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Introdução À Análise de Dados de Sequenciadores de Nova Geração PDF
Introdução À Análise de Dados de Sequenciadores de Nova Geração PDF
Verso 2.0.1
Leonardo Varuzza
Abril 2013
2
Sumrio
1 Introduo 5
1.1 O que NGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Como funciona o NGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.1 Preparo da amostra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2.2 Amplificao de biblioteca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.3 Sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.4 Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.5 SOLiD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3 Aplicaes do NGS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.1 Ressequenciamento genmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.2 Target Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.3 RNA Seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3.4 Sequenciamento denovo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3.5 Metagenoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2 Arquivos de Sequncia 15
2.1 Fasta e FastQ Files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.1 Fasta format . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.1.2 FastQ format . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.2 SFF File . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.1 Converter arquivo SFF para Fasta ou FastQ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3 Unmapped BAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4 XSQ Format . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3 Mapeamento de Sequncias 23
3.1 SAM e BAM Files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.1.1 Estrutura do arquivo SAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.1.2 BAM File . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.1.3 Samtools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.1.4 Picard . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2 Mapeando os reads com o TMAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.1 Criando o ndice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.2 Mapeando os reads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.3 Exemplo: Mapeando os reads de E. coli com o TMAP . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.2.4 Mapeando dados de Long Mate Pair . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.3 Bowtie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.3.1 Utilizando o Bowtie 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.3.2 Utilizando o Bowtie 2 com o Ion Torrent . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4 Visualizando arquivos BAM com o IGV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.4.1 Importanto o genoma de referncia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3
4 Arquivos de Anotao de Genomas 39
4.1 BED Formats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2 Formatos GFF e GTF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.3 Gerando arquivos de anotao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3.1 Obtendo anotaes do UCSC Browser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.4 Manipulando arquivos BED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4.1 Extrair sequncias da regies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
5 Deteco de Varincias 45
5.1 VCF Files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.1.1 Manipulando arquivos VCF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.1.2 Indexando as variantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.2 Utilizando o samtools para detectar SNPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.2.1 Gerando um arquivo consenso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.3 Utilizando o GATK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.3.1 Chamando Variantes no GATK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.3.2 Anotando as variantes com o dbSNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.4 Utilizando Ion Varriant Caller . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.5 Anotando os SNPs com o snpEff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
6 Montagem denovo 55
6.1 Montando o genoma com o Mira . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
6.1.1 Montando uma biblioteca de fragmentos utilizando o Mira 3.4 . . . . . . . . . . . . 56
6.1.2 Montando uma biblioteca de mate-pair utilizando o Mira 3.4 . . . . . . . . . . . . 57
6.1.3 Fazendo uma montagem mista com o Mira 3.4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.1.4 Fazendo uma montagem mista com o Mira 3.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
6.1.5 Interpretando os resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
6.1.6 Comparando a montagem com uma referncia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
6.1.7 Visualizando a montagem no Tablet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
7 Apndices 65
7.1 Ordem dos gentipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.2 Pileup format . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
7.3 Samtools VCF file . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
7.4 Script para converter os nomes dos cromossomos em um arquivo VCF . . . . . . . . . . . 67
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Captulo 1
Introduo
Sequenciadores de DNA so equipamentos que leem uma amostra de DNA e geram um arquivo eletrnico
com simbolos que representam a sequncia de bases nitrogenadas A, C, G, T contidas na amostra. O
primeiro mtodo popular de sequenciamento da DNA foi o de terminao de cadeia de Sanger, publicado
em 1977. Em 1986 foi lanado o primeiro sequenciador automtico de DNA, o ABI 370, e em 1998, o
primeiro sequenciador de eletroforese capilar, o ABI 3700. Com a automatizao foi possvel realizar
grandes projetos de sequenciamento, como o genoma humano, do camundongo e outros. Para realizar
esses projetos foram montados grandes centros com dezenas de mquinas instaladas e ao custo de bilhes
de dolres.
Na figura 1.1 vemos a evoluo do custo por megabase sequenciada. Nota-se um primeiro decrsimo
em 2004, ano do lanamento do sequenciador 454 da Roche e um decrsimo mais acentuado a partir
de 2006 e 2007, anos em que foram lanados os sequenciadores de nova gerao da Illumina e da Life
Technologies. No grfico, vemos tambm qual seria a reduo de custo, se a tecnologia de sequenciamento
tivesse evoluido segundo a lei de Moore[23]. V-se que a evoluo do sequenciamento de DNA foi muito
mais acelerada do que dos processadores de computadores. A implicao disso que os sequenciadores
evoluiram muito mais rpido do que os computadores que analisam os dados gerados, da a necessidade
computacional para lidar com os dados gerados ter se tornado muito maior do que h 10 anos.
Apesar da reduo impressionante no custo por megabase, o custo por reao, tambm chamdado do
custo de apertar o boto start, ainda bastante alto, da ordem de dezenas de milhares de dlares. Ou
seja, ampliou-se muito a capacidade dos sequenciadores, permitindo at o sequenciamento de mais de um
genoma por corrida, mas sem reduzir muito o custo de operao do equipamento. Um fator limitante na
reduo desse custo o uso de reagentes caros, como bases marcadas por fluorforos. No final de 2010,
foi lanado o PGM, da Ion Torrent, o primeiro sequenciador a detectar a incorporao dos nucleotdeos
atravs de um semicondutor, reduzindo, dessa forma, a complexidade do equipamento e o custo da reao
de sequencimento.
uma nica molecula de DNA, porm todas as tecnologias propostas sofreram de problemas de baixa acurcia e baixo
throughput.
2 Uma excesso essa regra o sequenciamento de amplicons, nesse caso o objetivo sequenciar pequenas regies que
6
Figura 1.2: Processo da amostra de Long Mate Pair.
Um artefato que pode surgir nessa etapa so as duplicaes de reads causadas por artefatos de PCR.
Esses artefatos podem gerar distores na cobertura do genoma e impactar as anlises de variaes do
genoma ou de expresso do transcriptoma. Por conta disso, as pipelines de anlises normalmente possuem
uma etapa em que os reads duplicados so marcados, e consequentemente ignorados nas anlises finais.
O caso de Multiple beads controlado pelo tamanho do reator, de forma que caiba somente uma esfera
por reator. As empty beads so eliminadas atravs de uma operao de enriquecimento para beads com
template incorporado. Por fim, as beads policlonais so controladas por meio de um processo estatstico,
que segue uma distriuiode Poisson. Basicamente temos muito mais beads do que templates . Por
exemplo, se tivermos 10 vezes mais beads do que templates, espera-se que somente 0,47% das beads
sejam policlonais. Claro que o efeito secundrio que 90% das beads estejam vazias, porm essas beads
so eliminadas por meio do processo de enriquecimento.
O principal fator que afeta a etapa de amplificao a quantificao do DNA. Se o DNA for subquan-
tificado, ou seja, existe mais DNA na amostra do que o reportado, o resultado vai ser um aumento da
quantidade de beads policlonais. Por outro lado, se o DNA for sobrequantificado, ou seja, se existe menos
DNA do que o reportado, o resultado vai ser uma quantidade muito pequena de beads com fragmentos.
Na tabela 1.1 vemos a porcentagem esperada de beads policlonais e empty beads, se tivermos uma relao
1 para 1 entre beads e fragmentos esperasse que mais de 26% das beads sejam policlonais.
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Razo Policlonal (%) Empty (%)
10 0.47 90.5
5 1.75 81.9
4 2.65 77.9
3 4.46 71.7
2 9.02 60.7
1 26.4 36.8
Tabela 1.1: Relao entre a razo beads/fragmentos, a probabilidade de beads policlonais e a probabili-
dade de empty beads.
1.2.3 Sequenciamento
O sequenciador um instrumento que executa uma srie de reaes qumicas. Estes geram sinais que so
detectados e determinam a sequncia de bases template se est sendo analisado. A seguir, vamos mostra
o processo de sequenciamento de dois intrumentos que tm abordagens completamente diferentes: o Ion
Torrent e o SOLiD.
Outro ponto importante para determinar a sequncia sincronizar a polimerase com a deteco,
tanto no Ion Torrent quanto no 454 essa sincronizao feita pelo controle do tipo disponvel para a
polimerase. Por exemplo, suponha que o incio do fragmento que se deseja sequenciar seja AGT e que o
sequenciador disponiblize uma certa quantidade de dTTP. A polimerase vai fazer o pareamento do A com
o T e o sinal vai ser detectado pelo transitor ISFET. Para continuar a reao, a polimerase necessita de
um dCTP, porm esse reagente no est disponvel e, portanto, a reao para e a leitura da incorporao
feita. Em seguida, ocorre uma lavagem, e a base seguinte injetada, e assim por diante em uma srie
3 A reao de polimerizao tambm gerar um fosfato e esse o caminho de deteo utilizado pelo 454, com a diferena
que a emisso do fosfato no detectada diretamente, mas indiretamente atravs da ativao de uma luciferase que gera
luz
8
de fluxos. Podemos ver na figura 1.4 uma representao dos sinais detectados pelo sensor de um nico
poo. essa informao de intensidade de sinal que convertida depois na sequncia de bases.
Uma questo relevante para os sequenciadores que utilizam fluxos de dNTPs so os homopolme-
ros, sequencias contnuas de bases iguais como AAAA, CCCCC e etc4 . Nesse caso, todas as bases do
homopolmero vo ser incorporadas em um nico fluxo. Felizmente, o sensor ISFET tem uma resposta
bastante linear; portanto, se um A tem um sinal x, um AA vai ter um sinal aproximadamente 2x, e
assim por diante. Na prtica, possvel detectar com boa acurcia homopolmeros de at 6 bases.
O ltimo elemento importante, e que diferencia os sequenciadores da nova gerao em relao
anterior, o paralelismo da reao e da deteco. No Ion Torrent esse paralelismo obtido pelo uso de
chips de silcio. Utilizando o processo CMOS, o mesmo utilizado na fabricao de chips de computador
ou sensores de cmeras digitais, so construdos milhes de poos microscpicos um pouco maiores do
que as esferas com fragmentos de DNA, de forma que, em cada poo, tenha somente uma esfera. No
chip esto tambm os transitores IsFET que fazem a deteco da mudana de pH, ou seja, cada poo
possui o seu prprio pH-gmero para fazer a deteco do sinal[29].
1.2.5 SOLiD
A sigla SOLiD significa Sequencing by Ligation and Detection e descreve bem o processo de sequencia-
mento utilizado pelo instrumento. Ao invs de utilizar uma polimerase e detectar a incorparao de cada
uma das bases, o SOLiD utiliza octmeros marcados com fluorforos para identificar a sequncia alvo.
As primeiras 5 bases da probe garantem a especificidade da ligao da probe com o template, enquanto
que as 3 timas so inosinas que anelam de maneira inespecfica. Conectado ltima, inosina temos o
flurforo que gerar o sinal luminoso a ser detectado pelo sequenciador (ver fig 1.5).
Fluorforo
Probe
n1 n2 n3 n4 n5 x x x
No SOLiD, assim como no Ion Torrent, cada fragmento amplificado milhares de vezes na superfcie
de uma bead5 . Essas beads so ento depositadas e fixadas em uma lmina de vidro. muito importante
ter essa fixao, porque sabemos que o sinal luminoso que ser gerado pelo processo de sequenciamento
est vindo da mesma bead (ou seja, da mesma populao de clones geradas de um template) por meio
das coordenadas do ponto luminoso na lmina.
4 Notem que microsatlites com mais de uma base na repetio, como ACACAC, no so homopolimeros
5 Essesuma novo modelo do SOLiD, o 5500W, que no utiliza beads. A amplificao dos templates feita diretamente
na lmina.
9
A reao de sequenciamento ocorre para cada um dos milhares de clones em cada uma das centenas
de milhes de beads depositadas na lmina. As etapas dessa reao so, de maneira simplificada, as
seguintes:
10
Cor Fluorforo
0 Azul FAM
1 Verde Cy3
2 Amarelo TXR
3 Vermelho Cy5
Pelo processo de sequenciamento, cada probe 2 de cada 5 bases cobertas por ela, para cobrir todas as
bases duas vezes, temos que utilizar 5 probes, que se alinham em posies diferentes de P1 e permitem
que se cubra todo o fragmento8 . Veja a figura 1.8.
O resultado do sequenciamento codificado em nmeros de acordo com a tabela 1.2. A relao entre
as duas primeiras bases da probe, n1 e n2 , e a cor do flurforo dada pela tabela 1.4. Essa tabela
tem diversas propriedades interessantes: ela simtrica e nenhuma cor se repete na mesma linha ou na
mesma coluna (como em um jogo de Soduko). Por causa dessas propriedades temos que, se soubermos
a primeira base do par e a cor fica determinada a segunda base. Suponhamos que a primeira base do
par seja um T, se a cor lida pela probe for verde, a segunda base , portano, um G. Como o primeira
probe do primer PB l a ltima base do adaptar P1 , que conhecida, podemos portanto descobrir qual
a primeira base da leitura. Tendo a primeira base da leitura e a segunda cor, podemos descobrir a
segunda base, e assim por diante. Podemos pensar nas cores como transformaes entre bases, e que se
essas transformaes forem encadeads, podemos gerar todas as bases da leitura.
Suponha que a ltima base de P1 seja um T, e que a seguinte sequncia de cores tenha sido obtida:
3 1 3 1 0 2 . Se consultarmos a tabela 1.2, temos que T na primeira base com 3 gera um A, portanto
a primeira base da nossa sequncia um A, o que nos gera o seguinte resultado intermedirio:
A1 3 1 0 2
Vendo agora, a combinao de A com 1 gera um C, e o nosso segundo resultado intermedirio :
AC 3 1 0 2
Continuando a aplicar as transformaes chegamos aos seguintes resultados:
ACG 1 0 2
ACGT 0 2
ACGT T 2
ACGT T C
Portanto, a sequncia T313102 codificada em color space representa a sequncia ACGTTC em base
space.
8 Pela construo das probes sequenciaramos tambm as 5 ltimas bases de P , o que no interessante. Por isso, aps
1
o primer PB , adicionado um espaador que desloca a posio inicial do sequenciamento 5 bases para frente.
11
A. Um novo Primer se liga ao template uma C. Novamente as inosinas e o fluroforo so
posio para dentro do primer. removidos.
primer primer
5 5
B. Como no primer anterior a probe se anela, D. E o processo segue, sempre com uma base
porm deslocada uma base esquerda. deslocada esquerda.
Probe Probe
primer primer
n2
A C G T
A 0 1 2 3
C 1 0 3 2
n1
G 2 3 0 1
T 3 2 1 0
12
0 5 10 15 20 25
P1
PA
PB
PC
PD
PE
Figura 1.8: Esquema de cobertura do template pelos probes para uma leitura de 25 bp.
com frequncias menores do que as variantes germinativas. A capacidade de deteco da variante vai
depender da frequncia mnima que se deseja detectar e da acurcia das leituras geradas.
13
uma taxa muito baixa de reads mapeados. Outro problema o RNA Ribossomal, ele corresponde a
uma grande quantidade da massa de RNA de uma clula e, se no for removido da amostra no final, a
maioria dos reads ser de RNA ribossomal, o que normalmente no objetivo do experimento. possvel
utilizar um kit de depleo de RNA Ribossomol, como o Ribominus da Invitrogen, ou ento fazer um
enriquecimento para RNA com calda polyA, como o poly(A) Purist tambm da Invitrogen. Caso haja
interesse tambm em RNAs no codificantes melhor utilizar somente o Ribominus. Caso contrrio, o
poly(A) Purist mais eficiente (alguns grupos utilizam os dois para garantir a remoo dos ribossomais).
1.3.5 Metagenoma
A metagenmica o estudo do material gentico extrado diretamente do ambiente. Normalmente,
quando se quer estudar o genoma de uma bactria, feita uma cultura para garantir que se est sequen-
ciando um nico genoma. Porm, a diversidade de micro-organismos presentes no ambiente muito maior
do que possvel acessar via sequenciamento individual de bactrias. Por isso, o estudo do metagenoma
importante.
Existem dois tipos de estudo de metagenomas:
1. Estudo de diversidade utilizando o gene ribossomal 16s: Nesse tipo de estudo amplifica-se por PCR
a sequncia 16s e se compara o resultado contra um banco de dados de bactrias conhecidas. Com
isso, possvel avaliar e comparar a diversidade de bactrias presentes na amostra.
2. Shotgun Metagenomics: Nesse segundo caso no se faz nenhuma seleo de alvo. Todo o DNA
extrado da amostra fragmentado e sequenciado. A anlise consiste em montar o metagenoma
da amostra para tentar identificar, alm da diversidade de genomas, novos genes.
A metagenmica uma rea muito ativa de pesquisa e os mtodos de anlise ainda so muito manuais.
14
Captulo 2
Arquivos de Sequncia
Em princpio, bastante simples representar uma sequncia de DNA em formato texto. Cada base pode
ser presentada por um caracter: A para Adenina, C para Citosina, G para Guanina e T para timina.
O cdigo oficial para representar DNA mantido pela IUPAC e inclui tambm cdigos para identificar
bases ambguas, ou seja, os casos em que no se sabe ao certo a base correta, mas se sabe que deve ser
um C ou T ou algo similar. O cdigo completo est na tabela 2.1.
A Adenina
C Citosina
G Guanina
T (ou U) Timina (ou Uracila)
R A ou G
Y C ou T
S G ou C
W A ou T
K G ou T
M A ou C
B C ou G ou T
D A ou G ou T
H A ou C ou T
V A ou C ou G
N qualquer base
. ou - gap
Onde Perro a probabilidade da base ter sido identificada de maneira errada1 . Na figura 2.1, temos
o grfico da funo que calcula o phred score e na tabela 2.2 temos exemplos de alguns valors de phred.
Nela vemos que, por exemplo, uma base com phred 20 tem 99% de acurcia, ou seja, uma chance em
100 de estar errada.
1 O score phred construdo com base em uma srie de preditores de qualidade que so calibrados com dados reais para
15
Q Chance de erro Acurcia da base
10 1 em 10 90 %
20 1 em 100 99 %
30 1 em 1000 99,9 %
40 1 em 10000 99,99 %
50 1 em 100000 99,999 %
Phred Score
40
35
30
Phred Score
25
20
15
10
5
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
P de erro
Tipicamente, os valores de phred score esto entre 1 e 40. At possvel sequenciar com uma acurcia
maior que 40, porm, a acurcia das etapas anteriores de 99,99%, e a acurcia do processo inteiro no
pode ser maior do que da parte menos acurada, o que uma consequncia da propagao derros.
A maneira mais simples de representar os valores de qualidade em formato texto uma lista de
inteiros, o que adiciona de 2 a 3 bytes de dados para cada base sequenciada (1 a 2 caracteres para o valor
da qualidade e um caracter como separador entre os valores). Antes do NGS essa forma de representao
era prtica porque o volume de dados era pequeno, mas recentemente se tornou necessrio criar novos
formatos que economizassem bytes.
Neste captulo, vamos analisar os formatos de representao de dados de sequenciamento mais usados
e como manipul-los utilizando ferramentas gratuitas.
16
>HSBGPG Human gene for bone gla protein (BGP) (fragment)
GGCAGATTCCCCCTAGACCCGCCCGCACCATGGTCAGGCATGCCCCTCCTCATCGCTGGGCACAGCCCAGAGGGT
ATAAACAGTGCTGGAGGCTGGCGGGGCAGGCCAGCTGAGTCCTGAGCAGCAGCCCAGCGCAGCCACCGAGACACC
ATGAGAGCCCTCACACTCCTCGCCCTATTGGCCCTGGCCGCACTTTGCATCGCTGGCCAGGCAGGTGAGTGCCCC
CCTGGAGCCCAGGAGGGAGGTGTGTGAGCTCAATCCGGACTGTGACGAGTTGGCTGACCACATCGGCTTTCAGGA
GGCCTATCGGCGCTTCTACGGCCCGGTCTAGGGTGTCGCTCTGCTGGCCTGGCCGGCAACCCCAGTTCTGCTCCT
CTCCAGGCACCCTTCTTTCCTCTTCCCCTTGCCCTTGCCCTGACCTCCCAGCCCTATGGATGTGGGGTCCCCATC
ATCCCAGCTGCTCCCAAATAAACTCCAGAAG
>HSGLTH1 Human theta 1-globin gene (fragment)
CCACTGCACTCACCGCACCCGGCCAATTTTTGTGTTTTTAGTAGAGACTAAATACCATATAGTGAACACCTAAGA
CGGGGGGCCTTGGATCCAGGGCGATTCAGAGGGCCCCGGTCGGAGCTGTCGGAGATTGAGCGCGCGCGGTCCCGG
GATCTCCGACGAGGCCCTGGACCCCCGGGCGGCGAAGCTGCGGCGCGGCGCCCCCTGGAGGCCGCGGGACCCCTG
CTTCTTGCCGTGCTCTCTCGAGGTCAGGACGCGAGAGGAAGGCGC
Neste exemplo, vemos duas sequencias: uma identificada com HSBGPG e outra como HSGLTH1.
Depois de cada identificador temos um espao e em seguida um comentrio sobre a sequncia. Depois
disso temos o corpo de cada sequncia, o padro manda que a sequncia seja quebrada em linha entre 70
e 132 caracteres. No exemplo, est uma sequncia de nucleotdeos, mas o arquivo fasta pode ser utilizado
para representar qualquer tipo de sequncia biolgica.
O arquivo fasta pode vir acompanhado de um arquivo com extenso .qual. Nesse arquivo esto
os valores de qualidade associados com cada base. Ele tem basicamente o mesmo formato do arquivo
.fasta, porm, no lugar da sequncia de bases, ele tem os valores de qualidade na escala phred separados
por espaos. Abaixo temos um exemplo de arquivo .fasta e o respectivo arquivo .qual.
FASTA
>RWBG8:4:5
CTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACT
ACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGA
QUAL
>RWBG8:4:5
23 16 31 29 30 26 31 31 32 25 32 33 33 29 32 32 31 29 29 29 33 29 31 31 33 31
30 22 29 20 26 18 24 26 12 26 19 25 28 29 13 29 24 32 32 30 30 30 34 33 33 32
33 33 33 33 33 33 29 33 33 25 31 31 29 29 24 24 24 24 24 24 29 29 31 31 18 29
25 29 21 25 25 13 13 15 19 26 22 26 27 28 29 25 31 28 33 29 33 33 33 33 33 29
33 33 34 34 30 30
Como o fasta um formato de texto, possvel utilizar ferramentas padro do unix para manipul-lo.
Para contar o nmero de sequncias em um arquivo fasta, usa-se o seguinte comando:
Para contar o nmero de bases no arquivo pode-se utilizar este outro comando:
17
@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65
Nesse formato, o cabealho definido pelo caracter @, e seguido pelo identificador da sequncia. Na
linha seguinte tem-se a sequncia e, ao contrrio do formato fasta, que manda quebrar a sequncia em
diversas linhas, no fastQ deve-se ter somente uma linha (mas muitas vezes essa regra no respeitada).
Na linha seguinte tem-se o caracter + que pode ser seguido pelo identificador da sequncia novamente, e
na ltima linha tem-se os valores de qualidade representados em ASCII.
Para converter o valor de qualidade phred para fastQ adiciona-se 33 a ele e procura-se o caracter
ASCII correspondente. Este o padro definido pelo Sanger Institute e mais utilizado atualmente.
Porm as primeiras verses da pipeline de anlise da Illumina definem o valor de qualidade como phred
mais 64, o que pode causar problemas para quem estiver manipulando esses arquivos. A partir da verso
1.8 da pipeline de anlises a Illumina tambm passou a adotar o padro do Sanger.
Para converter de fastQ para fasta pode-se utiliar o programa seqtk que vem junto com o samtools:
O conversor mais fcil de utilizar o sff_extract, pois ele somente um script em python. Porm,
ele o conversor mais lento. O sff2fastq o mais rpido, porm menos flexvel, pois s gera arquivo
no formato fastQ. Por fim, o Flower rpido e flexvel, mas necessita ter a linguagem de programao
Haskell instalada no sistema.
2 O Torrent Browser fornece o resultado da corrida no formato BAM, mas ele tambm gera as sequncias nos formatos
18
Converter utilizando o sff_extract
Para utilzar o sff_extract voc precisa baixar o script. O nome do arquivo ser sff_extract_<verso>.
Renomeie para sff_extract e torne o arquivo executvel com o comando chmod +x sff_extract. Para
converter de SFF para fasta/qual utilize o seguinte comando:
Onde <prefixo> o nome dos arquivos .fasta e .qual que vo ser gerados e <entrada.sff> o
nome do arquivo sff que se deseja converter. Este comando vai gerar trs arquivos:
<prefixo>.xml Arquivo XML com as informaes extras de cada read, em especial, as informaes
de clipping de cada read.
<?xml version="1.0"?>
<trace_volume>
<trace>
<trace_name>RWBG8:4:5</trace_name>
<clip_quality_right>149</clip_quality_right>
<clip_vector_left>5</clip_vector_left>
<clip_vector_right>114</clip_vector_right>
</trace>
...
</trace_volume>
Todos os valores de clipping so indexados a partir de 1. Para encontrar a primeira base no trimada,
utiliza-se a seguinte expresso:
Neste caso, sero gerados os mesmos arquivos, porm o arquivo XML no ter as informaes de
clipping porque o clipping j foi feito nos arquivos fasta e qual.
Para gerar o arquivo em formato FastQ, utilize:
Esse comando vai gerar o arquivo <prefixo>.fastq e <prefixo>.xml, e da mesma forma que no
exemplo anterior, se for adicionada a opo -c, o resultado ser com hard clipping.
19
Utilizando o seq_crumbs
O sff_extract foi suplantado pelo pacote seq_crumbs. Diferentemente do programa anterior, o seq_crumbs
foi concebido em mdulos, que podem ser combinados de maneira muito mais verstil. Alm disso, ele
utiliza a biblioteca biopython. Para baixar o programa, utilize esse endereo:
https://github.com/JoseBlanca/seq_crumbs
J o biopython est disponvel em:
http://biopython.org/wiki/Download
Para fazer a converso de SFF para fastQ utiliza-se:
Note que a verso do seq_crumbs s gera arquivos em formato fastq, no tendo mais a opo de
gerar fasta/qual. Como no programa anterior, a opo -c pede para o programa fazer o trimming das
sequncias.
Para fazer a converso de arquivos SFF de mate-pair vemos uma diferena muito maior, pois temos
que combinar o programa sff_extract com o programa split_matepairs:
sff_extract <entrada.sff> |
split_matepairs -l ION_TORRENT
A combinao desses dois comandos equivalente ao sff_extract -l. Mas o seq_crumbs oferece
mais opes de manipulao de arquivos. possvel tambm gerar dois arquivos de mates desentrelaa-
dos, ou seja, um arquivo com a primeira tag e outro com a segunda. Para isso utilize:
sff_extract <entrada.sff> |
split_matepairs -l ION_TORRENT |
pair_matcher -p <orphan.fastq> |
deinterleave_pairs -o <out.1.fastq> <out.2.fastq>
O comando pair_matcher remove as tags que esto sem os seus respectivos pares e coloca no
arquivo <orpha.fastq>, j o deinterleave_pairs separa os pares nos arquivos <out.1.fastq> e
<out.2.fastq>.
Utilizando o Flower
O Flower um utilitrio para ler arquivos SFF feito na linguagem de programao Haskell. Por ser
uma linguagem compilada ele muito mais do que o sff_extract, que foi escrito em Python. Duas
desvantagens que o runtime do Haskell menos ubquo do que do Python e ele no gera o arquivo
XML com as informaes de clipagem necessrias para o Mira (ver 6.1).
Tendo instalado o Haskell, muito fcil instalar o Flower. Basta utilizar o programa Cabal da seguinte
maneira:
Alm de converter o SFF, o flower tambm permite inspecionar o arquivo. Para visualizar o SFF em
formato texto, use:
Por fim, o flower gera uma visualizao do flow space em um formato tabulado muito til. Para
gera-la:
flower -F <entrada.sff>
20
...
RWBG8:9:36 81 T 1.05 Qual {unQual = 34}
RWBG8:9:36 82 C 1.03 Qual {unQual = 27}
RWBG8:9:36 83 G 0.00
RWBG8:9:36 84 A 5.72 Qual {unQual = 27},Qual {unQual = 27},
Qual {unQual = 27},Qual {unQual = 27},
Qual {unQual = 27},Qual {unQual = 7}
RWBG8:9:36 85 T 1.93 Qual {unQual = 27},Qual {unQual = 21}
RWBG8:9:36 86 C 0.97 Qual {unQual = 26}
RWBG8:9:36 87 G 0.00
RWBG8:9:36 88 A 0.00
...
Note que mesmo os fluxos que no tiveram sinal so registrados no arquivo SFF e tambm que,
para os homopolmeros, temos uma estimativa de qualidade para cada uma das bases (quebra de linha
adicionada para facilitar a visualizao).
Ser criado um diretrio Libraries dentro do <diretrio de sada>. Dentro de Libraries, ser
criado um diretrio para cada tag F3, R3, etc e dentro deste um diretrio reads com os arquivos
csfasta, qual e fastq (caso o sequenciamento tenha sido feito com ECC). A opo -f pede para o programa
filtrar os reads marcados como filtrados pelo basecaller e portanto altamente recomendvel.
Tambm possvel converter de csfasta/qual para XSQ com o comando convertToXSQ.sh. De-
pendendo do tipo de biblioteca, preciso passar diferentes argumentos. Para biblioteca de fragmentos
utiliza-se:
21
./convertToXSQ.sh -x <out.xsq> --mode Fragment
--c1 <F3.csfasta> --q1 <F3.QV.qual>
--libraryName <libname> --runStartTime "0000-00-00 00:00:00"
Nesse caso temos que informar, alm dos campos do arquivo utilizados no caso da biblioteca de
fragmentos, o arquivos do de sequncia e qualidade do mate e, o tamanho mnimo do e mximo do
inserto.
22
Captulo 3
Mapeamento de Sequncias
Aps um experimento de NGS quase sempre necessrio fazer o mapeamento das leituras geradas em
um genoma de referncia. O primeiro programa para fazer esse mapeamento foi o BLAT1 , criado por
Jim Kenth para mapear leituras com alta similaridade contra um genoma de referncia. Porm, o BLAT
no consegue alinhar regies com menos de 40bp e tambm no tem performance suficiente para alinhar
os milhes de reads gerados por NGS. Os primeiros mapeadores open source otimizados para NGS foram
o MAQ[17] e o SOAP[19], ambos mapeadores que utilizam hash tables para acelerar a busca, com a
diferena que o MAQ indexa os reads enquanto o SOAP indexa o genoma de referncia. Com o aumento
do throughput, dos sequenciadores a abordagem de indexar os reads se tornou invivel e por isso os
mapeadores mais recentes indexam a referncia.
O problema do uso de hash table o uso de memria. Alguns mapeadores, como o mapreads
do SOLiD, podem dividir a hash em partes e fazer o mapeamento em etapas de forma a permitir o
mapeamento de grandes genomas mesmo com pouca memria. Alternativamente, possvel utilizar
um FM-Index, que indexa o genoma de referncia compactado pela Burrows-Wheeler[33, 6] e entre os
programas que implementam esta tcnica esto o BWA[15, 16],bowtie[11] e o SOAPv2[20].
Para aumentar a eficincia os algoritmos citados diminuem a sensibilidade, limitando o nmero de
mismatches permitidos. Como os reads de NGS normalmente possuem uma qualidade maior no incio
do read, utiliza-se uma estratgia de seed and extend: na primeira fase pega-se o incio do read, entre 25
e 30 bases, e faz-se a busca permitindo poucos erros como 2 por exemplo. Encontrada uma posio de
ancoramento do read feita a extenso do alinhamento de modo a maximizar o score de alinhamento2 .
Na seo seguinte explorado o format SAM/BAM, que o formato universal para representar
alinhamentos de NGS e nas prximas sees ser mostrado como utilizar alguns mapeadores.
23
Cdigo Descrio
@HD Identifica o incio do arquivo SAM e a verso dele.
@SQ Identifica dada uma das sequncias no arquivo de
referncia
@RG Read group: identifica conjuntos de reads dentro do
arquivo. Esse registro muito importante quando
so combinados os resultados mltiplas corridas em
um nico arquivo.
@PG Lista de programas utilizados no arquivo.
@CO Comentrios
2. FLAG: Bits descrevendo algumas propriedades do alinhamento. o layout dos bits esta abaixo e o
significado de cada bit est na tabela 3.3.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
M A U UM R RM F L S Q D
Por exemplo, um read corretamente mapeado vai ter um valor de flag 2, mas se ele mapear na
fita oposta a flag vai ser 2 + 16 = 18. Caso o read seja o primeiro de um par a flag vai ser
1 + 2 + 16 + 64 = 83.
3. RNAME: Nome da sequncia de referncia ou um nmero indicando qual o registro @SQ do header
com a correspondente sequncia. Um read no mapeado tem o valor * neste campo.
4. POS: Posio mais esquerda do alinhamento do read com a referncia (valores comeando em
1). Se o valor for 0, o read no est alinhado.
5. MAPQ: Qualidade do mapeamento. Este valor representado como um inteiro com interpretao
similar ao ndice phred de qualidade, ou seja, P = 10 log10 Q, onde Q a probabilidade do read
estar mapeado de maneira errada.
6. CIGAR: Sequncia de caracteres que descrevem como o read est mapeado na referncia. O
significado de cada caracter o seguinte:
24
Sim. valor Descrio
M 1 Template com mltiplos segmentos, ou seja, mate-pair ou pair-
end3 .
A 2 Cada segmento est corretamente alinhado.
U 4 Segmento no mapeado.
UM 8 Prximo segmento no mapeado.
R 16 O campo SEQ o reverso complementar do read.
RM 32 O campo SEQ do prximo segmento o reverso complementar do
read.
F 64 Esse segmento o primeiro do template.
L 128 Esse segmento o ltimo do template.
S 256 Alinhamento secundrio. Essa flag indica que existe outro alinha-
mento desse read que considerado o primrio pelo mapeador.
Q 512 Esse alinhamento no passou pelo controle de qualidade.
D 1024 Esse read foi considerado uma duplicata de PCR ou tica.
7. RNEXT: Sequncia na referncia do prximo segmento. Se RNEXT for * ento esta informao
no est presente e se for = RNEXT tem o mesmo valor e RNAME.
9. TLEN: Tamanho do inserto entre os segmentos. O segmento esquerda tem sinal positivo e o
segmento direita tem sinal negativo, o valor 0 indica que essa informao no est presente.
10. SEQ: Sequncia do segmento. Pode ser * se o valor no tiver sido armazenado. Um = denota
uma base idntica da referncia.
Aps os campos obrigatrios, pode haver campos opcionais. Esses campos tm o formato
T AG : T Y P E : V ALU E
, onde tag uma sequncia de 2 caracteres que inidcam o campo, TYPE indica o tipo de dado e VALUE
o valor do campo, para a documentao completa veja a especificao do formato SAM[8].
Na figura 3.1 vemos alguns alinhamentos e as entradas equivalentes em formato SAM. O primeiro
read, r001, tem as seguintes flags 163(= 1 + 2 + 32 + 128) = A + M + RM + L, portanto est corretamente
mapeado (A), o segundo membro de um par (M +L) e o seu par mapeia na posio 37 na fita oposta (flag
RM ). O read r002 posui trs soft-clipped bases, a coordenada mostrada no arquivo SAM da primeira
base alinhada. A string CIGAR deste alinhamento contm um P (padding) que corretamente alinha a
sequncia inserida. A informao de padding pode ser omitida se o alinhador no suportar alinhamento
mltiplo de sequncias. As ltimas 6 bases do read r003 mapeiam na posio 9, e as 5 primeiras mapeiam
na posio 29 da fita reversa. O hard clipping (H) indica bases que no esto presentes na referncia. A
tag opcional NM indica o nmero de mismatches no alinhamento. O read r004 alinha sobre um intron,
fato indicado pelo caracter N.
25
Figura 3.1: Exemplos de alinhamentos e os respectivos registros em formato SAM[18].
3.1.3 Samtools
Junto com o formato SAM/BAM foi criada a ferramenta samtools para manipular esses arquivos. Ele
est disponvel no site:http://samtools.sourceforge.net/. Para baixar o cdigo fonte do programa,
v para a URL:
http://sourceforge.net/projects/samtools/files/samtools/0.1.18/
Aps baixar o cdigo fonte compile, com o comando make, ser gerado um executvel chamado
samtools o qual voc pode copiar para o diretrio que quiser, como por exemplo /usr/local. A
estrutura geral de execuo do samtools est abaixo, command um dos comandos reconhecidos pelo
samtools e <arg>* so as opes para cada um dos comandos.
Converter entre SAM e BAM: Para fazer a converso entre a verso binria e texto utiliza-se
o comando view:
BAM para SAM: samtools view <input.bam> > <output.sam>
SAM para BAM: samtools view -S -b <input.sam> > <output.bam>
Visualizar o header de um arquivo BAM: Para extrair somente o header de um arquivo
BAM, use:
Ordenar e indexar um arquivo BAM: Para visualizar e tambm para realizar diversas anlises
preciso ordenar os alinhamentos de acordo com a posio genmica. Para isso utiliza-se o seguinte
comando:
26
samtools sort <arquivo.bam> <novo.nome>
Onde <novo.nome> o prefixo do nome do novo arquivo que vai ser gerado com os reads ordenados.
Esse nome no pode ser o mesmo do arquivo original e no precisa colocar a extenso .bam.
Ela adicionada automaticamente, e se voc coloc-la no final vai ter um arquivo com extenso
.bam.bam, o que no muito elegante. Caso o arquivo bam no caiba na memria disponvel
(que controlada pela opo -m), ser gerado um arquivo temporrio com o <novo.nome>.X.bam.
No final do processo esses arquivos vo ser combinados e um arquivo chamado <nome.nome>.bam
gerado. O valor default de -m 500000000 (500Mb). Se o computador tiver mais memria
disponvel e o arquivo BAM for bastante grande, interessante aumentar esse valor de forma a
agilizar o processo de ordenao do arquivo bam. Portanto, em um computador com 8Gb de RAM
pode-se utilizar algo como:
Se for aplicado em um BAM file gerado pelo PGM vai gerar um resultado como este:
Os valores so classificados como QC-passed reads e QC-failed reads de acordo com o valor da flag
Q(512) do campo FLAGS. Todos os valores esto divididos nessas duas categorias. Esse exemplo
no tem nenhum read marcado com QC-failed e portanto os valores no segundo grupo so todos
zero. A maioria dos valores nesse relatrio diz respeito a bibliotecas de reads pareados, e como
essa era uma biblioteca de fragmentos, ento o valor mais importante o nmero e porcentagem
de reads mapeados, no caso 81.284, 81,67% do total de 99.525 reads. Abaixo vemos o resultado do
flagstat em um arquivo de reads mate-pair do SOLiD:
27
844482954 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
225681606 + 0 duplicates
688865129 + 0 mapped (81.57%:nan%)
844482954 + 0 paired in sequencing
422241477 + 0 read1
422241477 + 0 read2
345539940 + 0 properly paired (40.92%:nan%)
533247304 + 0 with itself and mate mapped
155617825 + 0 singletons (18.43%:nan%)
178287164 + 0 with mate mapped to a different chr
90834280 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
Combinar diversos arquivos BAM em um novo arquivo: Para combinar diversos arquivos
bam em um novo arquivo utiliza-se:
Porm, essa opo vai simplesmente copiar o header do arquivo <input1.bam> e combinar os
alinhamentos de todos os arquivos, mas isso pode fazer com que as tags @SQ, @RG e @PG fiquem
inconsistentes entre o header e os alinhamentos. Por isso, necessrio criar um novo header, com
as informaes corretas, e utilizar o comando:
Substituir o header de um arquivo BAM: Para substituir o header de um arquivo BAM, crie
um novo header em um arquivo texto e utilize o seguinte comando:
Por exemplo, se quiser modificar a tag SO de unsorted para coordinate, utilize os seguintes
comandos:
3.1.4 Picard
Picard um conjunto de programas para manipular arquivos SAM/BAM escritos em Java e um
excelente complemento ao samtools. A pgina do projeto http://picard.sourceforge.net/ e um
arquivo .tar.gz, com os pacotes jar j compilados pode ser baixado em:
http://sourceforge.net/projects/picard/files/picard-tools/1.67/
O pacote est estruturado como uma srie de arquivos jar, sendo que cada jar um comando. A
estrutura geral para executar um comando a seguinte:
Cada ferramenta tem um conjunto prprio de argumentos, porm, alguns argumentos que so comuns
todas as ferramentas podem ser visualizados na tabela 3.4. Abaixo temos alguns comandos teis do
Picard, neles o path de instalao est omitido para deixar mais limpa a linha de comando.
28
Argumento Descrio
MAX_RECORD_IN_RAM Nmero mximo de registros serem mantidos na
memria. Aumentando esse valor reduze-se o n-
mero de operaes intermedirias de disco. Default:
500.000
TMP_DIR Diretrio temporrio
CREATE_INDEX Cria arquivo de ndice .bai.
1. Ordenar um arquivo BAM: O Picard possui um comando similar ao samtools sort, que o
SortSam.jar:
A grande vantagem do SortSam.jar em relao ao samtools sort que esse comando atualiza
de maneira apropriada o header do arquivo, trocando a tag SO para coordinate. Para ordenar
arquivos muito grandes interessante aumentar o valor de MAX_RECORD_IN_RAM. Em uma mquina
com uma boa quantidade de RAM pode-se aumentar esse valor em 10, como por exemplo:
2. Fazer o merge de diversos arquivos BAM: O Picard tambm possui uma alternativa ao
comando samtools merge
Assim com o SortSam.jar, o MergeSamFiles.jar trata melhor o header do arquivo gerado do que o
comando equivalente do samtools. Por default ele gera corretamente as tags @RG e @PG no header,
e com a opo MERGE_SEQUENCE_DICTIONARIES, ele tambm gera as tags @SQ corretas. A opo
AS significa Assume Sorted e existe para lidar com o fato do samtools no atualizar o header do
arquivo gerado, e portanto indicar como unsorted um arquivo ordenado. A opo USE_THREADING
faz com que o programa utilize duas threads 4 .
Quando se deseja combinar diversos arquivos BAM juntos, um pouco tedioso colocar uma argu-
mento I=<file.bam> para cada arquivo. possvel combinar o MergeSamFiles com o comando
find do unix para combinar todos os arquivos BAM em um mesmo diretrio.
29
3. Identificar Read Duplicados:
Durante o preparo de biblioteca pode ocorrer a duplicao de um fragmento, o que causa um vis
artificial da regio que originou o fragmento. Por isso, recomendado que reads suspeitos de serem
duplicatas sejam marcados e ignorados nas anlises subsequentes. O MarkDuplicates.jar procura
reads nos quais as posies mais 5 do alinhamento e a orientao sejam iguais. O read com a
melhor qualidade no alterado e todos os outros so marcados como duplicados. Para bibliotecas
de mate-pair e pair-end ocorre o mesmo, porm as cordenadas e a orientao dos dois pares de reads
devem coincidir[9]. Uma vantagem do MarkDuplicates.jar que ele consegue encontrar duplicatas
mesmo se os reads do par no mapearem no mesmo cromossomo.
Para executar o comando utilize:
Algoritmo Referncia
map1 BWA Short Li and Durbin [15]
map2 BWA Long Li and Durbin [16]
map3 SSAHA Ning [25]
map4 SMEM Li [14]
30
80
75
map %
70
65
60
Figura 3.2: Sensitividade dos algortmos do tmap e do bowtie2 (Amostra de E. Coli O104H4)
Caso haja bases ambguas na referncia, ser mostrada uma mensagem de aviso e as bases ambguas
sero trocadas, dentre as bases possves, pela de menor valor lexicogrfico. Por exemplo, a base Y, que
representa C ou T, ser trocada por C, a base N que representa qualquer base ser trocada por A, e
assim por diante. A indexao do genoma humano pode demorar 4 horas em um computador atual. O
resultado ser diversos arquivos com os ndices.
Onde mapN map1, map2, map3 ou map4, <reference> nome de um arquivo fasta que j tenha
sido indexado e <reads> o arquivo dos reads, que pode estar em formato, fasta, fastQ ou SFF. Como
resultado o tmap gera um arquivo SAM na sada padro. Caso se utilize um arquivo SFF, possvel
propagar a informao dos flows para o aquivo SAM por meio da opo -Y. Tambm possvel utilizar
diversas threads com a opo -n <num threads>.
A opo -o X controla o formato de sada do programa, -o 0 o default e gera uma sada texto em
formato SAM, -o 1 gera um resultado binrio em formato BAM, e por fim -o 2 gera um arquivo BAM
no comprimido, uma opo til se o resultado for tmap vai ser enviado para um outro comando para
mais processamentos, como por exemplo no comando abaixo, que combina o tmap com o samtools sort:
Normalmente, os algoritmos individuais no so utilizados, mas sim o comando mapall. Com esse co-
mando voc pode combinar os algoritmos em estgios adicionando argumentos no formato stageM mapX*
que define quais algoritmos sero utilizados em cada estgio. possvel definir diversos estgios de modo
que, se um read no mapear em um determinado estgio, ele passado para o estgio seguinte. Uma
estratgia colocar o map1 no primeiro estgio, porque ele mais rpido, e o map3 e o map4 no segundo
estgio. Para isso, utilizamos o seguinte comando:
31
150
map time (s)
100
50
Tambm possvel controlar as informaes da tag @RG atravs da opo -R. Isso importante porque
outros programas validam essa tag ao abrir o arquivo BAM. E alm disso bom adicionar metadata
sobre a amostra para facilitar a organizao dos arquivos. Algumas tags que podem ser utilizadas so:
ID Identificador nico do read group
SM cancer Nome da amostra (sample)
LB hg19 Nome da biblioteca
CN USP Nome do centro de sequencia-
mento
PU PGM/318 A utilizao varia entre platafor-
mas. No PGM tem sido usado
para identificar o tipo de chip
utilizado.
PL IONTORRENT Nome da plataforma de sequen-
ciamento (esses valores so tabe-
lados pelo formato SAM)
Combinando todas as informaes apresentadas, uma sugesto para rodar o TMAP a seguinte:
32
3. Faa o download da referncia no site do NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_
010473.1 em formato fasta e renomeie o arquivo dh10b.fasta
4. Indexe a referncia: tmap index -f dh10b.fasta
5. Utilize o TMAP para mapear os reads na referncia. Para mapear uma amostra utilize:
Para mapear todas as amostras voc pode utilizar o comando for do bash:
33
sff_extract <entrada.sff> |
split_matepairs -l ION_TORRENT |
pair_matcher -p <orphan.fastq> |
deinterleave_pairs -o <out.1.fastq> <out.2.fastq>
importante colocar a opo -Q 1 para indicar que os dados so de mate-pair e colocar a opo -r
duas vezes, uma para cada arquivo dos pares.
3.3 Bowtie
O bowtie[11] um mapeador bastante popular criado para mapear short reads. Ele especialmente
eficiente para reads com 50bp ou menos. O bowtie suporta dados tanto em base quanto color space.
A verso mais nova, bowtie 2[12], suporta alinhamentos com gaps e por isso mais adequado para
reads com 100bp ou mais. Infelizmente ele no suporta mais color-space. Em termos de algoritmo, o
bowtie 2 muito similar ao TMAP, dividindo o mapeamento em uma primeira etapa de alinhamento
sem gaps seguida de uma etapa de alinhamento Smith-Waterman. Diversos softwares utilizam o bowtie
como mapeador, em especial o pipeline de anlise de RNA-Seq Tophat[32] e o pipeline na nuvem de
ressequenciamento Crossbow[13].
Onde <prefix> o prefixo do nome dos arquivos de ndice que vo ser gerados. Esse nome vai ser
depois utilizado para referenciar os ndices. Para mapear um arquivo fastq utiliza-se:
Onde <threads> o nmero de threads a utilizar, <prefix> o prefixo usado na criao do ndice
e <reads.fastq> o arquivo com os reads mapear. Diferentemente do TMAP, o bowtie2 s suporta
reads em formato fasta ou fastq, no em SFF. Para gerar diretamente os alinhamentos em formato BAM,
combina-se o bowtie com o samtools:
Onde <memory> a quantidade de memria utilizada na ordenao dos reads e <output> o nome
do arquivo de sada sem a exteno .bam.
34
3.3.2 Utilizando o Bowtie 2 com o Ion Torrent
Vamos agora mapear os mesmos dados utilizados com o TMAP (seo 3.2) com o Bowtie 2. Assim
como no caso do TMAP, a primeira etapa indexar o genoma de referncia. Para isso, utilize o seguinte
comando:
Como o bowtie no suporta o formato sff, preciso fazer a converso para fastQ. Para isso, utilize
um do programas descritos na seo 2.2, como por exemplo o sff_extract:
sff_exract -c 64.sff
for i in *.sff; do
sff_extract -c $i
done
for i in data/*.fastq; do
b=basename $i .fastq
bowtie2 -p 8 -q dh10b $i
| samtools view -Suh -
| samtools sort - $b.bowtie2
done
gunzip FLO-528.bam
samtools index FLO-528.bam
No IGV, v para o menu File, escolha Load from File... e selecione o arquivo FLO-528.bam.
Inicialmente o IGV no vai mostrar nenhuma informao porque o nvel de zoom est muito alto. Para
visualizar os alinhamentos necessrio selecionar uma das regies capturadas pelo ampliseq. Para isso,
v na caixa de texto na toolbox superior e coloque o nome do gene MTRR. Como o IGV tem a anotao
do genoma humano, ele vai focalizar a janela principal na regio onde se encontra o gene MTRR, no caso
entre as coordenadas 7,865,776 e 7,901,794 do cromossomo 5 como pode ser visto na caixa de texto, que
mudou de MTRR para as coordenadas da regio mostrada.
Na figura 3.5 vemos o um screenshot do IGV mostrando a regio selecionada. A parte principal da
tela est dividida em duas regies: No topo, temos a barra de navegao que mostra o caritipo do
cromossomo que est sendo exibida e a regio que est sendo mostrada, que indicada por uma pequena
35
barra vermelha no caritipo. Logo abaixo temos uma escala com as coordenadas da regio. No resto
da tela so mostrados os arquivos carregados. No caso, temos o arquivo bam com os alinhamentos e na
parte de baixo temos a anotao do genoma. possvel adicionar outras sees na visualizao, basta
abrir novos arquivos e a tela ser subdividida verticalmente para acomodar as novas visualizaes.
A visualizao do arquivo bam est dividade em duas regies. No topo temos um grfico que mostra
a cobertura, ou seja, o nmero de reads cobrindo cada base do genoma. Na parte de baixo temos o ali-
nhamento de cada read. No nvel e zoom do gene inteiro podemos ver poucos detalhes dos alinhamentos,
mas pelo grfico de cobertura j possvel verificar a eficincia do processo de captura. Vemos que as
leituras esto nas regies do exons, o que exatamente o objetivo do processo de captura.
possvel mudar o nvel de zoom atravs dos botes - e + no canto superior direito da tela.
Tambm possvel aumentar o nvel de zoom com um click duplo em um ponto de interesse. Com o click
duplo ser feito o zoom e a tela ser centralizada no ponto de click. Por fim, possvel mudar o zoom e
a posio digitando novas coordenadas na caixa de texto. Pode-se aumentar o zoom at ser possvel os
ncleotdeos do genoma.
Na figura 3.5 vemos o zoom de um dos exons do gene MTRR. Nesse nvel de zoom podemos ver cada
um dos reads alinhados na regio, representados pelas caixas cinzas. A seta na ponta do read indica o
sentido do alinhamento. Todas as posies em cinza indicam que a base no read igual da referncia,
qualquer troca indicada como um retngulo colorido, j inseres so indicadas como um I azul e
delees so indicadas como uma quebra com um trao preto no read.
Podemos obter mais informaes sobre cada read e cada posio basta deixar o ponteiro do mouse
parado em uma posio e uma popup box ir aparecer (fig 3.6. Tambm possvel colocar o mouse sobre
a cobertura e o IGV ir informar a quantidade de reads na posio indicada, assim como a quantidade
de cada base, delees e inseres.
Clicando na regio com o nome do arquivo possvel mudar a visualizao do painel com os alinha-
mentos. Mudar a visualizao de Expanded para Collapsed permite ter uma viso mais geral dos
alinhamentos, com menos foco em cada alinhamento individual. Na figura 3.7 vemos que o exon em
questo est coberto por reads vindos de dois amplicons diferentes com um pequeno overlap no meio.
Vemos tambm mais claramente duas trocas nucleotdicas. possvel tambm mudar a visualizao
dos genes, s que o padro t-los em Collapsed, o que dficil de visualizar se o gene tiver diversas
isoformas diferentes ou se houver genes com overlap em fitas opostas. Nesses casos recomenda-se mudar
a visualizao dos genes para Expanded.
36
Figura 3.5: IGV mostrando os alinhamentos dos reads na regio do gene MTRR
Unique Identier Um ID para o genoma, deve ser nico para todos os genomas registrados no
programa, por exemplo human_hg19.
Descriptive Name Um nome descritivo, que vai aparecer na lista de genomas do menu pull down.
opcional Alias file Um arquivo com duas colunas que determina uma relao entre os nomes das
sequncias (cromossomos, contigs etc.) do genoma e da anotao, por exemplo, podemos ter um
genoma cuja sequncia se chame chr9, mas no arquivo de genes est somente 96 .
Aps preencher todos os campos o IGV ir perguntar onde salvar o arquvo .genome que ser criado
com todas as informao necessrias para a visualizao. Esse um arquivo binrio que deve ser mantido
para futuros usos do genoma criado. A criao do genoma s precisa ser feita uma vez. Aps criado, ele
passa a fazer parte do menu de genomas disponveis da instalao local do IGV.
6 Uma exceo para essa regra so os nomes no formato NCBI, se por exemplo a sequncia do genoma tiver a forma
gi|125745044|ref|NC_002229.3|, mas na anotao estiver a forma curta NC_002229.3, o IGV far a associo entre as duas
automaticamente.
37
Figura 3.6: Popup boxes do IGV. A) Popup que aparece quando se deixa o cursor sobre um dos reads.
B) popup mostrado quando se deixa o cursor sobre o grfico de cobertura.
Figura 3.7: IGV com os alinhamentos no modo colapsado. Destaque para duas posies com trocas de
nucleotdeos.
38
Captulo 4
A sequncia linear de bases que formam o genoma somente o primeiro nvel de informao gentica.
Codificados nela esto os genes e os elementos de regulao de expresso gnica. Para identificar a
posio desses elementos, utiliam-se arquivos de anotao, que em geral nada mais so do que arquivos
texto que associam coordenadas genmicas com caractersticas ou features. A seguir vamos descrever
alguns formatos de arquivos de anotao.
Alm das linhas descrevendo as features, um arquivo bed pode ter um cabealho que comea com a
palavra track e descreve outros atributos utilizados na representao grfica das regies.
No formato bedDetail se adicionam mais duas colunas, tendo assim a seguinte estrutura:
O formato bedDetail utilizado pelo Ampliseq Designer para informar as regies cobertas pelo painel.
Na figura 4.1, vemos um exemplo de bedDetail file gerado pelo programa.
39
track name="4477685_CCP_Designed" description="Amplicon_Insert_4477685_CCP" type=bedDetail
chr1 2488068 2488201 AMPL242431688 . TNFRSF14
chr1 2489144 2489273 AMPL262048751 . TNFRSF14
chr1 2489772 2489907 AMPL241330530 . TNFRSF14
... ... ... ... ...
chr1 6528161 6528293 AMPL294026880 . PLEKHG5
chr1 6528282 6528404 AMPL294029495 . PLEKHG5
chr1 6528391 6528519 AMPL294044396 . PLEKHG5
... ... ... ... ...
3. type: Descreve a natureza biolgica da anotao, como gene ou exon. Tem que ser um termo
do SOFA1 ou um cdigo do Sequence Ontology[4].
5. end: Final da anotao, tem de ser um valor igual ou maior que start.
6. score: Nas verses iniciais, esse campo no estava bem definido. Atualmente se recomenda que
se utilize o p-value para predio de genes ou o e-value para mapeamento.
8. phase: Para anotaes como CDS, essa coluna indica o incio da anotao em relao ao frame
de leitura. O valor de 0 indica que o prximo cdon comea na primeira base, 1 que preciso pular
uma base e assim por diante at 2.
9. attributes: Lista de pares tag=valor. Os pares so separados por ;. A lista de tags que podem
ser utilizadas aberta, mas algumas tm semntica predefinida.
A lista das tags predefinidas para a coluna atributos est na pgina do formato, vale resaltar algumas:
Com as tags ID e Parente possvel definir qualquer estrutura hierrquica no genoma, como por
exemplo a relao genetranscritoexon. Abaixo temos um exemplo de anotaes em GFF:
1 Sequence Ontology Feature Annotatio
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ctg123 example mRNA 1300 9950 . + . ID=t_012143;gene_name=EDEN
ctg123 example exon 1300 1500 . + . Parent=t_012143
ctg123 example exon 3000 3902 . + . Parent=t_012143
ctg123 example exon 5000 5500 . + . Parent=t_012143
ctg123 example exon 7000 9000 . + . Parent=t_012143
ctg123 example exon 9400 9950 . + . Parent=t_012143
ctg123 example CDS 3301 3902 . + 0 Parent=t_012143
ctg123 example CDS 5000 5500 . + 1 Parent=t_012143
ctg123 example CDS 7000 7600 . + 1
Parent=t_012143
Uma outra abordagem para representao de genes e transcritos o formato GTF. Este formato
quase idntico ao GFF3, s mudando a coluna attributes. Em vez de utilzar o formato tag=valor, ele
utiliza tag "valor", e em vez de usar uma estrutura genrica de pai e filho entre as anotaes, ele exige
os seguintes atributos:
transcript_id: ID do transcrito
possvel converter de GTF para GFF utilizando o comando gffread que faz parte do cufflinks2 :
41
Figura 4.2: UCSC Table Browser site
Output Format (ver figura 4.2) que permite escolher, entre outros formatos, GTF e BED. Logo abaixo
possvel esolher um nome para o arquivo que vai ser gerado e tambm escolher para que o arquivo seja
enviado j comprimido com o programa gzip, reduzindo assim o tamanho do download. Por fim, clica-se
em Get Output para fazer o download das anotaes.
Caso se escolha gerar um arquivo em formato BED, ser mostrada uma outra tela que permite escolher
as regies do gene que sero includas no arquivo gerado (ver figura 4.3). So oferecidas as seguintes
opes:
Whole Gene
Upstream by X bases
Exons plus X bases at each end
42
Introns plus X bases at each end
5 UTR Exons
Coding Exons
3 UTR Exons
Downstream by X
Na figure 4.4 podemos ver graficamente os diferentes tipos de arquivos BED gerados.
43
44
Figura 4.4: Diferena entre os tipos de arquivos BED gerados pelo UCSC Table Browser.
Captulo 5
Deteco de Varincias
4. ALT: Bases alternativas. Se houver mais de uma alternativa, elas sero listadas separadas por
vrgulas.
6. FILTER: Se a variante passou pelos controles de qualidade: PASS; caso contrrio uma lista de
cdigos separos por vrgulas descrevendo por que ela foi rejeitada.
7. INFO: Lista de valores separados por dois pontos com estatsticas sobre as variantes. Os valores
esto na forma <chave>=<valor>, onde chave uma string curta que identifica o valor. Abaixo,
temos uma lista de chaves definidas pelo padro. Todas elas so opcionais e os usurios podem
tambm adicionar chaves extras. No entanto as chaves abaixo so reservadas:
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DB: Membro do dbSNP
DP: Cobertura para todas as amostras
END: Posio final da variante descrita nesse registro
H2: Membro do hapmap2
H3: Membro do hapmap3
MQ: RMS do mapping quality
MQ0: Nmero de reads com M Q = 0
NS: Nmero de samples
SB: Strand Bias nessa posio
SOMATIC: Indica que essa variante somtica
VALIDATED: Validado por outro experimento
1000G: Membro do 1000 Genomes
Um exemplo com as 8 primeiras colunas de um arquivo VCF est na tabela 5.1. Depois da 8a coluna
podemos encontrar informaes de gentipo. Primeiro temos uma coluna chamada FORMAT, a qual
define uma lista com tipos de dados (separados por dois pontos). Em seguida temos uma coluna para
cada amostra com os valores definidos por FORMAT, e no cabealho est o nome de cada amostra.
Vemos um exemplo na tabela 5.2. Neste, caso temos a informao de gentipos para duas amostras,
NA000001 e NA000002.
Assim como para o campo INFO, existem diversas chaves predefinidas para o gentipo. Abaixo temos
a lista definida pelo padro:
GT: Gentipo, codificado como valores de alelo separados por / ou |. O alelo da referncia
indicado por 0, o primeiro alelo em ALT indicado por 1, o segundo por 2, e assim por diante.
Para um genoma diplide esse campo pode ser 0/1, 1|0, 1/2 e assim por diante. Para um genoma
monoplide, somente um valor deve ser dado, e para um genoma triplide podemos ter algo como
0|0|1. A diferena dos separadores que / indica gentipos fora de fase e | indica genpicos em
fase.
FT: A mesma coisa que o campo FILTER, porm individual para a amostra.
GL: log10 da verossimillhana para possvel gentipo. Se A for o alelo de referncia e B o alelo
alternativo, a ordem dos gentipos AA,AB e BB (a frmula geral para a ordem dos gentipos
est explicada no apndice 7.1).
46
PL: Valores de GL em scala phred.
GP: Probabilidade posteriori dos gentipos em escala phred.
CQ: Probabilidade condicional do gentipo estar errado, dado que o locus variante (em escala
phred):
10 log10 p(gentipo est errado|locus variante) (5.1)
HQ: qualidade dos haltipos, dois valores separados por vrgula em escala phred.
PS: Phase Set, definido como o conjunto de gentipos em fase que este gentipo pertence.
PQ: Qualidade da atribuio de fase do gentipo, em escala phred.
EC: Lista separada por vrgulas do valor esperado da contagem de cada alelo alternativo listado
na coluna ALT.
MQ: RMS do mapping quality, similar encontrada na coluna INFO.
Alm dos registros VCF, o arquivo contm um header. Esse header bastante til porque adiciona
uma descrio texto para vrios campos contidos no arquivo. Para os campos padro pode-se consultar
a especificao do padro, mas para campos especficos de algum programa a descrio no arquivo
bastante til. Em especial as linhas INFO e FORMAT descrevem as chaves das colunas INFO e
FORMAT no arquivo. Abaixo temos um exemplo de VCF header:
##fileformat=VCFv4.1
##fileDate=20090805
##source=myImputationProgramV3.1
##reference=file:///seq/references/1000GenomesPilot-NCBI36.fasta
##contig=<ID=20,length=62435964,assembly=B36,
md5=f126cdf8a6e0c7f379d618ff66beb2da,species="Homo sapiens",taxonomy=x>
##phasing=partial
##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data">
##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description="Allele Frequency">
##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele">
##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129">
##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership">
##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">
##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data">
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">
##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality">
47
bgzip <var.vcf>
tabix -p vcf var.vcf.bgz
48
5.3 Utilizando o GATK
O GATK, Genome Analysis Toolkit um software desenvolvido pelo Broad Institute para anlise de
dados de nova gerao, com nfase na anlise de variantes e genotipagem. Ele est disponvel em:
http://www.broadinstitute.org/gatk/download
O programa tem uma estrutura modular, sendo dividio em diversas anlises, todas empacotadas junto
com o framework em um arquivo jar. Para ter a lista de anlises utiliza-se o comando:
Na proxima seo vamos mostrar a utilizao do GATK para fazer uma chamada de variantes em
dataset de ampliseq.
gunzip FLO-528.bam.gz
gunzip CCP.bed.gz
samtools index FLO-528.bam
>chrM
49
3. Fazer a chamada de variantes:
O passo seguinte indexar o arquivo vcf gerado. A melhor alternativa para isso utilizar o igvtools:
O resultado vai ser um novo arquivo vcf chamado FLO-528.ann.vcf, com o rsID dos SNPs conhecidos
no campo ID.
unzip -x variantCaller-2.2.3.31037.zip
Vai ser criado um diretrio chamado variantCaller com o programa. O comando para fazer a
chamada de variantes o seguinte:
mkdir FLO-528-tsvc ;
./variantCaller/variantCaller.py
-r ./variantCaller/
-p ./variantCaller/paramFiles/ampliseq.Somatic.json
-b CCP.bed
FLO-528-tsvc
hg19.fasta
FLO-528.sorted.bam
6 possvel instalar em qualquer diretrio que se queira, basta depois mudar a linha de comando para refletir essa
mudana.
50
necessrio criar o diretrio onde os resultados vo ser escritos, o programa no faz isso sozinho,
por isso a primeira linha. preciso tambm passar o diretrio onde o TSVC est instalado com a
opo -r. Em seguida, informa-se qual o arquivo com os parmetros para a chamada de variantes,
no caso escolhemos o arquivo ampliseq.Somatic.json, o nome do arquivo a combinao do tipo de
biblioteca com o nvel de estringncia desejado, no caso uma biblioteca de ampliseq com a estringncia
para variantes somticas, ou de baixa frequncia. Os arquivos de parmetros disponveis esto na tabela
5.3. O parmetro -p informa o arquivo .bed com as regies que foram capturadas. Por fim, temos os
seguintes argumentos: diretrio de sada, genoma de referncia e arquivo .bam. Os arquivos com os
resultados vo ser:
Tabela 5.3: Lista de parmetros para Torrent Suite Variant Caller (TSVC)
Os arquivos vo ser gravados no diretrio ~/snpEff/data/hg19. A localizao desses dados pode ser
mudada editando o arquivo de configurao snpEff.config. Para anotar um arquivo VCF utiliza-se:
O resultado vai ser um novo arquivo VCF com uma tag EFF no campo INFO, descrevendo o efeito
do SNP. Essa tag contm uma lista de registros com a seguinte estrutura:
NON_SYNONYMOUS_CODING(MODERATE|MISSENSE|Aag/Gag|K1222E|2240|PDE4DIP||CODING|NM_001198832.1|29|1)
51
Ele mostra um mutao no sinnimo no transcrito MN_001198832.1 do gene K122E. A descrio de
cada um dos campos :
1. Effect: Efeito da variantes. A lista dos efeitos que o programa detecta est na tabela 5.4.
2. Effect impact: Impacto do efeito. Pode ter os seguintes valores: High, Moderate, Low, Modifier.
3. Functional class: Classe funcional: NONE, SILENT, MISSENSE, NONSENSE.
9. Gene_Coding: Pode ser CODING ou NON_CODING. Caso o gene esteja marcado como codante de
protena ou no.
10. Trancript: ID do transcrito (usualmente ENSEMBL IDs)
11. Exon/Intron Rank: Posio do Exon ou do Intron (ex: 1 para o primeiro exon, 2 para o segundo
etc)
12. Genotype: Nmero do gentipo desse efeito (ex: 2 se o efeito corresponde ao segundo ALT)
13. Warnings / Errors: Qualquer aviso ou erro (no mostrado se estiver vazio).
Efeito Descrio
INTERGENIC A variante est na regio intergnica
UPSTREAM Regio Upstream do gene (por default at 5k bases)
UTR_5_PRIME Variante na regio 5UTR
UTR_5_DELETED A variante deleta um exon que est na regio 5UTR.
START_GAINED A variante na regio 5UTR produz um sequncia de 3 bases que
pode ser um START cdon.
SPLICE_SITE_ACCEPTOR A variante est em um splice acceptor site (definido como as duas
bases antes do incio do exon, exceto para o primeiro exon).
SPLICE_SITE_DONOR A variante est em um Splice donor site (definido como as duas
bases depois do exon, exceto para o ltimo exon).
START_LOST Variante converte um start codon em um non-start codon. Ex:
aTg/aGg, M/R)
SYNONYMOUS_START Variante converte um start codon em outro start codon. Ex:
Ttg/Ctg, L/L (TTG and CTG can be START codons)
CDS A variante est em um CDS.
GENE A variante est em um gene.
TRANSCRIPT A variante est em um transcrito.
EXON A variante est em um exon.
EXON_DELETED Uma deleo que remove um exon.
NON_SYNONYMOUS_CODING A variante faz o cdon gerar um amino cido diferente. Ex:
Tgg/Cgg, W/R
SYNONYMOUS_CODING A variante mudao o cdon, mas no o amino cido. Ex: Ttg/Ctg,
L/L
FRAME_SHIFT Uma insero ou deleo que gera um frame shift, por exemplo
um indel que no seja mltiplo de 3.
52
CODON_CHANGE Um ou mais cdons so modificados. Por exemplo, um MNP7 de
tamanho mltiplo de 3.
CODON_INSERTION Um ou mais cdons inseridos, por exemplo uma insero mltipla
de 3 na fronteira de um cdon.
CODON_CHANGE_PLUS_CODON_INSERTION Um cdon foi modificado e um ou mais foram inseridos. Ex: uma
insero mltipla de 3, mas no na fronteira do cdon.
CODON_DELETION Um ou vrios cdons foram deletados. Ex: Uma deleo mltipla
de trs na fronteira do cdon.
CODON_CHANGE_PLUS_CODON_DELETION Um cdon foi modificado e um ou mais foram deletados. Ex: Uma
deleo mltipla de trs, mas no na fronteira do cdon.
STOP_GAINED Variante gera um STOP codon. Ex: Cag/Tag, Q/*
SYNONYMOUS_STOP Variante modifica um STOP codon em outro STOP codon. Ex:
taA/taG, */*
STOP_LOST Variante muta um STOP codon em um no STOP codon. Ex:
Tga/Cga, */R
INTRON A variante atinge um intron. Tecnicamente, ele no atinge um
exon no transcrito.
UTR_3_PRIME A variante atinge a regio 3UTR.
UTR_3_DELETED A variante apaga um exon que est na regio 3UTR do transcrito.
DOWNSTREAM Downstream do gene (por default at 5K bases).
INTRON_CONSERVED A variante est em uma regio intrnica altamente conservada.
INTERGENIC_CONSERVED A variante est em uma regio intergnica altamente conservada.
INTRAGENIC A variante atinge um gene, mas nenhum transcrito nesse gene.
RARE_AMINO_ACID A variante atinge um aminocido raro, portanto tem grandes
chances de produzir uma perda de funo.
NON_SYNONYMOUS_START Variante muta um start codon em outro start start codon (o novo
cdon produz um AA diferente). Ex: Atg/Ctg, M/L (ATG e CTG
podem ser START codons)
Tabela 5.4: Lista de efeitos preditos pelo snpEff
53
54
Captulo 6
Montagem denovo
Nos captulos anteriores foram discutidas tcnicas de anlise que envolvem o mapeamento das sequncias
obtidas em um genoma de referncia, porm, quando no se tem o genoma de referncia do organismo
estudado preciso gerar, ou montar, esse genoma de novo, ou seja, pela primeira vez. Ao contrrio do
mapeamento em que os algoritmos esto muito bem estabelecidos, a rea de montagem de genomas
muito mais experimental e ainda um campo muito ativo de pesquisa[3, 30].
Neste captulo vamos mostrar como usar o montador Mira[2] para montar genomas bacterianos com
dados do Ion Torrent PGM.
<proj>_in.<platform>.fastq
<proj>_traceinfo_in.<platform>.xml
55
No caso do Ion Torrent <platform> tem que ser iontor e <proj> o nome escolhido para o projeto.
O comando para fazer a converso tem a seguinte estrutura:
sff_extract -s <proj>_in.iontor.fastq
-x <proj>_traceinfo_in.iontor.xml
<arquivo.sff*>
mira
--project=frag
--job=denovo,genome,accurate,iontor
Na opo --project utilizamos o mesmo nome dos arquivos, e com isso o Mira vai utilizar os arquivos
corretos. Na opo --job descrevemos o job de montageme as opes so: denovo ou mapping, genome
ou est, accurate ou draft e a lista de tecnologias serem utilizadas.
Alm dessas, possvel adicionar uma srie de outras opes que fazem o ajuste do algoritmo e do
comportamento do programa, alguns exemplos so:
-GE:not=x Ajusta o nmero de threads do programa para x. O Mira utiliza 2 threads
por default. Aumentar esse valor agiliza o processo, mas somente em uma das
etapas, o algoritmo SKIM.
-OUT:ora=1 Pede para o Mira gerar um arquivo .ace como sada da montagem. Esse arquivo
pode depois ser utilizado para visualizar a posio dos reads nos contigs.
Os resultados vo estar em um diretrio chamado <project>_assembly, e dentro deste vo estar os
seguintes diretrios:
sff_extract -s frag_in.iontor.fastq
-x frag_traceinfo_in.iontor.xml
C11-127_40X.sff
1 http://www.sanger.ac.uk/resources/software/caf/
56
Note que o nome do projeto frag. Em seguida, execute o Mira com o seguinte comando:
mira
--project=frag
--job=denovo,genome,accurate,iontor
-GE:not=4 -OUT:ora=1
IONTOR_SETTINGS -AS:mrpc=100
-
tag1 IA tag2
Na figura 6.1 vemos a estrutura do read gerado pela tcnica de mate-pair no Ion Torrent. Pela construo
temos a tag1 seguida pelo adaptador interno (IA) e a tag2 . O sentido de leitura est indicado pela seta.
Por conta dessa estrutura preciso separar as tags utilizando a sequncia do adaptador interno, o que
feito na converso de sff para fastq. O sff_extract utiliza o mapeador SSAHA2 para mapear o IA e
gerar as tags. Portanto, preciso instalar o SSAHA2, que est disponivel em:
http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/
preciso colocar os programas SSAHA2 no path e em seguida utiliza-se o seguinte comando para
gerar os arquivos:
sff_extract -l LMP_Linkers.fasta
-s lmp35_in.iontor.fastq
-x lmp35_traceinfo_in.iontor.xml
FRA-257_40X.sff
A opo -l fornece um arquivo com a sequncia do IA e do seu reverso complementar, no caso, para
o Ion Torrent as sequncias so:
>IA
CTGCTGTACCGTACATCCGCCTTGGCCGTACAGCAG
>IA_revcom
CTGCTGTACGGCCAAGGCGGATGTACGGTACAGCAG
mira
--project=frag
--job=denovo,genome,accurate,iontor
-GE:not=4 -OUT:ora=1
IONTOR_SETTINGS -AS:mrpc=100
-GE:tismin=3000 -GE:tismax=4000
sff_extract -s mix_in.iontor.fastq
-x mix_traceinfo_in.iontor.xml
C11-127_40X.sff
57
Em seguida, vamos extrair os dados de primeira biblioteca de mate-pair, devemos prestar muita
atena opo -a, que pede para que os novos reads extrados sejam anexados ao arquivo criado na
etapa anterior.
sff_extract -a -l LMP_Linkers.fasta
-s mix_in.iontor.fastq
-x mix_traceinfo_in.iontor.xml
-i "insert_size:3500,insert_stdev:500"
FRA-257_40X.sff
Outro ponto importante a opo -i, que adiciona as informaes do inserto ao arquivo XML, no
caso ns adicionamos o tamanho do inserto e o desvio padro deste, respectivamente, 3500 e 500 bp.
Repetimos o mesmo processo com a segunda biblioteca de mate-pair, no caso alterando o tamanho do
inserto para 8900 bp.
sff_extract -a -l LMP_Linkers.fasta
-s mix_in.iontor.fastq
-x mix_traceinfo_in.iontor.xml
-i "insert_size:8900,insert_stdev:500"
C28-140_40X.sff
Por fim, executamos a montagem com o mesmo comando do mira:
mira
--project=frag
--job=denovo,genome,accurate,iontor
-GE:not=4 -OUT:ora=1
IONTOR_SETTINGS -AS:mrpc=100
Note que no informamos o tamanho do inserto pois essa informao j est embutida no arquivo
xml. O resultado de todas as configuraes de montagem para o Mira 3.4 est na tabela 6.1.
Todos
Nmero de contigs 76 1,716 5,987 2,753
Consenso 4,606,198 4,915,162 5,133,612 6,509,621
Maior Contig 358,908 7,696 26,661 414,460
N50 119,555 3,923 1,422 126,091
N90 41,691 1,869 334 616
N95 31,604 1,128 255 506
Leituras Utilizadas 1,085,429 2,235,506 4,384,827 2,906,577
58
Para montar o dataset de fragmentos utiliza-se o seguinte arquivo, chamado frag.manifest. Exem-
plo:
project = frag
job = genome,denovo,accurate
parameters = -GE:not=4 IONTOR_SETTINGS -AS:mrpc=100
readgroup = fragment
technology = iontor
data = frag_in.iontor.fastq frag_traceinfo_in.iontor.xml
Note que os parmetros esto definidos no topo do arquivo, mas o nome dos arquivos esto definidos
na seo readgroup em vez de serem determinados pela conveno de nomes. Mantivemos os mesmos
nomes de arquivos dos exemplos do mira 3.4, mas poderamos t-los chamado de qualquer outro nome
que quisssemos. Para executar a montagem digita-se o comando:
mira frag.manifest
O uso do arquivo de configurao se torna mais til quando temos mais de um readgroup:
project = mix
job = genome,denovo,accurate
parameters = -GE:not=4 IONTOR_SETTINGS -AS:mrpc=100
readgroup = frag
data = C11-127_40X.fastq C11-127_40X.xml
technology = iontor
readgroup = lmp89
data = C28-140_40X.fastq C28-140_40X.xml
technology = iontor
templatesize = 8328 9774
segmentplacement = ---> --->
readgroup = lmp35
data = FRA-257_40X.fastq FRA-257_40X.xml
technology = iontor
templatesize = 3075 3863
segmentplacement = ---> --->
Note que definimos 3 readgroups, um para cada tipo de biblioteca. Definimos tambm o intevalo
vlido para o tamanho do inserto das bibliotecas de mate-pair, assim como a sua orientao. Veja que
dessa vez utilizamos uma conveno de nomes completamente diferente, algo que no seria possvel no
mira 3.4.
Na tabela 6.2 podemos ver os resultados da montagem de diferentes combinaes de bibliotecas.
Number of contigs: Total consensus: Largest contig: N50 contig size: N90 contig size: N95 contig
size:
59
frag lmp35 lmp35 + frag lmp89 lmp89 + frag
Contigs Grandes
Nmero de Contigs 79 223 55 348 54
Consenso 4,633,751 4,573,815 4,632,400 4,562,390 4629,730
Cobertura (%) 99,9% 98,6% 99,8% 98,3% 99,8%
Maior contig 231,197 188,021 590,852 99,306 540,324
N50 93,793 40,235 204,781 30,520 185,223
N90 35,799 11,397 46,501 5,929 55,558
N95 26,409 7,035 36,041 3,710 45,094
Todos
Nmero de Contigs 79 260 146 410 104
Consenso 4,633,751 4,585,603 4,770,620 4,586,296 4,714,793
Cobertura (%) 99,9% 98,8% 102,8% 98,8% 101,6%
Maior Contig 231,197 188,021 590,852 99,306 540,324
N50 93,793 40,235 179,289 30,520 185,146
N90 35,799 11,378 40,957 5,811 51,490
N95 26,409 6,703 32,292 3,502 41,464
Leituras utilizadas 1,022,516 2,302,069 3,246,379 2,319,887 3,300,475
nmero total de contigs. Quanto maior esse nmero, mais fragmentada est a montagem e mais gaps
ela apresenta.
Outra estatstica muito importante so os Nxx: N50, N90 etc. O N50 representa o tamanho do
contig tal qual 50% do Total Consensus est representado por contigs iguais ou de mesmo tamanho.
De maneira similar se define o N90, o N95 ou qualquer outro que se queira. Na figura 6.2 vemos o grfico
da soma dos tamanhos dos contigs: do maior para o menor, esto indicados os pontos em que a soma
do tamanho representa 50%, 90% e 95% da soma total, e os respectivos valores de N50, N90 e N95. O
N50 normalmente reportado nas publicaes que tratam de montagem de genomas porque ele um
compromisso entre a capacidade do montador de gerar grandes contigs mas tambm em no fragmentar
muito o genoma.
Analisando os dados da tabela 6.2, vemos que a combinao de uma biblioteca de mate-pair com
uma de fragmentos gera contigs maiores (o N50 aumenta aproximadamente 5), e um nmero menor de
contigs grandes. Por outro lado, se olharmos para os dotplots gerados para todos esses datasets (6.3),
vemos que o nmero de contigs que se alinham fora da diagonal aumenta, o que indica um maior nmero
de misassemblies.
60
Assembly Statistics
105
4,750,000
100
4,500,000
95
4,250,000
90
4,000,000
85
3,750,000
80
3,500,000
75
70 3,250,000
Cumulative Length (%)
65 3,000,000
Cumulative Length
60 2,750,000
55 2,500,000
50 2,250,000
N95=30,290 bp
45 N90=36,060 bp
2,000,000
40
1,750,000
35
1,500,000
30
1,250,000
25 N50=119,186 bp
1,000,000
20
750,000
15
500,000
10
5 250,000
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Contig Number
Figura 6.2: Grfico da soma do tamanho dos contigs para o dataset de fragmentos.
A opo -r diz para o programa escolher o melhor alinhamento em relao referncia. possvel
tambm filtrar pelo tamanho do alinhamento, com a opo -l. Por exemplo, -l 1000 vai mostrar
somente os alinhamentos 1kbp ou mais.
Por fim utilize o comando mummerplot para gerar o grfico de comparao dos contigs contra a
referncia:
O mummerplot utiliza o gnuplot para gerar os grficos, por isso necessrio que esse programa esteja
instalado. Tambm possvel gerar um arquivo de imagem com a opo --png ou um Postscript com
--ps. Podemos ver o resultado do mmumerplot na figura 6.4.
Tendo o arquivo .ace basta clicar em Open Assembly e escolh-lo na janela de dilogo. No painel
da esquerda est a lista de contigs. Quando se clica em um deles o painel central mostra os alinhamentos
(ver figura 6.5).
61
Frag
3.5 kbp
8.9 kbp + Frag
Figura 6.3: Dotplot de todas as bibliotecas montadas com o mira 3.9. Na primeira coluna vemos o dotplot
das bibliotecas de fragmentos, LMP 3.5kbp e LMP 8.9 kbp, e na segunda coluna vemos a combinao
desses bibliotecas junto com a de fragmentos.
62
Figura 6.4: Dotplot da montagem do dataset de fragmentos deita pelo mummerplot.
63
64
Captulo 7
Apndices
F (j, k) = k (k + 1) + j (7.1)
Para aplicar a frmula, associamos a base da referncia com o valor 0, e as bases alternativas com os
valores 1, 2, 3, .... Depois, geramos todos os pares distintos (para uma combinao A,B e B,A, mantemos
somente A,B) e os ordenamos de acordo com a funo F . A ordem para 2,3 e 4 gentipos :
2 AA, AB, BB
3 AA, AB, BB, AC, BC, CC
4 AA, AB, BB, AC, BC, CC, AD, BD, CD, DD
Por exemplo, se a referncia for A e a variante for T, a ordem dos gentipos :
AA,AT,TT
E se a referncia for A e os gentipos as variantes forem C e T, a ordem :
AA,AT,TT,AC,CT,CC
65
. Indica que o read possui a mesma base que a referncia
+[num][bases] Indica uma insero de tamanho [num], com as bases [bases]. Por exemplo:
+2AG representa uma insero das bases AG, j +2AGTC representa uma insero das bases
AG seguida de duas substituies
-[num][bases] Indica uma deleo de tamanho [num], com as bases [bases]. Por exemplo:
-2AG representa a deleo das bases AG.
^[Q] Indica o incio do read, o caracter seguinte ao ^ indica o mapping quality em codificao
fastQ
Para gerar o pileup de um BAM utiliza-se o comando mpileup do samtools da seguinte maneira:
Se o arquivo possuir regies com cobertura muito alta, preciso especificar o parmetro -d <max cov>,
cujo default 250.
O resultado do comando mpileup do samtools no uma lista de SNPs, mas sim um BCF intermedirio
que ser utilizado para fazer a chamada. Nesse arquivo, vale ressaltar o campo I16, que uma lista de 16
estatsticas que podem ser utilizadas no variant calling (tabela 7.1). Nessa tabela vemos a quantidade de
bases que concordam com a referncia e as que esto diferentes da referncia (non-ref) em ambas as fitas,
vemos tambm as somas das qualidades ref e non-ref, a soma dos quadrados das qualidades, tambm
vemos a soma dos mapping qualities e os quadrados dos mapping qualities. Nos ltimos campos temos
a soma tail-distance, que a distncia da posio do read em relao aos extremos dele. Suponha a base
na posio k do read de comprimento l, a tail distance nesse caso min(k, l k).
Tambm podemos ver uma coluna chamada FORMAT, seguida por uma coluna para cada amostra.
A coluna FORMAT descreve o formato da informao de gentipo e nas colunas seguintes temos os
valores de gentipo para cada amostra. No caso temos o formato PL, que mostra a probabilidade de
cada gentipo em escala phred. A ordem dos gentipos definida pelo formato VCF. Para mais detalhes
veja a seo5.1.
66
Pos. Descrio
1 number of reference Q13 bases on the forward strand
2 number of reference Q13 bases on the reverse strand
3 number of non-ref Q13 bases on the forward strand
4 number of non-ref Q13 bases on the reverse strand
Tabela 7.1: Descrio dos valores do campo I16 gerado pelo samtools mpileup
#!/usr/bin/env perl
sub addchr {
my $line=shift;
if($line =~ /^(\d+|X|Y)/) {
$line="chr$line";
}elsif($line =~ /^MT/) {
$line =~ s/(^MT)/chrM/;
}
return $line;
}
while(<>) {
if(/^#/) {
if (/##contig=<ID=(.*?),(.*)/) {
# print "1=$1 2=$2\n";
print "##contig=<ID=",addchr($1),",$2\n";
} else {
print;
}
} else {
print addchr($_);
}
}
67
68
Referncias
69
70
Lista de Figuras
71
72
Lista de Tabelas
7.1 Descrio dos valores do campo I16 gerado pelo samtools mpileup . . . . . . . . . . . . . . 67
73
74
Referncias Bibliogrficas
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