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Pelotas, 2008.
Alimentos
da
Universidade
Pelotas, 2008.
Agradecimentos
colaborao de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andria
Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientao,
confiana e oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
Profa. Dra. Miriam Galvo e Dra. Caroline Borges, pela orientao e
conhecimentos transmitidos.
s orientadoras da referente disciplina, Prof a. Dra. Carla Mendona e Profa.
Josiane Chim.
Aos amigos, e ao apoio e compreenso do meu companheiro de todas as
horas, Wilson Colvara.
Ao rgo apoiador de minha graduao, CNPQ, pela concesso de bolsa
Iniciao Cientfica.
Lista de tabelas
Tabela 1 Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimticos
encontrados no mercado..................................................................................
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Lista de figuras
Figura 1 Microscpio fluorognico, usado para contagem de microrganismos e
conseqente formao de colnias...........................................................................
Figura 2 Placas PetrifilmTM prontas para uso.........................................................
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time...........................
Figura 6 Riboprinter System da DuPont Qualicon, usado para identificar e
caracterizar bactrias de forma automatizada...........................................................
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Sumrio
1 Introduo...................................................................................................
2 Mtodos rpidos........................................................................................
2.1 Mtodos convencionais x mtodos rpidos........................................
3 Tcnicas rpidas para a identificao de microrganismos...................
3.1 Mtodos para avaliar a qualidade.........................................................
3.1.1 Mtodos de contagem direta..............................................................
3.1.1.1 Tcnica de membrana filtrante........................................................
3.1.1.2 Tcnica de epifluorescncia direta.................................................
3.1.1.3 Tcnica fluorognica........................................................................
3.1.1.4 Sistemas prontos para uso..............................................................
3.1.2 Mtodos de contagem indireta...........................................................
3.1.2.1 Bioluminescncia.............................................................................
3.1.2.2 Impedncia/condutncia..................................................................
3.1.2.3 Placas SIMPLATE TM.........................................................................
3.2 Mtodos para avaliar a inocuidade.......................................................
3.2.1 Mtodos bioqumicos..........................................................................
3.2.2 Mtodos imunolgicos........................................................................
3.2.2.1 Ensaios imunoenzimticos..............................................................
3.2.2.2 Imunocaptura....................................................................................
3.2.2.3 Imunoimobilizao............................................................................
3.2.2.4 Coaglutinao...................................................................................
3.2.2.5 ELISA................................................................................................
3.2.3 Mtodos moleculares..........................................................................
3.2.3.1 Sondas genticas............................................................................
3.2.3.2 Reao de Polimerase em cadeia (PCR)........................................
3.2.3.3 Bacterifagos com DNA modificado...............................................
3.2.3.4 Ribotipagem......................................................................................
4 Concluses ................................................................................................
Referncias....................................................................................................
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1. Introduo
impossvel determinar exatamente quando, na histria da humanidade, o
homem tomou conhecimento da existncia de microrganismos e da sua importncia
para os alimentos.
Aps o perodo no qual o ser humano tinha a sua alimentao baseada
apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar
animais e produzir o seu prprio alimento. Com o surgimento de alimentos
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2. Mtodos rpidos
Os mtodos rpidos surgiram a partir da dcada de 70, como conseqncia da
necessidade de se abreviar o tempo necessrio para a obteno de resultados
analticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL, 1998).
So utilizados, geralmente, como tcnicas de seleo e a fim de garantir a
segurana dos consumidores. Sob viso geral, a maioria desses mtodos consiste
em um dispositivo descartvel que contm 15 a 30 meios ou carcaas, projetados
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deteco
de
Salmonella
spp.
Listeria,
monocytogenes
(HAJDENWURCEL, 1998).
Quase todos os mtodos rpidos so projetados para detectar um nico alvo,
o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar
rapidamente um grande nmero de amostras contaminadas por um determinado
patgeno (YUSTE, 2007).
Os resultados com a utilizao dos mtodos rpidos podem se dar em alguns
minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliaes dos mesmos, mostram que o
bom desempenho desses mtodos est relacionado com o tipo de alimento. Isto
pode ser atribudo, na maioria das vezes devido composio qumica do alimento,
por isso, aconselhvel executar estudos comparativos para assegurar a eficincia
da anlise (FRAQUEZA, 2002).
Ainda so poucos os mtodos validados oficialmente para alimentos, porm, vrios
mtodos alternativos de contagem tm sido proposto nos ltimos anos, tem se
observado que a rea de mtodos rpidos desenvolve-se de forma espantosa.
Porm, muitos dos chamados novos mtodos em microbiologia de alimentos nada
tem de novos, so na verdade resultados da transposio de mtodos h muito
tempo utilizados em outras reas da microbiologia.
2.1 Mtodos convencionais X mtodos rpidos
Os mtodos convencionais recebem essa denominao porque foram
desenvolvidos h muitos anos e desde ento vem sendo empregados como
mtodos oficiais na maioria dos laboratrios de microbiologia de alimentos. Esses
mtodos
esto
internacionalmente
descritos
aceitos
em
e
publicaes
recomendados
consideradas
pela
American
de
referncia,
Public
Health
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mtodo
convencional
de
contagem
de
microrganismos
consiste
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Diminuio de custos;
Especificidade;
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microbiano
(slidos
em
suspenso
ou
agentes
antimicrobianos);
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sob luz ultravioleta de onda longa. A observao do nmero de tubos turvos, com
gs e fluorescentes aps 24 ou 48h, permite o clculo do nmero mais provvel de
E. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007).
Este mtodo oferece como vantagens:
- Rapidez e facilidade de usar;
- Identificao direta e enumerao de Escherichia coli ou enterococos em 36
horas (em comparao com 3 ou 4 dias usando mtodos tradicionais);
- Dispensa a preparao de meio de cultura;
- Emprega microplacas estreis e prontas para uso;
- Padronizao do preparo, incubao e tcnica de leitura para E. coli e
Enterococcus;
- Deteco da atividade de uma enzima especfica de cada bactria por
microplaca;
- Resultados confiveis;
- Economia de tempo e material.
A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscpio fluorognico, usado
nesta tcnica para enumerar as clulas viveis no viveis.
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que na face voltada para o filme inferior revestido por gis hidrossolveis a frio e
um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio TTC), com exceo daquelas
usadas para contagem de fungos.
As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8C, antes do
uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposio das mesmas a
temperaturas superiores a 25C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu
desempenho.
As placas Petrifilm so prontas para uso, isto , basta erguer o filme superior e
inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posio inicial e aplicar
um difusor plstico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, atravs de
leve presso manual. Os agentes gelificantes so solveis em gua e a frio. A gua
de diluio contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a
hidratao dos nutrientes e a geleificao da mistura.
Aps a geleificao (1 min) as placas so incubadas na temperatura e tempo
adequados, fazendo-se em seguida a enumerao de colnias. As colnias
apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo
microrganismo passa de incolor para vermelho.
A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumerao de: bactrias
aerbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactrias, leveduras e
bolores e ainda bactrias lticas.
Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos,
necessrio incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados,
sendo a incubao pelo perodo de 3-5 dias a 25C (SANTANA; CONCEIO;
AZEREDO, 2002).
Entre as vantagens desse sistema, tem-se:
Custo baixo;
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Bioluminescncia
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E - LH2 - AMP + PP
E - LH2 - AMP + O2
Resultados em minutos;
3.1.2.2 Impedncia/Condutncia
So baseadas na propriedade que os microrganismos tm de alterar a
transmisso da corrente eltrica atravs de um meio de cultura. Essas alteraes
ocorrem como conseqncia da mudana da composio qumica desse meio
devido
atividade
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SISTEMA
Salmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck
Listeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureus-
FABRICANTE
Organon Teknika
Tecra
Via
Unique Salmonella, Unique Listeria
ECOLI
Listeria Rapid Test
REVEAL Listeria, Salmonella e E. coli
Vip E. coli
VIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E.
Tecra
Difcro
Oxoid
Neogen
Biocontrol
bioMuriex
aureus
Fonte: MACHADO, 2007.
3.2.2.2 Imunocaptura
Tambm chamada de imunoseparao magntica, nessa tcnica os
anticorpos ficam ligados a partculas metlicas recobertas com policarbonato. Aps a
ligao com o antgeno especfico, as partculas metlicas so atradas por um im,
permitindo que o restante do material seja removido. Aps a retirada do im, obtmse um produto concentrado que pode, ento, ser submetido aos testes de escolha
para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa tcnica, quando aplicada
diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de prenriquecimento, sempre necessria quando se pretende investigar a presena de
microrganismos patognicos em alimentos por mtodos convencionais (SILVA,
1996).
3.2.2.3 Imunoimobilizao
Nessa tcnica, bactrias mveis cultivadas em meio semi-slido tm sua
mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares especficos. H formao
de uma banda de precipitao visvel na interface anticorpo-bactria.
3.2.2.4 Coaglutinao
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tratado com anticorpos secundrios que possuem uma enzima acoplada que ir
produzir uma substncia corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo
primrio. A superfcie lavada novamente para a retirada do anticorpo secundrio
que no se ligou ao anticorpo primrio. Adiciona-se o substrato de ligao para a
enzima produzir a substncia corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da
superfcie, pode-se quantificar e verificar a presena de alguma substncia de
interesse (SIMERSKY,2000).
A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reao especfica entre o
antgeno e o anticorpo.
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como
pr-mix)
que
contm
os
dNTPs
(desoxirribonucleotdeos
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4. Concluses
A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurana da
qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados indstria
alimentar. Logo, devido necessidade de rapidez de resultados, hoje, j so
encontrados no mercado varias tcnicas que possibilitam resultados muito rpidos,
essas tcnicas so conhecidas por mtodos rpidos de anlise microbiolgica, os
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Referncias
BRASIL. Resuluo RDC n 12, de 02 de janeiro de 2001. Regulamento tcnico
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