OLÁ!

SEJA BEM-VINDO AO UNIVERSO

DA BIOLOGIA MOLECULAR!

MEU NOME É EDUARDO CASTAN.

E hoje eu não estou dando as boas-vindas
apenas ao Universo (com "u" maiúsculo), a
comunidade da internet. Estou falando do
universo (com "u" minúsculo) que envolve toda a
biologia molecular.

Pois o caderno de hoje é para qualquer pessoa

que queira ou precise utilizar as ferramentas de
biologia molecular de maneira profissional.

Vamos falar dos 5 elementos para ser um

profissional de sucesso por meio da biologia
molecular.
SOBRE O AUTOR

QUEM É EDUARDO
CASTAN?
MESTRE E DOUTOR EM GENÉTICA COM FOCO
EM TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR. POR
VÁRIOS ANOS TRABALHOU COMO
ESPECIALISTA DE PRODUTOS NA MAIOR
EMPRESA DE CIÊNCIAS DA VIDA DO MUNDO,
ATENDENDO CENTENAS DE CLIENTES,
INCLUINDO OS MAIORES LABORATÓRIOS DO
BRASIL E AMÉRICA LATINA.

ATUALMENTE, EDUARDO TEM

COMO MISSÃO AJUDAR AS
PESSOAS QUE PRECISAM
APRENDER (OU APRENDER MAIS)
SOBRE BIOLOGIA MOLECULAR.
POR MEIO DO UNIVERSO DA
BIOLOGIA MOLECULAR, LIVES NO
INSTAGRAM E AULAS NO
YOUTUBE ELE VEM
DEMOCRATIZANDO O
CONHECIMENTO SOBRE ESSAS
TÉCNICAS E OUTROS TEMAS QUE
ORBITAM A BIOLOGIA
MOLECULAR
 Se está lendo este caderno é porque
você tem, pelo menos, curiosidade em
relação à biologia molecular.

Bom, nesse caso eu diria que você já tem

parte do caminho andado para se tornar
um profissional bem sucedido ou mais
bem sucedido, caso você já tenha
iniciado a sua carreira.

E para ser sincero, nem importa muito o

que significa ser bem sucedido nesse
momento para você. Pode ser defender o
mestrado ou o doutorado, pode ser
passar em um concurso, pode ser
BIOLOGIA
conseguir um emprego ou uma
MOLECULAR
promoção, fazer uma prova, dar uma
aula ou apenas se capacitar mesmo.

Não importa. O que vou falar a seguir,

muito provavelmente, te será útil em
alguma medida.

Isso porque a biologia molecular virou

uma daquelas coisas que a gente ouve
falar em festa de fim de ano. Sabe
aqueles comentários do tipo: “ouvi dizer
que esse negócio de bitcoin dá dinheiro”.
Ou como era na época em que prestei
vestibular: “quem faz engenharia não fica
sem emprego”.
Tá, beleza, eu sei que você não vai escutar
da boca da sua tia Marcia, enquanto ela faz
um salpicão de frango, que as ferramentas
de biologia molecular são o futuro.

Mas, para nós que somos do meio, que

estamos fazemos parte desse contexto
específico, fica no ar um pouco desse
sentimento de prosperidade e até de
glamour quando o assunto é, por exemplo,
novas tecnologia de sequenciamento de
DNA ou o poder do CRISPR para a
humanidade.

Essa percepção definitivamente não é vaga.

De fato, a biologia molecular nunca foi tão
aplicada na pesquisa como é aplicada
atualmente e nunca esteve tão presente no
dia-a-dia das pessoas, de qualquer pessoa.

Veja, por exemplo, a técnica de PCR em

tempo que está na boca do povo por conta
da COVD-19.

Então, vamos lá. Deixe-me te mostrar como

você pode utilizar tudo isso ao seu favor.
ÍNDICE

PÁGINA 7 PÁGINA 14 PÁGINA 17

Biologia molecular Como eu vim A teoria dos 5

é o presente e o parar aqui elementos
fututo

PÁGINA 28 PÁGINA 48 PÁGINA 63

PCR, PCR em Sequenciamento

O Clube do DNA
Sanger, NGS e 3ª
tempo real, PCR geração
digital
 EU NÃO SEI QUAL A SUA IDADE, MAS É
PROVÁVEL QUE VOCÊ JÁ TENHO
ESCUTADO ALGO COMO:

“FALAR INGLÊS É UM DIFERENCIAL

PROFISSIONAL”.

ESSA FRASE ERA (TALVEZ SEJA ATÉ

HOJE) REPETIDA POR BOA PARTE DAS
PESSOAS. E, PARA SER SINCERO, EU
CONCORDAVA COM ELA.
ANTIGAMENTE, UMA PESSOA QUE
FALAVA INGLÊS, TINHA UM BELO
DIFERENCIAL COMPETITIVO AO
PARTICIPAR DE UM PROCESSO
SELETIVO EM UMA EMPRESA, POR
BIOLOGIA EXEMPLO.

MOLECULAR PESSOAS ERAM CONTRATADAS

APENAS POR SABEREM FALAR INGLÊS.
ÉO NO ENTANTO, ISSO JÁ NÃO É
PRESENTE O VERDADE HOJE EM DIA. FALAR INGLÊS
DEIXOU DE SER UM DIFERENCIAL
FUTURO COMPETITIVO.

FALAR INGLÊS PASSOU A SER UM PRÉ-

REQUISITO.

HOJE EM DIA, VOCÊ NÃO CONSEGUE

UM EMPREGO POR FALAR INGLÊS.
VOCÊ DEIXA DE CONSEGUIR UM
EMPREGO POR NÃO FALAR.

PARA BOA PARTE DOS PROFISSIONAIS

DA ÁREA DE BIOLÓGICAS, A BIOLOGIA
MOLECULAR É O INGLÊS DE ALGUNS
ANOS ATRÁS.
A biologia molecular está deixando de
ser um diferencial profissional.
Está passando a ser um pré-requisito.
OLHE AO SEU REDOR
Perceba como muitos aspectos do seu
dia-a-dia e do dia-a-dia das pessoas
estão relacionados direta ou
indiretamente com ferramentas capazes
de analisar DNA, RNA e proteína.
Só a porção relacionada ao agronegócio,
por exemplo, já representa boa parte de
nossas vidas. Vai desde o que nós
comemos e vestimos até a produção de
cosméticos e fármacos.
Boa parte dos organismos produzidos
(senão todos) – desde a vaquinha leiteira
até o algodão fofinho – passaram e
seguem passando por processos de
melhoramento genético. Processos esses
que são fartamente assistido por
ferramentas de biologia molecular.
SEGURANÇA
Até caminhar na rua é mais
seguro por causa da biologia
molecular. Pense em todos os
criminosos justamente
condenados porque foram
identificados por meio de um
teste de DNA.
SAÚDE
A área da saúde é outra
amplamente impactada por
biomol. Quantos exames e testes
diagnósticos são realizados por
PCR, qPCR, sequenciamento, ELISA
etc.?
Certamente, há milhares de
pessoas habitando todos os
cantos do planeta porque um dia
já foram um embrião que teve seu
genoma analisado antes de ser
implantado no útero de uma
futura mamãe.
VOU PARAR POR AQUI
Mas poderia continuar
escrevendo páginas e páginas
sobre vacinas, medicamentos,
terapias gênicas, tratamento de
esgoto, tratamento de câncer,
testes de ancestralidade,
identificação de pré-disposição
a doenças, alimentos mais
saudáveis, alimentos livres de
patógenos, caracterização de
síndromes...
 Um ciclo muito interessante

A tendência é a expansão e popularização

ainda maior do uso dessas ferramentas.

Entramos em um ciclo muito favorável para que

tal tendência se acelere e dure muitos anos.

Se a análise de ácidos nucleicos e proteínas

trás tantas vantagens:

MAIS ACESSÍVEL MAIS BARATO MAIS FÁCIL

Quanto mais Com o aumento A competição gera
inovação. Assim,
laboratórios da oferta os
surgem novas
utilizam biomol, preços tendem a tecnologia e novos
mais diminuir. modelos de negócio
equipamentos e que tendem a facilitar
a rotina do
reagentes são
profissional. Ex.
vendidos e ensaios prontos,
distribuídos pelo mastermix, kits,
país. automatizações. Ao
ficar mas prático e
Consequentemen fácil de utilizar,
te, surgem novos aumenta-se a
fornecedores e o probabilidade de um
laboratório
mercado segue
implementar biologia
se aquecendo. molecular em sua
rotina.
Beleza. Já deu para entender que biologia
molecular está aí e veio para ficar.

Mas por que muitas vezes essas

ferramentas parecem ser tão difíceis de
utilizar, parecem que estão distantes da
sua realidade, que são para outros
profissionais e não para você?

Porque, de fato, pode ser muito difícil

aprender biologia molecular com
qualidade durante a graduação ou pós-
graduação.

Entre outros motivos, isso ocorre porque o

nosso sistema de ensino e o ambiente
acadêmico não favorecem o aprendizado
adequado das técnicas de manipulação
e análise de ácidos nucleicos.
TEM EXCEÇÃO
PARA ISSO QUE
ESCREVI NA VOCÊ ACHA QUE O QUE APRENDEU
PÁGINA sobre biologia molecular durante a graduação
não foi o suficiente para você trabalhar com isso.
ANTERIOR?
CLARO QUE TEM. VOCÊ JÁ QUIS ESTUDAR
o assunto, mas teve a sensação de não saber por
onde começar.
MAS EU ESTOU
ME REFERINDO VOCÊ QUE JÁ SABE UM POUCO
AO BRASILZÃO te parece que os conceitos estão todos meio

DE MANEIRA misturados em sua cabeça, algumas coisas ainda

não são claras e continuam meio nebulosas.
GERAL.
NO LABORATÓRIO
REFLITA VOCÊ já se sentiu extremamente inseguro

MESMO E ME
DIGA SE VOCÊ SE VOCÊ DEPENDE DE ALGUÉM PARA
APRENDER
VÊ OU JÁ SE VIU Um orientador ocupado demais, um colega que

EM ALGUMA não gosta muito de você, um pós-graduando que

também não sabe direito o que está fazendo etc.
DESSAS
SITUAÇÕES:

Pois se você se enxergou em alguma dessas

situações, saiba que essa é a regra para a
grande maioria das pessoas.

E que, muito provavelmente, a culpa não é sua.

O PONTO
CENTRAL DESSE
CADERNO

Os cinco elementos que você

deve considerar para romper
as barreiras que dificultam o
seu aprendizado sobre
biologia molecular.

Te garanto que se você

colocar em prática o que vou
te amostrar a seguir, você
obterá sucesso ao longo de
sua jornada profissional.

Antes de eu te falar sobre

esses elementos, deixe-me
te contar como eu cheguei
nesse método (se é que
podemos chamar isso de
método).
Fiz a graduação – nunca fui um
aluno excelente –, depois fiz o
mestrado e o doutorado – com
muitas dificuldades – até que eu
consegui um excelente emprego em
uma empresa gigante da área de
biologia molecular.

Aí as coisas mudaram um pouco

para mim, porque eu atuei por
diversos anos como assessor
científico dessa empresa, na qual eu
atendia dezenas (talvez centenas)
de laboratórios espalhados pelo
Brasil – de todos os tipos e
tamanhos.

Acabou que nesse período eu fui

muito exposto a diferentes técnicas EU NÃO SOU NADA
de biomol, diferentes situações, DIFERENTE DE VOCÊ
condições, necessidades, tipos de
amostra, nível de conhecimento dos
NESSE PROCESSO
meus clientes e assim vai. DE APRENDER
BIOLOGIA
E você acha que era fácil treinar e
resolver os problemas desses
MOLECULAR
clientes?

Era nada! Cada cliente, cada

resolução de problema, cada
treinamento era uma situação
diferente, um desafio. Alguma coisa
que eu não dominava e precisava
dominar.

Todo atendimento era a mesma

coisa. Estudar, estudar, atender o
cliente, ficar com um monte de
dúvidas sobre o caso dele, estudar
mais... até a situação estar
resolvida.

E assim foi por anos.

 Essa rotina, apesar de desgastante,
acabou mudando minha vida para
sempre. Permitindo-me o
desenvolvimento profissional dentro
da empresa, onde trabalhei por mais
de 7 anos e, mais recentemente,
também me permitindo a criação do
Universo da Biologia Molecular.

Pois bem, acontece que ao longo

desse processo, ao longo de anos
fazendo a mesma coisa, eu acabei
desenvolvendo uma metodologia

ROTINA para aprender e ensinar biologia

molecular.
PESADA,
RECOMPENSA Uma metodologia que por muitos
anos não estava formalmente
TAMBÉM estruturada, que eu fazia apenas por
intuição e que a utilizava somente
para mim.

Acontece que recentemente eu

estruturei essa metodologia. Eu criei
uma estrutura para que qualquer
pessoa possa aprender
adequadamente biologia molecular.

Essa estrutura está dividida em 5

partes que interagem entre si e que
eu estou simbolizando com a teoria
dos 5 elementos.
 ÁGUA

METAL

TERRA

FOGO

MADEIRA
 A teoria dos 5 elementos é uma
filosofia chinesa que afirma que
água, fogo, madeira, terra e metal
são os 5 elementos que formam o
mundo.

Além disso, esses elementos

interagem entre sei e se controlam
mutuamente.
POR UM ACASO, EU
ME DEPAREI COM
ESSA FILOSOFIA
LOGO DEPOIS DE
ESTRUTURAR O
MÉTODO QUE EU
UTILIZO PARA
APRENDER
BIOLOGIA
MOLECULAR E
PERCEBI QUE ELA
SIMBOLIZAVA
MUITO BEM COMO
DEVEMOS
PROCEDER PARA
APRENDER A ARTE
DE MANIPULAR
ÁCIDOS
NUCLEICOS.
 OS 5 ELEMENTOS DA CAPACITAÇÃO
EM BIOLOGIA MOLECULAR

BASE
NÃO É SÓ SOBRE

ESTRUTURA
BIOMOL

COMUNIDADE DISCIPLINA
Existe uma hierarquia de
conhecimentos e conceitos
que devem ser dominados.

O aprendizado não será

satisfatório se um conceito
intermediário for colocado na
frente de um conceito básico.

É muito difícil aprender como

resolver uma equação de
segundo grau se ainda não
foi ensinado soma e
subtração.

É muito difícil fazer uma PCR

adequadamente se não há
conhecimento sobre a
BASE
estrutura do DNA.

Esse elemento favorece um

pensamento crítico no
laboratório, facilitando a
resolução de problemas e
prática laboratorial livre de
vícios e medos.

Portanto: siga uma sequência

lógica de aprendizado. Ao
deparar com um conceito
desconhecido, pare e
aprenda esse conceito antes
de continuar a fazer ou
estudar o que estava fazendo
ou estudando.
Existe um mundo de
informação sobre
biologia molecular
disponível
gratuitamente.

Porém, essa informação

está decentralizada e
desorganizada.
ESTRU
Encontrar algumas
poucas fontes confiáveis TURA
de informação e
estabelecer um
esquema de estudo, de
fazer anotações e de
tirar dúvidas, é ponto
chave para o sucesso.

Portanto: crie uma

estrutura de
aprendizado, utilizando
poucas fontes confiáveis
de informação por vez.
É aqui que cai a maioria
das pessoas.

O desenvolvimento do
conhecimento e o que te
fará ser um profissional
diferenciado está nesse
elemento.

Não se trata de sentar a

bunda na cadeira e estudar
por horas todos os dias.

Por quê? Por que isso

simplesmente não
funciona. Ninguém aguenta
DISCI
fazer isso por muito tempo.
É chato.
PLINA
O que eu te proponho é: de
60 a 90 minutos de estudo
por semana. Faça isso por
anos e você será imbatível.
O desenvolvimento vem na
consistência e no longo
prazo.

Portanto: estude um
pouquinho por semana,
toda semana.
Já ouviu falar que a
combinação de diferentes
mentes tem poder maior do
que a soma dessas mentes
de forma individual? É o
famoso 1 + 1 = 3.

Ter com quem conversar,

com quem tirar dúvidas ou,
eventualmente, até criar
um grupo de estudos pode
fazer toda a diferença na
evolução do aprendizado e
da capacitação técnica.

Mas não pode ser com COMUNI

DADE
qualquer pessoa. Tem que
ser com alguém que você
goste e confie. Caso
contrário, não seria
diferente do que você vive
na faculdade ou na pós
graduação.

Sugestão: crie um pequeno

grupo de estudos e aplique
o elemento anterior. Faça
esse momento ser um
momento prazeroso. Leve
um vinho e petiscos para o
estudo. Associe esse
encontro com coisas boas.
A vida é multidisciplinar. Suas
competência também devem
ser.

Nós, pessoas de formação

técnica, temos a tendência de
fixar nosso aprendizado em um
único tema.

O problema é que, ao fazer isso,

nós nos limitamos a aprender
apenas um punhado de coisas
que estão dentro de nossa bolha.

O que eu quero dizer é que você

não pode deixar de aprender

NÃO É
pelo menos o básico de outras
áreas.

Eu, por exemplo, me arrependo SÓ

SOBRE
amargamente de não ter
aprendido a investir meu
dinheiro quando eu ainda tinha
20 anos.
BIOMOL
Ou seja, abra sua mente e seu
coração para conhecimentos
além daquilo que nos é óbvio.

Eu te garanto que aprender um

pouco sobre finanças pessoais,
gestão de pessoas, marketing
pessoal, negócios, vendas etc. te
fará uma profissional melhor e
uma pessoa mais feliz.

Sugestão: busque no YouTube ou

no Instagram perfis ou canais de
pessoas que falem de outros
temas além de temas
relacionados a biologia.
PARA CLAREAR VAMOS FALAR MAIS
TECNICAMENTE AGORA

Vou falar sobre 6 técnicas de

biologia molecular. Note
como todas elas tem algum
tipo de ligação entre si.

Vamos começar com a mãe

das técnicas de biologia
molecular – a PCR.

Mas antes de começarmos,

veja uma perspectiva sobre
o que são as técnicas de
biologia molecular.
PENSE NO TERMÔMETRO

O termômetro é uma ferramenta

que nos permite traduzir uma
informação.

Por exemplo, se você encostar a

mão na sua mesa agora, não
conseguirá dizer qual é a
temperatura exata dela.

Até conseguiria dizer se ela está

mais fria ou mais quente que sua
mão, mas não conseguiria dizer a
temperatura exata.

Já o termômetro “traduz” a
informação não compreensível
(temperatura) em informação
compreensível (valor numérico).

A maioria das técnicas de biomol

são como o termômetro. Nos
permitem traduzir uma
informação biológica não
compreensível em informação
compreensível.
No caso do termômetro, o processo de tradução se
dá quando, por exemplo, o mercúrio se dilata e se
move pela régua numérica, nos informando a
temperatura da mesa.

Já o processo de tradução na biologia molecular

se dá por diferentes maneiras.

Pode ser, por exemplo, por geração de luz

(fluorescência), variação de pH na reação, reações
químicas que mudam a cor de uma solução etc.

Com esse raciocínio inicial podemos falar de PCR.

PCR

A reação em cadeia da
polimerase ou,
simplesmente, PCR é uma
técnica que funciona de
forma muito parecida com
o Ctrl + C e Ctrl + V que
estamos tão acostumados.

A PCR permite que um

fragmento alvo de DNA
seja copiado ou, como se
diz no contexto de biologia
molecular, seja amplificado
de maneira exponencial e
específica.
 AMPLIFICAÇÃO EXPONENCIAL

A PCR É UMA REAÇÃO QUE ACONTECE EM

CADEIA OU EM CICLOS. ISSO PERMITE QUE O
FRAGMENTO ALVO QUE ESTÁ SENDO COPIADO
TENHA A SUA QUANTIDADE AUMENTADA
EXPONENCIALMENTE.

OU SEJA, EM UM DETERMINADO CICLO DA

REAÇÃO, 1 FRAGMENTO SERVE COMO
SUBSTRATO PARA A PRODUÇÃO DE 2
FRAGMENTOS. NO CICLO SEGUINTE, ESSES 2
NOVOS FRAGMENTOS SERVEM COMO
SUBSTRATO PARA A PRODUÇÃO DE MAIS 2
FRAGMENTOS, TOTALIZANDO 4.

AGORA, OS 4 FRAGMENTOS GERAM 8. DEPOIS

OS 8 GERARÃO 16, OS 16 GERARÃO 32 E
ASSIM POR DIANTE.

ATÉ QUE NO FINAL DO PROCESSO HÁ BILHÕES

DE CÓPIAS DAQUELE FRAGMENTO ALVO
ESPECÍFICO.
AMPLIFICAÇÃO ESPECÍFICA

ALÉM DE EXPONENCIAL, A PCR TAMBÉM

É MUITO ESPECÍFICA.

ISSO SIGNIFICA QUE É POSSÍVEL, POR

EXEMPLO, AMPLIFICAR UM FRAGMENTO
DE 200 PARES DE BASES MESMO QUE ELE
SEJA PARTE DE UM GENOMA DE 3
BILHÕES DE PARES DE BASES.

ESSA CARACTERÍSTICA É MUITO

INTERESSANTE PORQUE, GERALMENTE, O
ALVO DE ANÁLISE OU ESTUDO É ALGO
PONTUAL, COMO, POR EXEMPLO, UM OU
POUCOS GENES, MUTAÇÕES, REGIÕES
GENÔMICAS ETC.
Agora veja como é possível que

esse processo aconteça.

Fazer uma PCR não é muito

diferente de fazer um bolo.

– reagentes
Há ingredientes

Há modo de preparo – protocolo

Há um chef – você
 Modo de preparo

Receita de PCR
•Misture todos os ingredientes
em um tubo

Ingredientes
•Leve ao forno a 95 C por 1
minuto (denaturação)

•Baixe a temperatura do forno

•DNA (servirá como para 55 C por 2 minutos

(anelamento)
molde)

•Nucleotídeos •Aumente a temperatura para

•DNA polimerase
72 C por 3 minutos (extensão)

•Repita os passos anteriores 30

•Primers vezes

•Íon bivalente (MgCl2+) •Conservar no freezer

•Solução tampão
DENATURAÇÃO

95 °C

Durante o passo da denaturação, a fita

dupla da molécula de DNA se desfaz,
formando duas fitas simples.

Isso ocorre por meio do rompimento das

pontes de hidrogênio – que mantinham
as duas fitas unidas – causado pela alta
temperatura.
ANELAMENTO

55 a 60 °C

O passo seguinte é o anelamento dos

primers - os responsáveis pela
especificidade da PCR.

Os primers são pequenos fragmentos de

DNA fita simples, artificialmente sintetizados
com sequências complementares às
extremidades do fragmento alvo.

Cada primer precisa de uma temperatura

adequada para que ele se anele
especificamente ao DNA alvo.
EXTENSÃO
72 °C
Por último vem a formação das novas fitas.

Depois que os primers se anelaram de maneira

específica às extremidades do fragmento a ser
copiado, uma enzima chamada DNA polimerase, que
tem a capacidade de sintetizar DNA, se une ao primer +
DNA e começa a ligar nucleotídeos uns aos outros, de
maneira complementar ao fragmento alvo.

No final desse processo, cada primer associado ao DNA

serviu como estrutura inicial para a produção de duas
novas cópias do fragmento alvo.

Em outras palavras, um fragmento serviu como molde

para a produção de duas cópias idênticas desse
mesmo fragmento.
Esses 3 passos – denaturação, anelamento dos primers
e extensão (formação das novas fitas) formam um
ciclo da PCR.

Agora esse ciclo pode se repetir e todo o processo

explicado anteriormente ocorrerá uma vez mais.

A diferença é que agora, no início do segundo ciclo,

existem 2 cópias do fragmento alvo.

Isso significa que cada uma dessas cópias será

utilizada como substrato para a produção de mais 2
novas cópias do alvo, totalizando 4 cópias ao final do
ciclo.

Um terceiro ciclo poderá ser

realizado. Agora, as 4 cópias
do alvo serão copiadas,
gerando mais 4.

No quarto ciclo, 4 fragmentos

gerarão 8 e assim por diante.

O número de ciclos pode

variar um pouco. No geral,
são realizados de 30 a 50
ciclos de PCR.
A ciclagem da temperatura ou a termociclagem
é realizada por um equipamento específico
chamado termociclador.
No final de uma PCR, teoricamente, haverá bilhões de
cópias do fragmento alvo.

Eu digo teoricamente porque, apenas olhando para

um tubo pós PCR, não é possível dizer se a reação
funcionou ou não.

No entanto, existem moléculas que emitem

fluorescência e que, quando associadas a DNA e/ou
RNA, passam a emitir tal fluorescência com muito
mais intensidade.

Ou seja, para saber se a PCR funcionou, basta

adicionar um pouco desses agentes fluorescentes no
tubo contendo o produto da PCR.

Se houver aumento da fluorescência, significa que há

grande quantidade de DNA ali dentro.

É nesse exato momento que o processo de tradução

está acontecendo. É aqui que a informação biológica
está sendo traduzida em informação compreensível -
nesse caso, luz.

Mas ainda resta uma questão. O que me garante que

os fragmentos de DNA produzidos ao longo da PCR
são, de fato, cópias do fragmento alvo? Ou seja, o
que me garante que aquela luz gerada é proveniente
da amplificação do alvo e não de algum outro
fragmento? Por exemplo, amplificação de DNA
contaminante.
 Para responder a essa
pergunta, pode-se lançar
mão de outra técnica.

A ELETROFORESE
 ELETROFORESE

Técnica capaz de separar fragmentos

de DNA por meio de seu peso
molecular.

Durante a eletroforese o fragmento de

DNA a ser analisado (ex. alvo da PCR)
é submetido ao um processo de
migração através da malha de um gel
– gel esse que parece uma gelatina
caseira sem sabor.

O padrão de migração do fragmento

de DNA através dessa malha é
dependente de seu tamanho, ou seja,
da quantidade de pares de bases
(peso molecular).

Portanto, se o produto da PCR tem

tamanho conhecido, é possível
determinar o seu padrão de migração
no gel ao longo da eletroforese.

Dessa maneira há uma garantia extra

de que o produto da PCR represente,
de fato, o fragmento alvo.
A PCR seguida de eletroforese é muito
útil e continua sendo largamente
utilizada por laboratórios ao redor do
mundo.

Porém, existe uma maneira de deixar

esse processo mais prático.

Te pergunto: por que não colocar o

agente fluorescente misturado com os
outros ingredientes antes da PCR
acontecer? Assim, seria possível
verificar o aumento da intensidade da
fluorescência ao longo dos cliclos da
PCR.

Pois bem, alguém um dia fez isso e

colocou uma câmera capaz de
detectar o aumento da fluorescência
em tempo real ao longo da reação,
toda cada vez que novas cópias do
alvo eram formadas durante os ciclos.

Assim surgiu a PCR em tempo real.

A PCR em tempo real é uma variação da técnica de
PCR que permite a detecção em tempo real da
amplificação do fragmento alvo ao longo da
reação.

O fato de tal detecção acontecer em tempo real,

proporcionou não somente muita praticidade, mas
também o surgimento de novas aplicações, como
por exemplo, quantificação da expressão de genes
e quantificação de patógenos.
MAS NA PCR EM TEMPO
REAL, ASSIM COMO EM
QUALQUER TÉCNICA,
EXISTE UM LIMITE NO
QUAL É POSSÍVEL
DETECTAR E
QUANTIFICAR A
PRESENÇA DO ALVO.

POR EXEMPLO, SE UM
ALVO É MUITO RARO EM
UMA AMOSTRA (POR
EXEMPLO, UM GENE
POUCO EXPRESSO)
EXISTE A POSSIBILIDADE
DA PCR EM TEMPO REAL
NÃO SER UMA TÉCNICA
SENSÍVEL O SUFICIENTE
A PONTO DE
QUANTIFICAR E/OU
DETECTAR ESSE ALVO.

TALVEZ SEJA
EXATAMENTE POR
NECESSIDADE DE
QUANTIFICAR UM ALVO
RARO QUE FOI
DESENVOLVIDA UMA
OUTRA TÉCNICA, UMA
VARIAÇÃO DA PCR EM
TEMPO REAL.
 Então imagine a situação comentada
anteriormente, um fragmento que está
presente em quantidade muito pequena
em uma reação de PCR em tempo real.

Se a reação fosse realizada

normalmente, a fluorescência produzida
por este fragmento ao longo dos ciclos
poderia não ser suficientemente forte
para que ele fosse detectado ou
quantificado.

Agora, imagine que essa mesma reação

fosse particionada ou dividida em
milhares ou milhões de pequenas
reações, onde toda porção possuísse
todos os ingredientes da PCR em tempo
real, mas apenas algumas porções
possuíssem o fragmento alvo.
VERÍAMOS ALGO MAIS
OU MENOS ASSIM AO
FINAL DA PCR
Algumas porções gerando
fluorescência e outras não. Ou seja,
porções positivas (com o alvo
presente) e porções negativas (com o
alvo ausente).

Interessantemente, ao considerar uma

distribuição chamada distribuição de
Poisson, é possível calcular a
quantidade do alvo originalmente
presente na amostra (ou na reação
ainda não particionada).

Isso porque a quantidade de porções

positivas é diretamente proporcional a
quantidade do alvo na amostra.

Essa técnica é chamada de PCR

digital. Ela, assim como a PCR em
tempo real, precisa de equipamentos
específicos para ser realizada.
NOTE COMO HÁ REALAÇÃO ENTRE
AS 3 TÉCNICAS

TER A BASE DO CONHECIMENTO SOBRE A PCR É

FUNDAMENTAL PARA O ENTENDIMENTO, TANTO
DA PCR EM TEMPO REAL (QPCR), COMO DA PCR
DIGITAL (DPCR).

AGORA VAMOS ÀS TÉCNICAS DE

SEQUENCIAMENTO.
 MAIS ESPECIFICAMENTE NA TERCEIRA
FASE DA REAÇÃO, QUANDO A DNA
POLIMERASE FORMA A NOVA FITA DE
DNA POR INCORPORAR
NUCLEOTÍDEOS DE FORMA
COMPLEMENTAR À FITA MOLDE.
SEMPRE A COM T E C COM G.

AGORA PENSE NESSE PROCESSO SÓ

PENSE NA PCR

QUE, ALÉM DE SE UTILIZAR OS

NUCLEOTÍDEOS “NORMAIS”, TAMBÉM
SÃO UTILIZADOS NUCLEOTÍDEOS
MODIFICADOS.

ESSES NUCLEOTÍDEOS MODIFICADOS

TÊM A CAPACIDADE DE INTERROMPER
O FUNCIONAMENTO DA DNA
POLIMERASE TODA VEZ QUE UM
DELES É INCORPORADO AO
FRAGMENTO ALVO.
Ao final dessa reação haveriam fragmentos de
vários tamanhos. Fragmentos pequenininhos
gerados por causa da incorporação de um
nucleotídeo modificado logo no início da extensão.
Fragmentos grandes gerados por causa da
incorporação de um nucleotídeo modificado
somente no final da extensão. E fragmentos de
tamanhos intermediários por causa da
incorporação de nucleotídeos modificados em
diferentes momentos da extensão.
ESSE NEGÓCIO FICA
INTERESSANTE

Se 4 reações (como a que mencionei na

página anterior) idênticas fossem realizadas
em tubos separados.

E em cada tubo fosse colocado apenas um

tipo de nucleotídeo modificado. Em uma das
reações haveriam apenas adeninas
modificadas, em outra apenas timinas
modificadas, em outra apenas citosinas e em
outra apenas guaninas modificadas.

Fica interessante porque, ao final da reação,

saberíamos exatamente qual foi o último
nucleotídeo incorporado.

Por exemplo, na reação com adeninas

modificadas, necessariamente, a extremidade
“final” de todos os fragmentos teria um adenina
incorporada. Na reação com timinas
modificadas, todos os fragmentos produzidos
terminariam em timina. E assim também seria
para as outras duas reações.

Veja o tipo de informação que é possível de se

obter quando visualizamos o resultado das
quatro reações em um gel de eletroforese.
Assim foi desenvolvida a técnica
de sequenciamento Sanger há
várias décadas.

Hoje, no entanto, apesar do

raciocínio ser exatamente o
mesmo, o sequenciamento
Sanger é realizado por
nucleotídeos modificados
associados a fluoróforos.

No qual, cada nucleotídeo

modificado emite um
comprimento específico de luz.
Ou seja, cada nucleotídeo tem
uma cor específica.

Além disso, o processo não é

mais realizado em um gelzão
como mostrei anteriormente. A
eletroforese ocorre em uma
estrutura muito reduzida, um
pouco mais espessa que um fio
de cabelo.
 A análise de DNA por
sequenciamento Sanger pode
ser comparada a uma peça de
um quebra-cabeça gigante.

No qual o quebra-cabeça é o
genoma de um organismo e
uma de suas peças é, por
exemplo, o pedaço de um gene
sendo sequenciado por Sanger.

Nesse processo, a peça do

quebra-cabeça em questão é
separada das outras peças
para ser analisada
individualmente.
 Acontece que ao longo
das últimas décadas
as tecnologias de
manipulação e análise
de ácidos nucleicos
foram evoluindo e
ficando cada vez mais
baratas.

E mais recentemente (não tão

recentemente assim) foi desenvolvida uma
maneira de se analisar o quebra-cabeça
inteirinho.

Só que para isso, é necessário desmontá-lo

todo e analisar peça por peça
individualmente, para depois remonta-lo.

Ou seja, é possível sequenciar o genoma

completo de um organismo complexo, se
esse for o objetivo. Mas para isso é preciso
fragmenta-lo todo em pedaços muito
pequenos (cerca de 200 a 400 pares de
bases), sequenciar cada pedacinho
individualmente e ao mesmo tempo, para
depois remontar o genoma
completamente, juntando um pedacinho
no outro.
Essa é a ideia central do sequenciamento
de nova geração (NGS),
independentemente da tecnologia
utilizada para realizar o sequenciamento –
ou independentemente de como ocorre a
tradução da informação biológica em
informação compreensível.

A maneira como o sequenciamento ocorre

em cada tecnologia varia, mas, na maioria
dos casos, o processo é muito parecido
(mais uma vez) com a fase de extensão da
PCR.

Em algumas tecnologias o sequenciamento

acontece quando um nucleotídeo
modificado e associado a um fluoróforo é
incorporado na fita molde do alvo a ser
sequenciado, emitindo luz de cor
específica. Apesar de parecer com o
sequenciamento Sanger, o processo todo é
bem diferente.

Em outras, a incorporação de um
nucleotídeo específico altera o pH da
reação. Essa alteração é computada e
traduzida em dados analisáveis.
Quando se trata de NGS, além da tecnologia diretamente
relacionada a biologia molecular, ainda há todo o poder
computacional necessário para que bilhões de nucleotídeos, de
milhões de fragmentos de DNA, sejam sequenciados (todos) ao
mesmo tempo.
COMPLEXO,
DEMORADO MAS, SE VOCÊ PARAR PARA
E CARO PENSAR UM POUCO, AINDA
QUE NÃO TENHA
CONHECIMENTO SOBRE O
TEMA, PODERÁ PERCEBER
QUE O FLUXO DE
TRABALHO ENVOLVENDO
NGS PODE SER MUITO
COMPLEXO, DEMORADO E
CARO.

AFINAL, DESMONTAR UM
QUEBRA-CABEÇA
GIGANTESCO, ANALISAR
SUAS PECINHAS
INDIVIDUALMENTE E DEPOIS
REMONTA-LO TODO, NÃO
PODE SER SER NADA FÁCIL.
É AÍ QUE ENTRAMOS NA
TERCEIRA GERAÇÃO DE
SEQUENCIAMENTO DE DNA.

TECNOLOGIAS QUE PERMITEM

ANALISAR QUEBRA-CABEÇAS SEM
A NECESSIDADE DE DESMONTA-LO
OU DESMONTANDO APENAS
ALGUMAS PARTES.
O sequenciamento de terceira geração acontece em um
ambiente microscópico, o qual está dividido em duas porções.

Essas duas poções estão quase completamente isoladas por

uma membrana.

Não estão 100% isoladas porque existe poro que atravessa a

membrana, fazendo a comunicação entre os dois lados.

Nesse micro ambiente nós temos íons, o fragmento de DNA a ser

sequenciado, a membrana e seu poro, um polo negativo em uma
das porções e um polo positivo na outra porção.
Ao gerarmos corrente elétrica nesse ambiente, ocorrerá, através do
poro da membrana, uma troca de íons entre as duas porções.

Ao mesmo tempo, o DNA estando na porção do polo negativo

tenderá a migrar (também através do poro da membrana) para a
porção do polo positivo.

Acontece que esse poro é muito estreito e quando a molécula de

DNA o atravessa, ela perturba a troca iônica que estava
acontecendo.

E aqui está o pulo do gato, é aqui que ocorre a tradução da

informação biológica em informação compreensível. A maneira
como a troca iônica é perturbada pela presença da molécula de
DNA dentro do poro está diretamente relacionada à sua sequência
de nucleotídeos.

O perfil da perturbação da troca iônica dentro de um dado poro

indica a sequência de nucleotídeos do DNA alvo.
Esse tipo de sequenciamento é compatível com
fragmentos de milhares de pares de bases de
tamanho, o que é uma grande vantagem ao longo
do processo de análise.

Ele também demanda menos estrutura e é mais

barato que sequenciamento de nova geração.

No entanto, esta é uma tecnologia ainda em

desenvolvimento e a qualidade dos dados ainda é
menor que a qualidade dos dados gerados por
NGS.
 MAS ESSA TÉCNICA QUE É,
ATUALMENTE, O LIMITE DA
TECNOLOGIA DE
SEQUENCIAMENTO DE DNA,
TAMBÉM UTILIZA
ELETROFORESE, QUE, POR SUA
VEZ, É UMA DAS TÉCNICAS
MAIS ANTIGAS DA BIOLOGIA
MOLECULAR.

MAIS UMA VEZ ESTÁ TUDO

NÃO SEI INTERLIGADO.

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