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Biologia Molecular Na Genética Forense
Biologia Molecular Na Genética Forense
INTRODUO
Recebido em 27/12/2006
Aprovado em 18/10/2007
*Instituto de Cincias da Sade, Centro Universitrio Feevale, Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul, Brasil
1
Aluna formanda do curso de Biomedicina do Centro Universitrio Feevale
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Doutora em Gentica e Biologia Molecular, Professora Titular de Gentica Humana, Curso de Biomedicina do Centro Universitrio Feevale
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gues ao laboratrio forense e, para minimizar a deteriorao da amostra e os itens, devem ser guardados em ambiente frio e seco at que sejam submetidos testagem
(BENECKE, 2005).
Em casos de justia, se a evidncia no for documentada,
coletada, embalada e preservada com muito cuidado, ela
pode no preencher os requisitos legais e cientficos para
serem admitidos num tribunal, pois, se ela no foi apropriadamente documentada antes da coleta, sua origem pode
ser questionada e se tiver sido mal coletada ou embalada,
a possibilidade de contaminao aumentar, levando a
uma maior possibilidade de discordncia nos resultados da
anlise do DNA. Na perspectiva dos desafios legais, para
uma confiabilidade nos resultados dos mtodos aplicados,
essencial que medidas estritas de cuidados com contaminao sejam seguidas (LEE e LAAD, 2001).
Toda a atividade humana est associada a algum tipo de erro. Existem fontes potenciais de erro durante todo o estgio
do processamento da prova fsica, desde a coleta em campo,
passando pela anlise no laboratrio, at a interpretao dos
resultados dessa anlise. Nem todos os erros tm conseqncias prejudiciais; muitos nem tem conseqncias. Muitos so prontamente identificados e podem ser corrigidos.
Os lapsos que mais preocupam, so aqueles que possam levar a uma falsa semelhana. Falsas excluses so importantes, mas improvvel que levem a falsas condenaes. Para
conseguir resultados precisos, cuidados e ateno a detalhes, devem ser utilizados em todos os estgios do processo
de identificao pelo DNA (DUARTE et al., 2001).
MARCADORES MOLECULARES PARA A
IDENTIFICAO HUMANA
Nos testes de determinao de identidade gentica so estudadas regies genmicas em que h variao entre pessoas normais. Essas regies so chamadas de polimorfismos de DNA ou marcadores de DNA. Nos ltimos anos
foram desenvolvidas diversas tcnicas para estudo de diferentes tipos de polimorfismos de DNA, formando assim um
verdadeiro cardpio, no qual os cientistas e laboratrios
podem escolher o mtodo mais adequado para solucionar
o problema em mos (PENA, 2005).
O mtodo mais usado hoje em dia o estudo de regies repetitivas de DNA, chamadas de minissatlites (VNTRs) e microssatlites (STRs). A chave da diversidade nessas regies
que o nmero de repeties varia entre indivduos e pode ser
estudada com sondas de DNA, ou atravs de PCR, como vem
sendo feito em maior escala atualmente (PENA, 2005).
VNTRs: (do ingls variable number of tandem repeats ou
nmero varivel de repeties em tandem): tambm denominados de minissatlites, so polimorfismos de DNA
que consistem numa srie de comprimento de repeties
de fragmentos de DNA. Uma regio VNTR tpica consiste
de 500 a 1000 pb, compreendendo principalmente unidades repetidas em seqncia, cada qual com cerca de 15 a
35 pb de comprimento. Os locos VNTR so particularmente convenientes como marcadores para a identificao humana, pois possuem um nmero muito grande de alelos diferentes e, sendo assim, provvel que no existam dois
indivduos no aparentados que compartilhem o mesmo
gentipo (THOMPSON, 1993; DUARTE et al., 2001;
KASHYAP et al., 2004).
STRs (do ingls short tandem repeats ou repeties curtas
em tandem): STRs ou microssatlites so polimorfismos
muito similares aos VNTRs, mas diferindo em seu tamanho
(em geral no ultrapassam 200pb) e no comprimento das
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unidades de repetio em tandem, que variam de 2 a 7 nucleotdeos. Estes locos so muito abundantes no genoma
humano (KASHYAP et al, 2004), e cada um deles possui
um grande nmero de diferentes alelos, inclusive maior do
que o encontrado em VNTRs, o que os torna ainda mais til
para identificao humana.
Marcadores bi-allicos: alm dos minissatlites e microssatlites h dois grandes grupos de polimorfismos no genoma
humano - os polimorfismos de substituio de nucleotdeos
nicos (single nucleotide polymorphisms, ou SNPs) e os polimorfismos de insero ou deleo de um ou mais nucleotdeos (polimorfismos de insero - deleo; ins/del). Ambos
polimorfismos apresentam a grande vantagem de que podem ser estudados em produtos de amplificao muito curtos (50 pb ou menos) e, assim, apresentam distintas vantagens sobre os microssatlites no estudo de DNA extremamente degradado (PENA, 2005). Os mais abundantes e os
melhor estudados desse grupo so os SNPs. Cerca de 5,3
milhes deles foram encontrados no genoma humano, o que
corresponde a um SNP a cada 600pb (XIAO J et al, 2006).
Recentemente, vrias publicaes tm analisado a possibilidade de que SNPs marcadores ins/del possam vir a substituir os STRs na identifcao de criminosos. Porm, embora estes marcadores possam oferecer algumas vantagens, os bancos de dados j foram montados com microssatlites e, portanto, a facilidade de comparaes entre um dado biolgico
e uma seqncia armazenada muito maior para marcadores STRs. Alm disto, a tipagem dos SNPs relativamente
complexa mas por outro lado, os ins/del so muito mais fceis de serem tipados porque seus alelos diferem somente
em tamanho (PENA, 2005). Na rea de identificao humana, estes marcadores apresentam a desvantagem de possurem somente dois alelos, o que torna muito maior a possibilidade de dois indivduos compartilharem o mesmo gentipo, mesmo sem serem aparentados ou relacionadas cena
do crime. Uma maneira de superar esta desvantagem seria
a tipagem de um nmero maior de marcadores ins/del, de
maneira que fosse possvel uma identificao precisa.
Por muito tempo, estes polimorfismos foram detectados por
tcnicas que possuam como base a eletroforese, cujos fundamentos permitiram o desenvolvimento de mtodos automatizados que sero discutidos mais adiante. Assim, a primeira tcnica a ser descrita neste trabalho a de eletroforese. Logo aps uma tcnica que foi utilizada por um longo tempo, denominada de southern blotting, ser brevemente descrita, tanto na deteco de SNPs como de
VNTRs ou STRs. Com o advento da reao em cadeia da
polimerase (PCR), todos os tipos de marcadores moleculares passaram a ser detectados a partir de quantidades menores de amostras, com um tempo menor e, assim, uma
ateno especial ser dada para esta tcnica. E, por ltimo,
uma apresentao ser feita sobre os mtodos automatizados, que a partir do PCR detectam um grande nmero de
marcadores em um pequeno espao de tempo.
Essa informao utilizada para desenhar dois oligonucleotdeos iniciadores, denominados primers, os quais so especficos para a seqncia-alvo e apresentam cerca de 15
a 25 nucleotdeos de extenso. Aps os primers terem sido
adicionados ao DNA-molde desnaturado, eles se ligam especificamente s seqncias de DNA complementares ao
seu stio-alvo, flanqueando e delimitando a regio a ser
analisada. Na presena de uma DNA-polimerase termoestvel apropriada e dos quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iniciada a sntese
de novas fitas de DNA, que so complementares a cada
uma das fitas de DNA do segmento-alvo de DNA, formando, desta maneira, um fragmento de DNA com seqncia
idntica do DNA a ser analisado, e previamente selecionado pelo par de primers (STRACHAN et al., 2002).
Uma vez que este ciclo de duplicao molecular repetido
vrias vezes, a PCR uma reao em cadeia porque as fitas de DNA, recentemente sintetizadas, iro atuar como
moldes para mais uma sntese de DNA nos ciclos subseqentes. Aps cerca de 25 ciclos de sntese de DNA, os
produtos da PCR iro incluir, alm do DNA que iniciou a
reao, cerca de 105 cpias da seqncia-alvo especfica,
uma quantidade que facilmente visualizada como uma
banda distinta de tamanho especfico quando submetida
eletroforese em gel de agarose (STRACHAN et al., 2002).
O processo relativamente simples e fcil de realizar em
laboratrio. Os resultados podem ser obtidos em um espao curto de tempo, freqentemente menos do que 24 horas, em contraste com uma anlise do genoma total com
Southern, que exige at mesmo semanas.
Principais vantagens da tcnica de PCR
Velocidade e facilidade de utilizao: a clonagem de DNA
por PCR pode ser realizada em poucas horas usando-se um
equipamento relativamente simples, cuja funo fundamental a variao de temperatura em cada passo da tcnica. Uma reao de PCR consiste de 30 ciclos contendo as
etapas de desnaturao, sntese e pareamento, com cada
ciclo individual levando em geral 3 a 5 minutos em um termociclador automatizado, o que totaliza menos de trs horas para todo o processo. Evidentemente, algum tempo
tambm necessrio para a construo e a sntese dos oligonucleotdeos que serviro como primers, mas isso foi
simplificado pela disponibilidade de programas de computador para projetar primers e pela sntese comercial rpida
dos oligonucleotdeos desejados (STRACHAN et al., 2002).
Sensibilidade: a PCR capaz de amplificar seqncias a
partir de quantidades nfimas do DNA-alvo e, at mesmo,
do DNA de uma nica clula. Esta vantagem torna a tcnica particularmente til na anlise forense, quando, em muitos casos, a quantidade de material biolgico, e portanto
de DNA extrado de algumas amostras, muito pequena,
como em fios de cabelo ou traos de saliva em tocos de cigarro. Desta maneira, a tcnica possibilita a tipagem do
DNA em amostras de prova que no poderiam ser analisadas atravs de outras tcnicas, como por exemplo o Southern, uma vez que esta tcnica necessita de uma grande
quantidade de DNA total. Alm disso, a pequena quantidade de DNA, necessria para a PCR, torna mais fcil
guardar pores de amostras para repetir os testes no mesmo ou em outro laboratrio (DUARTE et al., 2001).
Tal sensibilidade excelente tem fornecido novos mtodos
para o estudo da origem molecular de doenas e tem encontrado numerosas aplicaes na cincia forense, no diagnstico, na anlise de ligaes genticas, utilizando a
classificao de um nico tipo de esperma, e nos estudos
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paleontolgicos em que as amostras podem conter um nmero insignificante de clulas. No entanto, a sensibilidade
extrema do mtodo implica que enormes cuidados devem
ser tomados para evitar a contaminao da amostra com
DNA de outras fontes (STRACHAN et al., 2002).
thern, se fazia necessrio que o DNA genmico inteiro estivesse no gel (KASHYAP et al., 2004). Com o advento dos
mtodos automatizados, uma srie de kits comerciais para
tipagem de STRs esto disponveis, o que demonstra a importncia destes marcadores na gentica forense.
Robustez e possibilidade de anlise de amostras degradadas: a PCR pode permitir a amplificao de seqncias especficas a partir de material no qual o DNA est gravemente degradado ou embebido em um meio onde o isolamento de DNA problemtico. Como o Southern utiliza
DNA genmico total, necessrio que este DNA esteja em
bom estado, ou seja, que as molculas estejam intactas.
Mas em gentica forense, nem sempre as amostras biolgicas so novas e se encontram em um bom estado de conservao, o que compromete a integridade do genoma da
clula a ser analisada. Uma vez que somente um fragmento do DNA isolado e amplificado pela PCR, uma enorme
vantagem desta tcnica permitir a utilizao, com sucesso, de amostras que contenham DNA degradado. Assim,
atravs da PCR, possvel a tipagem do DNA em amostras
que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como
amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio,
por exemplo (DUARTE et al., 2001).
MTODOS AUTOMATIZADOS
Seqenciamento automtico de DNA
Com o crescimento do interesse em desvendar a totalidade
dos genomas de diferentes organismos, incluindo o homem, tcnicas mais sofisticadas para o seqenciamento do
DNA tiveram que ser desenvolvidas. Os seqenciadores de
DNA analisam automaticamente as fitas de DNA previamente amplificadas, cujos didesoxirribonucleotdeos
(dNTPs) incorporados na PCR foram previamente marcados com compostos fluorescentes, de diferentes cores para
cada dNTP. O produto da PCR aplicado em um gel no interior de um capilar, e assim, a migrao do DNA acontece
at passar pelo detector do equipamento. Um feixe de laser rastreia o gel, excitando os marcadores, que emitem luz
em um comprimento de onda especfico, de acordo com o
corante utilizado. A luz detectada e o padro do espectro
analisado com ajuda de programas que permitem gerar as
seqncias de DNA (VOET et al., 2002).
Usando detectores de fluorescncia controlados por computador, os sistemas automticos podem identificar aproximadamente 10 mil bases por dia, bem mais do que as 50 mil bases
por ano obtidas pelos mtodos manuais (VOET et al., 2002).
Em gentica forense, o seqenciamento do DNA utilizado
principalmente para DNA mitocondrial, que extremamente
rico em SNPs, e sem polimorfismos do tipo VNTRs ou STRs.
Genotipagem de STRs utilizando o seqenciador automtico
Atualmente, entre as tcnicas de tipagem de DNA usadas
na identificao humana, a genotipagem automatizada de
DNA com STR Multiplex, baseada em fluorescncia , sem
dvida, a mais informativa, precisa, robusta e de maior rapidez (KASHYAP et al., 2004).
Nesta metodologia, vrios STRs so amplificados utilizando-se vrios pares de primers (PCR multiplex) que compe
um kit comercial. O produto da reao de amplificao dos
STRs pode ser facilmente detectado atravs de seus res21
pectivos tamanhos, atravs da migrao em gel de eletroforese de alta resoluo, localizado dentro de um capilar,
como ocorre no seqenciamento automtico. Quando utilizada a tecnologia de colorao fluorescente com deteco
por laser, possvel inclusive avaliar STRs de mesmo tamanho, bastando para isto que cada um seja marcado com
uma colorao diferente. Cada kit de PCR multiplex utiliza
diferentes coloraes, e amplifica diferentes STRs, como os
kits comerciais Profiler PlusTM que analisa simultaneamente 10 marcadores, o kit Power Plex para 16 STRs, e o IdentifilerTM para 16 marcadores (KASHYAP et al., 2004).
A tcnica para a anlise de STRs utilizando laser significativamente mais sensvel em comparao a outras metodologias padro. Geralmente necessrio apenas entre 0,5
e 2 ng de DNA para a genotipagem. Somente 1 a 2% dos
produtos de 28 ciclos PCR so necessrios para a tipagem
allica, o que significa que o material amplificado pode ser
estocado para uma nova anlise, quando necessrio. Essas
metodologias que utilizam fluorescncia so aproximadamente 200 vezes mais sensveis do que qualquer outra tcnica de colorao (KASHYAP et al., 2004).
O DNA MITOCONDRIAL NA IDENTIFICAO HUMANA
Embora a grande maioria dos genes se localize no ncleo,
um subgrupo pequeno, mas importante, reside no citoplasma, especificamente nas mitocndrias. So eles os genes
mitocondriais que exibem herana exclusivamente materna. Todas as clulas humanas possuem centenas de mitocndrias, cada uma contendo vrias cpias de uma pequena molcula circular, o cromossomo mitocondrial
(THOMPSON et al., 1993).
A principal vantagem do DNA mitocondrial, em comparao com o DNA nuclear, que ele est presente num total aproximado de 500 a 2.000 cpias por clula. Nesse
contexto a anlise do DNAmt particularmente til em investigaes criminais, uma vez que esta abundncia oferece uma maior chance de algumas cpias suportarem a degradao das amostras obtidas para a anlise forense. Apesar de o DNA nuclear possuir um timo poder para as identificaes criminais, ele aparece com uma freqncia de
apenas duas cpias por clula diplide (ALBUQUERQUE,
2004; PARSONS e COBLE, 2001).
Uma caracterstica importante do DNA mitocondrial que
ele herdado uniparentalmente, pois apenas as mitocndrias do gameta materno esto presentes no embrio e conseqentemente no indivduo adulto. Sendo assim, as relaes
familiares pela linhagem materna so reconhecidas facilmente (ALBUQUERQUE, 2004; SCHULLER et al., 2001).
Os alvos do seqenciamento do DNA mitocondrial so duas regies especficas do cromossomo, denominadas de regies hipervariveis I e II (HV1/HV2). A taxa de mutao
nestas regies de cinco a dez vezes maior em comparao com o DNA nuclear. Espcimes biolgicos so analisados comparando o polimorfismo encontrado nas regies
HV1 e HV2 com aqueles encontrados na linhagem materna, ou a partir de um banco de dados evolucionrio, biolgico ou antropolgico da populao, quando se deseja enquadrar um suspeito em algum grupo tnico, por exemplo,
uma vez que cada populao de origem distinta possui um
conjunto especfico de SNPs nesta regio (KASHYAP et al.,
2004; PARSONS e COBLE, 2001).
Entretanto, deve-se levar em conta que a tipagem de DNA
mitocondrial s dar um resultado correto e definitivo se a
variao do DNA do indivduo em questo for concordante com a de seus parentes maternos (PARSONS e COBLE,
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nao de identidade gentica que possa ajudar em investigaes criminais e aumentar a segurana pblica. De acordo com Pena (2005), as seguintes etapas seriam de grande
importncia: montar uma rede eficiente de laboratrios de
DNA forense; fazer treinamento da polcia para coleta correta da evidncia em cenas de crime; fazer treinamento dos
profissionais que atendem nas delegacias e nos servios de
urgncia mdica para que possam providenciar de maneira correta a coleta de evidncia de vtimas de estupro; fazer treinamento de juzes de vara criminal e promotores
para entenderem os princpios da tipagem de DNA com
fins forenses; montar um banco nacional de perfis gentico
semelhante ao Codis do FBI.
LIMITAES QUANTO AO USO DO DNA
Quando gmeos idnticos so suspeitos de crime em que o
autor deixou vestgios, o DNA em nada poderia colaborar para a elucidao do delito, uma vez que no consegue distingu-los por serem geneticamente idnticos. Neste caso a datiloscopia convencional seria til, se dentre os vestgios deixados, existissem impresses digitais (BONACCORSO, 2004).
As condies de preservao do material biolgico de um
cadver carbonizado ou que tenha ficado por muito tempo
submerso no mar, muitas vezes no permitem, atravs da
anlise do DNA, que se alcancem dados com significncia
estatstica para que se possa afirmar sua identidade, ao
passo que neste sentido seria mais significativo o exame de
sua arcada dentria (BONACCORSO, 2004).
Outro ponto importante a ser abordado sobre as limitaes do
DNA, principalmente na rea criminal, diz respeito a peculiaridades da anlise. Muitas vezes, qualquer vestgio de roupas
coloridas, que possa ser encontrado nas evidncias biolgicas,
acabam inibindo a reao de PCR (BONACCORSO, 2004).
Apesar de certas limitaes da anlise de DNA, deve-se
acima de tudo enfatizar sua importncia como prova extremamente poderosa, se realizada segundo as recomendaes tcnicas exigidas (BONACCORSO, 2004).
CONCLUSO
A anlise do DNA um dos maiores progressos tcnicos da
investigao criminal desde a descoberta das impresses digitais. Mtodos para determinar o perfil do DNA esto firmemente embasados na tecnologia molecular. Quando a determinao do perfil feita com cuidados adequados, os resultados so altamente reprodutveis (DUARTE et al., 2001).
Os mtodos baseados na PCR so imediatos, requerem
apenas uma pequena quantidade de material e podem fornecer identificao no-ambgua de alelos individuais. Assim, vrios mtodos de PCR, particularmente os que usam
os STRs, esto sendo cada vez mais usados. (DUARTE et
al., 2001; GOES et al., 2002).
A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise
de DNA progrediram a ponto de no colocar em dvida a
admissibilidade dos dados sobre o DNA quando adequadamente coletados e analisados (DUARTE et al., 2001).
No futuro, espera-se que as tcnicas de biologia molecular
existentes sejam aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam desenvolvidos, a fim de que a
grande maioria dos casos de investigaes forenses cveis
e criminais tenham um desfecho que no possa ser questionado nos tribunais.
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ENDEREO PARA CORRESPONDNCIA:
Profa. Dra. Fabiana Michelsen de Andrade
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email: fabiana.andrade@feevale.br
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