UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

PROJETO DE PESQUISA

CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO CITOTÓXICO DO AZA-PTEROCARPANO LQB

149 E DA AZA-PTEROCARPANOQUINONA LQB 223 SOBRE LINHAGENS DE
CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS

LARISSA DE OLIVEIRA MESQUITA

ORIENTADOR:
PROF. DR. MANOEL ODORICO DE MORAES FILHO

FORTALEZA
2017
 1. RESUMO

Inicialmente, o câncer era considerado como uma doença dos países desenvolvidos. Há
algumas décadas essa situação inverteu-se e, atualmente, a maior parte da incidência global do
câncer é observada em países em desenvolvimento. A Organização Mundial da Saúde estimou
que, no ano 2030, haverá 27 milhões de casos incidentes de câncer. O maior efeito desse
aumento vai incidir em países de baixa e média renda, como o Brasil, onde o câncer tem
conquistado espaço crescente nas agendas políticas de todas as esferas de governo. Ademais,
os quimioterápicos atualmente empregados na prática oncológica são pouco específicos e
propensos à toxicidade sistêmica e ao desenvolvimento de resistência tumoral. A pesquisa de
novos agentes anticâncer é necessária ao enfrentamento dessa doença. Nesse ínterim, o
Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará demonstrou que o
aza-pterocarpano LQB 149 e a aza-pterocarpanoquinona LQB 223 apresentaram atividade
citotóxica significativa contra as linhagens tumorais humanas HL-60 (leucemia promielocítica
aguda), K562 (leucemia mielogênica crônica), HCT-8 (adenocarcinoma colorretal ileocecal),
SF-295 (glioblastoma) e MDA-MB435 (melanoma). Tais moléculas são análogos sintéticos
dos pterocarpanos, produtos naturais derivados de isoflavonóides, encontrados em plantas da
família Fabaceae (leguminosas). Portanto, este projeto visa caracterizar a atividade
antitumoral desses compostos em modelos tumorais derivados de neoplasias diversas, cujos
indicadores epidemiológicos têm se mostrado preocupantes. Experimentos de avaliação de
citotoxicidade, sinalização e padrão de morte celular serão realizados para confirmar o
potencial das LQBs 149 e 223 como protótipos de novos quimioterápicos.

ii
 2. INTRODUÇÃO

2.1. Considerações Gerais Sobre Câncer

O câncer é uma doença complexa, cuja etiologia envolve uma gama de desordens
endógenas e exógenas. Fatores ambientais, biológicos e predisposições genéticas associadas a
desequilíbrios hormonais podem comprometer o comportamento celular e favorecer o
surgimento de neoplasias (COTRAN et al., 2005; JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2000; SILVA,
2007). Os tumores dividem-se em benignos e malignos. Tal diferenciação está relacionada a
fatores como taxa de crescimento celular (desequilíbrio entre a proliferação e apoptose), nível
de diferenciação, desenvolvimento de metástases e invasividade. Os tumores benignos
crescem como massas expansivas e coesas, mas que se restringem a seu sítio de origem. Já as
células malignas possuem capacidade de infiltração, invasão ou metastatização para locais
distantes daquele onde surgiram (COTRAN et al., 2005).
HANAHAN e WEINBERG (2011) sumarizaram as seis principais características
adquiridas durante o desenvolvimento de tumores malignos humanos. São elas: a manutenção
da sinalização proliferativa, a evasão dos supressores de crescimento, a resistência à morte
celular programada (apoptose), o potencial replicativo ilimitado, a indução de angiogênese e a
ativação da invasão tecidual e metástase. A instabilidade genômica das células tumorais dá
suporte a essas características, pois gera a diversidade genética necessária à transformação
celular. A inflamação gerada pelo tumor também contribui para a progressão do câncer.
Estudos das últimas décadas têm adicionado duas características ao rol dos tumores: a
reprogramação do metabolismo energético e a evasão do sistema imune. Além disso, a
complexidade do microambiente tumoral é imensa e não deve ser ignorada, pois garante a
manutenção do meio adequado para a implantação, manutenção e desenvolvimento das
células tumorais (HANAHAN & WEINBERG, 2011).
A perda do controle da proliferação celular resulta de mutações em genes reguladores
do ciclo celular, o que torna o câncer uma doença genética (FOREST, 2008). Devido à maior
capacidade de proliferação, as células tumorais sofrem uma expansão clonal, transmitindo
suas alterações genéticas às células que delas se originam (KING, 2000). Os genes envolvidos
no controle do ciclo celular são os proto-oncogenes e os genes supressores de tumor. Os genes
supressores de tumor atuam diminuindo a proliferação celular, e os proto-oncogenes estão
envolvidos na regulação positiva da proliferação celular. Quando alterados ou amplificados
no genoma, passam a ser denominados oncogenes (MENDELSOHN et al., 1995).
3
 2.2. Epidemiologia do Câncer

Conhecido há muitos séculos, o câncer foi amplamente considerado como uma doença
dos países desenvolvidos e com grandes recursos financeiros. Há algumas décadas, a situação
vem mudando, e a maior parte da incidência global do câncer pode ser observada em países
em desenvolvimento, principalmente aqueles com poucos e médios recursos (INCA, 2016).
O problema do câncer no Brasil ganha relevância pelo perfil epidemiológico que essa
doença vem apresentando, e, com isso, o mesmo tem conquistado espaço nas agendas
políticas e técnicas de todas as esferas de governo. O conhecimento sobre a situação dessa
doença permite estabelecer prioridades e alocar recursos de forma direcionada para a
modificação positiva desse cenário na população brasileira (INCA, 2016).
Com essa maior dimensão, o câncer se tornou um evidente problema de saúde mundial.
A Organização Mundial da Saúde (2016) estimou que, no ano 2030, podem-se esperar 27
milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes por câncer e 75 milhões de
pessoas vivas, anualmente, com câncer. O maior efeito desse aumento vai incidir em países de
baixa e média rendas (INCA, 2016).
No Brasil, as estimativas para o biênio 2016/2017 apontam a ocorrência de
aproximadamente 600.000 novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma,
reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Sem os casos de câncer da pele não
melanoma, estima-se um total de 420 mil novos casos. Os tipos mais incidentes serão os
cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto, estômago e cavidade oral para
o sexo masculino; e os cânceres de pele não melanoma, mama, intestino, colo do útero,
pulmão e estômago para o sexo feminino (Figura 1). São esperados um total de 214.350 casos
novos para o sexo masculino e 300.870 para o sexo feminino (INCA, 2016).

4
Figura 1. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2016 por
sexo, exceto pele não melanoma.

Fonte: INCA, 2016.

2.3. Tratamento do Câncer

O tratamento da maioria dos cânceres consiste na combinação de diferentes abordagens

terapêuticas, como as terapias farmacológicas, aliadas à cirurgia e à radioterapia. Mesmo com
o tratamento, as células tumorais podem se disseminar para outras partes do organismo,
originando as metástases (KUMMAR et al., 2013; INCA, 2016).
Os tipos primários de drogas anticâncer são os quimioterápicos, hormônios terapêuticos
e fármacos alvo-dirigidos. As imunoterapias são estratégias recentes em oncologia e incluem
os interferons e interleucinas recombinantes para tratamento de câncer de rim, além de
vacinas como o Gardasil® (Merck), empregado na prevenção do câncer cervical causado pelo
papilomavírus humano (HPV). Os quimioterápicos atuais são altamente tóxicos e geralmente
não específicos para células tumorais, estando frequentemente associados à toxicidade
sistêmica e à resistência tumoral ao tratamento (ARIAS, 2011).
Assim, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para o tratamento do
câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é alcançado devido a falhas nas estratégias
de tratamento, à redução da sobrevida dos pacientes e aos altos índices de recidivas e efeitos
adversos, estimulando assim a procura por novos fármacos (LUO et al., 2013; SALGALLER
& LODGER, 1998). Portanto, a baixa seletividade dos agentes quimioterápicos atuais torna
necessária a busca por novos compostos com ação mais seletiva e menos efeitos colaterais.
Não obstante, a indústria farmacêutica e biotecnológica norte-americana investe mais em
pesquisa e desenvolvimento em oncologia do que em qualquer outra área clínica (ARIAS,
2011).

5
 2.4. Produtos Naturais: o Grupo dos Pterocarpanos

Os produtos naturais têm sido uma excelente fonte de agentes farmacêuticos e ainda são
úteis à descoberta de novas drogas, como indicado pelo número relativamente grande de
substâncias de origem natural em testes clínicos (CRAGG et al., 2014). O desenvolvimento
de fármacos derivados do paclitaxel, alcaloides da vinca, etoposídeo, camptotecina e muitos
compostos antimicrobianos têm demonstrado a importância dos programas de descoberta de
drogas baseados em produtos naturais (NEWMAN e CRAGG, 2012). De um total de 155
agentes anticâncer aprovados para uso na medicina ocidental e Japão desde os anos de 1940,
47% foram classificados como produtos naturais em si, 14% como derivados sintéticos de
produtos naturais e 5% como outros derivados de produtos naturais (NEWMAN e CRAGG,
2013).
Os pterocarpanos são produtos naturais comumente encontrados em plantas da família
Fabaceae. Esses compostos são metabólitos secundários derivados de isoflavona (MILITÃO
et al., 2006), dotados de um sistema tetracíclico benzofurano-benzopirano com centros quirais
nas posições 6a e 11a (GOEL et al., 2012; JIMÉNEZ-GONZÁLEZ et al., 2008). Suas
atividades biológicas incluem a antiofídica (NAKAGAWA et al., 1982), anti-HIV (ENGLER
et al., 1993), anti-Trypanosoma spp. e anti-Leishmania spp. (SALEM et al., 2006),
antifúngica, antimicrobiana (JIMÉNEZ-GONZÁLEZ et al., 2008), antioxidante e anti-
inflamatória (LEE et al., 2006; ROSA et al, 2005; TESAURO et al. 2010), que justificam o
uso de plantas produtoras de pterocarpanos na medicina popular. Sua estrutura geral está
representada na Figura 2.

Figura 2. Representação da estrutura básica dos pterocarpanos.

FONTE: NETTO e colaboradores (2010).

Os pterocarpanos constituem um exemplo de que a síntese a partir de produtos naturais

pode gerar moléculas com bom potencial antitumoral. O Laboratório de Química Bioorgânica
(LQB) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) sintetizou compostos inspirados
6
nos pterocarpanos naturais, dos quais o número 1 (Figura 3) demonstrou atividade citotóxica
contra diversas linhagens de células leucêmicas, incluindo linhagens multirresistentes, e
apresentou baixa toxicidade nos linfócitos ativados. Contudo, concluiu-se que este composto
sofreria reações in vivo (transformação de catecóis em orto-quinonas), transformando-se no
composto 2 (Figura 3), ainda mais potente que o composto 1, porém altamente tóxico para os
linfócitos (NETTO et al., 2010).

Figura 3. Pterocarpanos 1 (catecol) e 2 (ortoquinona).

FONTE: NETTO e colaboradores (2010).

Uma vez observado o potencial citotóxico dos pterocarpanos sintetizados, percebeu-se

que a sua atividade linfotóxica poderia estar associada a transformações do grupo catecol em
orto-quinona pelo metabolismo celular. Posteriormente, pterocarpanoquinonas foram
sintetizadas no intuito de se obter compostos mais seletivos para células tumorais e menos
tóxicos aos linfócitos. Nessas moléculas, o grupo catecol original foi substituído por uma
naftoquinona. Os esqueletos naftoquinônicos do lapachol e da α-lapachona foram combinados
com o esqueleto pterocarpanóide do produto natural catecólico (Figura 4), isolado das flores
de Petalostemon purpureus por CHAUDHURI e colaboradores (1995).

7
 Figura 4. A síntese das primeiras naftoquinonas/ pterocarpanoquinonas a partir da combinação de
lapachona, lapachol e pterocarpano.

FONTE: NETTO e colaboradores (2010).

A partir do esqueleto pterocarpanóide foram geradas moléculas como

pterocarpanoquinonas, aza-pterocarpanoquinonas e aza-pterocarpanos, que continuaram
demonstrando atividade citotóxica e maior capacidade seletiva em relação aos pterocarpanos
iniciais (BUARQUE et al., 2013).

2.5. Resultados Preliminares

Um painel de 10 análogos de pterocarpanos foi gentilmente cedido pelo Prof. Paulo

Ribeiro Costa, coordenador do Laboratório de Química Bioorgânica da UFRJ. As substâncias
foram submetidas à análise de citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT. LQB 149 e
LQB 223 foram as substâncias que apresentaram CI 50 menor que 5 µg.ml-1 no maior número
de linhagens tumorais testadas (leucemias, câncer de cólon, glioblastoma e melanoma
humanos), após tratamento de 72 horas. Portanto, selecionou-se tais moléculas para maiores
investigações neste projeto.

8
 Tabela 1: Valores de CI50 em g.mL-1, determinado pelo ensaio de MTT, após
tratamento de células tumorais suspensas (HL-60, K562) e aderidas (HCT-8, SF-295, MDA-
MB435) por 72 h. NT: não testadas.
CI50 µg.ml-1
(Intervalo de Confiança)
LINHAGENS TUMORAIS
AMOSTRA HL-60 K562 HCT-8 SF-295 MDA-
MB435
Doxorrubicina 0,02 0,14 0,01 0,24 0,48
(controle (0,01 – 0,03) (0,09 - 0,23) (0,01 – 0,02) (0,17 – 0,36) (0,34 – 0,66)
positivo)
LQB 149 2,2 4,7 2,9 3,1 6,2
(349 g.mol-1) (1,9 – 2,6) (2,9 – 7,7) (1,7 – 4,8) (1,8 – 5,2) (4,4 – 8,6)
LQB 174 NT NT > 25 > 25 > 25
(222 g.mol-1)
LQB 205 > 25 NT > 25 > 25 > 25
(487 g.mol-1)
LQB 206 NT NT > 25 > 25 > 25
(242 g.mol-1)
LQB 216 1,2 2,7 3,5 5,9 3,8
(334 g.mol-1) (0,7 – 2,1) (1,6 - 4,4) (1,9 – 6,5) (3,8 – 9,3) (3,3 – 4,4)

LQB221 1,5 NT >5 >5 >5

(362 g.mol-1) (0,5 – 4,8)
LQB223 0,4 0,7 1,2 > 25 0,2
(375 g.mol-1) (0,3 – 0,4) (0,3 -1,6) (0,5 – 2,5) (0,1 – 0,3)
LQB225 5,8 15,6 7,1 11,9 10,3
(334 g.mol-1) (5,2 – 6,4) (12,0 - (4,7 – 10,6) (6,7 – 21,0) (8,1 – 13,0)
20,12)
LQB226 2,3 2,4 3,4 11,9 1,9
(377 g.mol-1) (2,0 -2,4) (1,9 - 2,9) (2,5 – 4,6) (6,7 – 21,0) (1,6 – 2,2)
LQB 235 NT NT > 25 > 25 > 25
(224 g.mol-1)

*Valores de CI50 em μg/ml originados de experimentos independentes (n=2). Os dados

foram obtidos por regressão não linear com intervalo de confiança de 95% através do
programa GraphPad Prism versão 5.0. (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).
*CI50: concentração inibitória de 50% do crescimento das células presentes na placa.

9
 2.6. Justificativa

A mortalidade associada às formas mais comuns de câncer ainda é inaceitavelmente

alta. Ademais, os quimioterápicos atualmente empregados na prática oncológica são pouco
específicos e propensos à toxicidade sistêmica e ao desenvolvimento de resistência tumoral.
Portanto, a pesquisa de novos agentes anticâncer é necessária ao enfrentamento dessa doença,
cuja incidência deve aumentar nos próximos anos, em razão do envelhecimento populacional.
Nesse contexto, os produtos naturais têm apresentado grande potencial de geração de novas
drogas, haja vista o grande número de ensaios clínicos realizados com esses compostos e seus
derivados. Os pterocarpanos são produtos naturais com boa atividade citotóxica contra
linhagens tumorais, conforme registrado na literatura. O estudo de análogos dessa classe de
moléculas é promissor para a geração de compostos líderes no desenvolvimento de novos
quimioterápicos. Esse fato é reforçado pelos resultados prévios obtidos com o aza-
pterocarpano LQB 149 e a aza-pterocarpanoquinona LQB 223, que apresentaram valores
satisfatórios de concentração inibitória de 50% do crescimento das linhagens tumorais HL-60,
K562, HCT-8, SF-295 e MDA-MB435, após 72 h de tratamento. Tais valores foram
inferiores a 5 µg.mL-1. Portanto, este projeto propõe-se a aprofundar o entendimento da efeito
citotóxico dessas moléculas.

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterizar o perfil citotóxico do aza-pterocarpano LQB 149 e da aza-
pterocarpanoquinona LQB 223.

3.2 Objetivos Específicos

 Determinar o perfil citotóxico in vitro dos compostos frente a diversas linhagens

tumorais humanas.
 Determinação da CI50 em linhagens não tumorais, para verificação da seletividade dos
compostos por linhagens tumorais.
 Determinar a viabilidade celular das moléculas selecionadas em tratamento de 24h,
utilizando a o ensaio do azul de tripan.
10
  Análise morfológica das células tumorais após tratamento com as substâncias LQB
149 e 223, por coloração com os corantes panóticos May Grünwald Giemsa.
 Determinar o padrão de morte, parada do ciclo celular e nível de apoptose em células
tratadas por citometria de fluxo.
 Avaliar a ação das drogas sobre o citoesqueleto celular, utilizando microscopia
confocal.
 Elucidar as vias de sinalização de morte celular por meio de western-blot.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais, equipamentos, soluções e modelos experimentais utilizados no

Laboratório de Oncologia Experimental

 Água destilada
 Câmara de Neubauer
 Diluidores
 Eppendorffs
 Frascos plásticos para cultura de células
 Gase
Materiais  Lâminas
 Pipetador
 Pipetas automáticas: mono e multicanal
 Pipetas descartáveis
 Placas de 96 poços
 Ponteiras de pipetas
 Seringas
 Seringas
 Tubos falcon

 Agitador- VDRL Shaker Ts 2000A

 Autoclave
 Banho Maria- DELLTA Mod 105Di
Equipamentos  Bomba a vácuo
 Centrífuga- FANEN Excelsa Baby Mod 206
 Centrífuga de placas- Eppendorf Centrifuge 5403
 Citocentrífuga- Centrimicro FANEM Mod 212
 Espectrofotômetro de placa- DTX 880 multimode
detector, Beckman Coulter
11
  Estufa- NUAIRE US autoflow
 Estufa de secagem e esterilização- FANEN Mod 315 SE
 Fluxo laminar- VECO
 High Through Put Screening (HTS)/ Laboratory
Automation Workstation- BIOMEK 300, Beckman
Coulter
 Microscópio de inversão- ZEISS
 Microscópio óptico- Nikon Eclipse E100
 Pipetador automático- Gilson
 Citometro de Fluxo
 Microscópio confocal LSM 710 (Carl Zeiss).

 RPMI- Cultilab
 MTT- Sigma
 Álcool 70%- VETEC
 Soro fetal bovino- Cultilab
 Streptomicina/ penicilina- Cultilab
 Doxorrubicina - Zodiac
 DMSO- VETEC
Soluções  Solução salina (NaCl 0,85% + CaCl2 10 mM)- Labsynth
 Triton X – 100 1% - Isofar
 Ficol- Sigma
 Fitohemaglutinina- Sigma
 PBS
 Azul de Tripan 10%- Sigma
 Corante May Grünwald-Guiemsa- Bioclin/ Reagen
 Corantes Alexa-Fluor (Molecular Probes)
 Iodeto de Propideo
 VectaShield
 Phalloidin / Alexa Fluor® 488
Anticorpos  Anti α-Tubulin / Alexa Fluor® 643

Modelos Experimentais  Células tumorais em cultura (Cedidas pelo National

Cancer Institute- USA)

4.2 Síntese Química

Este trabalho será realizado com a colaboração dos pesquisadores do Laboratório de

Química Bioorgânica (LQB), sob a responsabilidade do professor doutor Paulo Roberto
Ribeiro Costa. As moléculas estudadas nesse trabalho serão gentilmente cedidas pelo referido
grupo de pesquisadores da Universidade Federal do Rio Janeiro - UFRJ.

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 4.3 Cultura de células

No presente trabalho, serão utilizados dois tipos de linhagem celular, as linhagens em

suspensão (HL-60 e K-562) e as linhagens aderidas (HCT-8, MDA-MB-435, SF-295, PC3M
e HEK293). As linhagens celulares que serão utilizadas nos experimentos estão em destaque
na Tabela 2. As células serão cultivadas em frascos plásticos para cultura (Corning, 25 cm 2,
volume de 50 ml para células aderidas e 75 cm2, volume de 250 ml para células em
suspensão), utilizando-se o meio de cultura com 89% de RPMI 1640, 10% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células serão mantidas em estufa
a 37°C e em atmosfera de 5% de CO2 e 95 % de umidade, seguido da observação do
crescimento celular com ajuda de microscópio de inversão a cada 24 horas. Quando
necessário às células serão repicadas em meio de cultura novo, numa concentração de 0,5-1,0
x 106céls/mL (BUTLER; DAWSON, 1992).

Tabela 2 - Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro,

através do método do MTT.

LINHAGEM CONCENTRAÇÃO DE
ORIGEM DA LINHAGEM PLAQUEAMENTO
CELULAR
(CÉLULAS/ml)

HL-60 (*) Leucemia promielocítica humana 0,3 x 106

K-562 (*) Leucemia mielocítica crônica 0,3 x 106

humana

HCT-8 (**) Carcinoma de cólon humano 0,7 x 105

MDA-MB-435 (**) Mama humano 0,7 x 105

SF-295 (**) Glioblastoma humano 0,7 x 105

PC3M(**) Próstata Humano 0,7 x 105

HEK293(**) Rim embrionário humano (não 1,0 x 105

tumoral)

(*) Linhagem de células em suspensão

(**) Linhagem de células aderidas
13
 4.4 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro pelo método do
MTT
Princípio do teste: A análise de citotoxicidade pelo método do MTT, [3-(4,5-
dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida], vem sendo utilizada no programa de
screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), sendo testadas mais de
10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990), podendo ser utilizado para determinar
citotoxicidade, proliferação e ativação celular. O método baseia-se na redução do sal [3-(4,5-
dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida] ou MTT, um composto de cor amarela, a
formazan, composto de coloração púrpura, pelos substratos celulares NADH, NADPH e
succinato, presentes na mitocôndria de células viáveis, seguida de análise colorimétrica
(MOSMANN, 1983; BERRIDGE; TAN,1996). No presente trabalho, este ensaio foi utilizado
para seleção das substâncias mais ativas, para determinar a existência ou não de seletividade,
e também para estabelecer a concentração inibitória (CI50) a ser utilizada nos experimentos
posteriores.

Procedimento experimental: As células serão plaqueadas em concentrações variadas

(de acordo com a Tabela 1) para células suspensas e aderidas. Inicialmente, será realizada a
diluição das substâncias em DMSO puro e estéril em uma concentração estoque de 5 mg/mL.
Para estabelecer a atividade citotóxica as mesmas serão adicionadas nas placas de 96 poços
(100 μL/poço) contendo as células das linhagens tumorais citadas, e em duplicata. O
quimioterápico doxorrubicina será usado como controle positivo. Após um período de
incubação de 69 horas, as placas serão retiradas e centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O
sobrenadante será aspirado e será adicionado 200 μL de solução de MTT 10 % em RPMI
1640, sendo a placa colocada na estufa a 5% de CO2 por 3 horas. Em seguida, as placas serão
novamente centrifugadas a 3000 rpm/10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu
precipitado ressuspendido em 150 μL de DMSO e agitado por cerca de 10 minutos, até
completa dissolução dos cristais de formazan. As placas serão lidas no espectrofotômetro de
placas a um comprimento de onda de 595nm.
Análise dos dados: Os experimentos serão analisados segundo suas médias e
respectivos erros-padrão. As substâncias serão testadas em duplicata, será plotado o gráfico
absorbância x concentração e determinado as suas CI50 (concentração inibitória média capaz
de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%)

14
determinados a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão 5.0
(Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

4.5 Análise de alterações morfológicas – Coloração Diferencial por May Grünwald/

Giemsa
Princípio do ensaio: A coloração utilizada neste experimento baseia-se em interações
eletrostáticas entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul de metileno
(corante básico), eosina (corante ácido), entre outros componentes básicos, que permitem
fazer distinção entre o citoplasma e o núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua
integridade nuclear, bem como alterações no citoplasma e membranas.
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada serão plaqueadas em
placas de 24 poços, na densidade adequada, e incubadas por 24 horas com as
pterocarpanoquinonas 149 e 223 nas concentrações de 3,5 e 7,0 μM. A doxorubicina será
utilizada como controle positivo. Para observar a morfologia das células, lâminas serão
preparadas, com 50µL da suspensão de células, em citocentrífuga (cytospin) e fixadas com
metanol 100% por 1 minuto. Em seguida, as lâminas foram lavadas com água corrente para
remoção do fixador e coradas, inicialmente, com May Grünwald por 10 segundos, seguida por
Giemsa por mais 10 segundos.
Análise dos dados: As lâminas com células tratadas e não tratadas serão levadas ao
microscópico para a avaliação qualitativa de suas características morfológicas e comparadas
às células do controle negativo. Posteriormente, as células serão fotografadas para o registro
das alterações observadas.

4.6 Viabilidade celular por citometria de fluxo

A viabilidade celular foi avaliada por citometria de fluxo analisando-se a integridade
da membrana plasmática e pela contagem de células com morfologia normal.

4.6.1 Análise da integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo

Princípio do teste: As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante

quase todo o processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas. Este ensaio se
baseia na capacidade de o iodeto de propídeo (PI), hidrofílico, penetrar apenas nas células

15
cuja membrana plasmática (M.P.) esteja rompida e emitir alta fluorescência vermelha somente
quando excitado pelo laser de argônio (488nm) e estiver ligado ao DNA. As células cuja
membrana permanece íntegra emitem menor fluorescência (DARZYNKIEWICZ et al., 1992).
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada, na densidade adequada,
serão incubadas por 24 h com as LQB’S 149 E 223 nas concentrações de 0,23; 0,49; 0,99;
1,98 e 3,96μM. Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas será
incubada com 100 µL de uma solução de PI a 50µg/mL (diluído em tampão fosfato). Após 5
minutos, as amostras serão analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte da Guava
Tecnologies). Serão obtidas informações integridade de membrana utilizando-se o filtro para
o espectro do vermelho.
Análise dos dados: Os dados serão analisados a partir da média e do erro padrão da
média de um número de experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças
significativas entre os diferentes grupos, os dados serão comparados por análise de variância
(ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p<0,05) no
programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

4.6.2. Analise da morfologia celular por citometria de fluxo

Princípio do teste: O citômetro de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies) é capaz de

comparar populações de células quanto às características de tamanho e de granulosidade
(relativo a organelas, vacúolos etc). A partir desta ferramenta, pode-se delimitar a região
(através de um gate) que compreende a população de células normais realizando a contagem
da população de interesse.
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada, na densidade adequada,
serão incubadas por 24 horas com as LQB’S 149 e 223 nas concentrações estabelecidas de
acordo com o teste do MTT (IC50). Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e
não tratadas será incubada com 100µL de uma solução de PI a 50µg/mL (diluído em tampão
fosfato). Após 5 minutos, as amostras serão analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte,
Guava Tecnologies). Serão obtidas informações sobre morfologia celular a partir do
espalhamento frontal (tamanho relativo entre as células) e espalhamento lateral
(granulosidade relativa entre as células).
Análise dos dados: será realizada a contagem separada das células que se encontravam
dentro do gate permitindo assim, analisar o efeito dos derivados de pterocarpanos LQB’S 149
16
e 223 sobre a redução da concentração de células normais. Os dados serão analisados a partir
da média e do erro padrão da média de um número de experimentos. Para verificação da
ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados serão comparados
por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância
de 5% (p<0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San
Diego, CA).

4.6.3 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo.

Princípio do teste: Esse método consiste na capacidade do iodeto de propídeo se ligar

ao DNA de células, cuja membrana plasmática foi primeiramente lisada por um detergente
para permitir a entrada do corante no núcleo. O ciclo celular é constituído pelas seguintes
fases: G1, S, G2 e M. Durante o período de crescimento celular (fase G 1) uma célula diplóide
apresenta um conteúdo 2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA
nuclear, isto é, possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do
genoma nuclear (2-4n) e na fase seguinte (fase G 2) ocorre o segundo período de crescimento
celular, durante o qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida ocorre
a mitose (fase M, 4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas células filhas, cada
uma com um conteúdo 2n em DNA. As células que não se encontram em divisão celular (G 0)
apresentam um conteúdo 2n em DNA. Assim, as diferentes fases do ciclo celular podem ser
determinadas a partir do conteúdo de DNA que elas apresentam.
Quando as células se apresentam com a cromatina condensada e/ou DNA fragmentado,
a quantidade de PI incorporada é menor, e, portanto emitem uma fluorescência mais baixa
(GORMAN et al., 1997).
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada, na densidade adequada,
serão incubadas por 24 horas com as LQB’s 149 e 223 nas concentrações estabelecidas pelo
método do MTT. A doxorrubicina (0,5M) será usada como controle positivo. Uma alíquota
de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas será adicionado 100µL de uma
solução de PI (50µg/mL) diluído em tampão fosfato, contendo Triton X-100 a 0,2% e citrato
de sódio (0,1%). Após 30 minutos de incubação, na ausência da luz, as amostras serão
analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies) no filtro vermelho, onde
foram obtidos histogramas representando a quantidade de células em cada fase do ciclo
celular (G1, S e G2/M) e a quantidade de células com DNA fragmentado.
17
 Análise dos dados: Os histogramas de ciclo celular plotados como intensidade de
fluorescência vermelha (eixo x) versus números de células (eixo y) serão analisados no
programa ModFit LT 3.1 com a ferramenta syncronization wizard. Em seguida, de cada
experimento realizado serão contados 5000 eventos. Os dados serão expressos como a média
± erro padrão da média (E.P.M.) de três experimentos independentes. Para verificação da
ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados serão comparados
por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância
de 5% (p < 0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science,
San Diego, CA).

4.6.4 Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da anexina-V

Princípio do teste: A externalização do fosfolipídio de membrana, fosfatidilserina é,

frequentemente, um dos primeiros eventos a ocorrer quando a célula entra em apoptose. Este
ensaio permite diferenciar células viáveis, apoptóticas e necróticas pela coloração diferencial
por fluorescência. Neste ensaio, a detecção das células apoptóticas é feita pela ligação da
anexina-V conjugada a PE com a fosfatidilserina externalizada (fluorescência amarela).
Células necróticas são coradas pelo corante 7AAD (7-amino-actinomicina), que emitem
fluorescência vermelha, e penetra nas membranas celulares desintegradas e se ligam ao
núcleo. Células sem marcação pelos corantes são viáveis, verdes são consideradas apoptóticas
e positivas para os dois corantes são consideradas necróticas (VERMES et al., 1995;
FREIKMAN et al., 2009).
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada, na densidade adequada,
serão incubadas por 24 horas com as LQB’s 149 e 223 nas concentrações estabelecidas pelo
método do MTT. 135µL da suspensão de células serão incubados com 5µL de 7AAD e 10µL
de Annexin-V-PE do kit Guavanexin. Após 20 minutos de incubação, em gelo picado e no
escuro, as amostras serão analisadas por citômetria de fluxo (EasyCyte da Guava
Tecnologies) com os filtros vermelho e amarelo.
Análise dos Dados: Os dados serão analisados a partir da média e do erro padrão da
média de n experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os
diferentes grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por

18
Teste de Dunnet, com nível de significância de 5% (p<0,05) no programa GraphPad Prism
versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).

4.6.5 Detecção da ativação de caspases

Princípio do teste: As caspases formam uma família de proteases intimamente

relacionadas ao processo de morte por apoptose. As diferentes caspases podem desempenhar
suas funções tanto na ativação quanto na deflagração de todas as vias apoptóticas (WANG et
al., 2005).
Para detecção de caspases ativadas serão utilizados os kits Guava ® EasyCyte Caspase
3/7 Kit e Guava® EasyCyte Caspase 8 Kit. A realização da detecção se dá pela alta
fluorescência verde emitida que ocorre na ligação covalente do FLICA ™ que atravessa
facilmente a membrana plasmática. As células em apoptose inicial serão marcadas
exclusivamente pelo FLICA. A contra coloração para detecção de células em apoptose tardia
e necrose será feita com iodeto de propídeo (PI), o qual é bastante hidrofílico e só é capaz de
se ligar ao DNA das células que tiverem danos na membrana plasmática emitindo então alta
fluorescência vermelha quando excitado pelo laser argônio (488nm).
Procedimento experimental: Células da linhagem selecionada, na densidade adequada,
serão incubadas por 24 horas com as LQB’s nas concentrações estabelecidas pelo teste do
MTT. 10µL de FLICA 10X serão adicionados às células controle e tratadas sendo incubadas
por 1 h a 37ºC, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Após a
incubação as células serão lavadas com solução tampão de lavagem e adicionados 150µL de
PI diluído em ST (75µL de PI em 15mL).
Análise dos dados: Através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive
Software for Science, San Diego, CA), os dados serão analisados segundo análise de variância
ANOVA seguida de Dunnet com nível de significância de 5% (p<0,05) das médias do
percentual de 3 experimentos realizados em triplicata de células viáveis, em apoptose inicial,
apoptose tardia e necróticas.

4.7 Microscopia confocal: análise do citoesqueleto celular

19
 Princípio do método: O microscópio confocal de fluorescência por varredura a laser
utiliza fluorescência para a aquisição das imagens. A fluorescência é um tipo de
luminescência (emissão de luz) em que um corpo absorve luz e após um curto intervalo de
tempo reemite essa luz. Esse é o princípio da microscopia de fluorescência, na qual
compostos químicos chamados fluoróforos ou fluorocromos são usados para produzir a
fluorescência do material em estudo. A grande vantagem da microscopia confocal é a
possibilidade de se obter luz exclusivamente a partir de um único plano, onde um orifício,
chamado de “pinhole”, consegue separar apenas a luz proveniente do ponto focado,
impedindo assim que a luz refletida/emitida por outros pontos fora de foco chegue até o
detector. O microscópio de varredura a laser varre a amostra sequencialmente ponto a ponto e
linha a linha em diferentes planos focais da amostra, gerando imagens com alto contraste e
alta resolução nos eixos X, Y e Z. Todas essas informações são então processadas por um
computador e assim imagens tridimensionais podem ser geradas e manipuladas digitalmente.
Procedimento experimental: As células serão plaqueadas sobre lamínulas, em placas
de 6 poços na densidade de 7,0 x 105 células/mL. As LQB`s 149 e 223 serão incubadas junto
com as células durante 24 h, em concentração a ser determinada pelo método do MTT, em
estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2 e 95 % de umidade. Após o período de incubação
o meio será retirado e as células lavadas com PBS, fixadas em paraformaldeído (4,7 % em
PBS) e em seguida permeabilizadas com Triton X-100 (0,25 % em PBS). Uma solução de
RNAse será utilizada, a fim de eliminar possíveis interferências de fragmentos de RNA e
ribossomos. Em seguida as células serão incubadas com anticorpos específicos para actina
(phalloidin / Alexa Fluor® 488) e tubulina (Anti α-Tubulin / Alexa Fluor® 643) conjugados a
corantes da Alexa-Fluor (Molecular Probes). O núcleo foi corado com DAPI ou IP (Iodeto de
Propideo) e após extensas lavagens com PBS foram montadas sobre lâminas utilizando
VectaShield e analisadas e analisadas em microscópio confocal LSM 710 (Carl Zeiss).

4.7 Avaliação da expressão gênica em nível proteico por western-blot

O western-blot, também chamado de immunoblot, é um método bioquímico e
molecular utilizado para detectar a expressão protéica de uma determinada proteína em uma
amostra, usando um anticorpo mono ou policlonal específico para a proteína de interesse,
denominado de anticorpo primário. O procedimento de realização do ensaio do western-blot
consiste em várias etapas: (1) extração e quantificação de proteínas totais das células

20
submetidas ao tratamento com o composto; (2) separação das proteínas por peso molecular
em eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE ou Sodium Dodecyl
Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis); (3) eletrotransferência das proteínas para
uma membrana capaz de ligá-las e (4) revelação das proteínas específicas por meio de sondas,
capazes de reconhecer especificamente o anticorpo primário. Essas sondas são anticorpos
conjugados à enzima peroxidase, denominadas de anticorpos secundários. A revelação é
realizada por um método de quimioluminescência, que se baseia na degradação do peróxido
de hidrogênio pela enzima peroxidase, na presença de luminol. A luminescência produzida é
captada em câmara escura e permite a identificação da região (banda) da membrana onde se
encontra a proteína de interesse (ligada ao anticorpo primário, por sua vez ligado ao
secundário). Quanto maior a quantidade de proteínas de interesse na banda, mais intensa é a
quimioluminescência produzida, resultando em uma marcação mais forte na membrana.
Os anticorpos primários utilizados no experimento serão escolhidos de acordo com os
padrões de morte, análise morfológica observados e literatura subjacente. Todos serão
adquiridos comercialmente. A marcação com o anticorpo anti-β-Actina (adquirida da Imuny –
Campinas, Brasil) será utilizada como controle de massa total de proteína presente nas
amostras analisadas (loading control). Os anticorpos secundários serão compatíveis com os
anticorpos primários utilizados e obtidos da Cell Signaling Technology (Danvers,
Masschusetts, EUA). Todos os anticorpos serão solubilizados em tampão TBS (50 mM Tris-
Cl, pH 7.5 e 150 mM NaCl) ou TBST (50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1% v/v
Tween 20), com BSA ou leite desnatado 5% (m/v), em diluição 1:1000 – 1:5000.
Os tratamentos serão realizados em placas de 6 poços com 5 mL de meio e densidade
celular adequada para a linhagem escolhida. Cada extrato proteico será obtido de um pool de
células tripsinizadas e lavadas em PBS, provenientes de 3 poços. De cada pool será aplicado
50 μg de proteína total em cada canaleta do gel de eletroforese.

4.7.1 Extração de proteínas

Para o processo de extração, as células serão tripsinizadas (quando aderidas) e

centrifugadas; o pellet será lavado duas vezes com PBS. O sobrenadante será descartado e o
pellets suspendido em tampão RIPA Lysis Buffer (Milipore) 1X acrescido do coquetel de
inibidores de proteases da Sigma (1:100 v/v), ortovanodato de sódio 1 mM, β-glicerofosfato 1
mM e PMSF 1 mM. As amostras serão sonicadas por 60 s em água a 4˚C, três vezes, com
21
intervalos de 2 min entre as sonicações. Posteriormente, as amostras serão incubadas em gelo
por 30 min e centrifugadas a 13000 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante será coletado,
separado em alíquotas e armazenado a -20°C.

4.7.2 Quantificação de proteínas

A quantificação de proteínas totais extraídas das células será realizada por meio de
método colorimétrico com o kit DC Protein Assay (BioRad Laboratories). Para isso, uma
curva padrão de BSA (0,2-2 mg/mL; Sigma) diluída em tampão RIPA completo será utilizada
para a calibração do método. O tampão RIPA completo será utilizado para marcar o branco
experimental. Em seguida, 5 µL de cada amostra será pipetada em triplicata em placa de 96
poços. Serão adicionados em todos os poços: 25 µL de reagente A’ (20 µL de reagente S + 1
mL de reagente A) seguido de 200 µL de reagente B. As amostras serão incubadas por 10
minutos no escuro sob agitação leve e lidas em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 620 nm.
A curva de BSA será gerada por regressão linear no programa GraphPad Prism 5.0,
sendo plotado um gráfico da absorbância versus concentração de proteínas. Os valores de
absorbância obtidos de cada amostra serão aplicados na equação da curva para determinar as
concentrações de proteína.

4.7.3 Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida

A separação das proteínas totais baseada no peso molecular será realizada por meio de
eletroforese em gel de poliacrilamida em um sistema vertical. Após a montagem do sistema
vertical (BioRad, modelo mini-PROTEAN® Tetra Cell), o gel de resolução será
confeccionado para uma concentração final desejada de acrilamida em tampão Tris-HCl 1,5
M, pH 8,8. O gel de concentração será polimerizado sobre o gel de 12,5% e terá concentração
final de 5% de acrilamida em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 (BioRad Laboratories). O
marcador de peso molecular Full-Range Rainbow Marker (12-225 kDa; GE Healthcare) será
usado sempre no primeiro poço da esquerda para monitorar a separação das proteínas. Será
aplicado nos poços do gel de concentração 50 µg de proteína total de cada amostra, carregada
com o tampão Blue Juice 5X (5:1 v/v; Invitrogen). A corrida de eletroforese será realizada à
temperatura ambiente, utilizando o tampão de corrida para eletroforese (25 mM Tris, 192 mM
22
glycine, 0.1% SDS), sob voltagem constante de 60V (enquanto a amostra percorre o gel de
concentração) e de 120 V (enquanto a amostra percorre o gel de resolução). O tempo de
corrida varia entre 1h e 40 minutos a 2 horas.

4.7.4 Eletrotransferência

As proteínas separadas serão transferidas para uma membrana de PVDF Hybond-P

(GE Healthcare). Para isso, o gel será colocado em contato com a membrana previamente
lavada em metanol entre esponjas e papéis de filtro banhados na solução de transferência. A
eletrotransferência será realizada pelo modo de imersão (BioRad, modelo MiniTrans Plot
Modulo) sob voltagem livre e amperagem de 0,4 mA por 1h e 20 minutos em banho de gelo.

4.7.5 Imunodetecção

Após a transferência, as membranas serão incubadas em solução de leite desnatado ou

BSA 5% (m/v) em TBS ou TBST por uma hora sob agitação constante, a fim de bloquear
ligações proteicas inespecíficas. Após o período de incubação, serão realizadas três lavagens
com TBST de 10 minutos. As membranas serão, então, incubadas por 16 h a 4°C com os
anticorpos primários diluídos em solução de BSA ou leite desnatado 5% em TBS ou TBST.
Após o mesmo processo de lavagens realizadas anteriormente, as membranas serão incubadas
por uma hora com o anticorpo secundário acoplado à enzima peroxidase, diluído em solução
de leite desnatado ou BSA 3,5% em TBS ou TBST por 1 hora, sob agitação. Em seguida, as
membranas serão novamente lavadas para a revelação com aproximadamente 1 mL de
solução reveladora (Clarity™ Western ECL Blotting Substrate, obtido da Bio-Rad –
Hercules, Califórnia, EUA) e imediatamente expostas ao sistema de fotodocumentação em
câmara escura. Após a revelação, as membranas serão lavadas em TBS.

4.7.6 Análise de dados

A detecção será realizada pelo método de ECL no aparelho ImageQuant 300, no NPDM
(GE Heathcare, modelo ImageQuant® 300), utilizando para aquisição e edição o programa
ImageQuant®300 (GE Heathcare).
23
5. RESULTADOS ESPERADOS

A partir dos estudos realizados espera-se caracterizar o perfil antineoplásico dos

compostos, para definição quanto ao seu uso como novos protótipos para o desenvolvimento
de medicamentos para o arsenal terapêutico anticâncer.

6. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO

Agosto/17 Levantamento Bibliográfico

Setembro/17 Estudos sobre a proliferação celular:
Teste do MTT
Outubro/17
Novembro/17 Estudos sobre a proliferação celular:
Teste do MTT
Dezembro/17
Janeiro/18 Análise de alterações morfológicas:
Coloração May-Grunwald-Giemsa
Fevereiro/18 Análise de alterações morfológicas:
Coloração May-Grunwald-Giemsa
Março/18 Estudos de Mecanismo de Ação:
Viabilidade celular- Através do teste de exclusão do azul de
Abril/18
Tripan
Maio/18
Junho/18 o Citometria de fluxo:
Análise da morfologia celular
Julho/18
Análise da integridade de membrana plasmática
Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA
Agosto/18 o Citometria de fluxo:
Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da
anexina-V
Setembro/18 o Citometria de fluxo:
Detecção da ativação de caspases
Outubro/18 Microscopia confocal: análise do citoesqueleto celular
Novembro/18
Dezembro/18 Estudo das vias de sinalização envolvidas com a morte celular
das linhagens testadas por western-blot.
Janeiro/19
Fevereiro/19
Março/19 Análise e interpretação dos resultados

24
 Abril/19
Maio/19 Produção bibliográfica
Publicação dos resultados
Junho/19
Elaboração e apresentação da dissertação
Julho/19
Agosto/19

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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