SUMÁRIO

PREFÁCIO E AGRADECIMENTOS ...... .. .. ............................. .......................... ..... 7

CAPÍTULO I
Aminoácidos como Biofcrtilizantcs ........ ...................................................................... 9
Átila Francisco Mógor e Gilda Mógor
1. Introdução ........................................... ....................................................................... 9
2. Aminoácidos nas plantas ................... .. ........... ................. .......................................... 1O
2.1 Síntese e transporte de aminoácido ...................................................... ........ 1O
2.2 Polaridade e isomeria dos aminoácidos ........................................................... 12
2.3 Metabolismo dos aminoácidos .......... .............................................. ............... 15
2.4 Aminoácidos como moléculas sinalizadoras ................................................. 19
3. Aminoácidos na agricultura ..... ........... ..................................................................... 20
4. Obtenção de L-aminoácidos livres ............................................................................ 21
4. 1 Hidrolisados de proteínas ............................................................................... 21
4.2 Aminoácidos obtidos por processos biológicos ............................................... 22
5. Absorção e bioatividade de L-aminoácidos livres .................................................... 23
6. Determinações de L-aminoácidos livres ................................................................... 26

CAPÍTULO II
Extratos de macroalgas marinhas como biofertilizantes............................................ 29
Mateus B. de Freitas, Roberta Paulert, César Freitas Ribeiro, Marlon C. de Borba,
Aline C. Velho e Mareie! J. Stadnik
1. Introdução............................................................................................................... .. 29
2. Macroalgas verdes ..................................................................................................... 30
3. Macroalgas vennelhas ............................................................................................... 35
4. Macroalgas marrons .................................................................................................. 40
4.1 Ecklonia n1axima .................................................................................... ...... 46
4.2 Ascophyllum nodosum .......... ............................................................... ........ 50
5. Oetenninação de polissacarfdeos algnis em produtos ........................................ ... 58

CAPÍTULO IIl
Extratos Vegetais como Biofertilizantcs ............................................... .................... 61
Roberta Paulert, Sérgio Miguel Mazaro e Á1ila Fruncisco Mógor
l. Introdução ... _.......... ................ ............... ...... ...... ..... .. ...... ....... ... .. .. ............. . 61
2. Algumas espécies com potencial biofertilizante ...................................................... 62
2.1 Bioatividade dos extratos vegetais ............... .................... .... ............. ....... ..... 65
3. Aplicações fitotécnicas ............................................................................ ............ ... 66
4. Preparo de extratos vegetais e detenninação dos compostos bioativos ................... 72
4.1 Oetenninação do total de aminoácidos livres e polipeptídios .................. ..... 73
4.2 Oetcnninação da concentração de ácido ascórbico ............................... ....... . 74
4.3 Análise de compostos voláteis .. ............. .............................................. ....... 74
4.4 Análise dos óleos essenciais ....... ...... .................................. ....................... 75
4.5 Oetenninação da atividnde antioxidante ....................... ..... ...... ... ............ 75
4.6 Oetcnninação de carbono orgânico total (COT) ......... ...... ................. ..... 75
CAPÍTULO IV
Substâncias húmicas como Biofcrtilizantcs ...... ......................................................... 77
Luciano Posqualoto Canellns, Fábio Lopes Olivares, Rakicly Martins da Silva,
Natália Aguiar Canellns e Átilo Francisco Mógor
1. Introdução ..... ..... .......................................................................... ............................. 77
2. Definições básicas .................................................................................................. 78
3. Efeitos das substâncias húmicas sobre a absorção de nutrientes e metabolismo ...... 80
3.1 Efeitos relacionados ao metabolismo primário ....... ........................................ 84
3.2 Efeitos relacionados ao metabolismo secundário .................................. .......... 85
4. Substâncias húmicas na agricultura........... ...................................................... ......... 87
5. Obtenção de substâncias húmicas ............. ...................................... ... .................... 98
6. Caracterização de substâncias húmicas .................................................................... 98

CAPÍTULO V
Bioensaios e determinações bioquímicas na avaliação da bioatividade
de biofertilizantes ..... ........ ... .. ....... .... ....... ....... ...... ...... .... ...... . .. . ... ... ....... ....... .... ......... 1O1
Gilda Mógor, Juliana de Oliveira Amatussi e Ely Cristina Negrelli Cordeiro
1. Introdução ...................................................................................... - ............... _....... l O1
2. Bioensaios conduzidos em câmaras de crescimento ....................... .. ................... l 02
2.1 Bioensaios de crescimento das raízes ................................. ......................... 102
2.2 Bioensaios de expansão de cotilédones, coleóptilos, hipocótilos e epicótilos .. 103
3. Bioensaios em vasos.......................................................................... ... .... .. ...... . l 04
4. Detenninações bioquímicas em plantas ............................................................ . .. 106
4.1 Coleta de amostras .................................................... ............. .................... I 07
4.2 Variáveis bioquímicas .......................................... ................................ ...... 107
4.3 Enzimas relacionadas aos estresses abióticos. .. ................ .......... ......... .. ... 11 O

Capítulo VI
Potenciais fontes biofertilizantes .................................. ......... .................. ... ...... .. .. 115
"Próxima Geração de Quitosanas" como potenciais biofertilizantes ...................... 115
Roberta Poulert, Annc Vortkomp, Naivy Y. Nava Cruz,
Carolin Richter, Maho Attjioui, Nour Eddine EI Gueddari,
Rebecca Melcher e Bruno M. Moerschbachcr

Microalgas como potencius fontes biofertilizantes .... ............................ ....- , .... .... 120
Gilda Mógor e Átilu Francisco Mógor

REFERÊNCIAS .. ..... ..................................... ............................. - .. - ........ - .......... 125

PATROCINADORES ... ...... .. .. ... .. . .. ....... ...... ...... ... .. . .... .. ... .. ... .. .. 175
 PREFÁCIO E AGRADECIMENTOS

A evolução da agricultura brasileira nas últimas décadas teve como pilares

fundamentais o "Conhecimento" e o "Espírito Empreendedor" dos seus diversos atores.
Instituições públicas e privadas tiveram - e continuarão tendo, participação
relevante no desenvolvimento de novos insumos e de novas práticas de produção
que viabilizaram não só a expansão da atividade para todo o território nacional,
como também o incremento da produtividade e da qualidade da produção.
Produzir mais e melhor, de forma sustentável, têm sido o grande balizador das
iniciativas de pesquisa científica.
Inserida neste contexto, a indústria de Fertilizantes Especiais tem papel de
destaque. Respeitando as características empresariais dos nossos agricultores e as
condições ambientais onde sua produção está inserida, o setor demonstra cada ve:z
melhor a sua capacidade de identificar limitantes e oferecer soluções customizadas,
buscando o aumento da produtividade de forma inteligente, construindo melhores
resultados, produtor a produtor.
A Abisolo como entidade que representa o setor é grande incentivadora da
pesquisa cientifica e tem a difusão do conhecimento como um dos seus principais eixos
estratégicos. Disponibili7.ar conteúdo em linguagem acessível tem sido nossa tarefa
ruária para que agricultores e pecuaristas se utilizem cada vez mais do conhecimento
científico para definir suas estratégias visando a melhor performance da produção.
Este livro é prova deste compromisso.
Tendo como editores o Prof. Dr. Átila Francisco Mógor e a Ora. Gilda
Mógor, com a contribuição de outros 20 pesquisadores de importantes instituições
de pesquisa, esta obra consolida o conhecimento adquirido até aqui sobre os
Biofertilizantes e demonstra que a sua utilização impacta positivamente nos
resultados da produção agropecuária. As normativas que regulam a produção destes
insumos também estão contempladas.
Esta 111 Edição, com 1000 exemplares, será distribuída gratuitamente, inclusive
para as bibliotecas de importantes universidades que atuam na área de Ciências Agrárias,
democratizando o acesso a todas as pessoas interessadas no tema.
Agradecemos aos autores, a todos os pesquisadores que direcionaram as suas
pesquisas para a validação dos beneficias da utilização destes importantes insumos e às
empresas associadas à Abisolo, que custearam a produção do livro.
Boa Leitura!!!
 CAPÍTULO I

ÁMINOÁCIDOS COMO BIOFERTILIZANTES

Átila Francisco Mógor e Gilda Mógor

1. Introdução
O uso de aminoácidos em fommlações fertiliz.antes, geralmente fluidos,
é bem difundido e relacionado aos seus efeitos como agentes quelantes/
complexantes, melhorando características do produto (BRASIL, 2018) e a
disponibilização de nutrientes para as plantas (FERNÁNDEZ; SOTIROPOULOS;
BROWN, 2013). Já, o efeito direto da aplicação de L-aminoácidos livres no
metabolismo vegetal é um tema de recorrente discussão no setor produtivo
(MÕGOR. 2016; MÓGOR. 2018) e que ganha relevância na pesquisa científica
(COLLAet ai., 2015; RÕDER et ai., 2018; TEIXEIRA e/ ai., 2017).
Produtos contendo componentes bioativos, entre estes os
L-aminoácidos livres, com efeitos estimulantes que promovam o crescimento,
desenvolvimento, aumento da tolerância aos estresses abióticos, entre outros
beneficios às plantas, não sendo agroquímicos ou exclusivamente fontes de
nutrientes, são contemplados no Decreto 4.954 de 14 de janeiro de 2004
(BRASlL, 2004) na classe de "Biofertilizantes", sendo biofertilizante definido
como: "produto que contém princípio ativo ou agente orgânico, isento de
substâncias agrotóxicas, capaz de atuar, direta ou indiretamente, sobre o todo
ou parte das plantas cultivadas, elevando a sua produtividade, sem ter em
conta o seu valor hormonal ou estimulante".
A Instrução Nonnativa nº 61 do Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (BRASlL, 2020), estabeleceu novas regras sobre definições,
exigências, especificações, garantias, tolerâncias, registro, embalagem e
rotulagem de biofertilizantes, entre os quais os de aminoácidos, com garantia
relacionada à porcentagem de aminoácidos livres, definindo biofertilizante de
aminoácido como: "produto obtido por fermentação ou hidrólise de materiais
orgânicos naturais"; sendo necessário comprovar sua bioatividade: "efeito
benéfico que o produto biofertilizante apresenta sobre o todo ou partes das
plantas cultivadas".
Nesse capítulo serão discutidos aspectos do metabolismo dos aminoácidos
nas plantas, dos aminoácidos como aditivos em fertiliz.antes e como biofertilizante.
Os processos de absorção, síntese, transporte dos aminoácidos no tecido vegetal,
fontes e processos de obtenção de L-aminoácidos livres, seus efeitos fisiológicos,
bioatividade e aplicações fitotécrucas serão abordados.

9
2. Aminoácidos nas plantas
Os aminoácidos são componentes ou participam da síntese de
enzimas, de proteínas estruturais, da clorofila, de hormônios vegetais,
do transporte e armazenamento do nitrogênio (N) nos tecidos vegetais,
e de uma série de processos fisiológicos relacionados ao crescimento
e desenvolvimento das plantas, desde a germinação e emergência, à
frutificação e senescência, bem como de adaptações aos estresses abióticos
e bióticos (HlLDEBRANDT et ai., 2015; 01-!YAMA et ai., 2017; PATRELLI; PrLOT, 2014).
2.1 Síntese e transporte de aminoácido
Diversas formas de N são absorvidas pelas raízes, as inorgânicas
de nitrato (NO3·) e amônia (NH/ ), e as orgânicas como aminoácidos e
peptídeos (NÃSHOLM; KLELLAND; GANETEG, 2009; TEGEDER; RENTSCH, 201 O).
Nas leguminosas com raízes colonizadas por rizóbios, o N2
atmosférico presente nos solos é convertido em NH4+, processo que
ocorre pela ação dos bacterioides fixadores de nitrogênio presentes
nos nódulos. Nos processos da fixação biológica do N, a atividade do
complexo da enzima nitrogenase e os primeiros compostos nitrogenados
produzidos e exportados para outros órgãos das plantas, como os
aminoácidos glutamina e asparagina em leguminosas de regiões de clima
temperado que transportam amidas; ou a alantoina e o ácido alantoico
em leguminosas de clima tropical que transportam ureidas, são bem
descri tos na literatura (KERBAUY, 2008; MATAMOROA et ai., 2003; TAIZ et ai., 2017).
Esses compostos nitrogenados absorvidos diretamente pelas
raízes ou exportados dos nódulos, são transportados pelo xilema para
outros órgãos, especialmente para os tecidos jovens da parte aérea
direcionados pelo fluxo transpiratório, e também carregados no floema
para suprir as demandas de N em tecidos próximos, como novas raízes
em crescimento (TEGEDER, 2014).
O transporte desses compostos (NO 3· , NH/, aminoácidos, pep-
tídeos e ureidas) ocorre pelo espaço da lamela média e parede celular
(apoplasto) e também pela conexão contínua dos citoplasmas (sim-
plasto) via plasmodesmos, canais tubulares de 40 a 50 nm de diâmetro
formados pelas membranas plasmáticas, conectando células adjacentes
(TAIZ er ai., 2017). A transferência desses compostos de N entre apoplasto
e simplasto se dá pela presença de diversos transportadores específicos
nas membranas celulares (OKUMOTO; PILOT, 2011).
Portanto, a absorção e o transporte de aminoácidos nas plantas
requerem a participação de proteínas (transportadores) que possibilitam a
transferência desses compostos através das membranas celulares.

10
 Inúmeros estudos identificaram a presença e demonstraram as
funções e especificidades de transportadores de aminoácidos nos diversos
órgãos das plantas, das raízes às sementes (YANG ct ai., 2020b; YAO, 2020).
A Figura 1 ilustra a presença dos transportadores de aminoácidos
nas membranas celulares dos tecidos vegetais.

Aminoácido
coo-
H.,N-J-H
1
R

Membrana

---....... minoácidos
Figura 1. Transportadores de aminoácidos nas membranas celulares

A síntese de aminoácidos nas plantas a partir do N inorgânico (NO3· ,

NH/ ) ocorre em plastídios (organelas que podem atuar no metabolismo
energético, de reserva e na síntese de metabólitos e moléculas estruturais)
nas raízes, e em cloroplastos nas folhas . Nas raízes, a síntese de
aminoácidos é dependente do fornecimento de carboidratos distribuídos a
partir das folhas via floema, enquanto nas folhas a síntese é dependente do
N03• e das ureidas, distribuídos a partir das raízes via fluxo transpiratório
pelo xilema (TEGEDER, 2014), sendo o metabolismo dos aminoácidos e dos
carboidratos interdependentes.

11
 O NO3· translocado das raízes pelo xilema é absorvido via
transportadores nas membranas para o citoplasma de células do mesófilo
da folha, sendo reduzido a nitrito (NO2· ) pela enzima nitrato redutase
(NR) e translocado para o estroma do cloroplasto. No estroma, o nitrito é
reduzido pela enzima nitrito redutase (NiR) a NH/, que é convertido em
glutamato pela ação sequencial das enzimas glutarnina sintetase (GS) e
glutamato 2-oxoglutarato aminotransferase (GOGAT- glutamato sintase)
no cloroplasto (KAN et ai., 2015; TAIZ et ai., 2017). Da mesma forma, nas
raízes o N03• que não foi distribuído para as folhas também é reduzido a
NH4+ e convertido a glutamato, enquanto o NH4+ absorvido pelas raízes é
diretamente convertido a glutamato nos plastídios (TEGEDER, 2014).
As primeiras moléculas orgânicas de nitrogênio produzidas a
partir de N inorgânico são a glutamina (amida do ácido glutâmico) e
o glutamato, sendo convertidos em outros aminoácidos por meio de
reações de transaminação, catalisadas por enzimas conhecidas como
aminotransferases. A transaminação dá sequência ao sistema GS/
GOGAT, pois a partir da glutamina e do glutamato as aminotransferases
participam da formação dos grupos amino (NH2) dos demais
aminoácidos (KERBAUY, 2008). Portanto, as aminotransferases atuam para
produzir o conjunto dos aminoácidos das plantas de acordo com suas
demandas metabólicas (MAJUMDAR et ai., 2016), sendo a síntese de todos
os aminoácidos conectada em algum ponto com a glutamina ou com o
glutamato (PRATELLI; PILOT, 2014).
2.2 Polaridade e isomeria dos aminoácidos
Os aminoácidos são compostos de um carbono (carbono a) ao qual
estão ligados um grupamento amina (NH}, um grupamento carboxila
(COOH), um átomo de hidrogênio e uma cadeia lateral variável de
um aminoácido para o outro (Radical -"R") (Figura 2) e podem ser
classificados segundo a polaridade dos seus radicais ou grupamentos 'R'
(Figura 3) (NELSON; COX, 2018).

Figura 2. Estrutura básica de um aminoácido com o carbono a ao centro

A classificação dos aminoácidos, segundo a polaridade dos seus

radicais ou grupamentos são apresentados na Figura 3 (a-e) com 'R'
destacados em cinza.

12
 coo - coo
coo- + 1
coo + 1
- 1 lliN- C-1-1 ♦ 1 11,N - C -H
coo· 100 1-IIN•- C -11 1 11,N - C -11 1
1 OH, 1 CH1
H,N•- C-H H,N•- C -H 1
·s rôHf' 1
GlH
.r- C::-OH,
1
€fl1
1
CH,
1
~ IJ 1
OH,

Gli Ala Va1 Leu Ile Met

Figura 3n. Aminoácidos com ' R' apoiar - Possuem radical ' R' formado exclusivamente
por carbono e hidrogênio, com exceção da metionina que possui enxofre, sendo
hidrofóbicos: Glicina (Gli), Alanina (Ala), Valina (Vai), Leucina (Leu), Isoleucina (Jle)
e Metionina (Met)

coo·
coo· coo· 1
H,N~C-H
♦ 1
l-hN-C-J-1
l/H
e
/ ©Hl
~
~,
lhN•
f[ HlN 0
HlN
.,e,
1
0

Ser Tre Cis Pro Asp Gln

Figura 3b.Aminoácidos com Radical ' R' polar sem carga- Possuem radicais 'R' contendo
hidroxilas, sulfidrilas e grupamentos amida, sendo hidrofilicos: Serina (Ser), Prolina (Pro),
Treonina (Tre), Cistenina (Cis), Asparagina (Asp) e Glutamina (Gln)

coo·
+ 1
l·hN-C-H

~
l©m

Lis His Arg

Figura 3c. Aminoácidos com Radical 'R' polar com carga positiva - Possuem radicais
'R' contendo duas aminas e um grupamento carboxila: Lisina (Lis), Histidina (His) e
Arginina (Arg)

13
 coo-
coo- + 1
+ 1 HJN - ~ -H
HJN - C -H
1 ©&
Offi
1 i PJiz
ao_çf

Asp Glu
Figura 3d. Aminoácidos com Radical 'R' polar com carga negativa - Possuem radicais
' R' contendo uma amina e dois gmpnmentos carboxila: Aspartato (Asp) e Glutarnato (Glu)

coo-
+ 1
coo- coo-
lliN - C -H 1
'~ --
Ofb
+
HJN-C-H
1 HJ~-C-H

~,
1
€ -Of.l 0
\{w
~

Trp Fen Tir

Figura 3e. Aminoácidos com Radical ' R' aromático, - Possuem radicais 'R' com anéis
aromáticos, sendo o Triptofano (Trp) e a Fenilalanina (Fen) apoiares e hidrofóbicos, e a
Tirosina (Tir) polar sem carga e hidrofilica
Os aminoácidos têm propriedades ópticas (isômeros ópticos) que
desviam o plano de luz para lados opostos, definidas pela posição do
NH2 na configuração do aminoácido (Figura 4). O carbono alfa (C- a)
dos aminoácidos é assimétrico e está ligado a quatro grupos diferentes:
-NH3.-Coo-, -H,- R, com exceção da glicina, cujo C-a não é assimétrico
(grupo R = -H). Os aminoácidos com C-a assimétrico apresentam as
formas L e D, capazes de desviar a luz polarizada para a esquerda
(L-levógiro) e para a direita (D-dextrógiro) (NELSON; cox, 2018).

coo-
H-C-NH3
' +
1
CHJ
L-Alanina D -Alanina
Figura 4. Jsômeros ópticos, L-levógiro e D-dextrógiro da Alanina

14
 Como os aminoácidos nas proteínas dos organismos vivos
são L-aminoácidos, sendo estes considerados biologicamente ativos,
convenciona-se que as plantas não utilizam D-aminoácidos diretamente em
seu metaboi ismo (CAVANI et ai., 2003; LISIECKA et ai., 2011 ; SIERRAS et ai., 2016).
Trabalhos recentes indicam que a presença dos D-aminoácidos
no metabolismo das plantas pode ser resultante de racemização dos
L-aminoácidos (mudança de um composto opticamente ativo em uma
forma racêmica, inativa) por efeito de estresses abióticos, podendo a
D-metionina atuar na síntese de etileno, hormônio vegetal relacionado aos
estresses, maturação e senescência (KOLUKISAOGLU, 2020; KOLUKISAOGLU;
SOARES, 2017).

2.3 Metabolismo dos aminoácidos

O metabolismo dos aminoácidos é uma complexa rede de vias
de síntese (anabolismo) e degradação (catabolismo), reguladas para
suprir as demandas das plantas (homeostase) de acordo com as funções
específicas dos diferentes aminoácidos (HILDEBRANDT et ai., 2015). A
maioria dos estudos concentra-se nos aminoácidos proteinogênicos, por
serem essenciais na formação de peptídeos (sequência de aminoácidos
conjugados por ligações peptídicas) e síntese de proteínas (sequências
conjugadas de peptídeos). Além dos 20 aminoácidos essenciais usados
na síntese de proteínas, as plantas sintetizam mais de 250 aminoácidos
não proteinogênicos relacionados a compostos que são anti-herbivoria, de
respostas aos estresses bióticos e abióticos, transporte e armazenamento
de nitrogênio, toxinas e síntese de hormônios vegetais, entre outros
(PARTHASARATHY; SAVKA; HUDSON, 2019).
Os aminoácidos mais abundantes nas plantas são a L- glutamina
e o L-aspartato, entretanto, as concentrações dos aminoácidos são
muito diferentes entre as espécies vegetais, relacionadas aos estádios
do desenvolvimento e adaptação ao ambiente (KUMAR et ai., 2017),
com grandes variações entre os órgãos das plantas em função de suas
demandas metabólicas (WATANABE et ai., 2013). Os transportadores de
aminoácidos das membranas celulares são os principais reguladores
das concentrações dos aminoácidos nas diferentes partes das plantas
(YAO, 2020).
De fonna resumida, as funções de alguns aminoácidos no metabo-
lismo das plantas são discutidas a seguir.
O L-glutamato ocupa uma posição central no metabolismo dos
aminoácidos como substrato para a síntese de L-glutamina (ácido
L-glutâmico), sendo esta a principal doadora de NH2 e esqueleto carbônico

15
(estrutura de C do aminoácido sem o grupamento amida) para a síntese dos
demais L-aminoácidos e de outros compostos (KAN et ai., 2015), a exemplo
da síntese de clorofila, que tem início com a L-glutamina convertida em
ácido 5-aminolevulínico (ALA) pela ação da enzima ALA sintetase (WU
er ai., 201 9). O NH 2 do L-glutamato também pode ser transferido para
outros aminoácidos pela ação de uma ampla gama de aminotransferases,
por exemplo, para a síntese de L-prolina e do ácido gama-aminobutírico
(GABA) que se acumulam nas plantas em respostas aos estresses abióticos
(SCHERTL et ai., 2014).
A L-prolina é um aminoácido proteinogênico, que além de participar
dos processos de crescimento e desenvolvimento, desempenha um papel
central na resposta de adaptação das plantas ao ambiente, com sua síntese
aumentada sob estresses, especialmente o oxidativo. Nessas condições, a
L-prol ina pode atuar como um osmólito-soluto que contribui no ajustamento
osmótico para manter o gradiente de potencial hídrico e turgescência das
células, mas também pode atuar melhorando a estabilidade e integridade
das membranas e proteínas pelo seu efeito antioxidante, e como reserva de
C e N para o crescimento após o alívio dos estresses (KAHLAOUI et ai., 2015;
KISHOR er ai., 2015; SCHERTL er ai., 2014).
A glicina e a L-serina estão envolvidas na síntese de proteínas
e servem como precursores em uma variedade de vias biossintéticas,
incluindo de fosfolipídios, como os encontrados nas membranas celulares
(L-serina) e formação de purinas (glicina), que são bases nitrogenadas
que participam de inúmeros processos metabólicos, como a síntese do
DNA. Glicina e L-serina estão na base do metabolismo do Cedo N, com
a L-serina participando da ativação da enzima nitrato redutase (TAIZ et ai.,
201 7) e a glicina como precursora da enzima ALA sintetase para a síntese
de clorofila (CHATIERJEE; KUNDU, 2015). A glicina participa da mitigação
da fotorrespiração, que pode ocorrer por efeito de estresses abióticos,
especialmente de altas temperaturas, reduzindo a fixação do C02 ao reduzir
a carboxilação catalisada pela enzima do cloroplasto ribulose-1,5-bifosfato-
carboxilase/oxigenase (Rubisco) (KANG et c,I,, 2018; TIMM er ai., 2012).
A glicina também participa das respostas aos estresses abióticos por
ser precursora da glicina betaína, soluto que atua na proteção das células via
osmorregulação (GIRI er ai., 2011), cujo acúmulo participa dos mecanismos
de sinalização do sistema de defesa antioxidante das plantas, aumentando a
atividade das enzimas que degradam espécies reativas de oxigênio (TEIXEIRA
et ai., 2017), sendo estas espécies reativas (ex.: OH, 0 2, H20 2) responsáveis
pela degradação das membranas celulares (peroxidação lipídica), causando
por exemplo a degradação dos cloroplastos (HAYAT et ai., 2012).

16
 A L-arginina sintetizada a partir do glutamato, participa do transporte
de N pela sua alta razão N:C com 4 N para 6 C, sendo a precursora,
juntamente com a L-omitina, das poliaminas (putrescina, espermídina e
espennina), que são aminas relacionadas com a proliferação e diferenciação
celulares atuando no crescimento e desenvolvimento das plantas (CHEN et
ai., 2019; WINTER et ai., 2015). A L-asparagina atua também no transporte e
armazenamento do N (N:C = 2:4), acumulando-se em órgãos de reserva
como tubérculos e sementes (CURTIS el ai., 2018).
A L-alanina está envolvida na adaptação das plantas a períodos de
hipoxia (deficiência de oxigênio) que pode ocorrer em solos encharcados
(DAB; LIMAMJ, 2016), e juntamente com o L-aspartato são essenciais na
fotossíntese, principalmente em plantas C4 , relacionado ao expressivo
aumento da atividade da alanina e aspartato aminotransferases em tecidos
fotossinteticamente ativos (SCHULTER et ai., 2018).
Os aminoácidos de cadeia ramificada (L-leucina, L-valina,
L-isoleucina) servem como fontes de energia para as plantas. Suas vias
catabólicas semelhantes produzem intermediários ricos em energia, como
a acetil-Coenzima A. Entre outros processos, esses aminoácidos fornecem
energia durante os períodos de falta de luz prolongada e germinação
(GIPSON et ai., 2017).
Um exemplo da integração e complexidade no metabolismo dos
aminoácidos é o catabolismo da L-treonina e da L-metionina, servindo de
substrato para a síntese de L-isoleucina na regulação da sua homeostase
(JOSHJ et ai., 201 O). A regulação da homeostase de um aminoácido afeta o
nível de outros aminoácidos, principalmente sendo derivados da mesma
rota metabólica, como os sintetizados a partir do L-aspartato (L-lisina,
L-metionina, L-treonina e L-isoleucina) (YANG; ZHAO; LIU e1 ai., 2020n).
Dos aminoácidos que contém enxofre (L-metionina e L-cisteína),
a L-metionina participa em vários níveis no metabolismo, como
constituinte de proteínas e como uma molécula reguladora na forma
de S-adenosilmetionina (SAM), que além de transportadora de enxofre
pelo floema (TAN el ai., 201 O) é um composto chave da síntese do etileno
(POEL et ai., 2013 ).
A assimilação do enxofre pelas plantas ocorre pela redução do
sulfato a sulfeto, sendo incorporado à L-cisteína (MARSCHNER, 2012),
que além de transportador de enxofre confere ao aminoácido uma
série de funções relacionadas ao sulfeto, como a fonnação de clusters
(agrupamentos) de ferro e enxofre (Fe-S), que atuam como grupo prostético
(grupo inorgânico que confere estrutura à enzima) de diversas enzimas, a
exemplo da ALA-sintetase na síntese de clorofila e do cofator (molécula

17
não proteica necessária para a atividade da enzima) ferro/molibdênio da
enzima nitrogenase (HEEL; WIRTZ, 2011). As proteínas com c/usters Fe-S
são essenciais para vários processos fisiológicos, sendo encontradas nos
plastídios, mitocôndrias, citoplasma e núcleo (BALK; PILON, 2011).
A L-histidina desempenha um papel central no crescimento e
desenvolvimento das plantas. O seu radical imidazol, que pode alternar os
estados protonado (caráter ácido) e não protonado (caráter básico), permite
sua participação em reações de catálise ácido-básicas, estando presente
no sítio ativo de um grande número de enzimas. Também desempenha
papéis bioquímicos importantes como um nucleófilo (doador de par de
elétrons) na transferência de grupos fosforil (P032· ) que participam de
inúmeros processos fisiológicos, como em rotas de sinalização hormonal,
fotossíntese e metabolismo de açúcares. A L-histidina também atua como
ligante de íons metálicos em um grande número de metaloproteínas
(proteínas com um ou mais íons metálicos) (INGLE, 2011; PETERSEN et ai.,
201 O; TAIZ et ai., 2017). .
AL-tirosina, L-fenilalanina e o L-triptofano são os três anúnoácidos
aromáticos sintetizados a partir do ácido chiquímico como doador do anel
aromático (via do chiquimato). Esses aminoácidos estão ligados à síntese
de uma variedade de metabólitos e de vias anabólicas, como as de síntese
de pigmentos, hormônios e lignina (PARTHASARATHY et ai., 2018).
A L-tirosina pode ser modificada por diferentes enzimas, sendo
a precursora de inúmeros compostos do metabolismo secundário
que recebem sua estrutura cíclica, como o tocoferol e seus análogos
(a-tocoferol - vitamina E), lipídios solúveis que desempenham importante
papel antioxidante nas plantas (XU et al., 2019).
O L-triptofano, além de componente de proteínas, fornece
seu esqueleto carbônico/estrutura cíclica para inúmeros metabólitos
secundários das plantas, incluindo a auxina AIA (ácido indol-3-
acético), hormônio relacionado com a expressão da enzima H ..-ATPase
e expansão celular - e das indolaminas melatonina e serotonina, que
desempenham papéis importantes em todas as fases do ciclo de vida
da planta, incluindo a germinação, crescimento e desenvolvimento
(ERLAND; SAXENA, 2019).
A L-fenilalanina, além de componente de proteínas, é precursora
de vários compostos que são cruciais para a reprodução, crescimento,
desenvolvimento e defesa das plantas contra diferentes tipos de estresses.
Os seus compostos derivados incluem os fenilpropanoides, que são
constituintes de alguns dos conjuntos de metabólitos secundários mais
importantes, como as antocianinas e a lignina (PASCUAL et ai., 2018).

18
A lignina é sintetizada a partir da L-fenilalanina pela ação da enzima
fenilalanina amônia-liase (FAL), e a partir da L-tirosina pela enzima tirosina
amônia-liase (TAL), sendo a homeostase desses aminoácidos aromáticos
detenninante para o crescimento, desenvolvimento e adaptação das plantas
ao ambiente (LIU, 2012). O ácido salicílico, hormônio relacionado à resposta
imune das plantas a patógenos, também é sintetizado pela ação da FAL a
partir da L-fenilalanina transportada do cloroplasto para o citoplasma, via
transportadores nas membranas (LEFEVERE; BAUTERS; GHEYSEN, 2020).
2.4 Aminoácidos como moléculas sinalizadoras
A complexa regulação da homeostase de aminoácidos, integrando
síntese, degradação e transporte para suprir as demandas nas células
dos diferentes tecidos das plantas, acontece a partir da percepção
(sinalização) pela demanda por aminoácidos específicos, por energia
ou por compostos do metabolismo (PATRELLI; PILOT, 2014).
A regulação pode ocorrer pela oxidação de aminoácidos
para suprir em parte a demanda de energia durante a germinação e
emergência das plantas até que ocorra a fotossíntese. Nas células
fotossinteticamente ativas, a regulação pode ocorrer para a síntese de
proteínas como a Rubisco, com a g1icina sendo o seu aminoácido mais
presente, ou durante a senescência, com a degradação das proteínas
e seus aminoácidos sendo transportados das folhas para as sementes,
ou ainda, nas respostas de adaptação aos estresses bióticos e abióticos
(GALILI et ai., 2014; HILDEBRANDT et ai., 2015, SEVIDNIK, 2017).
A presença de sensores/receptores de aminoácidos e as vias de
sinalização correspondentes, ainda não são totalmente compreendidas
nas plantas, mas a regulação da homeostase e a percepção de estimulos
ambientais têm influência na expressão de genes relacionados aos
transportadores, alterando a permeabilidade e seletividade das
membranas aos aminoácidos (DINKELOO; BOYD; PILOT, 2018).
A expressão de genes relacionados ao metabolismo dos
aminoácidos é bem discutida, como na síntese de glutamina e asparagina,
sujeita a regulação em resposta a fatores ambientais como a luz, e fatores
metabólicos, como presença de sacarose e N . A luz induz a expressão
da enzima glutamína sintetase (OS - GLN2) e reprime a expressão dos
genes da asparagina sintetase (AS - ASN 1). A regulação recíproca dos
genes GLN2 e ASN l pela luz define o nível da transcrição (síntese do
RNA), portanto, da prevalência da síntese de glutamina em relação à
asparagina durante o dia (OLIVEIRA et {11., 2001 ).

19
 Patrelli e Pilot (2014) sumarizaram trabalhos identificando 37
genes que regulam transportadores de aminoácidos, e também de 48
enzimas do metabolismo dos aminoácidos, com expressões sendo
sinalizadas pela presença de açúcares, de aminoácidos específicos,
de N , luz, por estresses abióticos e bióticos, por micorrizas e pela
ação de hormônios.
Exemplos de sinalização são: o L-glutamato exógeno (aplicado) em
baixa concentração (50 µM) pode atuar como molécula sinalizadora, alte-
rando a arquitetura de raízes, e estimulando seu crescimento; a L-leucina,
L-prolina, L-lisina, glicina e o ácido aspártico podem desempenhar funções
de sinalização na expressão de genes de resposta aos estresses abióticos
(ALI et ai.• 2020); ou ainda da aplicação de baixas concentrações de ácido
L-glutâmico em solução (90µL L- 1) promovendo o aumento da atividade
da enzima NR e consequente aumento na concentração de L-aminoácidos
livres no tecido vegetal (RÕDER et ai., 2018).

3. Aminoácidos na agricultura
Na década de 1950, estudos utilizando ácidos aminopolicarboxí-
licos (ex. ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA e ácido dietileno-
triaminopentacético - DTPA) como agentes que lantes de íons metálicos
(Fe, Cu, Zn, Mn) indicavam o aumento da eficiência no fornecimento
desses nutrientes para as plantas em solução nutritiva (WEINSTEIN
et ai., 1954). Nos anos 80, além dos ácidos aminopolicarboxílicos, os
aminoácidos foram incorporados em formulações fertilizantes como
agentes quelantes, principalmente para aplicação foliar de nutrientes
(FERNÁNDEZ; SOTJROPOULOS; BROWN, 2013).
O efeito dos aminoácidos na complexação/quelação de íons, a
exemplo da reação de formação do quelato bis-glicinato ferroso a partir de
dois ligantes de glicina e um átomo de ferro na fom1a bivalente (ferroso)
(ASHMED, 2001) (Figura 5), é bem discutido na literatura, sendo os amino
quelatos usados na nutrição humana, animal e das plantas há décadas
(PAVAN, 2015).

Figura 5. Reação de quelação de um átomo de ferro por dois ligantes de glicina

Fonte: ASHMED, 2001

20
 Nas formulações de fertilizantes, a legislação brasileira contempla
os aminoácidos como agentes quelantes ou complexantes: compostos
químicos que formam moléculas complexas com íons metálicos,
adicionados ao produto para melhorar a sua estabilidade, durabilidade,
aplicabilidade ou facilitar o processo de produção. São classificados como
sendo do Grupo dos ÁcidosAminopolicarboxílicos, nesse especificamente
a glicina, e também classificados de forma genérica no Grupo dos
Compostos Naturais (BRASIL, 2018).
Portanto, a classificação como agentes quelantes/complexantes
na legislação não atribuí aos aminoácidos qualquer efeito direto no
metabolismo vegetal, ou relacionado à absorção pelas folhas ou raízes,
mas tão somente a beneficios para as formulações. Entretanto a eficiência
na absorção foliar e radicular dos nutrientes amino quelatos é bem descrita,
relacionada à sua característica de neutralidade, reduzindo interações
químicas limitantes à absorção (SOURI et ai., 2016; SOURI; HATAMIAN, 2019),
facilitando a difusão pelas cutículas das folhas (NUMATA et ai., 2018).
Ainda assim, o uso como agentes quelantes, com beneficios para
a estabilidade, durabilidade, aplicabilidade das formulações e para a
absorção de nutrientes pelas plantas, não atribuí aos aminoácidos dos
amino quelatos presentes em fertilizantes qualquer efeito direto no
metabolismo vegetal.
Nesse sentido, o efeito fisiológico da aplicação especificamente de
L-aminoácidos livres (aminoácidos que não estão ligados a peptídeos,
proteínas ou em amino quelatos) é contemplado pela 1N 61 (BRASIL,
2020), relacionado à sua bioatividade: "efeito benéfico que o produto
biofertilizante apresenta sobre o todo ou partes das plantas cultivadas". A
absorção e bioatividade dos L-aminoácidos livres é discutida no item 5.

4. Obtenção de L-aminoácidos livres

-
Os L-aminoácidos livres são geralmente obtidos por três processos:
pela hidrólise de materiais proteicos, por processos biológicos micro-
bianos, e pela síntese química (D'ESTE;ALVARADO-MORALES;ANGELIDAKI,
2018). Esta última sem abrangência pela legislação de biofertilizantes, na
qual os aminoácidos devem ser obtidos de fontes naturais.
4.1 Hidrolisados de proteínas
Os hidrolisados de proteínas são produzidos geralmente pelo uso de
enzimas ou por hidrólise química de uma variedade de resíduos animais
e vegetais, com a fonte de proteínas e o processo de produção afetando
fortemente as características químicas dos hidrolisados (NARDI et ai., 2015).

21
 O processo enzimático é baseado na ação de enzimas hidrolíticas,
como amônia-liases, L-aminoácido desidrogenases, entre outras,
permitindo a conservação da forma L dos aminoácidos livres. São
exemplos, a extração enzimática a partir da proteína de peixe com as
e,
enzimas alcalase e neutrase (RAMAKRISHNAN ai. , 2013), ou a partir do
colágeno pela enzima pepsina (VIDAL et ai., 2018), e também da biomassa
de plantas com elevado teor proteico (COLLA et ai., 2015), como a partir do
farelo de soja utilizando diferentes proteases (LJCERES, 2012).
A hidrólise química ácida é um processo agressivo realizado em alta
temperatura(> 121 ºC) e pressão(> 220,6 kPa) usando os ácidos clorídrico
e sulfúrico, enquanto a hidrólise alcalina é um processo menos complexo
em que as proteínas são solubilizadas por aquecimento seguido pela adição
de agentes alcalinizantes, como o hidróxido de potássio (PASUPULETI;
BRAUN, 201 O). As hidrólises químicas atacam todas as ligações peptídicas,
levando a um alto grau de hidrólise das proteínas (alto teor de aminoácidos
livres), porém, com o risco de destruição de vários aminoácidos. Por
exemplo, o triptofano é geralmente destruído com hidrólise ácida, também
a cisteína, serina e treonina podem ser perdidos (COLLA et ai., 2015).
Outro aspecto crítico da hidrólise química é o aumento da salinidade
do hidrolisado, e principalmente o risco da conversão de aminoácidos livres
da forma L para a forma D (racemização), tomando-os biologicamente
inativos (COLLA et ai., 2015).
4.2 Aminoácidos obtidos por processos biológicos
A maioria dos processos industriais para a produção de
L-aminoácidos livres é baseada em fermentação aeróbia ou anaeróbia,
com vários microrganismos sendo usados para converter os açúcares, o N
e outros nutrientes presentes em um substrato, como o melaço da cana-de-
açúcar, em um amplo espectro de aminoácidos. Processos fermentativos
produzem exclusivamente L-aminoácidos, sem risco de racemização
(UGIMOTO, 201 O). Entre os microFganismos comumente usados para
a produção de L-aminoácidos por fermentações estão as bactérias
Corynebacterium glutamicum e Escherichia co/i (D'ESTE; ALVARADO-
MORALES; ANGELLDAKI, 2018) e a levedura Saccharomices cerevisiae
(MALANEY; TANNER; RODRIGUES, 1991).
Recentemente, a obtenção de L-aminoácidos livres de microalgas,
organismos unicelulares fotossintetizantes produzidos em sistemas abertos
ou em biorreatores, tem recebido atenção (BALLESTEROS-TORRES et ai.,
2019; MÓGOR et ai., 2018), sendo esses microrganismos capazes de produzir
biomassa rica em L-aminoácidos que podem ser usados em diferentes

22
setores, como suplementos alimentares, produtos farmacêuticos e para
agricultura (RONGA cr ai., 2019).

5. Absorção e bioatividade de L-aminoácidos livres

Como apresentado no item 2.1, as plantas podem absorver
L-aminoácidos livres da solução do solo (NÃSHOLM; KIELLAND; GANETEG,
2009) e distribuir para tecidos próximos ou distantes, como novas raízes em
crescimento ou folhas (HlLDEBRANDTet ai., 2015; YAO, 2020).
Diferentemente das raízes, imersas na solução do solo e perme-
áveis (especialmente as radicelas) (MARSCHNER, 2012), nas folhas
a absorção de uma solução pode ocorrer diretamente pela cutícula,
tricomas e estômatos, de forma variável em função da espécie vegetal e
idade das folhas, sendo a difusão facilitada em folhas novas com cutí-
culas menos espessas, e influenciada pelas condições ambientais, como
a umidade relativa do ar e temperatura. A baixa umidade relativa e alta
temperatura limitam a difusão (FERNÁNDEZ; SOTIROPOULOS; BROWN,
2013). A absorção foliar de L-aminoácidos livres em solução por plantas
com folhas cerosas, com tricomas, foi relatado por Nyman et ai. (1987).
Como apresentado na Figura 3, os L-aminoácidos tem 'R'
apoiares (Gli, Ala, Vai, Leu, Ile e Met), polares não carregados ou
neutros (Ser, Pro, Tre, Cis, Asp, Gln, Trip, Fen e Tir), polares carregados
negativamente (Asp e Glu) e polares carregados positivamente (Lis, Arg
e His). Entretanto em solução aquosa os aminoácidos livres tem caráter
anfótero, pois comportam-se como ácido e como base formando íons
dipolares, com o grupamento carboxila ionizando-se, liberando próton
e adquirindo carga negativa; enquanto o grupamento amina ioniza-se
aceitando próton e adquirindo carga positiva. Este comportamento
depende do pH do meio aquoso em que o aminoácido se encontra: em
meio ácido os aminoácidos livres tendem a adquirir carga positiva, em
meio básico tendem a adquirir carga negativa (NELSON; cox, 2018).
A cutícula das folhas pode apresentar componentes lipofílicos
como ceras e cutina, majoritariamente hidrofóbicos apoiares e, polissa-
carídeos hidrofílicos com alta polaridade e capacidade de interações de
ligação com prótons (FERNÁNDEZ et ai., 2016; FERNÁNDEZ et ai., 2017).
Portanto, considerando o caráter anf6tero dos aminoácidos e as altera-
ções de suas cargas em solução, aliada à capacidade de ligação dos
componentes polares das cutículas, o pH da solução pode influenciar a
difusão dos aminoácidos livres pelas cutículas (ARAND et ai., 2010).
A absorção e a metaboJização de L-aminoácido livre em solução
aplicado às folhas foram relatadas no trabalho clássico de Beale, Gough

23
 e Granick (1975), com o ácido L-glutâmico (L-glutamina) marcado
com isótopo C 14 sendo pulverizado em cevada, identificando-se que
o rádioisótopo foi incorporado ao ácido aminolevulinico (ALA) na
biossíntese de clorofila, sendo essa uma das funções metabólicas da
L-glutamina (item 2.3).
A absorção, metabolização e efeitos fisiológicos de L-aminoácidos
livres aplicados em espécies agrícolas tem sido tema de inúmeros
trabalhos científicos, a exemplo da aplicação de L-glutamato, L-cisteina,
L-fenilalanina e glicina, tanto nas folhas quanto em sementes de soja
(Glycine max), promovendo o aumento da síntese de enzimas do sistema
antioxidante das plantas (TEIXEIRA et ai., 2017); do uso de L-prolina para
mitigação de estresse salino em trigo (Triticum aesüvum) (BEKKA;
BELBACHIR; DJEBBAR, 20)8); ou uso de L-arginina e L-glutamina
promovendo crescimento, aumento da produtividade e de sólidos solúveis
em bulbos de cebola (SHAFEEK et ai.• 2012).
A 1N n. 0 6 I estabelece que produtos biofertilizantes de
aminoácidos devem ser obtidos por fermentação ou hidrólise de
materiais orgânicos naturais. Entretanto, grande número de trabalhos
científicos utilizam aminoácidos de padrão analítico (PA), como
os citados acima, limitando as referências de trabalhos de pesquisa
adequadas ao escopo da Instrução Nor.mativa.
Alguns exemplos de trabalhos com L-aminoácidos obtidos de
materiais orgânicos naturais são o da aplicação foliar de um fermentado
pela bactéria C. glutamicum contendo 30% em volume do ácido
L-glutâmico em plantas de batata (So/anum luberosum), promovendo
o aumento da atividade da enzima nitrato redutase com o consequente
aumento no conteúdo de aminoácidos livres, proteínas e clorofila nas
folhas (RÔDER et ai., 2018); o da aplicação foliar de um fermentado da
levedura Saccharomyces cerevisiae contendo L-aminoácidos livres,
promovendo o crescimento de mudas de tomate, aumento no volume
radicular., no teor de clorofila e expansão das folhas (GEMIN et ai., 2018a);
o de aplicações foliares de hidrolisado proteico contendo glicina, e
os L aminoácidos prolina, ácido glutâmico, alanina, arginina e ácido
aspártico, promovendo incremento ~m massa e diâmetro de brócolis
(BETTONI et ai., 2013); ou ainda, o uso de um fermentado bacteriano com
L-aminoácidos livres reduzindo os efeitos do metabólito fitotóxico
do ácido aminometilfosfônico, acumulado em função da aplicação do
glyphosate em soja resistente ao herbicida (ZOBIOLE et ai., 2010).
Na Tabela 1 são relacionados trabalhos utiliz.ando L-aminoácidos
livres, suas fontes e seus efeitos, sendo obtidos de materiais orgânicos naturais.

24
Tabela 1. Fonnas de obtenção, de aplicação e feitos de L-aminoácidos livres em
diferentes cultivas

€ultivos Efeitos Referências

~9res

Aumento do volume dns ml1.cs,

Fermentado de levedura Mudns de GEMIN et al.
crcsc imento dn pnrte nérca,
Aplicação foliar tomate (2018a)
numenlo no teor de clorofila

Promoção do crescimento, da
Fermentado de levedura
eficiência fotossintética, da FRANCESCA et ai.
Aplicação por irrigação Tomate
viabilidade do pólen, do número e (2020)
localizada
, produçilo de frutos

Fermentado bacteriano Mudns de Promoçilo do crescimento, GEMIN etal.

Aplicação foliar folhosas aumento na slntcse de aminoácidos (2018b)

Aumento de produtividade,
Fermentado bacteriano RÔDER etal.
Batata atividade enzimática, síntese de
Aplicação foliar (2018)
, aminoácidos, proteinas e clorofila

Fermentado bacteriano Abobrinha

! Aumento da conservação WELINSKJ et a/.
1 pós-colheita no processamento
Aplicação foliar italiana ' (2017)
1 mínimo
1

1 Aumento do volume das raízes,

Fermentado bacteriano ' Mudas de aumento ou redução da parte aérea RÔDEReta/.
Aplicação foliar repolho ' dependente da dose, aumento de (2015)
1
clorofila

Fermentado bacteriano
Redução de efeito fitotóxico por I ZOBIOLE et ai.
Aplicação foliar e Soja
glypliosa/e (2010)
sementes
- - - - - - -- - - -- - - - - - - -- - - -- -- - - . - - - - - - 1

Hidrolisado proteico . "dad I BETIONJ ct ai.

Brócolis Aumento de massa e produllv1 e ( 0l3)

------1
Aplicação foliar 2

Hidrolisado proteico
Milho
l: Mitigaçilo de estresse salino ERTANle/al.
I (2013)
Via solução nutritiva
,------ - ----
1
- -- -- -
COLLAetal.
Hidrolisado proteico
Aplicação foliar
t Tomnte i Incremento nn produção 1

1 (2017)
1 1

---,--- ~ WILSON· -
Hidrolisado proteico Pepino I Promoção do crescimento l AMlRKHANI;
_Aplicado_e~se~entes_ _'_ _ _ _ L _____________ TAYLOR(2018)

25
 ©ultivos Efeitos Referências

Hidrolisado proteico Maior crescimento, teor de

Alface XU; MOU (2017)
Aplicado ao solo clorofiln e maior troco gasosa

Hidrolisado proteico Aumento de protclnas nas folhas e TEJADA et ai.

Milho
Aplicação foliar produtividade (2018)

- - -------------- ----------

Hidrolisado proteico Melhor desenvolvimento de raízes CÁCERES et ai.

Morango 1
Aplicação via gotejo e biomassa das plantas (2009)

Hidrolisados proteicos Revisão bibliográfica sobre efeitos NARDI era/.

Diversos
Aspectos gerais fisiológicos · (2015)

Hidrolisados proteicos Cultives , Revisão bibliográfica sobre efeitos ' COLLA et ai.
Aspectos gerais olerícolas fisiológicos e filotécnicos (2015)

Hidrolisados Proteicos Revisão bibliográfica sobre efeitos

Diversos I
Aspectos gerais fisiológicos e fitotécnicos ABOBAITA <2020>

- - - l- - - - - -- -
Mudas e 1 Promoção do crescimento,
Extrato da biomassa da • d
CU1IIVO e aumento da produtividade e dos 1
. MÓGOR et ai.
m1croalga Spirol/ina sp. 1 bet b
r ti r
Ap icação O mr
erra a
olerfcola
teores de clorofila, aminoácidos e 1 (2018)
1 proteínas

------ ---
Aminoácidos obtidos
I
de biomassas de Revisão bibliográfica sobre efeitos RONGA et ai.
Diven.os
diversas espécies de j fisiológicos e fitot~cnicus (2019)
microalgas

6. Determinações de L-aminoácidos livres

Em um produto biofertilizante de aminoácidos, a garantia deve
ser dada pelo seu teor (% em peso) de aminoácidos livres (BRASIL, 2020).
Metodologias resumidas para a determinação de aminoácidos livres são
apresentadas nos capítulos UI e V.

26
 A Figura 6 apresenta o resumo gráfico do efeito de L-aminoácidos
livres como biofertilizantes.

Promovem o crescimento
dn parte néren e raízes

Redistribuídos
pelo apoplasto e
Participam da simplasto
síntese de clorofila

Adaptação e
recuperação de
estresses abióticos Incorporados ao
metabolismo
Estimulo de enzimas Convertidos a outros
do metabolismo do N aminoácidos
Aumento da síntese
de aminoácidos

Absorvidos pelas
raízes

Figura 6. Resumo gráfico do efeito de L-aminoácidos livres como biofertilizantes

Linha vennelhas representam a absorção de aminoácidos e caminhamento pelo fluxo
transpiratório. Linhas azuis representam o transporte de aminoácidos pelo floema.

27
 CAPÍTULO II

EXTRATOS DE MACROALGAS MARINHAS COMO

BIOFERTILIZANTES
Mateus 8. de Freitas, Roberta Paulert, César Freitas Ribeiro, Marlon C. de Borba,
Aline C. Velho e Mareie) J. Stadnik

1. Introdução
Cerca de 70% do nosso planeta é coberto pelo biorna marinho
que possui uma grande diversidade de espécies, muitas delas ainda
desconhecidas. Neste biorna, podemos encontrar as macroalgas que são
indivíduos eucarióticos, pluricelulares, macroscópicos e autotróficos que
fonnam um grupo de organismos heterogêneo contendo mais de 10.000
espécies. Geralmente, as macroalgas são classificadas de acordo com sua
pigmentação, em três grandes grupos: Chlorophyta (verdes), Rhodophyta
(vermelhas) e Phaeophyta (marrons). Algas pertencentes a esses grupos
são utilizadas há séculos para alimentação humana e de animais e como
fertilizantes na agricultura. Além dessas aplicações clássicas, as macroalgas
vêm sendo utilizadas na fabricação de cosméticos e medicamentos devido
à sua diversidade única de moléculas bioativas, que possuem atividades
antioxidante, anti-inflamatória, anticâncer e antienvelhecimento. Além
desses efeitos descritos, as algas apresentam grande potencial para a
obtenção de compostos fitossanitários e/ou com efeito estimulante e/
ou protetor de plantas, na promoção do crescimento e desenvolvimento
vegetal e na ativação de mecanismos fisiológicos contra diferentes tipos
de estresses abióticos (CRAIGIE, 2011 ; KHAN et ai., 2009; LEANDRO; PEREIRA;
GONÇALVES, 2020; STADNIK; DE FREITAS, 2014).
Os extratos de macroalgas marinhas se constituem atualmente
em um dos principais componentes bioativos presentes em diferentes
formulações de potencial uso como biofertilizantes (STADNlK; ASTOLFI;
DE FREITAS, 2017). Neste capítulo, o termo biofertilizante é adotado para
designar o produto comercial classificado, de acordo com a legislação
brasileira, como aquele que contém princípio ativo ou agente orgânico,
isento de substâncias agrotóxicas, capaz de atuar, direta ou indiretamente,
sobre o todo ou parte das plantas cultivadas, elevando a sua produtividade,
sem ter em conta o seu valor hormonal ou estimulante (BRASIL, 2004).
Sem o propósito de esgotar o tema, abordaremos neste capítulo
algumas características, componentes e formas de obtenção de extratos

29
das macroalgas mais exploradas dentro de cada um dos três grandes grupos
(verdes, vermelhas e marrons). Além disso, são sumarizados resultados
relacionados com a promoção do crescimento e desenvolvimento
vegetal, bem como do aumento de produtividade devido à aplicação
dos principais extratos e seus produtos comercializados e os possíveis
mecanismos envolvidos.

2. Macroalgas verdes
As macroalgas verdes pertencem a um grupo parafilético de
organismos com características diversas que podem ser encontrados
em habitats marinhos, de água doce e terrestres. Junto com as plantas
terrestres (Embryophyta) as algas verdes formam o clado Viridiplantae
(plantas verdes). Este clado é dividido em dois outros: Streptophyta
e Chlorophyta. O primeiro é formado por algas verdes de água doce
(Charophyta) e plantas terrestres. O segundo, por sua vez, contém
algas verdes uni, pluricelulares e coloniais de água salgada e doce
e de ambientes terrestres. O clado Chlorophyta é composto por três
grandes classes que apresentam uma grande diversidade de espécies
(Chlorophyceae, Ulvophyceae e Trebouxiophyceae) e duas linhagens
(Chlorodendrophyceae e Pedinophyceae). Dentro de Chlorophyta são
encontrados os gêneros de algas verdes testadas/estudadas e, em alguns
casos, até comercializadas como promotores do crescimento de plantas.
Dentre estes, pode-se destacar os gêneros Uiva (incluindo Enteromorpha;
Figura l) e C/adophora (FANG et ai., 2017; LELIAERT et ai., 2012; STADNIK; DE
FREITAS, 2014).
Os gêneros Uiva e Cladophora contêm, respectivamente, cerca
de 130 e 183 espécies de algas que habitam ambientes de água salgada
ou doce de todos os continentes, incluindo a Antártica. Esta ampla
distribuição ao longo d0 planeta é atribuída à sua tolerância e adaptação
a fatores externos como luminosidade, salinidade e temperatura. Devido
a esta plasticidade, algas destes gêneros estão frequentemente associadas
ao fenômeno chamado de maré verde. Neste caso, o crescimento destas
alg~s é acelerado (de 10 a 50%) devido à eutrofização do ambiente pela
atividade humana. Este fenômeno ocorre anualmente em vários países,
inclusive no Brasil, podendo causar grandes prejuízos (MANTIU et ai., 2020;
MICHALAK; MESSYASZ, 2021).
Devido à sua composição única e a presença de grandes quantidades
de vitaminas, elementos traço e minerais, quando comparada a plantas,
espécies dos gêneros Uiva e Cladophora vêm sendo amplamente
estudadas nos mais variados campos de conhecimento. Com isso,
se verificou que extratos e/ou compostos isolados de algas destes

30
gêneros apresentam atividade antimicrobiana, antivirai, antioxidante,
anticoagulante, anti-inflamatória, anticâncer, indutora de resistência
e promotora de crescimento de plantas. Além disso, estas algas vêm
sendo utilizadas como alimento há muitos anos em países asiáticos e,
recentemente, foram autorizadas para consumo humano em países do
ocidente como a França (MANTRI et ai., 2020; MICHALAK; MESSYASZ, 2021;
STADNIK; DE FREITAS, 2014).
Extratos de algas pertencentes ao gênero Uiva vêm sendo amplamente
testados nas mais variadas espécies de plantas visando incrementar a
germinação, o crescimento e a produção de plantas (Tabela 1). Assim, por
exemplo, o extrato líquido de Uiva lach1ca L. (0,2%) aumentou em 2,4 vezes
a porcentagem de germinação e reduziu em cerca de 5% o tempo médio
de germinação de sementes de tomate (Solanum lycopersicum L.). Quando
pulveriz.ados semanalmente nas folhas, estes extratos aumentaram em cerca
de 15% o comprimento das raízes e a altura de plantas de tomate cultivadas
em casa de vegetação. A aplicação via irrigação, por sua vez, aumentou o
comprimento das raízes, a altura de plantas e a massa fresca em cerca de
20% (HERNÁNDEZ-HERRERA et ai., 2014). Em outro trabalho, concentrações
crescentes de extrato líquido (variando de 20 a 100%) de Uiva jlexuosa
Wulfen aumentaram a porcentagem de germinação, o comprimento da
plúmuJa e da raiz e reduziram o tempo médio de germinação de sementes
de tomate-cereja (S. /ycopersicum L.). Além disso, o tratamento de sementes
com os extratos incrementou a produção, os teores de sólidos solúveis, ácido
ascórbico, licopeno e fenóis em frutos em cerca de 150% (CHANTHINI et ai.,
2019). O incremento na germinação, no crescimento e na produção de plantas
tem sido associado à presença de inúmeros compostos bioativos nos extratos
e/ou a melhoria da associação com microrganismos presentes no solo (CALVO;
NELSON; KLOEPPER, 2014; CHANTIIINI et ai., 2019; HERNÁNDEZ-HERRERA el ai.,
2014; KHAN et ai., 2009; MISHRA et al., 2020).
Além da promoção do crescimento e do incremento na produção,
extratos de algas podem mitigar efeitos de estresses abióticos (Tabela 1). O
extrato aquoso de U. lactuca (5%) aumentou a germinação de cebola (A/lium
cepa L.) submetidas a altas temperaturas, estresses salino e hídrico em cerca de
30, 1Oe 30%, respectivamente, quando comparado com sementes não tratadas
(MUHIE et ai., 2020). A embebição de sementes em extrato aquoso de Uiva
fasciata Delile (100%) aumentou a área foliar e a massa seca de plântulas de
feijão-caupi ( Vigna sinensis (L.) Savi) em cerca de 40 e 70%, respectivamente,
sob estresse salino (HUSSEIN et ai., 2021 ). A presença de moléculas bioativas (ex.
betaínas) e as alterações metabólicas induzidas pelos extratos de algas, têm
sido apontados como responsáveis pelos efeitos positivos observados em
plantas sob condições de estresses abióticos (CALVO; NELSON; KLOEPPER,
2014; HUSSEIN et ai., 2021 ).

31
 Dentre os compostos presentes no extrato de algas, os polissacarídeos
também podem afetar processos fisiológicos de plantas (Tabela 1). Por
exemplo, a embebição de sementes de feijão (Phaseo/us vulgaris L.) em
uma solução (10 mg mL- 1) do polissacarídeo extraído das paredes celulares
de algas do gênero Uiva (ulvana) incrementou a germinação em cerca de
35% (PAULERT et ai., 2009) e a emergência de plântulas em cerca de 45% (DE
BORBA; DE FREITAS; STADNIK, 2019). Polissacarídeos extraídos de Uiva rígida
C. Agardh e U. lactuca aumentaram em cerca de 15% a porcentagem e a
velocidade de germinação de sementes de tomate quando incorporados em
meio de cultura na concentração de 0,1 mg mL·1 (MZIBRA et ai., 2021). Além
disso, estes polissacarídeos incrementaram a altura das plantas, a massa seca
da parte aérea e das raízes, e o conteúdo de clorofila a e b de plantas de tomate
em cerca de 40% quando aplicados semanalmente via irrigação (O, 1 mg
mL·1) em casa de vegetação (MZIBRA et ai., 2018; MZIBRA et ai., 2021). Nestas
condições, a aplicação dos polissacarídeos via irrigação foi mais eficiente do
que via foliar na promoção do crescimento de plantas de tomate.
Apesar de o mecanismo ainda não estar completamente elucidado,
o efeito dos polissacarídeos algais em plantas pode estar associado ao seu
reconhecimento por receptores e ao posterior aumento na mobilização e
assimilação de nutrientes e/ou ao fornecimento de elementos essenciais
como, por exemplo, o enxofre (DE BORBA; DE FREITAS; STADNJK, 2019;
MZIBRA et ai., 2018). Adicionalmente, os polissacarídeos poderiam quelar
cátions e/ou se ligar a moléculas de água favorecendo assim a formação de
géis e a aeração do solo (MZTBRA et ai., 2021 ).
Apesar de pouco estudado, se comparado a Uiva, extratos de algas
do gênero Cladophora também vêm sendo testados como promotores do
crescimento de plantas. Por exemplo, a irrigação do solo com uma solução
de 5% do pó seco e triturado de Cladophora prolifera (Roth) Kütz. 15 dias
após o transplante de mudas de tomate incrementou a produção total em
cerca de 230% em condições de campo (CAVALLOetal., 2006). Por outro lado,
a embebição de sementes de soja (G/ycine max (L.) Merrill) com um extrato
aquoso de Cladophora g/omerata (L.) Kütz. nas concentrações de 50 e 100%
reduziu em cerca de 50% a formação de plântulas consideradas normais
(MlCHALAK et ai., 2018). A redução na porcentagem de plântulas normais
pôde ser explicada pela concentração utilizada do extrato. Sabe-se que
concentrações elevadas de extratos de algas e, consequentemente, de alguns
de seus componentes podem diminuir a germinação e o desenvolvimento
inicial de plântulas (GHADERlARDAKANl et ai., 2019; KHAN el ai., 2009).

32
 Tabela 1. Principais efeitos reportados de extratos de algas verdes do gênero Uiva e alguns de seus polissacarídeos na fisiologia e no crescimento
de plantas
· i&~fer!nd•
DE BORBA; DE FREITAS;
PSP Feijão s Aumento do germinnçilo de sementes e do emergência de plãntulas STADN IK. 2019; PAULERT et
___________ ai. (2009) __
EA I Fei'ão cau i
,- - 1 J p
IS IAum~nto dn ó~ folinr, mnss_n scc? e dos nlvcis de clorofila "n .,,. uI, ,.Pm
condições nonno1s e sob eslrcsse salmo _ _ _
11,
HUSSEIN et ai. (202 1)
U. fasciata Reduçllo nn concentmçilo de metnis pesados no solo. Aumento da germi-
Rabanete AHMED; GHEDA; ISMAIL
AS So nnçi\o de sementes, comprimento, massas seca dn parte aérea e ralzes, área (2020)
folinr e conteúdo de clorofilos e cnrotcnoidcs _ _ _ ___ _ _ . _.
1 1
Aumento dn genninuçilo de sementes, nJtura de plantas e dos nlveis de MZJBRA et ai. (2018);
PSP Tomate So
-·-·····--a e_ b_
clorofila _ _____________ MZ
__ lBRA et_a_l._(20_2_1)
U. fene.strata I EA Trigo-sarraceno !._ Aumento do com.trimento de ralzes - - ~ - , ~ - - ___ ANl~~MOV e~ai. (2013_) __
U.jlexuasa EA Tomate S Au~ento d_e g~nni~nçilo de s~men!es, cresciment~ da parte aérea e ralzes, CHANTHINI et ai. ( 2019)
t,J
t,J - - - - --+-- ---+- - - -- --+- ---+ sólidos soluve1s, ácido asc6rb1co, hcopeno e fen61s em frutos __ _ _ ___ __
Cebola Aumento da_gennina~o de sementes submetidas n altAs temperaturas e a MUHIE et ai. (2020)
EA s estresses salmos e hfdncos ~ ---- --- -- -- - -
Feijão mungo Aumento de germinação de sementes, comprimento de raízes e parte aérea, CASTELLANOS-BARRIGA et
EA s massa seca e fresca e niveis de clorofila em plàntulas ai. (2017)
EA Aumento do genninação de sementes, crescimento da parte aérea e radi- HERN ÁNÕ)~H·EHERREÁ RAEZ
et a1. (20 l 4 , RN N0 •
U. lacruca ENA. liomate
• 1
S, So, F cuIar, a mosso seca de p1antu os e ptantas e conleu' do de lerpenos e ac1
, ·d
os HERRERA et ai. (2016);
f-- - + - - - - -~ - --l--grax
_ o_s_e_m_p_l_
nn_w_ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ __ _ EL-SHEIKH et ai:_ (202~ ) ____ _

PSP Tomate So I
Aumento da altura de planta, mnssn seco de ralzes e niveis de clorofila MZIBRA et ai. (2018, 2021 )
aeb
Tomate Aumento da genninação de sementes, nJturo de planta, número de folhas, 1MZIBRA et ai. (2018, 2021 )
U. rígida PSP So,F
massa seca de raízes e parte aérea, níveis de clorofilas a e b _ _ _ _ _.......,__ _ _ _ _ _ _ _ ______
_ _ _ _..i__ __.1~- - --l...-- ..1------------
1Tipo de material (TM): AS: alga seca; EA: extraio aquoso; PSP: polissacnrídeos semi purificados; ENA: Extraio neutro alcalino
2 Via de aplicação (VA): F: foliar, R; raiz; S: semente; So: solo
Figura 1. Exemplares de algas verde ( Ulvafasciata, A), vennelha (Kappaphycus alvarezii,
B) e marrons (Laminaria japonica, C; Ecklonia maxima, D e Ascophy/lum nodosum, E).
Fontes e locais das imagens: A (Mareie! J. Stadnik, Florianópolis, SC, Brasil); B (Leila
Hayashi, Florianópolis, SC, Brasil); C (Luís Bennemann, China); D (Mareie! J. Stadnik,
Cidade do Cabo, África do Sul); E (Nelson Horowitz, Saint Maio, França)

34
3. Macroalgas vermelhas
As macroalgas vermelhas pertencem ao filo Rhodohyta e estima-se
a existência de 6.200 a 7.000 espécies no ambiente marinho, sendo mais
diversas do que as marrons e verdes (ISMA I L et ai., 2020). Os gêneros de algas
vermelhas mais cultivadas globalmente incluem Eucheuma sp., Gracilaria
sp., Kappaphycus sp., e P01phyra sp. (LÂI-ITEENMÂKI-UUTELA el ai., 2021 ).
Embora a maioria dos extratos utilizados sejam produzidos a partir
de espécies macroalgas marrons, muitos produtos formulados com extratos
de algas vermelhas podem ser encontrados no mercado (SANGHA et ai.,
2014). Extratos dessas algas são fontes promissoras de substâncias com
influência no metabolismo, promoção do crescimento, do desenvolvimento
e da produção vegetal (EL BOUKHARI et ai., 2020). Estes produtos ocupam
um papel de destaque na biotecnologia agrícola, bastante utilizados na
horticultura (MELO er ai., 2020) e mais comumente possuem extratos aquosos
solúveis dos gêneros: Kappaphycus sp., Gracilaria sp., Laurencia sp. ou
Gelidum sp. (BATIACHARYYA et ai., 2015).
Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ex Silva, é uma espécie de
alga vennelha intensamente cultivada nas Filipinas, Indonésia, Malásia e
Tanzânia como fonte de matéria-prima para a indústria de alimentos (Figura
1. HURTADO et ai., 2019). No Brasil, teve seu cultivo experimental inicial em
1995 e comercialmente a partir de 1998 a 2003 no Rio de Janeiro (HAYASHI;
REIS, 2012). Também é cultivada em São Paulo (CASTELAR et ai., 2009) e no
Nordeste (de fonna artesanal como, por exemplo, na Paraíba) (ARAÚJO er
ai., 2013) e, em 2020, a alga teve seu cultivo comercial autorizado no litoral
do estado de Santa Catarina. Desta forma, a maricultura de K . alvarezii,
uma alga tropical nativa das Filipinas, tem recebido destaque porque
muitos trabalhos demonstram que seu extrato líquido pode aumentar o
crescimento e a produção de inúmeras espécies agrícolas (KUMAR er ai.,
2020; PATEL et ai., 2018; PRAMANICK et ai., 2020; ZODAPE el ai., 201 l).
O extrato líquido de Kappaphycus sp. é composto por
macronutrientes (potássio, magnésio, cálcio, fósforo e nitrogênio) e
micronutrientes essenciais (ferro, manganês, zinco e níquel); além
de outros componentes como colina, honnônios, glicina betaína e
vitamfoas (PRAMANICK et ai., 2020). A aplicação foliar do extrato líquido
de Kappaphycus sp. (concentração de 7,5%) aumentou significativamente
o crescimento e o rendimento de plantas e a qualidade dos grãos de arroz
(O,yza saliva) devido a melhor qualidade fisiológica (PRAMANICK et
ai.. 2020). Quando aplicado em plantas de pimentão ( Capsicum annuum
L.), formulação comercial contendo 0,5% de extrato de K. alvarezii e
Sargassum vulgare C. Agardh, aumentou a condutância estomática e a

35
concentração de nutrientes (N, P, K, Ca, Mg e S) em folhas e a produção
de frutos (MELO et ai.. 2020).
Extratos líquidos de K. alvarezii e Gracilaria edulis (S.G.Gmel.)
P.C.Silva vêm sendo testados na promoção do crescimento do trigo
(Triticum aestivum L.) (Tabela 2. SHAH e/ ai., 2013; ZODAPE et ai., 2009)
e milho (Zea mays L.). O extrato líquido obtido de algas frescas de K.
alvarezii aumentou a taxa fotossintética em 26% e a biomassa em plantas
de milho tratadas via aplicação foliar (MONDAL ai ai., 2014). Em outro
trabalho, extratos líquidos de K. alvarezii e G. edulis aumentaram a altura
e peso seco de plantas e os teores de clorofila (LAYEK et ai., 2019).
O extrato líquido de K. alvarezii aplicado via foliar, também
aumentou significativamente os parâmetros agronômicos de plantas de
milho cultivadas em vasos como: tamanho e número de grãos por espiga,
com exceção do peso de 100 grãos que não foi alterado. A concentração de
radicais livres do oxigênio diminuiu concomitantemente com o aumento
de enzimas antioxidantes e, em destaque, a produtividade foi elevada em
14 a 23% (TRIVEDI et ai.. 2018). Além disso, a aplicação destes extratos pode
aumentar o acúmulo de proteínas em grãos de mi lho (LAYEK et ai., 2019).
Para compreender o mecanismo de ação e os processos biológicos
em plantas de milho tratadas com extrato líquido de K. alvarezii, Kumar
et ai. (2020) avaliaram RNA mensageiro e genes presentes em células de
raízes que foram irrigadas com o extrato da macroalga vermelha. Um total
de 896 genes tiveram aumento na expressão, entre eles, os relacionados
com o crescimento das raízes, metabolismo do nitrogênio, sinalização via
ácido giberélico e auxinas, e também, de genes ligados ao desenvolvimento
de sementes. Em contrapartida, mRNAs relacionados à degradação de
amido e sacarose apresentaram redução na expressão. A concentração de
alguns fitohormônios também aumentou em plantas de tomate tratadas
com o extrato líquido de K. alvarezii. Houve um acréscimo de l ,6x nas
concentrações de ácido abscísico e 6,7x no acúmulo de citocinina zeatina,
promovendo maior crescimento das plantas e mitigação em situações de
estresse (AGARWAL et ai., 2016).
O crescimento e desenvolvimento de plantas, bem como o aumento
significativo da produtividade, foi observado com a utilização do extrato
líquido de K. alvarezii em quiabo (Abe/moschus escu/entus (L.) Moench)
(ZODAPE et ai., 2008). Além disso, em experimentos conduzidos a campo
com aplicação foliar de extrato com 5% de K. a/varezii aumentou o
rendimento (de 11,5 a 56,6%) e a qualidade em quatro variedades de
banana (Musa sp.) (KARTHIKEYAN; SHANMUGAM, 2014).

36
 Tabela 2. Principais efeitos reportados de extratos de algas vennelhas e alguns de seus polissacarfdeos na fisiologia e no crescimento de plantas

u.
.-~•...:."lft.: •. •: .. Referênçiã

Ge/idium serrulatum ENA Tomate F Aumento de altura, biomassa seca e número de folhas RAMKJSSOON et ai. (20 17)

Gelidium pectinutum EA Pepino F Aumento de crescimento vegetativo e rendimento AHMED; SHALABY (201 2)

PRAMANICK;
Gracilaria sp. 1 EA 1 Feijão mungo IF 1 Aumento de rendimento
1 BRAHMACHARI; GHOSH
(2013); PRAMANICK et ai.
(2016)

LIU et ai. (2019)

CM
Grateloupia filicina 1 PSP 1 Arroz 1s 1 Acúmulo de prolina e enzimas relacionadas ao
estresse salino
....J
Gracilaria dura IEA 1 Trigo F Aumento de ácido abscísico e tolerância a seca SHARMA et ai. (20 19)

Gracilaria textorii 1 EA
I Tomate, chili e S,F Aumento da produtividade RAO; CHAITERJEE (20 14)
berinjela

Aumento de altura de planta, peso seco e teores de

Graci/aria edu/is 1 EA 1 Milho F 1 LAYEK et ai. (20 19)
clorofila., nitrogênio, proteínas e micronutrientes

Aumento de germinação e crescimento de plantas e

EA Feijão-caupi e milho S,So 1 HUSSEIN et ai. (202 1)
efeitos frente ao estresse salino

Laurencia obtusa
AS Milho So Aumento de altura e número folhas SAFINAZ; RAGAA (20 13)

EA 1 Trigo 1s I Aumento de germinação, crescimento e enzimas IBRAHIM (20 16)

relacionadas ao estresse salino
 EA 1 Arroz IF 1 Aumento du produçilo e dn qunlidnde dos grilos PRAMANICK et ai. (2020)

KARTHJKEYAN;
EA 1 Banana IF 1 Aumento dn produtividade
SHANMUGAM (2014)

Acúmulo de nitrogênio, protelnns e micronutrientes.

EA 1Milho 1F, So
l Aumento de nlturo das plantas, peso seco, porcentagem
de clorofiln e taxn fotossintética, enzimas antioxidantes,
produtividade, expressão de genes relacionados ao
TRJVEDI et ai. (20 I 8);
KUMAR et ai. (2020);
MONDAL et ai. (2014);
Kappaphycus alvarezii 1
crescimento das ralzes, metabolismo do nitrogênio, LAYEK et ai. (2019)
sinalização via ácido gibcrélico e auxinas

~ 1 Aumento da atividade fotossintética, do crescimento

00 1 EA 1 Quiabo IF 1 ZODAPE et ai. (2008)
vegetal, produtividade e qualidade

EA 1 Tomate
I Aumento da concentração de ABA, SA, genes PR e
IF AGARWALeta/.(2016)
MAPK2

ZODAPE et ai. (2009); SHAH

EA 1 Trigo IF 1 Aumento da qualidade dos grilos e da produtividade
et ai. (2013);

PRAMANICK;
1 BRAHMACHARI; GHOSH
Kappapl,ycus sp. 1 EA 1 Feijão-mungo IF 1 Aumento da produção
(2013); PRAMANICK et ai.
(2016)
1
Tipo de material (TM): AS: alga seca; EA: extrato aquoso; PSP: polissacarídeos semi purificados; ENA: Extrato neutro alcalino
: Via de aplicação (VA): F: foliar, S: semente; So: solo
 Graci!aria é um gênero de algas vennelhas de importância econômica
para obtenção de ágar para uso alimentar e por apresentar substâncias que
estimulam o crescimento de plantas. Algas deste gênero têm sido cultivadas
com sucesso principalmente em Taiwan, China, Vietnã, Tailândia, Chile e
Indonésia (FAO, 2011). Um aumento da produtividade com a utilização do
extrato líquido de Gracilaria sp. foi demonstrado em milho (LAYEK et ai..
2015; SJNGH etal., 2016), arroz (O,yza saliva L.) (além de melhorar a qualidade)
(PRAMANICK et ai., 2020), feijão ( Vigna radia/a, Vigna mungo) (PRAMANICK;
BRAHMACHARI; GHOSH, 2013; PRAMANlCK et ai., 2016), berinjela (So/anum
melongena L.), tomate e chili (Capsicum sp.) (RAO; CHATIERJEE, 2014).
A aplicação foliar do extrato líquido de Gracilaria dura (C.Agardh)
J.Agardh pode aumentar a tolerância à seca, aumentando a biomassa e
o rendimento através de alterações fisiológicas (potencial osmótico
e conteúdo de prolina) associadas à retenção de água (com redução da
abertura dos estômatos). Importante destacar que estas mudanças foram
associadas ao significativo acúmulo de ABA e expressão de genes de
biossíntese. O extrato da macroalga vermelha atuou na performance do
trigo em laboratório e também em condições de campo. A pulverização
foliar do extrato de Gracilaria ( 5%) aumentou a tolerância à seca das
plantas de trigo em experimento conduzido a campo e está relacionado ao
aumento de teor de clorofila em 35,4%, comprimento e número de espigas
e pela indução da expressão dos genes TaNCED3. J, TaERD2, TaHAJ1 e
DREB (SHARMAet ai., 2019).
Vinoth et ai. (2012), com a utilização de extratos de G. edulis,
demonstraram que o meio de cultivo MS para micropropagação in vitro,
quando suplementado com extrato líquido da alga, pode aumentar a
germinação das sementes de tomate (de 80 para 100%), induzir múltiplos
brotamentos a partir do expiante, além de induzir a formação de raízes.
Extratos de outros gêneros de algas vermelhas como, por exemplo,
Gelidium e Laurencia também vêm sendo testados na promoção do
crescimento de plantas sob condições normais e de estresses abióticos.
O extrato aquoso e alcalino da alga vermelha Gelidium serrulatum
J.Agardh na concentração de 0,5% foi pulverizado duas vezes com 15
dias de intervalo, em plantas de tomate promovendo o crescimento,
com aumento da altura, biomassa seca das plantas e também do número
de folhas (RAMKISSOON et ai., 2017). O extrato líquido de Gelidium
peclinatum Schousb. ex Mont. aumentou o crescimento vegetativo
e a produtividade de pepino (Cucumis sativus L.) em experimento a
campo (AHMED; SHALABY, 2012). Hussein et ai. (2021) investigaram o
efeito do extrato aquoso (20 g L· ') de Laurencia obtusa na germinação
e crescimento das plântulas, e mitigação do estresse salino em feijão

39
caupi e milho. Para isso, as sementes foram embebidas ou o extrato foi
aplicado na irrigação.
A embebição das sementes de trigo, por 18 horas, com o extrato
bruto aquoso da macroalga vermelha na concentração de I 0%, aumentou
significativamente a porcentagem de germinação, crescimento e os
níveis de enzimas envolvidas na atividade antioxidante (CAT e SOO)
em plântulas sob estresse salino (IBRAHIM, 2016). Por outro lado, quando
o pó da alga seca L. obtusa foi acrescentado ao solo, houve promoção
do crescimento, aumento da altura das plantas (6,2%) e do peso seco
(6,9%) de milho (SAFINAZ; RAGAA, 2013).
Moléculas parcialmente purificadas a partir de extratos de algas
vermelhas também vêm sendo testadas na promoção do crescimento de
plantas sob condições de estresse. Oligômeros e polissacarídeos obtidos
da alga Grateloupia filicina (J.V. Lamour.) C.Agardh estimularam o
desenvolvimento de plântulas de arroz quando utilizados na concentração
de O, 1 mg mL· 1• Os tratamentos propiciaram o acúmulo de prolina e
enzimas relacionadas ao estresse oxidativo (SOO e POD), favorecendo as
plântulas em condições de estresse salino (LlU et ai.• 2019).

4. Macroalgas marrons
As macroalgas marrons possuem grande biodiversidade. Por isso,
apresentam extensa classificação e dispõem de diferentes substâncias
com moléculas bioativas, que podem ser utilizadas em diferentes áreas
industriais. Também conhecidas como algas pardas, as algas marrons
pertencem ao supergrupo SAR, subreino Stramenopiles ou Heterokonta,
divisão Ochrophyta, classe Phaeophyceae e são distribuídas em cerca
de 308 gêneros (SILBERFELD; ROUSSEAU; REVIERS, 2014). Dentre esses,
destacam-se Ascophyllum, Ecklonia, Fucus, Laminaria e Sargassum, os
quais são frequentemente encontrados em regiões costeiras de oceanos
com águas frias (Figura 1. BARTSCH et ai.. 2008; KAJN, 1979; MAC MONAGAlL
et ai., 2017; MILLEDGE; NlELSEN; BAJLEY, 2016; SILBERFELD; ROUSSEAU;
REVLERS, 2014). Algumas das substâncias bioativas que se encontram
em algas pardas são fucoidanas (MJYASI-UTA; MIKAMI; HOSOKAWA, 2013),
alginalo (FERTAH el ai., 2017; RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2007), betaínas
(BLUNDEN et ai., 2010), ágar e laminarana (MAC MONAGAIL et ai., 2017;
MILLEDGE; NLELSEN; BAILEY, 2016; RJOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2007).
Algas pardas podem ser utilizadas conforme seu gênero, espécie
e peculiaridade de suas moléculas. Na medicina oriental, relatam-se os
seus usos há milênios, de modo especial Laminaria japonica Aresch. e
Sargassum fusiforme (Harvey) Setchell, as quais apresentaram eficácia

40
no tratamento de algumas doenças humanas (CHENGKUI; JUNFU, 1984;
MIYASHITA; MIKAMI; HOSOKAWA, 2013). 0 alginato é um polissacarídeo
estrutural localizado na parede celular de algas pardas. Ele é uma excelente
fonte de sódio e possui propriedades gelificante e estabilizante, por isso,
é largamente utilizado na indústria alimentícia, farmacêutica e médica
(FERTAH el ai., 2017).
As algas geralmente são extraídas dos seus habitats naturais (MAC
MONAGAIL e1 ai., 201 7). Estima-se que entre 2009 e 2014, a Europa e as
Américas colheram aproximadamente l .236.976 e l . 726.666 toneladas
de algas marrons, respectivamente (MAC MONAGAIL et ai., 2017). Em
2016, somente de L. japonica foram colhidas aproximadamente 8,2 mil
toneladas no mundo (FAO, 2016).
Os extratos de algas marrons podem ser obtidos por diferentes
métodos, como hidrólise alcalina, alcoólica ou ácida e ruptura celular
sob pressão ou fermentação (ARIOLI; MATrNER; WlNBERG, 2015;
BATIACHARYYA et ai., 2015). Além disso, o método e tempo de extração
podem influenciar o tamanho e peso do polímero, como na obtenção de
molécula bioativa de fucana, que são oriundas de algas marrons do gênero
Fucus e Laminaria (ALE; MIKKELSEN; MEYER, 2011; FERNANDO et ai., 2019).
Aplicações de alginato de baixo peso molecular, despolimerizado por
radiação, aumentaram a germinação de sementes, bem como estimularam
o crescimento de feijão-fava (Vicia/aba L.) (EL-MOHDY, 2017). Os extratos
de algas marrons podem ser processados para comercialização em pó ou
na forma líquida.
Na agricultura, extratos, substâncias isoladas e produtos à base
de algas marrons vêm sendo utilizados para estimular o crescimento
de plantas e potencializar o rendimento de culturas agrícolas (fabela
3. BAITACHARYYA et ai., 2015; KHAN el ai., 2009). Além de algas do gênero
Ascophyllum e Ecklonia, destacam-se com potencial uso na agricultura
as macroalgas marrons Sargassum, Laminaria, Macrocystis, Durvillaea
e Fucus, entre outras (BATIACHARYYA et ai., 2015; KHAN et ai., 2009). Testes
com extratos aquosos de Sargassum wighlii Greville ex J.Agardh em
feijão-caupi mostraram que a menor concentração testada (20%) aumentou
a germinação de sementes e o crescimento de plântulas (SNASANKARI et ai.,
2006). A embebição de sementes (12h) e a posterior pulverização de plântulas
(20 dias após a semeadura) com extrato de S. vulgare (3 mL L- 1) aumentou
o crescimento vegetativo, rendimento e níveis de fósforo, manganês e
potássio em folhas e raízes de rabanete (Raphanus sativus L.) (MAHMOUD
et ai., 2019). A aplicação de extrato de Laminaria spp. em plantas de milho
estimulou o crescimento de raízes e aumentou a atividade de esterases, a
composição mineral e quantidade de açúcares em folhas de milho (ERTANI

41
 Um produto comercia] à base de L.japonica também aumentou
et ai., 201 8).
a concentração de glucosinolatos em brócolis (Brassica oleracea var ilalica
L.) após quatro irrigações do extrato líquido, nas concentrações de 0,5 e 1 g
L·' (HELLÍN et ai., 2018).
Além de aumentar a genninação de sementes, o crescimento e o
rendimento de plantas, extratos de algas marrons vêm sendo testados na
pós-colheita. O uso de produto à base de Sargassum mostrou-se eficiente
também para conservação pós-colheita de laranja (Cilrus x sinensis
Macfad.). Este produto aumentou os teores de sólidos solúveis, açúcares
totais e açúcares redutores em laranjas armazenadas em temperatura
ambiente ou refrigeradas, melhorando a qualidade do fruto (OMAR, 2014).

42
 Tabela 3. Principais efeitos reportados de extratos de algas marrons e alguns de seus polissacarideos na fisiologia e no crescimento de plantas

Aumento de germinnçilo de sementes e

EA 1Feijilo-caupi 1 F,S, So l crescimento de plnntns, protcinns, carboidrato, 1 SIVASANKARI et ai. (2006); KU~IAR et ai. (20 12)
lipídios e pigmentos folossintéticos em folhas e
onlecipnçllo de ílomçllo
Sargassum wightii
1 1 1 1
Aumento de comprimento de plântula. número
EA 1 Fcijilo-dc-cordn IF 1 de folhas, peso fresco, fcnólicos totais. proteína 1 VASANTHARAJA et <si. ( 2019)
e ílavonoidcs

Sargassum sp. IEA 1Larnnjn IF

1Au~cnto cm teores de sólidos solúveis. açúcares IO!'vlAR ( 2014 )
totms e redutores
~
w
1 1 1 1
Aumento de crescimento vegetativo,
S. mlgare IEA 1 Rabanete i F, S 1 rendimento e valores nutricionais de folha 1 MAHMOUD et ai. (2019)
e raiz

S. lsorridum 1 1 1
1Aumento de germinação de sementes. peso seco
e comprimento de plântula

ENA 1 Feijão-mungo 1 F, S j DI FILIPPO-HERRERA et ai. (2019)

Aumento de germinaçilo de sementes,
Macrocystis PJrifera 1 1 1 1 comprimento, peso fresco e seco de plãntula e
comprimento de raiz
 Aumento de crescimento de raiz, atividade de
Laminaria sp. IEA 1 Milho Ir 1 cstemse,composiçilo mineral e teores de açúcar 1 ERTANI et ai. (20 18)
nas folhas

IAminaria japonica IAS 1 Brócolis l so 1 Aumento na conccnlmçào de glucosinolatos HELLÍN etal. (20 18)

1Aumento de área foliar, diâmetro de caule,

Durvillea potaJontm I ENA 1Brócolis IF 1 MAITNER et ai. (2013)
biomassa e número de folhas

1Aum~nto de matéria seca da planta e formação

Fucus velisulosos 1Feijão-mungo 1SHARMAetal. (2012)
IENA IF de raizes
~
~
· Aumento de germinação de sementes,
Roserrvigea 1 comprimento do caule e raiz, número de raízes
intricata IEA 1Feijão guar 1So laterais, número de folhas, pigmentos foliares e
1THIRUMARAN et ai. (2009)

massa de plantas

Aumento de crescimento das plantas e conteúdo

Lessonia nigrescens PSP Trigo R de clorofila. 1 ZOU et ai. (2019)
Melhora contra estresse salino

1
Tipo de material (TM): AS: alga seca; EA: extrato aquoso; PSP: polissacarideos semi purificados; ENA: Extrato neutro alcalino
2
Via de aplicação (VA): F: foliar; R: raiz; S: semente; So: solo
 Algas pardas do gênero Macrocystis, Durvillaea e Fucus também
demonstram estimular o crescimento e rendimento em cultivas agrícolas.
Em experimentos com plantas e sementes de feijão-mungo ( Vigna radiata),
extratos alcalinos de Macrocystis pyrifera (L.) C.Agardh e Sargassum
honidum Setchell & N.L.Gardner, aumentaram a genninação de sementes
(OI FIUPPO-HERRERA et ai., 2019). Adicionalmente, o extrato de M pyrifera
aumentou o comprimento, peso fresco e seco de plântulas, bem como o
comprimento de raízes. A aplicação de extrato alcalino de Fucus vesiculosus
L. em feijão-mungo estimulou significativamente o aumento de matéria seca
de plantas (SHARMAet ai. , 2012).
A mistura de diferentes espécies de algas marrons pode melhorar a
atividade biológica se comparada aos extratos isolados. Assim, por exemplo,
a mistura de extratos de Atf. pyrifera e de outras algas aumentou a genninação
e o crescimento de feijão-mungo quando comparado às espécies isoladas (DI
FILIPPO-HERRERA et ai., 2019). O produto da mistura de Durvillaea potaton,m
(Labillardiere) Areschoug e Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis aumentou a
área foliar, diâmetro de caule e biomassa de brócolis em até 70%, 65% e 145%,
respectivamente (MATINER et ai., 2013). Além disso, este produto aumentou o
número de folhas em plantas, independentemente da concentração testada (2,5
ou25 Lha·1).
O modo de ação de produtos à base de algas marrons é fortemente
correlacionado com a sua composição. Seus efeitos podem variar confonne a
presença de minerais, polissacarideos e honnônios nas algas (BATTACHARYYA
et ai., 2015; KHAN et aL, 2009). Extratos de Laminaria hyperborea (Gunnerus)
Foslie e Sargassum muticum (Yendo) Fensholt podem conter altas quantidades
de minerais, como cálcio, ferro, magnésio e potássio (SHARMA et ai., 2012), os
quais podem servir de nutriente para plantas (BATTACHARYYAet ai., 2015). Além
disso, encontrou-se alto teor de ácido indolacético (AIA) em extratos de F.
vesiculosus, esse tipo de auxina estimula o crescimento de plantas (KHAN et ai.,
2009; SHARMAetal.,2012). Outros hormônios também são encontrados em algas
marrons como citocininas em Fucus serratus L. (STIRK; VAN STADEN, 1997) e
ácido giberélico, ácido abscísico e AIA em Laminaria spp. (ERTANI et ai., 2018;
SCHAFFELKE, 1995). O extrato de Laminaria spp. pode aumentar a atividade
de esterases em milho. Essas enzimas atuam como indicadores precoces de
embriogênese somática e estão envolvidas na organogênese (ERTANI et ai.,
2018). Aplicações com extratos de Sargassum wightii aumentaram teores de
clorofila em feijão-caupi (STVASANKARI et ai., 2006). Este incremento, por sua
vez, pode potencializ.ar a fotossíntese e o desenvolvimento da planta (KHAN et
ai., 2009). A betaína é outra molécula com capacidade de estimular o crescimento
de plantas (DU JARDIN, 2015; KHAN et ai., 2009), a mesma é encontrada em A.
nodosum, Laminaria digita/a (Huds.) Lamouroux, L. hyperborea e F. serratus
(BLUNDEN et ai., 2010). Desta maneira, há um grande potencial na utiliz.ação de

45
algas marrons na agricultura, pois as mesmas possuem substâncias capazes de
estimular o crescimento e rendimento das plantas, além de ser um insumo que
não causa impacto ambiental.
4.1 Ecklonia maxi11ia
A macroalga marrom Ecklonia maxima (Osbeck) Papenfüss (Filo
Ochrophyta, Classe Phaeophyceae) cresce abundantemente em águas frias
ao longo da costa oeste da África do Sul (Figura 1. BOLTON et ai., 2012). Sua
biomassa, desde 1970, tem sido utilizada para a formulação de produtos
agrícolas. Aproximadamente l .000 toneladas de peso fresco desta alga são
colhidos anualmente para fabricação de extrato de E. maxima (Kelp Produtos
Ltd, Simon, África do Sul) (ANDERSON et ai., 2007). Este produto é obtido
por meio de um processo que utiliza alta pressão e baixas temperaturas
denominado "cold cell burst process" no qual nenhum aditivo químico ou
calor é usado durante o processo de extração para não afetar os compostos
ativos ali presentes (PAPENFUS et ai., 2012).
O extrato líquido de E. maxima é composto principalmente por car-
boidratos ( 16,9 g kg· 1); aminoácidos (2,5 g kg- 1); vitaminas Bl (0,9 mg kg- 1) ,
B2 (0,1 mg kg·1), C (20 mg kg·1) e E (0,7 mg kg· 1); macronutrientes (ni-
trogênio 3,6 g kg·1, fósforo 8,2 g kg·1, potássio 7,2 g kg·1, cálcio 0,8 g kg- 1
e magnésio 0,2 g kg·1) ; micronutrientes (ferro 13,6 mg kg·1, manganês
8,4 mg kg· 1, boro 0,24 mg kg·1, zinco 4,2 mg kg· 1 e cobre 0,2 mg kg· 1)
e fitormônios (auxinas 11 mg kg- 1, citocininas 0,03 mg kg·1 e relação
auxina/citocinina de 367/ 1) (COLLA et ai. , 2017; SOSNOWSKI et ai., 2017).
Variações sazonais nos níveis de poliaminas (putrescina e espermina)
(PAPENFUS et ai., 2012) e de ácido abscísico, giberelinas e brassinosterói-
des (STTRK et ai., 2014) têm sido encontrados em extratos de E. maxima.
Diversos trabalhos na literatura indicam que as plantas tratadas com
extratos de E. maxima apresentam maior produtividade, maior conteúdo de
compostos orgânicos e minerais e melhor tolerância a estresses abióticos
(Tabela 4). Esses efeitos positivos relacionados às moléculas bioativas
no extrato, estimulam processos fisiológicos como a fotossíntese, e por
consequência, melhoram o rendimento e a qualidade nutricional dos cultivos
(DI MOLA et ai., 2019; KULKARNI et ai., 2019; ROUPHAELet ai., 2018).
Plantas de abobrinha (Cucurbila pepo L.) pulverizadas quinzenal-
mente com extrato de E. maxima exibiram um maior rendimento de frutos
e produção de biomassa aérea (ROUPHAEL et ai., 2017). O tratamento com o
produto aumentou a taxa de troca gasosa foliar, os níveis de clorofila e reduziu
o tamanho dos estômatos (menor comprimento e largura da célula-guarda) e
acelerou seu funcionamento. Os frutos, por sua vez, exibiram maior conteúdo
de matéria seca e de sólidos solúveis totais, os quais foram associados com
uma melhor assimilação de C02, conteúdo de clorofila e estado nutricional da
planta (alto acúmulo de K e baixo Na) (ROUPHAEL et ai., 2017).

46
 A pul verização foli ar com produto contendo E . maxima
aumentou significativamente os teores de pig mentos foliares,
bi omassa e valor nutri cional de plantas de alface (Lacluca s aliva L.)
( DI MO LA e1 ai., 20 19: OI MOLA et ai., 2020) alfafa (Medicag o s aliva L.)
(SOSNOWSKI et ai., 201 7; SOSNO WSKI et ai., 20 19) e espinafre (Spinacia
oleracea L.) (KULKARN I et ai., 201 9; ROUPHA EL et ai., 201 8). Folhas de
a lface tratadas com o extrato al ga) apresentaram ma iores teores de
clorofila a e b, carotenóides e at ividade antiox ida nte (DI MO LA et ai.,
2019, OI MOLA e, ai., 2020). Plantas de alfafa tra tadas tiveram maior
número de brotos por m2 (SOSNOWSKI e1ai., 20 17), conteúdo de fósforo,
potássio, zinco e manganês (SOSNOWSKI et al., 2014) e melhor eficiência
do aparato fotossintético em relação ao controle (SO SNOWSKI et ai.,
2019). Em resumo, esses trabalhos evidenciaram que o tratamento
com o extrato de E. maxima melhorou o crescimento, rendimento,
qualidade nutricional e a resistência de plantas folhosas em condições
de estresses abióticos, particularmente associados com o aumento da
eficiência fotoquímica e maior biossíntese de pigmentos foliares.
Aumento significativo no rendimento comercial de tubérculos de
batata (Solanum luberosum L.) (WADAS; DZIUGrEL, 2020) e de raízes de
cenoura (Daucus carola L.) (SZCZEPANEK et ai., 2017; WSZELACZYNSKA
et ai., 2019) foram observados após a pulverização foliar com produto
contendo E. maxima. Plantas de batata tratadas tiveram um aumento no
diâmetro do tubérculo (~ 30 cm) (WADAS; ozruGIEL, 2020), enquanto as
plantas de cenoura exibiram um aumento na distribuição do tamanho
de raízes médias (1 ,9 a 3,8 cm de diâmetro) e raízes grandes (3,8 a
5,0 cm) em 30,5% e 15,8%, respectivamente (SZCZEPANEK er ai., 201 7).
O uso do extrato também aumentou o conteúdo de açúcares totais,
açúcares redutores, carotenoides e vitamina C em raízes de cenoura
(WSZELACZYNSKA et ai., 2019) e conferiu maior tolerância ao calor às
plantas de batata (WADAS; DZIUGIEL, 2020).
Sementes de feijão-mungo ( Vigna mungo L.) e de milho (Zea mays
L.) embebidas com eckol, um composto fenólico isolado a partir da alga
E. maxima, apresentaram maior capacidade de genninação e emergência
de plântulas quando comparadas ao controle (RENGASAMY et ai. , 2015a;
RENGASAMY et ai., 2015b). Além disso, a embebição de sementes de feijão-
mungo promoveu um incremento no número de raízes, comprimento do
caule e peso de plântula (RENGASAMY et ai., 2015a). Em milho, por sua vez,
a embebição de sementes aumentou o comprimento de colmo e de raiz,
o número de raízes seminais, peso de plântula, acúmulo de proteínas,
fenólicos totais, iridoides glicosídeos e a atividade de a-amilase e maiato
desidrogenase (RENGASAMY et ai., 2015b).

47
 Tabela 4. Principais efeitos reportados de extratos de Ecklonia maxima nn fisiologia e crescimento de plantas

Aumento de número de frutos por planta, assimilação de CO2, teores de 1 ROUPHA EL et ai. (20 17)
clorofila, sólidos solúveis totais e matériu seca cm frutos

PCL 1 Alface IF 1 Aumento de biomassa, teores de clorofila e carotenoides e atividade 1 OI MOLA et ai. (2019); DI
antioxidante, cspccialrncntc sob estresse de nitrogênio MOLA et ai. 2020)

PCL 1 Alfafa IF 1 Aumento de número de brotos, massa seca, teor de clorofila a e b, fósforo, 1SOSN OWSKI et ai. (2014);
potássio, zinco e manganês na biomassa aérea e maior tolerância à seca SOSNOWSKI et ai. (201 7);
SOSNOWSKI et ai. (20 19)
PCL Batata F Aumento da produtividade e tolerância ao calor WADAS; DZIUGIEL (2020)
~
00

PCL 1 Cenoura IF 1 Aumento de volume, acúmulo de açúcares, carotenoides e vitamina C em ISZCZEPANEK_et ai. (201 7);
raízes WSZELACZYNSKA et ai.
(2019)
PCL Espinafre F Aumento de área foliar, número e comprimento de folhas, massa seca, ROUPHAEL et ai. (201 8);
conteúdo de proteínas, ácido ascórbico, ácido sinápico, potássio e KULKARNl et ai. (2019)
magnésio, maior teor de clorofilas e atividade de fenilalanina amônia Iiase
PCL Feijão F Aumento do número de sementes e de vagens por m2, conteúdo de 1 KOCIRA et ai. (2017); KOCIRA
proteínas, flavonoides, polifenois e antocianinas em sementes et ai. (2018); KOCIRA et ai.
(2020)
MP Feijão-mungo s Aumento de número de raízes, comprimento do caule e peso de plântula RENGASAMY et ai. (2015a)
 MP l Milho IS 1 Aumento de peso de plântula, comprimento de colmo e raiz, nú mero de j RENGASAMY el ai. (20 15b)
ralzes seminais e conteúdo protefnas, fenól icos totais, iridoides glicosf-
deos e atividade de a-amilose e maiato desidrogenase em raízes
PCL 1 Quiabo So Aumento de vigor dos plflntulos em condições limitantes de nitrogênio, PAPENFUS et ai. (2013)
fósforo e potássio

PCL 1 Repolho IF 1 Aumento de área fo liar, número de folhas, comprimento, massa fresca e RENGASA!vlY et ai. (201 6)
seca da parle aérea e raiz, conteúdo de clorofila, carotenoides, proteína,
prolina e atividade de a-amilase e mirosinase
PCL 1 Soja IF 1 I
Aumento de produtividade, altura de planta, número de vagens por planta e KOCIRA et ai. (20 19)
de sementes por m 2, conteúdo de fenólicos totais, flavonoides e antociani-
~
nas em sementes
\0
PCL 1 Trigo IF 1 Aumento de biomassa de raiz, número e peso de grãos por espiga, peso de SZCZEPANEK el ai. (2018);
mil grãos, e acúmulo de fósforo e potássio nos grãos SZUMILO et ai. (2019)

PCL Tomate F Aumento de produtividade e conteúdo de cálcio em frutos COLLA et ai. (20 17)

1
Tipo de material (TM): MP: molécula purificada; PCL: produto comercial liquido
2
Via de aplicação (VA): F: foliar; R:raiz; S: semente; So: solo
 Aumento na produtividade e qualidade nutricional do feijão-comum
(Phaseo/us vu/garis L.) (KOCIRA et ai., 2017; KOCIRA el ai., 2018; KOCIRA et
ai., 2020), da soja (Glycine max L.) (KOCIRA et ai., 2019) e do trigo (Trilicum
aestivum L.) (SZCZEPANEKetal.,2018; SZUMILO etal., 2019) foram observados
após a aplicação foliar de extratos de E. maxima. Plantas de feijão tratadas
exibiram maior número de sementes e de vagens por m2 (KOCIRA et ai.,
2017), maior conteúdo de antocianinas (KOCIRA et ai., 2018) proteínas,
flavonoides e polifenois em sementes (KOCIRA et ai. , 2020). Em soja, a
aplicação desse extrato aumentou a altura de planta, número de vagens
por planta e de sementes por m2 assim como o conteúdo de compostos
fenólicos totais, flavonoides e antocianinas em sementes (KOClRAeta/., 2019).
No trigo, a pulverização foliar sequencial aumentou o número de grãos
por espiga e peso de nül grãos, a biomassa das raízes e o conteúdo de
fósforo e potássio nos grãos quando comparados ao controle (SZCZEPANEK
et ai., 2018). Além do trigo comum, plantas de trigo duro (T. durum L.) e de
trigo espelta (T. aestivum subsp. spelta) tratadas com o extrato também
exibiram maior número de espigas por planta, maior número e peso de
sementes por espiga (SZUMILO et ai., 2019). Segundo Shah e/ ai. (2013), o
aumento na concentração de nutrientes em grãos de trigo após a aplicação
do extrato da alga é resultado de um aumento na taxa de fotossíntese ou
senescência retardada das duas últimas folhas, o que aumentaria, assim, o
fornecimento de fotoassimilados para a planta (KOCIRA et ai., 2020).
No estudo conduzido por Rengasamy et ai. (2016), a pulverização
foliar com eckol ( 1Q-6 M) aumentou significativamente o comprimento,
massa fresca e seca da parte aérea e da raiz, área foliar e número de folhas
em plantas de repolho (Brassica oleracea var. capitala). O tratamento
também aumentou os teores de pigmentos fotossintéticos (clorofilas a,
b, total e carotenoides}, conteúdos de proteínas, prolina e glicosídeos
iridoides e na atividade de a-amilase e mfrosinase em comparação com as
plantas não tratadas. No tomate (Solanum lycopersicum L.), a aplicação
foliar de E. maxima melhorou a produtividade e promoveu maior acúmulo
de cálcio nos frutos (COLLA et ai., 2017).
4.2 Ascophyllum nodosum
Ascophyllum é um gênero de rnacroalgas marinhas marrons (Filo
Ochrophyta, Classe Phaeophyceae) que pertence à ordem Fucales e família
Fucaceae (Figura 1). A ordem possui diversos representantes, sendo a
espécie Ascophyllum nodosum uma das mais importantes. A descrição
original (basiônimo) desta macroalga era Fucus nodosus L. (l 753) pela
sua grande semelhança com as espécies do gênero Fucus. No entanto,
um século depois a espécie foi transferida para o gênero Ascophy/lum e
reclassificada como Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis (1863), sendo
esta a nomenclatura atualmente utilizada (GUIRY; GUIRY, 2021).

50
 Como todas as outras espécies da ordem Fucales, a macroalga
A. nodosum possui apenas uma única geração sexual. Contudo, é
praticamente impossível identificar todas as fases do ciclo de vida, uma
vez que está constantemente cm processo de regeneração a partir de sua
base. Estima-se que as frondes de A. nodosum podem durar até 15 anos
e os seus respectivos povoamentos podem durar de 30 a 40 anos. Vale
salientar que os povoamentos densos e gregários são essenciais para a
longevidade desta macroalga (PEREIRA et ai.. 2020).
A espécie é predominante nas águas frias e costas rochosas do
Atlântico Norte. Sua ocorrência estende-se entre o Canadá, Groenlândia,
Islândia, Noruega (latitude 70°N) até os limites que englobam a região
Norte de Portugal e Nova Iorque nos EUA (latitude 40ºN). Apesar da
espécie ser única e predominante nos oceanos, algumas variedades de
A. nodosum podem ser encontradas em distintos habitats. Ascophyllum
nodosum var. mackayi é encontrada em praias e lagos da costa oeste da
Irlanda e da Escócia e Ascophyl/um nodosum var. sc01pioides é abundante
em New Hampshire (EUA).
A espécie é uma fonte natural de macro e micronutrientes, sendo
o Na, Mg, K Cl e S04 os principais que compõem a sua estrutura
(PEREIRA er ai., 2020). Dentre os compostos orgânicos podemos encontrar
ácidos algínicos, lipídios, aminoácidos, betaínas, proteínas, fibras,
fenóis, polissacarideos sulfatados, oligossacarideos, além de pigmentos,
vitaminas e hormônios (WALLY et ai., 2013). Em geral, os carboidratos
tipicamente encontrados são conhecidos como fucoidanas (polímeros
contendo fucose), laminaranas (P-1,3-glucanas), ascophyllanas, celulose,
ácidos alginicos e manitol. As algas também são constituídas de fibras de
celulose e alginatos (insolúveis e solúveis em água) (EL-SAID; EL-SIKAILY.
2013). Alginato é o termo geralmente usado para os sais de ácidos algínicos,
mas também pode se referir a todos os seus derivados. Quimicamente, os
alginatos são copolímeros lineares de ácido P-D-manurônico (M) e ácido
a-L-gulurônico (G) ligados a resíduos (1-4), sendo estes dispostos tanto
em estruturas de heteropolímeros (MG), e/ou homopolímeros (M ou G)
(LEAL et ai., 2008).
Assim como em outras espécies de algas marrons, os pol issacarídeos
sulfatados são abundantes na composição da A. nodoswn. Estes
polissacarídeos são a principal razão pelo qual as algas são reconhecidas
pelas suas atividades bioativas. As ascophyllanas são os polissacarídeos
sulfatados isolados especificamente da alga marrom A. nodosum.
Este polissacarídeo possui em sua estrutura fucose e uma cadeia de
monossacarídeos muito semelhante às fucoidanas (JJANG et ai., 2011).
A macroalga A. nodosum tem sido usada de fonna comercial por
séculos no norte da Europa (MAC MONAGAIL; MORRJSON, 2020), com a
colheita realizada de forma manual, sempre na região apical, tomando o

51
cuidado de manter intacto o caule principal de sustentação. O corte é realiza-
do a cada 3-5 anos, sempre respeitando o limite de 25 cm para que o dossel
consiga recuperar o seu tamanho original (GUIRY; MORRISON, 2013). Ao final
da década de 40, a colheita comercial desta alga se intensificou na costa
oeste da Irlanda, com uma produção média de 5.000-6.000 t ano- 1• Desde
então, a A. nodosum tornou-se uma das mais importantes algas comerciais
ao longo da região marítima do Atlântico Norte. Nos anos 50, a exploração
comercial se estendeu ao longo da costa da Nova Escócia (Canadá), princi-
palmente para utilização como matéria-prima do alginato de sódio e farinha
de kelp. Neste local, a colheita era feita de fom1a mecânica a cada 2-3 anos,
fornecendo rendimentos de 21,9-47,7 t ha· 1 (UGARTE; SHARP, 2012).
Atualmente, centenas de empresas estão envolvidas na produção
de extratos comerciais de A. nodosum para uso na agricultura. Essas
empresas utilizam diferentes métodos de extração para produzir uma
alta quantidade de biomassa e produzir formulações de uso agrícola
de alta qualidade na forma líquida ou pó. Muitas vezes, a estação do
ano, o estado fisiológico e o método de extração, podem influenciar
na qualidade e eficiência destes extratos (DE SAEGER et ai., 2019). Os
métodos mais comuns para obtenção são: em água (suspensão da
alga seca), hidrólises ácidas (HCI ou H 2SO4 ) ou alcalinas (NaOH ou
KOH), extrações assistidas por micro-ondas (MAE), ultrassom (UAE)
ou enzimas (E-AE) e extração com fluído supercrítico (SFE) ou por
líquido pressurizado (PLE) (SHUKLA et ai., 2019).
Dentre as algas marrons exploradas para uso agrícola, A. nodosum
é a espécie mais amplamente usada e estudada, não só pelos benefi-
cios para as plantas, mas também porque é utilizada em programas de
biomonitoramento marinho e como matéria-prima na indústria alimen-
tícia (DE SAEGER et ai., 2019; SHUKLA et ai., 2019). Quando utilizada para
biomonitoramento, atua de forma muito eficiente como biossorvente de
elementos químicos como cobalto, cádmio e chumbo (HOLAN; VOLESKY,
1994; PENNESI etal., 2019).
Na agricultura, os extratos de A. nodosum são conhecidos por
promoverem um aumento no crescimento e no rendimento de plantas de
interesse comercial, e ao mesmo tempo mitigando diversas formas de estresse
abióticos, atuando na regulação de processos bioquímicos e moleculares
na planta (CHOULIARAS et ai., 2009; DI STASIO et ai., 2018; SHUKLA et ai., 2019)
(Tabela 5). Historicamente, durante as marés mais baixas, as macroalgas
já eram coletadas por agricultores, maceradas e enterradas uma vez ao ano
no solo. O método era considerado mais vantajoso em comparação ao uso
de esterco animal, principalmente para enriquecer os solos considerados
pobres em potássio para cultivo de batata (SHUKLA et ai., 2019).
As algas não processadas e seus extratos podem influenciar o
crescimento das plantas de modo direto e indireto. Os beneficias indiretos

52
ocorrem quando alteram as propriedades fisicas e químicas do solo,
resultando em uma melhoria na textura, uma maior capacidade de retenção
de água e modificações na microbiota do solo. Os beneficios diretos
incluem: aumento na taxa de germinação das sementes, do crescimento
radicular, da biomassa da parte aérea, melhoria da eficiência do uso de
nutrientes, florescimento precoce, retardo na senescência, aumento no
teor de clorofilas e flavonoides, maior rendimento, além de promover
uma maior tolerância aos estresses (DE SAEGER ct ai.• 2019: KHAN ctal., 2012;
PEREIRA et ai., 2020; SHUKLA et ai., 2019).

53
 Tabela S. Principais efeitos reportados de extratos de Ascophy/111111 11odosrm1 na fisiologia e no crescimento de plantas
,_,.~- ,--------------------------,
Ré(er!ncia
- - -- \ ~~ 1 P. ;;~ _{· : "'; '.
Aumento de genninação de sementes, desenvolvimento de planta e
EA 1 S, So, R SILVA et ai. (20 19)
Alface produtividade
PCL 1 F Aumento de crescimento de planta e maior tolerância a estresse salino 1 GUINAN et ai. (2012)
EA 1 Alfafa So Aumento de crescimento de planta e maior nodulaçuo das raízes KHAN et ai. (2012)
HIDANGMAYUM;
PCL 1 Cebola IF 1 Aumento no crescimento vegetativo e rendimento
SHARMA (2017)
1 Aumento no crescimento vegetativo, tamanho dos tubérculos e da ativi-
PCL 1 Cenoura 1 So ALAM et ai. (2014)
dade microbiana no solo
Melhoria na genninaçilo e vigor de sementes, aumento na atividade da RAYORATH et ai. (2008)
UI PCL Cevada So
~ enzima amilase
EA Canola R Aumento de crescimento de plantas e absorção de nutrientes JANNIN et ai. (2013)
PCL 1 Couve IF 1 Aumento na biossíntese de metabólitos secundários LOLA-LUZ et ai. (20 13)
Aumento de crescimento de planta, qualidade das folhas, valor nutri- CASSAN et ai. ( 1992);
EA, PCL 1 Espinafre I F, So 1 cional, tolerância ao estresse hídrico, níveis de compostos fenólicos e XU; LESKOVAR (20 15):
antioxidantes FAN et ai. (2013)

EA 1 Feijão 1 F, So
I Aumento de tolerância ao estresse hídrico e alteração no metabolismo CARVALHO et ai. (2018)
da prolina
I Aumento no tamanho e peso dos frutos, alteração no processo de matu- CHOULIARAS et ai. ( 1997)
EA 1 Kiwi IF
ração dos frutos

PCL 1 Citros 1 F, So
I Aumento de tolerância ao stress hídrico, produtividade e maturação SPANN; LITTLE (201 1);
antecipada de frutos FORNES et ai. (2002)
 Aumento de período de floração, brotação, qualidade dos frutos e aporte BASAK (2008)
PCL Macieira F
de nitrogênio
PCL Manga R Aumento de qualidade dos frutos, pl-1, acidez e sólidos solúveis MELO et ai. (2018)
MENDONÇA JÚNIOR et ai.
PCL Melancia IF Aumento de crescimento da planta e produtividade (2020)
PCL Milho F Melhoria na absorção de nutrientes e maior crescimento de raiz ERTANI et ai. (2018)
Aumento de crescimento de plonta, qualidade dos frutos, atividade SPINELLI et ai. (2010);
PCL Morango So ALAM et ai. (20 13)
microbiana no solo e quelnnte do ferro
EA Oliva F, So Aumento da produtividade, conteúdo de óleo e maturoção antecipada dos frutos CHOULIARAS et ai. (2009)
PCL Pimentão F Aumento de tolerância à salinidade, rendimento e qualidade dos frutos YILDIZTEKIN et ai. (2018)
UI
UI PCL Soja So Aumento de tolerância ao estresse hídrico e modulação da expressão gênica I SHUKLA el ai. (20 18)
. , . , . 1 KOYAMA et ai. (2012);
Aumento de tolerância ao estresse h1dnco e calor durant~ os estágios GONI el ai. (2018);
PCL, EA IF reprodutivos, produtividade e modulação da expressão gêmea CARMODY et ai. (2020)
Tomate
Aumento de tolerância ao estresse salino, crescimento da planta e quali- 1 DI STASIO et ai. (20 t 8)
PCL 1 lso
dade dos frutos -

TURAN; KÔSE (2004);

SABIR et ai. (2014);
Aumento de crescimento, rendimento, qualidade dos frutos. conteúdo de POPESCU; POPESCU
PCL, EA Videira F
antocianinas, compostos fenólicos e absorção de nutrientes (2014); FRJONI etal. (20 19);
SALVI et ai. (2019)

1 Tipo de material (TM): EA: extrato aquoso; PSP: polissacarídeos semi purificados; ENA: Extrato neutro alcalino; PCL: produto comercial líquido
1 Via de aplicação (VA): F: foliar; R: raiz; S: semente; So: solo
 Estresses abióticos ocasionados por temperaturas extremas, falta ou
excesso de água, excesso de radiação, salinidade ou suas combinações,
são consideradas uma das principais causas de perdas na agricultura. Em
determinadas situações, os prejuízos podem chegar a 50%, e os extratos de
A. nodosum melhoram as condições da planta em suportar ou até mesmo
se restabelecer após vários tipos de estresses. Como uma tentativa de
conhecer os mecanismos que são ativados após a sua utilização e aprimorar
as formas de aplicação, pesquisas utilizam principalmente plantas modelo
como arabidopsis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold), e culturas de
interesse comercial como soja, tomate, feijão, videira ( Vi tis vinifera L.)
(DI STASlO et ai.. 2018; JITHESH et ai.. 2019; SHUKLA et ai.• 2019).
Em arabidopsis, um estudo publicado por Gofli et ai. (2016)
demonstrou que o tratamento com diferentes extratos de A. nodosum
modulou a expressão de diversos genes envolvidos nos mecanismos de
tolerância ao estresse hídrico. De modo similar, Jithesh e/ ai. (2019)
também demonstraram que a aplicação de sub-frações de extratos
de A. nodosum em arabidopsis, quando submetidas a estresse salino,
induziram a expressão de 184 e 262 genes no primeiro e quinto dia após
os tratamentos, respectivamente. Em ambos os casos, além da expressão
de uma ampla gama de genes envolvidos em diferentes processos
celulares, os extratos também induziram a atividade de proteínas LEA
(late embryonic abundant proteins) e dehidrinas, que são produzidas em
resposta ao estresse hídrico protegendo as estruturas celulares da perda
de água (nTHESH et ai., 2019).
Além dos efeitos na regulação do potencial osmótico, os extratos de
A. nodosum também induziram um aumento significativo na biossíntese
de flavonoides, aminoácidos e carboidratos, e neste caso, a eficiência foi
atribuída a maior disponibilidade de carbono e energia para as plantas
durante as situações de estresse. Em soja, a aplicação de um extrato
comercial melhorou a tolerância das plantas ao estresse hídrico por meio
da expressão de genes e do aumento da condutância estomática (regulação
da via de biossíntese do ABA) (SHUKLA et ai.• 2018). Em tomate, Carmody
et ai. (2020) demonstraram que a aplicação de extratos e frações ricas em
carboidratos aumentaram a tolerância das plantas às allas temperaturas
durante a fase reprodutiva (aumentando nº de flores e frutos) e também
regulou a expressão de proteínas envolvidas com variações intensas de
temperatura HSPs (heat shock proteins). Em videira, Frioni et ai. (2019)
também demonstraram que extratos em pó de A. nodosum podem ser uma
ferramenta valiosa para o aumento da produção quando as plantas estão
submetidas a estresse, portanto, o principal mecanismo de ação é através
da regulação de vias metabólicas específicas.
Extratos de Ascophyllum também melhoram o crescimento e
a produtividade das plantas, pois propiciam uma maior absorção de

56
nutrientes. O mecanismo não está bem estabelecido, mas diversos estudos
indicam que os efeitos são atribuídos em função da regulação de genes
específicos ou pelo aumento de microrganismos no solo que favorecem a
aquisição de nutrientes (KHAN et ai.. 2012; SHUKLA et ai., 20 19). Por exemplo,
em tomate, aplicações de dois extratos comerciais promoveram um
incremento nos teores de macro (N, P, K, Ca, S) e micronutrientes (Mg,
Zn, Mn, Fe) nas plantas e frutos (DI STASIO et ai., 20 18). Em oliveiras (Olea
europea L. ), observou-se uma maior absorção de K, Fe e Cu (CHOULIARAS
et ai.. 2009). Um produto comercial aplicado em plantas de canola (Brassica
napus) estimulou uma maior absorção de nitrogênio e bioacumulação
de enxofre através da regulação da expressão dos genes envolvidos no
metabolismo destes elementos (JANNIN et ai.. 2013).
Da mesma forma, um estudo publicado por Fan et ai. (2014)
mostrou que a imersão das raízes de espinafre em um extrato de A.
nodosum estimulou a atividade das enzimas glutamina sintetase e nitrato
redutase, que desempenham um papel muito importante no metabolismo
e assimilação do nitrogênio. Em alfafa, a aplicação dos extratos
induziu a planta a produzir mais exsudatos de raiz (ex: flavonoides) e
consequentemente atraíram mais bactérias para a sua superficie (KHAN
et ai., 2012). Salvi et ai. (2019) demonstrou que a aplicação foliar de um
extrato de A. nodosum nos três principais estágios de crescimento de
plantas de videira, aumentou a atividade fotossintética, a condutância
estomática e a atividade de enzimas do metabolismo secundário.
Além de promover o crescimento de plantas, extratos deAscophyllum
podem melhorar a qualidade pós-colheita de frutos. Assim, aplicações
foliares de A. nodosum aumentam a qualidade de frutos, como melancia
(Citrullus /anatus (Thunb.) Matsum. & Nakai) (MENDONÇA JÚNIOR et ai.,
2020), maçã (Malus domestica Bork.h.) (BASAK, 2008), uva (FRIONI et ai.,
2019) e oliva (CHOULIARAS et ai., 2009). Os efeitos em frutos são atribuídos
a um aumento na atividade antioxidante e uma redução na peroxidação de
lipídios quando as plantas são submetidas a um tratamento pré-colheita
com os extratos.
Em arabidopsis, a aplicação da alga também alterou a regulação de
genes envolvidos no estresse oxidativo, no metabolismo de carboidratos e
nas vias de sinalização hormonal (OMlDBAKHSHFARD et ai., 2020). Estudos
indicam que os extratos de algas possuem uma variedade de compostos
bioativos que podem modular as vias de biossíntese hormonal (WALLY
et ai., 2013). Compostos bioativos presentes em extratos comerciais de A.
nodosum chamados de ficoelictores, também podem atuar contra estresses
bióticos (SHUKLA et ai., 2019).

57
5. Determinação de polissacarídcos algais cm produtos
Algas são fontes de uma grande variedade de compostos bioativos
incluindo hormônios, macro e micronutrientes, polissacarídcos, aminoáci-
dos e vitaminas (KHAN etal., 2009; STENGEL; CONNAN; POPPER, 20 11 ). Dentre
estes compostos, alguns polissacarídeos são restritos a determinados
grupos taxonômicos (STENGEL; CONNAN; POPPER, 20 11 ) e, por isso, podem
ser utilizados como indicadores da presença de algas em formulações.
Neste tópico, abordaremos de forma sucinta alguns métodos utilizados
para detectar e quantificar ulvanas, carragenanas e alginatos encontrados,
respectivamente, em algas verdes, vermelhas e marrons.
Ulvanas podem ser detectadas por meio da quantificação de alguns
de seus monossacarídeos. Para tanto, uma alíquota do produto é misturada
com fenol 80%. Em seguida, ácido sulfúrico concentrado é adicionado e
a mistura é incubada a 25-30 ºC. Por fim, a absorbância é determinada no
comprimento de onda de 480 nm e a concentração de ramnose é calculada
com base em curva padrão do mesmo açúcar obtido comercialmente
(DUBOIS et ai.. 1956). Alternativamente, pode-se determinar o conteúdo de
ácidos urônicos. Para isso, o produto é misturado com uma solução de
0,025 M de tetrabarato de sódio em ácido sulfúrico e incubada a 100 ºC.
Após o resfriamento em temperatura ambiente, uma solução de 0,125%
de carbazol é adicionada e a mistura é incubada novamente a 100 ºC. Por
fim, após o resfriamento, a absorbância é determinada no comprimento de
onda de 530 nm e a concentração de ácidos urônicos é calculada com base
em curva padrão (BITIER; MUfR, 1962).
Carragenanas podem ser detectadas e quantificadas de forma
simples utilizando-se o corante azul de metileno (SOEDJAK, 1994). Para
tanto, uma alíquota do produto é misturada com uma solução de azul de
metileno (0,41 m.M). Em seguida, a absorbância a 559 nm é registrada e a
quantidade de carragenanas é determinada com base na curva padrão do
produto purificado. Alguns compostos (ácidos, açúcares, sais, proteínas,
corantes e emulsi.ficanles) podem afetar a precisão do método. No entanto,
devido à alta sensibilidade da técnica, as amostras podem ser bastante
diluídas visando reduzir ou eliminar a interferência (SOEDJAK. 1994).
Os alginatos podem ser detectados em fonnulações complexas
na forma de ácido algfnico por meio de eletroforese capilar (MOORE;
MIAO; BENIKOS, 2004). Para tanto, o ácido algf nico é separado dos demais
componentes da formulação por meio de lavagens com metanol, HCI (9%)
e água. O material resultante é solubilizado em NaOH (O, 1 M) e submetido
à eletroforese capilar (tampão borato 12,5 mM, pH 8.3; campo elétrico
de 550- 650 V/cm; temperatura de capilaridude de 23ºC e voltagem de
migração de 5 kV por I Os). O ácido algfnico é detectado no comprimento
de onda de 200 nm e pode ser quantificado por meio de curvn padrno

58
construída com produto purificado obtido comercialmente (MOORE;
MIAO; BENIKOS, 2004). De acordo com a legislação brasileira, a garantia
da presença de extratos de algas marrons em produto biofertilizante se
dá em função do seu teor de ácido algínico (BRASIL, 2020), porém ainda
há necessidade de se estabelecer critérios de qualidade adequados para as
algas verdes e vermelhas.
Além das técnicas apresentadas até aqui, outras mais sofisticadas
podem ser utilizadas para a detecção, quantificação e caracterização de
polissacarídeos. Dentre elas, podemos destacar a cromatografia de troca
aniônica de alto desempenho com detecção amperométrica pulsada
(HPAE-PAD) e a ressonância magnética nuclear (NMR). Estas técnicas,
no entanto, requerem amostras purificadas e, a princípio, são utilizadas
em estudos mais avançados com o objetivo de desvendar a estrutura e
composição dos polissacarídeos.
A Figura 2 apresenta o resumo gráfico do efeito dos extratos de
macroalgas como biofertilizantes.

\
\

Tratamento de sementes
Irrigação

Figura 2. Resumo gráfico do efeito dos extratos de macroulgas como biofcrtilizantcs

59
 CAPÍTULO III

EXTRATOS VEGETAIS COMO BIOFERTILIZANTES

Roberta Paulert, Sérgio Miguel Mazaro e Átila Francisco Mógor

1. Introdução
O aumento da população mundial ocasionou mudanças no processo
de produção agrícola, conduzindo para o cultivo em larga escala das mais
diferentes espécies vegetais. Nesse sentido, o melhoramento genético
foi intensificado na busca por cultivares cada vez mais produtivas, de
ciclos curtos e adaptadas às mais diferentes condições agrícolas, sendo
acompanhadas do incremento no uso de agroquímicos.
No entanto, tal sistema de produção intensivo vem preocupando
pela contaminação de alimentos, do homem e do ambiente, bem
como, pela dificuldade de manter altas produtividades, considerando
a seleção de insetos e patógenos resistentes com consequente perda
de eficiência de agroquímicos e o uso de fertilizantes sem considerar a
real necessidade nutricional.
Nesse modelo de agricultura convencional, além dos fatores já
mencionados, deve ser considerado com muita atenção as mudanças
climáticas mais acentuadas, associadas às perdas por estresses abióticos
que podem afetar o rendimento dos cultivas. Ainda, deve-se acrescentar
a crescente demanda mundial por alimentos saudáveis, produzidos sem
resíduos químicos, e de forma sustentável. Nesse sentido, os biofertilizantes
são produtos de origem natural com grande potencial de auxiliarem em
um processo de produção agrícola mais eficiente e seguro.
Na classe de biofertilizantes estão contemplados os extratos
vegetais, pois possuem em suas composições moléculas orgânicas, com
potencial bioativo (BRASIL, 2020) capazes de ativarem o metabolismo
das plantas para diferentes respostas relacionadas ao crescimento,
desenvolvimento e adaptação ao ambiente. São capazes de melhorar
a qualidade dos cultivas, a eficiência do uso de nutrientes (KUNICKI et
ai., 2010) e reduzir o efeito de estresses abióticos (ZIOSI er ai., 2013). Os
extratos vegetais, estão sendo cada vez mais integrados em sistemas
de produção, com o objetivo de melhorar os processos metabólicos e
otimizar o potencial produtivo (YAKHIN el ai., 2017).
Vale salientar que os extratos vegetais para serem enquadrados
como biofertilizantes devem seguir o seguinte preceito: produto obtido
por extração de compostos orgânicos solúveis da fermentação ou

61
beneficiamento de materiais orgânicos, isentos de contaminação biológica
(BRASIL, 2020).
A diversidade de compostos bioativos é característica dos extratos
vegetais e a identificação é importante do ponto de vista científico,
no entanto, o isolamento pode não apresentar o efeito de um extrato
completo. Nesse sentido, os mesmos devem ser entendidos quanto sua
ação fisiológica na planta e não exclusivamente quanto a sua composição.
A garantia para os biofertilizantes de extratos vegetais é dada pelo seu teor
de carbono orgânico total, e a sua bioatividade identificada por bioensaios
e pesquisas de acordo com a Instrução Normativa nº 61 do Ministério da
Agricultura (BRASIL, 2020).
O potencial dos extratos vegetais faz parte da história da
humanidade, com citações da época dos Romanos, quando Demócrito
(470 A.C.) relatou que o extrato da borra das videiras era eficiente no
controle de doenças de plantas (AMORIN et ai., 2018). A revisão publicada
por Yakhin et ai. (2017), relata que a primeira discussão da teoria dos
"estimulantes biogênicos" pode ser atribuída ao Prof. V.P. Filatov e foi
iniciada em 1933, propondo que materiais biológicos, incluindo plantas
que foram expostas a condições de estresse, podem afetar os processos
metabólicos e energéticos em humanos, animais e plantas. A utilização de
preparados vegetais foi se consolidando de geração a geração, constituindo
conhecimentos empíricos, que fortaleceram produções agrícolas, como os
sistemas de produção orgânica e biodinâmica.
Nesse sentido, com as novas legislações estabelecendo conceitos
claros de biofertilizantes e bioatividade, e com o avanço científico de
técnicas que permitem quantificar a ação de produtos sobre as plantas, bem
como o interesse de pesquisadores pelo tema, a utilização de biofertilizantes
a base de extratos vegetais será crescente, com a consolidação de produtos
altamente eficientes na melhoria de parâmetros relacionados ao processo
de produção mais sustentável, e com aumento da produtividade agrícola.
A diversidade de plantas com potencial de bioatividade é enonne,
muitas sendo utilizadas de forma empírica, poucas relatadas e estudadas
cientificamente, e ainda há uma diversidade enorme a ser explorada,
considerando a biodiversidade do planeta.
A seguir, serão apresentadas algumas espécies já relatadas quanto
sua utilização como potenciais biofertilizantes.

2. Algumas espécies com potencial biofertilizante

Allium sativum - Pertence à família Aliaceae, com utilização
relacionada principalmente a macerações, infusões, extratos e óleo
essencial. Caracterizações químicas demonstraram conteúdo fenólico
total médio de 6,5 mg equivalentes de ácido gálico, sendo que os

62
principais ácidos fenó]icos encontrados foram o ácido cafeico e o ácido
ferúlico, e em menor proporção os ácidos vanílico, p-hidroxibenzóico
e p-cumárico (BEATO et ai., 2011), ainda os ácidos graxos identificados
foram o ácido láurico e o ácido linoleico. O conteúdo fenólico do extrato
etanólico apresentou teores de fenóis totais, flavonoides ( quercetina) e
proantocianidinas (catequina) (MALLET er ai., 2014).
Artemisia vulgaris - É uma das várias espécies do gênero Artemisia,
originária da Europa ou Ásia (OLIVEIRA er ai., 2009). Principalmente
são utilizadas suas folhas em macerações, infusões, extratos e óleo
essencial, sendo que as folhas são fontes abundantes em artemisinina,
uma lactona sesquiterpênica (MAGIERO er ai., 2009). No óleo essencial de
folhas de artemisia foram identificados 18 componentes, principalmente
sesquiterpenos oxigenados (44,4%), hidrocarbonetos sesquiterpênicos
(33,3%) e monoterpenos oxigenados (16,6%), cariofileno (37,45%),
germacreno D (16,17%) e humuleno (13,66%) foram os componentes
principais (MALIK er ai., 2019).
Azadirachta indica - Nativa da Índia e Birmânia, é uma das três
espécies do gêneroAzadirachta,juntamente com A. siamensis eA. excelsa.
Suas folhas, frutos, sementes e casca são utilizados para macerações,
infusões, extratos e óleo essencial. Pesquisas da composição química
identificaram uma grande diversidade de compostos, entre eles alcaloides,
carboidratos, açúcares redutores, flavonoides, glicosídeos, compostos
fenólicos, taninos, saponinas, aminoácidos, triterpenoides e esteroides
(PRASHANTH; KRJSHNAJAH, 2014).
Cuscuta reflexa - Pertence ao gênero Cuscuta, o qual possui mais
de 100 espécies. Esta espécie trepadeira é parasita de plantas, originária do
subcontinente indiano e no Grande Himalaia. Seus ramos são utilizados em
macerações, infusões, extratos e óleo essencial. A análise cromatográfica
identificou dezesseis compostos do óleo essencial de C. reflexa, dos
quais os majoritários foram o piperitona (15,19%), cariofileno (12,55%),
~-elemeno (10,35%), elemol (6,20%), selineno (4,49%), humuleno
(3,98%) e tujona (5,18%) (JSLAM; RAHMAN; RAHMAN, 2015).
Cymbopogon citratus - O capim-cidreira ou capim-limão é nativo
das regiões tropicais da Ásia, especialmente da Índia. Seus ramos são
utilizados em macerações, infusões, extratos e óleo essencial. Foram
identificados 13 componentes principais, sendo os principais os isômeros
geranial e neral, que juntos formam o composto citral, bem como o
monoterpeno mirceno (PINTO et ai., 2015). Os extratos e óleos essenciais
são ricos em taninos, ácidos fenólicos (derivados do ácido cafeico e
p-cumárico) e glicosídeos de flavona (derivados da apigenina e luteolina)
(FIGUEIRINHA er ai., 2008).
Foeniculum vulgare - O funcho é nativo da bacia do Mediterrâneo,
com variedades na Macaronésia e no Médio Oriente. Suas folhas são

63
usadas principalmente em macerações e infusões. Análises químicas
do óleo essencial das folhas identificaram os compostos trans-anetol
(31-36%), a-pineno ( 14-20%) e limoneno ( 11-13%); enquanto metil
chavicol (= estrago}) (79-88%) foi dominante no óleo obtido das
sementes (MIGUEL et ai., 201 O).
Glycyrrhiza glabra - pertence à família Fabaceae, sendo conhe-
cida como alcaçuz. É originária do norte da África e oeste da Ásia,
mas amplamente distribuída em todo o mundo e consiste em mais
de 30 espécies. Os rizomas e raízes são as partes medicinais mais
importantes, sendo utilizados para obtenção de macerados, infusões e
extrato alcóolico. A análise química dos extratos de G. glabra revelou
a presença de vários ácidos orgânicos, liquirtina, ramnoliquirilina,
liquiritigenina, prenilicoflavona A, apiosídeo de glucoliquiritina,
1-meto-xifaseolina, shinpterocarpina, shinflavanona, licopiranocuma-
rina, glisoflavicirinocumarina, glisoflavrizirinocumarina, glisoflavrini-
zolizo, semilicoisoflavona B, licorifenona e l-metoxifenol, kanzonol R
e vários componentes voláteis (EL-SABER BATIHA, 2020).
MetroJ.y!on sagu - É uma espécie de palmeira nativa do sudeste
da Ásia, mais encontrada na Indonésia, Nova Guiné, Malásia e Filipinas.
A planta é explorada na extração de amido, e o resíduo é rico em
polissacarídeos, especialmente açúcares redutores (KUMAR et ai., 2019).
Medicago saliva - conhecida pelos nomes comuns de luzerna e
alfafa, é uma leguminosa pertencente à família Fabaceae, amplamente
utilizada como alimento para ruminantes. Sua biomassa é fonte de
oligossacarídeos e polipeptídeos, e de aminoácidos livres obtidos por
hidrólise (ERTANl el ai., 2012).
Moringa oleifera - O gênero Moringa é o único representante
da família Moringaceae, originária do noroeste da Índia, é amplamente
distribuída nos países da Ásia e da África. Seu potencial bioativo relaciona-
se aos compostos não-terpenoides (ácidos, álcoois e hidrocarbonetos) e
terpenoides oxigenados (monoter,penos, sesquiterpenos e diterpenos)
(BARRETO el ai., 2009).
Yucca schidigera - pertence à família Asparagaceae, é nativa dos
desertos do sudoeste dos Estados Unidos e norte do México. São utilizados
principalmente ramos e raízes, para obtenção de pó e extratos. É uma fonte
rica em saponinas esteroides, polifenólicos, incluindo o resveratrol e uma
série de outros estilbenos (CHEBKE; PJACIENTE; 0LESZEK, 2006). Estudos
das características químicas revelaram constituintes fenólicos, sendo o
resveratrol, trans-3,3 ', 5,5'-tetrahidroxi-4'-metoxistilbeno, e larixinol
sprirobiflavonoide, e derivados fenólfoos muito incomuns, chamados de
yuccaols A- E e yuccaone A (PlACBNTE; PJZZA; 0LESZEK, 2005).

64
 2.1 Bioatividade dos extratos vegetais
Inúmeros compostos do metabolismo das plantas apresentam
potencial bioativo quando aplicados a outras plantas. Por exemplo, a
análise química dos extratos aquosos das folhas jovens de moringa revelou
a presença de compostos fenólicos, aminoácidos e prolina (AHMAD et
ai., 2019; HASSAN; FETOUH, 2019). As folhas ainda possuem carotenoides
(principalmente beta-caroteno e xantinas), vitaminas B (ácido fólico,
piridoxina e ácido nicotínico), vitamina C (ácido ascórbico) e vitamina
E. Fitoquímicos como taninos, terpenoides, flavonoides, saponinas e
antraquinonas também estão presentes (ALJ; HASSAN; ELGIMABI, 2018;
FERREIRAetal., 2008). O extrato de folhas de moringa apresenta composição
complexa com bioatividade em diversas culturas.
Aminoácidos e peptídeos podem ser obtidos através de hidrólise
de proteínas oriundas da biomassa vegetal de diversas origens (BAGLIERI
et ai., 2014; COLLA et ai., 2014; DONNO et ai., 2013; ERTANI et ai., 2012; GARCÍA-
GARCÍA et ai., 2020). Estes compostos têm apresentado diversas atividades
biológicas com efeitos positivos em parâmetros de crescimento vegetal
bem como na qualidade dos frutos, pelo maior acúmulo de antocianinas e
ácido ascórbico (PARRA.DO et ai., 2007; XU; GEELEN, 2018).
Mesmo com o grande interesse mundial na obtenção de
extratos vegetais que melhorem o desempenho das plantas cultivadas
(DEL BUONO, 2021 ), poucos produtos ainda possuem ingredientes
bem caracterizados quimicamente, impactando na ·limitação dos
conhecimentos sobre os mecanismos de ação (DROBEK; FRAÇ;
CYBULSKA, 2019; ROUPHAEL; COLLA, 2018). Por outro lado, raros são
os estudos com ênfase na atividade sinérgica desses compostos para o
desenvolvimento de produtos (ROUPHAEL; COLLA, 2018).
A determinação do modo de ação dos extratos vegetais depende: a)
do detalhamento dos processos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem
no metabolismo das plantas tratadas (desde poucos minutos até horas ou
dias após o tratamento), b) da determinação dos constituintes químicos
ativos (XU; GEELEN, 2018), e c) da forma de obtenção dos extratos e sua
aplicação (CHECHINEL FILHO; YUNES, 1998). Assim, os estudos demandam
abordagens conjuntas da química, biologia e tecnologias (ROUPHAEL
et ai., 2018a) "ômicas", como g,enômica, proteômica, transcriptômica,
metabolômica e mais recentemente da prime-omic proposta por Balmer
et ai. (2015).
Efetivamente, muitos estudos recentes indicam que os produtos
naturais, mesmo em baixas concentrações, podem proteger plantas frente
aos estresses abióticos pela indução molecular e fisiológica de mecanismos
de defesa via pré-condicionamento ou molecular priming (KERCHEV et ai.,
2020; RADY; VARMA, HOWLADAR, 2013). O tratamento induz mecanismos

65
endógenos de defesa das plantas, em períodos que antecedem o estresse,
como: expressão de genes, mudanças na cromatina e no proteoma, acúmulo
de compostos, entre outros fatores (CONRATH, 2011; TANOU; FOTOPOULOS;
MOLASSIOTIS, 2012).
Somando-se a multidisciplinaridade das análises e os estudos que
precisam ser realizados nas condições reais do campo (ROUPHAEL et ai.,
2018a), registra-se que esta carência de informações é derivada da vasta
biodiversidade e grande complexidade dos extratos vegetais. No entanto,
trabalhos publicados recentemente reportam os efeitos benéficos destes
compostos em termos de produtividade, lucratividade e qualidade (DEL
BUONO, 2021 ).

3. Aplicações fitotécnicas
Diversos trabalhos relatam o efeito de extratos de plantas em
cultivos agrícolas, como os exemplos a seguir.
O uso do extrato aquoso de alho aumentou o conteúdo de clorofila,
carotenoides, e o comprimento das raízes de plantas de berinjela (So/anum
melongena) e pimentão (Capsicum annuum), via tratamento foliar ou
fertirrigação (HAYAT et ai., 2018). Plantas de pimenta (Capsicum sp.) (HAYAT
et ai., 2018) e tomate (Solanum lycopersicum) (HUSSEIN et ai., 2015) também
apresentaram maior crescimento, melhores parâmetros fisiológicos e de
rendimento pelo tratamento com extrato aquoso de alho.
A bioatividade do extrato de Morif!ga oleifera, planta exótica
cultivada no Brasil (TEIXEIRA et ai., 2014), mostrou efeitos que favorecem
a germinação de sementes, crescimento vegetal, melhor utilização dos
nutrientes, além de conferir maior durab~lidade às flores e favorecer a
tolerância aos estresses abióticos (AHMAD et ai., 2019; HASSAN; FETOUH,
2019; HOWLADAR, 2014). Com a aplicação foliar do extrato aquoso de folhas
de M oleifera, plantas de feijão (Phaseolus vulgaris) apresentaram maior
crescimento e rendimento, bem como acúmulo de prolina em plantas
submetidas a estresse salino (HOWLADAR, 2014). Similannente, plântulas
de feijão apresentaram tolerância ao estresse salino devido à ativação do
sistema antioxidante, além de incrementar o crescimento e o rendimento,
quando as sementes foram pré-condicionadas (embebidas) no extrato M
o/eifera (RADY; MOHAMED, 2015; RADY; VARMA; HOWLADAR, 2013).
O extrato aquoso de raízes de alcaçuz (Glycyrrhiza glabra)
em aplicação foliar e/ou pela embebição de sementes aumentaram
o crescimento vegetativo, rendimento, pigmentos fotossintéticos,
carboidratos e conteúdo relativo de água em plantas de feijão em
condições de estresse salino (RADY etal., 2019). O tratamento de sementes
de ervilha (Pisum sativum) com extrato aquoso (obtido com água quente)
de raízes secas de alcaçuz proporcionou aumento no crescimento das

66
plântulas, pigmentos fotossintéticos, prolina e do sistema antioxidante
(DESOKY et ai.. 2019).
Em experimento a campo, o pré-condicionamento de sementes
de lentilha (Lens culinaris M.) com extratos de folhas de Azadirachta
indica favoreceram o crescimento vegetativo e a produção (BHATESHWAR
et ai .• 2020).
O extrato obtido de folhas de artemísia (Artemisia vu/garis
L.), aplicado por pulverização foliar em plantas de batata (Solanum
tuberosum), promoveu o aumento de 27% na concentração de clorofila
e carotenoides em folhas de batateira (FINDURA et ai., 2020), estimulou
o crescimento das raízes de plantas de repolho (Brassica oleracea var.
capitata) (GODLEWSKA et ai., 2019) e aumento de produtividade de soja
(Glycine max L.) (SZPARAGA et ai., 2021).
A planta de Yucca schidigera tem compostos bioativos relativos à
adaptação a regiões desérticas, como saponinas e compostos fenólicos.
O extrato de Quillaja saponaria, espécie nativa do Chile também é rica
em saponinas. A combinação de uma estrutura de aglicona hidrofóbica e
moléculas de açúcar hidrofilicas confere propriedades de emulsificação
às saponinas, sendo usadas como surfactantes naturais (KREGIEL et ai.,
2011). A aplicação de extratos contendo saponinas em algumas espécies
apresenta efeitos como estimular a germinação de sementes de milho,
aumento dos teores de clorofila em ervilha, estimular o crescimento
radicular em alface e tomate (MOSES et ai., 2014).
Como descrito nos exemplos acima, muitas substâncias bioativas
são derivadas de extratos vegetais complexos (OU JARDIN, 2015; ZULFIQAR
er ai., 2020), no entanto, poucas atividades são atribuídas aos carboidratos
presentes nestes extratos. Apesar disso, a promoção do crescimento e
a influência sobre a fisiologia vegetal é claramente benéfica quando
polissacarídeos são aplicados às plantas (KUMAR et ai., 2019).
O subproduto (bagaço) da produção de amido de palma/saga
(Metroxylon sagu) por hidrólise enzimática fornece polissacarídeos com
diversos tamanhos, incluindo açúcares redutores. Estes são fonte de
energia e de precursores metabólicos, capazes de propiciar efeitos que
aliviam o estresse e promovem o crescimento vegetal, a germinação de
sementes, acúmulo de açúcar e de proteínas, como em frutos de tomate
(KUMAR et ai.• 2019).
Além dos carboidratos, proteínas vegetais hidrolisadas,
química ou enzimaticamente, contendo misturas de aminoácidos e
peptídeos têm apresentado efeitos benéficos em diversas culturas
(COLLA el ai., 2015).
O hidrolisado proteico de alfafa (Medicado saliva), contendo
peptídeos e L-aminoácidos livres, foi eficiente em promover a assimilação
do nitrogênio (SCHlAVON; ERTANI; NARDI, 2008) e em reduzir os efeitos do

67
estresse salino em milho (ERTANI er ai, 2012), enquanto um hidrolisado
proteico de sementes de leguminosas aumentou significativamente o
rendimento da biomassa fresca e o peso seco das folhas de espinafre
(Spinacia oleracea L.) por aplicação foliar (ROUPHAEL et ai., 201 8b).
Os extratos de plantas são misturas complexas derivadas de
matérias-primas de origens bastante diversas, utilizando também
inúmeros processos de obtenção e, como esperado, um amplo espectro
e,
de bioatividade se faz presente (YAKHIN ai., 2017). A Tabela 1 apresenta
exemplos de extratos vegetais bioativos com efeitos positivos em
processos fisiológicos, bioquímicos e melhoria de parâmetros relativos
à produtividade e qualidade, ou conferindo tolerância aos estresses
abióticos. A Tabela 1 apresenta exemplos de extratos vegetais bioativos.

68
 Tabela 1. Exemplos de extratos vegetais bioativos com efeitos positivos em processos fisiológicos, bioquímicos e melhoria de parâmetros relativos à
produtividade, qualidade ou conferindo tolerância aos estresses abióticos

1~tâs da,1}ilanta1(efcitos ,fisiológicos e ~gron6micos} 1Reférências

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Solução HASSAN;
Palma
Moringa Extrato foliar líquida para Aumento da capacidade antioxidante, longevidade das
(Gladiolus FETHOU
oleífero aquoso as flores flores e manutenção da qualidade pós-colheita (2019)
grandiflon1s)
cortadas

ALI;
Gerânio HASSAN;
Moringa Extrato foliar Aplicação Aumento do crescimento, produtividade, pigmentos
0\ (Pelargonium ELGIMAB
1,,0 oleífero aquoso foliar fotossintéticos, compostos fenólicos e óleo essencial
graveolens) (2018)

Alcachofra ELDEEN
Moringa Extrato etanólico Aplicação
(Cynara Aumento do crescimento, rendimento e qualidade
oleífero das folhas foliar (2015)
scolymus L.)
Pimenta DUNSIN;
Moringa Aplicação
(Capsicum Extrato aquoso Aumento do crescimento e número de frutos ODEGHE
oleífero foliar
annum L.) (2015)

Feijão
(Phaseolus
vulgaris)
1 Moringa
oleífero
l Extrato aquoso
1 Aplicação
foliar
1 Maior crescimento, rendimento, aumento de prolina,
tolerância ao estresse salino
1 HOWLADAR
(2014)
 Jarital{e.feitos fisiológicos e agrorrõmicos) i ·Referências
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-~ -_,.;. . •.' ~/-':

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f\ \~. '.~ : .t '.'

_ -·· _ _

Feijão
Moringa Aplicação 1 ELZAAWELY
(Phaseolus Extrato aquoso Aumento no crescimento e rendimento
oleifera foliar et ai. (20 t 7)
vulgaris)
Embcbição
Trigo
(Triticum
Moringa
Extrato aquoso
de semente IAumento do crescimento, do peso dos grãos e do 1 REHMAN et
oleifera ou aplicação rendimento ai. (2017)
turgidum L.)
foliar
BASRA;
Milho Moringa Embebição IFTIKHAR;
Extrato aquoso Aumento do crescimento
(Zea mays) oleifera de sementes AFZAL (20 t 1)
-..J
= Feijão-caupi
Funcho Aumento de osmoprotetores, enzimas antioxidantes,
(Vigna Aplicação 1 DESOKY et ai.
Foenicu/um Extrato aquoso aumento da relação K·/Na♦, tolerância ao estresse (2020)
unguicu/ata) foliar
vulgare Milt. salino

Aplicação
Feijão AJcaçuz 1 Aumento do crescimento, clorofila, prolina, açúcares, RADYetal.
Extrato aquoso foliar e 1
(Phaseo/us (Glycyrrhiza selênio, enzimas antioxidantes. (2019)
das raízes embebição
vu/garis L.) glabra)
das sementes
Alcaçuz Tratamento 1 Aumento no crescimento das plântulas, pigmentos 1 DESOKY et ai.
Ervilha (Pisum
( Glycyrrhiza Extrato aquoso fotossintéticos, enzimas antioxidantes, prolina (2019)
sativum) 1 glabra) de sementes

Trigo Planta parasita 1 1 Aumento da genninação, biomassa, tolerância ao 1 ALI et ai.

1 Embebição
(Triticum (Cuscuta Extrato aquoso (2020)
de sementes estresse híbrico
turgidum L.) reflexa)
 L.AUQ\U U~ SÁNCHEZ-
Uva branca Aplicação Acúmulo de compostos fenólicos e voláteis, redução
poda de Extrato aquoso GOMEZ etal.
(Vitis vinifera) foliar do teor de açúcar
videiras (2020)
Batata
Artemisia Aplicação Aumento da clorofila, carotenoides, compostos FTNDURA et
(Solanum Extrato aquoso
vulgaris foliar fenólicos e prolina ai. (2020)
tuberoasum)
Planta
ornamental Aplicação
Alho (Allium 1 Aumento do crescimento, biomassa, acúmulo de N e 1 HANAFY et ai.
(Sch_ejfiera Extrato aquoso foliar e no (2012)
sativum) carboidratos
solo
....
....J arborícola)
Tomate Alho
(Solanum 1 Aplicação 1 Aumento do rendimento dos frutos, compostos 1 HUSSEIN et
(Allium Extrato aquoso
foliar fenólicos totais e flavonoides ai. (2015)
lycopersicum) sativum)
Extrato hidroli-
Tomate Palma/sago
sado composto 1 Aplicação 1Aumento da germinação e crescimento, maior acúmulo I KUMAR et ai.
(Solanum (Metroxylon
por mono- e foliar de açúcar total e de proteínas em frutos (20 19)
lycopersicum) sagu)
polissacarideos
Extrato com
Diversos I Yucca 1 saponinas e
1 Diversas 1 Promoção do crescimento da parte aérea e raízes
1 ROUPHAEL;
Schidigera compostos COLLA (2020)
fenólicos
4. Preparo de extratos vegetais e determinação dos compostos
bioativos
As substâncias orgânicas bioativas presentes nas plantas e que
compõem os extratos podem ser produtos do metabolismo primário
ou secundário (G RANELLA et ai., 202 1). Sabe-se que a produção de
metabólitos secundários é influenciada por inúmeros fatores que alteram
a concentração, combinações e proporções relativas dos componentes
nos vegetais (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; ZULFJQAR et ai., 2020). Assim,
são necessários estudos para a otimização das condições e época para
cultivo e/ou colheita da matéria-prima vegetal para atingir concentrações
adequadas dos metabólitos secundários (PAVARIN1 et ai., 2012). Embora
exista uma enorme biodiversidade de compostos que agem isoladamente
ou em combinação, os extratos vegetais bioativos são formados por
carboidratos, proteínas e/ou metabólitos secundários que promovem o
crescimento vegetal (XU; GEELEN, 2018).
A matéria-prima para obtenção dos extratos para potencial
uso como biofertilizantes contendo derivados de plantas poderá ser
constituída a partir de sementes (e seus derivados hidrolisados), folhas,
cascas, bulbos, raízes, restos vegetais; isolados ou em combinação
(AHMAD et ai., 2019; DROBEK et ai., 2019; GODLEWSKA et ai., 2019). As folhas
podem ser utilizadas frescas (AHMAD et ai., 2019) ou secas (FINDURA et
ai., 2020; MELGUIZO-MELGUJZO et ai., 2014; SZPARAGA et al., 2021), com
observação do uso correto das tecnologias de secagem para preservação
da qualidade do material (ABOLTINS; KIC, 2016).
Os extratos naturais podem ser preparados utilizando solventes
alcoólicos, acetona ou apenas água (fria ou quente) para a extração dos
componentes (FINDURA et ai., 2020). Por exemplo, Ahmad et ai. (2019),
iniciou o processo com folhas frescas e jovens de moringa para cada litro
de água, fazendo a extração com um equipamento local, e o extrato obtido
foi filtrado em papel filtro e centrifugado. Findura et ai. (2020) quando
utilizaram a maceração das folhas de artemísia (5 g de folhas secas para
100 mL de água em temperatura ambiente por 24 horas), obtiveram
resultados mais expressivos do que aqueles obtidos por infusão (com
água fervente).
Com resultados positivos no rendimento da cultura de soja,
infusões de folhas secas de Artemisia absinthium foram fervidas por 30
minutos (5 g de folhas secas para 250 mL d~ água destilada). Em uma
segunda forma de preparação a frio, 5 g de folhas secas de artemísia
foram adicionadas a 100 mL de água destilada e deixadas em ambiente
escuro por 48 horas a temperatura de 4ºC. Depois, ambos os extratos
foram centrifugados e filtrados antes da utilização (SZPARAGA et al., 2021).

72
 Os compostos presentes em raízes de a lcaçuz podem ser utilizados
através da proporção de 100 g de raízes secas para 20 litros de água
(0,5%, ou sej a, 5 g de raízes secas para cada litro de água) a 50ºC durante
24 horas de extração. Então, a solução resultante deve ser filtrada e o
volume fina l ajustado (RADY e1ai., 201 9).
Por outro lado, aminoácidos e peptídeos podem ser obtidos através
de hidrólise de proteínas oriundas de restos vegeta is (BAG LI ERI et ai., 2014)
ou matéria-prima de cascas de frutas (DONNO et ai., 20 13).
Apesar dos extratos vegetais serem misturas complexas de
multicomponentes, análises técnicas experimentais de quantificação
e identificação de substâncias ou grupos de molécula s são de vital
importância para o estudo da composição dos extratos vegetais
(SAS IDHARAN et ai., 201 I ). Os constituintes ativos são informações
valiosas e merecem destaque da mesma forma que o modo de ação e
a identificação da relação da estrutura-atividade otimizam o produto
final. Neste contexto, alguns dos métodos laboratoriais úteis na
análise da composição e quantificação das substâncias presentes em
extratos vegetais estão descritos a seguir.

4.1 Determinação do total de aminoácidos livres e

polipeptídios
Os aminoácidos são componentes iônicos sem cor que formam as
proteínas. Também existem na forma livre em muitos tecidos e, portanto,
são referidos como aminoácidos livres e possuem uma característica
importante porque geralmente são solúveis em água. Em plantas que
sofrem condições de estresse, esses aminoácidos livres são encontrados
e a sua determinação é um importante ponto de referência da condição
fisiológica vegetal.
Diversos extratos e produtos vegetais que são promotores do
crescimento vegetal contêm aminoácidos livres, oligopeptídeos e/ou
polipeptídios provenientes de extração ou hidrólise enzimática (parcial
ou intensa) de proteínas.
A concentração do total de aminoácidos livres presente nos extratos
vegetais pode ser determinada de acordo com o método descrito por
Dubey e Rani (1989). Folhas de moringa foram moídas com etanol, a
mistura foi fervida, centrifugada e o sobrenadante utilizado na estimativa
de aminoácidos livres pelo método que emprega o reagente ninidrina. A
coloração desenvolvida foi determinada em 570 nm, de acordo com o
proposto por Moore e Stein (1948).
O conteúdo total de aminoácidos presentes foi determinado após a
hidrólise ácida com a utilização de cromatografia líquida de alta eficiência
( CLAE/HPLC) (COLLA et ai., 2014).

73
 4.2 Determinação da concentração de ácido ascórbico
Os métodos mais comumente empregados são os titulométricos
e espectrofotométricos baseados nas propriedades de redução do ácido
ascórbico, além dos cromatográficos. A técnica de extração do ácido as-
córbico das amostras pode ser assistida por ultrassom ou por ácido (6-8%
de ácido acético, metafos fórico ou tricloroacético) (STAN; SORAN; MARUTOIU,
2014). A maceração do material em nitrogênio líquido causa o extravasa-
mento do conteúdo intracelular dos tecidos e em baixas temperaturas (na
presença de ácido) previne atividades metabólicas.
A quantificação pode ser realizada pela redução do corante
2,6-dicloro-indofenol (DCFI) com ácido ascórbico em meio ácido
(metafosfórico ou acético) (HELRICH, 1990). Em solução neutra ou alcalina,
o reagente DCFI na forma oxidada é azul e altera-se para rosa em solução
ácida. O protocolo utiliza a titulação de uma solução padronizada do
corante em extrato ácido contendo a amostra e o ponto final rosa determina
o excesso de corante não reduzido na solução (HOEHNE; MARMITT, 2019).
A capacidade do extrato em reduzir o corante é diretamente proporcional
ao teor de ácido ascórbico, no entanto, o procedimento possui limitações
em soluções coloridas.
Outro método se baseia na redução do F e3+ para F e 2+ pelo ácido
dehidroascórbico. Então, o ácido dehidroascórbico é reduzido a ascórbico
por incubação com o agente redutor ditiotreitol (DDT), cujo excesso
é removido. Através da complexação de Fe2+ com 2,2-dipiridil, o total
de ácido ascórbico é. determinado pela leitura realizada em 525 nrn
(KAMPFENKEL; VAN MONTAGU; INZÉ, 1995). 0 extrato em meio ácido
é misturado com dinitrofenil-hidrazina, seguido da adição de toureia e
fervido. Depois do resfriamento da solução contendo ácido sulfúrico, as
amostras permanecem em banho de gelo e a absorbância é medida em 530
nm em espectrofotômetro. A concentração de ácido ascórbico é calculada a
partir de uma curva padrão contendo concentrações conhecidas e expresso
como mg g-1 de matéria.
A concentração presente nos extratos vegetais pode ser determinada
através do sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
(BALL, 1998; STAN; SORAN; MARUTOIU, 2014).

4.3 Análise de compostos voláteis

Muitos estudos baseiam.:se na análise dos metabólitos secundários
voláteis presentes em material vegetal. São misturas complexas de
substâncias com baixa concentração e, portanto, estes compostos podem
ser analisados após a extração com extração sortiva em barra de agitação
(SBSE) ou microextração em fase sólida (SPME) com auxílio de um
dispositivo revestido co1n polidimetilsiloxano (CHAVEZ; QUEIROZ, 2008).
Neste último caso, as substâncias voláteis podem ser coletadas em alguns

74
minutos pela fibra e transferidas por injeção ao sistema GC-MS ou
GC-EIMS (Gas Chromatography-Electron Jmpact Mass Spectrometry)
(Agi lent Technologies, EUA) que identificará e quan tificará os compostos
voláteis coletados da a tmosfera que pe rme ia ao redor do material vegetal
(BARNEY; HAY; WESTON, 2005). A comparação com as á reas dos picos
re lativos é realizada utilizando compostos puros, de referência ou de
dados de bibliotecas (ADAMS, 2007; GIULIAN I et ai., 201 8; PISTELLJ et ai., 2020).
Trata-se de miniaturização do sistema analítico e m étodo cromatográfico
com alta sensibilidade e seletividade analítica com resultado em análises
rápidas com baixo consumo de solvente, permitindo a reutilização do
sistema extrator e ta mbé m maio r precisão a nalít ica e automação das
análises (CHAVEZ; QUEIROZ, 2008).

4.4 Análise dos óleos essenciais

Após a hidrodestilação em aparato de Clevenger, o óleo essencial
extraído pode ser analisado quanto à composição química por injeção
de peque nos volumes, após diluição em n-hexano, em sistema GC-MS,
conforme descrito no item anterior para compostos voláteis (PISTELLI
et ai., 2020).

4.5 Determinação da atividade antioxidante

A capacidade antioxidante tem grande importância em sistemas
biológicos e por isso um amplo acervo de métodos está disponível na
literatura científica para mensurar esta atividade em extratos. Uma das
técnicas utilizadas adequada para substâncias puras e misturas em etanol
ou metanol se baseia na eliminação do radical livre estável 1, l-difenil-
2-picrilhidrazil (DPPH), definida como método de sequestro do radical
livre ou simplesmente método DPPH. Este método é bastante utilizado
e apresenta diversas modificações/adaptações cmn inúmeros protocolos
descritos (OLIVEIRA et ai., 2015).
A atividade é mensurada pelo decréscimo da absorbância em 517 nm
usando espectrofotômetro UV-visível e a concentração do extrato ütg mL·1)
que fornece 50% da atividade antioxidante (IC50) é calculada utilizando
gráfico de porcentagem de inibição (PISTELLI et ai., 2017; PISTELLI et ai., 2020).

4.6 Determinação de carbono orgânico total (COT)

A garantia de um biofertilizante de extratos vegetais se dá em função
do seu teor de carbono orgânico total (COT) expresso pela porcentagem
em peso (BRASIL, 2020).
A metodologia para a determinação do COT é definida em: Manual
de métodos analíticos oficiais par fertilizantes e corretivos (BRASIL, 2017),
no seu capítulo III, método 13.

75
 A Figura l apresenta o resumo gráfico do efeito de extratos vegetais
como biofertilizantes

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~Aplbçlo rollar

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Figura 1. Resumo gráfico do efeito de extratos vegetais como biofertilizantes

76
 CAPÍTULO IV

SUBSTÂNCIAS HÚMICAS COMO BIOFERTILIZANTES

Luciano Pasqualolo Cancllas, Fábio Lopes Olivares, Rakiely Martins da Silva,
Nalália Aguiar Canellas e Átila Francisco Mógor

1. Introdução
O aumento nos custos de produção e na frequência de secas e
outros fenômenos climáticos adversos tem atraído a atenção para o uso
de substâncias húmicas (SI-1) na agricultura. As SH solúveis aplicadas
ao solo ou diretamente nas plantas podem modificar o metabolismo para
promoção do crescimento vegetal, absorção de nutrientes e aumentar a
tolerância aos estresses abióticos, promovendo a quantidade e qualidade
da produção.
Os estudos dos efeitos da matéria orgânica sobre a produção são
tão antigos quanto à própria agricultura. Na era moderna, os estudos sobre
os efeitos fisiológicos das SH foram intensificados com a primeira grande
crise do petróleo em 1974. Quase dez anos depois, foi publicado o primeiro
estudo sistemático sobre a bioatividade das SH (VAUGHAN; MALCOLM,
1985). Nesse capítulo o objetivo é apresentar resumidamente os principais
tópicos relacionados ao efeito bioativo das SH solúveis sobre o metabolismo
primário e secundário das plantas, e as consequências desses estímulos na
promoção do crescimento e respostas aos estresses a bióticos. É feito antes
uma breve apresentação de alguns conceitos básicos, uma vez que a química
das SH é de longe a área mais controversa da Ciência do Solo (LEHMANN;
KLEBER. 2015).
Diferentemente dos reguladores vegetais sintéticos, as SH são
produtos naturais complexos, sem composição química definida nem
alvos celulares específicos nas plantas, sendo sua ação na fisiologia
uma propriedade sistêmica e dependente de muitos fatores, incluindo
origem e concentração da substância húmica solúvel, a espécie e estádio
fonológico das plantas, além das condições ambientais e de manejo das
lavouras, principalmente da água e dos fertilizantes. O conhecimento
dos efeitos fisiológicos (bioatividade) das SH pode embasar a atuação
de agricultores, técnicos e agrônomos e contribuir para o aumento da
eficiência de seu uso e na consistência das respostas de promoção do
crescimento e mitigação de estresses.

77
2. Definições básicas
Mais do que macropolímeros formados por macromoléculas de
elevada massa molecular, as SH podem ser consideradas como uma
associação supramolecular complexa não covalente de moléculas
heterogêneas, resultantes da degradação microbiana dos tecidos vegetais
e animais. Essa associação é mantida unida por forças dispersivas fracas,
ligações hidrogênio e pontes metálicas intermoleculares formadas por
interações eletrostáticas (P ICCOLO et ai., 20 18).
As primeiras evidências experimentais do arranjo supramolecular
das SH em solução foram obtidas por Piccolo (2001) e Piccolo (2002)
que demonstrou a reversibilidade da massa molecular das SH com a
adição de ácidos orgânicos de cadeia curta a suspensão de SH. Foram
utilizados ácidos orgânicos normalmente exsudados pelas raízes e
observada a fragmentação do arranjo supramolecular com o surgimento
de picos nas determinações por cromatografia líquida de alta eficiência
por exclusão de tamanho na faixa relacionada à presença de compostos
com menor distribuição de massa/tamanho molecular. A Figura 1 resume
o experimento do Prof. Piccolo.

CH:JCOOH

......

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I
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Volume morto Volume de retenção Volume morto

Volume de retenção
Volume total

Volume total

Figura 1. Modificações no arranjamento supramolecular de ácidos húmicos após a adição

de ácido acético. Note o forte deslocamento do cromatograma para região de menor massa
molecular relativa (deslocamento para direita)

O experimento original de Piccolo (2001) e Piccolo (2002)

foi confirmado posteriormente de forma inequívoca com o uso da
Ressonância Magnética Nuclear com Campo Difuso Ordenado, que

78
permitiu ver a separação das principais unidades estruturais das SH com
a adição de ácidos orgân icos (SIMPSON, 2002). A Figura 1 é uma adaptação
da apresentação feita pelo Prof. A. Piccolo sobre as S H, na Universidade
de Nápoles Federico II , Portici, em 2007.
A consequência prática dessa definição de SH é vis ível no campo
da fisiologia vegetal. Os primeiros resultados indicando a possibilidade de
absorção das SH no tecido vegetal foram obtidos com auxílio do carbono
radioativo e intrigaram a comunidade científica, uma vez que o tamanho
dos transportadores nas membranas das células era incompatível com a
passagem de rnacromoléculas. Uma revisão desses prime iros trabalhos
pode ser encontrada em Nardi et ai. (2002) e Nardi et ai. (2009). Atualmente
sabe-se que não existe relação entre a massa molecular aparente das SH e
seu efeito fisiológico, ou sej a, sua bioatividade. Tanto moléculas de massa
aparente alta como baixa podem disparar eventos bioquímicos, moleculares
e fisiológicos (CANELLAS et ai., 20 10). A reatividade e a bioatividade das SH
é uma função da razão entre a quantidade de seus grupos hidrofóbicos e
grupos hidrofilicos (CANELLAS et ai., 201 2; MUSCOLO; SfDARI; NARDI, 2013;
PICCOLO, 2002), sendo que as plantas podem modificar a supraestrutura
molecular das SH exsudando ácidos orgânicos.
Sendo assim, dentre as SH, os ácidos húmicos foram considerados
como um conjunto heterogêneo de moléculas orgânicas com natureza
predominantemente hidrofóbica, com capacidade de desenvolver ligações
hidrogênio entre as moléculas com tal intensidade que, a partir de um
determinado valor de pH, pode ocorrer a floculação do arranjamento
seguido da precipitação. Já os ácidos fúlvicos foram considerados como
um conjunto de moléculas heterogêneas que apresentam alta densidade de
grupos funcionais negativos (COOH, OH) fazendo com que permaneçam
solúveis em qualquer valor de pH (PICCOLO, 2002). Já as huminas são
insolúveis em meio aquoso tanto básico como ácido, devido a sua forte
interação com a fração mineral por meio de ligações hidrogênio. No
entanto, como demonstraram Hayes e Swift (2020), as huminas podem ser
obtidas e isoladas com a utilização de solventes polares apróticos como
DMSO (dimetilsulfóxido) e uréia, ambos capazes de romper as ligações
hidrogênios com a fração mineral, separando a fração humina. Depois
de isolada, a natureza química da humina foi acessada por métodos
espectroscópicos e não revelou qualquer diferença significativa em relação
aos ácidos húmicos.
As SH têm natureza química complexa, mas não no sentido de
difícil, complicado ou inacessível. Os pesquisadores italianos Nebiosso
e Piccolo (2011) desenvolveram um protocolo para acessar todos os
componentes das SH, procedimento este denominado de humeômica
em referência as ciências ômicas. No entanto, a interconexão entre os
elementos que formam o complexo húmico dá origem a propriedades

79
sistêm icas. Assim, ma is do que quantificar cada elemento da composição
é preciso estabe lecer o "padrão de comportamento", indicando sua
qualidade, revelada pela configuração das relações entre os componentes
do arranjamento supramolecular.
Atualmente, esse padrão de comportamento tende a ser indicado
pela hidrofobic idade das SH, sendo seus efeitos dependentes de inter-
relações envolvendo a planta e o ambi ente. Portanto, o efeito das SH nas
plantas é depende nte da origem e do processo de obtenção da substância
húmica, da concentração aplicada, da espécie e estádio da planta, além das
condições ambientais (NARDI et ai., 2009).
A Figura 2 , apresenta um resumo do trabalho de meta-análise
de dados sobre os efeitos das SH em plantas realizado por Rose el
ai. (2014). Foi o bservado um a umento médio em torno de 20% no
crescimento de raízes e parte aérea das plantas tratadas com diferentes
SH, em diferentes condições experimentais de laboratório e casa de
vegetação. Verificou-se também que o crescimento do sistema radicular
das dicotiledôneas foi mais estimulado que o das monocotiledôneas.
Além disso, fatores ambientais definidos no referido estudo, como
presença de estresses abióticos, também apresentaram influência
significativa na magnitude das respostas de crescimento da parte aérea,
enquanto o meio de cultivo influenciou mais no crescimento de raízes
em resposta à aplicação de SH.
-dtlH -- 1-.,odtplllà
1.5 0..

Figura 2. Efeilo médio estimado das SH sobre o crescimento da parte aérea (A) e das raízes (B),
bem como principais fatores que afetam significativamente o modelo de predição das respostas.
Fonte: Adaptado do estudo de meta-análise realizado por Rose et a/.(2014)

3. Efeitos das substâncias húmicas sobre a absorção de

nutrientes e metabolismo
O incremento da absorção de nutrientes pelas raízes é um
dos efeitos mais atribuídos às SH. Para tanto, um dos mecanis1nos

80
estimu lados re laciona-se aos transportadores, pro teínas específica s
capazes de reconhecer os íons e tra nsportá-los do a po plas to ( espaço
da parede celu lar e lamela média) para s implasto (citoplas ma) através
d as m e mbranas celulares. Em termos genéricos, e considerando
somente os macronutrientes ni trogênio (N), fósforo (P) e potássio
(K), é possível reconhecer dois tipos de transportadores, um d e baixa
e outro de a lta a finidade.
Os transportadores de baixa afinidade são aqueles constitutivos já
previamente sintetizados e incorporados às membranas celulares, eficientes
quando a concentração de nutrientes no meio é elevada. Em s ituações de
depleção de nutrientes, como na maioria dos casos na interface ri zoplano-
solo, a baixa concentração de nutrientes induz à síntese de transportadores
específicos de alta afinidade. Esses transportadores demandam energia
proveniente da quebra do trifosfato de adenosina (ATP) realizada por
enzimas transmembranares (transpassam as membranas entre apoplasto
e simplasto) conhecidas como H +-ATPases, ou mais genericamente como
bombas de prótons (H+).
A quebra do ATP em ADP ocorre num domínio específico da
enzima gerando energia e ao mesmo tempo liberando H+, que por sua
vez é transportado por outro domínio da proteína, para o lado externo da
célula (apoplasto) promovendo uma diferença de potencial eletroquímico
(gradiente) necessário para a absorção. No caso de ânions, o transporte contra
o gradiente de concentração (do meio menos para o mais concentrado), e
também para o nitrato (NOJ, o sistema transportador é um simporte (íons
são transportados através da membrana em uma mesma direção contra um
gradiente de concentração) do tipo 2: 1 (H+:NOJ e para fosfato (HPO/ ) do
tipo 1: 1, ou seja, para absorção de cada NQ3- são necessários dois H+, e para
cada HP032• , um H +.
Um dos efeitos fisiológicos mais estudados das SH é justamente
o incremento da atividade das bombas de prótons membranares em
diferentes modelos de planta (MAGGIONI et ai., 1987; NARDI et ai., 1991 ;
PINTON et ai., 1992; PINTON et ai., 1997; PINTON et ai., 1999; VARANINI et
ai. , 1993). As SH podem induzir a síntese de H +-ATPase (CANELLAS
er ai., 2002; QUAGGIOTTI et ai., 2004), bem como promover a modulação
concertada na atividade das bombas de H + no citoplasma e no vacúolo
(ZANDONADI; CANELLAS; FAÇANHA, 2007).
A energização dos transportadores e o aumento do gradiente
eletroquímico foi acompanhado tanto nos parâmetros cinéticos de
absorção de nitrato como no aumento do número de transportadores
de nitrato de alta afinidade e de algumas isoformas das H +-ATPase de
membrana plasmática em plântulas de arroz tratadas com ácidos húmicos
(TAVARES et ai., 2017).

81
 O aumento na absorção de P também foi observado em plântulas
de tomate tratadas com ácidos húmicos, com o aumento na transcrição de
transportadores de fosfato de alta afinidade mesmo em altas concentrações
de P, contrariando as expectativas, já que na presença de concentrações
elevadas de nutrientes os transportadores de alta afinidade não costumam
estar em níveis elevados, indicando que as SH podem modificara percepção
da concentração do P (JlN DO et ai., 20 16).
Uma das principais características da absorção de K+ é sua
rapidez, devido à e levada permeabilidade das membranas ao nutriente,
sendo a presença de transportadores nas membranas facilitadora da
difusão. Se por um lado a alta permeabilidade das membranas facilita a
entrada de K+ no simplasto, por outro não dificulta a saída. A retenção
de K+ nas células é dependente da manutenção do potencial negativo
na célula, que é aumentado com a atividade das bombas de prótons
pelo aumento de OH- no citoplasma. Além disso, foi observado um
aumento da transcrição de transportadores de K+ de alta afinidade
(HKTl ) em Arabidopsis thaliana tratada com ácidos húmicos na
presença de NaCl, contribuindo para o mecanismo de mitigação de
salinidade pela troca K +fNa+ (KHALEDA et ai., 2017).
Além da energização dos transportadores e do gradiente
eletroquímico formado pela atividade das bombas de prótons, a
acidificação do apoplasto pelo acúmulo de H+ favorece a atividade
das expansinas (fenol oxidases). Essas proteínas não enzimáticas
hidrolisam a parede celular tornando-a mais flexível e, com isso,
facilitando o alongamento e a expansão celulares decorrentes da
turgescência (aumento da pressão de água). Esse mecanismo necessário
para o crescimento celular é conhecido como teoria do crescimento
ácido (HAGER, 2003). De acordo com essa concepção, a atividade das
H+-ATPases é desencadeada pelas auxinas, que também estimulam
a emissão de raízes laterais, portanto, aumentando a superfície de
absorção das raízes.
A atividade do tipo hormonal nas SH é bem relatada (NARDI;
PIZZEGHELLO; ERTANf, 2018). Trevisan et ai. (201 O) verificaram a
atividade tipo auxínica de ácidos húmicos usando tanto inibidores
específicos de transporte e receptores, bem como, com o gene
DR5:GUS em arabidopsis. A Figura 4 (A), apresenta um segmento
radicular de tomateiro com a fusão do gene repórter DR5:GUS tratado
com ácidos húmicos isolados de vermicomposto, indicando tanto a
proliferação de pelos radiculares como o aumento da concentração de
auxinas no sítio de emissão das raízes laterais, revelado pelo aumento
da intensidade da coloração azul.

82
Figura 4. (A) Sítio de em issão de raízes laterais cm plântulas de to mate iro tratadas com
ácidos húmicos. A coloração azulada indica a concentração de auxinas revelada pe la
reação do gene repórter DR5:G US com o corante Xgluc. ( B) Ápice radic ular d e plântula
de m ilho tratada com ácidos húmicos. (C) mesma fa ixa de segmento radicula r em plântulas
controle mostrando a ausência de sítios de e missão de raízes laterais e ápice radic ular com
concentração no rmal de auxinas. Fonte. Arquivo pessoal de LPC. A microg rafia foi o btida
num microscópio ótico da Zeiss pelo professor Fábio Lopes Olivares na UENF/N UDJBA.
O mutante de tomateiro MT DRS:GUS é construção do Professor Lázaro Eustáquio Pereira
Peres da USP/ESALQ que cedeu gentilmente o material ao NUDIBA

Mais recentemente, outro mecanismo fisiológico relacionado à

nutrição celular foi ativado em pfantas tratadas com ácidos húmicos.
Para que ocorra o crescimento celular é necessário que exis tam
energia e metabólitos em quantidades suficientes. Quando açúcares
e aminoácidos estão em quantidades adequadas no citoplasma ocorre
a sinalização para a continuidade do crescimento e proliferação
celulares. Essa sinalização é realizada por uma proteína sensora
conhecida como TOR (Target of Rapamycin) (ROBAGLIA; THOMAS;
MEYER, 2012). Quando os níveis de amino ácidos, açúcares e energia
disponíveis são baixos a TOR é inibida e a célula reduz a taxa de
crescimento, chegando até a morte celular induzida em caso extremo.
Foi observado que plântulas de milho tratadas com ácidos húmicos
tiveram níveis de transcrição elevados da TOR, mesmo em condições
de restrição nutricional no meio de crescimento. Além disso, não
foi observada qualquer relação entre os baixos níveis de açúcares e
aminoácidos encontrados nos tecidos foliares e a elevada transcrição
da TOR nas plântulas tratadas (CANE LLAS et ai. , 2019). ATOR tem um
papel central no controle dos fluxos energéticos e uma desregulação
da atividade pode indicar uma aceleração do crescimento celular
mesmo em condições desfavoráveis na disponibilidade de metabólitos.
A duração desse estímulo e a consequência em longo prazo dessa
alteração não são conhecidas, mas pode sugerir a presença de um novo
mecanismo de adaptação em plantas tratadas com ácidos húmicos.
Os diversos mecanismos fisiológicos relacionados à bioatividade
das SH podem promover inúmeras alterações metabólicas, como
identificado em análise metabolômica de plantas tratadas com ácidos
húmicos, revelando alterações quantitativas no nível de metabólitos

83
provenientes tanto do metabolismo primário como do secundário
(AGU I A R et ai., 201 8).

3. 1 Efeitos relacionados ao metabolismo primário

Além da absorção de nutrientes, a fixação de carbono e a assimilação
de nitrogênio constituem a base do crescimento vegetal. As SH afetam
ambos os processos conhecidos genericamente como metabolismo primário.
A reação de redução do C02 atmosférico com a oxidação da
H 20 utiliza a energia da luz para produzir carboidratos e ocorre nos
cloroplastos. O caminho básico no qual o C02 é convertido até carbono
orgânico é o c iclo de redução das fosfato-pentases conhecido como Ciclo
de Calv in. Um açúcar fosforilado (ribulose-5-di-fosfato) é convertido
até glicose-6-fosfato que, por sucessivas transformações, produz amido.
A energia da luz é usada para produzir ATP e NADPH, já que o ciclo
requer nove ATPs e sejs moléculas de NADPH para produzir uma
molécula de gliceraldeído-6-fosfato. Todo o ciclo é realizado dentro do
cloroplasto e catalisado por enzimas localizadas no estroma. As plantas
que usam esse ciclo são conhecidas como plantas de :fisiologia C3 tais
como leguminosas e espécies arbóreas. Em algumas plantas conhecidas
como plantas C4 existe uma via adicional na qual o C02 atmosférico
é primeiro convertido a maiato e aspartato (moléculas com quatro
carbonos, daí C4) que depois serão assimilados no ciclo de Calvin. O C01
atmosférico é convertido pela PEP carboxilase (fosfoenolpiruvato) nos
cloroplastos de células especiais do mesófilo foliar ( células da bainha do
feixe vascular) para formar oxalacetato que, por sua vez, é rapidamente
convertido em maiato e aspartato. Esses produtos são imediatamente
transferidos para células especializadas onde são descarboxilados e
dirigidos para o ciclo de Calvin e regenerar o fosfoenolpiruvato. Após
a :fixação de C os compostos são utilizados para síntese de outros
compostos do metabolismo primário e secundário bem como usados
como combustível do crescimento celular na via da glicólise e do ciclo
do ácido tricarboxílico (também conhecido como ciclo de Krebs).
As enzimas da glicólise e do ciclo de Krebs tiveram a atividade
estimulada significativamente em plantas tratadas com ácidos húmicos.
Entre as enzimas com atividade elevada encontraram-se a glicoquinase,
fosfoglicose isomerase, fosfofrutoquinase, piruvato quinase, isocitrato
desidrogenase (NADP), citrato sintase e maiato desidrogenase (MDH),
permitindo caracterizar a influência significativa das SH sobre o
metabolismo do carbono (NARDI et ai., 2007).
Além da identificação da atividade das enzimas do ciclo do ácido
tricarboxílico aumentadas, medidas fisiológicas corroboraram os resultados,
evidenciados pelo aumento na taxa fotossintética líquida em plantas tratadas
com ácidos húmicos (AGUIAR et ai., 2016; CANELLAS et ai., 2013), sendo o

84
aumento na taxa fotossintética líquida um evento fisiológico relativamente
raro, uma vez que é preciso tanto aumentar o metabolismo da fixação do
carbono como reduzir as perdas por foton-espiração.
A assimilação de nitrogênio (N) faz parte do metabolis mo primário
da célula vegetal. A intervenção das SH nas reações de assimilação
de nitrato e amônio catalisadas por enzimas foram estudadas por
Nardi et a!. (199 1) e Nardi et ai. (2000) utilizando as ferramentas da
bioquímica clássica, e corroborados anos ma is tarde com técnicas de
biologia molecular, indicando que baixas concentrações de SH no meio
influenciaram positivamente o metabolismo do nitrato, proporcionando
aumento de proteínas solúveis, estimulando a síntese de amino ácidos e
a atividade e o nível de transcrição das enzimas de assimilação de N e do
ciclo de Krebs (VACCARO et ai., 20 15).
3.2 Efeitos relacionados ao metabolismo secundário
O principal papel dos metabólitos secundários é a proteção das
plantas contra estresses bióticos e abióticos, além do envolvimento em
processos de atração e repelência de polinizadores e patógenos, pois esses
compostos são responsáveis pela cor e aroma. Os compostos precursores
do metabolismo secundário são produtos transformados do metabolismo
primário. De um modo geral, é possível indicar que os metabólitos
secundários derivam de três rotas biossintéticas principais: a via do
fenilpropanoide, a do isoprenoide e a via dos alcaloides. Esse tópico
concentra-se na via dos fenilpropanoides.
Os fenilpropanoides são uma classe de compostos derivados do
aminoácido fenilalanina e tem como esqueleto básico o fenilpropano
(C6-C3). A fenilalanina é sintetizada na via do ácido chiquímico, bem
como os outros aminoácidos aromáticos como tirosina e o triptofano. Os
precursores são o fosfoenolpiruvato oriundo da glicólise e a eritrose-4P
proveniente da pentose fosfato, levando a dois intermediários importantes,
os ácidos chiquímico e corísmico. Nas etapas seguintes, até a ramificação da
via, a fenilalanina e a tirosina são sintetizadas a partir dos ácidos pré-renico
e arogênio, enquanto o triptofano é sintetizado a partir do ácido antranílico.
A remoção de um grupo amino da fenilalanina (desaminação) é catalisada
pela enzima fenilalanina amônia liase (PAL) e leva a formação do ácido
cinâmico que, por sua vez, é o precursor do hidroxicinamato formado por
uma série de hidroxilação do anel benzênico. Esses compostos incluindo os
ácidos p-cumárico, ferulico e siríngico são reduzidos aos seus respectivos
álcoois via intermediários aldeídicos e chamados de álcool cumarílico,
coniferílico e sinapílico, respectivamente. A dimerização ou polimerização
dessas unidades leva a formação das lignanas e ligninas, respectivamente.
Alignificação é uma reação complexa na qual as enzimas peroxidases
catalisam a polimerização da lignina consumindo H20 2 • O ácido benzoico

85
 e hidrox ibcnzoico (C6-C 1) representam outro grupo de compostos
deri vados do ác ido c inâmico formado pela quebra do fragmento C2 da
estrutura do fenilpro pano . O ácido sa licílico também pode ser sintetizado
a partir do corismato-isocrorismato pela enzima isocorismato sintase e é
um metabólito chave para indução de defesa nas plantas.
Os metabólicos genericamente chamados de fenólicos simples
se d iferenciam para formar os compostos polifenólicos que possuem
um anel benzênico adicional, oriundo da ciclização de três resíduos do
ácido mevalônico pela estilbeno sintase ou pela chalcona sintase para
fonnar esti lbenos (C6-C2-C6) ou chalconas (C6-C3-C6). Finalmente,
as protoantocianinas e taninos condensados incluindo seus polímeros ou
oligômeros podem ser formados a partir de flavonoides.
Os produtos fenólicos da via dos fenilpropanoides atuam na
defesa das plantas em várias formas, seja como compostos antibióticos,
na aliviação de danos das espécies reativas de oxigênio ou ainda como
solutos orgânicos osmoprotetores. Por exemplo, os ácidos protocatecoico,
hidróxi benzílico, vanílico e p-cumárico foram reconhecidos como agentes
alelopáticos (EINHELLIG et ai., 2004). O ácido cafeico e o clorogênico
tem atividade antioxidante comprovada contra radicais livres (OLTHOF;
HOLLMAN; KATAN, 2001). Já o ácido p-hidróxi-benzóico exibiu atividade
antimicrobiana (CHONG; ROSSALL; ATONG, 2009). Os polifenóis ( e taninos
em geral) tem comprovada atividade anti-herbivoria (INDERJIT, 1996).
Em estudo pioneiro considerando o efeito das SH sobre o metabolismo
dos compostos fenólicos foi observado tanto acúmulo de polifenois nos
tecidos como aumento da atividade da PAL, incluindo aumento no nível de
transcrição dessa enzima nas plântulas de milho tratadas com SH (SCHIAVON
et ai., 2010). Ertani et ai. (2016) também observaram efeito significativo no
metabolismo dos fenilpropanoides em resposta ao tratamento com SH,
enquanto Olivares et ai. (2015) fortificaram o substrato de crescimento
de mudas de tomateiro com ácidos do tipo húmicos e também verificaram
aumento na atividade da PAL nas mudas tratadas. Outro exemplo de indução
do metabolismo em plantas tratadas com ácidos hú1nicos foi relatado por
Hemandez et ai. (2015), encontrando aumentos na atividade das enzimas
nitrato redutase, glutamina sintetase e PAL, com repercussões na maior
eficiência do uso do N e aumento da produção.
O uso de SH na prevenção do estresse oxidativo foi indicado por
García et ai. (2012), que relataram aumento da atividade da peroxidase,
redução na concentração de H 2 O2 e aumento no nível de prolina, que
podem reduzir os danos provocados pelas espécies reativas de oxigênio
que tem sua concentração aumentada em condições de estresses abióticos.
Mais recentemente foi verificado que os próprios ácidos húmicos per si
podem induzir respostas anti-estresse usando o mecanismo conhecido
como estresse por ácidos fracos (BAÍA et ai., 2020) e, portanto, podem ser

86
utilizados na aclimatação de plantas protegendo-as contra ação futura de
agentes de estresse (CANELLAS et ai., 2020).
Portanto, é pertinente concluir que plantas em melhor estado
nutricional conferido pelo aumento da eficiência e absorção de nutrientes,
e com metabolismo primário e secundário estimulados, podem suportar
melhor os efeitos de diferentes tipos de estresse e manter a qualidade da
produção. Esse é o princípio fundamental dos efeitos fisiológicos das SH.

4. Substâncias húmicas na agricultura

Um dos efeitos mais notórios das SH está relacionado à absorção
dos nutrientes. A elevada densidade de cargas faz com que em solos
altamente intemperizados, as SH sejam responsáveis pela maior parte da
capacidade de troca de cátions, poder tampão, e abaixamento do ponto
de carga protônica líquida zero (DOBBSS et ai., 2008), retendo nutrientes e
funcionando como excelente condicionador de solo. Além disso, formam
complexos com íons deixando nutrientes mais prontamente assimiláveis
pelas plantas e microrganismos (CHEN; NOBILI; AVIAD, 2004).
Entre os principais desafios das Ciências Agrárias do nosso tempo,
está o de alimentar uma população cada vez mais exigente e crescente,
com diminuição do uso de insumos externos e impactos ambientais
mínimos, e ainda, sob condições climáticas variáveis e mais extremas
no futuro (PITIELKOW et ai., 2015). Preservar a qualidade do ambiente de
produção agrícola e manter o retorno econômico positivo é um conceito
chave para essa meta. Nesse contexto, a conservação da matéria orgânica
do solo (MOS), maior reserva de carbono na terra (LAL, 2004), formada
principalmente pelas SH (HAYES; SWIFT, 2020) assume papel fundamental.
Do ponto de vista agronômico, as SH melhoram a capacidade de
retenção de água, a capacidade de troca catiônica, a aeração e agregação
do solo (STEVENSON, 1994). Plantas que crescem em solos com quantidade
adequada e equilibrada de ácidos húmicos (AH), fúlvicos (AF) e huminas
são mais saudáveis e toleram melhor as alterações ambientais recorrentes
em todas as fases do ciclo (NARDI; PIZZEGHELLO; ERTANI, 2018). 0 manejo
e conservação da MOS e o aumento da relação AH/AF são a base de
sistemas agrícolas mais sustentáveis.
O desenvolvimento de tecnologias e produtos à base de SH é antigo
e acompanha o desenvolvimento da agricultura. Nos anos 1930 foram
criadas as primeiras empresas extratoras e comercializadoras de produtos
húmicos nos Estados Unidos (WAKSMAN, 1936). Na última década do século
passado foi observado um salto expressivo no interesse da pesquisa no uso
das SH, não só como condicionadores de solo, mas aplicada diretamente
nas plantas na forma solúvel e em baixas concentrações, objetivando a
promoção do crescimento e a absorção de nutrientes (DU JARDIN, 2015).

87
 Os efeitos das SH sobre a absorção dos nutrientes, aumento da
eficiênc ia de uso dos fertilizantes, promoção do metabolismo primário
e secundário das plantas, bem como a redução das perdas causadas por
estresses foram vistos na primeira parte desse capítulo,e tem justificado seu
uso direto sobre os cultivos (CA NELLAS et ai., 2020; CANELLAS; OLIVARES,
2014; NARDI et ai., 2009; PIZZEGH ELLO et ai., 2020; ZAN IN et ai., 20 18). Além
disso, a interação das SH na rizosfera, e seu efeito sobre o microbioma da
interface solo-raiz, toma-se um grande tema a ser explorado para geração
de biotecnologias ecologicamente corretas.
Nesse sentido, Bettoni et ai. (2014) identificaram que a aplicação
de SH aliada à inoculação micorrízica em ambiente com CO2 elevado,
promoveu maior acúmulo de açúcares solúveis, proteínas e prolina em
folhas de cebola, bem como, Bettoni et ai. (2017) identificaram também
que essa associação apresentou o efeito de aumentar o conteúdo de açúcares
solúveis, proteínas e compostos fenólicos nos bulbos. Maji et ai. (2015),
verificaram que um vermicomposto rico em ácido húmico promoveu
o crescimento das plantas de ervilha (Pisum sativum), melhorando a
estrutura da comunidade microbiana do solo, bem como, a nodulação e a
colonização micorrízica nas raízes.
Além das rnicorrizas, a associação de SH com bactérias apresenta
resultados relevantes, como o de bactérias promotoras do crescimento de
plantas e SH aplicados no substrato para a produção de mudas, e também
via foliar em plantas de tomate, aumentando a produção em sistema
orgânico (OLIVARES et al., 2015), ou do aumento da produtividade da
cana-de-açúcar com aplicação de bactérias endofiticas diazotróficas e SH
(SILVA; OLIVARES; CANELLAS, 2017), ou ainda, da co-inoculação de rizóbio e
Herbaspirillum seropedicae associados a substância orgânica semelhante
ao AH, melhorando a recuperação de plantas de feijão (Phaseo/us vulgaris)
submetidas a estresse hídrico (MELO et ai., 2017). Segundo Canellas e
Olivares (2017) a combinação de Herbaspirillum seropedicae e SH têm
mostrado resultados promissores quando aplicados diretamente no solo,
usados em substratos, ou pela pulverização foliar em viveiros e condições
de campo, como por exemplo, no aumento do rendimento de grãos de
milho (Zea mays) em condições de laboratório e de campo, aumentado
também a população bacteriana associada às plantas (LIMA et ai., 2014).
Diversos trabalhos (CANELLAS et ai., 2019; PUGLISI et ai., 2008; PUGLISI
et ai., 2009; PUGLISI et ai., 2013) identificaram a produção de exsudados nas
raízes induzida por ácidos húmicos, apoiando o conceito de que as SH
influenciam no tamanho da população e na estrutura da comunidade
microbiana. Nesse sentido, De Hita et al. (2020), identificaram promissoras
bactérias promotoras do crescimento de plantas, partindo da hipótese de
que o tratamento de plantas de pepino com ácidos húmicos poderia levar
ao isolamento de microrganismos endofiticos benéficos, cuja proliferação

88
dentro da planta poderia ter sido promovida pelos ácidos húmicos, como
foi confirmado.
Em condições experimentais controladas, as SH têm proporcionado
um incremento médio de cerca de 20% sobre a massa seca da parte
aérea ou das raízes em diferentes espécies de plantas (ROSE et ai., 2014).
Além disso, os mecanismos de ação na fisiologia das plantas têm sido
elucidados progressivamente nos últimos 40 anos (NA RDI ; ERTANI;
FRANCIOSO, 2016). Entretanto, em condições de campo os resultados
podem variar muito, promovendo algumas vezes inconsistência de dados
e de respostas (LITTLE er ai., 2014).
A credibilidade do uso dos biofertilizantes à base de SH é baseada
mais na experiência de uso prático, do que em resultados da experimentação
agrícola a campo. Algumas falhas nesse sentido foram observadas por
Olk et al. (2019), que indicaram a necessidade de inventariar e avaliar
os diferentes tipos de interferência em condições de campo, incluindo a
interação com os fatores ambientais, a espécie agrícola e sistema de cultivo,
o manejo da fertilidade e da irrigação, pois influenciam significativamente
os resultados obtidos. Sendo os estudos sistemáticos a campo em diferentes
condições ambientais escassos para condições de clima temperado, muito
mais raros são os resultados de ensaios em lavouras em condições tropicais.
Diferentes dos reguladores de crescimento sintetizados pela indústria
química, as SH não têm um princípio ativo definido, nem uma molécula
alvo específico na planta. Como visto anteriormente, os efeitos fisiológicos
são dependentes de muitos fatores, além do estádio de desenvolvimento
da planta, das condições ambientais e do tipo de manejo do cultivo, da
concentração, do modo de aplicação, e da fonte de obtenção das SH.
Já se sabe que a presença ou não de diferentes tipos de estresses
abióticos é determinante no efeito final de promoção do crescimento
pelas SH (ROSE et al., 2014). Por si só, os ácidos húmicos podem induzir as
respostas típicas contra estresses abióticos, tanto no nível bioquímico como
molecular (BAÍA et ai., 2020; CANELLAS et ai., 2020). As plantas estimuladas
por ácidos húmicos suportam melhor as consequências negativas dos
estresses, mitigando seus efeitos.
O manejo da fertilidade, a presença ou não de irrigação também
são fatores que já foram estudados e que afetam o desempenho de
produtos à base de SH. Existe um certo consenso na direção de que o
uso de SH permite reduzir o uso de NPK sem prejuízos para a produção
final. O quanto pode ser reduzido depende das condições locais e deve
ser determinado experimentalmente. Alguns exemplos foram citados na
Tabela 1. Lavouras experimentais conduzidas em solos excepcionalmente
férteis, com níveis elevados de MOS, com rotação de culturas e utilização
massiva de fertilizantes químicos ou orgânicos não responderam ao uso
de SH solúveis (CANELLAS et ai., 2015; HARTZ; BOTTOMS, 2010). Porém, o

89
estresse nutricional é, geralmente, a condição normal na rizosfera de solos
altamente intemperizados na zona tropical.
A Tabela 1 apresenta um extrato simplificado de alguns trabalhos
conduzidos em outros países, em condições de campo experimental, com uso
de SH solúveis ou no estado sólido em diferentes tipos de cultivos.

Tabela 1. Experimentos de campo com diferentes tipos de SH em diferenles espécies agrícolas

Princip.als
resultados Referência blbllog.-áftca

Aplicação de AH
em combinação A aplicação de
ou não com AH não teve efeito
Azotobacter em sobre a produção.
diferentes níveis A utilização
deNPK{IOO% combinada+
Milho e 50% da dose 50% NPK da ABBAS et ai. (2017)
recomendada) em dose recomen-
combinação ou dada aumentou
não com adubação significativamente
orgânica.. Solo a produção e o
com baixa retorno econômico.
fertilidade natural.

A aplicação de
AH e mistura de
Aplicação foliar micronutrientes não
deAH em duas mostrou diferenças
épocas (25 e significativas no
35 dias após o rendimento de
plantio) com Oe grãos em duas
1000mgL"1 em EL-MEKSER; MOHAMED;
localidades nas
Milho ALI (2014)
duas estações de temporadas de
crescimento e 2012 e 2013,
em duas locali- exceto em uma
dades diferentes. estação de cresci-
Diferentes níveis mento de 2013 com
20% de aumento
de micronutrientes.
em relação ao
controle.

90
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Faixas maiores
Aplicação
de concentração
de diferentes
produziram
concentrações
aumento médio de
Milho/ de AH (O, 10, DAUR; BAKHASHWAIN
12% na produção
silagem 15, 20, 25, 30 (20 13)
de silagem (massa
kg ha·') em pó
verde) e 16% na
no solo após a
massa seca do
emergência.
milho

Aumento da
Aplicação de
produção de grãos
SH líquidas
de44 e 74% em
proveniente de
relação ao controle
turfa e leonardita MOHAMMADPOURKHANEGHAH e/
Milho com os extratos de
em fertirrigação ai. (2012)
turfa e leonardita,
em seis diferentes
respectivamente.
genótipos de
Redução do uso de
milho.
NPK

22% de aumento
Aplicação foliar na produção de
de AH em grãos em relação
Trigo comparação com ao controle;
DELFINE et ai. (2005)
aplicação de N mesmo patamar de
via foliar e no produção obtido
solo. com a aplicação
foliar de N

Aplicação foliar
de diferentes Aumento da
níveis de N (O,
eficiência de uso
Trigo 60,90, 120e 150 EHSAN el ai. (2014)
de N (60 kg N ha· 1
kg ha· 1) em dois + 40 mg AH L·1)
níveis de AH (O e
40 mg L·1).

Aumento na
genninação,
Feijão absorção de
Aplicação nas
Preto AKJNCI et ai. (2009)
sementes. nutrientes, massa e
comprimento das
raízes e produção

91
 Aplicação
no solo de
Feijão Aumento de até
leonardita em ECE el ai. (2007)
Preto 12% na produção.
diferentes taxas
de fertilizantes.

Humatode
potássio
Aumento da
Feijão combinado com
produção entre 25 IBRAHIM; RAMADAN (2015)
Preto micronutrientes e
e35%.
quitosana; aplica-
ção via foliar.

Aumento no
crescimento e
no peso de 100
HA comercial
sementes (26%
Fava com aminoáci- EL-GHAMRY; EL-HAI;
em comparação
dos; aplicação GHONEEM (2009)
com o controle);
via foliar.
decréscimo da
incidência e danos
de doenças.

SH líquida/
formulação
comercial;
Aumento de 15%
combinação com
na produção e qua-
Brócolis diferentes doses SELIM; MOSA (2012)
lidade do produto; 1

de NPK (100, 75
diminuição do uso
e 50% da dose
de nutrientes
recomendada)
via fertirrigação
(120LAH ha· 1) .

Aumento da
Aplicação foliar produção de
de AH comercial; frutos entre 23 a
Berinjela 63%; aumento da AZARPOUR et ai. (2012)
diferentes doses
1

deN. eficiência de uso

1
deN.

92
 · - ~H .... criçlo
Principais
r, d_, i ~,_;,_) ;r- üifühia do Refer@ncla bibllograifica
resultados
:, "~' _erlmento
Aumento da
eficiência de uso
de nutrientes.
Aumento da
AH isolado de concentração do
DENRE; GHANTI; SARKAR
Alho turfa; aplicação ácido pirúvico
(2014)
foliar. (indicador de
pungência) de 1.96
até 2.28 vezes
em relação ao
controle.
AH de
vermicomposto;
Aumento da
aplicação via
Alface produção;
foliar; experi- HERNANDEZ et a/. (2015)
encurtamento do
mento de campo
ciclo de produção.
/agricultura
urbana.
Aplicação foliar
Aumento na
de AH comercial KANDIL; SHARIEF;
produção entre 5 e
Cebola e aminoácidos;
6% em relação ao FATHALLA (2013)
diferentes doses
controle
deN.

AH sólidos/apli-
cação no solo (O,
Aumento médio de
J, 2 e 3 kg ha·1 ); SAJID et ai. (2012)
Cebola 15% na produção
metade da dose
com 2 kg AH ha·1
recomendada
deN.

Extratos de
matéria orgânica
compostada Aumento de
Quiabo SIDDIQUI et ai. (2008)
combinado com produção
Trichoderma;
aplicação foliar.

HAeAF Aumento na
comerciais eficiência de uso
Batata SUH; YOO; SUH (2014)
aplicado no solo de nutrientes e
e via fo liar. 13% na produção.

93
 Descrição
sumária do Principais
resultados Referência bibliográfica
experimento
Aumento na
produção com
Aplicação de AH SELIM; MOSA; EL-GHAMRY
Batata redução de 25% de
via fe rtirrigação. (2009)
NPK via fertirri-
gação em conjunto
com AH
Diferentes Aumento na
regimes de produção e dos
irrigação; HA indicadores
Batata aplicados no solo bioquímicos SELIM; MOSA(2012)
em diferentes de resistência a
concentrações (O, estresse hídrico
60 e 120 kg ha· 1) . com 120 kg ha·•
Aplicação AH
comercial dire- Aumento da
Batata tamente ao solo produção entre SEYEDBAGHERJ (201 O)
em diferentes 11% a 22%.
concentrações .
Duas taxas de
aplicação de Aumento da
NPK(IO0e produção de
50% da dose batatas; diminuição
recomendada) em ABU-ZfNADA; SEKH-ELEID
Batata de custos: mesma
(2015)
combinação com produção com 50%
duas concentra- da dose de NPK e
ções de AH (15 e 20 kg AH ha·•
20 kg ba·1) .

Aumento da
produção de frutos
Lixiviado de
entre 10e 14% em
vermicomposto;
Morango relação ao controle SINGH et ai. (2010)
aplicação via
e diminuição da
foliar.
incidência de
doenças.

AHem
Aumento na
diferentesconcen-
Morango eficiência de uso AMERI; TEHRANIFAR (2012)
trações via foliar de N
e fertirrigação.

94
 Tomados em conjunto, os resultados da Tabela l apontam para
um aumento médio em tomo de l 0% na produção e economia de ¼ de
fertilizantes (principalmente N, o mais estudado). Não é possível indicar uma
concentração média de SH para atingir esses resultados, dado a diversidade
dos tratamentos empregados e condições nos experimentos. Chen, Nobili e
Aviad (2004) sugerem uma indicação geral de concentração para aplicação
via foliar de, no mínimo, 0,5 kg de AH proveniente de turfas/leonardita por
hectare, para estimular processos fisiológicos e aumentar a produção. Em um
cálculo aproximado, considerando o valor médio de 55% de C nas SH e uma
taxa de aplicação de calda de 200 Lha·' para gotas < l 05 µm, a recomendação
equivale a uma concentração aproximada de 115 mM C L- 1 de calda. Porém,
utilizando concentrações muito menores (4 mM C L·') de AH isolados de
vermicomposto aplicados via foliar, foram obtidos aumentos médios de
produção de milho de 17% em ensaio a campo em solo tropical altamente
intemperizado (CANELLAS et ai., 2013), indicando que o ambiente e o manejo
são determinantes na definição da concentração de SH.
Lyons e Gene (2016) em trabalho de revisão bibliográfica,
citaram alguns experimentos sem resposta significativa com uso de
SH, e atribuíram os resultados ao uso de concentrações muito baixas.
Entretanto, interações fundamentais com o tipo de manejo, uso da água
e fertilizantes, tipo de solo e condições ambientais, como condições de
estresse, não foram consideradas.
Por outro lado, em trabalhos de longa duração, foram observados
resultados consistentes. Brownell et ai. (1987) avaliando o uso de AH
isolados de leonardita, observaram aumento médio de 10,5% e 11 % na
produção de tomate e de algodão, respectivamente em várias safras.
Verlinden et ai. (2009) compilaram os resultados da aplicação de SH
obtidas de leonardita na produção e na absorção de nutrientes em seis
experimentos de campo e dois em casa de vegetação, com pastagem, milho,
batata e espinafre, em sistemas de produção com utilização intensiva de
insumos, sendo as SH aplicadas no solo na forma líquida ou misturadas
aos fertilizantes na forma sólida. A análise geral dos resultados indicou
aumento significativo na produção da pastagem, um acréscimo entre 13 a
17% na produção de batata e efeito pouco significativo sobre a produção
do milho, este atribuído ao elevado nível nutricional do solo. Já Olk et ai.
(2013), avaliaram durante três anos consecutivos 35 cultivos comerciais de
milho com manejo convencional, utilizando extrato líquido de leonardita
aplicados a uma dose equivalente a 3,57 L ha·1, na maioria dos casos na
forma de spray foliar junto com a aplicação de rotina dos agrotóxicos, e
observaram aumento significativo de produção de grãos, na média de 8.4%
em 70 a 80% dos plantios estudados. Seyedbagheri (201 O) compilando os
resultados de anos de experimentação com diferentes formas de aplicação

95
e tipos de SH em batata (Solanum tuberosum) calculou um efeito médio
de 11 ,4% no aumento da produção, com incremento máximo de 22,3%.
No Brasil, a compilação dos resultados da experimentação a campo
também enfrenta o problema da alta heterogeneidade. A seguir foram
reunidos alguns experimentos indicando a viabilidade do uso das SH em
clima tropical e subtropical.
Na Circular Técnica 35 da Embrapa, Benites et ai. (2006), reportam
o resultado de aplicações foliares de ácidos húmicos em experimento a
campo com soja, indicando um aumento médio de 17% na produção. Não
foram observadas diferenças significativas entre os estádios de aplicação
e entre as concentrações utilizadas, sendo a menor concentração (aproxi-
madamente 8 mM C AH L-1) a de máximo retorno. Já Ruwer et ai. (2019),
obtiveram um patamar menor de aumento de produtividade da soja em
pesquisa conduzida em três anos agrícolas consecutivos, ou seja, quatro
safras, em área com 24 anos de plantio direto consecutivo, utilizando um
produto comercial na concentração de aproximada de 480 mM C L·1 de
calda aplicada. Em todas as safras foi observado aumento da produtivida-
de com a aplicação de SH, variando de 2, 1 a 4,6%.
A cana-de-açúcar ocupa a terceira maior área plantada depois da
soja e do milho e pode responder positivamente à aplicação de SH. Por
exemplo, Gullo (2006) conduziu dois experimentos no interior de São
Paulo em solo arenoso de baixa fertilidade natural com aplicação de
produto comercial à base de ácidos húmicos, realizado com duas (O e
350 L ha· 1) e três (O, 300, 600 L ha- 1) concentrações, em cana planta e
cana soca, respectivamente, e diferentes níveis de adubação mineral. Foi
possível observar efeito significativo da aplicação de SH na produção
de colmos, tanto na cana planta como na cana soca, e interação com
a adubação mineral. Rosato et al., (2010) aplicaram produto húmico
comercial no sulco de plantio em oito cultivares de cana e monitoraram
aspectos qualitativos, sendo que uma das oito cultivares apresentou
acúmulo mais significativo de sacarose.
Oliveira et al. (2018), em experimento com uso intenso de adubação
mineral, realizaram aplicação foliar de dois produtos comerciais à base de
SH após a rebrota da cana, observando incremento de produção de colmos,
que passou de 127 para 166 Mg ha-1, porém, sem incremento na qualidade
industrial. Tanto nos experimentos de Gullo (2006) como Oliveira et al.
(2018) foram observados aumentos da absorção de nutrientes nas plantas
tratadas com SH, revelando maior eficiência do uso de fertilizantes.
O aumento da eficiência da absorção foliar de N-ureia em cana-de-
açúcar tratada com SH e ácidos húmicos isolados de turfa, foi avaliado
por Leite et al. (2020) em experimentos de campo em dois locais distintos
(São Paulo, Brasil; e Kansas, Estados Unidos). O uso da ureia marcada
com isótopo 15N permitiu acompanhar a eficiência de assimilação do N nas

96
folhas. Em ambos os experimentos foi observado aumento da eficiência
de uso do N quando a ureia foi aplicada em conjunto com suspensão de
SH. A magnitude de resposta foi maior no experimento localizado em SP,
e as diferenças atribuídas às variações de cultivar, clima e solo. Os autores
também observaram a maior conversão do N-ureia em NH/ nas folhas
tratadas com AH ou SH, provavelmente devido a ativação do sistema
enzimático da urease e da H"-ATPase.
Além das commodities agríco las, as S H podem aumentar a produção
de alimentos. Bettoni et ai.(2016) avaliaram a produção de cebola (Allium
cepa cv alfa São Francisco Ciclo VIII da Embrapa) em experimento de
campo em sistema orgânico e solo com CTC elevada (20 Cmolc dm·3),
testando a imersão de mudas e imersão seguida de pulverizações foliares
com soluções de SH ao longo do ciclo. Como resultado, a combinação
da imersão com pulverizações promoveu o aumento da biomassa dos
bulbos e da produtividade, bem como, aumentos nos teores de P, K, Mg, e
açúcares solúveis nos bulbos. Borcioni, Mógor e Pinto (2016) conduziram
experimentos simultâneos em casa de vegetação e campo experimental
com alface americana, usando diferentes concentrações de ácidos fiílvicos
comerciais. As concentrações variaram na faixa aproximada de 7,5, 15, 30
e 60 mM CAF L·1, com aplicação realizada pela imersão das mudas um dia
antes do transplantio. A imersão nas soluções com diferentes concentrações
de ácido fülvico promoveu o crescimento das plantas de alface, em
especial do sistema radicular. A emissão de raízes, com predominância das
de menor diâmetro, foi encontrada nas maiores concentrações de ácido
fiílvico. A concentração de aproximadamente 15 mM C AF L·1 resultou em
maior massa fresca de folhas, número de folhas e circunferência da cabeça
de alface americana, ou seja, em melhor desempenho agronômico.
Recentemente, Amatussi et ai. (2020) baseados na hipótese de que
as deposições da alga calcária Lithothamnium sp. (Rodófita) no fundo
do oceano contêm SH bioativas que podem promover o crescimento das
plantas, conduziram trabalho que comprovou a presença de SH com alto
grau de polimerização e bioatividade. Quando aplicado em pulverização
foliar, a suspensão da alga calcária micronizada estimulou o enraizamento,
o crescimento e a produtividade de plantas de tomate, promovendo
aumentos nas concentrações de aminoácidos, açúcares e proteínas, como
efeitos relacionados à presença de SH. Da mesma maneira, Mógor et ai.
(2021 ), utilizando a alga calcária micronizada em pulverizações foliares
em duas cultivares de cebola, verificaram a promoção do crescimento
e aumento da produtividade comercial, relacionando os ganhos a
alterações no metabolismo dos aminoácidos e estímulo à translocação
de fotoassimilados para os bulbos. Além disso, a maior aquisição de
nutrientes também foi alcançada pelo estímulo à emissão de raízes finas,
como consequência da bioatividade da SH.

97
5. Obtenção de substâncias húmicas
Os biofertilizantes de substâncias húmicas, são definidos como
sendo produtos obtidos por decomposição e solubilização de materiais
orgânicos e posterior oxidação e polimerização, formadas basicamente por
ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e hum inas (BRASIL, 2020), sendo em geral
obtidos de matéria orgânica naturalmente humificada como turfa, biomassa
compostada e vennicompostos, ou de depósitos minerais de leonardita (DU
JARDIN, 20 15).
A obtenção das SH de diferentes fontes, se dá pela solvatação de
grupos funcionais de natureza ácida em meio alcalino obtido com base
forte diluída e a separação efracionamento em diferentes valores de pH
em função de sua solubilidade em: ácidos húmicos, ácidos fúlvicos e
humina. De acordo com Sai to e Secklers (2014), em trabalho com turfa, o
procedimento clássico da obtenção de SH da matéria orgânica consiste em
uma extração alcalina de ácidos húmicos e fúlvicos, deixando um resíduo
sólido formado por humina, matéria orgânica não humificada e material
inorgânico. Na sequência, a acidificação do extrato alcalino promove a
precipitação dos ácidos húmicos, deixando os ácidos fúlvicos em solução,
procedimento que leva a separação da matéria orgânica em frações de
compostos com características químicas semelhantes (BENITES; MADARI;
MACHADO, 2003).
Uma fonte frequentemente utilizada em produtos comerciais é a
leonardita, mineral que contém 30-80% de SH, sendo uma forma oxidada
de linhita, geralmente encontrada em áreas pouco profundas cobrindo
o carvão mais compacto em uma mina de carvão. O nome se deu em
homenagem ao geólogo Arthur Gray Leonard, em reconhecimento à
suas contribuições na pesquisa com esse mineral (QUIAN et al., 2015). A
extração das SH de leonardita, em geral segue protocolo preconizado pela
Jnternational Humic Substances Society (IHSS), para padronização da
extração de SH do solo (SWIFf, 1996).
O Comunicado Técnico 16 - Embrapa Solos, apresenta a descrição
da extração de SH de solos (BENJTES; MADARI; MACHADO, 2003), enquanto
Canellas, Guridi e Velloso (2005), em texto a respeito do isolamento,
purificação e métodos de análise de substâncias húmicas, descrevem de
forma detalhada os procedimentos para extração e caracterização ·de SH
e outras frações org~nicas, como parte do trabalho clássico "Humosfera:
Tratado preliminar sobre a química das substâncias húmicas" (CANELLAS;
SANTOS, 2005).

6. Caracterização de substâncias húmicas

Após a extração das SH é preciso determinar o conteúdo de carbono
presente na amostra. Vários métodos analíticos podem ser empregados

98
nessa determinação sendo a combustão por via úmida o mais empregado
em função da facilidade. Esse método é conhecido como Walkley & Black,
sendo utilizado como método de rotina na maioria dos laboratórios de
análise. A técnica da combustão via seca empregada nos equipamentos
conhecidos como analisadores elementares apresenta a vantagem da rapidez,
a lta reprodutibilidade e não gera resíduos tóxicos ao ambiente, mas enfrenta
a desvantagem do alto custo do equipamento e dos consumíveis. Além do
conteúdo de carbono as SH podem ser quanlificadas gravimetricamente
indicando-se a massa contida num determinado volume (teor). Em um
produto biofertilizante à base de SH, a garantia deve ser dada pelo seu teor
(%) de ácidos húmicos e/ou ácidos fúlvicos (BRASIL, 2020).
A caracterização da natureza química das SH pode ser realizada
por diferentes métodos químicos e espectroscópicos. A técnica mais
poderosa para acessar a natureza química e a funcionalidade das SH
é a ressonância magnética nuclear (RMN) do isótopo 13 C (CONTE et
ai., 2002). A técnica é quantitativa e permite identificar a presença dos
principais grupamentos funcionais, sendo cada núcleo de 13 C observado
numa região típica do espectro: grupamentos alquílicos (0-30 ppm),
metoxilas (56 ppm), C-alquílico ligado a O e/ou N (50-70 ppm), C
anomérico (100-110 ppm), C aromático não substituído (120-140 ppm),
C aromático substituído (fenóis) (150-160 ppm) e grupos carboxílicos
(160-200 ppm). Já a composição molecular das SH pode ser acessada
com uso da pirólise acoplada à cromatografia gasosa (CG) e espec-
trometria de massas (EM). Os produtos da reação de termoquemólise
(pirólise) são separados pela CG e identificados com a EM (]ANOS et
ai., 2003). A identidade química das SH também pode ser acessada com
o uso da espectroscopia na região do infravermelho que apresenta uma
região de absorção típica, própria para cada tipo de substância conhecida
como região de impressão digital. A técnica é relativamente simples e
rápida e especialmente útil para identificar a presença de grupos com
grande diferença de polaridade como ligações O-H, C-O, C=O e COOH.
A presença de cromóforos nas SH é facilmente determinada com o uso
da espectroscopia na região do ultravioleta e visível e pode ser utilizada
para uma avaliação expedita indireta do grau de aromaticidade das SH
(SAAB, MARTIN-NETO, 2007).
Métodos de separação como a cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) por exclusão de tamanho permitem relacionar aspectos
da eluição (passagem de um fluido ou eluente por um adsorvente com
diâmetro fixo) com o raio hidrodinâmico das SH e, indiretamente, com a
distribuição da massa molecular.
A Figura 5 apresenta o resumo gráfico do efeito de substâncias
húmicas como biofertilizante.

99
 Aumento na atividade de Aumento na
enzimH relacionadas com atividade de
a assimilaçlo do N enzimas
relacionadas
coma
fotossfntese

aos estresses
1bl6ticos

lnduçloda
sfntese de
H+-ATPase

Aumento do sistema
radicular
Estimula a emisslo de
Incremento na ndicelas
absorçlo de Estimula a interaçlo
nubientes com microorganismos
benlficos

Figura 5. Resumo gráfico do efeito de substâncias húmicas (SH) como biofertilizante

Setas azuis representam os efeitos de SH nas raízes e absorção de nutriente. Setas vermelhas
representam os efeitos sistêmicos das SH no metabolismo vegetal

100
 CAPÍTULO V

BIOENSAIOS E DETERMINAÇÕES BIOQUÍMICAS NA

AVALIAÇÃO DA BIOATIVIDADE DE BIOFERTILIZANTES
Gilda Mógor, Juliana de Oliveira Amatussi
e Ely Cristina Negrelli Cordeiro

1. Introdução
Segundo Mógor et ai. (20 I'7), a técnica de bioensaios relaciona
a diferenciação e expansão de partes específicas de plantas modelo
em condições controladas, como raízes, hipocótilos e cotilédones, aos
efeitos de substâncias bicativas, bem como, a alterações bioquímicas
nos tecidos vegetais.
Os bioensaios podem identificar a bioatividade, ou seja, o efeito
benéfico que um biofertilizante apresenta sobre o todo ou parte das
plantas (BRASIL, 2020) de maneira rápida e eficaz, avaliando variáveis
biométricas (ex. comprimento, volume e fracionamento das raízes em
diâmetros, expansão das folhas, ontogenia) e bioquímicas (ex. teores
de aminoácidos livres, pigmentos, açúcares, proteínas e enzimas)
como resultado da ação de compostos biologicamente ativos.
Preferencialmente, a condução de bioensaios deve ser realizada
em condições controladas, como câmaras de crescimento, ou em
ambientes protegidos, como casas de vegetação.
As plantas mais adequadas para serem utilizadas em bioensaios
são as que apresentam ciclos curtos, metabolismo acelerado ou maior
sensibilidade ao potencial componente bioativo do biofertilizante, ou
ainda, serem utilizadas as espécies agrícolas de interesse, nesse caso,
limitando-se a estádios fonológicos específicos, já que os bioensaios
não têm por objetivo quantificar a produção agrícola. Para os
tratamentos, devem ser considerados no mínimo: controle absoluto,
dose recomendada e controle positivo com um produto semelhante
às características do biofertilizante a ser testado, se houver. No caso
da presença de nutrientes adicionados ao produto após a obtenção
da fração orgânica bioativa, estes devem ser utilizados como
controle positivo na concentração equivalente à dose utilizada do
biofertilizante, isolando assim, o efeito bicativo do eventual efeito
nutricional (BRASIL, 2020).
A seguir são apresentados alguns exemplos de trabalhos com
bioensaios, separados de acordo com as condições de condução e
similaridade das variáveis analisadas.

101
2. Bioensaios conduzidos em câmaras de crescimento
2.1 Bioensaios de crescimento das raízes
Tripepi e George (1991) conduziram bioensaio para quantificar o cres-
cimento das raízes de Jligna radiata L., utilizando plântulas que apresentavam
expansão completa das folhas cotiledonares, sendo seccionadas próximo ao colo
para separação das raízes, e em seguida, a parte aérea colocada em recipientes
contendo as soluções a serem testadas e mantidas em câmara de crescimento
por período determinado, avaliando no final o crescimento de raízes adventícias.
Amatussi el ai. (2020); Gemin et ai. (2019); Mógor et ai. (2017) e Mógor
et ai. (2018) utilizando a metodologia proposta por Tripepi e George ( 1991)
com adaptações, realizaram bioensaios visando verificar o efeito de diversas
fontes bioativas em V. radiata, mantidas em câmara de crescimento com
fotoperiodo de 12 h a 22ºC durante 15 dias, avaliando o crescimento (Figura
1) e o fracionamento das raízes por diâmetro com o software WinRhizo®,
acoplado a um Scanner LA 1600 (Regent lnstruments Inc., Canadá).
A Figura 1 apresenta imagens de bioensaios de crescimento de raízes com
V. radiata.

Figura 1. Bioensaio com plântulas de Vigna radiata L. (a) Plântulas em substrato (b) Plântulas
nas soluções, apresentando crescimento e sintomas de toxidez (c) Alterações no comprimento e
morfologia das raízes. Laboratório de Biofertilizantes da Universidade Federal do Paraná (2020)

102
 Colla et ai. (20 14) conduziram bioensaio com estacas de plantas
de tomate (Solanum lycopersicon) para avaliar o crescimento de raízes
adventícias. A semeadura foi realizada em bandejas em câmara de
crescimento com fotoperíodo de 12 h. Após 35 dias, as plantas foram
seccionadas na base do caule e imersas em soluções com o produto a ser
testado, em seguida sendo transferidas para caixas com perlita umedecida.
Após 8 dias, as plantas de tomate foram separadas em parte aérea e raízes
para determinação da biomassa e emissão de raízes adventícias.
Subbarao et ai. (2015) utilizaram sementes de arroz ( Oryza saliva)
pré-germinadas acondicionadas em tubos de ensaio com as soluções a
serem testadas e mantidas no escuro por 7 dias, ao final foram avaliados a
elongação das raízes e coleóptilos.
Na Tabela 1 são relacionados trabalhos utilizando bioensaios que
avaliam a expansão radicular.

Tabela 1. Bioensaios para avaliação da expansão radicular

- --------- --~ -

· ,· !]tdf;.Jí{~.,:r.;(,:r

Arabidopsis thaliana RAYORATH el ai. (2008)

TRIPEPI; GEORGE (1991); UPADHYAYA et ai. (2014);
Vigna radiata MÓGOR et ai. (2017); MÓGOR el ai. (2018); GEMIN et ai.
(2019); AMATUSSI et ai. (2020)
So/anum lycopersicum COLLA el ai. (2014)

Pennisetum glaucum SUBBARAO el ai. (2015)

ERTANI et ai. (2016); ERTANI el ai. (2018); ERTANI et ai.
Lepidium salivum
(2019)
Zeamays ERTANI et ai. (2012)

Oryza saliva SUBBARAO et ai. ·(201.S)

2.2 Bioensaios de expansão de cotilédones, coleóptilos,

hipocótilos e epicóti.los
Zhao et ai. (1992) conduziram bioensaio com cotilédones de pepino
(Cucumis sativus), sendo inicialmente as sementes colocadas em substrato
e mantidas no escuro até a germinação e expansão inicial dos cotilédones,
que foram separados e .acondicionados em caixas tipo gerbox, contendo
papel filtro embebido nas soluções a serem testadas. Foram quantificados
a massa fresca, volume e diâmetro dos cotilédones, bem como o número
de raízes emitidas a partir dos cotilédones.
Stirk et ai. (2002) conduziram bioensaios quantificando a massa
fresca, volume, diâmetro dós cotilédones de pepino (Cucumis sativus),

103
enquanto Fellner et ai. (2001) quantificaram a expansão dos hipocótilos de
tomate (So!anum lycopersicon).
Colla et ai. (2014) conduzirnm bioensaio com coleóptilos de milho (Zea
mays) utilizando sementes germinadas em câmara de crescimento até que os
coleóptilos atingissem 3 cm de comprimento. Os coleóptilos foram separados e
padronizados no comprimento de 2 cm. Esses segmentos foram colocados em
placas de Petri contendo 20 mL das soluções a serem testadas e mantidas em
câmara de crescimento por 48h no escuro a 24ºC. A expansão dos coleóptilos
foi determinada, em comprimento. De maneira similar, Ertani et ai. (2019)
determinaram aumento no comprimento dos epicótilos de alface (Lactuca
sativa) para a identificação de bioatividade de diferentes fontes bioativas.
Na Tabela 2 são relacionados trabalhos utilizando bioensaios que
avaliam a expansão e desenvolvimento de cotilédones, hipocótilos, coleóp-
tilos e epicótilos.
Tabela 2. Bioensaios para avaliação da expansão e desenvolvimento de cotilédones,
hipocótilos, coleóptilos e epicótilos
·.~ . ·--11 . -
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',
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l}i:\"fJ.1}lll-UfüBm®)
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1

. .. . •• f:lfG.11trir(,
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.

Cucumis sativus Expansão de cotilédones ZHAO et ai. (1992);

e raízes STIRK et ai. (2002);
MÓGOR et ai. (2017);
NAVARRO-LÓPEZ t?I
ai. (2020)

Zea mays Crescimento de coleóptilos COLLA et ai. (2014)

ERTANI et ai. (2016);
Lactuca saliva Crescimento de epicó_tilos ERTANl et ai. (2018);
ERTANI et ai. (2019)

Solanum lycopersicon Expansão do hipocótilo HUMPLÍK et ai. (20 I 5)

3. Bioensaios em vasos
Resultados de pesquisas conduzidas em vasos e ambiente protegido
são frequentemente encontradas na literatura científica. Classificados
também como bioensaios na legislação de biofertilizantes (BRASIL, 2020),
trabalhos conduzidos em vasos podem identificar efeitos bioativos em
variáveis biométricas e bioquímicas em estádios fonológicos específicos,
bem como, possíveis efeitos da mitigação de estresses abióticos, como a
restrição hídrica e a salinidade excessiva.
Alguns exemplos são os trabalhos relacionados à promoção do
crescimento das plantas em função de tratamentos com fontes bioativas,
como o de Colla et ai. (2014), utilizando plantas de ervilha (Pisum sativum)
com hábitos de crescimento diferentes para identificar alterações no

104
 alongamento dos caules; o de Subbarao et ai. (2015), utilizando plantas
de feijão caupi (Vigna unguiculata) mensurando o crescimento das raizes,
caules, expansão da área foliar e teores de clorofila; o de Ertani et ai. (2018),
utilizando plantas de milho (Zea mays) detenninando a biomassa das raízes,
colmos e folhas, bem como teores de açúcares e atividade de enzimas; o de
Borcioni et ai. (2016), utilizando plantas de alface (Lactuca saliva) para a
identificação de alterações no crescimento e diâmetro das raízes; enquanto
Amatussi et ai. (2020) e Gemin e/ ai. (2019) identificaram o crescimento e
alterações bioquímicas em plantas de cebola (Allium cepa).
Outros exemplos de trabalhos conduzidos em vasos são os
relacionados ao estudo dos efeitos e mitigação de estresses abióticos, como
o de Outra et ai. (2012), avaliando o efeito da restrição hídrica em plantas de
girassol (Helianthus annuus); o de Zhang et ai.(2016), avaliando alterações
metabólicas em folhas de soja (Glycine max) submetidas à salinidade; assim
como os de El Sayed (2011) avaliando o crescimento e desenvolvimento
de feijão-fava (Vicia faba); Alves et ai. (2013) avaliando o crescimento
do cajueiro anão (Anacardium occidentale) e Butt et ai. (2016) avalindo
alterações fisiológicas e bioquímicas em pimentão ( Capsicum annuum L. ),
todos com imposição de salinidade.
Na Tabela 3 são relacionados trabalhos conduzidos em vasos e em
ambiente protegido, para identificação da ação de compostos bioativos em
variáveis biométricas, bioquímicas e submetidas aos estresses abióticos.
Tabela 3. Bioensaios conduzidos em vasos para a avaliação do efeito de compostos
bioativos em variáveis biométricas, bioquímicas e submetidas aos estresses abióticos
- - - - .. - - - ,... - -
~~ -- --- ~ -
• , 11 \~IW'1] ~ l l tTufG"i:Efft.0
1
- - - -

Piswn sativum COLLA et ai. (2014)

SUBBARAO et ai.
Vigna unguiculata
(2015)

Beta vulgaris MÓGOR et ai. (2018)

Expansão de fo lhas,
caules e raízes GEMJN et ai. (2019);
Allium cepa AMATUSSI et ai. (2020)

So/anum lycopersicum KHAN et ai. (2020) .

Lactuca saliva BORCIONI et ai. (2016)

105
 .. _-.-.
;, r_ 11.,·;_)1.ü.@;~ . Variável avaliada
J, .•-,. ••

SUBBARAO et ai.
Raphanus sativus
(2015)
Aumento da biomassa
ERTANI etal. (2016);
Zea mays
ERTANI et ai. (2019)
SUBBARAO et ai.
Vigna unguiculata
(2015)
ERTANI et ai. (2016);
'Zea mays ERTANI et ai. (2018);
ERTANI et ai. (2019)
Alterações em variáveis
Beta vulgaris MÓGOR el ai. (2018)
bioquímicas
Allium cepa GEMIN et ai. (2019)

Glycine max ZOBIOLI et ai. (2010)

Solanum lycopersicum KHAN et ai. (2020)

Helianthus annuus DUTRA et ai. (2012)

Glycine max ZHANG et ai. (2016)

Vicia/aba Estresses abióticos EL SAYED (2011)

Anacardium occidentale ALVES el ai. (2013)

Capsicum annuum L. BUTT et ai. (2016)

4. Determinações bioquímicas em plantas

O conhecimento dos processos metabólicos permite relacionar
os efeitos de compostos bioativos ao desenvolvimento, crescimento e na
adaptação das plantas aos estresses abióticos. A identificação e quantificação
de substâncias específicas do metabolismo, utilizando técnicas de análises
bioquímicas, podem contribuir para a elucidação dos efeitos de produtos
biofertilizantes, servindo de marcadores metabólicos para a caracterização
da sua bioatividade.
Sem a menor pretensão de esgotar o tema, a seguir são apresentados
alguns resumos de metodologias básicas utilizando espectrofotômetro
(UV-vis), para identificação e quantificação de indicadores bioquímicos
do metabolismo vegetal. A espectrofotometria, também denominada
como técnica colorimétrica, é uma das técnicas analíticas mais utilizadas
para determinações quantitativas de espécies químicas, devido à robustez,
instrumentação relativamente simples e de baixo custo, e ao grande
número de aplicações desenvolvidas. E~ta técnica consiste na medida da

106
absorção de radiação eletromagnética nas regiões visível e ultravioleta
por espécies químicas (moléculas ou íons) em solução (BERGAMTN FILHO
et ai. , 20 10), ou seja, o espectrofotômetro fornece um número chamado
absorbância, que é diretamente proporcional à concentração da espécie
química responsável pela cor.
Para usar a absorbância com finalidade analítica, uma curva de
calibração deve ser gerada pela medida da absorbância de várias soluções
contendo concentrações conhecidas do analito (substância ou componente
químico) em uma amostra (SKOOG et ai., 2006). A amostra deve ser comparada
a uma referência negativa, ou ensaio em branco (branco), que contém todos
os reagentes menos a substância de interesse, e a padrões da substância que
se quer analisar, em concentrações conhecidas. A absorbância de amostras e
padrões é medida em um detem1inado comprimento de onda (À), e expressa
em nanômetro (nm). (MURITO; FINETE, 2010).
4.1 Coleta de amostras
A coleta do material vegetal deve considerar:
• O estádio fonológico e a padronização da coleta, por exemplo:
terço médio de plantas de soja aos 45 dias após a emergência,
ou folha abaixo da segunda ráquis em plantas de tomate aos 60
dias após o transplantio.
• O horário da coleta com temperaturas amenas no período inicial
da manhã.
• O resfriamento e rápido congelamento do material vegetal.
4.2 Variáveis bioquímicas
4.2.1 Pigmentos
Nas análises de clorofilas e carotenoides, a extração dos pigmentos
das folhas pode ser realizada segundo Lichtenthaler ( 1987), com acetona
80%. O procedimento deve ser realizado em ambiente protegido da luz,
para que não ocorra degradação dos pigmentos. Após a extração, a amostra
é centrifugada e o sobrenadante utilizado para as leituras das absorbâncias
(À= 663, 647 e 470 nm), sendo o branco realizado com acetona 80%.
Os teores de clorofila a, b, total e carotenoides na amostra são obtidos
aplicando as fórmulas propostas por Lichtenthaler ( 1987), Lichtenthaler e
Buschmann (2001):
Clorofila a (C11)= 12.25 (A663 ) - 2.79 (A648)
Clorofila b (Ci) = 21.50 (A-646_8) - 5.10 (A66)
Clorofila Total= 7.15 (A663) + 18.71 (A646_8)
Carotenoides = (1000 (A470) - 1.82 (Cª) - 85.02 (Cb))/198

107
 Após aplicar os valores das absorbâncias nas fórmulas, o cálculo
final é realizado de acordo com a quantidade utilizada de solução extratora.
Os resultados são expressos em mg de pigmento por grama de massa
fresca (mg g-1).

4.2.2 Açúcares solúveis totais e redutores

A análise de açúcares solúveis totais e redutores pode ser realizada
como descrito por Hodge e Hofreiter ( 1962) (por meio das reações com
antrona, À= 620 nm) ou Maldonade el ai. (2013), (por reações de óxido-
redução, À= 540 nm).
A metodologia de Maldonade et ai. (2013) utiliza o teste de DNS
(ácido dinitrosalicílico), fundamentado na reação entre o açúcar redutor
e o ácido 3,5-dinitrosalicílico, como agente oxidante.
A análise de açúcar total é precedida de hidrólise ácida, para a
quebra dos açúcares não-redutores em redutores, utilizando a amostra e
HCl (2N). Os tubos de ensaio são colocados em banho-maria (aproxi-
madamente 100ºC) durante 1O minutos, sendo posteriormente realizado
o resfriamento e adicionado NaOH (2N). A reação colorimétrica ocorre
em ambiente protegido da luz, utilizando a amostra e o reagente DNS
(ácido 3,5 dinitrosalicílico, NaOH, fenol e metabissulfito de sódio), que
são submetidos novamente ao aquecimento/resfriamento, sendo ao final
adicionado solução de tartarato duplo de sódio e potássio ( sal de Rochelle).
A quantificação dos níveis de açúcares utiliza glicose (1 mg mL·1)
para a curva padrão, e o branco corresponde à adição de todos os reagentes,
exceto a amostra. Os resultados são expressos em µg g· 1•

4.2.3 Aminoácidos livre totais

Aminoácidos livres totais podem ser extraídos seguindo o método
proposto por Magné e Larher (1992). Na amostra são adicionados tampão
citrato pH 4,6 (0,2 M) (ácido cítrico e NaOH em água destilada) e solução
de ninhidrina (ninhidrina 1% e ácido ascórbico 0,03% em metoxietanol)i
Após agitação (tipo vórtex) os tubos. de ensaio são transferidos para banho-
maria (aproximadamente I00ºC) durante 15 minutos. Após o resfriamento
ocorre a adição de etanol 60%, seguido novamente de agitação. Os teores de
aminoácidos livres totais são obtidos a p~ir de curva padrão de aminoácidos
(asparagina, glut~mina 2 mM). O branco corresponde à adição de todos os
reagentes, exceto a amostra. As leituras das absorbâncias são realizadas a
570 nm, e os resultados expressos em µg g·1•

108
 4.2.4 Prolina livre
O aminoácido prolina pode ser quantificado de acordo com a
metodologia de Bates, Waldren e Teare ( 1973). Neste método a extração
do material vegetal é realizada com ácido sulfossalicílico 3%. Para
quantificar o conteúdo de prolina nas plantas a reação colorimétrica deve
ocorrer protegida da luz, utilizando a amostra extraída e ninhidrina ácida
(solução contendo ninhidrina, ácido fosfórico e ácido acético glacial),
permanecendo em banho-maria (aproximadamente J00ºC) durante uma
hora, para o desenvolvimento da cor. A reação é interrompida com a imersão
dos tubos de ensaio em banho de gelo. Posteriormente é acrescentado
tolueno, seguido de agitação, e na sequência ocorre separação de fases.
A quantificação dos níveis de prolina livre é realizada com curva padrão,
utilizando como branco o tolueno. As leituras das absorbâncias são
realizadas a 520 nm, utilizando a fase superior da amostra, e os resultados
expressos em µg de prolina livre por grama de massa fresca (µg g- 1).

4.2.5 Compostos fenólicos totais

A determinação dos compostos fenólicos totais pode ser realizada
pelo método Azul da Prússia (À = 700 nm) (PRICE; BUTLER, 1977) ou do
reativo de Follin-Ciocauteu (À= 760 nm) (WOISKY; SALATINO, 1998), sendo
a extração realizada com metanol 80%. O branco corresponde à adição
de todos os reagentes, exceto a amostra. A curva padrão é realizada com
ácido gálico e as leituras das absorbâncias são realizadas a 700 ou 760 nm,
de acordo com a metodologia a ser seguida, e os resultados expressos em
µg g"" 1 OU mg g"° 1•

4.2.6 Flavonoides totais

Na metodologia descrita por Zhishen et ai. ( 1999), a extração
dos flavonoides totais é feita com metanol 80% e a determinação
ocorre por complexação com o íon alumínio {AP+). A amostra
extraída é adicionada na solução de NaNO2 , seguido da solução de
AlCl . Posteriormente ocorre incubação durante 5 minutos, sendo
acre:centado ao final a solução de NaOH (1 M). As leituras das
absorbâncias são realizadas a 51 O nm, sendo os teores de flavonoides
totais expressos em equivalentes de quercetina, utilizando curva
padrão. O branco corresponde à adição de todos os reagentes, exceto
a amostra. Os resultados são expressos em µg g- 1•

4.2. 7 Proteínas solúveis totais

A determinação de proteínas solúveis totais pode ser realizada
utilizando a metodologia proposta por Bradford ( 1976), que implica na
adição de etanol, ácido fosfórico e corante Azul Brilhante de Coomassie

109
à solução contendo prote ínas. As leituras das absorbâncias são realizadas
a 595 nm , e comparadas com curva padrão de proteína, utilizando BSA
(soro de a lbumina bovina) ou caseína. O branco corresponde à adição de
todos os reagentes, exceto a amostra. Os valores finais são ajustados de
acordo com a quantidade utilizada de solução extratora. Os resultados
são expressos em µ g de proteína por grama de massa fresca (µg g·1) , e
também são utilizados para os cálculos da atividade das enzimas catalase,
peroxidase e superóxido dismutase.

4.2.8 Enzima fenilalanina amônia-liase (FAL)

A atividade da FAL, que em última análise está relacionada à
síntese de lignina, pode ser determinada de acordo com a metodologia
proposta por Umesha (2006). Após a maceração do material vegetal
ocorre a homogeneização com tampão TRIS-HCI pH 8,8 (25 mM), e
posteriormente a centrifugação. Para a determinação da atividade da
enzima é adicionado ao extrato o tampão TRIS- HCI pH 8,8 (25 mM) e
fenilalanina 50 mM. Posteriormente, ocorre a incubação a 40ºC durante
duas horas, sendo a análise interrompida após adição de HCI (5N).
As leituras das absorbâncias são realizadas a 290 nm, sendo
o branco todos os reagentes, exceto a amostra, enquanto o controle de
reação de cada amostra corresponde à adição de todos os reagentes,
exceto a fenilalanina (50 mM). Para o cálculo da atividade da enzima é
determinada a produção de ácido trans-cinâmico a partir da fenilalaruna.
Os valores finais são obtidos com base em curva padrão ~e ácido trans-
cinâmico e os resultados expressos em µg ácido trans-cinâmico por mg· 1
de proteína por h· 1•
4.3 Enzimas relacionadas aos estresses abióticos
Após a maceração do material vegetal em nitrogênio líquido, ocorre
a maceração em tampão fosfato de potássio pH 6,8 (O, 1 M) e o extrato
obtido é centrifugado. Ao final, os sobrenadantes das amostras ( extrato
vegetal) são armazenados em freezer para utilização na detenninação de
proteínas e de enzimas relacionadas às respostas das plantas aos estresses
oxidativos, como a catalase, peroxidase e superóxido dismutase (KAR;
MISHRA, 1976).

4.3.1 Catalase (CAT)

Para a determinação da atividade da CAT, de acordo com a
metodologia de Peixoto et ai. (1999), o sistema de reação é realizado até
a estabilização da leitura ( que poderá sofrer variação de tempo conforme
a espécie vegetal estudada), utilizando como solução de detenninação
o tampão fosfato de sódio pH 7,0 (50 mM), acrescido de peróxido de
hidrogênio ( 12,5 mM) e extrato vegetal. O branco corresponde à adição

110
de todos os reagentes, substituindo a amostra pelo tampão. A s leituras das
absorbâncias são realizadas a 240 nm, sendo utilizado para os cálculos o
coeficiente de extinção molar do H 20 2 (E = 39,4 mM·' cm·1). A atividade da
enzima é expressa em nmol de H20 2 min- 1 mg-1 de proteína.

4.3.2 Superóxido dismutase (SOD)

De acordo com a metodologia de Giannopolitis e Ries ( 1977),
a determinação da SOD é dada pela capacidade da enzima em inibir a
fotorredução do azul de nitrotetrazólio (NBT). A atividade é determinada
pela adição de extrato bruto e so lução contendo metionina, NBT, ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA), riboflavina e tampão fosfato
de sódio pH 7,8 (50 mM). A reação é realizada na presença de luz e
interrompida no escuro e, dessa forma, ocorre a formação da formazana
azul, utilizando o meio de reação sem a adição de extrato vegetal. Esse
procedimento é efetuado em ambiente protegido da luz e exposto dentro
de uma câmara com luz fluorescente (> 15 watts), durante 1O minutos
em temperatura ambiente. Quando adicionado o extrato vegetal no meio
de reação é observada a inibição da fotorredução do NBT, que ocorre
na presença da luz. Após o término da reação, o composto azul formado
(formazana) será determinado pelas leituras das absorbâncias a 560 nm.
O branco corresponde à adição de todos os reagentes, substituindo a
amostra pelo tampão, enquanto o controle de reação de cada amostra
corresponde à adição de todos os reagentes, sendo mantidos em
ambiente protegido da luz. Uma unidade da SOD (U) é definida como a
atividade da enzima necessária para a inibição de 50% da fotorredução
do NBT (PEIXOTO et ai., 1999), sendo o resultado expresso em U por ug
de proteína.

4.3.3 Peróxidase (POD)

A atividade da POD é determinada com o sistema de reação
composto de extrato enzimático, tampão fosfato de potássio pH 6,5 (50
mM), pirogalol (1,2,3-benzenotriol) e peróxido de hidrogênio (H20 2),
conforme metodologia de Teisseire e Guy (2000). A reação é conduzida
em temperatura ambiente durante 5 minutos. A formação de purpurogalina
é medida na absorbância 430 nm, e o branco corresponde a todos os
reagentes, substituindo a amostra pelo tampão. O coeficiente de extinção
molar (E= 2,5 mM-1 cm·') é usado para calcular a atividade específica da
enzima, expressa em µmol de purpurogalina min- 1 mg-1 de proteí_n a.

4.3.4 Peroxidação lipídica

A peroxidação dos lipídeos (PL) produz malondialdeído (MOA),
que é usado para determinar a PL das membranas das células vegetais

111
pelo estresse oxidativo. A análise pode ser detenninada de acordo com a
metodologia de Heath e Packer (1968). O material vegetal, previamente
macerado, é homogeneizado em solução contendo ácido tiobarbitúrico
(TBA) 0,25% e ácido tricloroacético (TCA) I 0%. Em seguida, o conteúdo
é acondicionado em recipiente com rosca, para evitar a evaporação da
amostra, e incubado em banho-maria a 90ºC durante uma hora, seguido de
resfriamento e centrifugação. As leituras das absorbâncias são realizadas
em dois comprimentos de onda (À = 532 e 600 nm), utilizando apenas
o sobrenadante. Para o cálculo da peroxidação lipídica é utilizado o
coeficiente de extinção molar do MDA, (ê = 155 mM·1 cm· 1). Os resultados
são expressos em nmol MDA g· 1 de massa fresca.

4.3.5 Enzima nitrato redutase (NR)

A NR é essencial na redução do nitrato (NO3·) a nitrito (NO2· ), que
posteriormente é convertido à forma amoniacal do nitrogênio (NH4+)
para a síntese dos aminoácidos. A atividade da NR pode ser determinada
segundo Jaworski (1971 ), sendo a extração do tecido vegetal realizada
em tampão fosfato de potássio pH 7 ,5 (O, 1 M) acrescido de nitrato de
potássio (0,2 M). Na sequência a amostra é incubada em banho-maria
durante uma hora a 37ºC, com agitação a cada 5 minutos, protegida da
luz. Após a incubação, para determinar a quantidade de nitrito formada
pela reação, são retiradas alíquotas do meio de incubação e acrescentado
solução de sulfanilamida 1% em HCI (1 ,5N) e adição de N-2-naftil-
etileno 0,02% em água destilada. O branco corresponde à adição de
todos os reagentes, exceto a amostra. As leituras das absorbâncias são
realizadas a 540 nm, e comparadas com curva padrão ajustada de acordo_
com as concentrações de N na forma de NO2•• De acordo com esses
dados, são realizados os cálculos da atividade da enzima nitrato redutase,
expressos em µg N-NO2 g· 1 h· 1•
Na tabela 4 são apresentadas a~ referências de algumas metodologias
de análises bioquímicas.

112
Tabela 4. Análises bioquímicas e referências de metodologias
Referências
LICHTENTHALER (1987); SCHINDLER et ol.(1994);
Pigmentos LICHTENTHALER; BUSCI-IMANN (2001); POMPELLI et ai.
(2013); LICI-ITENTI-IALER (2007); SA RIJEVA et ai. (2007)

Açúcares totais e
HODGE; HOFREITER ( 1962); MALDONADE et ai. (2013)
redutores

MAGNÉ; LARHER (1992); WINTERS e/ ai. (2002); YEMM;

Aminoácidos livres lotais
COCKING (1955)

Proteínas solúveis lotais BRADFORD (1976)

BATES; WALDREN; TEARE (1973); MAGNÉ; LARHER (1992);

Prolina livre
HOFMANN et ai. (2003); TEKLIC et ai. (201 O)

Compostos fenólicos GRAHAM (1992); PRICE; BUTLER (1977); WOISKY;

totais SALATINO (1998); POPOVA et ai. (2004)

PRJCE; BUTLER ( 1977); GRAHAM ( 1992); WOISKY;

SALATINO (1998); ZHISHEN et ai. (1999); MORENO et ai.
Flavonoides totais
(2000); POPOVA et ai. (2004); EGHDAMI; SADEGHI (201 O);
LAHOUAR et al. (2014)

Catalase AEBI (1983); PEIXOTO et ai. (1999); SEZGINTURK et ai. (2005)

Superóxido dismutase BEAUCHAMP; FRIDOVICH (1971); GIANNOPOLITJS; RJES

(SOD) (1977); SUN et ai. (1988)

KHAN; ROBINSON (1994); TEJSSEIRE; GUY (2000); LIMA et

Peroxidase (POD)
ai. (1999); CAMPOS; SILVEIRA (2003)

UMESHA (2006); MOURA et ai. (2013); KUHN (2007); OLSEN

Fenilalanina amônia-liase
et ai. (2008); MORI et ai. (2001); RODRUIGUES et ai. (2006); FU
(FAL)
et ai. (2011)

Peroxidação lipídica (PL) HEATH; PACKER (1968); DEVI; PRASAD (1998)

Nitrato redutase (NR) JAWORSKI (1971); CATALDO et ai. (1975)

113
 CAPÍTULO VI

POTENCIAIS FONTES BIOFERTILIZANTES

Além das fontes biofertilizantes discutidas nos capítulos anteriores,
a pesquisa científica acadêmica e do setor produtivo trazem inovações
constantes, apresentando novas potenciais fontes bioativas, ou novas
formas de extração ou transfom1ação de fontes já utilizadas. Nesses casos,
além dos grupos estabelecidos na legislação, novas fontes que venham a
ser aprovadas pela pesquisa brasileira oficial ou credenciada, certamente
farão parte do portfolio de empresas inovadoras.

"PRÓXIMA GERAÇÃO DE QUITOSANAS" COMO POTENCIAIS

BIOFERTILIZANTES

Roberta Paulert, Anne Vortkamp, Naivy Y. Nava Cruz,

Carolin Richter, Maha Attjioui, Nour Eddine El Gueddari,
Rebecca Melcher e Bruno M. Moerschbacher

As quitosanas são conhecidas por suas atividades antimicrobianas e

por seu potencial de induzir resistência às doenças em plantas, mas também
possuem outras bioatividades altamente relevantes para uma agricultura
sustentável, tais como aumentar a tolerância das plantas ao estresse abiótico e
promover seu crescimento e desenvolvimento (Figura 1) (CORD-LANDWEHR
et ai., 2020; WAITJES et ai., 2020). Assim, paralelamente as outras propriedades,
as quitosanas também podem atuar como potenciais biofertilizantes. No
entanto, no passado, o efeito das quitosanas na proteção de plantas era
variável. Isto mudou com a percepção de que o termo quitosana descreve
toda uma família de quitosanas, ou seja, cadeias lineares variando em
números e proporções de resíduos de glicosamina e N-acetilglicosamina.
As quitosanas diferem em seu grau de polimerização (DP) e
fração de acetilação (FA), e ambos os fatores influenciam fortemente as
propriedades físico-químicas e, por consequência, nas funcionalidades
biológicas (CORD-LANDWEHR et ai.• 2020; WATTJES et ai., 2020). Métodos
analíticos cada vez mais sensíveis e confiáveis para a determinação de
FA e DP (CORD-LANDWEHR et ai., 2019) têm permitido o desenvolvimento
de processos controlados de qualidade para a produção de quitosanas de
"segunda geração" bem definidas.
Durante extensos estudos de estrutura-função para a produção
de quitosanas, foram observados frequentemente efeitos de promoção
do crescimento com o tratamento de quitosana, mesmo na ausência de

115
patógenos. Aparentemente, as quitosanas podem estimular o metabolismo
das plantas, levando a aumentos de produtividade, qualidade e maior
tolerância aos estresses abióticos conferindo tolerância ao calor, à seca,
salinidade e até mesmo à luz UV (CHAKRABORTYe1a/.,2020;HIDANGMAYUM
et ai., 2019; JIA; RAJLB; YIN, 2020). As relações estrutura-função destas
bioatividades ainda não são totalmente compreendidas, mas parecem
ser claramente diferentes daquelas descritas para outras propriedades
biológicas das quitosanas.
A Tabela 1 fornece uma visão geral de exemplos da literatura
recente que descrevem os efeitos biofertilizantes de quitosana em relação
a culturas relevantes para a agricultura brasileira, tais como soja, milho
e feijão. Os estudos relatam mudanças fisiológicas, bioquímicas e de
expressão gênica nas plantas tratadas com quitosana. O efeito específico
mais frequentemente observado é a promoção do crescimento que parece
ser estimulado principalmente quando as quitosanas são aplicadas nas
sementes ou raízes. Menos frequentemente são relatados aumentos de
rendimento que parecem ser induzidos principalmente por pulverização
foliar, bem como, melhorias na eficiência do uso de nutrientes e água e maior
tolerância ao estresse abiótico. Alguns trabalhos também relatam o uso de
quitosanas em nanoformulações ou derivados de quitosana, e aplicações
potencialmente sinérgicas de quitosanas e outros biofertilizantes, como
ácidos húmicos.
Claramente, este é um campo emergente e altamente promissor
para aplicações agrícolas de quitosanas de segunda geração, que são
estruturalmente bem definidas em termos de suaFA e DP(CORD-LANDWEHR
et ai., 2019; CORD-LANDWEHR et ai., 2020; WATTJES et ai., 2020).
Na Tabela 1 são apresentados alguns exemplos do potencial de
quitosanas como biofertilizante.

116
 Tabela 1. Exemplos do potencial de quitosanas como biofertilizante para culturas com relevância agrícola no Brasil
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1IJ

1 BaixoMw•• MIRAJKA R et ai.

Saccharum spp. 1 Solução aquosa 1 Pulve rização foliar X X X
DA*** 15% (20 19)

G/ycine mat L. Tratamento de YANG et ai. (2019)

DA4% Solução aquosa X
j,,,,l sementes
j,,,,l
--...1 HASANAI-1;
Polímero e oligômeros Tratamento de sementes
Glycine max L. Solução aquosa X X SIREGAR; MAWA RN I
(DP*** 3 to 7) e pulverização foliar (2018); J IA et ai. (20 19)
1 Com solução nutriente MEH MOOD et ai.
G/ycine max L. 1 Não especificado 1 Carvão modificado X X X X
(Hoagland) (2020)
CHAT E LA IN;
. I Mw < 3 kDa
Phaseo/us vulgarts L. DA _ % 1 Solução aquosa 1 Com solução nutriente X
1 PrNTADO;
15 20 1 l x 1 1 1
VASCONCELOS
(2014)
IB RAHIM;
Phaseolus vulgaris L. 1 DA 15% 1 Zinco + ácidos húmicos I Pulverização foliar X X X
RAMADAN (20 15)
I Tratamento de
Phaseolus vu/garis L. 1 Oligômeros 1 Solução aquosa X X X O RWAT et ai. (20 17)
sementes
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Pliaseo/us vulgaris L. 1 Não especificado 1 Ácido salicílico e Tratamento de sementes EL-MOHAi\.lEDY et
ácidos húmicos X X X
e pulverização foliar ai.(2017)

Oligômeros
..... Triticum aestivum L. Solução aquosa Com solução nutriente X X 1 ZOU et ai. (2015)
1 DA 2, 29, 50, 68% / X 1 1 1
"""
00

Triticum aestivum L. 1 Oligômeros Solução aquosa Tratamento de sementes I X / X I X 1 1 \YANG era/. (20 15)
e pulverização foliar 1

Oligômeros sulfatados
Triticum aestivum L. 1 Mw 1.6 kDa j Solução aquosa 1 Com solução nutriente 1
X 1 1 1 1 X 1 ZOU era/.(2016)
sulfato 48.5%

Triticzm1 aestivum L. I Oligômeros

(DP 6, 7, 8)
f Solução aquosa f Pulverização foliar
1
X 1 1 j X 1 j Z HANG et ai. (201 7)

1 Oligômeros
Triticum aestivunr L. f Solução aquosa f Pulverização foliar X j ZHANG et ai. (2018)
(DP7) 1 1 1 1 1

Triticum aestivzm1L.
I Mw22 kDa Nanopartlculas
1 Tratamento de
DA3¾
1 X / X 1 1 LI et ai. (20 19)
sementes 1 1 1
 CHOUDHARY et ai.
(201 7); CHOUDHARY

ZeamaysL.
I Mw 50-190 kDa 1 Nanopartículas
1 Tratamento de sementes 1
X ' et ai. (2019);
KUMARASWAMY et
DA20% e pulverização foliar 1 XI X 1
1
ai. (2021 );
.,_
.,_ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 SHARMA et ai. (2020)

\0 X TURK (2019)
ZeamaysL. Não especificado Solução aquosa Pulverização foliar X X

DA36.5% X X X RABÊLO et ai.(20 19)

Zeamays L. Solução aquosa Pulverização foliar
Derivados N-succinil
Nanopartículas com
1 KUBAVAT et ai. (2020)
ZeamaysL. j DA< 10% 1 ácido metacrilico e 1 Tratamento no solo 1 X 1 X 1 1 1
metacrilato de potássio

Zeamays L. 1 Não especificado 1 Solução aquosa I Pulverização foliar l X

1 1 1 1
1 ALMEIDA et ai.
(2020)
VERONEZE-JÚNIOR
ZeamaysL. 1 DA36.5% 1 Solução aquosa 1 Pulverização foliar X X
1 1 1 1 1 1 ai. (2020)
et

•EUN - Eficiência de Uso do Nitrogênio e EUA - Eficiência de Uso da Água...Mw - peso molecular e •••DA- grau de acetilação e DP - grau de polimerização.
 Os tratamentos com quitosana podem ter múltiplos efeitos benéficos
nas plantas, incluindo melhoria da tolerância aos estresses abióticos e
estimulação do crescimento e desenvolvimento. É importante salientar que
nem todas as quitosanas têm os mesmos efeitos, porém algumas quitosanas
apresentam potencial para serem usadas como biofertilizantes.
A Figura 1 apresenta o resumo gráfico dos potenciais efeitos
biofertilizantes da "próxima geração" de quitosanas.
Proteção contra luz UV

Estimulação do Aumento da atividade

crescimento de brotos fotossintética

Aumento da tolerância Aumento do número

ao estresse térmico de flores e frutos

Aumento da tolerância Melhoria das

ao estresse hídrico características de
qualidade

Aumento da tolerância Aumento da eficiência

ao estresse salino de uso da água

Estimulação do Aumento da eficiência de

crescimento das raízes uso dos nutrientes

Melhoria do microbioma da rizosfera

Figura t. Resumo gráfico dos potenciais efeitos bfofertilizantes da "próxima geração" de
quitosanas

MICROALGAS COMO POTENCIAS FONTES

BIOFERTILIZANTES
Gilda Mógor e Átila Francisco Mógor

As microalgas são organismos encontrados como parte do

fitoplâncton em quase todas as superfícies aquáticas, em ambientes
marinhos ou de água doce, e também terrestres. São classificadas

120
principalmente considerando sua pigmentação, ciclo de v ida e estrutura
celular. Estima-se que existam em torno de 800.000 espécies de
microalgas, das quais aproximadamente 50.000 espécies são descritas,
compondo um grupo altamente diversificado de microrganismos,
que inclui cianobactérias, que são organismos procarióticos como
Arthrospira pia tens is (Spirulina), Nos toe kihimani e A nabaena
cylindrica (Cyanophyta); e organismos eucarióticos, como as microalgas
verdes (Chlorophyta) (ex. Scenedesmus sp., Chlorelia sp., Acutodesmus
dimorphus, Dunaliella salina), com uma ampla gama de características
fisiológicas e bioquímicas (RONGA et ai., 2019).
As microalgas (incluindo cianobactérias) podem ser produzidas de
diversas formas, tomando-se fontes de recursos renováveis, pois sua alta
capacidade fotossintética as define como eficientes produtoras primárias
de biomassa e de muitos compostos de interesse, sendo utilizados na
indústria de alimentação humana e animal, na indústria de cosméticos,
biocombustíveis, entre tantas outras, incluindo de insumos agrícolas
(SINGH et ai., 2016).
As microalgas têm sido relatadas como fontes de diversas
moléculas bioativas, entre elas: poliaminas, compostos derivados do
aminoácido ornitina que apresentam efeito de modular o crescimento
e desenvolvimento das plantas; polissacarídeos que podem apresentar
efeito promotor de crescimento e de mitigar estresses abióticos;
L-aminoácidos livres e peptídeos, que absorvidos pelas folhas ou raízes
podem ser incorporados ao metabolismo de acordo com as demandas
metabólicas das plantas, ou estimular processos fisiológicos atuando
como moléculas sinalizadoras (LIN; LIN, 2019; MÓGOR et ai., 2017; MÓGOR
et ai., 2018; RACHIDI et ai., 2020).
As pesquisas com o uso agrícola de microalgas não são recentes,
entretanto, nos últimos anos tem se multiplicado, relacionando seus
efeitos à promoção do crescimento das plantas, aumento de produtividade
e na mitigação dos estresses abióticos, como déficit hídrico e a salinidade.
Por exemplo: a biomassa de Acutodesmus dimorphus estimulou
o crescimento e desenvolvimento de plantas de tomate (GARCIA-
GONZALEZ; SOMMERFELD, 2016); aplicação de Ch/ore/la vu/garis ao
substrato melhorou o crescimento das mudas de alface (FAHEED; ABD-EL
FAITAH, 2008); espécies de cianobactérias produziram efeitos positivos na
germinação e parâmetros de crescimento da planta em trigo (HUSSAIN;
HASNAIN, 2011) e ervilha (OSMAN et ai., 2010).
No Brasil, artigos científicos e patentes do uso agrícola de
microalgas têm surgido recentemente. Mógor et ai. (2017) identificaram
a bioatividade de um hidrolisado da biomassa de cianobactéria em
bioensaios e também no crescimento e produção de alface, atribuindo
a promoção do crescimento a alterações no metaqolismo de poliaminas;

121
Mógor et ai. (2018) utilizando biomassa de A. platensis, identificaram
sua bioatividade em bioensaios e o aumento de produção de beterraba
em sistema orgânico com aplicações foliares, relacionando os efeitos
à presença de L-aminoacidos livres; enquanto Gemin et ai. (2019)
associaram a biomassa da microalga Scenedesmus subspicatus a ácido
fúlvico obtido de leonardita, identificando sinergia entre os compostos,
com promoção do crescimento e aumento de produtividade e teores de
nutrientes em bulbos de cebola.
Os efeitos de diversas espécies de microalgas em inúmeros cultivos
agrícolas são relatados por Chiaiese et ai. (2018), Renuka et ai. (2018), Colla
e Rouphael (2020) e Alvarez et ai. (2021 ), além de associações sinérgicas
com outros microrganismos, como bactérias promotoras do crescimento de
plantas (KANG et ai., 202 1). Esses trabalhos ressaltam o recente aumento do
interesse da pesquisa científica no uso de microalgas como potenciais fontes
biofertilizantes.
Na tabela 1 são relacionados alguns trabalhos utilizando microalgas
em diversos cultivos.
Tabela 1. Uso de microalgas (cianobactérias e microalgas verdes) em cultivos agrícolas,
suas formas de aplicação e efeitos
- - - - - --- -- -- - - ---- - - - -
1
' .,--· ""Tt,J ~JlL1(1_(c)0U]t-r-s~J-0 IS!lG.lli1 ff_
t{Gf.&lrto
-· - .... ·- - -
Milho Biomassa liofilizada Aumento da DfNESHKUMAR et
aplicada no solo produção de grãos ai. (2019)

Milho Biomassa aplicada Aumento da MAQUBELA

no solo produção e teor de N el ai. (2009)
das plantas

Tomate Extrato com Aumento do cresci- RACHIDI el ai.

polissacarídeos via mento e atividade de (2020)
fertirrigação enzimas

Tomate, pepino Extrato da biomassa Promoção do SHARIATMADARl

aplicado ao solo crescimento e teor et ai. (2011)
de nitrogênio das
plantas

Trigo Biomassa aplica às Promoção do HUSSAIN;

sementes crescimento e HASNAIN (2011)
aumento da massa de
grãos

122
Trigo Biomassa apl icada Promoção do GHEDA; AHMED
às sementes crescimento de (20 15)
raízes

Petúnia x Aplicação fo liar Mitigação de BAYONA-

hybrida de biomassa estresse salino, MORC lLLO et ai.
hidrolisada crescimento das (2020)
raízes, aumento do
número e massa das
flores
Olericolas Biomassa por Aumento do FAHEED; FATTAH
folhosas aplicação foliar e crescimento (2008); KJM et ai.
no solo (2018)

Trigo e feijão Extrato com polissa- Incremento do EL-NAGGAR et ai.

carideos aplicado às crescimento, (2020)
sementes pigmentos foliares e
proteínas.

Trigo Extratos aplicados Aumento do KHOLSSI et ai.

em solução ao solo crescimento e (2019)
biomassa das plantas

Tomate Biomassa por Incremento na ÔZDEMIR;

aplicação foliar e produção, classi- SUKATAR;
no solo ficação e sólidos OZTEKIN (2016)
solúveis

Tomate Biomassa por Mitigação do EL ARROUSSI et

aplicação foliar estresse salino ai. (2018)

Tomate Biomassa aplicada Promoção do GARCIA-

às sementes e folhas crescimento e GONZALES;
desenvolvimento SOMMERFELD
(2016)

Milho Biomassa aplicada Promoção do UYSAL; UYSAL;

às sementes crescimento EKJNCI (2015)

123
 A Figura 2 apresenta o resumo gráfico dos potenciais efeitos de
microalgas como biofertilizantes.

Produção sustentável Diversidade de espécies

em biofábricas ricas em compostos bioativos

Promoção do Aumento da
crescimento produtividade

Mitigação de estresses abióticos

Figura 2. Resumo gráfico dos potenciais efeitos de microalgas como biofertilizantes

124
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