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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

Crtex cingulado anterior e respostas nociceptivas em

cobaias: modulao GABArgica, colinrgica e

opioidrgica

Joo Zugaib Cavalcanti

Ribeiro Preto

2012

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA

Crtex cingulado anterior e respostas nociceptivas em

cobaias: modulao GABArgica, colinrgica e

opioidrgica

Joo Zugaib Cavalcanti

Dissertao de Mestrado apresentada


Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto USP,
para a obteno do ttulo de Mestre em Cincias,
rea de Fisiologia

Orientadora: Profa. Dra. Leda Menescal de Oliveira

Ribeiro Preto

2012
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AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRFICA

Cavalcanti, Joo Zugaib

Crtex cingulado anterior e respostas nociceptivas em cobaias: modulao GABArgica,


colinrgica e opioidrgica Ribeiro Preto, 2012.

90 p.

Dissertao (Mestrado) - Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto/USP

rea de concentrao: Fisiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Leda Menescal de Oliveira.

Palavras-Chaves: Vocalizao, Cobaias, Crtex cingulado anterior, nocicepo, formalina.

Data da defesa: 23 de fevereiro de 2012

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Banca Examinadora

Profa. Dra. Leda Menescal de Oliveira (Orientadora)

Julgamento: Assinatura .

Prof. Dr. Luis Felipe Souza da Silva

Julgamento: Assinatura .

Profa. Dra. Anette Hoffmann

Julgamento: Assinatura .

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Agradecimentos

Aos meus pais devo a vida e por isso agradecer-lhes em primeira instncia se faz
oportuno. No s por isso, entretanto... O gosto e o suporte na busca pelo conhecimento
me foram incentivados e oferecidos durante toda minha trajetria. Portanto, Lucia Costa
Zugaib e Marcio Alves Cavalcanti so os principais responsveis por essa conquista.
Muito obrigado!

Minha irm Maria Zugaib Cavalcanti sempre ofereceu muito amor e admirao,
que me renderam vontade e fora para atingir meus objetivos. Minha filha Luiza, que
muito amo e me esforo para que conquistas como essa possam faz-la se orgulhar de
mim. .

minha mulher e companheira Sofia Waria, que me mostra a cada dia a


preciosidade do amor. Obrigado por ter participado dessa trajetria tornando tudo mais
belo.

minha av Edna, minha tia Ftima, minha tia Ceclia e meu tio Luciano, que
representaram o porto seguro para poder seguir o caminho que escolhi.

No mbito acadmico, agradeo primeiramente ao mestre Abraho, que me


proporcionou o contato com pesquisa bsica, me fazendo optar pela carreira acadmica.
prof Dr Leda Menescal de Oliveira que possibilitou meu ingresso neste departamento
e sempre esteve engajada na minha formao. Agradeo ainda todos os docentes deste
departamento pelo comprometimento em me tornar um indivduo mais crtico. FMRP,
CAPES, FAPESP e CNPq por todo o suporte logstico e financeiro, que viabilizaram o
desenvolvimento deste trabalho.

Agradeo a todos os tcnicos e funcionrios deste departamento pelo ambiente


harmnico, os bate papo no cafezinho e nas rodas de cigarro, as risadas e o suporte para
as mais variadas necessidades. Em especial, Mariulza Rocha Brentegani e Rubens
Fernando de Melo, que ofereceram alm do apoio tcnico eficiente, toda disponibilidade
para resolver os mais variados problemas.

Aos colegas de laboratrio e amigos, Marcinho da Bahia e Mateuzinho, que


sempre estiveram ao lado para mostrar os atalhos e facilitar minha caminhada.

Agradeo aos amigos de Salvador, Bruno, Marcola, Mari e Cntia, que me


mostraram que trabalho srio tambm pode ser feito brincando.

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No menos importante agradeo a galera do baba de quinta-feira. Destaco o
brother Kpta pela afinidade de idias e pelos momentos de lazer proporcionados. Porm,
seria tudo mais difcil se no houvesse a fora de todos para formar essa equipe bi-
campe de futsal no CEFER.

Por fim, agradeo todos aqueles que por algum descuido no foram citados, mas
que tiveram sua participao nesses dois anos de mestrado.

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1. Resumo .......................................................................................................... 8

2. Abstract ........................................................................................................ 10

3. Introduo .................................................................................................... 12

4. Objetivo ........................................................................................................ 22

5. Materiais e mtodos ..................................................................................... 23

5.1. ANIMAIS .................................................................................................................................................. 23


5.2. PROCEDIMENTOS CIRRGICOS...................................................................................................................... 23
5.3. MICROINJEO DAS DROGAS ....................................................................................................................... 24
5.4. DROGAS UTILIZADAS ......................................................................................................................... 24
5.5. TESTE ALGESIMTRICO DE VOCALIZAO ........................................................................................................ 25
5.6. T ESTE DA FORMALINA ....................................................................................................................... 27
5.7. GRUPOS EXPERIMENTAIS............................................................................................................................. 28
5.7.1. Experimento I: Efeito do agonista preferencial de receptores GABAa, muscimol e do antagonista
bicuculina, microinjetados no CCA sobre a resposta de vocalizao ...................................................... 28
5.7.2. Experimento II: Efeito do agonista preferencial de receptores GABAa, muscimol e do antagonista
bicuculina, microinjetados no CCA sobre o teste da formalina............................................................... 29
5.7.3. Experimento III: Efeito do agonista de receptores colinrgicos, carbacol e do antagonista
muscarnico atropina, microinjetados no CCA sobre a resposta de vocalizao .................................... 29
5.7.4. Experimento IV: Bloqueio da atividade do agonista de receptores colinrgicos, carbacol, com
naloxona, um antagonista preferencial -opiide microinjetados no CCA sobre o teste de vocalizao29
5.7.5. Experimento V: Efeito do agonista de receptores colinrgicos, carbacol e do antagonista
muscarnico, atropina, microinjetados no CCA sobre o teste da formalina ............................................ 30
5.7.6. Experimento VI: Efeito do agonista preferencial de receptores de opiides, morfina e do
seu antagonista, naloxona, microinjetados no CCA sobre o teste de vocalizao ................................. 30
5.7.7. Experimento VII: Efeito do agonista preferencial de receptores de opiides, morfina e do
seu antagonista, naloxona, microinjetados no CCA sobre o teste de formalina .................................... 30
5.8. HISTOLOGIA ....................................................................................................................................... 30
5.9. ANLISE DOS RESULTADOS .............................................................................................................. 32

6. Resultados ................................................................................................... 33

6.1. EXPERIMENTO I......................................................................................................................................... 33


6.2. EXPERIMENTO II........................................................................................................................................ 41
6.3. EXPERIMENTO III....................................................................................................................................... 45
6.4. EXPERIMENTO IV ...................................................................................................................................... 51
6.5. EXPERIMENTO V ....................................................................................................................................... 54
6.6. EXPERIMENTO VI ...................................................................................................................................... 58

7. Discusso ..................................................................................................... 61

8. Concluses................................................................................................... 75

9. Referncias Bibliogrficas ............................................................................ 76

10. Apndice .................................................................................................... 82

7
1. Resumo

A dor um fenmeno multidimensional, que geralmente desencadeia

reaes emocionais desconfortveis quando identificada. Sua relao com injria

tecidual pode ser interpretado como um mecanismo adaptativo de defesa

integridade do organismo, tendo em vista sua preservao evolutiva. Porm, o

substrato neurobiolgico do organismo parece determinar a complexificao do

repertrio comportamental em diferentes espcies. Nesse sentido, o crtex

cingulado anterior (CCA) tem sido amplamente descrito em mamferos modulando

diferentes aspectos da dor. O presente trabalho utilizou os testes algesimtricos

de vocalizao e da formalina em cobaias, para se avaliar o decurso temporal do

efeito da microinjeo de agonistas e antagonistas GABArgico (muscimol e

bicuculina); colinrgico (carbacol e atropina) e opioidrgico (morfina e naloxona).

A microinjeo de bicuculina (1 nmol / 0,2 l) exacerbou as respostas nociceptivas

em ambos os testes, porm diferentes doses de muscimol (0,5, 1 e 2 nmol / 0,2

l), no modificaram as respostas. O efeito da bicuculina foi bloqueado em ambos

os testes pela microinjeo prvia de muscimol (1 nmol/ 0,2 l) no CCA.

A microinjeo de carbacol (2,7 nmol /0,2 l) neste substrato promoveu

antinocicepo, evidenciada por meio da atenuao da amplitude das

vocalizaes, mas no pelo teste da formalina. Esse efeito foi bloqueado pela

administrao prvia de atropina (0,7 nmol /0,2 l) e de naloxona (2,7 nmol /0,2

l). A microinjeo de morfina (4,4 nmol /0,2 l) promoveu antinocicepo em

ambos os testes. Conclumos que a inibio do tnus GABArgico no CCA

exacerba os comportamentos nociceptivos e que a antinocicepo promovida por

carbacol pode ter sido mediada pelo sistema de opiides endgenos, tendo em

8
vista o bloqueio do seu efeito com naloxona. Alm disso, a estimulao opiide

promove uma contundente antinocicepo.

9
2. Abstract
Pain is a multidimensional phenomenon which usually triggers

uncomfortable emotional reactions when identified. Its relation injury can be

interpreted as an adaptive mechanism to defend the integrity of the body given its

evolutionary conservation. However the neurobiological substrate of the body

seems to determine the complexification of behavioral repertoire in different

species. Thus, the anterior cingulated cortex (ACC) has been widely described in

mammals by modulating different cognitive aspects of pain. This study used

algesimetric tests of vocalization and formalin in guinea pigs to evaluate the time

course of the effect of microinjection of GABA agonists and antagonists

(bicuculline and muscimol) and cholinergic (carbachol and atropine) beyond the

opioid antagonist naloxone. The microinjection of bicuculline (1 nmol / 0,2 l)

exacerbated the nociceptive behavior in both tests but different doses of muscimol

(0,5; 1 e 2 nmol / 0,2 l) did not change the responses. The effect of bicuculline

was blocked in both tests by prior microinjection of muscimol (1 nmol / 0,2 l) in

the ACC.

The microinjection of carbachol (2,7 nmol / 0,2 l) on this substrate

promoted antinociception as evidenced by attenuation of the amplitude of

the vocalizations, but not by the formalin test. This effect was blocked by prior

administration of atropine (0,7 / 0,2 l) and naloxone (0,7 nmol / 0, 2

l). The microinjection of morphine (4,4 nmol / 0,2 l) promoted antinociception in

both tests. We conclude that inhibition of GABAergic tone in the ACC exacerbates

nociceptive behaviors and that the antinociception promoted by carbachol may

10
have been mediated by endogenous opioid system in order blocking its effect with

naloxone. In addition opioid stimulation promotes a striking antinociception.

11
3. Introduo

A dor pode ser considerada uma modalidade sensorial somtica

diferenciada, que freqentemente est relacionada leso tecidual (Hathway e

Fitzgerald, 2009). A definio mais utilizada atualmente diz que a dor uma

experincia sensorial e emocional desagradvel associada a um dano tecidual

real, potencial ou descrita em tais termos (Merskey e Bogduk, 1994). De acordo

com essa definio, a dor um fenmeno multidimensional, constitudo por um

componente sensrio-discriminativo e outro afetivo-motivacional. Embora sejam

complementares no que se refere percepo de dor, esses componentes

possuem substratos neurais e vias sensoriais que so especializadas para cada

uma dessas submodalidades perceptuais. O componente sensorial se refere

capacidade de localizar e qualificar um estmulo nociceptivo. O afetivo se refere

ao contedo emocional de desprazer que acompanha a sensao de dor. Porm,

a dor no deve ser entendida como uma funo matemtica da quantidade de

leso corporal, pois experincias prvias, situao ambiental, a significncia da

dor e a cultura, tm um papel importante na percepo de sua intensidade e

qualidade (Lico et al, 1974).

Numa perspectiva de funo biolgica da nocicepo plausvel

considerar, que a capacidade do indivduo perceber potenciais ameaas sua

integridade fsica, favorece situaes de defesa, busca por alimento e o sucesso

reprodutivo. Porm, essa hiptese s vlida se a deteco do estmulo nocivo

acompanhada de um comportamento de esquivar-se da fonte do estmulo

12
(Walters, 1994). Evidncias das propriedades funcionais, de mecanismos

nociceptivos neurais e moleculares, anlogas entre Aplysia e ratos, sugere uma

presso seletiva que preserva a capacidade de reconhecer estmulos nocivos e

desencadear reaes fisiolgicas e comportamentais coerentes ao contexto

ambiental (Walters, 2009a). Ainda neste mbito, respostas comportamentais

aversivas de retirada/escape tm sido demonstradas em diversas espcies do

sub-reino Eumetazoa, que abrange todos os animais que possuem sistema

nervoso. Porm, a diversidade do repertrio comportamental apresentado por

diferentes espcies possui relao com o grau de complexificao do sistema

nervoso (Walters, 2009b). Diante disso, respostas cognitivas e emocionais

desagradveis promovidas pela sensao que acompanha uma injria tecidual,

parecem estar presentes em espcies, que ao longo do desenvolvimento

filogentico, desenvolveram substratos enceflicos capacitados.

As primeiras evidncias acerca da modulao enceflica da dor se referem

ao envolvimento da substncia cinzenta periaquedutal e do bulbo rostro-ventro-

medial, enquanto substratos que atuam principalmente nas reaes defensivas e

autonmicas induzidas pela dor (Heinricher e Ingram, 2009). Posteriormente,

outras estruturas do tronco enceflico e do diencfalo foram caracterizadas como

estruturas que modulam esta sensao, relacionando-se com reaes emocionais

e memria nociceptiva (Millan, 2002). Mais recentemente, tem-se evidenciado que

no crtex cerebral ocorre o processamento mais refinado da informao dolorosa,

integrando componentes afetivos e cognitivos. Especificamente, o crtex

cingulado uma rea especializada do neocrtex, que participa do

processamento emocional e cognitivo e, transforma a necessidade interna do

organismo na elaborao de comportamentos (Devinsky et al, 1995). Essa


13
heterogeneidade funcional est ligada relao estrutura-funo dos tipos

neuronais que o compem, bem como sua organizao citoarquitetnica (Vogt,

2009). Circuitos neurais especficos so capazes de processar quantidades

limitadas de informao, por exemplo, diferentes aspectos cognitivos de

processamento da dor ou componentes da emoo, como desbalano

autonmico e desconforto. Evidncias sugerem que a regio anterior do crtex

cingulado seja mais ativada em eventos de contedo emocional, enquanto a

regio posterior fornea o contedo cognitivo da tomada de deciso (Vogt, 2009).

O crtex cingulado anterior (CCA) possui uma organizao celular

intrnseca diferenciada, que provavelmente reflete uma neuroqumica particular.

Embora sua citoarquitetura seja laminar, desprovido de camada IV, que o

caracteriza como uma regio agranular. Apresenta neurnios com pequeno

tamanho na camada III e uma camada II mais espessa quando comparado

regio posterior (Vogt, 2004; Vogt, 2009). Alm disso, possui um denso plexo

dendrtico na camada Va e neurnios fusiformes na camada Vb orientados

verticalmente projetando-se para a substncia branca, o que no ocorre nos

crtex cingulado posterior e mediocingulado. Estudos com experimentao animal

ou com neuroimagem em humanos tm frequentemente utilizado a terminologia

crtex cingulado anterior rostral e/ou caudal. Essa denominao aceita que o

crtex cingulado anterior caudal uma extenso do CCA e no uma entidade

funcional independente. Estudos de imagem funcional em humanos e,

particularmente, um trabalho realizado por Palomero-Gallagher et al (2008)

sugerem que a regio referida como crtex cingulado anterior caudal possui

caractersticas morfolgicas, neuroqumicas e funcionais distintas, sendo coerente

referir-se a ela como crtex mediocingulado (Vogt, 2009).


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A funo do CCA na modulao da dor em humanos pode ser entendida

observando que pacientes submetidos cingulotomia para tratamento de dores

crnicas, referem conseguir identificar e localizar um estmulo doloroso, porm

esta sensao no parece ser incmoda, nem desagradvel (Ballantine et al,

1967). Um estudo verificou que neurnios do CCA de coelhos anestesiados com

halotano, eram ativados pela estimulao nociva em diferentes regies do corpo.

Assim, neurnios nesse substrato parecem no possuir uma organizao

somatotpica que permita discriminar a regio do corpo onde o estmulo foi

aplicado (Sikes e Vogt, 1992). Reaes autonmicas e comportamentos com

contedo emocional representam aspectos da percepo de dor, que

caracterizam o papel de uma subregio do CCA, conhecida como pregenual

(CCAp), que abrange as reas 24a, 24b e 32 (Vogt, 2009).

Estudos com diferentes abordagens experimentais, incluindo leso

eletroltica, estimulao eltrica e qumica no CCA, tm evidenciado seu papel na

modulao de processos lgicos (Pastoriza et al, 1995; Fuchs et al, 1996; Lee et

al, 1999). Particularmente, parece estar envolvido na aquisio e reteno de

memria nociceptiva, que surge como uma reao secundria dor. Um trabalho

realizado por Johansen et al (2001) verificou que a leso do CCA impediu o

aprendizado de esquiva, desencadeado pela associao do estmulo doloroso ao

contexto ambiental. Sugere-se que esse processo seja dependente de uma

atividade excitatria nos neurnios do CCA, tendo em vista que a microinjeo de

cido quinurnico (antagonista glutamatrgico) previamente s sesses de

condicionamento, impediu a aquisio do aprendizado de esquiva (Johansen e

Fields, 2004).

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Registros autorradiogrficos e de hibridizao in situ demonstram a

presena de receptores para uma variedade de transmissores com aes

diferentes nesse substrato neural (Bozkurt et al, 2005; Xie et al, 2009). Nesse

sentido, alguns mecanismos neuroqumicos subjacentes s respostas

nociceptivas tm sido investigados, para se compreender a circuitaria intrnseca

do CCA na percepo de dor. O sistema GABArgico parece atuar como um

importante sistema inibitrio, responsvel por exercer um efeito fisiolgico tnico,

sobre os neurnios piramidais do CCA, principalmente, os de projeo da camada

V (Higashi et al, 1991). Registros eletrofisiolgicos desses neurnios

demonstraram que a aplicao de bicuculina (antagonista GABA), facilitou os

potenciais excitatrios ps sinpticos promovidos por glutamato. Alm disso,

microinjees de muscimol (agonista GABAa) no CCA de ratos, impede a

aquisio de memria nociceptiva relacionada ao contexto ambiental (Wang et al,

2005).

Ainda no que se refere ao envolvimento do GABA nos circuitos do CCA,

responsveis por diferentes aspectos da dor, LaGraize e Fuchs (2007) induziram

neuropatia perifrica em ratos e avaliaram o efeito de agonistas GABArgicos na

sensibilidade mecnica e no condicionamento de esquiva, induzido por

estimulao mecnica nociva. Verificou-se que a aplicao de muscimol no CCA

bloqueava as respostas comportamentais aversivas, de associao entre

estmulos nocivos e o contexto ambiental, porm no influenciou respostas

nociceptivas de retirada da pata. Esses resultados sugerem que o CCA parece

exercer influncia, particularmente, em testes algesimtricos que envolvam

respostas comportamentais com contedo afetivo. Porm, essa especificidade

funcional apresenta-se inconsistente, tendo em vista que outras evidncias


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demonstram a estimulao eltrica ou qumica do CCA alterando respostas

nociceptivas reflexas (Calejesan et al, 2000).

O sistema de neurotransmisso colinrgico tambm tem sido explorado

com diferentes abordagens experimentais, referentes modulao central da dor

(Yaksh et al, 1985; Menescal de Oliveira e Hoffmann, 1995; Guimares e Prado,

1999; Guimares et al, 2000). Especificamente, as projees colinrgicas ao

crtex cingulado provem principalmente do complexo da banda diagonal de Broca

septum medial (Gaykema et al, 1990), onde exercem funes de aprendizado e

memria, essenciais nos comportamentos de esquiva e predio eliciados por

estimulao nociva. Como demonstraram Ortega-Legaspi et al (2003), a

microinjeo de escopolamina (antagonista muscarnico) previamente a um

estmulo nocivo trmico e desnervao do citico de ratos diminui o escore de

autotomia. Isto sugere o envolvimento do sistema colinrgico na aquisio de

memria nociceptiva, pois, quando esta droga foi administrada posteriormente

aos procedimentos citados, no foi capaz de modificar tal resposta. Corroborando

esses achados, Malin et al (2007) verificaram que a aplicao de agonista

colinrgico (oxotremorina) no CCA potencializa a aquisio de memria

relacionada com eventos emocionais, utilizando como modelo experimental o

treinamento de esquiva inibitria.

Nessa perspectiva, a estimulao qumica colinrgica, muscarnica ou

nicotnica, foi capaz de melhorar a reteno de memria, aps treinamento de

uma semana, com o animal sendo submetido a choques nocivos na pata, dentro

do labirinto em T elevado. Essa mesma resposta foi obtida quando microinjetou-

se antagonistas GABAa e GABAb (bicuculina e saclofeno, respectivamente) no

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CCA (Farr et al, 2000). Provavelmente, estes sistemas de transmisso interagem

entre si e com diversos outros, direta e indiretamente, via interneurnios e por

meio de projees extrnsecas. A interpretao mais precisa do funcionamento de

cada sistema de neurotransmisso e suas interaes, so obtidos com registros

eletrofisiolgicos. Nesse sentido, McCormick e Prince (1986), demonstraram que

a hiperpolarizao de curta latncia em neurnios piramidais da camada V do

CCA, promovida por estimulao colinrgica, era mediada por interneurnios

GABArgicos, tendo em vista que, a administrao prvia de seus antagonistas,

bicuculina ou picrotoxina, desencadeava surtos de despolarizao paroxsticas

epileptiformes. Sugere-se a partir desses resultados que a atividade de

interneurnios GABArgicos no CCA pode ser acentuada pela excitao

colinrgica.

Os efeitos da modulao opiide, em diferentes nveis de processamento

da dor, tambm tem sido extensivamente investigado (Millan, 2002). Num nvel

celular, este sistema age basicamente inibindo os potenciais de ao, por

aumentar a condutncia ao potssio e reduzir a corrente de clcio dependente de

voltagem (Tanaka e North, 1994). Nesse sentido a atividade opioidrgica parece

funcionar, em condies fisiolgicas, como um sistema regulatrio que se

encontra quiescente, at ser recrutado em situaes que exijam atenuar a

sensao de dor ou o estresse (Herz et al, 1997). No CCA a atividade opiide

parece refinar o balano entre atividade excitatria e inibitria, pois, capaz de

inibir potenciais excitatrios ps sinpticos mediados por glutamato, bem como,

potenciais inibitrios ps sinpticos desencadeados por ao GABArgica

(Tanaka e North, 1994). Um estudo com neuroimagem em humanos demonstrou

que a neurotransmisso opiide no CCA est diminuda durante estados afetivos


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com valncia negativa (Zubieta et al, 2003). Alm disso, a aplicao de morfina no

CCA de ratos por meio de microdilise induz uma reduo nos nveis

extracelulares de glutamato (Hao et al, 2005). Embora no sejam evidncias

diretas acerca da funo deste sistema em aspectos nociceptivos, esses achados

auxiliam na compreenso da neuroqumica intrnseca do substrato, o que,

eventualmente, permite associaes pertinentes dos mecanismos subjacentes a

antinocicepo.

Camundongos que receberam a microinjeo de agonistas e opiides

no CCA aumentaram a latncia para emitir respostas nociceptivas, quando

submetidos a uma plataforma com temperatura nociva (Lee et al, 1999). Os

autores inferem que esse efeito antinociceptivo tenha sido promovido por uma

reduo na atividade sinptica excitatria e/ou aumento na transmisso inibitria

do CCA. Adicionalmente, ratos com neuropatia, por ligadura do nervo que emerge

de L5, no alteraram o limiar nociceptivo para estimulao mecnica, quando

receberam microinjeo de morfina no CCA. Porm, a resposta de escape do

lugar, induzida por estimulao nociva foi reduzida, o que sugere a participao

da neurotransmisso opioidrgica do CCA, eminentemente, na aversividade da

resposta eliciada por estimulao nociva (LaGraize et al, 2006). Embora esses

resultados possam parecer contraditrios, uma interpretao parcimoniosa

permite aceit-los como complementares, tendo em vista, as particularidades

metodolgicas, referentes s espcies, variaes neuroanatmicas e natureza do

estmulo.

Conforme descrito acima, testes algesimtricos especficos se destinam a

verificar prioritariamente determinado componente da percepo de dor. Nesse

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contexto, a vocalizao tem sido apresentada na literatura como uma resposta

emitida por alguns animais, diante de situaes que possuem um contedo

emocional (Jrgens, 1998). Quando esta resposta emitida em conseqncia da

aplicao de estmulos nocivos perifricos aceitvel interpret-la como a

expresso do componente afetivo-motivacional da dor (Menescal-de-Oliveira e

Lico, 1977; Harte et al, 2004). Alm disso, redes neurais de processamento da

vocalizao e da dor, compartilham muitos substratos enceflicos (Jrgens,

2009). Logo, a utilizao de um teste algesimtrico que se destine a analisar

comportamentos nociceptivos, exclusivamente esqueletomotor, fornece uma

medida complementar, para verificar os mecanismos especficos desse

fenmeno. Nesse mbito, o teste de formalina, desencadeia a instalao de

alteraes patolgicas plsticas no sistema de transmisso nociceptiva, como

potenciao a longo prazo, wind up, aumento de campo receptivo e sensibilizao

central (Tjlsen et al, 1992). Esse mtodo no avalia o limiar de dor, mas permite

o avaliador quantificar as respostas comportamentais de um estmulo doloroso

inflamatrio persistente. Dubuisson e Dennis (1977) classificaram a intensidade da

dor objetivamente em categorias comportamentais, que so apresentadas pelos

animais e identificadas pelo avaliador. Os comportamentos recuperativos de

lamber e/ou sacudir a pata, eliciados pela administrao de formalina,

eventualmente so tratados na literatura como relacionados ao componente

sensorial da dor. Porm, existem evidncias acerca de estruturas lmbicas

corticais, sendo ativadas e modulando a manifestao desses comportamentos

(Yi et al, 2011).

Conforme exposto, a circuitaria intrnseca do CCA, envolvida na modulao

de submodalidades especficas da percepo de dor ainda necessita de algumas


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elucidaes. Nesse sentido, propusemos neste trabalho um delineamento

metodolgico que agregou algumas informaes acerca da neuroqumica do CCA

de cobaias, envolvidos em diferentes aspectos nociceptivos. No encontramos na

literatura nenhum trabalho cuja proposta foi verificar possveis influncias e

interaes da neurotransmisso GABArgica, colinrgica e opioidrgica do CCA,

modulando a resposta de vocalizao induzida pela aplicao de um estmulo

nocivo perifrico. Embora o teste da formalina, em ratos, tenha sido

extensivamente utilizado como uma ferramenta para se investigar dor

experimentalmente, em cobaias h poucos registros acerca das respostas

comportamentais provocadas pela administrao subcutnea de formalina na

pata.

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4. Objetivo
Verificar o envolvimento dos sistemas de neurotransmisso

GABArgico, colinrgico e opioidrgico do CCA na modulao de

respostas nociceptivas em cobaias (Cavia porcellus). Para tanto

foram utilizados os modelos algesimtricos de vocalizao e o teste

da formalina.

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5. Materiais e mtodos

5.1. Animais
No presente estudo, utilizamos cobaias macho (Cavia porcellus), pesando

entre 450-500 g, fornecidos pelo Biotrio da Faculdade de Medicina de Ribeiro

Preto. Os animais foram mantidos em caixas acrlicas, forradas com maravalha,

com temperatura controlada (24 10C), com ciclos de 12/12h de claro/escuro e

com acesso livre a gua e comida. As condies de manuteno dos animais e os

procedimentos experimentais obedeceram aos padres do guia para cuidados e

uso de animais de laboratrio, elaborado pelo Colgio Brasileiro de

Experimentao Animal (COBEA). O projeto foi aprovado pelo Comit de tica

em Experimentao Animal (CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

da Universidade de So Paulo (protocolo n 145/2010).

5.2. Procedimentos cirrgicos


Os animais foram profundamente anestesiados com uma associao de 0,2 ml

de cloridrato de ketamina e 0,15 ml de xilazina (intramuscular). Em seguida, foram

realizadas a tricotomia e assepsia da cabea, imediatamente aps a fixao da

mesma em um aparelho estereotxico (Davis-Kopff) adequado para animais de

pequeno porte. Posteriormente exposio da calota craniana, foi implantada a

cnula-guia no CCA esquerdo, por onde foram efetuadas as administraes das

drogas em estudo. A localizao do implante teve como referncia as

coordenadas do Atlas de Rssner (1965) para cobaias. Os parmetros

23
estereotxicos utilizados para atingir o CCA foram 1,2 mm anteriormente ao

bregma, 0,4 mm lateralmente linha mdia e 4,7 mm acima da linha intraural. O

comprimento da cnula-guia para o CCA foi de 10 mm. Os implantes foram

fixados com auxlio de uma prtese de acrlico e um parafuso rosqueado na

superfcie ssea. Em seguida, os animais receberam uma injeo subcutnea de

Banamine (Schering Plought, flunixina meglumina, 2,5 mg/Kg, 10 mg/ml, 0,2 ml)

que possui propriedades analgsicas e anti inflamatrias. O perodo de

recuperao foi de 5 a 7 dias, com livre acesso a comida e gua.

5.3. Microinjeo das drogas


A administrao das drogas foi realizada com uma seringa de Hamilton (5,0 ul)

conectado por meio de um segmento de polietileno de aproximadamente 45 cm

(PE-10), a uma agulha dental (Mizzi, USA) de 0,3 mm de dimetro externo e 11

mm de comprimento para atingir o CCA. A cnula da injeo foi preenchida com a

droga utilizada, enquanto que a microsseringa e a parte do polietileno foram

preenchidas com gua destilada com uma pequena bolha separando os dois

lquidos. A extremidade da agulha Mizzi foi 1 mm alm da extremidade inferior da

cnula guia para assim atingir o tecido cerebral. A microinjeo ocorreu em um

perodo de 15 segundos e a agulha foi deixada no local por mais 60 segundos

para evitar refluxo. Aps esse perodo, a agulha foi retirada e o animal submetido

aos testes de vocalizao ou da formalina.

5.4. DROGAS UTILIZADAS


- Muscimol - agonista preferencial de receptores GABAA (Sigma St. Louis -

USA);
24
- Bicuculina antagonista especfico de receptores GABAA (Sigma St. Louis -

USA);

- Carbacol agonista de receptores colinrgicos (Sigma St. Louis - USA);

- Atropina antagonista de receptores muscarnicos (Sigma St. Louis - USA);

- Morfina agonista preferencial de receptores -opiides (Sigma St. Louis -

USA);

- Naloxona antagonista preferencial de receptores -opiides (Sigma St.

Louis - USA);

- Formalina.

- Todas as drogas foram dissolvidas em soluo salina tamponada (NaCl a

0,9%), que foi usada tambm para controle do veculo das drogas microinjetadas.

- Todas as microinjees foram efetuadas em um volume de 0,2 l, de acordo

com trabalhos anteriores (Coutinho e Menescal-de-Oliveira, 2010; Favaroni

Mendes e Menescal-de-Oliveira, 2008).

- A formalina tambm foi diluda a 5% com soluo salina (NaCl 0,9%), a partir de

uma soluo me de formaldedo (37%).

5.5. Teste algesimtrico de vocalizao


O teste algesimtrico de vocalizao utilizado em nosso laboratrio, tem se

mostrado adequado para a mensurao de respostas nociceptivas em cobaias

(Menescal-de-Oliveira e Lico, 1977 e 1982; Menescal de Oliveira e Hoffmann,

1993). Esse teste consiste na aplicao de um estmulo agudo perifrico nocivo

(choque eltrico) que provoca a emisso de uma resposta de vocalizao pelo

animal, o que interpretado como expresso de dor.


25
Para a aplicao do estmulo nocivo perifrico, foi implantado, na regio

subcutnea da coxa do animal, um par de eletrdios de ao-inox, no isolados,

medindo 0,3 mm de dimetro e 10 mm de comprimento. Aps esse procedimento,

a cobaia foi parcialmente contida em uma caixa de acrlico preenchida com

espuma de nylon, onde permaneceu sem qualquer forma de manipulao por 20

minutos para habituao da situao experimental.

Aps o perodo de habituao, os animais foram submetidos a um estmulo

eltrico com corrente pulsada, forma de onda retangular, freqncia de 100 Hz e

durao do pulso de 0,5 ms. Inicialmente a intensidade do estmulo foi de 0,5 volt

(V) para o estabelecimento do limiar da resposta de vocalizao. Em caso de

ausncia da resposta, a intensidade da estimulao foi aumentada

gradativamente at que o animal emitisse alguma vocalizao ou at a

intensidade mxima de 4,0 V. As cobaias que no responderam at a intensidade

mxima (4,0 V), foram excludas do experimento.

Estabelecida a magnitude da estimulao nociva que evocou a resposta de

vocalizao do animal, mais duas estimulaes subsequentes foram realizadas

para confeco de uma linha de base ou registro controle. Na seqncia, a droga

em estudo foi administrada no stio previamente determinado, para em seguida,

realizar-se novos registros das amplitudes das vocalizaes nos intervalos de

tempo de 2, 5, 15, 30, 45, 60 e 75 minutos aps a microinjeo.

A vocalizao captada e convertida num sinal eltrico, por meio de um

microfone Aiwa DM-64, conectado a um pr-amplificador (Bioeletric Preamplifier

RB-5). Esses sinais so transmitidos para um dos canais do polgrafo (Nihon

Kohden) para registros grficos das respostas de vocalizao. A amplitude dos

26
picos do registro grfico proporcional intensidade de vocalizao do animal.

Dessa forma, a mdia dos picos de cada resposta representa um ndice confivel

da magnitude de vocalizao.

5.6. TESTE DA FORMALINA

As cobaias foram levadas para a sala de experimentao 20 minutos antes

do inicio do teste, para habituao numa caixa de acrlico (25 x 17 x 25 cm), onde

foram realizadas as sesses experimentais. Em seguida, receberam a

microinjeo das drogas testadas ou salina (NaCl 0,9%) no CCA. Um minuto aps

a microinjeo das drogas, os animais receberam uma injeo subcutnea - com

um volume de 50 l - de formalina diluda a 5%, na regio dorsal da pata traseira

direita. As sesses experimentais duraram 60 minutos, onde eram quantificados os

comportamentos nociceptivos, dentro de janelas de cinco minutos. Os animais

eram filmados com uma Webcam (Compaq), utilizando o software CyberLink

YouCam. Posteriormente, a anlise desses comportamentos era feita com o

auxlio do programa VLC mdia player, que permite reproduzir o filme em

diferentes velocidades e melhora a acurcia da anlise. Experimentos prvios

utilizando formalina tm caracterizado dois comportamentos induzidos (lambidas e

sacudidas) que indicam dor e podem ser objetivamente quantificados.

Classicamente o teste de formalina produz uma resposta de dor bifsica,

sendo a primeira, com uma durao mdia de 10 minutos e relacionada com a

ativao direta dos nociceptores. A segunda fase consiste no desenvolvimento de

um processo inflamatrio e, conseqentes alteraes plsticas no corno dorsal da

medula espinhal. Embora ratos apresentem um perodo quiescente entre essas


27
duas fases, estudos de validao do teste da formalina para outras espcies, como

gatos e cobaias, no exibem essa caracterstica (Dubuisson & Dennis, 1977;

Wheeler-Aceto e Cowan, 1991).

5.7. Grupos experimentais


5.7.1. Experimento I: Efeito do agonista preferencial de receptores
GABAa, muscimol e do antagonista bicuculina, microinjetados no CCA
sobre a resposta de vocalizao
Grupo 1: Microinjees de soluo salina a 0,9 % (0,2 l) previamente ao teste

de vocalizao.

Grupo 2: Microinjees de muscimol (0,5 nmol / 0,2 l) previamente ao teste

de vocalizao.

Grupo 3: Microinjees de muscimol (1 nmol / 0,2 l) previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 4: Microinjees de muscimol (2 nmol / 0,2 l) previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 5: Microinjees de bicuculina (1 nmol / 0,2 l), previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 6: Microinjees de muscimol (1 nmol / 0,2 l) 10 minutos antes de

microinjees de bicuculina (1 nmol / 0,2 l), previamente ao teste de vocalizao.

28
5.7.2. Experimento II: Efeito do agonista preferencial de receptores
GABAa, muscimol e do antagonista bicuculina, microinjetados no
CCA sobre o teste da formalina
Grupo 1: Microinjees de soluo salina a 0,9 % (0,2 l) previamente ao teste

da formalina.

Grupo 2: Microinjees de muscimol (1 nmol / 0,2 l) previamente ao teste da

formalina.

Grupo 3: Microinjees de bicuculina (1 nmol / 0,2 l) previamente ao teste da

formalina.

Grupo 4: Microinjees de muscimol (1 nmol / 0,2 l) 10 minutos antes de

microinjees de bicuculina (1 nmol / 0,2 l), previamente ao teste da formalina.

5.7.3. Experimento III: Efeito do agonista de receptores colinrgicos,


carbacol e do antagonista muscarnico atropina, microinjetados no
CCA sobre a resposta de vocalizao
Grupo 1: Microinjees de carbacol (2,7 nmol / 0,2l) , previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 2: Microinjees de atropina (0,7 nmol / 0,2l), previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 3: Microinjees de atropina (0,7 nmol / 0,2l) 10 minutos antes de

microinjees de carbacol (2,7 nmol / 0,2l), previamente ao teste de vocalizao.

5.7.4. Experimento IV: Bloqueio da atividade do agonista de receptores


colinrgicos, carbacol, com naloxona, um antagonista preferencial -
opiide microinjetados no CCA sobre o teste de vocalizao
Grupo 1: Microinjees de naloxona (2,7 nmol / 0,2l) 10 minutos antes de

microinjees de carbacol (2,7 nmol / 0,2l), previamente ao teste de vocalizao.


29
5.7.5. Experimento V: Efeito do agonista de receptores colinrgicos,
carbacol e do antagonista muscarnico, atropina, microinjetados no
CCA sobre o teste da formalina
Grupo 1: Microinjees de carbacol (2,7 nmol / 0,2l), previamente ao teste da

formalina.

Grupo 2: Microinjees de atropina (0,7 nmol / 0,2l), previamente ao teste da

formalina.

5.7.6. Experimento VI: Efeito do agonista preferencial de


receptores de opiides, morfina e do seu antagonista, naloxona,
microinjetados no CCA sobre o teste de vocalizao
Grupo 1: Microinjees de morfina (4,4 nmol / 0,2l), previamente ao teste de

vocalizao.

Grupo 2: Microinjees de naloxona (2,7 nmol / 0,2l) 10 minutos antes de

microinjees de morfina (4,4 nmol / 0,2l), previamente ao teste de vocalizao.

5.7.7. Experimento VII: Efeito do agonista preferencial de


receptores de opiides, morfina e do seu antagonista, naloxona,
microinjetados no CCA sobre o teste de formalina
Grupo 1: Microinjees de morfina (4,4 nmol / 0,2l), previamente ao teste de

formalina.

Grupo 2: Microinjees de naloxona (2,7 nmol / 0,2l) 10 minutos antes de

microinjees de morfina (4,4 nmol / 0,2l), previamente ao teste de formalina.

5.8. HISTOLOGIA
Aps a realizao do protocolo experimental, os animais foram anestesiados

profundamente com tiopental sdico (40 mg/Kg, ip) e submetidos a perfuso

trans-cardaca, atravs do ventrculo esquerdo, com soluo fisiolgica, para


30
retirada do sangue do animal. Em seguida, foi perfundida uma soluo de

formaldedo a 10%, para fixao dos tecidos do animal. Os crebros foram

retirados e mantidos em soluo de formaldedo (10%) por no mnimo 24 horas e

na soluo de sacarose por 2 dias. Aps este tempo, foi realizado cortes de 40

m no criostato (Mcron HM 505N) e corados com o mtodo de Nissl. Os cortes

foram analisados sob microscopia de luz (Axiovert 100, sistema de aquisio de

imagens KS-300 Zeiss), e os stios de microinjeo foram identificados segundo o

Atlas de Rssner (1965), para cobaias. Foram considerados para anlise dos

resultados, apenas os animais cuja microinjeo atingiu a estrutura alvo, nos

planos especficos da rea a ser investigada (-1,2 -2,6 mm referentes ao

bregma).

31
5.9. ANLISE DOS RESULTADOS

Nos experimentos de vocalizao, a amplitude dos picos no registro grfico da

vocalizao foi medida em milmetros (mm) e a mdia de cada resposta foi

interpretada como uma medida quantitativa de vocalizao. Os resultados em mm

foram transformados em ndice de vocalizao (Ivoc) utilizando a seguinte

frmula:

Ivoc = mdia de vocalizao valor da linha de base

Valor da linha de base

Os resultados do teste da formalina consistiram na quantificao dos

comportamentos recuperativos de lamber e/ou sacudir a pata durante 60 minutos,

dividido em janelas de cinco minutos. Para anlise desses dados foram feitas as

mdias dos grupos em cada janela de tempo e seus respectivos erros padro

(mdia erro padro da mdia).

A anlise estatstica dos dados foi realizada por meio de uma anlise de

varincia de duas vias para medidas (two-way ANOVA) e as diferenas

determinadas pelo ps teste DUNCAN. Alm disso, os dados foram considerados

estatisticamente diferentes quando o p 0,05.

32
6. Resultados
6.1. Experimento I

- Efeito do agonista preferencial de receptores GABAa, muscimol e do

seu antagonista, bicuculina, microinjetados no CCA sobre a resposta

nociceptiva de vocalizao

Nessa etapa experimental, observamos o decurso temporal do tratamento com

bicuculina, muscimol e salina no CCA de cobaias, sobre a resposta nociceptiva de

vocalizao induzida por um estmulo nocivo perifrico. Verificou-se, por meio do

two-way ANOVA para medidas repetidas, que o tratamento com bicuculina (1

nmol / 0,2 l) produziu um aumento significativo (F(280, 35) = 3,894; p < 0,001) na

amplitude dos registros de vocalizao induzida pela aplicao de um estmulo

nocivo perifrico, em relao ao grupo salina e linha de base (Figura 1). A

aplicao do ps teste de DUNCAN mostrou diferena entre as mdias

experimentais nos tempos, 2, 5, 15, 30 e 45 minutos, e as mdias controle nos

mesmos perodos. Observa-se ainda que a microinjeo de muscimol (1 nmol /

0,2 l), previamente bicuculina bloqueou o efeito pronociceptivo desta droga.

Dessa forma, muscimol + bicuculina quando microinjetados no CCA de cobaias

no promoveram alterao significativa (p > 0,05) na mdia das amplitudes de

vocalizao em relao ao grupo salina e controle (linha de base). Alm disso,

muscimol microinjetado no CCA em diferentes doses (0,5; 1 e 2 nmol / 0,2 l) no

foi capaz de alterar a resposta nociceptiva de vocalizao nos perodos avaliados,

33
em relao linha de base (Figura 2). Tambm no foi observada diferena

estatstica (p > 0,05) entre as mdias da amplitude de vocalizao entre os grupos

de animais tratados com muscimol e o grupo tratado com soluo salina.

A figura 3 mostra uma representao esquemtica do CCA, contendo os stios

das microinjees dos grupos citados nessa etapa experimental. As figuras 4 e 5

mostram registros de animais representativos do desempenho geral do grupo, no

que se refere a resposta de vocalizao. A fotomicrografia da figura 6 ilustra a

localizao de uma microinjeo no CCA de uma das cobaias utilizadas no

estudo.

34
Figura 1 Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do ndice de vocalizao

no perodo controle (LB) e aps os tratamentos com salina 0,9 % (Sal; n = 7), bicuculina

(Bic 1nmol; n=8) e 1 nmol de muscimol previamente a 1 nmol de bicuculina(Musc + Bic;

n=8) no CCA. As barras verticais representam o EPM. * representa p < 0,05 quando

comparado com os grupos salina, bicuculina e muscimol + bicuculina.

35
Figura 2 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do ndice de vocalizao

no perodo controle (LB) e aps os tratamentos com salina 0,9 % (Sal; n = 7), muscimol

(Musc 0,5 nmol; n=8), muscimol (Musc 1 nmol; n=8) e muscimol (Musc 2 nmol; n=6) no

CCA. As barras verticais representam o EPM.

36
Figura 3 Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II bicuculina

(1 nmol); III muscimol (1 nmol) seguido de bicuculina (1nmol); IV muscimol (0,5 nmol),

V muscimol (1 nmol); VI muscimol (2 nmol). AP = plano ntero posterior; CC = corpo

caloso; V = ventrculo lateral. Os esquemas foram modificados a partir do atlas de Rssner

(1965), para cobaias.

37
Figura 4 Registro poligrfico da amplitude (mm) de vocalizao de um animal

representativo de cada grupo aps a microinjees no CCA de cobaias. (A) salina, (B)

bicuculina (1 nmol) e (C) muscimol (1 nmol) seguido de bicuculina (1 nmol). As barras

horizontais indicam o perodo de aplicao do estmulo nocivo (3 seg) nos diferentes

intervalos de tempo (minutos). A linha de base (LB) representa o registro de vocalizao

antes da microinjeo das drogas.

38
Figura 5 - Registro poligrfico da amplitude (mm) de vocalizao de um animal

representativo de cada grupo aps a microinjees no CCA de cobaias. (A) salina, (B)

muscimol (0,5 nmol), (C) muscimol (1 nmol) e (D) muscimol (2 nmol). As barras

horizontais indicam o perodo de aplicao do estmulo nocivo (3 seg) nos diferentes

intervalos de tempo (minutos). A linha de base (LB) representa o registro de vocalizao

antes da microinjeo das drogas.


39
Figura 6 - Fotomicrografia de seco coronal do crebro de cobaia representativo do

grupo e do stio de uma microinjeo localizada no crtex cingulado anterior (CCA). ACB

= ncleo acumbens; CC = corpo caloso; CP = complexo caudado-putamen; V = ventrculo

lateral.

40
6.2. Experimento II

- Efeito do agonista preferencial de receptores GABAa, muscimol e do

antagonista bicuculina, microinjetados no CCA sobre o teste da formalina

Assim como no teste algesimtrico de vocalizao observamos o decurso

temporal do efeito da bicuculina, muscimol e salina, microinjetados no CCA, sobre

os comportamentos recuperativos de lamber e/ou sacudir a pata, aps

administrao de formalina na mesma. Novamente, a bicuculina (1 nmol / 0,2 l)

promoveu um efeito pronociceptivo, evidenciado pelo aumento no nmero de

lambidas e/ou sacudidas da pata que recebeu a injeo de formalina (Figura 7).

Verifica-se que as mdias nos intervalos de tempo, 0 5; 5 10 e 15 20

minutos, dos animais que foram tratados com bicuculina, quando comparados ao

grupo controle (salina) nesses mesmos tempos, apresentaram valores

significativamente maiores (F(275,3) = 8,524; p<0,001). Este efeito pronociceptivo

promovido pelo tratamento com bicuculina no CCA tambm foi bloqueado neste

teste, quando se microinjetou previamente o muscimol (1 nmol / 0,2 l). Logo, a

microinjeo de muscimol + bicuculina no CCA de cobaias no alterou as

respostas nociceptivas induzidos pela formalina, quando comparados ao grupo

controle (Figura 7). De forma semelhante ao que ocorreu no teste de vocalizao,

a microinjeo de muscimol, per se, (1 nmol / 0,2 l) no CCA no foi capaz de

promover nenhuma alterao significativa nas respostas nociceptivas de lambidas

e sacudidas, em relao aos animais que receberam tratamento com salina

(Figura 7).
41
A figura 8 mostra uma representao esquemtica do CCA, com os stios das

microinjees dos grupos experimentais descritos nesta seo de resultados.

42
Figura 7 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do nmero de lambidas e

sacudidas emitidas pelas cobaias aps injeo de formalina. Comparao de animais

tratados com salina 0,9 % (Sal; n = 5), bicuculina (Bic 1nmol; n=8); muscimol (Bic 1nmol;

n=8) e 1 nmol de muscimol previamente a 1 nmol de bicuculina (Musc + Bic n=8) no

CCA. As barras verticais representam o EPM. * representa p < 0,05 quando comparado

com os grupos salina, bicuculina, muscimol e muscimol + bicuculina.

43
Figura 8 - Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II bicuculina

(1 nmol); III muscimol (1 nmol); IV muscimol (1 nmol) seguido de bicuculina (1nmol).

AP = plano Antero posterior; CC = corpo caloso; V = ventrculo lateral. Os esquemas

foram modificados a partir do atlas de Rssner (1965), para cobaias.

44
6.3. Experimento III
- Efeito do agonista de receptores colinrgicos, carbacol e do

antagonista muscarnico atropina, microinjetados no CCA sobre a resposta

nociceptiva de vocalizao. Envolvimento de interneurnios opioidrgicos

O tratamento com o agonista inespecfico de receptores colinrgicos, carbacol

(2,7 nmol / 0,2 l), produziu antinocicepo avaliada pela reduo da amplitude

dos registros de vocalizao induzida pela aplicao de choque eltrico nocivo na

pata das cobaias. Quando comparados aos registros da linha de base, a

amplitude das vocalizaes nos tempos de 15, 30, 60 e 75 minutos, do grupo

tratado foram significativamente menores (Figura 9). De forma semelhante, em

comparao com o grupo salina, a amplitude dos registros de vocalizao dos

animais tratados com carbacol tambm apresentou uma reduo estatisticamente

significante (F(152,14) = 1,839; p<0,05). A microinjeo de antagonista muscarnico,

atropina (0,7 nmol / 0,2 l), no CCA, previamente ao tratamento com carbacol foi

capaz de bloquear o efeito antinociceptivo promovido por esta droga em relao

linha de base e ao grupo salina. Assim, atropina + carbacol no CCA no alterou a

amplitude dos registros de vocalizao quando comparados ao grupo salina

(Figura 9). Alm disso, a microinjeo de atropina, per se, tambm no alterou a

expresso comportamental nociceptiva das cobaias, evidenciada pela amplitude

dos registros de vocalizao.

45
Como forma de verificar se o efeito antinociceptivo promovido pela

microinjeo de carbacol no CCA era mediado pela participao de interneurnios

inibitrios, que no atuassem via neurotransmisso GABArgica, investigamos o

papel de um antagonista preferencial -opiide, naloxona (2,7 nmol / 0,2 l),

previamente ao tratamento com carbacol. Verificamos que microinjeo prvia de

naloxone tambm foi capaz de bloquear o efeito do carbacol na amplitude dos

registros de vocalizao. Ao longo de todo o decurso temporal de ao da droga

no houve nenhuma alterao estatisticamente significante entre esse grupo e o

grupo controle (Figura 10). Logo, naloxona + carbacol, microinjetados no CCA no

alterou a amplitude dos registros de vocalizao desencadeada por um estmulo

nocivo perifrico (p > 0,05).

A Figura 11 mostra uma representao esquemtica do CCA, com os stios

das microinjees dos grupos experimentais descritos nesta seo de resultados.

A Figura 12 mostra registros de animais representativos do desempenho geral do

grupo, no que se refere resposta nociceptiva de vocalizao.

46
Figura 9 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do ndice de vocalizao

no perodo controle (LB) e aps os tratamentos com salina 0,9 % (Sal; n = 7), carbacol

(CCh 2,7 nmol; n=8), atropina (Atr 0,7 nmol; n=7) e atropina 0,7 nmol previamente a 2,7

nmol de carbacol (Atr + CCh; n=9) no CCA. As barras verticais representam o EPM. *

representa p < 0,05 quando comparado com os grupos salina, carbacol, atropina e atropina

+ carbacol.

47
Figura 10 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do ndice de vocalizao

no perodo controle (LB) e aps os tratamentos com salina 0,9 % (Sal; n = 7), carbacol

(CCh 2,7 nmol; n=8) e naloxona 2,7 nmol previamente a 2,7 nmol de carbacol (Nal + CCh;

n=8) no CCA. As barras verticais representam o EPM. * representa p < 0,05 quando

comparado com os grupos salina, carbacol e naloxona + carbacol.

48
Figura 11 - Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II atropina

(0,7 nmol); III carbacol (2,7 nmol); IV atropina (0,7 nmol) seguido de carbacol (2,7

nmol); V naloxona (2,7 nmol) seguido de carbacol (2,7 nmol). AP = plano ntero

posterior; CC = corpo caloso; V = ventrculo lateral. Os esquemas foram modificados a

partir do atlas de Rssner (1965), para cobaias.

49
Figura 12 - Registro poligrfico da amplitude (mm) de vocalizao de um animal

representativo de cada grupo aps a microinjees no CCA de cobaias. (A) salina, (B)

carbacol (2,7 nmol), (C) atropina (0,7 nmol), (D) atropina (0,7 nmol) previamente ao

carbacol (2,7 nmol), (E) naloxona (2,7 nmol) previamente ao carbacol (2,7 nmol). As

barras horizontais indicam o perodo de aplicao do estmulo nocivo (3 seg) nos

diferentes intervalos de tempo (minutos). A linha de base (LB) representa o registro de

vocalizao antes da microinjeo das drogas.

50
6.4. Experimento IV
- Efeito do agonista de receptores colinrgicos, carbacol e do

antagonista muscarnico atropina, microinjetados no CCA sobre o teste da

formalina

A microinjeo de carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) no CCA, no foi capaz de

modificar as respostas nociceptivas induzidas pela aplicao de formalina na

regio dorsal da pata de cobaias. Portanto, no foram observadas alteraes

estatisticamente significantes (p>0,05). A Figura 13 mostra que tanto a

microinjeo de carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) quanto de atropina (0,7 nmol / 0,2 l)

no CCA no foram capazes de alterar o nmero de lambidas e/ou sacudidas

apresentadas pelas cobaias, ao longo de todo o tempo analisado.

A Figura 14 mostra uma representao esquemtica do CCA, com os stios

das microinjees dos grupos experimentais descritos nesta seo de resultados.

51
Figura 13 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do nmero de lambidas e

sacudidas emitidas pelas cobaias aps injeo de formalina. Comparao de animais

tratados com salina 0,9 % (Sal; n = 5), carbacol (CCh 2,7 nmol; n=8); atropina (Atr 0,7

nmol; n=8) no CCA. As barras verticais representam o EPM.

52
Figura 14 - Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II carbacol

(2,7 nmol); III atropina (0,7 nmol). AP = plano ntero posterior; CC = corpo caloso; V =

ventrculo lateral. Os esquemas foram modificados a partir do atlas de Rssner (1965),

para cobaias.

53
6.5. Experimento V
- Efeito do agonista preferencial de receptores opiides, morfina e

do seu antagonista, naloxona, microinjetados no CCA sobre a resposta

nociceptiva de vocalizao

Nessa etapa experimental verificou-se, por meio do two-way ANOVA para

medidas repetidas, que o tratamento com morfina (4,4 nmol / 0,2l) no CCA das

cobaias promoveu um efeito antinociceptivo (F(98,7) = 5,117; p<0,001), evidenciado

pela reduo na amplitude de vocalizao, desencadeada pela aplicao de um

estmulo nocivo agudo na periferia (Figura 15). A aplicao do ps-teste de

Duncan evidenciou que este efeito ocorreu durante todo o decurso de tempo do

nosso protocolo experimental, em relao ao grupo salina e linha de base. Nota-

se ainda que a microinjeo prvia de naloxona (2,7 nmol / 0,2l) preveniu o

efeito antinociceptivo promovido pela morfina. Dessa forma, naloxona + morfina

quando microinjetados no CCA de cobaias no alteraram significativamente (p >

0,05) a mdia das amplitudes de vocalizao, quando comparadas ao grupo

salina e linha de base.

A figura 16 mostra uma representao esquemtica do CCA, contendo os

stios das microinjees dos grupos citados nessa etapa experimental. A figura 17

mostra registros de animais representativos do desempenho geral do grupo, no

que se refere a resposta de vocalizao.

54
Figura 15 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do ndice de vocalizao

no perodo controle (LB) e aps os tratamentos com salina 0,9 % (Sal; n = 7), morfina

(Mor 4,4 nmol; n=9) e naloxona 2,7 nmol previamente a 4,4 nmol de morfina (Nal + Mor;

n=8) no CCA. As barras verticais representam o EPM. * representa p < 0,05 quando

comparado com os grupos salina, morfina e naloxona + morfina.

55
Figura 16 - Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II morfina

(4,4 nmol); III naloxona (2,7 nmol) seguido de morfina (4,4 nmol). AP = plano ntero

posterior; CC = corpo caloso; V = ventrculo lateral. Os esquemas foram modificados a

partir do atlas de Rssner (1965), para cobaias.

56
Figura 17 - Registro poligrfico da amplitude (mm) de vocalizao de um animal

representativo de cada grupo aps a microinjees no CCA de cobaias. (A) salina, (B)

morfina (4,4 nmol), (C) naloxona (2,7 nmol) previamente morfina (4,4 nmol). As barras

horizontais indicam o perodo de aplicao do estmulo nocivo (3 seg) nos diferentes

intervalos de tempo (minutos). A linha de base (LB) representa o registro de vocalizao

antes da microinjeo das drogas.

57
6.6. Experimento VI

- Efeito do agonista preferencial de receptores opiides,

morfina e do seu antagonista, naloxona, microinjetados no CCA sobre


o teste de formalina

Verificamos que a microinjeo de morfina no CCA das cobaias tambm

promoveu um efeito antinociceptivo no teste da formalina. Conforme mostrado na

figura 18, os animais que receberam esse tratamento apresentaram uma reduo

estatisticamente significante do nmero de lambidas e/ou sacudidas da pata em

que foi aplicada a formalina, utilizando o teste estatstico two way ANOVA para

medidas repetidas (F(198,22) = 3,964; p<0,001). De acordo com o ps teste de

DUNCAN esse efeito foi evidenciado nos intervalos de tempo, 0 5, 15 20, 20

25, 25 30, 30 35, 35 40, 40 45 minutos, quando comparados aos animais

tratados com soluo salina. Observamos ainda, assim como no teste

algesimtrico de vocalizao, que a microinjeo prvia do antagonista

preferencial de receptores opiides, naloxona, foi capaz de prevenir o efeito

antinociceptivo promovido pela morfina. Logo, a microinjeo de naloxona +

morfina no CCA no alterou os comportamentos nociceptivos induzidos pela

formalina, quando comparados ao grupo controle (Figura 18).

A figura 19 mostra uma representao esquemtica do CCA, com os stios das

microinjees dos grupos experimentais descritos nesta seo de resultados.

58
Figura 18 - Decurso temporal da mdia ( erro padro da mdia) do nmero de lambidas e

sacudidas emitidas pelas cobaias aps injeo de formalina. Comparao de animais

tratados com salina 0,9 % (Sal; n = 5), morfina (Mor 4,4 nmol; n=8) e naloxona 2,7 nmol

previamente a 4,4 nmol de morfina (Nal + Mor; n=8) no CCA. As barras verticais

representam o EPM. * representa p < 0,05 quando comparado com os grupos salina,

morfina e naloxona + morfina.

59
Figura 19 - Representao esquemtica de seces do CCA de cobaias. Os crculos

preenchidos () indicam os stios das microinjees: I - Salina (NaCl 0,9%); II morfina

(4,4 nmol); III naloxona (2,7 nmol) seguido de morfina (4,4 nmol). AP = plano ntero

posterior; CC = corpo caloso; V = ventrculo lateral. Os esquemas foram modificados a

partir do atlas de Rssner (1965), para cobaias.

60
7. Discusso
Nossos dados corroboram a idia de que o CCA influencia respostas

nociceptivas. Estudos com neuroimagem funcional em humanos e em animais de

experimentao evidenciam um papel crtico no controle de sistemas motores

vinculados a expresso das emoes, incluindo vocalizao e dor, alm de que,

sua atividade est relacionada com o contedo negativo da emoo que

acompanha a dor (Vogt e Vogt, 2009). O comportamento de vocalizao embora

seja considerado uma resposta de contedo emocional, pode expressar

comportamentos de cunho hedonstico, como cpula, e/ou situaes

desagradveis, como separao de filhotes da me e dor (Jrgens, 2009). Nesse

sentido, no verificamos vocalizaes espontneas nos animais que receberam

microinjeo de bicuculina (antagonistas GABAA) no CCA, sendo este

comportamento expresso somente durante a aplicao do estmulo nocivo

perifrico. Essa observao nos permite interpretar que esse tratamento tenha

influenciado diretamente a expresso nociceptiva do animal. Nossos resultados

tambm evidenciam algumas propriedades funcionais da neuroqumica intrnseca

do CCA, envolvida na modulao de respostas nociceptivas. Com base em

nossos dados e na literatura revisada, os sistemas de neurotransmisso

GABArgico, colinrgico e opioidrgico influenciam a elaborao de diferentes

modalidades comportamentais nociceptivas neste substrato.

Verificamos que o bloqueio da atividade GABArgica no CCA, por meio da

administrao de bicuculina, um antagonista especfico de receptores GABAA,

exacerbou as respostas comportamentais nociceptivas de cobaias. Esse efeito

61
pronociceptivo foi evidenciado pelo aumento na amplitude das vocalizaes

induzidas por um estmulo nocivo perifrico, bem como pelo nmero de lambidas

e/ou sacudidas provocadas pela administrao subcutnea de formalina na regio

dorsal da pata das cobaias. A alterao comportamental nociceptiva promovida

pela administrao de um antagonista GABArgico, per se, sugere que nessa

estrutura possa haver uma liberao tnica desse neurotransmissor, durante a

aplicao de um estmulo nocivo perifrico. Corroborando esses dados, registros

eletrofisiolgicos in vitro de clulas do CCA de ratos mostraram aumento da

freqncia, amplitude e comprimento dos potenciais de ao, aps a

administrao de bicuculina, indicando a existncia de um tnus GABArgico

nesse substrato (Higashi et al, 1991; Wang et al, 2005). O efeito pronociceptivo da

bicuculina no CCA, pode ser compreendido, aceitando que o bloqueio da

neurotransmisso GABArgica inibitria facilitou os potenciais excitatrios ps-

sinpticos, promovidos por estimulao nociva. Nessa perspectiva, evidncias

demonstram que durante a estimulao nociceptiva ocorre um aumento nos

nveis extracelulares de glutamato no CCA, que eleva a atividade do substrato e

exacerba a sensao dolorosa (Zhang et al, 2005; Xu et al, 2008).

A participao de interneurnios GABArgicos no CCA tem sido avaliada com

diferentes modelos algesimtricos (Wang et al, 2005; LaGraize e Fuchs, 2007),

porm h poucos registros acerca da administrao isolada de um antagonista

GABArgico modulando respostas nociceptivas (Jasmin et al, 2003). Nesse

sentido, a microinjeo do agonista preferencial de receptores GABAA, muscimol,

no CCA de ratos no foi capaz de alterar as respostas nociceptivas no teste da

formalina, nem a sensibilidade mecnica de ratos neuropticos, testada com

filamentos de Von Frey (LaGraize e Fuchs, 2007). Esses resultados esto de


62
acordo com nossas observaes de que a microinjeo de diferentes doses de

muscimol no foi capaz de influenciar a magnitude da resposta de vocalizao

desencadeada por um estmulo nocivo perifrico, nem as respostas induzidas

pela injeo de formalina na pata das cobaias. Em contrapartida, nos trabalhos

referidos, o tratamento com muscimol no CCA reduziu a capacidade dos animais

desenvolverem aversividade ao local onde recebiam estimulao nociva. Diante

desses achados os autores concluram que a estimulao GABArgica do CCA

capaz de atenuar o componente afetivo da dor, sem alterar a capacidade do

animal reconhecer o estmulo nocivo (Wang et al, 2005; LaGraize e Fuchs, 2007).

Nosso modelo algesimtrico de vocalizao, embora esteja mais envolvido

como a expresso do componente afetivo motivacional da dor em cobaias,

tambm no apresentou nenhuma alterao na amplitude dos registros de

vocalizao nos grupos tratados com muscimol. Dados de outros modelos

algesimtricos, foram comparados aos nossos, para analisarmos a funo do

substrato em diferentes condies. Dessa forma, atribumos essas diferenas a

questes metodolgicas, que determinam os circuitos recrutados para modular

adequadamente a melhor estratgia de comportamento, com base no contexto

ambiental. Nesse sentido, testes que utilizam o paradigma de escape/esquiva

induzido por estimulao nociva realizam sesses de condicionamento, com os

estmulos geralmente no sendo aplicados durante a quantificao dos

comportamentos (Farr et al, 2000). Nesse caso, no h aumento da

neurotransmisso excitatria no CCA, desencadeada por estimulao nociva, que

se oporia ao efeito inibitrio promovido pela administrao de agonistas

GABArgicos. Com isso, sugerimos que o nosso tratamento com muscimol no

tenha sido capaz de subrepujar as descargas excitatrias no CCA, promovidas


63
pela aplicao de um estmulo nocivo de alta intensidade (choque eltrico), bem

como pela ao da formalina.

Verificamos ainda que a exacerbao das respostas nociceptivas induzidas

por bicuculina, nos dois testes algesimtricos, foi bloqueada pela administrao

prvia de muscimol. A partir dos mecanismos farmacolgicos dessas drogas - nos

quais os dois frmacos competem pelo mesmo stio de ligao no receptor -

sugerimos que o muscimol tenha ocupado o stio de ligao dos receptores

GABAA e, reduzido o contedo de bicuculina ligada a esses receptores, bem

como dado incio a alguma resposta celular inibitria. Adicionalmente, o muscimol

tambm capaz de se ligar aos receptores GABAC, o que no ocorre com a

bicuculina. Sugerimos que o muscimol, em sinergismo com o pool endgeno de

GABA, anulou o efeito promovido pela bicuculina, mas no foi capaz de impedir

que os neurnios do CCA disparassem descargas excitatrias, tendo em vista

que os animais responderam estimulao nociceptiva. A validao desta

hiptese requer a elucidao de mecanismos eletrofisiolgicos e bioqumicos,

com tcnicas de alta acurcia, que no constutui o foco principal de nossas

investigaes no presente trabalho.

Outros estudos tm utilizado o teste da formalina, principalmente em ratos,

para se investigar o papel do CCA na modulao de processos nociceptivos

(Tjlsen et al, 1992). interessante salientar que nesse teste existem algumas

particularidades na expresso das respostas nociceptivas emitidas por cobaias,

em relao aos ratos. Embora, ambas as espcies manifestem a dor,

principalmente, por meio de lambidas e/ou sacudidas na pata, a quantidade

desses comportamentos expressos ao longo do tempo variam entre elas. Ratos

64
apresentam duas fases bem definidas, relacionadas com diferentes aspectos da

nocicepo, conforme descrito anteriormente. Observa-se na Figura 7 que

imediatamente aps a injeo de formalina as cobaias emitem uma grande

quantidade de respostas nociceptivas, que reduzem significativamente aps cinco

minutos. Alm disso, em termos qualitativos, observamos nesse perodo uma

grande agitao do animal, que se manifestou por locomoo desorientada e

cinesiologicamente alterada, saltos errticos e alguns episdios de vocalizao.

Aps os cinco primeiros minutos os animais tenderam a permanecer mais tempo

num local, expressando numa freqncia reduzida as respostas de lambidas e/ou

sacudidas. A transio entre essas duas fases no acompanhada por um

perodo de remisso das respostas, conforme se observa em nos ratos.

A microinjeo de agonista colinrgico, carbacol, no CCA de cobaias atenuou

o aspecto desagradvel da dor, evidenciado pela reduo na amplitude dos

registros de vocalizao induzida por um estmulo nocivo perifrico. A

neurotransmisso colinrgica no sistema nervoso central atua por meio da

ativao de receptores nicotnicos e muscarnicos (ionotrpicos e metabotrpicos,

respectivamente). A atividade colinrgica no CCA mediada principalmente por

neurnios de projeo subcortical, que ativados favorecem funes como

aquisio e reteno de memria, bem como atuam na modulao nociceptiva

(Farr et al, 2000). Antinocicepo produzida pelo tratamento com agentes

colinrgicos tm sido descrita em alguns ncleos enceflicos (Menescal-de-

Oliveira e Hoffmann, 1995; Guimares e Prado, 1999; Harte et al, 2011). Ratos

nos quais se microinjetou carbacol na substncia cinzenta periaquedutal dorsal

apresentaram um aumento no limiar de vocalizaes induzidas por estimulao

nociva, sendo esse efeito revertido pela microinjeo de antagonistas


65
colinrgicos, bem como pelo antagonista preferencial opiide, naloxona

(Guimares et al, 2000). Nesse contexto, a microinjeo de naloxona no ncleo

central da amgdala e no hipocampo dorsal de cobaias submetidas ao mesmo

modelo algesimtrico de vocalizao utilizado nesse estudo, tambm foi capaz de

bloquear a antinocicepo promovida por ao do carbacol nesses substratos.

(Leite-Panissi et al, 2004; Favaroni Mendes e Menescal-de-Oliveira, 2008). Diante

dessas evidncias a antinocicepo promovida por estimulao colinrgica no

CCA tambm pode ter sido dependente de sua interao com o sistema de

transmisso opioidrgico.

Numa outra direo, ratos submetidos desnervao do citico reduziram

o escore de autotomia, quando tratados com escopolamina (antagonista

colinrgico) no CCA (Ortega-Legaspi et al, 2003). Os mecanismos celulares

subjacentes a esse efeito se correlacionam positivamente com a expresso de

RNAm e protenas dos receptores M1 e M2 (Ortega-Legaspi et al, 2010).

Adicionalmente, ratos submetidos ao teste de esquiva inibitria, numa plataforma

contendo compartimentos, claro e escuro, aumentaram a latncia de reteno de

memria nociceptiva quando se microinjetou um agonista colinrgico,

oxotremorine, no CCA (Malin et al, 2007). A metodologia desse trabalho consistiu

na aplicao de choques nocivos e reteno do animal (15 segundos), quando

este acessava o compartimento escuro da plataforma e, em seguida,

administrava-se oxotremorine no CCA dos animais. Aps 48 horas os animais

eram novamente colocados na plataforma de teste, verificando-se que o grupo

que recebeu esse tratamento evitou o acesso ao compartimento escuro. Esses

dados sugerem que a neurotransmisso colinrgica no CCA est envolvida na

consolidao de memria nociceptiva. No devemos interpretar os resultados


66
expostos como paradoxais, tendo em vista os detalhes metodolgicos entre os

modelos expostos.

Confirmamos tambm que a antinocicepo promovida pela microinjeo de

carbacol foi mediada, preferencialmente, por receptores muscarnicos. A Figura 9

ilustra o bloqueio deste efeito pela administrao prvia do antagonista

muscarnico, atropina. Ainda nesse sentido, verificamos que o efeito do carbacol

evidenciou-se 15 minutos aps a microinjeo, prolongando-se at 75 minutos.

Essa caracterstica temporal possui uma caracterstica mais prxima com uma

sinalizao celular mediada por receptores metabotrpicos (Kandell et al, 2003).

possvel que em situaes nociceptivas agudas, como as apresentadas em nosso

modelo, a neurotransmissso colinrgica no CCA atenue o desconforto oriundo

da percepo de dor. Porm, sabe-se que a ligao do carbacol a receptores

muscarnicos promove despolarizaes na clula ps sinptica e, que a excitao

de neurnios piramidais do CCA exacerba o desconforto motivado pela dor

(Zhang e Sgula, 2010). Diante destes achados, nossa hiptese que a

administrao de carbacol no CCA tenha excitado preferencialmente

interneurnios inibitrios, nas diferentes camadas, impedindo que os neurnios de

projeo do substrato desencadeassem potenciais de ao. Embora haja

registros eletrofisiolgicos de interneurnios GABArgicos no CCA de cobaias

sendo ativados por estimulao colinrgica (McCormick e Prince, 1986), nossos

resultados mostraram que a estimulao GABArgica no CCA, per se, no foi

capaz de reduzir as respostas nociceptivas nos testes de vocalizao e da

formalina.

67
A microinjeo de naloxona no CCA, previamente ao tratamento com

carbacol, tambm reverteu a antinocicepo. Nesse caso, sugerimos que a

sinalizao colinrgica aumentou a disponibilidade de opiides endgenos no

substrato, atenuando o componente afetivo-motivacional da dor, evidenciado pela

reduo na amplitude dos registros de vocalizao induzida por estmulos nocivos

perifricos. No encontramos na literatura pesquisada nenhuma investigao

propondo analisar essa interao no CCA em nvel eletrofisiolgico, bioqumico ou

funcional. Porm, dados anatmicos acerca da distribuio de receptores opiides

no CCA, bem como a eletrofisiologia da sinalizao opioidrgica isolada

forneceram consistncia s nossas inferncias (Tanaka e North, 1994; Palomero-

Gallagher et al, 2008). Ainda no que se refere possvel interao entre esses

sistemas, existe uma predominncia de receptores muscarnicos em clulas pr

sinpticas do CCA, bem como 60% dos seus neurnios opiides, nas camadas

profundas, so interneurnios locais (Vogt e Vogt, 2009). Diante disso, cresce a

probabilidade de que estimulao colinrgica no CCA tenha ativado

interneurnios opiides locais.

Ainda nessa perspectiva, nosso trabalho tambm evidenciou a ao

antinociceptiva da morfina, quando microinjetada no CCA. Esse efeito, alm de

mostrar o papel da neurotransmisso opiide nos modelos algesimtricos

investigados, aparece como mais um indicativo de que a ao do carbacol no

teste de vocalizao foi mediada por opiides. Com base na literatura podemos

inferir que nossos dados comportamentais so coerentes com os mecanismos

subjacentes sinalizao opiide na circuitaria intrnseca do CCA. Em termos

neuroanatmicos, esse substrato neural possui um grande nmero de neurnios

opioidrgicos, distribudos por todas as camadas corticais. Alm disso, neurnios


68
nociceptivos tlamo-corticais, que liberam glutamato, possuem uma alta

densidade de receptores em seu terminal axnico (Vogt et al, 1995).

Funcionalmente, a organizao desses receptores justifica a reduo nos nveis

extracelulares de glutamato no CCA, em ratos submetidos ao tratamento agudo

com morfina por via sistmica (Hao et al, 2005). Ainda no que se refere aos

neurnios opiides do CCA, eles possuem uma morfologia bipolar ou multipolar,

que os permite modular aferencias, eferncias e circuitos locais (Vogt et al, 1995).

Diante disso, evidncias de registros extracelulares multiunitrios no CCA de

ratos submetidos ao teste da placa quente, demonstraram que a administrao

sistmica de morfina, alm de aumentar a latncia para emitir a resposta

nociceptiva, foi capaz de reduzir a magnitude da resposta neural, a frao de

neurnios responsivos e a durao (Wang et al, 2009).

Um trabalho realizado por LaGraize et al, 2006 demonstrou que a

microinjeo de morfina no CCA promoveu um efeito antinociceptivo em ratos

com neuropatia induzida pela ligadura do nervo que emerge de L5. A

interpretao desses resultados evidenciou que os animais tratados no evitavam

e/ou esquivavam do compartimento em que recebiam estimulao mecnica

nociva. Logo, a estimulao do sistema opiide no CCA diminui a capacidade do

animal realizar a associao entre estimulao nociva e o contexto ambiental.

Assim como no presente trabalho, a administrao prvia de naloxona foi capaz

de prevenir o efeito promovido pela morfina, o que confirma os referidos efeitos

sendo mediados pela ativao dos receptores opiides (LaGraize et al, 2006).

Nossos resultados referentes ao teste da formalina tambm evidenciaram

antinocicepo promovida pela microinjeo de morfina no CCA, sendo revertida

69
pela aplicao prvia de naloxona. Embora, o tratamento com carbacol no tenha

apresentado efeito no teste da formalina, esse achado no invalida nossa

hiptese acerca da interao entre esses sistemas. Conforme exibido nas figuras

9 e 15, a antinocicepo promovida pela morfina possui uma maior magnitude

quando comparada ao carbacol. Para tanto, salientamos que a maior densidade

de receptores opiides distribudos nos diferentes tipos neuronais do CCA parece

ter sido um fator importante na determinao dessas particularidades. Nesse

sentido, inferimos que a estimulao com morfina exgena tenha hiperpolarizado

no s o neurnio de projeo descendente, como tambm as aferncias

nociceptivas, que liberam principalmente colecistocinina e glutamato (Erel et al,

2004). Em contrapartida, o carbacol agiu eminentemente nos neurnios opiides

locais do CCA, estimulando a liberao desses peptdeos produzidos

endgenamente. Logo, essa manipulao farmacolgica no se mostrou

suficiente para conter as descargas excitatrias nociceptivas e,

consequentemente, reduzir as respostas nociceptivas.

Verificamos ainda que a microinjeo isolada de um antagonista

muscarnico, atropina, no CCA no foi capaz de modificar as respostas

nociceptivas investigadas. Essa observao sugere que no h liberao tnica

de acetilcolina, sendo este sistema recrutado em situaes que impliquem

mudanas no funcionamento da estrutura. Nesse sentido, o desenvolvimento de

aversividade a um ambiente, determinado por estimulao nociva, parece ser

dependente da neurotransmisso colinrgica no CCA (Malin et al, 2007). Porm,

nosso protocolo experimental no envolveu sesses de pr-condicionamento,

evitando que o animal pudesse realizar alguma associao ao contexto ambiental

no qual foram aplicados os estmulos nocivos. Embora tenhamos utilizado testes


70
algesimtricos com propriedades funcionais distintas, nenhum deles representa

um modelo de dor crnica. Essas caractersticas metodolgicas tambm podem

ter determinado a ausncia do efeito da atropina, tendo em vista que a

microinjeo de um antagonista colinrgico foi capaz de reduzir as respostas

nociceptivas induzidos por um modelo de dor neuroptica crnica em ratos

(Ortega-Legaspi et al, 2003).

O teste da formalina em cobaias no apresentou sensibilidade para

manifestar o efeito de agentes colinrgicos no CCA. Os comportamentos

recuperativos de lambidas e/ou sacudidas no sofreram influncia do tratamento

com carbacol nem atropina. Nossos resultados com microinjeo de bicuculina,

bem como trabalhos com estimulao eltrica e leso do CCA, mostraram que

este substrato neural pode estar envolvido na modulao das respostas

comportamentais nociceptivas induzidas pela formalina (Fuchs et al, 1996).

Conforme observamos, a segunda fase do teste apresenta uma resposta

comportamental mais branda. Paralelamente, o efeito produzido pelo carbacol no

teste de vocalizao ocorreu 15 minutos aps a microinjeo, o que coincide com

o incio da fase inflamatria do teste da formalina em ratos. Desse modo, no

pudemos verificar o real efeito do carbacol na ativao direta dos nociceptores

promovida pela administrao subcutnea de formalina. Entretanto, esses

resultados corroboram um estudo realizado por Kender et al, 2008, em que a

microinjeo carbacol na rea tegmentar ventral foi capaz de aumentar o limiar

nociceptivo para as respostas de vocalizao desencadeadas por um estmulo

nocivo perifrico, sem interferir nos reflexos motores espinhais.

O componente afetivo motivacional da dor se refere ao indivduo interpret-

la como uma experincia emocional desagradvel, motivada por estimulao de

71
alta intensidade e/ou memrias negativas (Vogt, 2009). Nesse mbito, respostas

imunes, endcrinas e neurais interagem bidirecionalmente, desencadeando

reaes de desbalano autonmico e desconforto (Chapman et al, 2008).

Entretanto, o desencadeamento dessas reaes dependente e indissocivel da

capacidade do indivduo discriminar se um estmulo nocivo. Diferentes

submodalidades cognitivas esto contidas nesse componente, incluindo o

desenvolvimento de aversividade (esquiva) a um contexto ambiental no qual se

aplicou previamente estmulos nocivos, bem como a expresso de um

comportamento com contedo emocional negativo durante a estimulao. Logo,

diferentes protocolos experimentais elucidam uma parcela desse componente e, a

interpretao dos resultados deve levar em considerao essas particularidades

(LeBars, 2001).

A literatura tem destacado diferentes modelos algesimtricos para se

investigar experimentalmente esse componente da dor (Johansen et al, 2001;

Borscz, 1995). Nosso modelo de vocalizao deve ser compreendido como uma

reao comportamental de contedo emocional, emitida numa situao de dor

aguda, na qual o animal no pode escapar da fonte de estmulo. Em

contrapartida, os estudos tm frequentemente demonstrado o papel do CCA na

modulao de respostas nociceptivas antecipatrias, que visam a esquiva do

perigo em potencial (Johansen e Fields, 2004; Wang et al, 2005). Um estudo

desenvolvido em nosso laboratrio evidenciou que a microinjeo de agonista de

aminocidos excitatrios (DLH) no CCA de cobaias diminuiu a durao dos

episdios do comportamento defensivo de imobilidade tnica (Coutinho e

Menescal-de-Oliveira, 2010). Esse comportamento emitido por algumas

espcies, quando no existe mais a possibilidade de evitar o contato com o

72
predador e, quando emitido, pode ativar o sistema de analgesia endgena (Leite-

Panissi et al, 2000). Desse modo o CCA parece tambm influenciar a estratgia

comportamental no momento da situao aversiva. Podemos fazer um paralelo

com esses dados para compreender a circuitaria neuroqumica envolvida no

nosso modelo de vocalizao. A condio em que o animal recebe a estimulao

nociva limita seu repertrio comportamental e o impossibilita de esquivar-se da

fonte de estmulo. Nesse sentido, se extrapolarmos para uma situao na

natureza, descargas excitatrias no CCA promovidas pela estimulao nociva,

desencadearia as vocalizaes, como uma reao inata de dor, que

possivelmente alerta coespecficos sobre um ataque predatrio (Jrgens, 2009).

Nossos resultados reforaram o papel funcional do CCA na modulao de

processos nociceptivos com natureza distinta. A compreenso mais sensvel do

funcionamento dessa estrutura numa situao real requer a correlao dos dados

experimentais, com os achados clnicos e epidemiolgicos. No mbito da

pesquisa experimental, nota-se uma carncia de trabalhos que realizem

simultaneamente anlises bioqumicas, eletrofisiolgicas e comportamentais, para

um mesmo modelo algesimtrico. Estudos com esse delineamento experimental

permitem avaliar os mecanismos celulares e moleculares, subjacentes

estratgia comportamental emitida, fornecendo maiores subsdios s inferncias.

Por meio dos modelos algesimtricos empregados no presente trabalho foi

evidenciado que os sistemas de neurotransmisso do CCA interagem entre si,

sendo o resultado final do funcionamento deste circuito, a elaborao e expresso

de um comportamento coerente com o contexto ambiental e as necessidades

internas do organismo (Devinsky et al, 1995). O sistema GABArgico parece

modular o substrato em condies fisiolgicas e, mesmo com administrao do

73
seu agonista, no foi capaz de alterar as reaes comportamentais secundrias

ao estresse nociceptivo agudo. Porm, a inibio desse sistema exacerba as

respostas nociceptivas investigadas, possivelmente, devido facilitao de

descargas excitatrias no CCA. Alm disso, a estimulao colinrgica do CCA

reduziu a resposta nociceptiva de vocalizao, sem interferir nos comportamentos

induzidos pela formalina. Sugerimos que esse efeito tenha sido mediado pela

ativao do sistema de opiides endgenos, tendo em vista a eficcia do

naloxona em bloque-lo. A estimulao opiide neste substrato, com microinjeo

de morfina, promove antinocicepo nos dois modelos algesimtrcios

investigados, sugerindo que sua ativao seja importante para mediar analgesia

em situaes de dor aguda e/ou tnica.

74
8. Concluses
Evidenciamos que os padres de comportamento se diferenciaram em

funo do tipo de estmulo nocivo aplicado (qumico ou eltrico). Observamos

tambm que os diferentes sistemas de neurotransmisso atuam em cada

submodalidade da percepo de dor de maneira particular. Desse modo,

verificamos que o bloqueio do tnus GABArgico, com microinjeo de bicuculina

no CCA, produziu pronocicepo evidenciada pelo aumento da expresso de dor

nos dois modelos algesimtricos utilizados. Alm disso, a administrao exgena

de muscimol no foi capaz de alterar as respostas nociceptivas avaliadas.

No que se refere ao envolvimento do sistema colinrgico, a microinjeo de

carbacol no CCA promoveu uma reduo na amplitude dos registros de

vocalizao induzida por estimulao nociva, sem alterar as respostas

nociceptivas induzidas por formalina. O efeito antinociceptivo do carbacol sobre a

resposta nociceptiva de vocalizao foi bloqueado pela microinjeo prvia de

atropina. A microinjeo do antagonista preferencial -opiide, naloxona, tambm

bloqueou o efeito promovido pelo carbacol no mesmo teste algesimtrico,

evidenciando que esta antinocicepo pode ter sido mediada pelo sistema de

opiides endgenos no CCA.

Demonstramos ainda que a microinjeo de morfina no CCA foi capaz de

promover antinocicepo nos dois modelos algesimtricos estudados, sendo esse

efeito revertido pela administrao prvia de naloxona. Assim, a

neurotransmisso opiide no CCA possui propriedades analgsicas

contundentes, que podem ser exploradas posteriormente com outras abordagens

experimentais.

75
9. Referncias Bibliogrficas
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81
10. Apndice

10.1 Tabelas

Tabela I. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
salina (NaCL 0,9% / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 0 0,5 0,6 0,6 -0,3 0 0,5
2 0 0 0 0,1 -0,1 -0,3 0 0
3 0 -0,3 -0,4 -0,3 -0,7 -0,4 -0,3 -0,4
4 0 0 0,6 0,5 -0,5 0,1 0 0,6
5 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0,1
6 0 0 0 0 0,1 -0,1 0 0
7 0 -0,1 0 0 0 -0,3 -0,1 0
Mdia 0,00 -0,06 0,11 0,14 -0,07 -0,17 -0,06 0,11
DPM 0,00 0,11 0,34 0,31 0,43 0,21 0,11 0,34
EPM 0,00 0,04 0,13 0,12 0,16 0,08 0,04 0,13

Tabela II. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
bicuculina (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0,00 0,56 0,81 1,20 0,77 0,35 -0,15 -0,23
2 0,00 2,18 1,80 2,58 0,71 0,96 -0,56 -0,92
3 0,00 0,72 0,06 1,07 0,85 0,55 0,55 0,42
4 0,00 3,20 0,89 3,96 1,28 2,78 0,94 0,83
5 0,00 0,66 1,12 0,96 0,82 0,03 -0,50 -0,42
6 0,00 1,35 1,35 0,69 1,69 2,14 2,14 2,14
7 0,00 0,21 0,08 -0,26 -0,63 -1,00 -1,00 -1
8 0,00 3,37 2,21 4,14 5,43 3,85 2,97 0,34
Mdia 0,00 1,53 1,04 1,79 1,37 1,21 0,55 0,15
DPM 0 1,23 0,75 1,59 1,77 1,59 1,40 1,03
EPM 0 0,43 0,26 0,56 0,62 0,56 0,49 0,36

82
Tabela III. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do
estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
muscimol (1 nmol / 0,2 l), seguido de bicuculina (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 -0,04 -0,3 -0,07 0,38 0,23 0,64 0,04
2 0 -0,13 0,1 -0,26 -0,27 -0,22 0,14 0,11
3 0 0,21 -0,21 0,02 0,33 -0,21 0,046 -0,3
4 0 0,06 0,01 0,07 -0,12 -0,13 -0,13 0,14
5 0 -0,12 0,06 -0,13 -0,11 -0,11 -0,1 0,22
6 0 0,008 -0,14 0,2 0,04 -0,14 -0,03 0,01
7 0 0,25 0,1 0,28 0,31 0,31 0,08 0,32
8 0 -0,01 -0,003 -0,13 0,07 0,45 0,03 -0,003
Mdia 0 0,02 -0,047 -0,002 0,078 0,0225 0,084 0,067
DPM 0 0,13 0,150 0,181 0,240 0,264 0,241 0,184
EPM 0 0,04 0,053 0,06 0,085 0,093 0,085 0,065

Tabela IV. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
muscimol (0,5 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0,00 0,00 -0,88 -1,00 -1,00 -1,00 -1 -0,01
2 0,00 -0,26 -0,62 -0,94 -1,00 -0,84 -0,96 0,03
3 0,00 0,02 -0,06 -0,72 -1,00 -0,72 -0,79 0
4 0,00 -0,36 -0,70 -0,02 -0,04 0,02 0,10 0,24
5 0,00 0,16 0,07 0,09 0,45 0,09 0,06 -0,11
6 0,00 -0,02 -0,24 -0,12 -0,13 -0,29 -0,96 -0,23
7 0,00 1,14 1,14 1,27 0,57 1,23 0,49 0,035
8 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 -0,22 -0,42
Mdia 0,0 0,1 -0,2 -0,2 -0,3 -0,2 -0,4 -0,1
DPM 0,0 0,5 0,6 0,7 0,7 0,7 0,6 0,2
EPM 0,0 0,2 0,2 0,3 0,2 0,3 0,2 0,1

83
Tabela V. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do
estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
muscimol (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Animais LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 0,10 -0,08 -0,35 -0,13 -0,28 -0,81 -1,00
2 0 0,13 0,65 -0,66 -0,58 -0,21 -0,33 0,00
3 0 0,04 -0,57 -0,84 -1,00 -0,62 -0,75 0,25
4 0 -0,09 0,29 0,50 -0,35 -0,03 -0,35 -0,03
5 0 -0,57 -0,18 -0,52 0,06 -0,004 -0,13 -0,28
6 0 -0,71 -0,72 -0,22 0,16 -0,11 -0,39 -0,2
7 0 -0,22 -0,43 -0,27 -0,34 -0,5 -0,62 -0,55
8 0 0,4 0,27 0,19 0,1 0,28 0,1 0,05
Mdia 0,0 -0,1 -0,1 -0,3 -0,3 -0,2 -0,4 -0,2
DPM 0,0 0,4 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 0,2
EPM 0,0 0,1 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1

Tabela VI. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do estmulo


nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de muscimol (2
nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 -0,15 -0,41 0,11 -0,25 -0,13 -1 -0,3
2 0 -0,06 -0,04 -0,007 -0,41 -0,04 -0,51 -0,19
3 0 -1 0,21 0,33 -0,03 0,27 -0,17 0,1
4 0 0,35 0,25 0,21 0,21 -0,8 -0,16 -0,75
5 0 -0,1 -0,2 -1 -1 -1 -1 -1
6 0 0,05 -0,21 -0,01 -0,01 -0,22 -0,24 -0,52
Mdia 0 -0,15 -0,07 -0,06 -0,25 -0,32 -0,51 -0,44
DPM 0 0,45 0,26 0,48 0,43 0,48 0,40 0,40
EPM 0 0,18 0,11 0,20 0,17 0,20 0,16 0,16

84
Tabela VII. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do
estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 0,6 -1 -1 -1 -0,67 -0,62 -0,93
2 0 -0,09 -0,25 -0,72 -0,43 -0,13 -0,01 -0,35
3 0 -0,63 -0,1 -0,61 -0,26 -1 -0,69 -0,84
4 0 1,5 -0,01 -0,02 -0,33 -0,33 -0,4 -0,3
5 0 0,8 0,77 0,03 -1 -0,74 -0,65 -0,69
6 0 -0,34 -0,34 -0,29 -0,26 -0,28 -0,4 -0,19
7 0 -0,03 0 -0,34 -0,01 0,33 0,33 0
8 0 -0,37 -0,23 -0,55 -0,35 -0,56 -0,86 -0,43
Mdia 0 0,18 -0,14 -0,43 -0,45 -0,42 -0,41 -0,46
DPM 0 0,72 0,49 0,35 0,36 0,41 0,39 0,33
EPM 0 0,25 0,17 0,12 0,12 0,14 0,13 0,11

Tabela VIII. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
atropina (0,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 0,08 0,32 0,17 0,36 0,33 0,10 -0,10
2 0 -0,15 -0,11 -0,01 -0,24 -0,27 -0,24 -0,36
3 0 0,23 -0,04 -0,63 0,10 -0,17 -0,35 0,06
4 0 0,18 -0,50 0,00 0,04 0,26 0,17 0,00
5 0 -0,42 0,29 0,21 0,71 0,75 0,52 0,65
6 0 -0,001 0,28 0,36 0,01 0,01 0,01 0,01
7 0 -0,15 -0,07 0,08 -0,37 -0,23 -0,3 -0,31
Mdia 0,0 -0,1 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0
DPM 0,0 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,3 0,4
EPM 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,0

85
Tabela IX. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do
estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
atropina (0,7 nmol / 0,2 l), seguido de carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 -0,027 0,02 0,3 0,12 0,07 0,23 0,05
2 0 -0,036 -0,027 -0,027 -0,027 -0,027 -0,027 -0,01
3 0 -0,07 -0,07 -0,001 0,17 0,26 0,08 0,1
4 0 0,021 0,22 -0,027 -0,027 -0,027 -0,027 -0,1
5 0 -0,005 -0,01 -0,02 -0,005 0,004 0,16 0,16
6 0 -0,32 -0,44 -0,16 -0,32 -0,06 -0,04 -0,31
7 0 -0,07 0,03 0,25 -0,1 -0,1 -0,1 -0,05
8 0 -0,12 0,17 0,14 0,18 -0,09 -0,08 -0,07
9 0 -0,02 0,2 -0,02 -0,03 0,16 -0,01 0,2
Mdia 0 -0,071 0,010 0,048 -0,004 0,021 0,020 -0,003
DPM 0 -0,071 0,010 0,048 -0,004 0,021 0,020 -0,003
EPM 0 -0,023 0,003 0,016 -0,001 0,007 0,006 -0,001

Tabela X. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
naloxona (2,7 nmol / 0,2 l), seguido de carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 -0,08 0,14 -0,12 0,15 -0,08 0,13 -0,08
2 0 -0,01 -0,07 -0,007 -0,01 -0,02 0,09 -0,09
3 0 -0,002 0,14 -0,02 0,05 -0,02 -0,02 -0,24
4 0 0,005 -0,002 -0,002 -0,01 0,24 0,24 0,13
5 0 -0,03 0,01 0,19 0,01 -0,06 0 -0,003
6 0 -0,005 0,032 -0,005 -0,005 -0,05 -0,04 -0,03
7 0 0,043 0,043 0,06 0,06 0,06 0,05 -0,01
8 0 0 0,09 0 -0,01 -0,02 -0,03 -0,03
Mdia 0 -0,009 0,047 0,012 0,029 0,006 0,052 -0,043
DPM 0 0,034 0,072 0,087 0,056 0,103 0,097 0,103
EPM 0 0,012 0,025 0,030 0,019 0,036 0,034 0,036

86
Tabela XI. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do
estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
morfina (4,4 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 -1 -1 -1 -0,71 0,25 -1 -0,56
2 0 0,4 -0,42 -1 -0,78 -0,93 -0,55 -0,85
3 0 -0,6 -0,22 -0,27 -0,6 -0,86 -0,6 -0,2
4 0 -1 -1 -1 -1 -0,78 -1 -1
5 0 -0,96 -0,77 -0,57 -0,38 -0,38 -0,15 -0,67
6 0 -0,6 -0,61 -0,62 -0,66 -0,78 -1 -1
7 0 -0,39 -0,57 -0,29 -1 -0,6 -1 -1
8 0 0,022 -0,89 -0,73 -0,66 -1 -1 -0,66
9 0 -0,35 -1 -1 -1 -1 -1 -1
Mdia 0 -0,49 -0,72 -0,72 -0,75 -0,67 -0,81 -0,77
DPM 0 0,48 0,28 0,30 0,21 0,40 0,30 0,27
EPM 0 0,16 0,09 0,10 0,07 0,13 0,10 0,09

Tabela XII. Valores individuais do ndice de vocalizao durante a aplicao do


estmulo nocivo perifrico, nos diferentes tempos (minutos) aps a microinjeo de
naloxona (2,7 nmol / 0,2 l), seguido de morfina (4,4 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia LB 2 5 15 30 45 60 75
1 0 0,03 0,06 0,07 0,06 0,07 0,07 0,08
2 0 -0,16 -0,28 -0,1 0,17 0,13 0,11 0,18
3 0 0,1 0,02 0,06 -0,23 0,04 0,04 -0,24
4 0 0,1 -0,17 -0,08 0 -0,08 -0,34 0,11
5 0 0,05 0,06 -0,05 -0,04 -0,6 -0,007 0,01
6 0 0,18 0,07 -0,08 -0,53 -0,09 -0,09 0,07
7 0 0,18 0,06 0,11 0,14 0,14 0,18 0,11
8 0 -0,56 -0,09 -0,31 -0,27 -0,23 0,07 0,06
Mdia 0 -0,01 -0,03 -0,04 -0,08 -0,07 0,00 0,04
DPM 0 0,24 0,13 0,13 0,23 0,24 0,16 0,12
EPM 0 0,08 0,04 0,04 0,08 0,08 0,05 0,04

87
Tabela XIII. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na pata,
medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de salina (NaCl 0,9% / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 0-5 5 -10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60


1 52 11 58 59 69 94 79 83 33 58 33 23
2 74 15 9 17 24 29 68 43 28 27 11 0
3 60 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 101 50 0 0 0 2 0 0 0 5 0 0
5 188 9 30 33 58 31 14 27 36 17 42 39
Mdia 95 17 19,6 21,8 30,2 31,2 32,2 30,6 19,4 21,4 17,2 12,4
DPM 55,22 19,24 24,62 24,91 32,17 37,99 38,33 34,58 17,93 23,00 19,33 17,89
EPM 22,54 7,85 10,05 10,17 13,13 15,51 15,64 14,12 7,32 9,39 7,89 7,30

88
Tabela XIV. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de bicuculina (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 0-5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 30 30 - 35 35 - 40 40 - 45 45 - 50 50 - 55 55 60
1 85 118 167 135 135 136 102 89 101 79 75 70
2 276 90 26 59 27 25 65 71 20 72 81 75
3 245 82 74 41 33 33 1 60 39 34 22 28
4 180 68 52 106 15 14 55 19 23 18 38 28
5 163 0 0 34 55 31 0 34 43 21 33 31
6 93 29 3 99 104 2 17 62 43 48 52 37
7 134 26 21 27 8 4 0 5 7 3 6 0
8 121 13 53 24 42 56 18 74 127 84 104 64
Mdia 162,12 53,25 49,5 65,62 52,37 37,62 32,25 51,75 50,37 44,87 51,37 41,62
DPM 69,03 42,04 53,98 42,14 44,70 43,42 37,69 29,27 41,79 30,71 33,04 25,79
EPM 24,40 14,86 19,08 14,89 15,80 15,35 13,32 10,35 14,77 10,86 11,68 9,12

89
Tabela XV. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de muscimol (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 0-5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 30 30 - 35 35 - 40 40 - 45 45 - 50 50 - 55 55 60
1 112 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 73 0 0 0 0 0 32 29 17 12 7 3
3 81 0 0 0 0 0 0 20 23 6 1 2
4 106 8 0 11 26 0 0 0 0 7 7 5
5 79 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 26 6 0 0 0 0 0 2 22 0 0 0
7 153 6 26 16 0 0 0 0 3 6 7 0
8 166 11 20 28 25 19 20 17 11 14 2 9
Mdia 99,5 3,87 5,75 6,87 6,37 2,37 6,5 8,5 9,5 5,62 3 2,37
DPM 45,27 4,42 10,76 10,57 11,80 6,71 12,45 11,68 10,07 5,44 3,38 3,24
EPM 35,17 1,37 2,03 2,43 2,25 0,83 2,29 3,00 3,35 1,98 1,06 0,83

90
Tabela XVI. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de muscimol (1 nmol / 0,2 l), seguido de
bicuculina (1 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 0-5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 30 30 - 35 35 - 40 40 - 45 45 - 50 50 - 55 55 60
1 192 13 9 0 0 0 6 7 8 17 13 9
2 62 9 25 38 55 17 11 31 18 13 3 4
3 122 4 5 18 72 79 52 66 74 78 76 68
4 158 4 2 11 3 6 9 5 4 3 8 10
5 151 24 19 6 8 14 4 11 5 13 32 29
6 132 21 16 5 6 0 5 1 20 21 25 34
7 180 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
8 166 12 0 4 2 8 14 12 5 21 17 19
Mdia 145,37 10,87 9,5 10,25 18,37 15,5 12,62 16,62 16,75 20,75 21,75 21,62
DPM 40,82 8,42 9,48 12,68 28,33 26,46 16,49 22,18 24,15 24,37 24,41 22,16
EPM 14,43 2,97 3,35 4,48 10,01 9,35 5,83 7,84 8,54 8,61 8,63 7,83

91
Tabela XVII. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de carbacol (2,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 0-5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 30 30 - 35 35 - 40 40 - 45 45 - 50 50 - 55 55 - 60
1 65 9 3 11 10 16 11 6 20 39 31 28
2 96 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 110 32 12 8 10 15 16 2 6 15 25 14
4 140 0 13 7 4 2 3 4 48 25 17 9
5 167 54 7 11 19 20 20 18 11 13 9 15
6 139 173 5 16 3 0 0 2 7 6 21 23
7 149 30 45 67 47 49 37 29 16 57 55 54
8 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mdia 112 38 10,62 15 11,62 12,75 10,875 7,62 13,5 19,37 19,75 17,87
DPM 46,44 57,73 14,72 21,71 15,64 16,84 13,14 10,41 15,62 20,07 18,13 17,62
EPM 39,59 13,43 3,75 5,30 4,11 4,50 3,84 2,69 4,77 6,85 6,98 6,31

92
Tabela XVIII. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de atropina (0,7 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 05 5 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60
1 172 33 36 14 29 25 17 33 18 10 47 30
2 110 2 5 9 36 48 35 34 31 19 6 3
3 109 84 34 45 26 12 30 26 28 43 20 28
4 109 15 2 0 2 18 12 12 13 18 12 10
5 175 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0
6 150 37 33 37 44 58 51 43 38 34 36 42
7 169 12 0 33 78 83 65 41 51 22 30 19
8 150 5 7 0 0 22 27 22 21 12 4 0
Mdia 143 23,5 14,62 17,25 26,87 33,25 29,62 26,87 25 19,75 19,37 16,5
DPM 29,37 28,01 16,50 18,43 26,88 27,48 21,01 13,71 15,69 13,61 16,89 15,76
EPM 10,38 9,90 5,83 6,51 9,50 9,71 7,43 4,84 5,54 4,81 5,97 5,57

93
Tabela XIX. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de morfina (4,4 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 05 5 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60
1 54 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 38 0 0 3 6 5 4 11 6 8 7 8
4 27 0 0 1 0 0 2 1 2 5 2 1
5 5 0 0 1 3 16 2 0 0 0 0 0
6 25 0 0 0 3 0 0 0 0 0 4 3
7 42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
8 44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mdia 34 0 0 0,62 1,5 2,62 1 1,5 1 1,62 1,62 1,5
DPM 14,92 0 0 1,06 2,26 5,68 1,51 3,85 2,13 3,11 2,61 2,82
EPM 5,27 0 0 0,37 0,80 2,00 0,53 1,36 0,75 1,10 0,92 1

94
Tabela XX. Valores individuais do nmero de lambidas e sacudidas, aps a administrao de formalina (5% / 0,5 l) na
pata, medido em diferentes intervalos de tempo (minutos) aps a microinjeo de naloxona (2,7 nmol / 0,2 l), seguido de
morfina (4,4 nmol / 0,2 l) no CCA.

Cobaia 05 5 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60
1 85 24 7 9 40 42 6 9 21 24 29 29
2 131 8 0 0 0 0 0 0 0 0 8 4
3 115 23 19 9 8 33 40 51 45 42 21 18
4 107 1 7 17 7 19 12 16 16 19 27 22
5 125 1 0 0 0 0 16 23 21 19 3 21
6 93 4 16 8 19 22 27 25 24 23 25 12
7 112 18 15 16 28 30 18 24 17 19 28 27
8 114 29 14 28 31 32 31 27 25 19 16 12
Mdia 110,25 13,5 9,75 10,87 16,62 22,25 18,75 21,85 21,12 20,62 19,62 18,12
DPM 15,27 11,30 7,32 9,32 15,15 15,40 13,29 14,97 12,43 11,40 9,76 8,40
EPM 5,40 3,99 2,58 3,29 5,35 5,44 4,70 5,29 4,39 4,03 3,45 2,97

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