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TEORIA E PRTICA
Alimentos, atuando Pesquisa, como a
principalmente nos Universidade Tecnolgica
seguintes temas: Federal do Paran, Instituto
hidrolisados proticos,
hidrlise enzimtica,
isolado protico de soja,
DA MICROBIOLOGIA: Paulista de Educao e
Universidade Estadual de
Campinas, principalmente na
TEORIA E PRTICA
peptdeos e irradiaco gama rea de ensino do cultivo e
e funcionalidade de manipulao de
alimentos. microrganismos em
Laboratrios de
Microbiologia. Atualmente
docente no Instituto Federal
de Educao, Cincia e
Tecnologia de Braslia,
atuando tambm como
Edilsa Rosa da Silva pesquisadora na rea de
Microbiologia Bsica e
Aparecida Snia de Souza Aplicada ao controle de
qualidade higinico-sanitria
de alimentos, biodegradao
de resduos
ligninocelulsicos,
monitoramento
microbiolgico sistemas de
tratamento biolgico de
Autoras: Edilsa Rosa da Silva e resduos e isolamento de
Aparecida Snia de Souza bactrias e fungos de
Ministrio da amostras ambientais.
Educao
PARTE 1
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
Introduo
ao Estudo da
Microbiologia:
Teoria e Prtica
Edilsa Rosa da Silva
Aparecida Snia de Souza
EDITORA IFB
BrasliaDF
2013
1
REITOR
Wilson Conciani
PR-REITORIA DE ENSINO
Adilson Cesar de Araujo
PR-REITORIA DE EXTENSO
Giano Luiz Copetti
PR-REITORIA DE ADMINISTRAO
Simone Cardoso dos Santos Penteado
Introduo
ao Estudo da
Microbiologia:
Teoria e Prtica
Edilsa Rosa da Silva
Aparecida Snia de Souza
EDITORA IFB
BrasliaDF
2013
2013 EDITORA IFB
Todos os direitos desta edio reservados Editora IFB.
Nenhuma parte desta publicao poder ser reproduzida ou transmitida de qualquer modo ou por qualquer meio, eletrnico ou
mecnico, incluindo fotocpia, gravao ou qualque tipo de sistema de armazenamento e transmisso de informao, sem prvia
autorizao, por escrito, da Editora do IFB.
Conselho Editorial Carlos Cristiano Oliveira de Faria Almeida Luiz Diogo de Vasconcelos Junior
Cristiane Herres Terraza Marco Antonio Vezzani
Francisco Nunes dos Reis Jnior Reinaldo de Jesus da Costa Farias
Gabriel Andrade Lima de Almeida Renato Simes Moreira
Gustavo Ablio Galeno Arnt Richard Wilson Borrozine de Siqueira
Juliana Rocha de Faria Silva Tatiana de Macedo Soares Rotolo
Katia Guimares Sousa Palomo Vanessa de Assis Araujo
Luciano Pereira da Silva Vinicius Machado dos Santos
ISBN 978-85-64124-22-6
CDU 579
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS5
APRESENTAO7
PARTE 1
INTRODUO MICROBIOLOGIA
PARTE 2
SEGURANA EM MICROBIOLOGIA 33
NORMAS BSICAS DE BIOSSEGURANA EM LABORATRIO 34
CONTROLE DE MICRORGANISMOS 36
AULA PRTICA 1 - ISOLAMENTO DE BACTRIAS TOTAIS PRESENTES
NAS DIGITAIS DAS MOS 38
AULA PRTICA 2 - ISOLAMENTO E QUANTIFICAO DE
MICRORGANISMOS A PARTIR DE AMOSTRA AMBIENTAL OU DE
ALIMENTOS 40
AULA PRTICA 3- MONITORAMENTO MICROBIOLGICO DE
AMBIENTES 43
AULA PRTICA 4 - ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE FUNGOS
FILAMENTOSOS E LEVEDURAS 47
AULA PRTICA 5 - TCNICAS DE PREPARAO DE LMINAS PARA
COLORAO 53
REFERNCIAS59
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
Qual a importncia no seu curso?
13
Microbiologia Ambiental;
Microbiologia de Alimentos;
Microbiologia Veterinria;
Microbiologia Agrcola;
Microbiologia Industrial;
entre outros.
14
PARTE 1
1858 Rudolf Virchow, Louis Pasteur e John Tyndall, e outros estudiosos
europeus desenvolveram experimentos que finalmente terminaram
com os debates sobre gerao espontnea.
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
Experimentos realizados por Pasteur e outros estudiosos, no sculo
XIX, resultaram em muitos avanos para a Microbiologia:
15
o patgeno deve ser isolado do animal inoculado e preciso
demonstrar que ele o organismo original;
16
PARTE 1
1928 Alexander Fleming e colaboradores (Chain e Florey)
descobriram e produziram o antibitico penicilina, sintetizado
pelo fungo Penicillium notatum;
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
animalia, protista, fungi e monera para as bactrias), com base em
anlises da morfologia da clula e na forma de nutrio dos seres vivos;
17
AS FERRAMENTAS DA Microbiologia
Microscopia tica
18
PARTE 1
A microscopia ptica (campo claro) se refere ao uso de qualquer tipo
de microscpio (Figura 1) que use luz para observar amostras.
Microscpio ptico
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
Figura 01. Microscpio ptico composto. (figura disponvel no Manual de
Instrues do Microscpico Olympus).
1. Fonte luminosa
2. Base
3. Interruptor de controle de voltagem
4. Platina
5. Condensador
6 e 7. Parafuso macro e micromtrico
8. Pinas
9. Tubo ou canho
10. Objetivas
11. Revlver
12. Oculares
13. Brao
19
Poder de resoluo (PR) a medida do menor objeto que pode ser
visto ao microscpio. funo do comprimento de onda luminosa () e da
abertura numrica (AN) da objetiva:
PR= /AN
20
PARTE 1
Distncia da operao
4,50 0,65 0,13
aproximada (mm)2
Poder de resoluo
2,0 0,7 0,4
(=500nm) (m)
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
Mxima ampliao
aproximada obtida 100X 450X 1000X
com a ocular 10X
1
Distncia focal a distncia do centro da lente da objetiva ao foco, dada em mm.
2
Distncia da operao a distncia entre a parte externa da lente da objetiva e o objeto, quando em
foco, dada em mm.
3
A objetiva de ampliao linear 10X denominada objetiva a seco de pequeno aumento.
4
A objetiva de ampliao linear 40-45X denominada objetiva a seco de grande aumento.
5
A objetiva de ampliao linear 100X denominada de imerso.
21
BACTRIAS
Ribossomo
DNA (nucloide)
Cpsula Citoplasma
Parede celular
Membrana Flagelos
Plasmtica
Pili
22
PARTE 1
Voc deve fazer uma pesquisa nos livros de Microbiologia Bsica e
pginas confiveis da Internet e identificar as bactrias nos ambientes
citados anteriormente.
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
seres vivos segundo Whitaker (reinos) e Woese (domnios).
23
A fase lag tambm chamada de fase de pseudo repouso, pois no
verificado aumento da populao bacteriana. Contudo, possvel detectar
intensa atividade metablica no interior da clula, com duplicao dos seus
componentes, preparando a clula para a diviso.
24
PARTE 1
As infeces alimentares so as doenas provocadas pela ingesto
de alimentos contaminados, em sua maioria, por um nmero elevado
de clulas bacterianas, que provocaro um quadro de infeco quando
atingirem o trato intestinal humano.
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
As intoxicaes alimentares so as doenas provocadas pela ingesto
de alimentos contaminados com toxinas produzidas previamente pelo
microrganismo patognico.
FUNGOS
25
Os fungos filamentosos so multicelulares ou pluricelulares. Os seus
filamentos so chamados de hifas, que podem apresentar-se como cenoctica
ou hifas que no apresentam septos, separando as clulas umas das outras
e hifas septadas mononucleadas ou multinucleadas. O conjunto de hifas
denominado de miclio e representa o corpo fngico com caractersticas
morfolgicas especficas para cada gnero: algodonoso, aveludado, com ou
sem pigmentao, crescimento intenso ou discreto entre outros.
Ribossomo
Membrana Plasmtica
Lisossomos
Complexo de Golgi
Microtbilos Vescula
Reticulo endoplasmatico
Ribossomos livres
Mitocondria Vescula
26
PARTE 1
Os fungos se destacam no ambiente tambm por suas associaes
benficas: se associam s razes da maioria das plantas, em uma interao
simbitica, formando as micorrizas, que ajudam as plantas a absorverem
minerais e gua do solo, e tambm constituem os lquens, que so uma
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
combinao de uma alga verde (ou uma cianobactria) com um fungo, em
uma associao mutualstica.
27
clula parental (me). No final do processo de separao ocorre a formao
de duas clulas desiguais, ficando a clula me com cicatrizes em sua
superfcie.
28
PARTE 1
O Filo ascomiceto, ou fungos de saco, inclue fungos com hifas
septadas e algumas leveduras. Os esporos assexuais so chamados de
condios produzidos em cadeias a partir de um corpo de frutificao
microscpico (conidiforo). Esses esporos so liberados facilmente no
INTRODUO A MICROBIOLOGIA
ambiente e flutuam no ar como poeira. Os esporos sexuais, chamados de
ascsporos, so produzidos em uma estrutura em forma de saco conhecido
como asco. Gneros bastante conhecidos so o Neurospora (muito estudado
pela engenharia gentica), Talaromyces e Aspergillus.
29
PARTE 2
Introduo a
Microbiologia Prtica
PARTE 2
O laboratrio de Microbiologia trabalha com uma variedade de
microrganismos e materiais contaminados. Alguns desses organismos so
patgenos oportunistas ou podem vir a s-lo de acordo com as circunstncias
e a dose da contaminao.
SEGURANA EM Microbiologia
33
As principais rotas de infeco ou portas de entrada de microrganismos,
no corpo humano, no ambiente laboratorial so: boca (ingesto) pipetao,
mos e materiais contaminados; pulmes (inalao) ar contaminado; pele:
agulhas contaminadas, pipetas Pasteur, vidros infectados quebrados; olhos:
atravs de respingos contaminados.
34
PARTE 2
Use culos de segurana nas tarefas que apresentarem riscos.
35
Identifique de maneira clara e completa os materiais particulares (por
exemplo: tipo de amostra, data, nome da equipe, turma, mtodo,
meio de cultivo, microrganismo inoculado, entre outras informaes
pertinentes).
CONTROLE DE MICRORGANISMOS
36
PARTE 2
Os seguintes termos so usados para descrever os processos
fsicos e qumicos empregados no controle de microrganismos:
37
AULA PRTICA 1 - ISOLAMENTO DE BACTRIAS TOTAIS
PRESENTES NAS DIGITAIS DAS MOS
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Realizar o procedimento de coleta das digitais dos dedos das mos,
na Placa de Petri com gar padro, prximo ao bico de Bunsen ou
lamparina com assepsia, conforme orientao/demonstrao do(a)
professor(a);
38
PARTE 2
RESULTADOS
Intensidade: +++: crescimento intenso; ++: crescimento moderado; +: crescimento pequeno; -: ausncia
de crescimento.
39
AULA PRTICA 2 - ISOLAMENTO E QUANTIFICAO DE
MICRORGANISMOS A PARTIR DE AMOSTRA AMBIENTAL
OU DE ALIMENTOS
MATERIAL
Diluio da Amostra
40
PARTE 2
Tcnica de Profundidade (Pour Plate)
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
Realizar a coleta da amostra ambiental ou de alimentos, atendendo s
recomendaes de assepsia;
41
RESULTADOS
gar padro
(bactrias totais)
gar PDA
(fungos totais)
1. Por que o meio na tcnica do pour plate deve ser mantido fundido a
no mximo a 50C?
4. Por que a tcnica de spread plate mais indicada para aerbicos estritos?
42
PARTE 2
AULA PRTICA 3- MONITORAMENTO
MICROBIOLGICO DE AMBIENTES
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
A amostragem deve ser feita perto de equipamentos abertos e outros
locais nos quais as correntes de ar podem levar a contaminao;
43
RESULTADOS
Expressar o resultado em nmero de microrganismos viveis/ rea de
placa de Petri (rea padro: 70,88 cm2)/ tempo de exposio (15 min
a 2 horas).
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Adicionar 10 mL de soluo de Ringer no recipiente a ser analisado
e agitar cuidadosamente;
44
PARTE 2
retirar uma alquota de 1 mL e distribuir em placas de Petri (duplicata/
triplicata) e fazer inoculao tipo pour plate com o gar liquefeito; e
MATERIAL
45
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Colocar o padro de cartolina estril sobre a superfcie a ser
examinada;
RESULTADOS
Efetuar a contagem das colnias nas placas e emitir o resultado como
nmero de UFC/ 25 cm2 de rea avaliada.
46
PARTE 2
2. Qual o principal objetivo do mtodo de soluo de enxague e do mtodo
do esfregao em superfcie?
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
47
Fungo:
48
PARTE 2
Examine ao microscpio, nas objetivas de aumento de 4 e 10x, os
fungos filamentosos (preparo de lmina fresco) e identifique: hifas
areas (presena ou ausncia de septos e colorao), hifas submersas
e corpos de frutificao (endgenos/ exgenos, forma, tamanho, cor).
Isolamento fngico
Em uma Placa de Petri contendo PDA ou gar Sabouraud, procure fixar
no centro alguns gros/oleaginosas (por exemplo, amendoim, feijo,
arroz, trigo, soja). Incube a 2530C, por 5 dias, ou temperatura
ambiente e verifique o crescimento fngico atravs de anlise macro
e microscpica.
49
Meio de cultura/ Caractersticas macroscpica
Fungo/Aumento e microscpicas
Microcultivo (figura 4)
50
PARTE 2
Meio de cultura/Fungo/Aumento Caractersticas microscpicas
51
PLANILHA DE OBSERVAO
MATERIAL: ______________________________________________________
OBSERVAES:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
52
PARTE 2
AULA PRTICA 5 - TCNICAS DE PREPARAO DE
LMINAS PARA COLORAO
2. Fixao do material
Passar a lmina na chama do Bico de Bunsen ou lamparina (parte
azul), rapidamente trs vezes, com o lado do material a ser analisado
voltado para cima. A lmina no deve aquecer excessivamente.
53
3. Colorao
COLORAO DE GRAM
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparar um esfregao no centro da lmina e deixar secar ao ar;
54
PARTE 2
lavar a lmina com gua corrente de baixa presso (pisseti);
RESULTADO
Clulas violetas (Gram +); clulas vermelhas (Gram -).
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparar um esfregao no centro da lmina e deixa secar ao ar;
55
RESULTADO
MATERIAL
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Coletar a amostra cuidadosamente homogeneizada e colocar uma
gota em uma lmina. Misturar com uma gota da soluo de cristal
violeta;
RESULTADO
3. Quais os principais cuidados que devem ser tomados com relao ao uso
do microscpio?
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PARTE 2
PLANILHA DE OBSERVAO
MATERIAL: ______________________________________________________
OBSERVAES:
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
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REFERNCIAS
60
ANEXO 1
MICROSCOPIA DE BACTRIAS
62
ANEXO 2
MICROSCOPIA DE FUNGOS
A B
C D
F
E
64
Esta obra foi composta pela fonte Famlia Optima,
corpo 11 e em papel couche fosco 115g.