Universidade de So Paulo

Instituto de Cincias Biomdicas

Departamento de Microbiologia
BMM121 Microbiologia Bsica

Apostila de Aulas Prticas

Profa. Elisabete Jos Vicente
bevicent@usp.br
3091.7350

2004
 MICROBIOLOGIA

NORMAS DE SEGURANA PARA AS AULAS PRTICAS DE MICROBIOLOGIA

indispensvel o uso de avental no laboratrio. O avental deve ser comprido, de

mangas compridas e estar abotoado;
No comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratrio;
O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido
longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material
necessrio ao trabalho prtico, como: roteiro de aula, papel e lpis ou caneta para
anotaes;
Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas,
ferimentos, aspirao de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o
tcnico responsvel pela aula prtica;
Descarte de material:
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes prprios,
existentes nos laboratrios. NUNCA deix-los nas bancadas ou pias;
b) Placas de petri devero ser deixadas tampadas sobre a bancada;
c) Lminas fornecidas para visualizao devero ser deixadas sobre as
bancadas;
d) Tubos com culturas devero ser deixados nas estantes.

Prestar ateno s atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes

Terminados os trabalhos prticos:
a) Esterilizar alas e fios de platina;
b) Verificar se as torneiras de gua e gs esto fechadas;
c) Desligar lmpadas e microscpios;
d) Limpar microscpios e cobri-los com a capa;
e) Tirar o avental e guardar;
f) Lavar cuidadosamente as mos com gua e sabo ou anti-sptico.

3
 Mdulo I
Introduo microbiologia

4
 Mdulo I ......................................................................................................................... 4
Introduo microbiologia ............................................................................................. 4
Prtica 1 - NOES BSICAS DE ASSEPSIA ................................................................. 7
Tcnica de semeadura ............................................................................................... 7
Objetivo .................................................................................................................... 10
Material ..................................................................................................................... 10
Procedimento e Resultados...................................................................................... 10
Questionrio ............................................................................................................. 11
PRTICA 2 - COLORAO DE GRAM........................................................................... 12
Fixao e colorao de microrganismos................................................................... 12
Preparao de esfregaos e colorao pelo mtodo de gram.................................. 13
A tcnica ................................................................................................................... 15
Objetivo .................................................................................................................... 16
Material ..................................................................................................................... 16
Procedimento:........................................................................................................... 16
Resultados:............................................................................................................... 18
Questionrio ............................................................................................................. 18
PRTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCPICA E MICROSCPICA MICROBIANA..... 19
Objetivo .................................................................................................................... 19
Materiais ................................................................................................................... 19
Procedimento e resultados ....................................................................................... 19
A. Visualizao de bactrias:.................................................................................... 19
B. Visualizao de fungos......................................................................................... 20
PRTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO .................................................................... 21
Crescimento Bacteriano ........................................................................................... 21
Curvas de crescimento ............................................................................................. 22
Objetivo .................................................................................................................... 25
Material ..................................................................................................................... 25
Procedimento............................................................................................................ 25
Resultados................................................................................................................ 25
Questionrio ............................................................................................................. 25
PRTICA 5 - DETERMINAO DA CONCENTRAO MICROBIANA NUMA
SUSPENSO................................................................................................................... 26
Estimativa do nmero de clulas viveis .................................................................. 26
Problema: ................................................................................................................. 27

5
 Verificao de entendimento: ................................................................................... 28
PRTICA 6 - AO DE ANTI-SPTICOS NA DESINFECO DA PELE ..................... 29
Anti-spticos e desinfetantes .................................................................................... 29
Objetivos................................................................................................................... 31
Material ..................................................................................................................... 31
Procedimento............................................................................................................ 32
Resultados................................................................................................................ 32
Questionrio ............................................................................................................. 32
PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA ...................................................................................... 32
Teoria ....................................................................................................................... 32
Objetivo .................................................................................................................... 33
Materiais ................................................................................................................... 33
Procedimento............................................................................................................ 33
Questionrio ............................................................................................................. 34
PRTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS. ............... 35
Introduo................................................................................................................. 35
Objetivo .................................................................................................................... 35
Material ..................................................................................................................... 35
Procedimento............................................................................................................ 35
Resultados................................................................................................................ 35
Questionrio ............................................................................................................. 35
PRTICA 9 - CONJUGAO DE BACTRIAS............................................................... 36
Introduo................................................................................................................. 36
Objetivo .................................................................................................................... 37
Material ..................................................................................................................... 37
Procedimento............................................................................................................ 38
Resultados................................................................................................................ 39
PRTICA 10 - POSTULADO DE KOCH.......................................................................... 40
Abordagem clssica ................................................................................................. 40

6
 PRTICA 1 - NOES BSICAS DE ASSEPSIA

Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminao do manipulador

como tambm dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.

TCNICA DE SEMEADURA

Toda a vez que se fizer uma semeadura importante seguir as regras abaixo
mencionadas para evitar a contaminao dos meios de cultura por microrganismos
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais.
1. Flambagem da ala ou fio de platina:
Tanto a ala quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de
qualquer operao de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte
inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posio correta para
a flambagem da ala que a mesma faa um ngulo de 45o em relao mesa de
trabalho (Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Para retirar o material, seja para fazer um esfregao ou para uma semeadura, esfriar
previamente a ala. Esta dever ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na
tampa da placa de petri;

Figura 1- Posio correta para a flambagem da ala

2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a

7
 boca dos mesmos imediatamente aps a retirada da tampa (ou tampo de
algodo). Esta dever ser mantida segura pelo dedo mnimo, da mo que est
segurando a ala ( Figura 2). Aps a retirada do material com a ala, flambar
novamente a boca do tubo e colocar a tampa. No pousar os tampes sobre a
bancada!!! Flambar a ala aps o uso;

Figura 2 Removendo o tampo de algodo

3. As pipetas utilizadas em microbiologia so previamente esterilizadas, so

oferecidas embrulhadas em papel (s vezes, dentro de um cilindro metlico).
Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente o papel
da parte superior e depois a parte inferior (correspondente ponta da pipeta).
Esta seqncia evite que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador.
Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo
soluo desinfetante.

4. As placas de Petri devero ser abertas prximo ao bico de Bunsen para evitar
contaminao com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser
incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

5. Na semeadura usando placas de Petri, aps flambar a ala at o rubro, e

introduzi-la na cultura de bactria, semear na placa de Petri (fig.3).

8
 Figura 3 Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias

6. Aps a primeira estria, flambar novamente a ala, girar a placa cerca de 30 e

puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4) Essa
tcnica conhecida tambm por esgotamento.
7. As placas sero incubadas a 37C por 24h, e depois guardadas a 4C at a
prxima aula.

Figura 4 Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficincia no isolamento de

colnias

1No esquea!!!!!!
Sempre resfrie a ala (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou
num pedao do gar sem cultura), antes de colocar a ala em contato com a cultura,
lembre-se: ela est muito QUENTE!!!
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.

9
OBJETIVO
Fazer semeaduras em meios lquido e slido de cultura de Eschirichia coli, e obter
colnias isoladas

MATERIAL
ala de platina;
tubo de ensaio com meio completo lquido
placa de Petri com meio completo slido;
tubo de ensaio com cultura de Eschirichia coli.

PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Descreva o que foi realizado em cada uma das etapas abaixo, no esquecendo de
ilustrar os resultados obtidos

A) SEMEADURA EM MEIO LQUIDO

B) SEMEADURA EM PLACAS CONTENDO MEIO SLIDO

10
 C) OBTENO DE CULTURAS PURAS

QUESTIONRIO

1. Por que deve-se flambar os tubos antes e depois de cada transferncia?

2. Por que deve-se manter sempre que possvel a placa de Petri com meio slido
invertida?
3. Qual a finalidade de se fazer vrias estrias, na semeadura em placa, contendo
meio slido?

11
 PRTICA 2 - COLORAO DE GRAM

FIXAO E COLORAO DE MICRORGANISMOS

A morfologia individual e as reaes tintoriais constituem, em geral, os critrios

preliminares para identificao das bactrias e sua posterior classificao. O exame
microscpico direto de um microrganismo comumente suplementado com exame
microscpico aps colorao que, alm de facilitar sua observao, permite a
visualizao de determinadas estruturas. Porm, antes de ser corado, o microrganismo
deve ser fixado lmina, atravs de secagem por simples exposio ao ar ou secagem
na chama.
Os corantes so sais compostos de um on positivo e um on negativo. Um desse
ons, o que d a cor, chamado de radical cromforo. Ento, os corantes conhecidos
como bsicos tem a cor do seu on positivo, enquanto que os cidos tem a cor do seu on
negativo. A clula bacteriana negativamente carregada, portanto atrai corantes
bsicos. Os corantes bsicos mais comuns so: cristal violeta, azul de metileno e
safranina .
Existem inmeros mtodos para colorao. A introduo de coloraes, no estudo
dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro
razes principais:

Permitem uma visualizao melhor das clulas, j que nas preparaes

sem corantes so reveladas apenas o contorno e a conformao dos
arranjos;
Permitem a caracterizao de alguns componentes intracelulares;
Podem levar diferenciao entre os grupos de microrganismos e
Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.

Quanto aos tipos de colorao temos:

1) Colorao simples - cuja proposta apenas tornar a forma e estrutura bsica das
clulas mais visveis.

2) Colorao diferencial - nessa colorao o corante reage diferentemente com

12
 diferentes tipos de bactrias. A colorao de Gram e a lcool - cido resistente so
exemplos de coloraes diferenciais.

3) Colorao especial - so aquelas utilizadas para corar e identificar partes especficas

dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presena de cpsulas.

No processo de colorao podem ser usadas substncias que intensificam a cor por
aumentarem a afinidade do corante com seu espcime biolgico. Essas substncias so
chamadas mordentes, e o caso do iodo na colorao de Gram. Uma outra funo do
mordente tornar uma estrutura mais espessa e mais fcil de visualizar aps a
colorao.

PREPARAO DE ESFREGAOS E COLORAO PELO MTODO DE

GRAM

Mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans

Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um
esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-
acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em
Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das
amostras analisadas.
A colorao de Gram no est relacionada com os constituintes qumicos da
parede celular, mas sim com sua estrutura fsica, o que confere a caracterstica de
positividade ao Gram.
A colorao de Gram uma colorao diferencial porque no cora todos os tipos
de clulas igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, em
razo das diferenas na estrutura da parede celular das bactrias.
Aquelas bactrias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV)
mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo),
enquanto que as que no retm o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo).
Bactrias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que
as Gram(-) (Fig. 5).

13
 Parede celular constituda de uma camada
grossa de peptdeoglicano

Gram positiva
Membrana plasmtica

Complexo de membrana externa, com incluses

de lipopoliprotenas e lipossacardeos

Parede celular constituda de uma camada

fina de peptdeoglicano

Membrana plasmtica
Gram negativa

Figura 5 Estruturas tpicas das paredes de bactrias Gram positivas e Gram negativas

Quando aplicado em clulas Gram (+) e Gram (-) o cristal violeta (CV) e o iodo
penetram facilmente, e dentro das clulas eles se combinam para formar o complexo CV-
Iodo, que maior que a molcula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o
complexo no pode ser lavado das clulas Gram (+) pelo lcool e ento estas clulas
permaneceram coradas pelo CV e aparecem violeta.
Nas clulas Gram (-) o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo
lavado atravs da camada fina de peptideoglicano, que no consegue reter o complexo.
Estas clulas so ento contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e
aparecem vermelhas.
Esta colorao o ponto de partida na identificao bacteriana, mas no deve
nunca ser utilizada como um diagnstico definitivo. importante ressaltar que a
colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til, quando corretamente
realizada e interpretada.

14
A TCNICA

O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana

crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de
tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gram-
negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma
colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em
seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona
(1:1 v:v). O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias
Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, decorando as clulas. Por
outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Gram-
positivas e provoca a contrao dos poros do peptidioglicano, tornando-as impermeveis
ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da
descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo
do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A
reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e
qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade
e integridade.
Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Ao
microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as
Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Gram-positivas,
clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos,
tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou
todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco
importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o
tratamento com etanol-acetona for omitido.
O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo
azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho safranina.
A fucsina cora muitas bactrias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que
por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanol-
acetona pode ser substitudo por lcool 95%.

O objetivo desta prtica demonstrar a importncia desta colorao e fazer com

que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente,
devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.

15
OBJETIVO
Colorao de microrganismos provenientes de meios, slido e lquido, pelo mtodo
de Gram.

MATERIAL
ala de platina;
lmina de vidro;
placa de Petri com cultura de microrganismo em meio slido;
tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio lqudo;
cristal violeta a 1%;
lugol;
soluo diferenciadora;
fucsina bsica;

PROCEDIMENTO:

A. PREPARO DO ESFREGAO

Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio lquido

1) Flambar a ala corretamente
2) Esfri-la nas paredes do tubo
3) Introduzi-la no meio lquido de maneira que este forme um filme sobre a ala.
4) Colocar o material coletado sobre uma lmina limpa e seca.
5) Espalhar o material sobre a lmina, procurando obter um esfregao fino.
6) Secar tempetatura ambiente.
7) Fixar o esfregao na chama do bico de Bunsen, passando a lmina algumas vzes
pela chama.
OBS. Esperar que o esfregao esteja completamente seco para fix-lo.
8) Realizar a colorao.

Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio slido

1) Colocar com a prpria ala, j flambada, uma gota de gua de torneira no centro da
lmina de vidro.
2) Flambar novamente a ala

16
3) Esfri-la na tampa da placa de Petri, ou no meio slido numa regio sem colnia.
4) Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano.
5) Homogeneizar este material com a gota de gua, cuidando para obter uma suspenso
pouco densa e sem grumos.
6) Secar a lmina por exposio ao ar.
7) Fixar o esfregao.

B. COLORAO
1) Cobrir o esfregao com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENO PARA NO
COLOCAR A LMINA INVERTIDA!!!!!!!!
2) Lavar rapidamente em gua corrente;
3) Cobrir todo o esfregao com lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em gua corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a soluo diferenciadora: lcool ou acetona;
6) Lavar rapidamente em gua corrente;
7) Cobrir todo o esfregao com fucsina bsica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em gua corrente;
9) Secar a lmina, tomando o cuidado de no remover o esfregao;
10) Observar ao microscpio com objetiva de imerso.

1Observaes importantes para obteno de bons resultados na colorao de Gram.

A soluo de cristal-violeta deve ser semanalmente renovada, devendo ser filtrada para a
remoo de precipitados.
A etapa de descolorao um passo crtico na colorao. Ela deve ser efetuada
rapidamente. Porm, no to rapidamente que a descolorao no possa ser completada.
Os esfregaos no devem ser muito espessos, pois so mais difceis de descorar e de
permitir observaes.
Esfregaos obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na colorao, com
bactrias G (+) apresentando-se como G(-) e bactrias G(-) corando-se fracamente. Evitar estas
culturas!

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RESULTADOS:

___________________ ____________________

__________________ ___________________

QUESTIONRIO

1. Descreva como so e do que se compem as paredes das bactrias Gram

positivas e Gram negativas?
2. Cite alguns fatores que podem influenciar na colorao de Gram, podendo
inclusive levar a erros?

18
 PRTICA 3 - MORFOLOGIA MACROSCPICA E MICROSCPICA
MICROBIANA

OBJETIVO
Visualizao das colnias crescidas em placas contendo meio slido e anlise por
microscopia ptica e Morfologia de bactrias e de fungos .

MATERIAIS
Lminas de placas com microrganismos diferentes (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes e
dois tipos de fungos);
Microscpio tico;

PROCEDIMENTO E RESULTADOS
Faa um esboo das caractersticas morfolgicas e suas propriedades tintoriais de
cada uma das bactrias apresentadas. Repita o procedimento para os fungos
apresentados.

A. Visualizao de bactrias:

b) Cocos Gram + : Staphylococcus aureus

c) Bacilos Gram + : Bacillus subtilis

d) Bacilos Gram - : Pseudomonas aeruginosa

19
 e) Cocos Gram + : Streptococcus pyogenes

B. Visualizao de fungos
Filamentosos

Leveduras

20
 PRTICA 4 - CURVA DE CRESCIMENTO

CRESCIMENTO BACTERIANO

O crescimento de qualquer organismo pode ser definido como o aumento do

nmero de suas clulas ou o aumento de sua massa. Nos organismos unicelulares, o
crescimento pode ser entendido como:
aumento de tamanho de uma clula individual;
aumento da massa de uma clula individual;
aumento do nmero de clulas de uma populao;
aumento da massa total de uma populao.
O aumento em tamanho de uma clula bacteriana conduz diviso celular e
conseqente aumento do nmero de indivduos na populao, seja em ambientes
naturais (in vivo) ou em culturas de laboratrio (in vitro).
Do ponto de vista bioqumico, cada clula bacteriana uma unidade cataltica.
Quando uma bactria se divide, cada novo indivduo pode catalisar a biossntese de
material celular adicional. Assim, o nmero de unidades catalticas (clulas) aumenta
com o tempo e, como conseqncia, biomassa sintetizada em uma taxa progressiva na
populao em crescimento.
Uma caracterstica importante do crescimento bacteriano o fato de que a maioria
das espcies de bactrias capaz de crescer em taxas bastante rpidas. O tempo de
gerao refere-se ao tempo requerido para uma clula bacteriana duplicar seu DNA e
dividir-se. Sob condies timas de crescimento, muitas espcies bacterianas
apresentam um tempo de gerao mdio de 20 minutos, ou seja, a cada 20 minutos uma
nova gerao de indivduos produzida.
Em uma populao composta por milhares de bactrias em crescimento ativo,
pode-se presumir que a maioria delas esteja se dividindo ao mesmo tempo e a cada
nova gerao (e.g., a cada 20 minutos) a populao dobra de tamanho. Este tipo de
crescimento populacional denominado de crescimento exponencial ou logartmico, no
qual o nmero de indivduos dobra a cada gerao.
A maior vantagem de um tempo de reproduo to rpido que as bactrias
podem evoluir muito rapidamente e esta e a razo do seu sucesso no mundo vivo. A
evoluo ocorre atravs de mutaes genticas que produzem variaes na
descendncia de um organismo e o ambiente determina que mutaes so vantajosas
no sentido de aumentar suas chances de sobrevivncia e de sucesso reprodutivo
(adaptao). Devido aos tempos de gerao muito curtos, as bactrias podem testar

21
bilhes de mutaes em pequenos intervalos de tempo.
Portanto, o crescimento bem sucedido de uma populao bacteriana reflete seu
grau de adaptao a um determinado ambiente e depende primariamente de sua
composio: condies nutricionais, temperatura, pH, osmolaridade, oxignio e luz. As
distintas espcies bacterianas diferem no mbito de fatores dentro dos quais podem
crescer. Cada grupo bacteriano tem uma faixa de condies nas quais seu crescimento
atinge uma taxa tima.
Para se estudar o crescimento de uma bactria preciso cultiv-la, como cultura
pura, em meios de cultura e condies ambientais que variam em condies qumicas e
fsicas, tais como fontes de nutrientes, osmolaridade, pH, presena ou ausncia de
oxignio e temperatura de incubao.
O crescimento de uma cultura bacteriana pode ser monitorado atravs do
aumento da biomassa total em determinados intervalos de tempo (atravs de curvas de
crescimento) ou da estimativa do nmero de clulas viveis presentes na populao
(mtodo de determinao do nmero de unidades formadoras de colnia). No h
mtodo perfeito; ambos os mtodos apresentam vantagens e desvantagens. A escolha
do mtodo depende da situao particular que se apresente.

CURVAS DE CRESCIMENTO

Uma das abordagens mais comuns no estudo do crescimento bacteriano a

obteno de curvas de crescimento. Estas so representaes grficas do aumento do
nmero de indivduos em um determinado perodo de tempo.
Em condies experimentais, quando se inocula uma populao bacteriana em
um frasco contendo uma quantidade inaltervel de meio de cultura (sistema fechado), o
crescimento dessa populao passa por quatro fases caractersticas, dependendo do
ponto no qual o processo do crescimento seja interrompido pelo experimentador. Essas
quatro fases esto representadas na Figura 6.

Figura 6 Curva de crescimento bacteriano padro em sistema fechado

22
Fase lag: fase de adaptao metablica ao novo ambiente; o metabolismo celular est
direcionado para sintetizar as enzimas requeridas para o crescimento nas novas
condies ambientais encontradas pelas clulas. O nmero de indivduos no aumenta
nesta fase, podendo at mesmo decrescer. A durao dessa fase depende das
condies ambientais nas quais as clulas se encontravam anteriormente. A fase lag
ser to mais longa quanto maiores as diferenas de composio do ambiente anterior
ou se a populao for constitudo de bactrias esporuladas.
Fase exponencial ou logartmica: fase na qual o nmero de clulas da populao
dobra a cada gerao. Esta taxa de crescimento no pode ser mantida indefinidamente
em um sistema fechado. Aps um determinado perodo de crescimento exponencial, as
condies ambientais tornam-se desfavorveis pela escassez de nutrientes essenciais,
acmulo de metablitos txicos e limitao de espao. A taxa de crescimento da
populao diminui e segue-se a fase estacionria.
Fase estacionria: fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido
s condies limitantes do meio. As clulas continuam metabolizando e se dividindo, mas
parte das clulas torna-se invivel e a taxa de diviso celular muito prxima da taxa de
morte celular, o que mantm constante o nmero de clulas viveis na populao. A
curva de crescimento atinge um plat. A durao da fase estacionria depende do
balano entre a taxa de diviso celular e o nmero de clulas que vo se tornando
inviveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido s condies ambientais
tornarem-se progressivamente desfavorveis.
Fase de declnio: fase de declnio exponencial do nmero de clulas viveis: a taxa de
morte celular torna-se maior que a taxa de diviso. O nmero de clulas viveis entra em
declnio progressivo at a completa extino da populao.

Para a construo de uma curva de crescimento bacteriano, mede-se o aumento

da biomassa total de uma cultura bacteriana em crescimento em meio lquido atravs de
medidas da densidade ptica da cultura. Alquotas da cultura em crescimento so
retiradas em determinados intervalos de tempo e mede-se a absorbncia da cultura
contra um comprimento de onda de 600 nm. Para tal utiliza-se um espectrofotmetro
onde o branco o meio de cultura utilizado, ausente de inculo.
Cada medida obtida corresponde densidade ptica (DO) da cultura em um dado
momento do crescimento. A absorbncia aumenta proporcionalmente ao aumento do
nmero de clulas (biomassa) na populao. Desta forma pode-se construir um grfico
representativo do progresso do crescimento, relacionando-se a DO pelo tempo.

23
 S so confiveis medidas de DO at 2.0. Acima disto as leituras perdem a
confiabilidade. Se a leitura de uma amostra for maior que 2.0 deve-se fazer uma diluio
10-1 dessa amostra e registrar sua DO. Para a plotagem dos dados no grfico deve-se
multiplicar a DO obtida por 10.

Quadro 1. Vantagens e desvantagens do mtodo de medidas da densidade ptica

Vantagens Desvantagens e limitaes
simplicidade da metodologia; no possvel a estimativa do
nmero de clulas/ml da populao;
medidas prontamente obtidas: o clulas inviveis, fragmentos de
resultado do experimento conhecido ao seu clulas mortas e material difundido no
final; meio de cultura interferem na obteno
de resultados ;
possibilita o reconhecimento do padro s se obtm leituras acuradas da
de crescimento da populao bacteriana em DO at o valor de 2.0, acima disto as
estudo (as diferentes fases do crescimento leituras perdem a confiabilidade;
bacteriano podem ser visualizadas em
grfico);
pode-se estabelecer comparaes do
padro de crescimento de diferentes
populaes bacterianas;
pode-se estabelecer comparaes do
padro de crescimento sob diferentes
condies ambientais;
clulas bacterianas agrupadas aps a
diviso celular no prejudicam os resultados;
reduzida quantidade de material
utilizado;
a introduo de erros experimentais
pelo operador menor;
o experimento no cansativo,
reduzindo a introduo de erros experimentais
por parte do operador;

24
OBJETIVO
Obter uma curva de crescimento bacteriano de uma cultura pura de E. coli
atravs de medidas de densidade ptica.

MATERIAL
Cultura bacteriana pura;
Espectofotmetro;
Soluo salina;
Pipetas;
Tubos de ensaio;

PROCEDIMENTO
Durante a aulas sero obtidos apenas alguns pontos experimentais, os demais
pontos sero medidos pelos monitores e repassados para os grupos.

RESULTADOS
A) Construir um grfico a partir dos pontos obtidos.(No se esquea
de identificar os eixos, e suas unidades!!!)
B) Identificar cada uma das fases de crescimento no grfico.

QUESTIONRIO
1. Quais os problemas observados na construo dos grficos (em que etapa do
crescimento)? Voc diria que todos os pontos so confiveis? Justifique sua resposta.

25
 PRTICA 5 - DETERMINAO DA CONCENTRAO MICROBIANA NUMA
SUSPENSO

ESTIMATIVA DO NMERO DE CLULAS VIVEIS

A estimativa do nmero de clulas viveis comumente feita atravs de diluies

seriadas de uma cultura bacteriana, em soluo salina, seguido da semeadura de uma
alquota de cada diluio em placas de Petri contendo meio bacteriolgico slido. Esta
tcnica baseia-se na hiptese de que, no espalhamento, clulas bacterianas individuais
ocuparo posies separadas na superfcie do meio de maneira que cada uma d
origem a uma colnia bacteriana isolada. As colnias crescendo no meio de cultura
podem ser visualizadas e contadas pelo experimentador.
Como cada colnia supostamente originou-se da multiplicao um nico indivduo,
o resultado da contagem das colnias multiplicado pela quantidade de diluies decimais
a estimativa do nmero de bactrias presentes em um ml da cultura original. A clula
individual que originou uma colnia denominada de "Unidade Formadora de Colnia"
ou UFC.
Esse procedimento repetido em diferentes intervalos de tempo e com os
resultados pode-se construir um grfico representando o progresso do crescimento

Quadro 2. Vantagens e desvantagens do mtodo da contagem de clulas viveis

Vantagens
permite uma estimativa do nmero
de clulas viveis/ml da populao
possibilita o reconhecimento do
padro de crescimento da populao
bacteriana em estudo (as diferentes fases
do crescimento bacteriano podem ser
visualizadas em um grfico)
Desvantagens e limitaes
detecta somente as clulas viveis e
que se repliquem, ou seja, aquelas
capazes de formarem colnias; muitos
indivduos viveis podem no se replicar,
prejudicando o clculo
se as clulas da bactria estudada
mantm-se agrupadas aps a diviso
celular (cada colnia em meio slido seria
formada por mais de uma clula)

pode-se estabelecer comparaes se as diluies no forem

do padro de crescimento de diferentes
populaes bacterianas
pode-se estabelecer comparaes
do padro de crescimento sob diferentes
condies ambientais
homogeneizadas adequadamente
se um nmero muito pequeno ou
muito grande de colnias for usado na
contagem
se o operador no fizer o
espalhamento rapidamente e de forma

26

clulas inviveis, fragmentos de
clulas mortas e material difundido no meio
de cultura no interferem na obteno de
resultados
adequada.
a cada diluio um erro experimental
introduzido pela instrumentao e pelo
experimentador
este mtodo detecta apenas um
nmero muito reduzido de clulas, o que
prejudica a estimativa
a grande quantidade de material
utilizado

a acuracidade dos resultados est

diretamente relacionada quantidade de
material (principalmente placas de Petri)

a limitao de material impe um

aumento do erro experimental
o resultado do experimento s
conhecido aps o crescimento das colnias
isoladas nas placas de Petri

A) BACTERIANA
A determinano da concentrao de bactrias feita geralmente pela tcnica de
determinao do Nmero de UFC (unidades formadoras de colnias).

PROBLEMA:
1. Voc tem um estoque de uma super bactria Escherichia coli (lac+). Voc fez
um cultivo em meio liquido e tem suspeita que a cultura esta contaminada. VOCE
PRECISA RECUPERAR SUA BACTRIA SUPER MELHORADA GENETICAMENTE,
QUE FAZER?

2. Mas digamos que voc precisa ou deseja conhecer o nvel de contaminao e

que a bactria contaminante seja lac-. Neste caso voc poder:
0,1ml (diluio 10-3) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey ______ lac+ e _________lac-

3. Qual a concentrao de E. coli nmero de (UFC/ml da cultura original)?

(X)_________

27
 4. Qual a concentrao da bactria lac- contaminante (UFC/ml da cultura
original)? ( Y) _________
Qual porcentagem da contaminao? _( Y) / (X)_____________________

B) DE LEVEDURAS
Pela tcnica de contagem em cmara de Neubauer

VERIFICAO DE ENTENDIMENTO:
Vrias tcnicas podem ser empregadas para atingir o objetivo desta Prtica. Voc
saberia discutir por que as aqui empregadas foram escolhidas em cada um dos casos?

28
 PRTICA 6 - AO DE ANTI-SPTICOS NA DESINFECO DA PELE

ANTI-SPTICOS E DESINFETANTES

HISTRIA
O uso de anti-spticos e desinfetantes evolui desde o Antigo Egito, em relao aos
processos de embalsamento, inicialmente desenvolvidos com o intuito da preservao do
corpo ressurreio. Os egpcios e outros povos utilizaram vrias misturas, tais como
leos volteis, resinas oleosas, vinhos, vinagres, mel, mura, blsamo, alm do fato de os
vinhos e vinagres continuarem a serem utilizados durante a Idade Mdia ao recobrimento
de feridas e, consequentemente, evitando a infeco.
A descoberta do cloro na Idade Mdia foi amplamente utilizada como substncia
desodorante e anti-sptica, sendo utilizado em 1847-49 em um hospital vienense quanto
demonstrao prtica da ao benfica da anti-sepsia.
Anos mais tarde Pasteur explicou sobre a fermentao bacteriana e a existncia de
agentes infectantes como responsveis por processos patolgicos. Coube a Lister, em
1865, a divulgao dos mtodos de esterilizao de bandagens, compressas cirrgicas,
instrumental cirrgico e anti-sepsia das feridas.

CONCEITOS GERAIS
Um desinfetante uma substncia usada para destruir bactrias ou outros
microrganismos infectantes. Os desinfetantes possuem atividade bactericida ou
germicida e costumam ser aplicados em superfcies inanimadas.
Uma substncia antisptica no mata o microrganismo, mas inibe sua
velocidade de crescimento. Os anti-spticos so valiosos no tratamento de infeces
locais causadas por microrganismos refratrios a quimioterapia sistmica. As
substncias anti-spticas so aplicadas ao tecidos para suprimir ou impedir a infeco
bacteriana. A concentrao de anti-sptico em geral baixa para evitar a leso e
irritao tecidual indesejveis. O aumento da concentrao de um agente anti-sptico
pode irritar e talvez, at matar o tecido normal do hospedeiro. Bem como as clulas
bacterianas, interferindo assim com o crescimento normal do tecido de granulao na
cicatrizao de feridas.
A diferena entre um anti-sptico e um desinfetante pode ser uma questo de
tempo de reao, nmero de microrganismos, concentrao da droga e temperatura.

USOS TERAPUTICOS DE ANTI-SPTICOS E DESINFETANTES

Vrios fatores podem influenciar na eficcia e/ou eficincia dos procedimentos ou
agentes microbianos. Tais como:
O microorganismo, seu nmero e sua suscetibilidade;
O agente microbiano e sua respectiva concentrao;
O tempo de contato entre o microorganismo e o antimicrobiano;
A presena ou no de uma limpeza mecnica prvia;
A prvia remoo ou no de detritos e impurezas da superfcie ou tecidos
atravs do uso de sabes ou detergentes;
A presena ou no de resistncia bacteriana ao agente antimicrobiano.

29
LCALIS
Os lcalis foram utilizados como desinfetantes desde a antigidade. O mecanismo
de ao est relacionado concentrao do on hidroxila. Um pH maior do que 9 inibir a
maioria das bactrias.

LCOOIS
Os lcoois alifticos comuns so bons solventes, anti-spticos e desinfetantes.
So utilizados isoladamente ou combinados com outros agentes.
So potentes bactericidas contra micobactrias, Gram positivas, Gram negativas,
fungos patognicos, muitos vrus e no em esporos. A presena de gua fundamental
para a atividade dos lcoois (50-70%) e so mais eficazes na ausncia de sujeiras e
matria orgnica.
Vantagens apresentadas referem-se ao fato de serem timos solventes em
relao a outros agentes germicidas, de terem ao rpida, de apresentarem baixo custo
e praticamente serem atxicos.
As desvantagens so: baixa atividade fungicida e virucida, baixa penetrabilidade,
desidratantes, no possurem ao residual e no devem ser utilizados para limpezas de
ferimentos abertos.

SURFACTANTES
um composto qumico que diminui a tenso superficial de uma soluo aquosa.
Os surfactantes so adsorvidos em um grau significativo pelo algodo, pela borracha e
materiais porosos, diminuindo assim, a concentrao eficiente e a eficcia antibacteriana.
Com base na posio hidrofbica da molcula, h trs tipos:
Aninicos : Os sabes so os mais importantes. So antibacterianos contra
microrganismos Gram negativos e cido-resistentes;
Catinicos : Os compostos de amnio quaternrio so os principais. Apesar
de possurem efeitos limitados sobre os vrus, eles so eficientes contra
bactrias Gram positivas e Gram negativas, mas em geral, os detergentes
catinicos no possuem ao virucida, fungicida ou esporocida, Vantagens:
No so em geral irritantes para a pele e tecidos, baixa toxicidade, so
inodoros, podem ser usados em solues com gua e lcool.
Desvantagens: So neutralizados por surfactantes aninicos (sabes), no
agem na presena de matria orgnica e podem causar irritao quando
em contato prolongado com a pele, mucosas e trato respiratrio.

No-inicos.

HALOGNIOS
Possuem efeitos antibacterianos potentes devido alta afinidade pelo
protoplasma. As atividades em solues livres de matria orgnica so, em ordem
decrescente: 1. Cloro, 2. Bromo, 3. Iodo. J, na presena de matria orgnica o mais
ativo o Iodo.

METAIS PESADOS

30
Derivados do mercrio
Parecem ser primariamente bacteriostticos e apenas levemente bactericidas. A
sua ao antibacteriana est relacionada inibio reversvel da atividade enzimtica
essencial da bactria e capacidade de se combinar com ons de compostos metlicos
orgnicos e inorgnicos. Possuem pouca atividade esporicida e so inativados por restos
orgnicos. O uso para anti-sepsia de superfcies e objetos inanimados parece
imprudente j que h agentes com um modo de ao mais eficiente.

Compostos de Prata
Produzem efeitos custicos, adstringentes, antibacterianos pela ao do on de
prata livre e produz desnaturao de protenas. Os preparados de Prata coloidal no so
corrosivos nem irritantes e so usados sobre tecidos sensveis. A prata metlica precipita
as protenas e produz efeito irritante.

AGENTES OXIDANTES
So compostos germicidas de ao breve sobre algumas bactrias aerbicas
Gram+ e Gram-. Inibem por pouco tempo o crescimento de microrganismos anaerbicos,
mas no destroem esporos bacterianos. Liberam Oxignio que se combina com a
matria orgnica se tornando inativos.
A soluo de Perxido de Hidrognio libera Oxignio livre rapidamente ao entrar
em contato com mucosas e superfcies sem plos que fornecem a enzima catalase.
Quando distribudo sobre ferida com exsudato, a sua efervescncia vai remover o pus
e restos celulares e confere atividade germicida limitada. valioso para limpar e
desodorizar o tecido infectado.
O Permanganato de Potssio libera Oxignio em contato com a matria orgnica.
As solues possuem uma grande ao antibacteriana.

OBJETIVOS
Verificar a ao de anti-spticos no crescimento bacteriano.

MATERIAL

4 Placas com gar-sangue : Meio base para gar sangue ou TSB enriquecido
com 5% sangue desfibrinado de carneiro;
4 zaragatoas (Swab) estreis;
3 cotonetes embrulhados em papel alumnio autoclavados, ou + 3 zaragatoas
estreis;
sabo, lcool iodado, mertiolate, anti-spticos comerciais (anti-spticos em geral
disponveis 1 para cada grupo, podendo haver repeties);
Ala de Platina , bico de Bunsen;
Microscpio ptico, bateria de Gram, lminas;

31
PROCEDIMENTO
1. Umedecer um cotonete estril em soluo fisiolgica e esfregar vigorosamente
sobre as costas de uma das mos. Procurar cobrir aproximadamente 4 cm de
dimetro;

2. Espalhar sobre a metade A da placa contendo meio gar sangue;

3. Umedecer um segundo cotonete com tintura de iodo ou mertiolato e esfregar

nas costas da outra mo, numa rea de mesmo dimetro da primeira;

4. Esperar 4 minutos para que haja ao do anti-sptico e passar na rea

desinfectada um terceiro cotonete umedecido com soluo fisiolgica. Tomar
cuidado para no atingir a regio no desinfectada;

5. Espalhar o contedo do terceiro cotonete sobre a metade D da placa contendo

gar-sangue;

6. Marcar na placa o anti-sptico utilizado e o nmero do grupo que realizou o

experimento;

7. Incubar a placa por 24h, em estufa a 37C.

RESULTADOS
Na quinta-feira:
1. Observar os resultados e anotar.
2. Analisar a Morfologia MACROSCPICA das colnias e MICROSPICA das bactrias
aps colorao de Gram. (No se esquea de ilustrar o que voc observou!)

QUESTIONRIO
1. Descreva duas situaes: uma em que voc usaria um anti-sptico e uma em que
usaria um desinfetante.
2. Faa uma lista com pelo menos seis anti-spticos e seis desinfetantes.Nesta lista
deve conter o principal composto ativo, o nome comercial, e o uso .
PRTICA 7 ANTIBIOGRAMA

TEORIA
Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade
de bactrias aos antimicrobianos. Estes testes so utilizados para avaliar in vitro a

32
atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergncia de bactrias
resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como
sensvel, intermedirio ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun
inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo de
diluio: consiste em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em meio slido ou
lquido e em seguida semear a bactria em estudo. Aps incubao determina-se MIC
e/ou MBC.
2- Mtodo de difuso de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): um teste
qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibitico so colocados na
superfcie do gar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no
gar e produz inibio do agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser
medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta tcnica, alguns
fatores so essenciais:
Meio de Cultura: normalmente utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza
por ser um meio enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas;
Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactrias,
devendo-se realizar a colorao de Gram. A densidade do inculo deve
corresponder a turbidez 0,5 na escala padro de turbidez (Escala de Mac-
Farland).

OBJETIVO
Analisar pelo mtodo de difuso a ressitncia de E. coli a alguns antibiticos.

MATERIAIS
Swab estril;
cultura lquida fresca de Eschirichia coli;
placas de Petri, com meio Mueller-Hinton slido;
discos de papel com antibiticos;
pinas;
rgua.
PROCEDIMENTO

1. Introduzir nas culturas um swab estril, retirar o excesso de lquido comprimindo

a ponta do swab nas paredes do tubo;

33
 2. Espalhar o contedo do swab sobre o meio de cultura slido distribudo numa
placa de Petri (meio Mueller-Hinton). Espalhar bem, de modo a obter um tapete
de bactrias em toda a superfcie do meio slido;

3. Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos);

4. Colocar os discos de papel contendo os antibiticos sobre a cultura seca (usar

pinas);

5. Incubar em estufa a 37C , por 16 a 24 horas;

6. Medir os halos formados (em mm), registrar os dados obtidos e relacionar com a
tabela abaixo:

Bactria Discos com antibiticos

Oxacilina Carbemicilina Kanamicina Rifampicina Sulfonamida Estreptomicina
OX CB K RIF SUL EST
(1g/mL) (100g/mL) (30g/mL) (30g/mL) (300g/mL) (10g/mL)
Escherichia coli
Leituras
(mm)
Resultados
Padres R< 10 R< 13 R< 12 R< 16 R< 12 R< 11
S> 13 S> 17 S> 15 S> 20 S> 17 S> 15

Relate os resultados obtidos e interprete comentando.

QUESTIONRIO
1. O que antibiograma e para que serve?
2. Quais so os antibiticos beta-lactmicos? Qual o seu modo de ao?
3. Qual a diferena entre agente bactericida e bacteriosttico?
4. Dos antibiticos testados na experincia acima qual seria o mais indicado para o
tratamento da infeco causada pela linhagem E. coli testada? Por que?
5. Faa um esquema da parede de uma bactria Gram-positiva e de uma bactria
Gram-negativa?

34
 PRTICA 8 - PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS.

INTRODUO
Muitos vegetais contm compostos que so inibidores de crescimento de
microrganismos e exercem papel importante na resistncia destes vegetais a patgenos.
Um importante exemplo deste processo o alho.
A presena de substncias antimicrobianas pode ser verificada atravs de extratos
ou partes homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.

OBJETIVO
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.

MATERIAL
Placas de gar Sabouraud;
Alho e cebola;
Cotonetes;
Graal e pistilo;
Discos de papel de filtro;
Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.

PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na
cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a
superfcie do meio semeado;
5. Incubar a 25C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.

RESULTADOS
Descreva as observaes feitas ao final da incubao.

QUESTIONRIO
Pesquise e relato algum outro antimicrobiano natural . Pode ser algum j relatado na
literatura ou algum de conhecimento popular.

35
 PRTICA 9 - CONJUGAO DE BACTRIAS

INTRODUO

A conjugao bacteriana, descoberta por Lederberg e Tatum (1946) o processo

sexual"de transferncia de genes de uma bactria doadora para outra receptora. Esta
clula doadora diferenciada durante a conjugao pela presena de um apndice na
sua superfcie chamado de pili F.
Para que uma linhagem bacteriana seja doadora, ela deve conter um plasmdio
conjugativo (elemento extra-cromossmico). O processo de conjugao foi descoberto
em E. coli K12 e o elemento extra-cromossmico responsvel foi chamado de fator F (de
fertilidade) ou plasmdio F.
H dois tipos de plasmdios conjugativos: os plasmdios auto-transmissveis e os
mobilizveis.
Os autotransmissveis carregam um conjunto de genes, os genes tra, cujos
produtos promovem a transferncia deste plasmdio para uma clula aceptora. Os genes
tra podem ser divididos em dois grandes grupos: um grupo, especifica protenas
envolvidas no s na interao superficial (contacto) entre as clulas doadora e
aceptora, bem como, na formao dos poros na membrana. O outro grupo, refere-se aos
genes mob, os quais especificam protenas envolvidas na mobilizao do DNA. A
transferncia do DNA iniciada pela ao de um gene mob que tem a atividade em
romper (nicking) em uma nica fita da molcula do DNA, em um stio especfico,
chamado de oriT e catalisa o desenrolamento da dupla hlice. Como resultado, somente
uma fita, pode ser transferida para a clula aceptora e a outra fita permanece na clula
doadora. Ambas servem como molde para sintetizar a fita complementar. Concluindo, os
produtos dos genes mob preparam o DNA para serem transferidos, ainda que os
produtos dos genes tra promovem o contacto das clulas doadora-aceptora e promovem
um contexto fsico (formao dos poros) para esta transferncia.
Por outro lado, os plasmdios mobilizveis codificam, somente um dos conjuntos
das funes encontradas nos plasmdios auto-transmissveis para concluir a
transferncia. Contudo, o plasmdio mobilizvel deve conter um ori T. Como a interao
mob-oriT especfica, o stio de oriT deve ser compatvel com as funces mob
presentes nas clulas doadoras, para que o plasmdio possa ser transferido. Um
exemplo de plasmdio mobilizvel o plasmdo natural ColE1 ou colicinognico que
codifica as atividades dos genes mob e seu oriT.
Experimentos genticos demonstraram que todas as trs classes de funces de

36
conjugao, tra, mob e oriT devem estar presentes para que ocorra conjugao entre
bactrias e bactrias e leveduras. Estes plasmdios ColE1 codificam protenas chamadas
de colicinas que matam algumas linhagens sensveis de E. coli.
Os plasmdios conjugativos aps serem transferidos e replicados podem
permanecerem livres (autnomos) ou integrarem-se ao cromossomo bacteriano
(chamados de estado integrado). No primeiro caso, a linhagem bacteriana chamada de
F+ e no segundo Hfr ( a integrao do fator F parece ser mediada por pequenas
sequncias chamadas de elementos IS). Neste estado, o fator F media a transferncia
do cromossoma da clula Hfr para a clula F-. Raramente, o cromossomo inteiro da
clula Hfr transferido.
As clulas F+ aps contato com as clulas F-, transferem em alta frequncia
para esta ltima uma rplica ou cpia do plasmdio F, tornando-a F+. Por outro lado, a
linhagem Hfr cujo fator F est integrado ao cromossomo bacteriano, transfere,
sequencialmente marcadores ou fragmentos deste cromossomo. Raramente, o
cromossomo inteiro da clula Hfr transferido. O fator F tambm raramente
transferido.
Aps a descoberta do fator F, outros plasmdios conjugativos foram sendo
descobertos como o caso dos fatores ou plasmdios R ou RTF (fator de transferncia
de resistncia). Estes plasmdios possuem marcadores para a resistncia s drogas
antibacterianas e no integram-se, normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns
plasmdios no promovem conjugao, mas podem ser mobilizados por outros
plasmdios conjugativos.

OBJETIVO
Tranferir de Salmonella typhimurium o plasmdio que carrega o gene que confere
resistncia a tetraciclina, para a Escherichia coli K12 .

MATERIAL
Tubos de ensaio ;
Placas com meio slido;

Linhagens
a) Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um
plasmdio que carrega o marcador que confere resistncia a tetraciclina (Tcr ).
b) Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , Nalr). O fentipo de resistncia
ao cido Nalidxico deve-se a uma mutao cromossomal.

37
Antibiticos
a) cido Nalidxico (Nal) usar a concentrao de 10g/ml
b) Tetraciclina (Tc) usar a concentrao de 50 g/ml
PROCEDIMENTO

1 Dia
1. Fazer os pr-inculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio
TSB. Incubar temperatura de 37C por uma noite.
2Dia
1. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB ou LB as seguintes
culturas:
1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e
1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora)

2. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitao temperatura de 37C.

3. Fazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio slido:

3.1 Clula doadora: S. typhimurium MG031

0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey-Nal
0,1ml (diluio 10-4) em meio MacConkey -Tc
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Tc
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Tc

3.2 Clula receptora: E. coli K12

0,1ml (sem diluio) em meio YT-Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-4 ) em meio MacConkey -Nal
0,1ml (diluio 10-5) em meio MacConkey -Nal
0,1ml (diluio 10-6) em meio MacConkey -Nal

3.3 Mistura de conjugao (Transconjugantes):

0,1ml (sem diluio) em meio MacConkey -Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-1) em meio MacConkey -Nal-Tc
0,1ml (diluio 10-2) em meio MacConkey -Nal-Tc

4. Incubar em estufa temperatura de 37C por 16-24 horas (durante uma noite).

38
RESULTADOS
3Dia
Analisar os resultados e determinar a freqncia de conjugao. A freqncia
determinada dividindo o nmero de clulas transconjugantes pelo nmero total de clulas
receptoras.

39
 PRTICA 10 - POSTULADO DE KOCH

Como provar que um microrganismo responsvel por uma doena?

A resposta clssica um conjunto de quatro postulados formulados por Robert Koch e
posteriormente revisados com o desenvolvimento da Microbiologia, Epidemiologia e da
Gentica Molecular.

ABORDAGEM CLSSICA
Robert Koch (1877) formulou um conjunto de quatro postulados os quais afirmava
deveriam ser adotados para que se aceitasse uma relao casual entre um
microrganismo em particular e uma doena.
1. A bactria deve ser encontrada em todas as pessoas com a doena; a bactria ou
seus produtos devem ser encontrados nas partes do corpo afetados pela doena;
2. A bactria deve ser isolada de leses de uma pessoa infectada e mantida em
culturas puras;
3. A cultura pura quando inoculada em voluntrio humano susceptvel ou animal
experimental deve produzir os sintomas da doena;
4. A mesma bactria deve ser re-isolada em cultura pura dos indivduos
intencionalmente infectados.
Os postulados de Koch foram originalmente desenvolvidos para identificar bactrias
causadoras de epidemias como a clera e a tuberculose. Estes se constituram nas
primeiras abordagens que forneceram bases cientficas para o estudo das doenas
infecciosas.
Estes postulados apresentam, contudo, uma srie de limitaes devido ao precrio
conhecimento, ao tempo de Koch, dos mecanismos que regem a infectividade
bacteriana.
1. Os postulados de Koch implicam que a virulncia uma caracterstica exclusiva das
bactrias e independente do hospedeiro. Na realidade, a susceptibilidade do hospedeiro
to ou mais importante que as caractersticas de virulncia da bactria:
Indivduos cujo sistema imunolgico esteja seriamente comprometido por
quimioterapia anti-cncer, tratamento com corticosterides, infeco por HIV ou
diabetes e que podem ser infectados por bactrias incapazes de causar infeco
em pessoas sadias;
A mesma bactria pode ou no satisfazer os postulados de Koch dependendo da
sub-populao usada como ponto de referncia.
2. O segundo postulado enfatiza a obteno de culturas puras do patgeno. H algumas

40
doenas cujo agente causativo no pode ser cultivado em meios de laboratrio ou cujo
meio adequando no , ainda, disponvel:
H considerveis evidncias para implicar as bactrias Treponema pallidum e
Mycobacterium leprae como causadoras da sfilis e hansenase, respectivamente.
Antibiticos que causam o desaparecimento de sintomas tambm causam a
eliminao da bactria do tecido infectado. H tambm, uma resposta imunolgica
dos indivduos infectados contra os antgenos de superfcie das bactrias
observadas nas leses provocadas pela doena;
A combinao das tecnologia da reao em cadeia da polimerase (PCR) com as
de seqenciamento de cidos nuclicos possibilita a deteco e identificao de
bactrias no-cultivveis e revela o agente causativo de muitas doenas.
3. Os segundo e quarto postulados consideram que todos os membros de uma espcie
bacteriana so igualmente virulentos e que somente uma nica espcie causa uma
determinada doena.
diferentes linhagens de uma espcie bacteriana no somente variam
consideravelmente em virulncia como podem causar doenas distintas;
os mesmos sintomas podem ser causados por diferentes espcies de bactrias e
h doenas cujas leses so causados por uma mistura de diferentes linhagens
(infeces polimicrobianas);
os casos nos quais uma nica espcie de bactria a nica responsvel por uma
doena parece mais uma exceo do que uma regra;
o cultivo de uma bactria em meio de laboratrio pode causar a "perda" do fator
de virulncia: no expresso dos genes nas condies ambientais do meio.
4. O terceiro postulado requer que a bactria seja reinoculada em um voluntrio humano
ou em um animal experimental e que a reinoculao cause os sintomas da doena.
Em muitos casos no possvel a utilizao de voluntrios humanos e a nica
alternativa a utilizao de um modelo animal, se houver um disponvel;
Alguns patgenos humanos no causam doenas em animais ou provocam
sintomas diferentes daqueles observados em humanos.

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