado para o balo Erlenmeyer.
2 - Juntar 2 ml de amnia conc. e 1 ml de sol. de iodeto de potssio a 10%.
3 - Titular com soluo de nitrato de prata N/200, at aparecimento duma turvao
permanente.
Para se obterem bons resultados, a soluo titulante deve ser adicionada
cuidadosamente prximo do ponto termo. Este mais evidente quando a titulao
realizada na semi-obscuridade fazendo-se passar um feixe de luz horizontalmente
atravs da soluo, ou, mais simplesmente, realizando a titulao sobre fundo escuro.

Clculos:
1000 ml AgNO3 N --------------- 2 x 27 = 54 g HCN
1 ml AgNO3 N/200 -------------- 0,00027 g HCN
n ml AgNO3 N/200 -------------- n x 0,00027 g HCN
n x 0,00027 g HCN ----------------- 25 ml
X g HCN -------------------------- 200 ml
Partimos de 4 g de farinha para a destilao e recolhemos 200ml de destilado.
Os resultados devem vir em g de HCN / 100 g de produto.
Nota: As farinhas no devem libertar mais do que 0,01g de HCN por 100g de
farinha.
6.2. Mtodo de Aldridge
Fundamento
um mtodo de dosagem do cido ciandrico muito sensvel, que se baseia na
reaco de Koenig, e aplicvel a material biolgico (urina, saliva, sangue, plasma ou
soro).
O cianeto convertido a brometo de cianognio pela gua de bromo.
A piridina, em meio alcalino, forma com o brometo de cianognio um sal de
piridnio. A adio a este derivado duma amina aromtica primria abre o ciclo

piridnico entre o azoto e o carbono

com formao dum derivado do aldedo

glutacnico intensamente corado.


As reaces que se seguem traduzem o fundamento:

A natureza e a sensibilidade da cor esto na dependncia da amina aromtica posta


em jogo, sendo a amina mais prtica a benzidina que permite a obteno duma cor
alaranjada.

Tcnica
1- A 6ml do destilado (ou duma diluio na soda 0,1N), juntar sucessivamente:
- 0,5 ml de cido actico conc.
-2 ml de gua de bromo saturada (preparada recentemente)
2- Deixar em banho-maria gelado durante 10 minutos
3- Juntar, agitando:
- 2,5 ml de soluo de arsenito de sdio (3g de meta-arsenito de sdio em 100ml de
NaOH N/5)

- 4 ml de soluo de piridina-benzidina [18ml de piridina em 12ml de gua destilada,


3ml de cido clordrico conc., 10ml de sol. de benzidina (0,560g de cloridrato de benzidina em
50ml de HCl N/2)]

- 5 ml de etanol a 95

4- Deixar desenvolver a cor durante 30 minutos na obscuridade e ler a sua


intensidade de cor no espectrofotmetro a

510 nm, em relao a um testemunho

preparado nas mesmas condies.


5- Comparar os resultados obtidos com uma curva de calibrao previamente
traada.
6-.Este mtodo muito sensvel e a curva de calibrao realizada com quantidades
de cido ciandrico entre 0 e 6 g (para a preparao da curva-padro, partir de uma soluo
contendo 1 g HCN / 1ml de gua).

Nota
Na ausncia de tiocianatos (que reagem de modo semelhante) pode o processo
realizar-se na urina e saliva sem tratamento preliminar, ou no sangue, plasma e soro
depois de desproteinizado pelo cido tricloroactico (1ml de sangue tratado com 2ml de
cido tricloroactico a 5%). Uma vez que o cido tiocinico no voltil mais seguro

separar o cido ciandrico por destilao.

LCOOL METLICO

1 - Introduo
A pesquisa toxicolgica do lcool metlico pode efectuar-se no sangue, tecidos
(essencialmente fgado e intestinos), contedo estomacal, vinhos, aguardentes e
outros lquidos suspeitos, ar, etc.
A amostra a analisar acidulada com cido tartrico e gua destilada para a tornar
fluida, destilando-se em seguida.

2 - Ensaios de pesquisa
2.1. Tcnica de Denigs
Fundamento
O lcool metlico reduz muito rapidamente a soluo de permanganato de potssio a
1:1000 em meio cido, oxidando-se a aldedo frmico (o lcool etlico oxida-se
muito lentamente):
2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- -------->

Mn2+ + 4 H2O)
5 (CH3OH --------> HCHO + 2 H+ + 2 e-)
.

2 MnO4- + 16 H+ + 5 CH3OH --------> 2 Mn2+ + 8 H2O + 5 HCHO + 10 H+


O aldedo frmico produzido caracterizado pelo reagente de Schiff (fucsina
bissulfitada) ao qual restitui a cor violeta. O excesso de MnO4- que fica na soluo
reduzido pelo cido oxlico em meio sulfrico:

2 (MnO4- + 8 H+ + 5 e- ----------> Mn2+ + 4 H2O )


5 (C2O42- ----------> 2 CO2 + 2 e- )
.

2 MnO4- + 5 C2O42- + 16 H+

----------> 2 Mn2+ + 10 CO2 + 8 H2O

Tcnica
1- Num tubo de ensaio deitar 2,5 ml do destilado e adicionar 0,5 ml da mistura
oxidante (KMnO4 3g; H3PO4 85% 15 ml; gua destilada qbp 100 ml).
2- Aps 10 minutos temperatura ambiente, descorar com 1,5 ml de soluo de
cido oxlico a 5% em cido sulfrico a 50%.
3- Juntar 2,5 ml de reagente de Schiff ( fucsina bsica 0,2 g em 120 ml de gua destilada
quente; arrefecer e juntar sulfito de sdio anidro 2 g dissolvido em 20 ml de gua destilada; por fim 2
ml de HCl concentrado) e esperar 10 minutos. A formao da cor violeta dentro de 10

minutos indica a presena de lcool metlico.


Notas e causas de erro:
Deve tratar-se uma amostra do destilado com reagente de Schiff sem prvia
oxidao, para excluir a presena de aldedo frmico no original.
Devem fazer-se outros testes do aldedo frmico para confirmao.
Quando o teste realizado num destilado dum crebro fresco, uma reaco positiva
pode ser interpretada com segurana como sendo uma reaco positiva ao metanol.
A reaco positiva para qualquer aldedo mas s durvel para o aldedo frmico.
A existncia de lcool etlico reduz a sensibilidade da tcnica de Denigs e o lquido
submetido a este mtodo no deve conter mais de 5% de lcool etlico. Se contiver
uma quantidade excessiva de lcool etlico, deve diluir-se a soluo, ou trabalhar
com testemunhos constitudos por misturas tituladas de lcool etlico e metlico.

3 - Dosagem
3.1. Mtodo colorimtrico
Fundamento
O lcool em presena da soluo de permanganato de potssio em meio cido, sofre
uma oxidao a aldedo frmico.
O bissulfito de sdio tem uma aco anloga indicada para o cido oxlico na
pesquisa.
O cido cromotrpico em soluo cida concentrada liga-se ao aldedo originando
um composto de cor prpura, com uma absoro ptima no comprimento de onda de
570 nm. O cido estvel em meio sulfrico.

Tcnica
Oxidao a formaldedo
1- Em balo aferido de 10 ml mergulhado em banho de gelo, introduzir
sucessivamente 2 ml de destilado, 0,5 ml de cido fosfrico a 85% e 0,05 ml de
soluo aquosa de KMnO4 a 5%.
2- Deixar no banho de gelo durante 5 minutos, agitando ocasionalmente.
3- Descorar por adio de quantidade suficiente de soluo saturada de bissulfito de
sdio (HSO3Na) evitando qualquer excesso de reagente, o que poderia provocar uma
opalescncia ou um enfraquecimento da cor.
Dosagem espectrofotomtrica do aldedo frmico
4- Juntar por pequenas pores de 1 ml, arrefecendo depois de cada adio, 5 ml de
reagente cromotrpico (cido cromotrpico 5g/100ml em gua destilada. Na altura do emprego,
diluir 4 ml desta soluo com cido sulfrico 15 M, ou seja a 80% em volume at perfazer 100 ml).

5- Levar a banho-maria fervente durante 30 minutos.


Desenvolve-se uma cor violeta estvel durante vrias horas e cuja intensidade
proporcional concentrao de aldedo frmico.
6- Arrefecer sob uma corrente de gua.
7- Completar os 10 ml com uma soluo de H2SO4 9M (ou seja a 48% em volume) e
determinar a sua intensidade de cor no espectrofotmetro a

570 nm.

Nota
Para a curva de calibrao usar metanol puro isento de acetona, purificado por
destilao sobre xido de clcio, rejeitar o primeiro 1/3 do destilado recolhendo as
fraces de 64,5 - 65 C.

Interpretao dos resultados


A dose txica varia com a susceptibilidade individual, mas devem considerar-se
extremamente perigosos para a vida, nveis superiores a 80 mg / 100 ml de sangue.
Valores superiores a 2,5 mg /100 ml j revelam metilismo.

Vantagens e causas de erro


Esta tcnica especfica do metanol em presena dos seus homlogos superiores.
perfeitamente aplicvel dosagem de pequenas quantidades de metanol em presena
de quantidades relativamente elevadas de lcool etlico.
Se j existir aldedo frmico no lquido a pesquisar comete-se um erro por excesso
(causa muito rara). Pode, no entanto, entrar-se com esse valor no clculo final, pelo
que conveniente pesquisar o aldedo frmico pr-existente (a omisso do passo da
oxidao torna o mtodo aplicvel ao formaldedo). Se houver uma oxidao
enrgica o lcool metlico passa a cido frmico, o que originaria um erro por
defeito.

FLOR
1 - Pesquisa de flor e fluoretos na gua

1.1. Com o reagente de BOER


Fundamento
Ao fazer a juno, em volumes iguais, das solues A (sol. aquosa de vermelho de
alizarina S [sulfo-alizarinato de sdio] a 0,17 %) e B (sol. aquosa de cloreto de zircnio a 0,81 %
[ou oxicloreto de zircnio a 0,9315 %]), que constituem o reagente de Ber, forma-se uma
laca vermelho-violeta (complexo de alizarina-zircnio) cuja formao envolve a
ligao, por adsoro qumica, da alizarina superfcie das partculas do sal de
zircnio.
Acontece que o flor e os fluoretos em soluo cida tm mais afinidade para o
zircnio do que a alizarina pelo que a deslocam da laca, formando com o zircnio o
anio complexo fluorado, incolor (ZrF6)2-.
A alizarina livre, em meio cido, tem cor amarela, e assim, a observao desta cor na
soluo indica a presena de flor ou fluoretos.
Tcnica
1- Misturar num tubo de ensaio, alguns mililitros de gua em anlise com HCl
concentrado.
2- Adicionar II a III gotas de reagente de Ber.
3- A formao de uma colorao amarela, indica a presena de flor ou fluoretos.
Nota
Estas reaces podem efectuar-se em papel:
a) Impregnar uma tira de papel de filtro com soluo de alizarina-zircnio. Secar.
b) Colocar no papel uma gota de cido actico a 5% e uma gota da gua em
anlise.
c) A cor vira para amarelo se existirem fluoretos. Se a quantidade de fluoretos for
muito pequena,
recomenda-se activar a reaco, aquecendo o papel no vapor de gua.

1.2. Reaco com a slica


Fundamento
A evaporao secura, da gua em anlise, tem por fim concentrar o flor.
O sulfato de prata que se junta ao resduo elimina possveis cloretos existentes na
gua que precipitam sob a forma de AgCl.
O vidro, que constitudo por slica, e o flor originam fluoreto de silcio (SiF4),
voltil que vai atingir a gota de acetato de brio colocada no vidro de relgio.
O fluoreto de silcio, em contacto com a soluo aquosa de brio, d origem a cido
fluossilcico e a um precipitado de hidrxido de silcio que se dispe em anel volta
da gota.
3 SiF4 + 4 H2O ----------> Si(OH)4 + 2 H2SiF6.
Por sua vez, o cido fluossilcico reage com o acetato de brio, originando cristais
incolores de fluossilicato de brio, que podem observar-se ao microscpio.
2 CH3COO- + Ba2+ + H2SiF6

---------->

BaSiF6 + 2 CH3COOH.

Tcnica
1- Em cadinho de porcelana deitar 10-20 ml de gua em anlise e evaporar secura
em bico de Bunsen.
2- Juntar ao resduo um cristal de sulfato de prata e algum vidro pulverizado.
Misturar.
3- Adicionar um pouco de HCl concentrado.
4- Tapar com vidro de relgio, no qual se coloca previamente pela parte inferior, I
gota de soluo de acetato de brio 10%.
5- A presena de flor ou fluoretos revela-se por um anel de slica e na parte central,
cristais incolores de fluossilicato de brio visveis ao microscpio.

2 - Dosagem de flor e fluoretos na gua


2.1. Mtodo Espectrofotomtrico
Fundamento
Formao do complexo flor-zircnio e libertao de alizarina, como j foi descrito
no mtodo de pesquisa com o reagente de Ber.
Tcnica
1- Numa srie de 6 tubos de ensaio proceder de acordo com a tabela seguinte.
2- A soluo me de NaF deve conter 0,1 mg flor / ml, (dissolver 0,221 g de fluoreto de
sdio em gua e completar o volume para um litro).

SoluoMe

guaemanlise

HClconc.

Reag.deBOER

guadestilada

Tubo 1

2ml

1ml

1ml

11ml

Tubo 2

4ml

1ml

1ml

9ml

Tubo 3

6ml

1ml

1ml

7ml

Tubo 4

8ml

1ml

1ml

5ml

Tubo 5

10ml

1ml

1ml

3ml

1ml

1ml

3ml

10ml

Tubo 6

3- Agitar bem os tubos. Esperar 5 minutos e ler no espectrofotmetro U:V.,


Spectronic 20, a

525nm.

Referir os resultados em mg de flor por litro de gua

TESTE DE REINSCH

Permite a deteco de uma forma rpida e fcil, ainda que no definitiva, de certos
metais, como o arsnio, mercrio, bismuto e antimnio (As, Hg, Bi, Sb), por
deposio do metal superfcie de uma espiral de cobre, em solues fortemente
cidas. A grande vantagem de que os metais podem assim ser separados dos fluidos
e dos tecidos sem prvia destruio da matria orgnica.
Nota
a) - As espirais de cobre devem estar limpas e brilhantes ( limpar com HCl ou HNO3
diludo 1:1).

b) - Este teste tambm pode aplicar-se a rgos finamente divididos, tais como o
fgado, rim, etc., sem prvia destruio da matria orgnica.
c) - A deposio de bismuto um pouco mais demorada.
d) - O As e o Hg podem encontrar-se por muitos dias na urina. Em exposies
crnicas, possvel encontr-los vrias semanas depois.
e) - Se o fio de cobre permanecer inalterado, pode concluir-se da ausncia de As, Sb,
Hg e Bi ou da sua presena em pequena quantidade.
f) - O aspecto do fio de cobre no pode aceitar-se como definitivo, mas to s como
ponto de partida para mtodos de confirmao especficos.
Tcnica
1 - Num Erlenmeyer (ou num tubo de ensaio) contendo 20 ml de urina (ou contedo
gstrico, alimento, etc.), juntar 3 ml de HCl conc. (fazer paralelamente um ensaio em
branco com urina normal).
2 - Introduzir uma pequena espiral de cobre bem limpa e brilhante.
3 - Colocar em banho-maria fervente, durante cerca de uma hora. Evitar que entre em
ebulio para prevenir a evaporao. Se necessrio, o volume pode ser mantido com
HCl 10%.
4 - Interpretao dos resultados.
Metal

Aspecto do fio de cobre

Sensibilidade do
teste (aprox.)

Sensibilidade

Arsnio
Mercrio

Preto
Prateado-brilhante

0,010 mg %
0,075 mg %

0,5 g/ml
2,5 g/ml

Bismuto
Antimnio

Preto-acinzentado
Preto-prpura brilhante

0,030 mg %
0,030 mg %

1,0 g/ml
1,0 g/ml

Os resultados sero referidos como presena fraca, moderada, intensa ou negativo.

Confirmao dos resultados:


a) Mercrio (prateado brilhante)
Teste de Gettler: - Num vidro de relgio colocar uma rodela de papel de filtro,
depositar II gotas de iodeto cuproso e deixar a espiral de cobre com o depsito sobre
a mancha esperando entre 1 a 12 horas. Forma-se o iodeto mercrico cuproso de cor
salmo.
2 Cu2I2 + Hg2+ ----------> Cu2(HgI4) + Cu22+
b) Arsnio (preto)
Num tubo de ensaio colocar a espiral de cobre escurecida e X a XV gotas de KCN
10%. O depsito escuro dissolve-se aps alguns minutos se o arsnio estiver
presente.
Esta soluo ciandrica contm tambm (se estiverem presentes na amostra) selnio e
telrio.
O depsito de Hg, Bi e Sb no se dissolve.
O teste de Gutzeit, praticado na soluo depois de acidificada com cido sulfrico
10%, confirmar a presena de As.
c) Bismuto (preto acinzentado)
Coloque a espiral de cobre com o depsito preto num tubo de ensaio, II gotas de
soluo de NaHSO3 10% , X gotas de HNO3 15%. O depsito negro dissolve-se
aps 5 minutos se o bismuto estiver presente.
Os depsitos de Sb ou As no se dissolvem.
Retire a espiral adicione 1ml de reagente quinina - KI e agite.
Um precipitado laranja mais ou menos intenso indica a presena do bismuto.
A reaco especfica para o bismuto.
d) Antimnio (Preto-prpura brilhante)
Completamente diferente de a) e no reactivo a b) e c).

ARSNIO
O arsnio pode existir normalmente no solo e nos alimentos. Os seus derivados
existem na indstria, nas artes e na fitofarmcia.
As intoxicaes agudas podem ser causadas pela utilizao de arsnio com fins
criminosos, da tentativa de suicdio e de acidentes diversos: alimentos (vinhos
arsenicais, cervejas e alimentos inquinados); origem teraputica e outras
(conservao de peles e animais embalsamados, luta contra parasitas agrcolas e
calcinao industrial de minrios arsenferos).
Na pesquisa e no doseamento de arsnio nos meios biolgicos, podem existir erros
por defeito (volatilizao) e por excesso devido introduo de As pelos reagentes e
pela presena de antimnio (d testes positivos). Na interpretao dos resultados das
anlises deve considerar-se o arsnio normal, o arsnio impureza de substncias
alimentares, o arsnio medicamentoso e o arsnio no solo.

1 - Pesquisa de arsnio na urina


1.1. Teste de BETTENDORF
Fundamento
Os compostos de arsnio trivalentes e pentavalentes so reduzidos a arsnio
elementar pelas solues de cloreto estanhoso fortemente acidificadas com cido
clordrico.
O arsnio separa-se sob a forma dum precipitado preto-acastanhado.
2 As5+ + 5 Sn2+

----------> 2 As + 5 Sn4+

2 As3+ + 3 Sn2+

----------> 2 As + 3 Sn4+

A reduo acelerada pelo aquecimento. S ocorre em soluo fortemente cida uma


vez que apenas os caties de arsnio reagem com o cloreto estanhoso.
Em solues fracamente cidas os caties no esto presentes devido reaco de
hidrlise:
As3+ + 3 H2O ----------> AsO33- + 6 H+

O tratamento com cloreto de magnsio em meio alcalino (amnia concentrada)


transforma o arsnio em Mg2As2O7 (piro-arsenato de magnsio), resistente ao calor,
pelo que pode ento preceder-se a um aquecimento intenso para nos libertarmos dos
sais de mercrio, volteis, no interferindo na reaco (nas condies do ensaio eles
tambm se reduzem ao estado metlico). O teste de Bettendorf bastante especfico
para o arsnio.
Tcnica
1 - Misturar num pequeno cadinho de porcelana 1ml de soluo em ensaio com I-II
gotas de amnia concentrada, I gota de perxido de hidrognio a 10% e I gota de
soluo de cloreto de magnsio a 10%.
2 - Evaporar a mistura lentamente e depois aquecer fortemente.
3 - Misturar o resduo com I-II gotas de soluo concentrada de cloreto estanhoso em
cido clordrico conc. e aquecer suavemente.
A formao de um precipitado ou de uma colorao preto-acastanhado indica a
presena de arsnio.
1.2. Teste de GUTZEIT
Fundamento
Por reaco de cido sulfrico diludo sobre o zinco, h libertao de hidrognio
nascente que, actuando sobre o AsO43- (composto oxigenado de arsnio), ou sobre o
arsnio noutros estados de oxidao, o reduz a arsina, que se desprende com o
excesso de hidrognio:
As O5 + 16 H+

----------> As H3 + 5 H2O

H3AsO4 + 4 H2

----------> AsH3 + 4 H2O

A arsina, em contacto com nitrato de prata, d um composto de substituio de cor


amarela que, em contacto com a gua, se torna imediatamente negra por formao de
prata metlica:
AsH3 +6 AgNO3

----------> (Ag3As) (AgNO3)3 + 3 HNO3

(Ag3As). (AgNO3)3 + 2 H2O ----------> HAsO2 + 3 HNO3 + 6 Ag

Tcnica
1 - Num matraz de 100 ml deitar 3ml de soluo em ensaio. Misturar com alguns
gros de zinco e cido sulfrico diludo. (Praticar paralelamente um ensaio em
branco s com os reagentes).
2 - Colocar um tampo de algodo no colo do matraz e suspender uma tira de papel
de filtro embebida em soluo de nitrato de prata a 20%.
Na presena de arsnio, forma-se uma mancha negra.

2 - Dosagem do arsnio em material biolgico


2.1. Mtodo de GUTZEIT
- Aparelho de Gutzeit

Cilindro
de
disperso com
vidro poroso
L de vidro

Balo de
Digesto e
Gerador

Fundamento
O princpio em que se baseia esta tcnica, o da reaco da arsina proveniente dos
compostos oxigenados do arsnio com molibdato de amnio em condies
convenientes, e posteriormente reduzido pelo sulfato de hidrazina, com formao
dum complexo de molibdnio, fortemente corado de azul.

Tcnica
A) DIGESTO - mineralizao
O balo do aparelho de Gutzeit pode servir como balo de digesto
1 - Colocar 5-10 ml de sangue, 25 ml de urina ou 5-10 g de tecido, no balo.
2 - Juntar 10 ml de cido ntrico concentrado, 4 ml de cido sulfrico concentrado e 5
ml de cido perclrico 60-70%.
3 - Colocar a mistura da digesto em banho de vapor por vrias horas at que se torne
homognea, transferir para uma placa de aquecimento e aquecer um pouco mais
fortemente at que se libertem fumos de cido perclrico (destruio da matria
orgnica).
4 - Se a mistura comear a ficar castanha, retire-a da placa de aquecimento, arrefeaa e junte 5-10 ml de cido ntrico e 1-2 ml de cido perclrico. Continuar a aquecer
at que a mistura fique clara e ento aquecer fortemente at libertao de fumos de
SO3. Arrefecer.
5 - Juntar 20 ml de gua e 0,1 g de NaHSO3.
6 - Aquecer no banho de vapor por 10 minutos e transferir depois a mistura para a
placa quente aquecendo uma vez mais at libertao de fumos de SO3. A mistura, se
estiver clara e transparente, est pronta para a libertao de arsina depois de
arrefecida.
B) DESTILAO E DOSAGEM DO ARSNIO
Mtodo colorimtrico
1 - Adicionar 1 ml de soluo de SnCl2 40%, e 40 ml de gua
2 - Juntar 2 ml de KI a 15% mistura, deixar ficar 15 minutos antes de introduzir 5 g
de grenalha de zinco activado com Cu SO4 e adaptar o cilindro de disperso do gs.
3 - Deixar borbulhar a arsina libertada por 1 hora atravs de 5 ml de soluo de iodo
0,001 N num tubo de ensaio introduzido em banho de gelo.
4 - Ao fim de 1 hora retirar o tubo com a mistura de iodo.
5 - Juntar 0,5 ml de soluo de molibdato de amnio (a 1% em H2SO4 5N) e 0,2 ml de
soluo de sulfato de hidrazina a15%. Misturar bem depois de cada adio

6 - Colocar a mistura num banho de gua fervente por 10 minutos, arrefecer e ler a
cor azul a 865 nm contra um branco de gua. A cor azul estvel por 24 horas. A
quantidade de arsnio na amostra determinada a partir duma curva previamente
calibrada de arsnio, preparada do mesmo modo.
Interpretao dos resultados
Concentraes aproximadas de Arsnio nos tecidos, expressas em mg/100 g,
segundo vrios autores
Fgado

Adulto saudvel
normal
Tratado com arsenicais

0,001- 0,01

Rim
0,001- 0,01

--

--

Tratado com arsenicais


orgnicos

0,1

0,02

Envenenamento arsenical
agudo

1 - 50

0,5 - 15

Sangue

Crebro

0 - 0,0030

Urina
0,001

Cabelo
0,020-0,067

0,01 -0,025

--

0,030

--

0,1

--

--

--

inorgnicos

0,1 - 1,5

0,05 - 2,0

0,008 - 0,5

CROMATOGRAFIA
1 Generalidades
2 - Anlise
2 1- Anlise Qualitativa
A identificao de uma amostra por cromatografia GL ou HPLC baseia-se no facto
de, sob idnticas condies de trabalho, os valores de reteno de uma dada
substncia manterem-se constantes.
O tempo de reteno de cada um dos componentes, ou seja, o tempo que decorre
desde a injeco da amostra e a sada da concentrao mxima do composto, uma
constante fsica para determinado componente em condies bem definidas. Este
tempo, que depende exclusivamente do coeficiente de partilha entre a fase mvel e a
fase estacionria, pode ser modificado por alterao de certos parmetros consoante
o tipo de cromatografia GL ou HPLC.
Para que a identificao possa ser possvel, os padres devem ser analisados nas
mesmas condies da amostra. Deve, no entanto, notar-se que uma simples anlise
de cromatografia no identifica completamente uma determinada amostra, uma vez
que existe uma possibilidade real de substncias diferentes apresentarem
comportamento cromatogrfico idntico para um dado sistema, sobretudo quando a
origem e composio da amostra so desconhecidas. Informao mais positiva
obtida pela repetio da anlise (amostra e padro), em outra coluna de polaridade
diferente da primeira, (ou fazendo variar qualquer outro parmetro que influencie o
tempo de reteno), uma vez que bem mais raro o fenmeno de duas substncias se
comportarem identicamente em condies diferentes. Porm a identificao
definitiva e inequvoca de determinada substncia s ser possvel usando um
conjunto de mtodos analticos, como por exemplo, outros mtodos cromatogrficos,
mtodos espectrofotomtricos de I.V., R.M.N. ou pelo acoplamento da cromatografia
a outras tcnicas, como por ex. , espectrometria de massa GC-MS, LC-MS, a
espectroscopia de radiao infravermelha GC-FTIR, LC-FTIR entre outras.

2.2 - Anlise quantitativa


Aps optimizar as condies de anlise, ter identificado os constituintes da amostra,
procede-se quantificao de um ou de todos os seus componentes, por um dos
seguintes mtodos:
A - Mtodo da normalizao de reas: A rea de cada pico calculada e directamente
traduzida em percentagem da soma das reas de todos os picos. Mtodo simples,
rpido e independente do tamanho da amostra. Mas no tomada em considerao a
resposta especfica do detector a cada uma das substncias. um mtodo
aproximativo.
B - Mtodo da normalizao de reas corrigidas. Os valores obtidos so de boa
reprodutibilidade. Mas exige a avaliao e correco das reas de todos os picos do
cromatograma. Pressupe a eluio e deteco de todos os componentes.
C - Mtodo do padro interno: A substncia padro adicionada amostra em
anlise. Esta substncia deve ser inerte, miscvel com a amostra, originar um nico
pico e ter um tempo de reteno diferente do(s) da amostra mas bem separado. Este
mtodo tem a vantagem de poder ser usado quando a natureza da amostra a analisar
desconhecida, podendo no serem eludos ou detectados todos os seus componentes.
No to vulnervel ao tamanho da amostra e estabilidade das condies de anlise.
A desvantagem prende-se com o facto da quantidade de padro adicionado
influenciar os resultados.
D - Mtodo do padro externo: Preparam-se e analisam-se quantidades conhecidas de
padres e calcula-se a resposta absoluta do detector para cada padro com base na
relao entre a rea e a concentrao, referente a cada um. Como vantagem deste
mtodo destaca-se o facto de apenas se considerarem a eluio e deteco dos
compostos que interessam. No entanto, tem que se controlar com grande exactido,
quer o tamanho, quer a concentrao da amostra injectada.

3 - Validao de Mtodos Cromatogrficos


A validao de um mtodo analtico o processo que, baseado em estudos de
laboratrio, permite garantir a qualidade dos resultados obtidos por esse mtodo. O
protocolo composto geralmente por 3 passos: (Ver ANEXO 1)
A - Aferio de instrumentos e calibrao do equipamento.

B - Padronizao analtica (linearidade, especificidade, limite de deteco, limite de


quantificao, exactido, preciso, recuperao, estabilidade).
C - Controlo de qualidade.

4 - Anlise de lcoois por Cromatografia Gs-Lquido (GC)


5 - Anlise de pesticidas por Cromatografia Lquida de Alta Presso
(HPLC)

DETERMINAO DE LCOOIS POR CROMATOGRAFIA


GASOSA

INTRODUO

O diagnstico e tratamento de envenenamentos acidentais ou intencionais, aps ingesto


de metanol, isopropanol, etanol ou etilenoglicol requerem mtodos de anlise rpidos e
sensveis.
Existem na literatura numerosos mtodos para a determinao de etanol em amostras
biolgicas, desde qumicos, enzimticos, cromatogrficos, assim como os de deteco
electroqumica (utilizados nos aparelhos para deteco da taxa de alcoolmia em
condutores de veculos).
A cromatografia gasosa a mais utilizada e considerada como o mtodo de referncia.
A injeco directa e de fase de vapor (head-space) so as tcnicas mais comuns na
determinao de compostos volteis, sendo a de fase vapor a de maior preciso e
exactido.
A cromatografia gasosa igualmente uma tcnica bastante utilizada na determinao do
teor alcolico de bebidas alcolicas e na verificao de contaminaes ou fraudes.
Duma maneira geral, as metodologias utilizadas para a sua determinao requerem a
escolha da amostra, a sua colheita e armazenamento adequado bem como a melhor
metodologia analtica.

MATERIAL E MTODOS
Equipamento
Cromatgrafo gasoso Varian
Detector de ionizao de chama (FID)
Integrador/ registador Spectra Physics
Coluna de empacotamento com enchimento Porapack Q 150-200 mesh
Seringa Hamilton de 10 L

Reagentes
Etanol, metanol, isopropanol, acetaldedo, acetona e n-propanol Merck

Padres:
Soluo aquosa de etanol - 0,1 mL/100 mL
Soluo aquosa de isopropanol - 0,125 mL/100 mL
Soluo aquosa de metanol - 0,125 mL/100 mL
Condies cromatogrficas
Coluna analtica Porapack Q 150-200 mesh
Temperatura do injector (manual) 210C
Temperatura do forno 158C/ temperatura constante ou isotrmica
Temperatura do detector 220C
Gs transportador Azoto com um fluxo de 30 mL/min
Fluxo para os gases do detector foi de 300 mL/min para o ar e 30 mL/min para o
hidrognio
Procedimento
1- Injectar 2 L de cada um dos padres
2- Injectar 2 L da amostra
3- Analisar os tempos de reteno para identificao dos componentes da amostra
4- Escolher o melhor processo de quantificao (Mtodo do padro interno e/ou
mtodo do padro externo)
5- Programar o integrador para o mtodo escolhido
6- Injectar novamente padres e amostra
Validao
Linearidade Curva de calibrao determinada com solues aquosas de etanol
num intervalo de concentraes de 0,08 a 1,0 g /L, utilizando a
relao rea de pico/concentrao
Especificidade, recuperao, exactido e preciso
Limite de deteco, limite de quantificao e estabilidade

RESULTADOS/CONCLUSO

Identificao do etanol existentes na amostra a partir dos cromatogramas obtidos.


Determinao da quantidade de etanol na amostra pelos diferentes mtodos de
quantificao.

DETERMINAO DE ALDRINA, ENDRINA E DDT POR HPLCUV NUMA AMOSTRA DE GUA

INTRODUO

Os pesticidas organoclorados so insecticidas que foram usados extensivamente na


dcada de 50/60 contra os parasitas que atacavam sobretudo as culturas. Dividem-se em
trs grupos: ismeros do hexaclorobenzeno (e.g. lindano), ciclodienos (endrina,
dieldrina, aldrina, endosulfo,...) e o DDT e anlogos. Destacam-se as principais
propriedades que caracterizam este grupo de compostos: baixa volatilidade, estabilidade
qumica, biotransformao e degradao ambiental lentas, baixa solubilidade na gua e
a elevada solubilidade em solventes orgnicos e lpidos. Existem pois vrias razes para
a sua bioacumulao nos sistemas biolgicos e persistncia no meio ambiente.
A determinao deste tipo de compostos seja em guas, solos, alimentos ou em fluidos
biolgicos continuam a justificar a grande preocupao que os POP (Persistent Organics
Pollutants) actualmente apresentam. Duma maneira geral, as metodologias utilizadas
para a sua determinao requerem numa primeira fase a preparao da amostra seguida
da aplicao de processos cromatogrficos (LC, GC) com deteco de UV, MS, DAD....

MATERIAL E MTODOS
Equipamento
Sistema de filtrao de solventes por vcuo Millipore com membrana de 0,45m
Banho de ultra-sons
Cromatgrafo Gilson equipado com injector Rheodyne e loop de 10 L
Detector Gilson de UV
Integrador/ registador Spectra Physics
Seringa Hamilton de 10 L
Coluna cromatogrfica de fase reversa Varian MCH10, 30x4 mm e 10 m de
tamanho de partcula, precedida de um pr-filtro metlico

Reagentes
Acetonitrilo, Lichrosolv, Merck
Metanol, Lichrosolv, Merck
gua Milli-Q, Resistividade 18 M cm

Padres:
Soluo trabalho do Padro DDT- 0,02 mg/mL
Soluo trabalho do Padro Aldrina- 0,02 mg/mL
Soluo trabalho do Padro Endrina- 0,01 mg/mL

Preparao da amostra
Partindo de 500 mL de gua de um rio, na proximidade de um campo de cultivo da
regio centro, procedeu-se concentrao dos pesticidas utilizando SPE (coluna SepPak C18) com vcuo. O DDT ficou retido na coluna e foi eludo com 1 mL de metanol.
O factor de enriquecimento da amostra foi de 500.

Condies cromatogrficas
Uso de uma coluna de fase reversa C18 para separar, identificar e quantificar
pesticidas
Uma eluio isocrtica/ Temperatura ambiente
A fase mvel escolhida para a eluio destes pesticidas foi uma mistura de metanol:
acetonitrilo: gua (73:10:17 v/v), previamente filtrada e desgaseificada.
O fluxo utilizado durante a anlise cromatogrfica foi de 1,3 mL/min
Deteco com UV/VIS a 224 nm com uma sensibilidade de 0.05 AUFS
Procedimento
1- Injectar 10 L de cada um dos padres
2- Injectar 10 L da amostra
3- Analisar os tempos de reteno para identificao dos componentes da amostra

4- Escolher o melhor processo de quantificao (Mtodo do padro interno e/ou


mtodo do padro externo)
5- Programar o integrador para o mtodo escolhido
6- Injectar novamente padres e amostra

Validao
Linearidade Curva de calibrao com concentraes de DDT entre 0,01 e 0,2
mg/L, utilizando a relao altura de pico/concentrao
Especificidade, recuperao, exactido e preciso
Limite de deteco, limite de quantificao e estabilidade

RESULTADOS/CONCLUSO

Identificao dos pesticidas existentes na amostra a partir dos cromatogramas


obtidos.
Determinao da quantidade de pesticida na amostra pelos diferentes mtodos de
quantificao.

BIBLIOGRAFIA
CASSARETT E DOULL,S

Toxicologia Cincia Bsica dos Txicos


MacGraw-Hill de Portugal
5 edio. 2001
ERVIN JUNGREIS

"Spot Test Analysis"


Clinical, Environmental, Forensic, and Geochemical Aplications
John Wiley & Sons, Inc. - USA
2 ed. - 1997
H. J. CHAVES das NEVES; A. M. COSTA FREITAS

"Introduo Cromatografia Gs - Lquido de Alta Resoluo"


Dias de Sousa Lda - Portugal
1996
CHAMBERLAIN, JOSEPH

"Analysis of Drugs in Biological Fluids"


C. R. C. Press, Inc. - USA
1985
SUNSHINE, IRVING

"Methodology for Analytical Toxicology"


Vol. I, II, e III
C. R. C. Press,.Inc. - USA
1985
BASELT, RANDALL C.

"Analytical Procedures for Therapeutic Drug Monitoring and Emergency


Toxicology"
Biomedical Publications - USA
1980
H. J. CHAVES das NEVES

"Introduo Prtica da Cromatografia Gs - Lquido"


Universidade Nova de Lisboa, F.C.T.L. - Portugal
1980