MARGARETH COSTA NEVES

ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO

TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA DE GERBIL

(Meriones unguiculatus)

ORIENTADOR: MARIA ANGÉLICA GUZMAN-SILVA

Universidade Federal Fluminense - UFF.

Niterói, RJ
2005
 MARGARETH COSTA NEVES

ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO

TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA DE GERBIL

(Meriones unguiculatus)

Dissertação apresentada ao curso de Pós-

Graduação Patologia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para obtenção do
grau de mestre. Área de concentração:
Patologia Experimental.

ORIENTADOR: MARIA ANGÉLICA GUZMÁN-SILVA

Niterói, RJ
2005
N518 Neves, Margareth Costa
Análise histopatológica e morfométrica do
tumor de células da granulosa de Gerbil
(Meriones unguiculatus)/Margareth Costa
Neves.-Niterói: [s.n.], 2005

78 f.
Dissertação (Mestrado em Patologia) –
Universidade Federal Fluminense, 2005

1. Tumor de células da granulosa. 2.

Gerbillinae. 3. Medicina experimental. 4.
Neoplasia das gônadas

CDD 616.992
 MARGARETH COSTA NEVES

ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO TUMOR DE

CÉLULAS DA GRANULOSA DE GERBIL (Meriones unguiculatus)

Dissertação apresentada ao curso de Pós-

Graduação Patologia da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para obtenção do
grau de mestre. Área de concentração:
Patologia Experimental.

Aprovada em março de 2005

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________________________
Prof. Kalil Madi, Professor Titular, Livre Docente/Pós-Doutorado
Faculdade de Medicina, Departamento de Patologia - UFRJ

___________________________________________________________________
Profa. Simone Florim da Silva, Professor Adjunto, Doutor
Departamento de Morfologia – Histologia UFF

___________________________________________________________________
Profa. Ana Maria Reis Ferreira, Professor Adjunto, Doutor
Centro de Ciências Médicas, Departamento de Patologia e Apoio Clínico

Niterói
2005
A causa suprema de todas as causas, o sustentáculo e essência de tudo. O sabor

da água, a luz do sol e da lua, a sílaba om nos mantras védicos, Sri Krishna.

Hare krishna

Hare Krishna

Krishna Krishna hare hare

Hare rama hare rama

Rama rama rare rare.

 AGRADECIMENTOS

Ao Sr. Krishna pela vida.

A Prof ª Maria Angélica Guzmán Silva de quem me orgulho de tê-la como
orientadora. Que indiscutivelmente com sua paciência atendeu a todas as
solicitações com particular atenção participando de todas as fases desta pesquisa,
mostrando ser uma excelente orientadora. Sem ela não seria possível a realização
deste trabalho.
Aos professores da pós-graduação de patologia experimental.
Aos funcionários da pós-graduação de patologia experimental.
Ao meu marido, Ronald de Mesquita Soares Rega, pela ajuda e paciência do
início ao fim na execução deste trabalho e principalmente pelo seu amor.
A minha mãe.
Aos meus amigos, em especial a Kalomira Glória Ilias que sempre nos
conforta com suas palavras doces e sábias.
A Lanuza Araújo de Freitas Bittencourt pelo auxílio terapêutico na descoberta
do verdadeiro eu.
 SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE GRÁFICOS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO 14
2 OBJETIVOS 16
3 REVISÃO DE LITERATURA 17
3.1 OVÁRIO HUMANO E TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA 18
3.2 OVÁRIO DE ROEDORES E TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA 23
3.3 TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA DE GERBIL 26
3.4 MORFOMETRIA 27
4 MATERIAL E MÉTODOS 29
4.1 AMOSTRA 29
4.2 MACROSCOPIA 30
4.3 HISTOPATOLOGIA 30
4.4 TESTOSTERONA 31
4.5 MORFOMETRIA 31
4.5.1 Histomorfometria nuclear 33
6 ESTATÍSTICA 37
7 RESULTADOS 38
7.1 MACROSCOPIA 39
7.2 HISTOPATOLOGIA 43
7.3 TESTOSTERONA 48
7.4 MORFOMETRIA 49
8 DISCUSSÃO 61
9 CONCLUSÃO 73
10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74
 LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estadiamento da FIGO para o Carcinoma Primitivo do Ovário 21
FIGURA 2 Macro utilizada pelo sistema de análise de imagens KS 300 32
FIGURA 3 Seqüência de imagens de TCG incipiente 35
FIGURA 4 Seqüência de imagens de TCG sólido 36
FIGURA 5 Fotomacroscopia de tumor de células da granulosa de gerbil 52
FIGURA 6 Fotomacroscopia de metástases de tumor de células da 53
granulosa de gerbil
FIGURA 7 Tumor de células da granulosa do tipo incipiente de gerbil 54
FIGURA 8 Tumor de células da granulosa do tipo sólido de gerbil 55
FIGURA 9 Tumor de células da granulosa do tipo misto de gerbil 56
FIGURA 10 Tumor de células da granulosa do tipo cístico de gerbil 57
FIGURA 11 Invasão local de tumor de células da granulosa do tipo incipiente 58
de gerbil
FIGURA 12 Metástases de tumor de células da granulosa no abdome de 59
gerbil
FIGURA 13 Metástases de tumor de células da granulosa no tórax e pescoço 60
de gerbil
 LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Distribuição de 167 gerbils por faixa etária e status sexual 29
TABELA 2 Planilha de dados ilustrativa referente a leitura da figura 3D 34
mediante a macro no sistema Kontron KS300
TABELA 3 Planilha de dados ilustrativa referente a leitura da figura 4D 35
mediante a macro no sistema Kontron KS300
TABELA 4 Distribuição de 167 gerbils portadoras de tumor de células da 38
granulosa de acordo com a faixa etária e o status sexual
TABELA 5 Apresentação macroscópica dos ovários de 167 gerbils 38
TABELA 6 Distribuição de 241 de tumores de células da granulosa de gerbil 42
por cor e tipo de tumor
TABELA 7 Características microscópicas de 241 tumores de células da 44
granulosa de gerbil por tipo de tumor
TABELA 8 Metástase abdominal de 241 tumores de células da granulosa de 47
gerbil por tipo de tumor
 LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 Distribuição de 167 gerbils portadoras de tumor de células da 40
granulosa por localização anatômica e tipo de tumor
GRÁFICO 2 Distribuição de 167 gerbils portadoras de tumor de células da 40
granulosa por idade e tipo de tumor
GRÁFICO 3 Distribuição de 167 gerbil portadoras de tumor de células da 41
granulosa por status e tipo de tumor
GRÁFICO 4 Distribuição de 240 tumores de células da granulosa por tamanho 42
e tipo de tumor
GRÁFICO 5 Invasão local de 241 tumores de células da granulosa de gerbil 45
por tipo de tumor
GRÁFICO 6 Metástase em tórax e pescoço de 241 tumores de células da 48
granulosa de gerbil por tipo de tumor
GRÁFICO 7 Nivel de testosterona em 48 casos de tumor de células da 49
granulosa de gerbil distribuídos por tipo de tumor
GRÁFICO 8 Análise morfométrica dos núcleos de TCG incipiente e sólido 51
RESUMO

O tumor de células da granulosa (TCG) faz parte de um grupo de neoplasias

derivadas do estroma do cordão sexual. Esses tumores originados do mesênquima
ovariano têm importância clínica, uma vez que podem sintetizar grandes
quantidades de estrogênios ou podem ter comportamento maligno. Sendo o TCG de
gerbil uma patologia espontânea nesta espécie, a caracterização de diversos
aspectos – histopatologia, crescimento e progressão tumoral, desenvolvimento e
padrão de metástases – permite definir o seu comportamento biológico e sua
utilização como modelo animal da doença. Para tanto é fundamental conhecer os
mecanismos envolvidos no desenvolvimento do TCG de gerbil e os aspectos que
determinam seu comportamento biológico. O objetivo do nosso trabalho é
caracterizar o TCG de gerbil como modelo animal da doença, bem como, analisar as
alterações histopatológicas, analisar pela morfometria as características nucleares e
correlacionar as diversas características achadas, com o comportamento biológico
do TCG de gerbil. Utilizamos material de arquivo correspondente a ovários de 167
fêmeas de gerbil, entre virgens e reprodutoras, de várias idades, que foram mantidas
no Biotério do Setor de Patologia Experimental, Departamento de Patologia, UFF, no
período 1982 a 1992. Após a necropsia completa, além de ambos os ovários,
fragmentos de diversos tecidos foram coletados, fixados em formol e processados. A
maior incidência dos TCG foi na faixa etária de 2 a 3 anos, sendo a maioria em
fêmeas virgens. Considerando a macroscopia, os ovários foram descritos como
normais (com TCG incipiente na microscopia) ou com TCG desenvolvido de aspecto
cístico, sólido ou misto. O total de tumores unilaterais e bilaterais para os incipientes
e desenvolvidos foi 71 e 96 respectivamente, sendo 13 sólidos, 63 císticos e 20
mistos. Todos os tumores incipientes foram menores que 9mm, apresentando cor
branco-amarelada, e os desenvolvidos apresentaram tamanho (qui-quadrado
p<0,01) e cor variada. Todas as lâminas foram revistas para o estudo
histopatológico, utilizando microscopia óptica, e os tumores foram classificados de
acordo com suas características morfológicas em incipiente, cístico, sólido e misto.
As características microscópicas dos TCG, a invasão local e a presença, freqüência
e o local de metástases foram analisados, definindo a classificação dos TCG em
malignos ou não. Todos os tumores caracterizaram-se por apresentar ninhos e
cordões de células tumorais cubóides; havia células luteinizadas, corpúsculos de
Call-Exner, pseudofolículos, cistos incipientes, necrose e figuras mitóticas, com
exceção destas duas últimas nos tumores incipientes. Ao comparar os diversos tipos
microscópicos de TCG, não houve diferença significativa apenas para ninhos e
cordões, células luteinizadas e corpúsculo de Call-Exner. Invasão local mais
freqüente ocorreu em hilo ovariano, gordura periovariana e fimbrias, sendo
registrada microscopicamente. O maior número de metástases ocorreu no abdome,
na região do omento, na maior parte dos TCG, com exceção do misto (p<0,01). Do
total da amostra apenas 11 de 71 tumores incipientes e 8 de 85 císticos não
apresentaram características de malignidade, invasão e/ou metástase; só 1 de 13
tumores sólidos foram benignos e todos os 20 mistos foram malignos. Todos os
tumores sólidos, mistos e císticos que apresentaram necrose correspondiam a
malignos, pela presença de metástases. Apenas 4 fêmeas virgens com TCG, na
faixa etária de 2 a 3 anos, tiveram morte natural e apresentavam diversos tipos de
TCG maligno. A dosagem de testosterona foi analisada em 48 casos. Os valores da
dosagem de testosterona do grupo com TCG incipiente variaram entre 0,06 e
4,80ng/ml e no grupo com TCG desenvolvido foram entre 0,16 e 13,0ng/ml (Mann-
Whitney p<0,01). Este tumor pode ser usado como modelo animal da doença, dando
oportunidade de futuros estudos no desenvolvimento deste tumor ovariano, incluindo
genética e modulação hormonal e imune, bem como a ação de drogas anti-
neoplásicas.
ABSTRACT

The granulosa cell tumor (GCT) is part of a group of neoplasms derived from the
stromal sexual cord. These tumors originated from the ovarian mesenchyme have
clinical importance, since they can synthesize great amounts of estrogens or have
malignant behavior. As the gerbil GCT is a spontaneous disease in this species, the
characterization of several aspects – histopathology, growth, and tumor progression,
development and metastasis pattern – allows defining the biological behavior and its
use as animal model of the disease. For so much, it is fundamental to know the
mechanisms involved in the development of gerbil GCT and the aspects that
determine its biological behavior. The aim of this study was to characterize the gerbil
GCT an animal model of the disease through its histopathology and nuclear
characteristics by morphometry, and to correlate the several characteristics with the
biological behavior of the tumor. We used file material corresponding to 167 gerbil
females, among virgins and reproducers, of several ages. The animals were
maintained in the Animal Facility of the Experimental Pathology Section in the
Department of Pathology, UFF, in the period of 1982 to 1992. After the complete
necropsy, besides both ovaries, fragments of several organs were collected,
fastened in formalin and processed for microscopy. The largest incidence of GCT
was in the age group of 2 to 3 years, being mostly in virgin females. The ovaries
were described at macroscopy as normal (with incipient GCT in the microscopy) or
with developed GCT of cystic aspect, solid or mixed. The total of unilateral and
bilateral tumors for the incipient and developed GCT was 71 and 96 respectively,
being 13 solids, 63 cystic and 20 mixed. All the incipient tumors were smaller than
9mm, presented white-yellowish color, and the developed tumors varied in size (Qui-
square p<0.01) and color. All the slides were reviewed for the histopathological study
by optical microscopy, and the tumors were classified in agreement with its
morphologic characteristics in incipient, cystic, solid and mixed. The microscopic
characteristics of GCT, the local invasion and the presence, frequency location and
the metastasis were analyzed, defining the classification of GCT in malignant or not.
All the tumors were characterized by tumoral nests and cords of cubical cells; there
were luteinic cells, Call-Exner bodies, pseudofollicles, incipient cysts, necrosis, and
mitosis, except for these last ones in the incipient tumors. When comparing the
several microscopic types of GCT, there was no significant difference for nests and
strings, luteinic cells and Call-Exner bodies. Invasion was more frequent in the
ovarian hilus, periovarian fat and fimbriae, being registered microscopically. The
largest number of metastasis was abdominal, in the omentum, except for the mixed
GCT type (p<0.01). Malignancy characteristics (invasion and/or metastasis) were
present in 60 of 71 incipient tumors and in 77 of 85 cystic GCT; only one of 13 solid
tumors were benign and all the 20 mixed were malignant. All the tumors with
necrosis were malignant, as they also showed metastasis. Natural death happened
in just four virgin females with malign GCT, 2 to 3 years old. The testosterone level
was analyzed in 48 cases. The values of the testosterone level in incipient group
varied between 0.06 and 4.80ng/ml and in the developed group varied between 0.16
and 13.0ng/ml (Mann-Whitney p<0.01). This tumor can be used as animal model of
the disease giving opportunity of futures studies in the development of this ovarian
tumor including genetic, hormonal and immune modulation, and action of
antineoplasic drugs.
 14

1. INTRODUÇÃO

Estudos utilizando animais como modelo experimental, tem sido muito

importante nas pesquisas sobre diversas doenças, tais como diabetes (ESTEVES,

2000), obesidade (WALDER et al, 2002) e muitas outras.

A utilização do gerbil como modelo animal em patologia tem sido descrita

desde meados do século passado (BENITZ & KRAMER, 1965; RINGLER et al,

1972; VINCENT et al, 1979; GUZMÁN-SILVA, 1995a; HANES, 1999) devido à forma

como esta espécie desenvolve espontaneamente diversas doenças, inclusive

neoplasias como o TCG. Dessa forma, evita-se a execução desnecessária de

protocolos experimentais de indução de doenças, o que está de acordo com a

norma ética vigente, designada de três R (“Replacement” do procedimento

experimental, “Reduction” do número de animais, “Refinement” das técnicas)

(PORTAL VETERINARIA, 2003) .

Tanto no rato quanto no camundongo, os tumores ovarianos ocorrem

esporadicamente, dependendo da linhagem e da idade dos animais. Os tipos

histológicos mais comuns descritos em camundongos são TCG e adenomas

tubulares (MURPHY, 1975). No gerbil o TCG é bem mais freqüente (BENITZ &
 15

KRAMER, 1965; VINCENT & ASH, 1978; MECKLEY & ZWICKER, 1979; GUZMÁN-

SILVA & ROSSI, 1990).

Sendo o TCG uma afecção espontânea com alta incidência no gerbil, a

caracterização de diversos aspectos – macroscopia, histopatologia, crescimento e

progressão tumoral, desenvolvimento e padrão de metástase – permitiria definir o

seu comportamento biológico e sua utilização como modelo animal da doença.

 16

2. OBJETIVOS

GERAL

Caracterizar o TCG de gerbil como modelo animal da doença.

ESPECÍFICOS

1. Analisar as características clínicas.

2. Analisar as características macroscópicas.

3. Analisar as alterações histopatológicas.

4. Analisar pela morfometria as características nucleares.

5. Avaliar os níveis de testosterona sérica.

6. Correlacionar as diversas características achadas com o comportamento

biológico do TCG de gerbil.

 17

3. REVISÃO DE LITERATURA

As explicações dos adventos científicos no passado sobre a reprodução eram

mais místicas do que científicas. Estudos iniciais de Hipócrates relatavam que

“sementes emanadas do corpo do homem e da mulher se juntavam para formar o

fruto”. Já, Aristóteles demonstrava que os fatores masculinos forneciam o

movimento e os femininos forneciam a substância. Graaf, em 1672, observou pela

primeira vez os folículos do ovário e erradamente concluiu que eles fossem ovos.

Porém, só em 1827, os gametas femininos foram identificados na tuba uterina por

von Baer (JACOB et al., 1990).

O TCG foi descrito pela primeira vez em 1855 por Rokitansky, mas a etiologia

e o seu comportamento maligno permaneceram desconhecidos (RINCK JUNIOR,

2002). Somente na metade do século XX que o interesse pelo estudo do TCG foi

surgindo não só em humanos, mas também em roedores, entre eles, o gerbil

(KURMAN et al., 1979; IGLESIAS et al., 1950; BENITZ & KRAMER, 1965).
 18

3.1 OVÁRIO HUMANO E TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA

O ovário humano só é identificável microscopicamente por volta da 10ª

semana do desenvolvimento embrionário (MOORE & PERSAUD, 2000).

O ovário é um órgão par em forma de amêndoa, medindo cerca de 5cm no

diâmetro maior e possui uma espessura máxima de 1,5cm. A superfície do ovário é

revestida por epitélio simples cúbico (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

No córtex ovariano são observados os folículos primordiais, folículos em

crescimento e os folículos maduros de Graaf. Cada folículo primordial apresenta um

ovócito primário, envolvido por uma camada única de células achatadas chamadas

de células foliculares ou granulosas. O ovócito é uma célula volumosa com cerca de

25µm de diâmetro nos folículos primordiais (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

Durante a fase de crescimento do folículo, se observa o aumento do volume e

a multiplicação das células foliculares. Estas células se tornam poligonais e o seu

conjunto forma a camada granulosa do folículo. Durante as modificações dos

folículos, o estroma imediatamente em torno de cada um se modifica para formar as

tecas foliculares com duas camadas: a teca interna e a teca externa. As células da

teca interna diferenciada sintetizam estrógenos. A teca externa apresenta células

semelhantes às células do estroma ovariano (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999).

Após a ovulação, as células foliculares e as da teca interna originam o corpo

lúteo que secreta progesterona e estrógenos. As células da teca interna do corpo

 19

lúteo são semelhantes às células luteínicas da granulosa, sendo, porém menores,

mais coradas e localizadas na parte periférica do corpo amarelo (JUNQUEIRA &

CARNEIRO, 1999).

O TCG, uma das formas dos tumores de células da teca-granulosa, fazem

parte de um grupo de neoplasias derivadas do estroma do cordão sexual (MIRANDA

et al., 2000; ASHLEY, 1978; CRUM, 2000). Os TCG são geralmente unilaterais,

apresentando macroscopicamente massas encapsuladas sólidas ou císticas, de

coloração amarelada na sua superfície de corte, em virtude de conterem lipídios.

Seu padrão histológico se caracteriza por células cubóides a poligonais, com

arranjos em cordões, camadas ou faixas que se anastomosam, além de corpúsculos

de Call-Exner (CRUM, 2000; DERCHAIN et al., 1997). Em alguns TCG as células

cubóides ou poligonais podem aparecer mais arredondadas com citoplasma

mostrando luteinização, caracterizando os tumores de células da granulosa

luteinizados (CRUM 2000). Dentro de um mesmo tumor pode-se encontrar áreas de

padrões histológicos variados como sólido, microfolicular, trabecular, insular e

sarcomatóide (DERCHAIN et al., 1997).

Segundo BRASILEIRO FILHO (2000), o TCG é volumoso, lobulado,

predominantemente sólido, mas com áreas císticas de necrose e hemorragia, de

coloração róseo-avermelhada, sendo constituído por células típicas da granulosa,

com núcleos em grão de café, arranjo organóide ou trabecular, podendo conter

número expressivo de células da teca. Este tumor é geralmente benigno, mas pode

ter comportamento maligno.

 20

Esses tumores originados do mesênquima ovariano têm importância clínica,

uma vez que podem sintetizar grandes quantidades de estrogênios ou podem ter

comportamento maligno (MIRANDA et al., 2000; GRIFFITHS, 1982; CRUM, 2000).

Os tumores funcionalmente ativos podem provocar, na mulher adulta, hiperplasia

endometrial e carcinoma de endométrio (ASHLEY, 1978; CRUM, 2000), doença

cística da mama e carcinoma de mama (CRUM, 2000). Porém, existem

controvérsias quanto à associação entre os tumores ovarianos hiperestrogênicos,

como os derivados da teca-granulosa, e o carcinoma de endométrio (MIRANDA et

al., 2000; ASHLEY, 1978; CRUM, 2000). Também foi observado que algumas

neoplasias de ovário podem produzir grande taxa de andrógenos, o que explica o

efeito virilizante de certos TCG. (ASHLEY, 1978; KURMAN et al., 1979; CRUM,

2000).

A revisão histológica de casos de TCG tem mudado o diagnóstico inicial em

cerca de 15 a 33%, sendo assim, há alteração da real taxa de mortalidade dos TCG.

(RINCK JUNIOR et al., 2002). O diagnóstico geralmente se faz em estádio inicial,

freqüentemente estádio I da classificação da FIGO (Fédération Internationale de

Gynécologie et d'Obstétrique) (FIG. 1) (MACHADO et al., 2003), pela precocidade

dos sintomas provenientes das alterações hormonais estrogênicas (RINCK JUNIOR

et al., 2002).
 21

FIGURA 1. Estadiamento da FIGO para o

Carcinoma Primitivo do Ovário.
(MACHADO et al, 2003)
 22

Segundo dados levantados no Brasil, a incidência de câncer de ovário é 1,8%

(3.576 casos) do total diagnosticado entre 1976 e 1980. É a oitava forma mais

freqüente de câncer na mulher, atingindo-a, em média, aos 48 anos. Quanto ao TCG

maligno, a incidência registrada é de 6,5% (233 casos), ocupando o sexto lugar

entre as neoplasias ovarianas malignas (BRUMINI et al., 1982). Em estudo

retrospectivo efetuado no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná,

no período de janeiro de 1979 a dezembro de 1989, verificou-se que o câncer de

ovário constitui-se atualmente na terceira causa de morte em mulheres com

neoplasias malignas, sendo ultrapassado somente pelo câncer de mama e intestino;

dentre os tumores ovarianos, os estromais representam 14,21% (OLIVEIRA et al.,

1992). Em 18 cidades do estado de São Paulo a incidência de câncer de ovário, em

1991, representou 7,2%, excluindo os cânceres de pele (ANDREONI et al., 2001).

O Brasil obteve um avanço considerável, no que tange às fontes de

informações sobre morbidade por câncer. As neoplasias, no geral, estão incluídas

como uma das principais causa morte representando a proporção de 12,32%.

Segundo dados do Ministério da Saúde em 1.892 óbitos, o câncer de ovário

representou 1,66% de causa morte em mulheres no ano de 1999 (INSTITUTO

NACIONAL DE CÂNCER, 2002).

O TCG tem despertado interesse nos endocrinologistas pela sua freqüente

associação com hiperplasia endometrial e adenonocarcinoma demonstrando

evidente produção de estrógeno (KURMAN et al., 1979). Para evidenciar a

importância clínica dos TCG, estudos em imunoistoquímica (IHQ) têm pesquisado a

localização de receptores de diversos hormônios esteróides relacionados a este

 23

tumor (KURMAN et al., 1979; CHADHA et al., 1990; MULVANY & RILEY, 1997;

JURIC et al., 2001). Estudos mais recentes tem abordado outros aspectos do TCG,

tais como proliferação celular, além das mudanças hormonais relacionadas ao tumor

(JURIC et al., 2001; MILLER et al., 2001; LONG et al., 2001)

3.2 OVÁRIO DE ROEDORES E TUMOR DE CÉLULAS DA

GRANULOSA

Os ovários dos roedores são órgãos pares, pequenos, que produzem

gametas e hormônios sexuais; são envoltos por uma cápsula, a cápsula do ovário.

Em corte transversal apresenta uma zona medular (vascular) e outra em volta

chamada zona cortical. Os vasos sanguíneos entram no órgão pelo hilo ovariano e

continuam seu curso pela região medular. A superfície livre do córtex apresenta uma

fina camada de células epiteliais cubóides (FEKETE, 1941; HUMMEL, 1975).

Os folículos primários consistem de células esféricas grandes, o ovócito

primário envolto por uma camada de células foliculares, os folículos em

desenvolvimento apresentam duas ou mais camadas de células cubóides foliculares.

O ovócito é separado dessas células pela membrana pelúcida. As células que

constituem o estroma estão dispostas concentricamente em volta do folículo

formando a teca folicular que contém duas camadas, a teca interna rica em capilares

e a teca externa rica em tecido conjuntivo (FEKETE, 1941; HUMMEL, 1975).

 24

À medida que os folículos se desenvolvem surge um espaço irregular entre as

células foliculares cheios de um fluido claro denominado líquido folicular. Esse

espaço gradualmente aumenta formando uma cavidade, o antro folicular. O antro é

delineado por uma camada estratificada de células foliculares, também chamadas

de células da granulosa e que formam a membrana granulosa. O folículo se

desenvolve até formar o folículo maduro chamado de folículo de Graaf (FEKETE,

1941; HUMMEL, 1975).

Na literatura os tumores espontâneos ovarianos em camundongos têm sido

estudados por diversos autores (FRITH et al., 1981; BEAMER, 1986). Esses

tumores são comumente encontrados em fêmeas de roedores em idade avançada

(12-14 meses) e o tipo de tumor que mais prevalece é o derivado de células da

granulosa (BEAMER et al., 1985). A classificação dos tumores de ovário de

camundongos tem sido baseada na sua atividade hormonal e na histogênese

ovariana (FRITH et al., 1981).

Os primeiros estudos sobre tumor de ovário em camundongos foram no início

do século XX (CLOUDMAN, 1941). Dos tumores ovarianos o tipo mais comum é o

de células da granulosa. GARDNER et al., citado por CLOUDMAN (1941),

descreveram um caso de TCG bilateral em camundongo idoso em 1936.

Em camundongos, o arranjo celular do TCG pode variar de massas sólidas a

grupamentos ocasionais de células luteinizadas de arranjo folicular ou

cistoadenomatoso. Podem exibir cistos hemorrágicos e algumas áreas pequenas de

necrose (BEAMER et al., 1985) bem como, arranjo de células em cordões, ninhos e
 25

pseudofolículos (MURPHY, 1975). Em camundongos e ratos as células da granulosa

além de exibirem massas sólidas podem também se apresentar em arranjo difuso

(ALISON et al., 1987). Nos ratos, o TCG tem uma grande variedade de padrões

histológicos: difuso, trabecular e papilar (IGLESIAS et al., 1950).

Algumas linhagens de camundongos apresentam alta incidência de TCG, e

nelas foi identificado o gene Gct que determina a susceptibilidade de

desenvolvimento espontâneo deste tumor (BEAMER et al., 1988). Mais

recentemente, foi identificado em camundongos SWR este mesmo gene, localizado

no cromossomo 4, o qual determina a susceptibilidade a TCG espontâneo e induzido

por deidroepiandrosterona (DHEA) (BEAMER et al., 1985; TENNENT et al., 1993).

No rato, os tumores de ovário mais freqüentes são os TCG ou da

teca-granulosa (ALTMAN & GOODMAN, 1979) e um destes tumores, produtor de

estrogênio, foi transplantado com sucesso por várias gerações (IGLESIAS et al.,

1950).

O TCG benigno e maligno tem sido descrito em ratos Sprague-Dawley e F344

(GREGSON et al.,1984, ALISON & MORGAN, 1987, LEWIS, 1987, ALISON et al.,

1987), assim como em cobaias (BURNS et al., 2001).

A indução experimental de TCG com dimetilbenzantraceno (DMBA) tem sido

descrita em camundongos e observou-se alta incidência do tumor nesses animais

(HILFRICH, 1975, VOLFSON, 1976, GEARY, 1984). Camundongos da linhagem

C3H irradiados mostraram TCG e adenoma tubular, e acredita-se que o TCG foi
 26

capaz de sintetizar estrogênio, pois foi observado no esfregaço vaginal a fase estro

e pelos cortes histológicos observou-se hipertrofia endometrial (YAKUSHIJI et al.,

1981).

KAMMERMAN et al. (1977) verificaram a presença de receptores para o

hormônio luteinizante (LH) e gonadotrofina coriônica (HCG) no TCG de

camundongos, observando que a quantidade do receptor está relacionada com o

grau de luteinização do tumor. Camundongos tratados com altas doses de LH

desenvolveram TCG apresentando uma dependência genética (KERI et al., 2000).

3.3 TUMOR DE CÉLULAS DA GRANULOSA DO GERBIL

O gerbil, Meriones unguiculatus, é um pequeno roedor originário de áreas

desérticas da China e da Mongólia, que pertence à família dos cricetídeos,

subfamília gerbilínea, portanto filogeneticamente o gerbil é próximo do hamster. Uma

vez adaptado como animal de laboratório, o gerbil vem sendo utilizado na pesquisa

médica ocidental desde a década de 60 (SCHWENTKER, 1963).

No gerbil, a localização primária mais comum das neoplasias espontâneas,

nas fêmeas, corresponde aos ovários (BENITZ & KRAMER, 1965; RINGLER et al.,

1972; VINCENT et al., 1975; ROWE et al., 1974; VINCENT & ASH, 1978; MECKLEY

& ZWICKER, 1979; GUZMÁN-SILVA & ROSSI, 1990; MATSUOKA & SUZUKI,

1995). Dentre os tumores ovarianos, tem sido diagnosticados disgerminomas, TCG,

leiomiomas e tumor de células luteínicas (BENITZ & KRAMER, 1965), teratomas

 27

(VINCENT et al., 1975), tumores de células luteínicas da teca e tumores de células

luteínicas da granulosa (VINCENT & ASH, 1978), TCG, tumor de células da teca,

teratoma e leiomioma (MECKLEY & ZWICKER, 1979).

Microscopicamente o TCG se caracteriza por apresentar padrão foliculóide,

com células cubóides com arranjo em ninhos e cordões e células – vacuoladas –

luteinizadas (ROWE et al., 1974; RINGLER et al., 1972). Os mesmos aspectos têm

sido descritos, além de corpúsculos de Call-Exner e ultra-estrutura das células

tumorais compatível com atividade secretora de esteróides (GUZMAN-SILVA et al.,

1995a).

Em estudos referentes à patologia ovariana espontânea do gerbil adulto,

foram registrados TCG ou tumores de teca-granulosa, com diversos graus de

luteinização (GUZMÁN-SILVA & ROSSI, 1990). Microscopicamente, o TCG,

apresentou padrão foliculóide, e a maioria das portadoras apresentava testosterona

sérica elevada (GUZMÁN-SILVA et al., 1995a, GUZMÁN-SILVA et al., 1995b).

O TCG de gerbil pode apresentar invasão (ROWE, 1974) e metástases

(BENITZ & KRAMER, 1965) e, portanto, comportamento maligno.

3.4 MORFOMETRIA

A aplicação da morfometria na pesquisa tem sido atualmente bem

generalizada, pois é imperioso que as descrições pseudoquantitativas dos

 28

morfologistas sejam substituídas por dados matemáticos passíveis de tratamento

estatístico (COTRIM et al., 1990).

Métodos morfométricos têm sido utilizados para analisar características

nucleares que pudessem contribuir no diagnóstico da malignidade de neoplasias

ovarianas humanas (RESTA et al, 1992, HABA et al., 1993, TAN et al, 1999,

MILLER et al., 2001, YIN & GU, 2002, KOLOSOV & NOVICHKOV, 2003).
 29

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 AMOSTRA

Foi analisado material de arquivo correspondente a 167 fêmeas de gerbil,

entre virgens e reprodutoras, de várias faixas etárias, que foram mantidas no

Biotério do Setor de Patologia Experimental, Departamento de Patologia,

Universidade Federal Fluminense, no período de 1982 a 1992.

Os animais permaneceram acondicionados em gaiolas de plástico, dispondo

de água filtrada e alimentação balanceada ad libitum, temperatura constante a 20ºC

e com ciclos de claro e escuro alternados de 12 em 12 horas.

Para este estudo, os animais foram distribuídos em 3 faixas etárias, jovens (1-

2 anos), adultos (2-3 anos), idosos (>3 anos) (TAB.1). As amostras provieram da

necropsia completa dos animais sacrificados, por inalação prolongada de éter, ou

daqueles que morreram naturalmente.

 30

TABELA 1. Distribuição de 167 gerbis por faixa etária e status sexual.

IDADE (anos) VIRGENS REPRODUTORAS TOTAL
1-2 48 10 58
2-3 39 28 67
>3 25 17 42
TOTAL 112 55 167

4.2 MACROSCOPIA

Os ovários foram classificados em normais ou com TCG desenvolvido de

aspecto cístico, sólido ou misto, conforme a macroscopia, distinguindo as formas

unilaterais e bilaterais. As características avaliadas comparativamente foram aspecto

externo, cor e tamanho dos ovários e/ou tumores. As cores foram definidas em

transparente, avermelhada, amarelada, amarelo-avermelhada e branco-amarelada.

O tamanho foi definido por faixas: <9mm, 10-19mm e >20mm e mensurados com o

auxílio de régua milimetrada. Os casos em que não foi possível verificar a cor ou

medir o tamanho do tumor denominamos de NFR (“não foi realizado”).

4.3 HISTOPATOLOGIA

Após a necropsia completa, além de ambos os ovários, fragmentos de

diversos tecidos foram coletados, fixados em formol 10% Millonig e processados da

forma rotineira para histopatologia em lâminas coradas com hematoxilina e eosina.

Todas as lâminas foram revistas para o estudo histopatológico, utilizando

microscopia óptica, e os tumores foram classificados de acordo com suas

características morfológicas em incipiente, cístico, sólido e misto. As características

 31

microscópicas dos TCG (cordões e ninhos tumorais, aspecto angiomatóide, células

luteinizadas, pseudofolículos, corpúsculo de Call-Exner, cistos incipientes, necrose),

a invasão local e a presença, freqüência e o local de metástases foram analisados,

definindo a classificação dos TCG em malignos ou não.

4.4 TESTOSTERONA

A dosagem sérica de testosterona foi efetuada em 48 gerbis portadoras de

TCG. O sangue foi coletado do seio retro-orbitário dos animais devidamente

anestesiados. O soro foi mantido à temperatura de -200C para análise do andrógeno

pela técnica de radioimunoensaio de fase sólida. (SAMANTA & ALI, 1990).

Para a análise da testosterona, os valores foram separados em TCG

incipiente e TCG desenvolvido, isto se deveu à diversidade na apresentação macro

e microscópica dos tumores. O grupo TCG incipiente se referiu as dosagens

somente dos tumores incipientes bilaterais (n=22) e o grupo TCG desenvolvido

(n=26) aos tumores sólidos, císticos e mistos, uni ou bilaterais, e quando unilaterais

combinados com qualquer uma das outras formas de TCG no ovário contralateral.

4.5 MORFOMETRIA

A morfometria nuclear foi efetuada utilizando-se o sistema de análise de

imagens Kontron Elektronic KS 300 versão 2.0, previamente calibrado, e com as

funções determinadas por uma função macro específica (FIG. 2). Para a captura de
 32

imagens foi utilizada uma câmara JVC TK 1270 acoplada a microscópio óptico

Zeiss, modelo Axiolab.

FIGURA 2. Macro utilizada pelo sistema de análise de imagens KS 300.

Comandos Função
1. imgdelete "*" Apaga todas as imagens anteriores e suas
respectivas janelas da galeria
2. Gclear 0 Apaga os planos gráficos anteriores
3. ! imgload Abre na janela e na galeria a imagem a ser
"c:\ks300\margaret\incipien\8413-e.tif",1 analisada, que foi previamente gravada como
arquivo tif
4. normalize 1,2,5 Fornece contraste automático à imagem a ser
analisada
5. stop Parada automática da macro
6. # write draw nuclear line Lembrete para desenhar a membrana nuclear
7. # write save image Lembrete para gravar a imagem com os
núcleos delineados, em formato tif
8. ! imgload "c:\ks300\margaret\incipien\84- Abre na janela e na galeria a imagem a ser
13ee.tif",3 analisada, que foi previamente gravada como
arquivo tif
9. ! dislevrgb Produz semi-automaticamente a imagem
3,4,1,0,0,0,0,0,128,128,10,"RGB" binária da imagem colorida, baseada na
seleção interativa de pixels contidos no tom da
marcação da membrana nuclear
10. MSload "a:\ms\40x.ms" Carrega as condições, previamente gravadas,
de calibração geométrica específica para a
unidade “micrómetro”, de acordo com o
aumento do microscópio no qual foi obtida a
imagem
11. MSload "a:\ms\marg40.ms" Carrega os tipos de parâmetros morfométricos
a serem executados nas medições
12. ! MSmeasmask 4,1,"database",0,1,10 Realiza as medições morfométricas
automaticamente
13. datalist "database",0,0 Fornece uma lista de resultados das medições
morfométricas
14. # write edit/copy database to excel Lembrete para lançar os resultados em um
programa de planilhas
 33

4.5.1 Histomorfometria nuclear

Esta análise foi efetuada em 5 casos de TCG incipiente e 5 casos de TCG

desenvolvido do tipo sólido. Com a finalidade de avaliar objetivamente as variações

em forma e tamanho dos núcleos – pleomorfismo - foram escolhidos campos

microscópicos no aumento de 400x, evitando-se áreas de necrose e ou infiltrado

inflamatório intenso (COTRIM et al., 1990; TALVE et al., 1996). De cada uma das

lesões selecionadas aleatoriamente foram capturadas 10 imagens.

Em cada imagem digitalizada, 10 núcleos aleatórios foram delimitados

manualmente de forma individual, com marcação azul. Após o processamento

computadorizado, foram medidas automaticamente a área e o perímetro nuclear, e

os diâmetros mínimo e máximo (FIG. 3 e 4). Com estes valores foram determinadas

as seguintes características nucleares:

Fator de regularidade (FR) – Avalia o grau de regularidade de uma estrutura, sendo

considerada regular quando o valor deste fator é igual a 1, quer seja na forma de um

círculo perfeito ou de uma elipse (ODA & TSUNEYOSHI, 1995).

área
FR =
ð
x diâmetro máximo x diâmetro mínimo
4

Fator elíptico (FE) – Avalia a forma de uma estrutura e quanto mais distante de 1 o

valor deste fator mais elíptica é a estrutura; ao atingir o valor de 1 ela é considerada

um círculo (ODA & TSUNEYOSHI, 1995).

 34

diâmetro mínimo
FE =
diâmetro máximo

Fator de forma nuclear (FFN) – Calculado pela seguinte fórmula (HABA et al., 1993):

perímetro2
FFN =
4π (área nuclear)

Volume nuclear (VN) – Com os valores do diâmetro mínimo e máximo calculou-se o

diâmetro médio e em seguida o raio nuclear. O VN foi calculado através da fórmula

referida por SARRAF et al. (1997):

4
VN =
3ð r3

Os resultados morfométricos de cada parâmetro avaliado foram expressos

como média aritmética em cada caso, e média e desvio padrão do grupo (TAB. 2 e

3).
 35

A B

C D

FIGURA 3. Seqüência de imagens de TCG incipiente. Ilustração durante a execução

da macro para análise dos parâmetros nucleares preestabelecidos, no sistema
Kontron KS300 versão 2.0. A – imagem original, HE 400x. B – imagem com
tratamento automático do contraste. C – imagem com os núcleos delineados
manualmente. D – imagem binária semi-automática, corresponde a imagem final
submetida à medição automática.

TABELA 2. Planilha de dados ilustrativa referente a leitura da figura 3D

mediante a macro no sistema Kontron KS300.
No AREAF PERIM FERETMIN FERETMAX FE FR RADIO VN FFN
µm2 µm µm µm µm µm 3
1 20,17 28,03 4,15 6,02 0,69 1,03 5,08 55,79 3,10
2 25,34 32,45 5,12 6,99 0,73 0,90 6,05 94,20 3,31
3 41,28 42,44 6,83 8,19 0,83 0,94 7,51 179,83 3,47
4 25,46 32,05 5,37 6,49 0,83 0,93 5,93 88,50 3,21
5 40,04 41,78 6,10 8,29 0,74 1,01 7,20 158,09 3,47
6 26,83 33,57 5,37 6,57 0,82 0,97 5,97 90,14 3,34
7 51,99 48,94 7,07 10,06 0,70 0,93 8,56 266,54 3,67
8 32,78 36,93 6,10 7,28 0,84 0,94 6,69 126,90 3,31
9 27,01 33,17 5,37 6,78 0,79 0,95 6,07 95,02 3,24
10 30,46 35,83 5,61 7,09 0,79 0,98 6,35 108,60 3,35
 36

A B

C D

FIGURA 4. Seqüência de imagens de TCG sólido. Ilustração durante a execução da

macro para análise dos parâmetros nucleares preestabelecidos, no sistema Kontron
KS300 versão 2.0. A – imagem original, HE 400x. B – imagem com tratamento
automático do contraste. C – imagem com os núcleos delineados manualmente. D –
imagem binária semi-automática, corresponde a imagem final submetida à medição
automática.

TABELA 3. Planilha de dados ilustrativa referente a leitura da figura 4D

mediante a macro no sistema Kontron KS300.
No AREAF PERIM FERETMIN FERETMAX FE FR RADIO VN FFN
µm2 µm µm µm µm µm 3
1 37,24 40,34 6,10 8,00 0,76 0,97 7,05 148,53 3,48
2 35,99 39,69 5,85 8,18 0,72 0,96 7,02 146,55 3,48
3 45,39 45,13 6,83 9,03 0,76 0,94 7,93 211,47 3,57
4 40,75 42,33 5,85 8,48 0,69 1,05 7,17 156,26 3,50
5 37,89 40,49 6,27 8,32 0,75 0,93 7,29 164,68 3,44
6 36,64 39,57 6,10 7,75 0,79 0,99 6,92 140,79 3,40
7 40,75 43,42 6,20 9,07 0,68 0,92 7,63 188,60 3,68
8 51,75 48,13 7,75 9,07 0,85 0,94 8,41 252,24 3,56
9 36,29 40,83 5,12 8,48 0,60 1,06 6,80 133,54 3,66
10 40,15 41,64 6,83 8,31 0,82 0,90 7,57 183,94 3,44
 37

6. ESTATISTICA

A análise estatística dos resultados foi efetuada mediante o programa SPSS e

consistiu nos testes de qui-quadrado, Mann-Whitney U e teste t de Student, os quais

foram usados para comparar os dados clínicos, macroscópicos, histopatológicos e

morfométricos. Os valores de p≤0,05 foram considerados estatisticamente

significativos.
 38

7. RESULTADOS

A distribuição de 167 gerbis portadoras de TCG que foram analisadas

encontra-se discriminada na TAB. 4.

TABELA 4. Distribuição de 167 gerbis portadoras de tumor de células da

granulosa de acordo com a faixa etária e o status sexual.
IDADE (anos) VIRGENS REPRODUTORAS TOTAL
1-2 48 10 58
2-3 39 28 67
>3 25 17 42
TOTAL 112 55 167

Nos 167 gerbis, os ovários foram classificados macroscopicamente como

normais em 71 casos (46 bilaterais e 25 unilaterais) e 96 com TCG desenvolvido,

sendo 13 com TCG sólido (2 bilaterais e 11 unilaterais), 63 com TCG cístico (22

bilaterais e 41 unilaterais) e 20 com TCG misto (4 bilaterais e 16 unilaterais) (TAB.

5). Foi considerado TCG misto aquele que apresentava área sólida e área cística no

mesmo tumor.

TABELA 5. Apresentação macroscópica dos ovários de 167 gerbis.

OVÁRIOS BILATERAL UNILATERAL TOTAL
NORMAL 46 25 71
TCG SÓLIDO 2 11 13
TCG CÍSTICO 22 41 63
TCG MISTO 4 16 20
 39

Microscopicamente, os ovários com aspecto normal apresentavam TCG que

foi classificado como incipiente.

7.1 MACROSCOPIA

Quarenta e seis tumores incipientes eram bilaterais (65%). Os tumores

incipientes unilaterais ocorreram no ovário direito (OD) em 17 casos (24%) e no

ovário esquerdo (OE) em 8 casos (11%). Nos tumores desenvolvidos observamos

apenas 28 tumores bilaterais (29%), 30 no OD (31%) e 38 no OE (40%) (GRÁF. 1).

Verificamos que houve associação significativa entre o tipo de tumor e a localização

anatômica (qui-quadrado p<0,001) havendo fraca intensidade entre as associações

(Phi 0,382).

A maior incidência de TCG incipientes foi na faixa etária de 1 a 2 anos em 36

casos (51%), e os tumores desenvolvidos na faixa etária de 2 a 3 anos com 47

casos (49%) (GRÁF. 2). Também houve associação significativa entre o tipo de

tumor e a faixa etária dos animais (qui-quadrado p<0,001) com fraca intensidade

entre as associações (Phi 0,343).

Do total de TCG incipientes 44 (62%) eram em virgens e 27 (38%) em

reprodutoras. Dos tumores desenvolvidos, 68 (71%) eram em virgens e 28 (29%) em

reprodutoras (GRAF. 3). Entre o tipo de tumor e o status sexual não houve

associação significativa.
 40

GRÁFICO 1. Distribuição de 167 gerbils portadoras de tumor de

células da granulosa por localização anatômica e tipo de tumor.

70

60

50

40 Ovário direito
% Ovário esquerdo
30 Bilateral

20

10

0
TCG Incipiente TCG Desenvolvido

GRÁFICO 2. Distribuição de 167 gerbils portadoras de tumor de

células da granulosa por idade e tipo de tumor.

60

50

40
1-2 anos
2-3 anos
% 30
>3 anos

20

10

0
TCG Incipiente TCG Desenvolvido
 41

GRÁFICO 3. Distribuição de 167 gerbil portadoras de tumor de

células da granulosa por status e tipo de tumor.

80

60

Virgem
% 40 Reprodutor

20

0
TCG Incipiente TCG Desenvolvido

Todos os 117 tumores incipientes apresentaram-se com tamanho menor que

9mm. Entre os desenvolvidos 51 (41%) apresentaram tamanho menor que 9mm, 41

entre 10-19mm (33%), 32 apresentaram-se maiores que 20mm (26%) (GRAF. 4 e

FIG. 5). Para a análise entre o tipo de tumor e o seu tamanho foi feito o teste qui-

quadrado que apresentou significância (p<0,001), com intensidade moderada entre

as associações (Phi 0,640).

Considerando a cor dos tumores, todos os 117 do tipo incipiente foram

branco-amarelados, dentre os tumores sólidos 2 apresentaram-se de cor

avermelhada (13%), 6 de cor amarelada (40%) e 7 amarelo-avermelhada (47%); 78

tumores císticos foram transparentes (92%), 4 de cor avermelhada (5%), 1

amarelada (1%) e 2 amarelo-avermelhada (2%); a parte sólida dos mistos foi de cor

avermelhada em 1 tumor (4%), amarelada em 12 (50%), amarelo-avermelhada em 8

 42

(34%) e branco-amarelada em 2 (8%); já a parte cística foi transparente em 17

tumores (71%) e 7 apresentaram-se de cor avermelhada (29%) (TAB. 6).

GRÁFICO 4. Distribuição de 241 tumores de células da granulosa por

tamanho e tipo de tumor.

100

80

< 9mm
60
10-19mm
% > 20mm
40

20

0
TCG Incipiente TCG Desenvolvido

TABELA 6. Distribuição de 241 de tumores de células da granulosa de gerbil

por cor e tipo de tumor.
COR INCIPIENTE SÓLIDO CÍSTICO MISTO
Parte sólida Parte cística
n % n % n % n % n %
Transparente 0 0 0 0 78 92 0 0 17 71
Avermelhada 0 0 2 13 4 5 1 4 7 29
Amarelada 0 0 6 40 1 1 12 50 0 0
Amarelo-avermelhado 0 0 7 47 2 2 8 34 0 0
Branco-amarelado 117 100 0 0 0 0 2 8 0 0
NFR 0 0 0 0 0 0 1 4 0 0
TOTAL 117 100 15 100 85 100 24 100 24 100

A visualização macroscópica de metástases em diversos órgãos ocorreu

apenas em um animal portador de TCG sólido unilateral (FIG. 6).

 43

7.2 HISTOPATOLOGIA

Todos os tumores estavam principalmente compostos por ninhos e cordões

de células tumorais cubóides. Os ninhos e cordões dos tumores incipientes foram

observados na parede cística ou substituindo o epitélio germinativo.

Com relação aos tumores incipientes, foram observadas as seguintes

características: 103 apresentavam células luteinizadas (88%), 91 exibiam cistos

incipientes (78%), 28 tinham corpúsculos de Call-Exner (24%), e 7 mostravam

pseudofolículos (6%) (FIG. 7). Mitoses e necrose não foram observadas. Com

relação aos tumores sólidos foram registradas células luteinizadas em 13 tumores

(87%), cistos incipientes em 2 (13%), corpúsculos de Call-Exner em 2 (13%),

pseudofolículos em 9 (60%), mitoses em 6 (40%) e necrose em 5 (33%) (FIG. 8);

foram observados ainda 13 tumores com células em arranjo difuso (87%) e 11 com

cistos hemorrágicos conferindo aspecto angiomatóide (73%). Com relação aos

tumores mistos foram observadas as seguintes características: 22 casos com

células luteinizadas (92%), 7 com cistos incipientes (29%), 7 com corpúsculos de

Call-Exner (29%), 17 com pseudofolículos (71%), 15 com mitoses (63%) e 1 com

necrose (4%); foram observados ainda 13 casos com células em arranjo difuso

(54%) e 21 com cistos hemorrágicos conferindo aspecto angiomatóide (88%) (FIG.

9). Nos tumores císticos foram observadas as seguintes características: 70

apresentavam células luteinizadas (82%), 49 exibiam cistos incipientes (58%), 17

tinham corpúsculos de Call-Exner (20%), 7 mostravam pseudofolículos (8%) (FIG.

10), 6 apresentavam mitoses (7%) e apenas 1 apresentou necrose (1%); foram

 44

observados ainda células com arranjo difuso em 17 tumores (20%) e 3 com cistos

hemorrágicos conferindo aspecto angiomatóide (4%) (TAB. 7).

TABELA 7. Características microscópicas de 241 tumores de células da

granulosa de gerbil por tipo de tumor.
CARACTERÍSTICAS INCIPIENTE SÓLIDO MISTO CÍSTICO
n % n % n % n %
Ninhos e cordões tumorais 117 100 15 100 24 100 85 100
Células tumorais em arranjo
difuso 0 0 13 87 13 54 17 20
Cistos hemorrágicos/Aspecto
angiomatóide 0 0 11 73 30 88 3 4
Mitoses/Inclusive atípicas 0 0 6 40 15 63 6 7
Células luteinizadas 103 88 13 87 22 92 70 82
Pseudofolículos 7 6 9 60 17 71 7 8
Corpúsculo de Call-Exner 28 24 2 13 7 29 17 20
Cistos incipientes 91 78 2 13 7 29 49 58
Necrose 0 0 5 33 1 4 1 1

Todos os tumores sólidos, mistos e císticos que apresentaram necrose

correspondiam a malignos, pela presença de metástases.

Dependendo da intensidade da luteinização, o aspecto do citoplasma das

células do TCG se mostrou variado em quantidade de escasso a moderado, e

finamente granular ou vacuolizado, principalmente nos tumores sólidos, mistos e

císticos.

Para a análise entre os tipos de tumores e suas características microscópicas

foi utilizado o teste exato de Fisher que apresentou significância (p<0,01) para a

maioria das características, com exceção de ninhos e cordões, células luteinizadas e

corpúsculo de Call-Exner. A intensidade da associação entre o tipo de tumor e cada

característica foi moderada para células em arranjo difuso, mitoses e

pseudofolículos (Phi 0,630, 0,619, 0,595 e respectivamente), forte para cistos

 45

hemorrágicos (Phi 0,847) e fraca para cistos incipientes e necrose (Phi 0,402 e

0,472 respectivamente).

Nos tumores incipientes a invasão local foi observada comprometendo hilo

ovariano em 83 casos (71%), gordura periovariana em 26 casos (22%), fimbrias em

24 casos (21%) e ligamento largo em 3 casos (3%) (FIG. 11). A invasão local foi

observada nos tumores sólidos comprometendo hilo ovariano em 1 caso (7%) e

ligamento largo em 1 caso (7%). Nos tumores mistos a invasão local foi observada

no hilo ovariano em 8 casos (33%), gordura periovariana em 3 casos (13%) e

ligamento largo em 3 casos (13%). Nos tumores císticos a invasão local ocorreu no

hilo ovariano em 50 casos (59%), gordura periovariana em 20 casos (24%), fimbrias

em 4 casos (5%), ligamento largo em 4 casos (5%) e tuba uterina em 1 caso (1%)

(GRAF. 5).

GRÁFICO 5. Invasão local de 241 tumores de células da

granulosa em gerbil por tipo de tumor.

80

70

60

50 Incipiente
% 40 Sólido
Misto
30 Cístico
20

10

0
Hilo ovariano Gordura Fimbrias Ligamento Tuba uterina
periovariana largo
 46

Na análise entre o tipo de tumor e a invasão local houve apenas diferença

significativa para o hilo ovariano e as fimbrias (p<0,01) pelo teste exato de Fisher,

havendo fraca intensidade entre as associações (Phi 0,355 e 0,274

respectivamente).

Com relação às metástases abdominais (FIG. 12), estas foram observadas

em linfonodos abdominais – 5 casos (4%), gordura abdominal – 3 casos (3%),

omento – 30 casos (26%) e mesentério - 3 casos (3%) de tumores incipientes. Nos

animais com tumores sólidos verificou-se metástase em linfonodos abdominais – 7

casos (47%), gordura abdominal – 6 casos (40%), omento – 12 casos (80%),

mesentério - 5 casos e adrenal – 1 caso (4%), fígado – 1 caso (7%) e parede

abdominal – 1 caso (1%). Nos casos com tumores mistos havia metástese em

linfonodos abdominais – 13 casos (54%), gordura abdominal – 9 casos (38%),

omento – 11 casos (46%), mesentério – 8 casos (33%), pâncreas – 1 caso (4%),

gânglio autônomo retroperitoneal – 2 casos (7%) e estômago – 1 caso (4%).

Metástase em linfonodos abdominais ocorreu em 23 casos (27%), na gordura

abdominal em 15 casos (18%), no omento em 46 casos (54%), no mesentério em

14 casos (16%), no fígado em 1 caso (1%), no pâncreas em 1 caso (1%) e em

gânglio autônomo retroperitoneal em 4 casos (5%) de tumores císticos (TAB. 8).

Para a análise entre os tipos de tumores e metástase abdominal foi utilizado o

teste exato de Fisher que apresentou significância apenas para omento, mesentério

e linfonodo abdominal (p<0,01), e gordura abdominal (p<0,05). A intensidade da

associação entre o tipo de tumor e a presença de metástase foi fraca para

 47

linfonodos abdominais (Phi 0,446), omento (Phi 0,338), mesentério (Phi 0,337) e

gordura abdominal (Phi 0,252).

TABELA 8. Metástase abdominal de 241 tumores de células da granulosa de

gerbil por tipo de tumor.
METÁSTASES INCIPIENTE SÓLIDO MISTO CÍSTICO
n % n % n % n %
Linfonodo abdominal 5 4 7 47 13 54 23 27
Gordura abdominal 3 3 6 40 9 38 15 18
Omento 30 26 12 80 11 46 46 54
Mesentério 3 3 5 33 8 33 14 16
Adrenal 0 0 1 4 0 0 0 0
Fígado 0 0 1 7 0 0 1 1
Pâncreas 0 0 0 0 1 4 1 1
Estômago 0 0 0 0 1 4 0 0
Gânglio autônomo retroperitoneal 0 0 0 0 2 8 4 5
Parede abdominal 0 0 1 7 0 0 0 0

Com relação às metástases no tórax e pescoço (FIG. 13), estas foram

observadas em linfonodo mediastínico – 3 casos (20%), pleura – 2 casos (13%),

pulmão – 2 casos (13%), linfonodo subcutâneo – 1 caso (7%) e gordura subcutânea

– 2 casos (13%) de tumor sólido. Nos animais com tumor misto verificou-se

metástase em linfonodo mediastínico – 2 casos (8%) e pleura – 2 casos (8%).

Metástase ocorreu em linfonodo mediastínico – 4 casos (5%), pulmão – 1 caso (1%)

e linfonodo subcutâneo – 1 caso (1%) de tumor cístico. Nos tumores incipientes não

foram observadas metástases no tórax e pescoço (GRAF. 6).

O teste exato de Fisher foi utilizado para a análise entre os tipos de tumores e

metástase no tórax e pescoço que apresentou significância para linfonodo

mediastínico e pleura (p<0,01) e para pulmão e gordura subcutânea (p<0,05); não

houve significância para linfonodo subcutâneo. A intensidade da associação entre o

 48

tipo de tumor e a presença de metástase foi fraca para linfonodo mediastínico (Phi

0,267), pleura (Phi 0,305), pulmão (Phi 0,285) e gordura subcutânea (Phi 0,355).

GRÁFICO 6. Metástase em tórax e pescoço de 241 tumores de

células da granulosa de gerbil por tipo de tumor.

Gordura subcutânea

Pulmão
Cístico
Pleura Misto
Sólido
Linfonodo subcutâneo Incipiente
Linfonodo
mediastínico

0 5 10 15 20

Do total da amostra apenas 11 (15%) de 71 tumores incipientes e 8 (9%) de

85 císticos não apresentaram características de malignidade, invasão e/ou

metástase; só 1 (8%) de 13 tumores sólidos foi benigno e todos os 20 mistos foram

malignos. Apenas 4 fêmeas virgens com TCG, na faixa etária de 2 a 3 anos, tiveram

morte natural e apresentavam diversos tipos de TCG maligno.

7.3 TESTOSTERONA

Os resultados dos níveis de testosterona sérica nos TCG incipientes variaram

entre 0,09 e 4,80ng/ml, em média 0,97ng/ml; já para os tumores desenvolvidos as

 49

taxas ficaram entre 0,16 e 13,0ng/ml, com valor médio de 3,57ng/ml. Houve

diferença significativa (p<0,01) entre os grupos pela análise estatística do teste de

Mann-Whitney (GRAF. 7).

GRÁFICO 7. Nivel de testosterona em 48 casos

de tumor de células da granulosa de gerbil
distribuidos por tipo de tumor.

14

12

10

8
ng/ml

0
TCG Incipiente TCG Desenvolvido

7.4 MORFOMETRIA

Na análise morfométrica dos TCG incipientes foram registrados, em média

aritmética, os seguintes valores: área nuclear – 25,75µm2, VN – 92,28µm3, FE –

0,745, FR – 0,950, e FFN – 3,27. Nos TCG sólidos verificou-se, em média, área

nuclear – 31,82µm2, VN – 125,64µm3 , FE – 0,779, FR – 0,957, e FFN – 3,33 (GRÁF.

 50

8). Na análise estatística pelo teste t Student houve diferença significativa apenas

para o FE (p<0,05).
 51

A. Área nuclear em tumor de células da B. Volume nuclear em tumor de células da

granulosa de gerbil. granulosa de gerbil.

50 180

160
40 140

120
30
100

µm3
µm2

80
20
60

40
10
20

0 0
TCG incipiente TCG sólido TCG incipiente TCG sólido

C. Fator Elíptico nuclear em tumor de D. Fator de Regularidade nuclear em

células da granulosa de gerbil. tumor de células da granulosa em gerbil.

0,80 0,97

0,78
0,96

0,76 *
FE

FR

0,95

0,74

0,94
0,72

0,70 0,93
TCG incipiente TCG sólido TCG incipiente TCG sólido

E. Fator de Forma Nuclear em tumor de

células da granulosa de gerbil.

3,50

3,40
GRÁFICO 8. Análise morfométrica
dos núcleos de TCG incipiente e
3,30 sólido. A. Área nuclear. B. Volume
FFN

nuclear. C. Fator elíptico (* teste t

3,20 Student p<0,01). D. Fator de
regularidade. E Fator de forma
3,10
nuclear.

3,00
TCG incipiente TCG sólido
 52

A B

C D

E F

FIGURA 5. Fotomacroscopia de tumor de células da granulosa de gerbil. A. Ambos

ovários exibindo TCG cístico, OD 20x15mm, OE 10x8mm. B. Ambos ovários exibindo
TCG cístico, OD 8x8mm OD, OE 15x15mm. C. Ambos ovários exibindo TCG cístico,
OD 2x2mm OD (seta), OE 15x15mm. D. OD mostrando aspecto normal e OE com TCG
sólido, grande massa tumoral medindo 25x10mm (seta) e outra de 10x8mm (seta). E.
OD exibindo TCG misto, grande massa tumoral medindo 15x15mm (seta) e cisto de
30x25mm; OE com TCG cístico, 15x15mm. F. OD exibindo TCG misto, grande massa
tumoral medindo 20x20mm (seta) e cisto de 20x20mm, OE com TCG cístico,
15x15mm.
 53

A B

2 1
1 2
3 3

C D

FIGURA 6. Fotomacroscopia de metástases de tumor de células da granulosa de gerbil.

A. OD de aspecto normal e OE com TCG sólido, grande massa tumoral medindo
25x10mm (seta) e outra de 10x8mm (seta). B. Metástase no omento e fígado (seta). C.
Metástase em pleura (setas 1 e 2) e mediastino (seta 3). D. Metástase em linfonodo do
hilo renal (seta 1), pleura (seta 2) e mediastino (seta 3).
 54

A B

C D

FIGURA 7. Tumor de células da granulosa do tipo incipiente de gerbil. A. Ninhos

tumorais de células cubóides substituindo o epitélio germinativo ovariano. B. Ninhos e
cordões tumorais de células luteinizadas. C. Corpúsculo de Call-Exner (seta),
pseudofolículos e cistos. D. Ninhos tumorais de células cubóides e células luteinizadas.
Hematoxilina e Eosina.
 55

A B

C D

E F

FIGURA 8. Tumor de células da granulosa do tipo sólido de gerbil. A. Necrose. B.

Ninhos e cordões de células tumorais cubóides. C. Corpúsculo de Call-Exner (seta). D.
Cistos hemorrágicos conferindo aspecto angiomatóide. E. Células cubóides de arranjo
difuso e cisto incipiente (seta). F. Células luteinizadas. Hematoxilina e Eosina.
 56

A B

C D

E F

FIGURA 9. Tumor de células da granulosa do tipo misto de gerbil. A. Células tumorais

cubóides em arranjo difuso e mitose (seta). B. Cordões tumorais de células cubóides.
C. Corpúsculo de Call-Exner (seta). D. Ninhos e cordões de células tumorais e cisto
hemorrágico. E. Cisto incipiente (seta). F. Células luteinizadas. Hematoxilina e Eosina.
 57

A B

C D

E F

FIGURA 10. Tumor de células da granulosa do tipo cístico de gerbil. A. Células

cubóides em arranjo difuso e mitose (seta). B. Ninhos e cordões tumorais de células
cuboides e cisto. C. Células luteinizadas. D. Ninhos tumorais de células cubóides. E.
Cisto. F. Cisto incipiente. Hematoxilina e Eosina.
 58

A B

FIGURA 11. Invasão local de tumor de células da granulosa do tipo incipiente em

gerbil. A. Invasão do hilo ovariano. B. Invasão das fímbrias. Hematoxilina e Eosina.
 59

A B

C D

FIGURA 12. Metástases de tumor de células da granulosa no abdome de gerbil. A.

Implante no omento. B Metástase em adrenal C.. Metástase no fígado D. Metástase
em linfonodo abdominal. Hematoxilina e Eosina.
 60

A B

C D

FIGURA 13. Metástases de tumor de células da granulosa no tórax e pescoço de

gerbil. A. Metástase na pleura. B. Metástase na pleura. C. Metástase em traquéia. D.
Metástase em músculo paravertebral. Hematoxilina e Eosina.
 61

8 DISCUSSÃO

Notou-se que os TCG incipientes surgem precocemente e à medida que o

animal envelhece, os tumores passam a manifestar-se sob a forma sólida, cística ou

mista. Os tumores espontâneos em gerbil, inclusive os de ovário, aparecem a partir

dos 2 anos de idade (BENITZ & KRAMER, 1965, GUZMÁN-SILVA et al, 1995) ou

dos 3 anos (MATSUOKA & SUZUKI, 1995). Nesta amostragem verificamos a

ocorrência de TCG incipiente – 51% – em idade inferior a 2 anos, e TCG

desenvolvido – 49% – na faixa de 2-3 anos, sendo estas associações significativas.

Em camundongos virgens são descritos TCG em animais da linhagem SWR/Bm de

4-6 semanas e na linhagem SWR/J de 14-16 semanas (BEAMER et al, 1985), e

camundongos inbred BALB/c, C57BL/6 e C3H os tumores ovarianos são descritos

em animais com menos de 1 ano (FRITH et al, 1981).

Em humanos os TCG geralmente são unilaterais e variam desde focos

microscópicos até grandes massas encapsuladas sólidas ou císticas (COTRAN et al,

2000, BRASILEIRO FILHO, 2000). Este último autor ainda descreve necrose e

hemorragia. Nós observamos que no TCG de gerbil do tipo incipiente houve maior

incidência de tumores bilaterais – 65% – sendo essa associação significativa,

enquanto que os desenvolvidos ocorriam mais freqüentemente no ovário esquerdo.

 62

ROWE (1974), descreve TCG de gerbil unilateral e 1 caso de TCG bilateral em

Meriones shawi .

TCG funcionalmente ativos em meninas jovens (TCG juvenis) podem

provocar desenvolvimento sexual precoce na pré-puberdade. Nas mulheres adultas,

podem estar associados a hiperplasia do endométrio, doença cística de mama e

carcinoma endometrial (COTRAN et al, 2000). FULLER & CHU (2004) relatam a

associação de TCG com menarca precoce, menopausa tardia e nuliparidade.

BEAMER et al (1985) ao analisar o TCG espontâneo em camundongos da linhagem

SWR/J verificou que nas fêmeas virgens os tumores apareciam em idade precoce

(14-16 semanas) e nas reprodutoras o TCG é tardio (26-30 semanas). Os TCG de

gerbil nesta amostragem foram mais freqüentes em fêmeas virgens representando

62% no tipo incipiente e 71% no grupo desenvolvido; estas associações foram

significativas. Os TCG tanto são regulados como podem sintetizar hormônios, então,

parece lógico pensar que mudanças moleculares que envolvem a via endócrina

conduzam à transformação neoplásica em células da granulosa (FULLER & CHU,

2004). A incidência mais alta de TCG em virgens poderia ser explicada considerando

a gravidez como uma condição protetora para o desenvolvimento deste tumor, em

roedores como também em humanos, desde que há uma interrupção na ação cíclica

do FSH.

Sobre o tamanho dos TCG em gerbil, MECKLEY & ZWICKER (1979)

descrevem um tumor de aproximadamente 6-7mm de diâmetro e RINGLER et al

(1972) outro tumor de massa firme e cor branca medindo 7x7x10mm. Quanto à

forma cística do tumor, há relatos de cistos com diâmetro de 2,5mm (BENITZ &
 63

KRAMER, 1965), 2,5cm de diâmetro (VINCENT et al, 1975), e outro destaca a

formação de cistos hemorrágicos de 6-7mm de diâmetro (MECKLEY & ZWICKER,

1979). Em ratos Sprague-Dawley, macroscopicamente os tumores de massas

sólidas e os cistos variaram de 1 a 54x44x40mm de diâmetro (LEWIS, 1987), em

camundongos SWR, o TCG é caracterizado por um rápido crescimento com

tamanho médio de 3x3x2 a 12x10x10mm (BEAMER et al, 1985). Nós verificamos

que havia uma relação entre o tamanho e o tipo de TCG que mostrou associação de

tamanho <9mm e o TCG incipiente em 100% dos casos.

Os TCGs de gerbil têm sido descritos de cor vermelho-escura com áreas

azuis escuras (MECKLEY & ZWICKER, 1979). Em camundongos, os TCGs

apresentam-se de cor rosa-claro (BEAMER et al, 1985). Os tumores sólidos

apresentaram cor amarelada, branca, avermelhada ou pálida (LEWIS, 1987). Em

humanos, TCGs sólidos mostram-se de cor cinza pardacento (KURMAN et al, 1979).

A cor amarelada do TCG de gerbil reflete, provavelmente, a luteinização das células

tumorais. O conteúdo lipídico confere cor amarelada à superfície de corte dos TCGs

endocrinologicamente ativos (COTRAN et al, 2000). A maioria dos tumores císticos e

a parte cística dos mistos foi transparente por apresentar conteúdo líquido seroso; a

maioria dos sólidos apresentou cor amarelo-avermelhada devido a luteinização

associada a hemorragia no tumor; todos os tumores incipientes foram de cor branco-

amarelada semelhante a cor de ovários normais.

À microscopia, o TCG de gerbil é descrito como sendo composto de células

cubóides em arranjo difuso, com ninhos, cordões e cistos ou ainda com padrão

folicular, além de figuras mitóticas (BENITZ & KRAMER, 1965, MECKLEY &
 64

ZWICKER, 1979, RINGLER et al, 1972, ROWE et al, 1974, GUZMÁN-SILVA et al,

1995a), características essas que também foram observadas neste trabalho para os

tumores sólidos, mistos e císticos. O mesmo aspecto é observado em TCGs

humanos (KURMAN et al 1979, CHADHA et al, 1990, HABA et al, 1993). Em ratos

F344 e camundongos B6C3F1, histologicamente o TCG apresenta padrão

microfolicular, sertoliforme, tubular, que lembra o adenoma tubular de baixa

malignidade, e cístico (ALISON et al, 1987, ALISON & MORGAN, 1987). Esses

mesmos autores descrevem que alguns TCG são fusiformes e compostos por áreas

sólidas de arranjo difuso. Em ratos Sprague-Dawley, o padrão histológico do TCG se

assemelha ao de outras espécies e, nesses animais, o tumor do tipo sólido é

caracterizado por apresentar ninhos de células uniformes separadas apenas por

vasos sanguíneos (LEWIS, 1987). No nosso estudo o padrão histopatológico foi

caracterizado por apresentar ninhos e cordões de células tumorais em arranjo difuso

principalmente para os tumores do tipo sólido – 87% – sendo essa associação

significativa.

O aspecto angiomatóide nos TCGs sólidos e mistos reflete a presença de

cistos hemorrágicos na massa tumoral. Este mesmo aspecto foi observado em TCG

de camundongos (BEAMER et al, 1985), humanos (KURMAN et al, 1979) e de ratos

Sprague-Dawley (LEWIS, 1987). Cistos hemorrágicos, de vários tamanhos, têm sido

descritos em TCG de gerbil (MECKLEY & ZWICKER, 1979). Em nossa amostragem

esse aspecto foi mais freqüente nos tumores mistos – 88% – sendo essa associação

significativa.
 65

Corpúsculos de Call-Exner são característicos em TCG humanos (KURMAN

et al 1979, CHADHA et al, 1990, COTRAN et al, 2000) e bovinos (JONES et al,

1983), porém em camundongos e ratos não são comuns (ALISON et al, 1987,

ALISON & MORGAN, 1987, LEWIS, 1987). Estudos semelhantes em gerbil, quando

se referem à descrição desses corpúsculos, também relatam que eles não são

comuns, destacando-se mais recentemente o trabalho de GUZMÁN-SILVA et al

(1995a). Nos humanos, quando essas estruturas são evidentes, o diagnóstico do

TCG torna-se consideravelmente mais simples (COTRAN et al, 2000). Em nossa

amostragem esse aspecto foi mais freqüente nos tumores mistos (29%).

Predomínio de células luteinizadas vacuolizadas é descrito em gerbil (BENITZ

& KRAMER, 1965, RINGLER et al, 1972, ROWE et al, 1974). Quanto ao aspecto do

citoplasma, que variou dependendo da intensidade da luteinização das células da

granulosa, nossos dados coincidem com os de IGLESIAS et al (1950), ALISON et al

(1987) e ALISON & MORGAN (1987) quando descrevem os TCG de ratos e

camundongos. Células luteinizadas estavam freqüentemente presentes em todos os

tipos tumorais analisados.

Quanto às mitoses observadas em TCG de gerbil, alguns autores descrevem

que são raras (BENITZ & KRAMER, 1965, VINCENT et al, 1975). Apenas um autor

relata que encontrou muitas figuras mitóticas (MECKLEY & ZWICKER, 1979); já em

ratos são relatadas numerosas mitoses (IGLESIAS et al, 1950). Nós verificamos um

maior número de mitoses nos tumores do tipo misto – 63% – sendo essa associação

significativa, e não encontramos nenhuma nos do tipo incipiente. A taxa de mitose

reflete de forma aproximada a velocidade de crescimento tumoral. O fato de não

 66

termos observado mitoses em tumores incipientes pode ser explicado talvez pelo

crescimento lento no início do desenvolvimento tumoral. Com o avanço do

desenvolvimento este tumor pode passar a se manifestar nos tipos cístico, sólido

e/ou misto – 63% – nos quais verificamos mitoses mais freqüentes e com

associação significativa para o TCG misto. O alto número de mitoses é considerado

um dos critérios para malignidade (ALISON et al, 1987, ALISON & MORGAN, 1987)

e em nossa amostragem todos os TCG mistos foram malignos.

LEWIS (1987) observou em tumores sólidos muitos TCG com áreas

hemorrágicas e necrose apresentando macrófagos com hemossiderina e grânulos

de lipofuscina. Áreas hemorrágicas e necrose foram observadas por IGLESIAS et al

(1950) em cistos de ratos. Em nossa amostragem encontramos necrose em 33% de

tumores do tipo sólido, sendo esta associação significativa. A necrose é considerada

um dos critérios para malignidade (ALISON et al, 1987, ALISON & MORGAN, 1987)

e em nossa amostragem apenas 1 dos tumores sólidos não apresentou

características de malignidade.

A intensidade da associação entre o tipo de tumor e cada característica

histopatológica encontrada neste trabalho, foi moderada para células em arranjo

difuso em TCG sólido e para mitoses e pseudofolículos em TCG misto, forte para

cistos hemorrágicos em TCG misto, e fraca para cistos incipientes em TCG

incipiente e necrose em TCG sólido. Não houve associação entre o tipo de tumor e

ninhos e cordões, células luteinizadas e corpúsculo de Call-Exner.

 67

Há relatos de invasão de TCG em serosa uterina e miométrio de gerbil

(ROWE et al, 1974) e na cápsula ovariana de ratos e camundongos (ALISON et al,

1987). Neste trabalho encontramos invasão no hilo ovariano, fimbrias, ligamento

largo, gordura periovariana e tuba uterina. Considerando o local da invasão e o tipo

tumoral observamos nos tumores incipientes a maior freqüência de invasão do hilo

(71%) e das fimbrias (21%), sendo essas associações significativas. A invasão é

considerada um dos critérios para malignidade (ALISON et al, 1987, ALISON &

MORGAN, 1987). Do total de tumores incipientes 60 – 85% – apresentaram

características de malignidade, invasão e/ou metástase.

Um trabalho relata a ausência de metástase em TCG de gerbil (MECKLEY &

ZWICKER, 1979). LEWIS (1987) observou em ratos Sprague-Dawley metástase em

rim, linfonodos, pulmão e peritôneo. BEAMER et al (1985), observou metástase de

TCG de camundongo em órgãos abdominais como linfonodos, rins, pâncreas, fígado

e diafragma. As metástases abdominais, neste trabalho, foram observadas em

omento, mesentério, linfonodos e gordura abdominal, além de adrenal, fígado,

pâncreas, estômago, gânglio autônomo retroperitoneal e parede abdominal. As

metástases abdominais ocorreram mais freqüentemente em omento (80%),

mesentério (33%), linfonodos (47%) e gordura abdominal (40%) de animais

portadoras de TCG sólido, e todas estas associações foram significativas. Em nossa

amostragem apenas 1 dos tumores sólidos não foi classificado como maligno.

Metástases de TCG em linfonodos para-brônquicos e pulmão têm sido

descritas em gerbil (BENITZ & KRAMER, 1965). No tórax e pescoço verificamos

metástases em linfonodos mediastínicos, pleura, pulmão, linfonodos e gordura

 68

subcutânea. As metástases no tórax e pescoço ocorreram mais freqüentemente em

linfonodo mediastínico (20%), pleura (13%), pulmão (13%) e gordura subcutânea

(13%) de animais portadoras de TCG sólido, e todas estas associações foram

significativas.

Nossos dados concordam com os descritos em gerbil quanto à metástase em

pulmão e linfonodos (BENITZ & KRAMER, 1965); camundongos quanto à metástase

em linfonodos, pâncreas e fígado (BEAMER et al 1985); e ratos quanto à metástase

em pulmão, linfonodos e peritôneo (LEWIS, 1987).

Em roedores os capilares linfáticos drenam a linfa para vasos sucessivamente

maiores e destes para os ductos torácico e linfático direito que desembocam nas

veias do pescoço (HUMMEL, 1975). O mesmo padrão anatômico é descrito para os

humanos (MOORE & DALLEY, 2001). Em humanos, a provável via primária de

disseminação dos tumores ovarianos se inicia com a invasão da cápsula do órgão e

o implante de células tumorais na superfície peritonial. A disseminação intraperitonial

segue o caminho de circulação do líquido peritonial desde a pelve subindo pelo

recesso paracólico em direção ao diafragma. Daí a disseminação continua pela rica

rede de linfáticos diafragmáticos, alcançando por último a via hematogênica. A

proximidade da pelve com o omento e outros órgãos abdominais torna esses locais

sítios freqüentes de implante precoce (GRIFFITHS, 1982). As nossas observações

referentes ao padrão de invasão e metástase do TCG de gerbil apoiam essas

descrições. Nos tumores incipientes observamos invasão prematura do epitélio

germinativo ovariano e dos tecidos adjacentes aos ovários e implante precoce

principalmente no omento. É provável que com a progressão desses tumores

 69

incipientes, ao avançar a idade dos animais, os outros tipos tumorais se

desenvolvam e ocorram as metástases em órgãos distantes a partir dos implantes

no peritôneo. Isto foi verificado principalmente nos TCG sólidos, onde houve

inclusive disseminação para órgãos do tórax e pescoço. A associação entre TCG

sólido e metástases abdominais, bem como torácicas, foi significativa.

Em humanos os tumores ovarianos são classificados pela FIGO (FIG. 1) em 4

estádios de acordo com as seguintes características: no estádio I, o tumor fica

restrito ao ovário, no estádio II o tumor se encontra em um ou ambos ovários com

extensão na pelve, no estádio III o tumor que atinge um ou ambos ovários apresenta

implantes peritoniais fora da pelve e/ou linfonodos retroperitoniais ou inguinais,

metástases superficiais em fígado, ou limitado à pelve com extensão ao omento ou

ao intestino confirmada pela histopatologia, e no estádio IV o tumor que atinge um

ou ambos ovários apresenta metástases à distância com derrame pleural e

metástases no parênquima hepático (MACHADO et al, 2003). Apesar de não existir

estadiamento nos tumores ovarianos em gerbil e outros roedores, em nosso estudo

observamos que nos TCG incipientes, em animais com menos de 2 anos de idade,

já ocorria a invasão do hilo ovariano – 71% – e implante no omento em 26% dos

casos. Estes achados poderiam ser enquadrados como equivalentes,

respectivamente, aos estádios IIc e III dos tumores ovarianos humanos (MACHADO

et al, 2003). Um pequeno percentual dos TCG incipientes e desenvolvidos, da nossa

amostra, já apresentava metástases fora da pelve em diversos órgãos abdominais, o

que corresponderia ao estádio III dos tumores ovarianos humanos (MACHADO et al,

2003). Apenas 3 casos de TCG sólido apresentaram metástase no tórax e pescoço e

 70

seriam, portanto classificados no estádio IV dos tumores ovarianos humanos

(MACHADO et al, 2003).

Sob certas condições patológicas ocorre efusão e acúmulo de líquido seroso

na cavidade peritoneal chamado de ascite. A disseminação de tumor para as

vísceras abdominais causa a exsudação de líquido, dessa forma o líquido ascítico

pode apresentar células neoplásicas (MOORE & DALLEY, 2001). Outra causa de

ascite é decorrente da obstrução de linfáticos diafragmáticos por embolia tumoral

(GRIFFITHS, 1982). Considerando o estadiamento dos tumores ovarianos humanos,

a ocorrência de ascite sem células malignas classifica o tumor em Ia e com células

malignas em Ic (MACHADO et al, 2003). Em nossa amostra foi observado apenas 1

caso com formação de ascite hemorrágica em gerbil virgem, com mais de 3 anos,

portadora de TCG misto no OD e cístico no OE, que já apresentava metástase fora

da pelve, o que corresponderia ao estádio III (MACHADO et al, 2003). Portanto, esta

característica – ascite – não poderia ser considerada padrão de comparação entre

os tumores de roedores e humanos.

Segundo ALISON & MORGAN (1987), estudos da carcinogênese em

roedores estão sendo usados como modelo apropriado para a resposta potencial

humana e esses estudos contribuiriam para formar um sistema comum na

classificação médica e veterinária dando condição para estudos filogenéticos

comparativos, bem como para o entendimento das vias de regulação e sinalização

na proliferação das células da granulosa (FULLER & CHU, 2004).

 71

Os TCG tanto são regulados como podem sintetizar hormônios, então, parece

lógico pensar que mudanças moleculares que envolvem a via endócrina conduzam à

transformação neoplásica em células da granulosa (FULLER & CHU, 2004). TCG

humano tem apresentado imunorreatividade mais constante para estradiol e

progesterona, já os resultados relacionados à testosterona têm sido variáveis

(KURMAN et al 1979, CHADHA et al, 1990, MULVANY & RILEY, 1997). A

intensidade da marcação tende a ser mais fraca na identificação de progesterona e

testosterona (KURMAN et al 1979, CHADHA et al, 1990). Em uma série de TCG

humanos, a pesquisa de receptor de estradiol foi negativa, ao passo que a de

receptor para progesterona foi positiva nos mesmos tumores (MULVANY & RILEY,

1997). Em humanos, a produção de testosterona pelas células do TCG é associada

a diversos graus de virilização (KURMAN et al 1979, CHADHA et al, 1990). SZÉCSI

et al (2004) observou altas taxas hormonais, inclusive da testosterona sérica, em

uma jovem portadora de tumor ovariano virilizante.

TENNENT et al (1993) estudando TCG espontâneo e induzido com DHEA em

camundongos de varias linhagens, verificou que após a administração de

testosterona ocorria aumento da tumorigênese na linhagem que desenvolve TCG

espontâneo, porém o mesmo não acontecia na linhagem dependente de DHEA.

Neste mesmo trabalho, nos animais tratados com testosterona, foi observado

apenas aumento dos níveis séricos de testosterona, mas não de DHEA em ambas

linhagens, e nos animais tratados com DHEA houve aumento do DHEA e da

testosterona no soro de ambas linhagens. O autor comenta que duas conclusões

podem ser tiradas: as diferenças na susceptibilidade à indução de TCG nas duas

linhagens não podem ser explicadas apenas pelas diferenças no padrão do

 72

metabolismo dos esteróides detectada no soro, e a testosterona não exerce ação na

indução de TCG através do aumento dos níveis de DHEA. Além disso, o autor

levanta a hipótese da participação de um segundo gene – Sot – na indução de TCG

por testosterona. GUZMÁN-SILVA et al (1995b) analisou a dosagem de testosterona

sérica em gerbil, pela técnica de radioimunoensaio de fase sólida, e encontrou em

fêmeas sem TCG o valor médio de 0,13ng/ml e em machos normais 0,82ng/ml. Os

valores encontrados nos machos se assemelham com os achados neste trabalho, no

grupo de TCG incipiente – 0,97ng/ml – entretanto, nos TCG desenvolvidos o valor

médio – 3,57ng/ml – foi significativamente mais elevado. Segundo SCHREIBER et al

(1984) os andrógenos em combinação com o FSH atuam sinergisticamente na via

metabólica de lipoproteínas em células da granulosa, e poderia se especular se esse

mesmo sinergismo não participaria da regulação da proliferação nessas células e

tendo então alguma contribuição na tumorigênese.

O alto grau de pleomorfismo é considerado um dos critérios para malignidade

(ALISON et al, 1987, ALISON & MORGAN, 1987). Pela análise morfométrica

analisamos 5 parâmetros que serviriam como indicativo objetivo do pleomorfismo

nuclear. Nossos dados referentes à área nuclear, perímetro nuclear, FR e FFN não

foram significativos, porém em humanos, YIN & GU (2002) obtiveram resultados

significativos para os mesmos parâmetros. A única característica morfométrica que

se apresentou estatisticamente significativa foi o FE, demonstrando a forma mais

elíptica nos núcleos de TCG incipiente quando comparado a TCG sólido. Estudos

complementares seriam necessários para avaliar o papel do pleomorfismo nuclear,

no TCG de gerbil, como característica histopatológica relevante na predição do

comportamento biológico de um determinado tipo de tumor.

 73

9 CONCLUSÕES

1. O TCG de gerbil começa a se desenvolver em animais, principalmente virgens,

com menos de 2 anos de idade, na forma incipiente – microscópica – bilateral e

medindo menos de 9mm, e à medida que o animal se torna mais velho, os

tumores passam a manifestar-se macroscopicamente sob as forma sólida, cística

ou mista.

2. Os achados histopatológicos se assemelham aos TCG observados em roedores

e humanos.

3. O pleomorfismo nuclear não é uma característica marcante dos TCG de gerbil.

4. A invasão local ocorre de forma precoce em TCG incipientes e a disseminação

inicial do tumor começa na cavidade peritonial, acometendo órgãos abdominais,

e, tardiamente, os órgãos torácicos por vias linfática e sangüínea.

5. O nível de testosterona sérica é elevado em gerbis portadoras de TCG e este

hormônio pode estimular o próprio desenvolvimento tumoral.

6. O comportamento biológico do TCG de gerbil é predominantemente maligno.

7. O TCG de gerbil pode ser usado como modelo animal desta doença.
 74

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