Relatorio Final MAC Vera Lopes

UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
RELATORIO DE ESTÁGIO
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes
LISBOA, 2010
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FÁRMACIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO

GENTIL, ENTIDADE PÚBLICA EMPRESARIAL (IPOPFG, E.P.E.)
Serviço de Hematologia Clínica,
Serviço de Imunologia, Laboratório de Imunologia Celular
Serviço de Genética, Laboratório de Genética Molecular e Laboratório de Citogenética
HOSPITAL CURRY CABRAL
Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.
Secção de Bioquímica Clínica
Secção de Microbiologia
MATERNIDADE ALFREDO DA COSTA
Serviço de Procriação Medicamente Assistida
ORIENTAÇÃO: DR. CARLOS MENDES, SERVIÇO HEMATOLOGIA CLÍNICA, IPO PORTO

DRª GABRIELA MARTINS, SERVIÇO DE IMUNOLOGIA, IPO PORTO
DRª SUSANA BIZARRO, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO
DRª CECÍLIA CORREIA, SERVIÇO DE GENÉTICA, IPO PORTO
DRª MARIA DO CÉU SANTOS, SERVIÇO NEFROLOGIA, H. CURRY CABRAL
DRª MARGARIDA BAPTISTA, LAC. DR. MANUEL REYMÃO PINTO, S.A.
DRª SÓNIA CORREIA, SERVIÇO PMA, MATERNIDADE ALFREDO COSTA
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
LISBOA, 2010
Resumo
O presente trabalho consiste no relatório de estágio curricular, efectuado como

parte integrante e conclusivo do Mestrado de Análises Clínicas da Faculdade de
Farmácia da Universidade de Lisboa. Tem em conta as normas regulamentares do ciclo
de estudos definidas pelo Decreto-lei nº 74/2006 de 24 de Março.
O relatório está estruturado em duas partes. A Parte I consiste no registo resumo
da aprendizagem teórica e prática obtida durante todo o período de estágio nas
diferentes áreas. A Parte II aborda um tema específico - Metodologias Laboratoriais
para Diagnóstico e Seguimento Terapêutico em Patologias Auto-Imunes.
A Parte I é constituída por sete capítulos nos quais se descreve o trabalho
realizado durante o estágio. O primeiro capítulo refere-se ao estágio realizado em
Colheitas de Análises Clínicas. O segundo capítulo resume o estágio da valência de
Hematologia, realizado no Serviço de Hematologia Clínica do IPO Porto, segundo a
orientação do Dr. Carlos Mendes. O terceiro capítulo resume o estágio da valência de
Imunologia, realizado no Serviço de Imunologia do IPO Porto, segundo a orientação da
Drª Gabriela Martins (estágio em Imunologia Celular – Citometria de Fluxo) e no
Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral, segundo a orientação da Drª Maria do
Céu Santos (estágio em Imunologia Humoral – Auto-Imunidade); a referência ao
estágio realizado no Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral é bastante breve,
dado ser este o tema desenvolvido na Parte II do relatório de estágio. O quarto capítulo
resume o estágio da valência de Genética Molecular Humana, realizado no Serviço de
genética di IPO Porto, Laboratório de Genética Molecular, segundo a orientação da Drª
Susana Bizarro (estágio em Biologia Molecular) e Laboratório de Citogenética, segundo
a orientação da Drª Cecília Correia (estágio em Citogenética Clássica e FISH). O quinto
capítulo resume o estágio das valências de Bioquímica Clínica e Endocrinologia,
realizados na Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel
Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª Margarida Baptista. O sexto capítulo
resume o estágio da valência de Microbilogia, realizado na Secção de Microbiologia do
Laboratório de Análises Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A., segundo a orientação da Drª
Margarida Baptista (abordagem geral da área de Microbiologia) e no Serviço de
Procriação Medicamente Assistida da Maternidade Alfredo da Costa, segundo a
iii
orientação da Drª Sónia Correia (realização de espermogramas). Por fim, o sétimo
capítulo aborda o Controlo de Qualidade Interno e Externo realizado nas diferentes
áreas de estágio.
A Parte II deste relatório desenvolve as Metodologias Laboratoriais para
Diagnóstico e Seguimento Terapêutico nas Doenças Auto-Imunes, focando com maior
relevo a técnica de Imunofluorescência Indirecta. O trabalho referente a esta segunda
parte foi desenvolvido em consequência dos conhecimentos apreendidos no estágio de
Imunologia Humoral realizado no Serviço de Imunologia do Hospital Curry Cabral,
segundo a orientação e acompanhamento permanente da Drª Maria do Céu Santos. A
escolha do tema por parte da estagiária deveu-se ao facto dos conhecimentos
apreendidos terem possibilitado a implementação de uma nova técnica de análise no
Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, onde hoje a estagiária
trabalha – a Imunofluorescência Indirecta.
Palavras-Chave:
ANA • Análises Clínicas • Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos • Auto-

Anticorpos Anti-Nucleares • Auto-Imunidade • Bioquímica Clínica • Citometria de
Fluxo • Doenças Auto-Imunes • ELISA • Endocrinologia • Ensaio Imunoenzimático
• FISH • Genética Molecular • Hematologia • Imunologia • Imunoflourescência
Indirecta • Microbiologia.
iv
Abstract
The present work represents a curriculum internship report, made conclusive as

well has an integrant part of Master in Clinical Analysis, School of Pharmacy,
University of Lisbon (Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade
de Lisboa), according to decree of law...
This report is structured in two main parts. The first part (Part I) contains the
resumed registry of the practical and theoretic learning obtain in different areas of
study during the occurring internship. The second part (Part II) goes to a specific
theme of study - Laboratory Methods for Diagnosis and Therapeutic Action in
Autoimmune Pathology.
In Part I there are seven different chapters where it is described the work done
during the internship in seven different areas of scope. Chapter one references the
work done in Clinical Analysis crops. Chapter two is a résumé of work developed in
Hematology, work that was performed, according to Dr. Carlos Mendes orientation,
at the Clinical Service of Hematology IPO OPorto (Serviço de Hematologia Clínica
do IPO Porto). Chapter three summarizes the work performed in Immunology field,
with the orientation of Dr. Gabriela Martins (internship in Cellular Immunology –
Flow Citometry), at the Clinical Service of Immunologyy IPO OPorto (Serviço de
Hematologia Clínica do IPO Porto) and with the orientation of Dr. Maria do Céu
Santos (internship in Humoral Immunology – Autoimmunity) at the Nephrology
Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital Curry Cabral); as
a note, in this first part (Part I) of the work, the citation of the developed work in
Nephrology Service, Hospital Curry Cabral (Serviço de Nefrologia do Hospital
Curry Cabral ) is very brief, since this is the subject that is vastly reported in Part II.
Chapter four is dedicated to Human Molecular Genetics, and the internship was
performed in Genetics Service IPO Oporto (Serviço de genética do IPO Porto) under
the supervising of Dr. Susana Bizarro (internship in Molecular Biology) and in
Cytogenetics Laboratory (Laboratório de Citogenética) under guidance of Dr. Cecília
Correia (internship in Classic Cytogenetics and FISH). This chapter five is dedicated
to the analysis of Clinical Biochemistry and Endocrinology, performed in Clinical
v
Biochemistry Department of Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão
Pinto, S.A. (Secção de Bioquíminca Clínica do Laboratório de Análises Dr. Manuel
Reymão Pinto, S.A) under guidance of Dr. Margarida Baptista. Chapter six is
accredit to studies in Microbiology, conducted in Microbiology Department of
Laboratory of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. under guidance of Dr.
Margarida Baptista and also in Service of Medical Assisted Procreation of the
Alfredo da Costa Maternity (Serviço de Procriação Medicamente Assistida da
Maternidade Alfredo da Costa), which was guided by Dr. Sónia Correia (breading
spermiograms). Lastly, chapter seven addresses the internal and external quality
control achieved in different areas of the internship.
In Part II of this report there’s a development on the laboratory methodologies

for diagnose and therapeutic follow-up in autoimmune diseases, with bigger strength on
a specific technique, Indirect Immunofluorescence. The work carried out in this second
part (Part II) of the report is an accumulation of experience and knowledge gathered in
the internship of internship in Humoral Immunology – Autoimmunity at the Nephrology
Service, Hospital Curry Cabral and with the orientation and permanent follow-up by Dr.
Maria do Céu Santos. This choice fell down to the fact that this learning’s enabled an
implementation of a new technique at the laboratory workplace of the intern, Laboratory
of Clinic Analysis Dr. Manuel Reymão Pinto, S.A. - Indirect Immunofluorescence.
Keywords:
ANA • Anti-Citoplasmatic Auto-Antibodys • Anti-Nuclear Auto-Antibodys •

Autoimmune Diseases • Autoimmunity • Clinical Analysis • Clinical Biochemistry •
ELISA • Endocrinology • FISH • Flow Citometry • Hematology •
Immunoenzymatic Essay • Immunology • Indirect Immunofluorescence
Microbiology • Molecular Genetics.
vi
Índice de Páginas
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

1. Colheitas ................................................................................................................................ 2
2. Hematologia .......................................................................................................................... 6
2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100 ................................................................................... 9
3. Imunologia........................................................................................................................... 18
3.1. Imunologia Celular ...................................................................................................... 20
3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo........................................................................ 20
3.1.2. Preparação das Amostras.................................................................................... 23
3.1.3. Marcadores Celulares.......................................................................................... 24
3.2. Imunologia Humoral.................................................................................................... 26
4. Genética Molecular Humana .............................................................................................. 29
4.1. Biologia Molecular....................................................................................................... 30
4.1.1. PCR ...................................................................................................................... 30
4.1.1.1. Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction) .... 30
4.1.1.2. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) ........................................................... 32
4.1.1.3. RT-PCR Nested ............................................................................................. 32
4.1.1.4. PCR Específico de Alelo (ASO-PCR) .............................................................. 33
4.1.1.5. PCR de Longa Distância (PCR-LD) ................................................................ 33
4.1.1.6. PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo .......................... 34
4.1.2. Restrição Enzimática ........................................................................................... 37
4.1.3. Electroforese ....................................................................................................... 37
4.1.3.1. Electroforese em Gel de Agarose ................................................................ 37
4.1.3.2. Electroforese Capilar ................................................................................... 38
4.2. Citogenética ................................................................................................................ 42
4.2.1. Citogenética Clássica ........................................................................................... 42
4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization) ............................................................. 44
4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias ......................................... 50
5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia ................................................................................... 55
5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados .............................................. 55
5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche .............................................................................. 55
5.1.2. Hydrasys Sebia, Phadia ........................................................................................ 58
5.1.3. Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................................................................ 58
vii
5.1.4. Urisys 2004, Roche .............................................................................................. 59
5.1.5. Immulite 2000, Amerlab...................................................................................... 59
5.1.6. Vidas, bioMérieux................................................................................................ 60
5.1.7. Vidia, bioMérieux ................................................................................................ 61
5.1.8. Serologia Manual................................................................................................. 62
5.2. Métodos Analíticos...................................................................................................... 62
5.2.1. Potenciometria .................................................................................................... 62
5.2.2. Fotometria ........................................................................................................... 63
5.2.3. Electroforese ....................................................................................................... 63
5.2.4. Imunoturbidimetria ............................................................................................. 64
5.2.5. Aglutinação.......................................................................................................... 64
5.2.6. Fluorescência Polarizada ..................................................................................... 64
5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) ............................................... 65
5.2.7.1. ELISA para a detecção de Ag ....................................................................... 66
5.2.7.2. ELISA para a detecção de Ac ....................................................................... 66
6. Microbiologia ...................................................................................................................... 68
6.1. Meios de Cultura ......................................................................................................... 69
6.2. Condições de Incubação das Sementeiras .................................................................. 70
6.3. Equipamentos ............................................................................................................. 70
6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux ................................................................ 70
6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos .......................................... 71
6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux ................................................ 71
6.4.2. Coloração de Gram .............................................................................................. 71
6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de Kinyoun modif. ou de
Tan - Thiam - Hok) ............................................................................................................... 71
6.4.4. Teste da Catalase................................................................................................. 72
6.4.5. Prova da Coagulase ............................................................................................. 72
6.4.6. SLIDEX Strepto Plus ............................................................................................. 72
6.4.7. Teste do Tubo Germinal ...................................................................................... 72
6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China............................................ 72
6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos Biológicos: ............................ 72
6.5.1. Urina Asséptica.................................................................................................... 72
6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal ................................................................................. 73
6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo ....................................................................................... 73
viii
6.5.4. Expectoração ....................................................................................................... 73
6.5.5. Fezes .................................................................................................................... 73
6.5.6. Hemoculturas ...................................................................................................... 73
6.6. Espermogramas........................................................................................................... 74
6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial ............................................................................ 74
6.6.1.1. Liquefacção e Viscosidade ........................................................................... 74
6.6.1.2. Aparência..................................................................................................... 75
6.6.1.3. Volume ........................................................................................................ 75
6.6.1.4. pH ................................................................................................................ 75
6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial ....................................................................... 75
6.6.2.1. Estimativa da Concentração Espermática ................................................... 75
6.6.2.2. Motilidade ................................................................................................... 76
6.6.2.3. Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides ........... 77
6.6.2.4. Agregação e Aglutinação ............................................................................. 77
6.6.2.5. Concentração Espermática.......................................................................... 77
6.6.2.6. Morfologia ................................................................................................... 78
6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar .............................................................. 80
6.6.3.1. Teste da Vitalidade ...................................................................................... 80
6.6.3.2. Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides ................................ 81
6.6.3.3. Testes Opcionais – Testes Bioquímicos ....................................................... 81
6.6.4. Nomenclatura...................................................................................................... 82
7. Controlo de Qualidade ........................................................................................................ 84
7.1. Controlo de Qualidade Interno ................................................................................... 84
7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ) ....................................................................... 85
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Terapêutico ................................................................................................................................. 87
1. Sistema Imunológico e Auto-Imunidade ............................................................................. 88
2. Doenças Auto-Imunes (DAI) ................................................................................................ 94
2.1. DAI Multi-Sistémicas ................................................................................................... 94
2.2. DAI Específicas de Orgão ............................................................................................. 99
3. Metodologias Laboratoriais .............................................................................................. 103
3.1. Imunofluorescência Indirecta (IFA) ........................................................................... 104
3.1.1. Fundamento ...................................................................................................... 104
ix
3.1.2. Aplicação ........................................................................................................... 106
3.1.3. Células e Tecidos Utilizados .............................................................................. 107
3.1.3.1. Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2.............. 107
PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO .................................. 112
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO ..................... 135
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO ...................... 140
3.1.3.2. Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae ............. 148
3.1.3.3. Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos ..................................... 150
3.1.3.4. Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos ............................... 162
3.2. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio em “Sanduíche” .................... 167
3.2.1. Fundamento ...................................................................................................... 167
3.2.2. Aplicação ........................................................................................................... 168
3.2.3. Ensaios Executados ........................................................................................... 169
3.2.3.1. ANA Screen ................................................................................................ 169
3.3. Immunoblotting - Imunodot’s ................................................................................... 170
3.3.1. Fundamento ...................................................................................................... 170
3.3.2. Aplicação ........................................................................................................... 172
3.3.3. Perfis Executados .............................................................................................. 173
3.3.3.1. Perfil ANA (“ANA Profile 3”) ...................................................................... 173
3.3.3.2. Perfil Hepático “Liver Profile” ................................................................... 174
3.3.3.3. Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”).......................................................... 175
3.3.3.4. Perfil Gástrico ............................................................................................ 176
3.4. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio em “Sanduíche” .................. 177
3.4.1. Fundamento ...................................................................................................... 177
3.4.2. Aplicação ........................................................................................................... 178
3.4.2.1. Ac. anti-DNAds .......................................................................................... 178
3.4.2.2. Ac. anti-Nucleossoma ................................................................................ 178
3.4.2.3. Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM .................... 178
3.4.2.4. Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA ........................................................ 178
3.4.2.5. Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA ............................................... 179
3.4.2.6. Ac. anti-CCP ............................................................................................... 179
3.4.3. Outros Ensaios Executados ............................................................................... 179
3.4.3.1. Ac. anti-ICC e anti-C1q ............................................................................... 179
3.4.3.2. Ac. anti-GBM ............................................................................................. 180
x
3.4.3.3. Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA) ................ 180
3.4.3.4. Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180 .......................................................... 181
4. O Futuro….......................................................................................................................... 182
5. Observações e Sugestões .................................................................................................. 183
Bibliografia ................................................................................................................................ 186

Agradecimentos ........................................................................................................................ 188
Anexo 1...................................................................................................................................... 189
Anexo 2...................................................................................................................................... 192
Anexo 3...................................................................................................................................... 193
xi
Índice de Figuras
Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

Figura 1 –Câmara DIFF do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................................. 11
Figura 2 - Câmara WBC/BASO do aparelho Sysmex XE 2100 ...................................................... 12
Figura 3 – Câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 .............................................................. 13
Figura 4 – Histogramas RBC e PLT do aparelho Sysmex XE 2100 ................................................ 14
Figura 5 – Canal RET do aparelho Sysmex XE 2100. .................................................................... 16
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100 ..................................................................... 17
Figura 7 –Gráfico com FSC versus SSC nos contadores hematológicos ...................................... 21
Figura 8 – Imagens obtidas num Citómetro de Fluxo ................................................................. 21
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto ...................... 23
Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR ................................................................. 34
Figura 11 – Actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-PCR. ............. 35
Figura 12 – Leitura do produto de PCR na fase exponencial ...................................................... 36
Figura 13 – Electroforese em gel de agarose .............................................................................. 38
Figura 14 – Sequenciação Automática ........................................................................................ 40
Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) ........................................................ 42
Figura 16 - Cariótipo com anomalia numérica constitucional e anomalia estrutural adquirida. 43
Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas. ...................................... 43
Figura 18 – FISH, Sondas de Painting .......................................................................................... 45
Figura 19 – FISH , Sondas Alfa-Satélite ........................................................................................ 46
Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. ............................................................................ 46
Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion....................................................................... 47
Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal .......................................................................................... 48
Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color, Dual Fusion ....................................................................... 49
Figura 24 – FISH, Sondas Dual Color, Break Apart ...................................................................... 49
Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Terapêutico ................................................................................................................................. 87
Figura 25 – Estrutura dos Anticorpos .......................................................................................... 89
Figura 26 – “Buttelfly rash”, LES, DAI Multi-Sistémica ................................................................ 94
Figura 27 – Sinovite das mãos, AR, DAI Multi-Sistémica ............................................................ 95
Figura 28 – Aumento das parótidas, SS, DAI Multi-Sistémica ..................................................... 95
xii
Figura 29 – Depósito de cálcio nas mãos, Esclerodermia, DAI Multi-Sistémica ......................... 96
Figura 30 – Necrose do dedo, F. de Raynaud, DAI Multi-Sistémica ............................................ 96
Figura 31 – Músculo Estriado destruído, Miosite, DAI Multi-Sistémica...................................... 97
Figura 32 – Glossite, Anemia Perniciosa, DAI Específica de Orgão ........................................... 101
Figura 33 – Intestino sem vilosidades, Doença Celíaca, DAI Específica de Orgão .................... 101
Figura 34 – Separação da epiderme, Pênfigo, DAI Específica de Orgão ................................... 102
Figura 35 – Pênfigo foliáceo, vulgaris e bulhoso. ...................................................................... 102
Figura 36 – Reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina............................................ 105
Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular ............................................................................. 110
Figura 38 – A célula durante a Interfase ................................................................................... 110
Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. .............................................................................. 111
Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2 ................................................................... 112
Figura 41 – Padrão homogéneo em células HEp-2. Cromossomas positivos em profase,
metafase, anafase e telofase .................................................................................................... 113
Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco.............................................. 113
Figura 43 – DNA, Histonas e Nucleossoma ............................................................................... 114
Figura 44 – Padrão de Scl-70 em células HEp-2 ........................................................................ 115
Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2 .................................................................. 116
Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B .......................................................................... 117
Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. ........................................................................ 118
Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP ........................................................................................ 118
Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2 ........................................................ 119
Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2. ............................................................................. 120
Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2................................................................ 121
Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear em células HEp-2. ...................................................... 122
Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco. ................................ 123
Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear em células HEp-2. ....................................... 124
Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear. .... 124
Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2. ................................................. 125
Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2.. ........................................................ 127
Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2. ....................................................... 127
Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2. ....................... 128
Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2. ........................................................ 129
Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2. .................................................. 130
xiii
Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2 ............................................... 131
Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2 .................................................................. 132
Figura 64 – Localização das proteínas centroméricas. .............................................................. 133
Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2. ...................................................................... 134
Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial em células HEp-2. ......................................... 135
Figura 67 – Padrão Actina em células HEp-2............................................................................. 136
Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2 ................................................................................ 137
Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2. ................................................................................ 138
Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2. .................................................................... 139
Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2. ....................................................... 140
Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2. ................................................................ 141
Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2....................................................................... 142
Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2. ..................................................................... 142
Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2. ................................................................ 143
Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2. ........................................................................ 144
Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2..................... 144
Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2. .................................................................... 145
Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2. ................................................................ 146
Figura 80 – Protozoário Crithidia luciliae. ................................................................................. 149
Figura 81 – Fluorescência em células de Crithidia luciliae ........................................................ 150
Figura 82 – Tecidos utilizados para pesquisa de auto-anticorpos citoplasmáticos .................. 152
Figura 83 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-mitocôndriais
(AMA) ........................................................................................................................................ 155
Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-actina (ASMA)
................................................................................................................................................... 152
Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-LKM1 ........... 152
Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para auto-anticorpos anti-células parietais
(APCA) ....................................................................................................................................... 152
Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares
................................................................................................................................................... 162
Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de
Langerhans em pâncreas de macaco. ....................................................................................... 163
Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em
córtex adrenal de macaco. ........................................................................................................ 164
Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-endomísio (EMA)
em esófago de macaco.............................................................................................................. 165
xiv
Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado
em músculo esquelético de macaco. ........................................................................................ 166
Figura 92 – Reacção de ELISA. ................................................................................................... 167
Figura 93 – Immunoblotting...................................................................................................... 172
Figura 94 – ELISA Quantitativa, Curva de calibração absorvância vs concentração. ................ 177
Figura 95 – ANCAs. .................................................................................................................... 184
Todas as figuras da Parte II têm como fonte os pontos 3 e 4 da Bibliografia:
3. Bradwell A. R., Hughes R. G., Atlas of HEp-2 Patterns, third edition, The Binding Site, 2007
4. Bradwell A. R., Stokes R. P., Johnson G. D., Atlas of Autoantibody Patterns on Tissues, second
edition, The Binding Site, 2004
xv
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche .............................. 58

Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche ............................ 58
Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia ........................................ 59
Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche............................................... 59
Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab ...................................... 60
Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux ................................................ 61
Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux ................................................. 61
Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual .............................................................. 62
Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática. ................... 76
Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas. ................................................................. 98
Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão. ........................................................ 102
Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos.. ..................................................... 147
Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. . 148
Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais
(AMAs). .............................................................................................................................. 154
Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira
do ANA Profile 3. ............................................................................................................... 173
Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas................ 175
Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas .................... 176
Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no
Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............................................................ 191
Tabela 19 – Estudos moleculares, Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto. ............. 192
Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae.......................... 193
Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.
........................................................................................................................................... 194
Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp. ............................ 194
Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae. .................................. 194
Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp. ......................... 195
Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes. .................. 195
Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp. ........................... 196
Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp. ...................... 196
Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares. ........................ 197
xvi
ParteI
Apreciação Global dos Estágios

Realizados
1
1. Colheitas
O estágio decorreu no Posto de Colheitas Eça de Queiroz do Laboratório

Lababa, integrado no grupo ReymãoLabs, durante o mês de Janeiro de 2009, sob a
orientação da técnica Manuela.O estágio perfez um total de 80 horas.
Para a colheita de sangue periférico total, deverão encher-se os tubos

necessários às análises requeridas pela seguinte ordem:
1. Tubo de citrato;
2. Tubo de EDTA;
3. Tubo seco.
Regra geral, o tubo de citrato utiliza-se para provas de coagulação, o tubo de
EDTA para hemograma e VS e o tubo seco para a maioria das análises bioquímicas. O
tubo de citrato e de EDTA exigem agitação suave após o seu enchimento, a fim de que o
sangue se misture com o anticoagulante.
No que respeita as provas de tolerância aos hidratos de carbono:

- Pós-Prandial (PP): tirar sangue em jejum, dar 50g de glucose oral ao utente e
voltar a tirar sangue ao fim de 60 minutos; caso o clínico der indicações específicas,
seguir à risca as mesmas;
- Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTOG): fazer a colheita de sangue em
jejum ao utente e executar o teste rápido da glicémia em equipamento próprio. Caso o
resultado obtido seja inferior a 150 mg/dL, dar 75g de glucose oral e tirar sangue aos
30, 60, 90 e 120 minutos; se o utente for uma mulher grávida, dar 100g de glucose oral
e tirar sangue aos 60, 120 e 180 minutos. Caso o resultado obtido esteja entre 150 e 200
mg/dL, o utente prossegue a prova com 50g de glucose oral. Caso o resultado obtido
seja superior a 200 mg/dL, o utente prossegue a prova com o pequeno-almoço. Colher
sempre sangue e urina em paralelo.
A optimização das condições de colheita de produtos para exame

microbiológico visa manter a viabilidade dos microrganismos mais sensíveis e a não
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 2|

Colheitas
contaminação da amostra a estudar com anti-sépticos, com flora saprófita do doente ou

com microrganismos do meio ambiente. Assim, exigem-se algumas regras para a sua
colheita:
- Colheita feita em rigorosas condições de assepsia e antes de se iniciar
terapêutica anti-microbiana e sob rigorosas condições de assepsia;
- Enviar rapidamente ao Laboratório, os produtos para exame Microbiológico; o
intervalo de tempo entre a colheita e a sementeira não deve ultrapassar duas horas;
- Urina Asséptica: amostras da 1ª urina da manhã ou, se não for possível, de
urina que tenha estado pelo menos durante 3 horas na bexiga; obtenção do jacto médio,
mantendo o prepúcio retraído ou os pequenos lábios da vagina afastados; para pesquisa
de BK fazer 3 colheitas de toda a urina da manhã. Conservar no frio;
- Exsudados Uretrais e Vaginais: não efectuar a higiene íntima de manhã; para
o exsudado uretral introduzir uma zaragatoa fina até 2 a 4 cm no interior da uretra,
rodando-a lentamente; para o exsudado vaginal utilizar espéculo ao nível do fundo da
vagina, do colo e do endocolo uterino. Colher com duas zaragatoas, uma colocada em
meio de transporte de carvão previamente aquecido a 37ºC e outra que se utiliza para
efectuar o esfregaço em lâmina. As colheitas para pesquisa de Chlamydia trachomatis
devem ser feitas por raspagem vigorosa;
- Quando para o mesmo utente for pedido urina asséptica e exsudado
uretral/vaginal, estes últimos devem ser colhidos em primeiro lugar;
- Exsudados Nasofaríngeos: Evitar tocarem com a zaragatoa do exsudado
faríngeo nos lábios, na língua ou na úvula, pressionando a língua para baixo, com uma
espátula; efectuar a colheita ao nível das amígdalas e em zonas que se encontrem
inflamadas. Inserir uma zaragatoa nas fossas nasais até encontrar resistência e rodá-la.
Colocar as zaragatoas de imediato num meio de transporte. Conservar à temperatura
ambiente;
- Exsudados Purulentos (Feridas, Auriculares e Oculares): os produtos de
feridas abertas são colhidos com zaragatoas e os das colecções purulentas fechadas e/ou
para pesquisa de microrganismos anaeróbios, com seringa. As zaragatoas devem ser
mergulhadas no meio de transporte adequado, previamente aquecido a 37C;
- Derrames das Serosas (Líquido Ascítico, Pleural, Pericárdico e Sinovial):
enviar um volume mínimo de 10 mL e de 50-100 mL se se suspeitar de um derrame de
etiologia tuberculosa;

Colheitas
- Expectoração: em jejum, depois de o utente fazer a sua higiene oral e se

assoar; não cuspir; para a pesquisa de BK 3 a 5 amostras em dias sucessivos. Conservar
à temperatura ambiente;
- Fezes: para pesquisa de ovos, quistos e parasitas as amostras devem ser
colhidas de 2 em 2 ou de 3 em 3 dias, até um total de 3, abrangendo um período de
tempo no mínimo de 8 dias. Fazer o teste da Fita Adesiva para pesquisa de Enterobius
vermicularis ou de Taenia sp., sem que o utente faça previamente a sua higiene matinal.
Conservar no frio, excepto para pesquisa de Entamoeba histolytica;
- Hemoculturas: colher no início da subida da temperatura; efectuar 3 colheitas
com intervalo de duas horas. Desinfectar a região a puncionar com éter, betadine e
etanol a 70%¸“injectar” o sangue no frasco do meio de cultura com uma seringa
diferente da utilizada para a punção. Conservar a 37ºC.
Segue-se a descrição para as condições de colheita de espermogramas:
1. Avaliação inicial:
 Mínimo duas amostras, com intervalo entre 1 a 3 semanas;
 Se a motilidade da primeira avaliação for baixa (< 25% com motilidade
progressiva) a segunda avaliação deverá ser feita o quanto antes, dado que a
motilidade diminui com o tempo;
 Se os resultados entre a primeira e a segunda avaliação forem muito
diferentes, deve fazer-se uma terceira avaliação;
 Os dias de abstinência para as várias avaliações deverão ser os mesmos.
2. Condições de Colheita:
 Abstinência sexual mínima de 2 dias e máxima de 7 dias; menos de 2 dias de
abstinência poderá resultar em diminuição da concentração; mais de 7 dias
de abstinência poderá resultar em diminuição da motilidade e vitalidade;
 Ausência de medicação e febre; febre pode causar alterações espermáticas
observáveis 10 a 12 semanas depois.
3. Colheita:
 Feita por masturbação para um recipiente estéril;

Colheitas
 A colheita de esperma tem que ser completa; a perda da primeira fracção

resultará na diminuição da concentração, visto ser nesta fracção que se
encontram a maioria dos espermatozóides;
 O recipiente de colheita deverá ser identificado com o nome/nº do utente,
data e hora da colheita;
 Feita preferencialmente no laboratório; quando feita no domicílio terá que
ser entregue ao laboratório num período máximo de 1 hora e deverá ser
transportada à temperatura do corpo (no bolso);
 Se for necessária uma análise microbiológica, o utente deverá urinar antes e
depois desinfectar-se; só em seguida será feita a colheita de esperma; a
abstinência sexual deverá ser de 5 a 7 dias;
 Em caso de ejaculação retrógrada, o utente deverá ingerir bicarbonatos de
véspera, para neutralizar a urina; na colheita deverá urinar antes e depois
masturbar-se; só depois deverá urinar para o recipiente de colheita;
 Se for necessário o uso de preservativo, este deverá ser livre de
espermicidas; os preservativos de látex diminuem a viabilidade dos
espermatozóides;
 Coitus interruptus não é aceitável para colheita: a primeira porção de
esperma (a mais rica em espermatozóides) pode perder-se; o pH ácido
vaginal diminui a motilidade, as formas normais e a concentração dos
espermatozóides; poderá haver contaminação celular e bacteriológica do
esperma com as secreções vaginais.

2. Hematologia
O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco

Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Hematologia
Clínica, durante os meses de Fevereiro e Abril de 2009 do IPO Porto, sob a orientação
do Dr. Carlos Mendes. O estágio perfez um total de 294 horas.
Trata-se de uma Entidade Pública Empresarial, de prestação de serviços de

saúde no domínio da oncologia, bem como a investigação, o ensino e o rastreio
oncológico. Pelo prestígio conquistado adquiriu hoje dimensão europeia e internacional,
sendo membro activo da European Organization of Research and Treatment of Cancer
(EORTC).
No Serviço de Hematologia Clínica procede-se à elaboração e interpretação de

hemogramas, mielogramas e outras técnicas manuais inseridas no contexto da área
(colorações citoquímicas várias), bem como à contagem de células sanguíneas em
citoesfregaços de LCR e outros líquidos biológicos. O laboratório divide-se em três
principais áreas distintas: uma área onde se efectuam as punções digitais para
monitorização do estado geral de crianças em ambulatório com patologias oncológicas
diagnosticadas, uma área onde se encontram os diferentes aparelhos e uma terceira área
destinada à validação dos resultados. O serviço recebe, em média, 400 hemogramas
diariamente.
Para o estágio realizado foi de extrema utilidade para a estagiária os

conhecimentos teóricos apreendidos na cadeira de Hematologia II do Mestrado em
Análises Clínicas. O défice de aulas práticas da referida cadeira justificou a escolha do
Instituto para a realização do estágio.
Assim, o estágio decorreu maioritariamente na área destinada à validação dos

resultados, onde o tempo foi sobretudo empregue na visualização de lâminas de sangue
periférico e medula óssea e realização da respectiva fórmula leucocitária para as
diferentes patologias oncológicas. Visualizaram-se lâminas que apareceram durante a

Hematologia
rotina laboratorial diária e também lâminas de arquivo do Instituto. Visualizaram-se

lâminas das seguintes patologias oncológicas:
Neoplasias Mieloproliferativas:
 Leucemia Mielóide Crónica (LMC), BCR-ABL1 positiva;
 Leucemia Neutrofílica Crónica;
 Policitémia vera;
 Mielofibrose Primária;
 Trombocitémia Essencial;
 Leucemia Eosinofílica Crónica.
Neoplasias Mielodisplásicas/Mieloproliferativas:
 Leucemia Mielóide Crónica atípica, BCR-ABL1 negativa.
Síndromes Mielodisplásicos vários (subclassificação é impossível pelo sangue

periférico)
Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA):

 LMA com t(8;21)(q22;q22), ETO-AML1;
 LMA com inv(16)(p13.1q22), CBFB-MYH11;
 Leucemia Aguda Promielocítica com t(15;17)(q22;q12), PML-RARA;
 LMA com t(9;11)(p22;q23), AF9-MLL;
 LMA (megacarioblástica) com t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1;
 LMA Com Diferenciação Mínima;
 LMA Sem Maturação;
 LMA Com Maturação;
 Leucemia Mielomonocítica Aguda;
 Leucemia Monocítica e Monoblástica Aguda;
 Leucemia Eritróide Aguda;
 Leucemia Megacarioblástica Aguda;
Leucemias Bifenotípicas

Hematologia
Neoplasias de Precursores Linfóides:

 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(9;22)(q34;q11.2), BCR-ABL1;
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(4;11)(q21;q23), AF4-MLL;
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(12;21)(p13;q22), TEL-AML1;
 Leucemia Linfoblástica Aguda B com t(1;19)(q23;p13.3), E2A-PBX1;
 Leucemia Linfoblástica Aguda T;
Neoplasias de Células B Maturas:

 Leucemia Linfocítica Crónica (LLC);
 Leucemia Prolinfocítica B;
 Linfoma Esplénico da Zona Marginal;
 Leucemia a Hairy-Cell (tricoleucemia);
 Mieloma Múltiplo;
 Linfoma da Zona Marginal;
 Linfoma Folicular;
 Linfoma do Manto;
 Linfoma Difuso de Grandes Células B;
 Linfoma de Burkitt.
Neoplasias de Células T e NK Maturas:

 Leucemia Prolinfocítica T;
 Leucemia Linfocítica T a Grandes Células Granulares;
 Desordem Linfoproliferativa Crónica a Células NK;
 Síndrome de Sézary;
 Linfoma Anaplásico.
Houve também oportunidade para realizar colorações citoquímicas (Fosfatase

Alcalina dos Leucócitos, Mieloperoxidase, Naftol-Cloroacetato Esterase, α-Naftil-
Acetato Esterase, Ácido Periódico de Schiff e Coloração de Perl’s).
Durante o estágio, a estagiária reorganizou ainda os dossies de arquivo do

Instituto segundo a classificação da OMS 2008 (visto estarem até à data organizados
pela classificação FAB), adicionou novas lâminas ao arquivo e fotografou todas as

Hematologia
lâminas relevantes, a fim de criar um arquivo de imagens com patologias diagnosticadas

no próprio Instituto. Por outro lado, houve ainda a possibilidade da estagiária criar a sua
própria laminoteca com as lâminas de interesse que foram surgindo no dia-a-dia.
Pela experiência adquirida durante o estágio, os parâmetros definidos para

visualização de lâminas de sangue periférico no laboratório onde a estagiária trabalha
foram afinados. Por outro lado, o laboratório alterou o seu equipamento de Hematologia
para o existente no IPO Porto – Sysmex XE 2100.
2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100
Utiliza os seguintes métodos para determinação dos vários parâmetros:
1. Citometria de fluxo:
Todas as células da amostra passam individualmente entre dois pólos, criando

assim um fluxo laminar. À medida que passam individualmente neste fluxo, faz-se
incidir sobre cada célula três tipos de radiação diferentes:
- FSC, Forward Scattered Light: radiação que incide de frente na célula, sendo
difundida através da célula; avalia o tamanho celular;
- SSC, Side Scattered Light: radiação que incide lateralmente na célula, sendo
dispersa; avalia a complexidade/granularidade celular;
- SFI, Side Fluorescent Light: radiação que incide lateralmente na célula; indica
a actividade fluorescente celular, relacionada com a quantidade de DNA e RNA que a
célula contém; faz com que as histonas directamente ligadas ao material genético
fluoresçam.
Através da informação obtida (tamanho celular, complexidade celular e
conteúdo em material genético), o aparelho faz a contagem total e diferencial dos
leucócitos, conta os eritrócitos imaturos (NRBC), os reticulócitos e as plaquetas
imatura.

Hematologia
2. Método de Capacitância Eléctrica / Medição de Resistência Eléctrica (fluxo

DC):
As células da amostra são colocadas individualmente num espaço entre dois

eléctrodos com cargas opostas. A presença de uma célula irá alterar a resistência
eléctrica; a alteração da resistência eléctrica gerada pela presença de uma célula entre os
dois eléctrodos é medida, sendo esta proporcional ao volume celular.
3. Método Colorimétrico:
A formação de um composto corado é medida em solução por determinação

fotométrica da sua absorvância, sendo comparada com a absorvância da mesma solução
sem o composto corado.
4. Método de Impedância Eléctrica (método RF-DC):
A amostra de sangue (mau condutor de corrente eléctrica) é diluída numa

solução electrolítica e é exposta a uma corrente eléctrica entre dois eléctrodos. A
presença de uma célula sanguínea entre os dois eléctrodos vai aumentar a resistência na
corrente eléctrica (DC), gerando uma alteração no potencial entre os eléctrodos e,
consequentemente, gerando um impulso eléctrico; a intensidade do impulso gerado é
proporcional ao tamanho celular. Por outro lado, a densidade relativa das células
(estrutura molecular interna) poderá determinar-se por radiofrequência (RF). Este
processo melhora a precisão e reprodutibilidade das contagens de células sanguíneas em
relação ao método de capacitância eléctrica.
A análise dos diferentes parâmetros é feita em 7 câmaras de detecção distintas:
1. Câmara DIFF:
Utiliza a técnica de citometria de fluxo.

Nesta câmara é feita a contagem diferencial das diferentes populações de
leucócitos, excepto dos basófilos.
Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 10 |

Hematologia
Para isso inicialmente são lisados os eritrócitos. Aos leucócitos são apontados
raios laser no bloco óptico de detecção; a luz difundida e dispersa são medidas, o que
permite tirar conclusões sobre o tamanho e complexidade celular, respectivamente.
Assim, o aparelho consegue distinguir as diferentes populações de leucócitos,
apresentando os resultados sobre a forma de um gráfico com o tamanho celular (FSC)
em ordenadas e a complexidade celular (SSC) em abcissas.
Figura 1 – Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara DIFF do aparelho

Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).
As células imaturas presentes na amostra também podem ser observadas neste

gráfico, uma vez que apresentam um tamanho muito superior à das células maturas.
Assim, irão aparecer no gráfico para cima, tipo foguetes, como prolongamentos das
respectivas células maturas. Sempre que estejam presentes estes foguetes justifica-se,
portanto, a visualização da lâmina de sangue periférico; estes poderão corresponder a
uma infecção bacteriana ou viral (mononucleose infecciosa) ou a um processo
neoplásico.
Esta tecnologia apresenta, no entanto, dois possíveis problemas. O primeiro
reside no facto de, por vezes, existirem eritrócitos resistentes à lise celular. Estes
eritrócitos são geralmente mais imaturos na sua diferenciação e aparecem muitas vezes
em amostras de sangue periférico de recém-nascidos ou em certas neoplasias
(Mielofibrose Primária, alguns SMD, LMA Eritróide). Irão aparecer no canto esquerdo
inferior do gráfico. Por outro lado, se a amostra contiver linfócitos fragilizados, como
acontece em certas patologias oncológicas linfóides, estes poderão não resistir ao
processo de lise destinado aos eritrócitos, sendo assim quantificados por defeito. Os

Hematologia
seus restos celulares irão aparecer na mesma zona do gráfico que os eritrócitos
resistentes à lise.
Através desta distribuição não é possível, no entanto, visualizar os basófilos,
uma vez que eles se localizam na mesma zona de distribuição que os linfócitos e, sendo
geralmente poucos, são encobertos pela população linfocitária. Assim, a contagem de
basófilos é feita numa câmara diferente.
2. Câmara WBC/BASO:

Nesta câmara é feita a contagem de basófilos, bem como a contagem total de
leucócitos.
Para isso, lisam-se inicialmente os eritrócitos maturos para que a contagem total
de leucócitos possa ser feita no bloco óptico de detecção. No caso da amostra conter
eritrócitos nucleados, estes irão resistir à lise celular e ser quantificados como
leucócitos. Esta correcção é feita por recurso a outra câmara do aparelho.
Seguidamente, todos os leucócitos excepto os basófilos são lisados, o que
permite a quantificação destes últimos no bloco óptico de detecção.
Assim, sempre que a mancha correspondente aos basófilos neste gráfico estiver
aumentada, justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois pode estar-se
na presença de uma LMC.
Figura 2 - Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara WBC/BASO do

aparelho Sysmex XE 2100 (imagem cedida pela Roche).

Hematologia
3. Câmara NRBC:

Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos imaturos nucleados (NRBC), a fim de
que não seja necessário fazer a correcção do número total de leucócitos por contagem
manual dos NRBCs em amostras de sangue periférico onde precursores eritróides estão
presentes.
Para isso lisam-se as membranas dos eritrócitos maturos, ficando intactos
NRBCs e os leucócitos. Seguidamente tinge-se o material genético (mais precisamente
as histonas) dos NRBCs e dos leucócitos, de forma a que este material genético
fluoresça quando a SFI incidir sobre ele. Uma vez que os leucócitos apresentam mais
histonas do que os NRBCs e visto que o tamanho de leucócitos e NRBCs é claramente
distinto, é possível quantificá-los separadamente. A sua distribuição faz-se num gráfico
com tamanho em abcissas e nível de fluorescência emitida em ordenadas.
Sempre que este canal indicar a presença de NRBCs, caso não se trate de um
recém-nascido, a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada, pois é possível que
se esteja na presença de uma anemia regenerativa mas também de um processo
neoplásico (Policitémia vera, Mielofibrose Primária, SMD com displasia da série
eritróide ou LMA Eritróide).
Figura 3 – À esquerda, imagem correspondente à visualização de um sangue periférico sem

NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, imagem correspondente à visualização
de um sangue periférico com NRBCs na câmara NRBC do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas
pela Roche).

Hematologia
4. Canal RBC:
Utiliza a técnica de capacitância eléctrica / medição de resistência eléctrica

(fluxo DC).
Nesta câmara quantificam-se os eritrócitos (RBC) e as plaquetas (PLT).
Discriminadores automáticos separam as duas populações celulares.
Sempre que os valores obtidos para os eritrócitos ou plaquetas forem muito
baixos justifica-se a visualização da lâmina de sangue periférico, pois muitos processos
neoplásicos conduzem a uma baixa destas duas séries por invasão da medula óssea por
precursores leucocitários.
Figura 4 – À esquerda, histograma RBC do aparelho Sysmex XE 2100; à direita, histograma

PLT do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).
5. Canal de fluxo:
Utiliza o método colorimétrico.

Neste canal quantifica-se a hemoglobina (Hb) da amostra.
Para tal, a amostra é diluída numa solução electrolítica que conduz a corrente
eléctrica, ocorrendo assim a lise dos eritrócitos e a consequente libertação da
hemoglobina (Hb). Segue-se a conversão da Hb em cianometahemoglobina (SLS-Hb),
um composto corado cuja absorvância a 540 nm é medida fotometricamente. A
absorvância da SLS-Hb é comparada com a absorvância da solução electrolítica sem
amostra diluída.
A partir dos parâmetros determinados no canal RBC e canal de fluxo, os índices

eritrocitários podem ser calculados pelo aparelho.

Hematologia
6. Canal RET:

Nesta câmara quantificam-se os reticulócitos e as plaquetas muito imaturas
(PLT-fl).
Para isso tinge-se o material genético (mais precisamente as histonas) de todas
as células presentes na amostra: leucócitos, NRBCs, reticulócitos e plaquetas muito
imaturas. As plaquetas maturas não apresentam núcleo e, portanto, não têm material
genético que possa ser corado; só as muito imaturas apresentam vestígios de material
genético.
Como a intensidade de fluorescência dos leucócitos e dos NRBCs é muito
elevada em relação à dos reticulócitos e das plaquetas imaturas, estas populações
conseguem facilmente distinguir-se das populações que se desejam avaliar nesta câmara
e o cut-off no gráfico é feito de forma a que leucócitos e NRBCs nem sequer sejam
visualizados.
À medida que maturam, os reticulócitos vão perdendo material genético e,
assim, intensidade de fluorescência. Como tal, num diagrama em que se avalia o
tamanho celular em abcissas e o grau de fluorescência emitida em ordenadas, é possível
distinguir as diferentes populações de reticulócitos, desde os mais imaturos (HFR - high
fluorescence ratio), passando pelos de maturidade intermédia (MFR – middle
fluorescence ratio), até aos reticulócitos mais maturos (LFR – low fluorescence ratio),
acabando nos eritrócitos maturos (RBC-o) já sem fluorescência emitida.
Adicionalmente, a fracção da população muito precoce de reticulócitos (IRF,
reticulócitos imaturos) é analisada.
As plaquetas imaturas (PLT-fl), que ainda emitem fluorescência, são muito mais
pequenas que os reticulócitos e, para além disso, emitem menos fluorescência que estes
últimos, podendo assim distinguir-se no gráfico. Estas plaquetas imaturas não são
quantificadas no canal que mede usualmente as plaquetas (canal RBC). Assim, se as
plaquetas forem quantificadas no canal RET, o seu valor será ligeiramente superior
dado a suplementar quantificação das plaquetas imaturas. Esta quantificação é muito
importante sobretudo para doentes que apresentam níveis baixos de plaquetas, exibindo
um valor próximo do cut-off entre o fazer ou não uma transfusão, receber ou não o seu
tratamento de quimioterapia. Assim, no IPO sempre que um doente apresenta um valor
de plaquetas ligeiramente inferior a 20x10^9/L (nível de cut-off importante para muitas

Hematologia
decisões terapêuticas, quase que como os 150x10^9/L do limiar inferior que geralmente
se admite fora de um instituto de oncologia), este parâmetro é quantificado no canal
RET, podendo, assim, evitar-se transfusões em certos casos ou permitir-se a
quimioterapia noutros.
Figura 5 – Localização das diferentes fracções de reticulócitos imaturos e de plaquetas

fluorescentes no canal RET do aparelho Sysmex XE 2100 (imagens cedidas pela Roche).
7. Canal IMI:
Utiliza a método de impedância eléctrica (método RF-DC).

Neste canal quantificam-se as células imaturas: as stem cell (HPC – Human
Progenitor Cells) e os granulócitos imaturos (IG – Immature Granulocytes).
O reagente utilizado afecta os constituintes lipídicos das membranas celulares.
Assim, eritrócitos e leucócitos maturos são lisados. Os leucócitos imaturos permanecem
intactos, dado o seu menor conteúdo em lípidos a nível das membranas celulares.
Assim, em amostras de sangue normais (isto é, sem precursores), nenhumas células
aparecem no gráfico correspondente ao canal IMI visto que todas as células são lisadas.
Este gráfico comporta em ordenadas o sinal RF (corresponde à estrutura molecular
interna das células) e em abcissas o sinal DC (correspondendo ao volume celular). Em
amostras de sangue de pacientes sujeitos a quimioterapia, a visualização dos HPC
permitirá concluir que o doente está a arrancar; o parâmetro IG permitirá detectar
precocemente uma possível infecção.
Assim, sempre que o gráfico correspondente ao canal IMI indicar a presença de
células precursoras a lâmina de sangue periférico deverá ser visualizada.

Hematologia
Por outro lado, este canal também dá uma ideia da existência de agregados
plaquetários (PLT Clumps), que no caso de existirem aparecerão como prolongamentos
das plaquetas isoladas. Poderá, nesse caso, ponderar-se uma pseudo-trombocitopénia,
devendo visualizar-se a lâmina a fim de a confirmar. Para a objectiva de 100x, a
observação de 5 plaquetas por campo corresponde sensivelmente a uma contagem de
100x10^9/L plaquetas.
Figura 6 – Canal IMI do aparelho Sysmex XE 2100; imagem de um sangue periférico sem
percursores mielóides nem agregados plaquetários (imagem cedidas pela Roche).

3. Imunologia
O estágio decorreu:
- No Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil, Entidade
Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), Serviço de Imunologia, Laboratório de
Imunologia Celular, durante o mês de Março de 2009, sob a orientação da Drª Gabriela
Martins (Imunologia Celular). O estágio perfez um total de 154 horas.
- No Hospital Curry Cabral, Serviço de Nefrologia, Laboratório de Imunologia,
entre 7 de Setembro e 16 de Outubro, sob a orientação da Drª Maria do Céu Santos
(Imunologia Humoral). O estágio perfez um total de 150 horas.
Antes da realização do estágio, a estagiária tinha pouco conhecimento teórico da

área, adquirido na valência de Hematologia II e Imunologia do Mestrado de Análises
Clínicas. Os estágios, contudo, permitiram o adquirir de conhecimentos teóricos mais
sólidos e a sua aplicação prática.
Os conhecimentos apreendidos e praticados no estágio de Imunologia Humoral

permitirão a implementação da Técnica de Imunofluorescência Indirecta no Laboratório
onde a estagiária trabalha.
O serviço de Imunologia do IPO Porto recebe, em média, cinco amostras

diariamente.
Durante a primeira semana de estágio, a estagiária teve a oportunidade de
aprender a preparar as amostras que foram surgindo na rotina diária; durante a segunda
semana adquiriu amostras nos dois Citómetros de Fluxo do serviço; a terceira e quarta
semanas de estágio foram dedicadas à análise de resultados no programa Infinicyt.
Durante o estágio, a estagiária teve ainda oportunidade de frequentar um curso
nocturno de Iniciação à Citometria de Fluxo leccionado pela Enzifarma.
O Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral executa semanalmente,

em média, 80 amostras para pesquisa de ANAs por Imunofluorescência Indirecta, 30
amostras para pesquisa de Auto-Anticorpos Anti-DNAds, 20 amostras para pesquisa

Imunologia Celular
geral de Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos e 30 amostras para pesquisa de ANAs

específicos por Dot’s.
Durante o estágio, a estagiara teve oportunidade de executar lâminas
manualmente e automaticamente para as diferentes técnicas de Imunofluorescência
Indirecta e visualizá-las. Teve ainda oportunidade de executar automaticamente testes
de ELISA, verificar o funcionamento do aparelho de ELISA e executar Dot’s para as
diferentes técnicas disponíveis no hospital.

Imunologia Celular
3.1. Imunologia Celular
3.1.1. Princípios da Citometria de Fluxo
A Citometria de Fluxo exibe a capacidade de medir propriedades (parâmetros

celulares) de partículas em suspensão, uma a uma.
Quando uma amostra em solução é injectada num Citómetro de Fluxo, as
partículas em suspensão são aleatoriamente distribuídas no espaço tridimensional.
Assim, é necessário que as partículas da amostra sejam alinhadas, de forma a que o
sistema de detecção do Citómetro de Fluxo as consiga avaliar individualmente. Este
processo é conseguido pelo sistema de fluidos do aparelho, que consiste num canal
central apertado através do qual a amostra é injectada com uma determinada velocidade
de fluxo. Sob condições optimizadas, obtém-se um fluxo laminar, sendo cada partícula
analisada individualmente.
Após focagem hidrodinâmica, cada partícula é atravessada por um feixe de luz
(laser). Estando cada partícula ligada a um fluorocromo, após a absorção de energia do
feixe de luz incidente, a emissão de fluorescência pelo fluorocromo fornecerá
informação acerca das propriedades da partícula a que está ligado. A radiação emitida
na direcção do feixe de luz incidente é captada por uma lente conhecida por “Forward
Scatter Channel” (FSC); fornece informação acerca do tamanho da partícula e
distingue partículas inteiras (células vivas, maiores) de partículas alteradas (restos
celulares, menores). A radiação emitida aproximadamente a 90 graus do feixe de luz
incidente é captada por uma lente conhecida por “Side Scatter Channel” (SSC); fornece
informação acerca da complexidade (conteúdo em granulação) da partícula. As duas
informações em simultâneo permitem distinguir vários tipos de células numa amostra
heterogénea.

Imunologia Celular
Figura 7 – Imagem obtida nos contadores hematológicos. Gráfico com FSC (tamanho celular) no
eixo dos y, versus SSC (granularidade) no eixo dos x. Só estes dois parâmetros permitem distinguir a
população normal de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e restos celulares (ghost). Os poucos
basófilos são encobertos pela vasta população de linfócitos normais (imagem cedida pela Enzifarma).
Figura 8 – Imagens obtidos num Citómetro de Fluxo. Na imagem à esquerda, gráfico com SSC
(granularidade) no eixo dos y e FSC (tamanho) no eixo dos x; é possível distinguir linfócitos (vermelho),
monócitos (azul escuro), neutrófilos (verde), eosinófilos (roxo) e restos celulares (laranja); os monócitos
(azul claro) misturam-se com os linfócitos. Na imagem à direita, gráfico com CD45 (marcador
leucocitário) no eixo dos y e SSC (granularidade) no eixo dos x; é possível isolar a população
monocitóide da linfóide (imagem cedida pela Enzifarma).
A medição da fluorescência emitida a diferentes comprimentos de onda,

seleccionados com recurso a diferentes filtros, fornece informação quantitativa e
qualitativa acerca dos fluorocromos ligados tanto à superfície das partículas (receptores
celulares) como ao seu interior (moléculas intracelulares, como DNA e citocinas).

Imunologia Celular
Quando a luz emitida atinge um fotodetector gera-se uma pequena corrente

eléctrica, cuja voltagem é proporcional ao número de fotões recebidos pelo detector.
Esta voltagem é convertida em sinal digital e, seguidamente, expressa graficamente.
Nem todos os fluorocromos podem ser utilizados em Citometria de Fluxo. É
necessário que a diferença entre a Energia de Absorção e a Energia de Emissão do
fluorocromo seja suficientemente elevada para que apresentem diferentes cores no
espectro de luz visível. Por exemplo, o fluorocromo FITC (“Fluorecein Isothiocyanate”)
absorve luz entre os 400-550 nm (luz azul) e emite o seu máximo de radiação a 525 nm
(luz verde).
Como escolher o melhor laser e o melhor filtro para cada fluorocromo? O pico
de absorção para o FITC ocorre para 490 nm. Assim, o laser escolhido para a sua
excitação deve excitar próximo deste valor (escolhe-se o laser Azul de Argon, que
excita a 488 nm), pois quanto mais o fluorocromo se excitar, maior intensidade de
fluorescência irá emitir. Por outro lado, embora emita o seu máximo de radiação a 525
nm (luz verde), o FITC emite radiação num espectro mais alargado que vai de 475 a 700
nm (abrange a zona do azul-verde-amarelo-laranja). Consoante o filtro escolhido, assim
a zona do espectro onde irá emitir radiação, assim a cor que evidenciará. O filtro
escolhido deverá seleccionar o máximo de radiação emitida para o fluorocromo, para
que este apresente a maior intensidade possível. Para o FITC deve escolher-se um filtro
que seleccione a radiação emitida a 525 nm (luz verde); daí dizer-se que o FITC é um
fluorocromo verde.
Utilizando-se vários fluorocromos é possível analisar vários parâmetros
celulares ao mesmo tempo numa determinada amostra. Assim, é possível que, por
exemplo, o fluorocromo FITC se ligue a todos os CD45 (marcador leucocitário) da
superfície celular, enquanto que o fluorocromo PerCP se liga a todos os CD19
(marcador de linfócitos B). Conjugando vários fluorocromos é possível obter-se
informação acerca de múltiplas propriedades celulares numa só análise.

Imunologia Celular
Figura 9 – Fluorocromos utilizados pelo Serviço de Imunologia do IPO do Porto nos dois
citómetros existentes no serviço (imagem cedida pelo Serviço de Imunologia do IPO, Porto).
Uma consideração a ter em conta quando se utilizam múltiplos fluorocromos é a

possível sobreposição espectral. Isto é, há possibilidade do espectro de emissão de dois
(ou mais) fluorocromos coincidir, tornando a medição da fluorecência do fluorocromo
que de facto emitiu a radiação difícil. Esta interferência é evitável porque actualmente o
próprio Citómetro faz automaticamente a chamada compensação de fluorescência; isto
é, selecciona diferentes comprimentos de onda para a leitura da emissão de radiação
para fluorocromos cujo espectro de emissão seja em parte sobreponível.
3.1.2. Preparação das Amostras
Utilizam-se amostras de sangue periférico total, aspirado medular, biopsia

aspirativa de gânglios, fragmentos de biopsia excisionais de gânglios, lavado bronco-
alveolar, líquido cefalo-raquidiano e líquido ascítico. O EDTA é o anticoagulante de
eleição.
As amostras deverão ser analisadas pouco tempo após a colheita, para que se
evite a morte celular.
A amostra deverá apresentar uma densidade celular que ronde os 10^6
células/mL para evitar entupir o Citómetro. Assim, a densidade celular da amostra é
medida previamente, sendo a amostra diluída numa solução isotónica.
À amostra adicionam-se os anticorpos-monoclonais (marcados com
fluorocromos) cuja presença se pretende analisar. Sempre que se utilizam anticorpos-
monoclonais que marcam as imunoglobulinas leves de superfície (κ e λ), adiciona-se

Imunologia Celular
uma solução de albumina à amostra antes de se adicionaram os anticorpos-

monoclonais; esta solução irá eliminar as imunoglobulinas serológicas que, de outra
forma, interfeririam com a determinação pretendida. Sempre que se utilizam anticorpos-
monoclonais que marcam antigénios citoplasmáticos, adiciona-se uma solução fixadora
e uma permeabilizadora antes de se adicionar o monoclonal à amostra, a fim de que
este consiga atingir o conteúdo intracelular, sem contudo destruir a célula.
Adiciona-se depois uma solução de lise dos eritrócitos para que estes não
interfiram na análise das populações leucocitárias.
Lava-se depois o preparado com a solução isotónica para que os eritrócitos
lisados e os monoclonais que não se ligaram aos antigénios celulares sejam removidos.
Entre as diferentes adições é necessário incubar o preparado no escuro (evitar a
perda de fluorescência do fluorocromo).
Procede-se, por fim, à aquisição do preparado no Citómetro de Fluxo.
3.1.3. Marcadores Celulares
Todas as células normais expressam uma variedade de marcadores de superfície

(receptores celulares) e marcadores intracitoplasmáticos (marcadores
intracitoplasmáticos, DNA, citocinas), dependendo do seu tipo celular e do seu grau de
maturação. Contudo, um crescimento celular anormal (neoplasia) pode interferir com a
expressão normal dos marcadores. Assim, qualquer alteração seguidamente descrita,
obriga a confirmar e caracterizar essa alteração, na tentativa de sugerir uma hipótese de
diagnóstico.
- Intensidade e/ou modo de expressão dos marcadores característicos de um
determinado tipo celular;
- Cronologia de expressão dos diferentes marcadores durante o processo de
maturação celular;
- Características de tamanho e complexidade celulares;
- Percentagens relativas de expressão de uma determinada população celular em
relação às restantes populações;
- Tipo de receptores que uma determinada linhagem celular costuma expressar
(expressões anormais).
Como tal, a técnica de Citometria de Fluxo é de extrema utilidade não só no
diagnóstico, como também na classificação, no prognóstico, na monitorização
Imunologia Celular
terapêutica e na avaliação de recaída de leucemias, Síndromes Mieloproliferativos,

Síndromes Mielodisplásicos, linfomas e mielomas.

Imunologia Humoral
3.2. Imunologia Humoral
As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imune onde

os linfócitos T e B respondem contra antigénios do próprio, com consequente produção
exagerada de auto-anticorpos, sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou
a presença de antigénios tumorais. Podem ser inespecíficas ou específicas de órgão,
sendo a sua prevalência felizmente baixa entre nós.
Assim, os testes laboratoriais imunológicos que detectam a presença de auto-
anticorpos fornecem informação relevante no que respeita o diagnóstico, prognóstico e
monitorização das DAI. Contudo, a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a
presença de doença, uma vez que em indivíduos saudáveis verifica-se por vezes a
existência destes auto-anticorpos, embora geralmente em títulos baixos. Por outro lado,
a utilização inadequada destes testes poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a
um aumento dos custos no tratamento destas patologias. Exige-se, portanto, uma
marcha analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.
No Hospital Curry Cabral (HCC), sempre que é feito um pedido de um

anticorpo-antinuclear (ANA) começam por se realizar duas técnicas de
imunofluorescência indirecta (IFA) em células HEp-2 (identificação de todos os ANAs,
com elevada sensibilidade e baixa especificidade) e células de Crithidia luciliae
(identificação específica de DNAds).
Nas células HEp-2, caso as células exibam um padrão de fluorescência nuclear
identifica-se o tipo de padrão (homogéneo, fino granular, granular, matriz nuclear,
perinuclear, poros da membrana nuclear, etc) e titula-se a fluorescência (1:160, 1:320,
1:640 ou > 640). Para estas amostras positivas por IFA realiza-se depois o teste de
ELISA ANA Screen que permite confirmar a existência de alguns auto-anticorpos
(DNAds, histonas, Sm e hnRNP para LES, Scl-70 para Escleroderma Difusa, SS-A e
SS-B para Síndrome de Sjögren, U1-snRNP para DMTC, centrómero para CREST e Jo-
1 para Miosites). Para as amostras positivas para o teste ANA Screen ou negativas para
ANA Screen mas com títulos altos por IFA (possível existência de um auto-anticorpo
não identificável por ANA Screen) segue-se a marcha analítica por execução de
Imunodot’s – reacções de ELISA que permitem a identificação do(s) auto-anticorpo(s)
presente(s) no soro do doente. O(s) Imunodot(‘s) escolhido(s) depende(m) do(s) auto-

Imunologia Humoral
anticorpo(s) que se desconfia que o doente possa ter ou da informação clínica

disponível:
- Perfil ANA (DNAds, Histonas, Nucleossoma, Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-
snRNP, PCNA, hn-RNP, PM-Scl, CENP-B, AMA-M2, Jo-1, estando sublinhados os
anticorpos não pesquisados no ANA Screen);
- Perfil Hepático (M2, M2-3E, gp210, sp100 e PML sobretudo associados a
Cirrose Biliar Primária; Ro-52 associado a Cirrose Biliar Primária e Hepatite
Autoimune I; LKM-1 e LC-1 sobretudo associados a Hepatite Autoimune II; SLA e LP
sobretudo associados a Hepatite Autominue III);
- Perfil Miosites (Mi-2, PM-Scl 75, PM-SCl 100, Ku, Jo-1, SRP, PL-7, PL-12 e
EJ). Os testes de ELISA caracterizam-se por apresentar menor sensibilidade mas maior
especificidade que as células HEp-2 para os ANAs.
No caso da amostra conter um auto-anticorpo anti-DNAds ou anti-nucleossoma,
identificável no Perfil ANA, segue-se a sua quantificação por um ELISA Quantitativo.
Para as amostras positivas nas células de Crithidia luciliae segue-se
directamente a quantificação do DNAds por um ELISA Quantitativo.
Se nas células HEp-2 se suspeitar da existência de um padrão citoplasmático
mitocondrial ou de actina procede-se de imediato à pesquisa destes auto-anticorpos em
substratos mais adequados do que as células HEp-2 à sua identificação: lâminas
compostas por seis tipos de tecidos (células HEp-2, tecido hepático de rato e macaco,
tecido renal, tecido gástrico e células VSM-47).
Sempre que é feito um pedido de um anticorpo anti-citoplasmático são as
lâminas compostas pelos seis tecidos já mencionados que se utilizam para a pesquisa
inicial por IFA. As lâminas permitem a identificação/suspeita de auto-anticorpos anti-
actina (característicos de Hepatite Autoimune tipo 1), anti-mitocôndrias (por vezes
característicos de Cirrose Biliar Primária), anti-LKM1 (característicos de Hepatite
Autoimune 2) e anti-Células Parietais (característicos de Gastrite Atrófica Crónica e
Anemia Perniciosa). A presença dos auto-anticorpos anti-actina é confirmada nas
próprias células VSM-47 das referidas lâminas. A suspeita de auto-anticorpos anti-
mitocôndrias e anti-LKM1 é confirmada por Imunodot’s realizando-se o Perfil
Hepático. A suspeita de auto-anticorpos anti-células parietais é confirmada por
Imunodot’s realizando-se o Perfil Gástrico.
Por outro lado, sempre que o pedido médico é específico para um determinado
tipo de auto-anticorpos utilizam-se lâminas com tecidos indicados para a sua pesquisa

Imunologia Humoral
por IFA: auto-anticorpos anti-ductos-salivares (característico de Síndrome de Sjögren),

anti-Ilhéus de Langerhans (característicos de Diabetes Mellitus tipo I), anti-Supra-
Renais (característicos de Doença de Addison Primária), anti-Endomísio (característicos
de Doença Celíaca) e anti-Músculo Estriado Esquelético (característicos de Myasthenia
gravis).
Para além da quantificação dos auto-anticorpos anti-DNAds e anti-nucleossoma
já referida é essencial ao diagnóstico / à monitorização clínica a quantificação dos
ANCAs (pANCA MPO e cANCA PR3) para as vasculites e auto-anticorpos anti-
Cardiolipina e anti-β2-Glicoproteína 1 IgM e IgG para o Síndrome Antifosfolipídico.
Para além destes, também se quantificam no HCC os auto-anticorpos anti-ICC e C1q, os
anti-CCP (específicos para Artrite Reumatóide), os anti-GBM (característicos de
Síndrome de Goodpasture) os anti-Gliadina e anti-Transglutaminase IgA e IgG
(característicos da Doença Celíaca) e os anti-Desmogleinas 1 e 3 e BP180
(característicos dos vários tipos de Pênfigo). Sempre que um destes pedidos médicos é
feito, realiza-se directamente a quantificação destes auto-anticorpos por um ELISA
Quantitativo, sem que nenhum teste de rastreio se realize previamente.
Por uma questão de organização do serviço, à 2ª feira realizam-se as lâminas das
células HEp-2, das células de Crithidia luciliae e as lâminas compostas por seis tecidos
para pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-nucleares e anti-citoplasmáticos. À 3ª feira
lêem-se estas lâminas por IFA e realizam-se os testes ANA Screen necessários. À 4ª
feira executam-se os Imunodot’s adequados. À 5ª realizam-se os ELISAs Quantitativos.
A 6ª é o dia das repetições e confirmações necessárias. Os tecidos para pesquisa de
auto-anticorpos específicos por IFA executam-se sempre que o número de amostras a
executar o justifica.
Desta forma garante-se no HCC organização no serviço e identificação de todos
os tipos de auto-anticorpos disponíveis até ao momento no mercado, sendo o auxílio
dado à clínica médica o melhor possível.

4. Genética Molecular Humana
O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco

Gentil, Entidade Pública Empresarial (IPOPFG, E.P.E.), no Serviço de Genética, nos
seguintes laboratórios:
- Laboratório de Genética Molecular, durante o mês de Maio de 2009, sob a
orientação da Drª Susana Bizarro (Biologia Molecular). O estágio perfez um total de
140 horas.
- Laboratório de Citogenética, durante o mês de Junho, sob a orientação da Drª
Cecília Correia (Citogenética Clássica e FISH). O estágio perfez um total de 126
horas.
O Serviço de Genética recebe, em média, cinco amostras diariamente para cada

um dos dois laboratórios.
Antes da realização do estágio de Biologia Molecular, a estagiária já tinha algum

conhecimento teórico da área, adquirido na valência de Biologia Molecular do Mestrado
de Análises Clínicas. O estágio, contudo, permitiu a consolidação e a aplicação prática
dos conhecimentos teóricos previamente adquiridos, tendo-se revelado muito útil. A
estagiária teve a oportunidade de observar e executar todas as técnicas moleculares que
seguidamente se descrevem.
Assim, foi possível propor ao Laboratório de Análises Clínicas onde a estagiária
trabalha a implementação de Técnicas Moleculares, actualmente já em curso.
Antes da realização do estágio de Citogenética, a estagiária não tinha

praticamente nenhum conhecimento da área, dado que só uma aula da cadeira de
Hematologia II abordou o assunto de forma genérica durante todo o Mestrado de
Análises Clínicas. Durante o estágio, a estagiária teve oportunidade de apreender
conhecimentos teóricos relacionados com a Citogenética Clássica e FISH, executar
lâminas para Citogenética Clássica e FISH, aprender a nomenclatura dos cromossomas
para a realização de cariótipos, realizar cariogramas e observar lâminas de FISH ao
microscópio de fluorescência.

Genética Molecular Humana – Biologia Molecular
4.1. Biologia Molecular
Nas últimas décadas, numerosas alterações genéticas foram detectadas em

neoplasias hematológicas. Hoje sabe-se que uma determinada alteração genética
específica está na génese de um tumor hematológico em particular, por causar uma
alteração no equilíbrio proliferação celular / apoptose. Esta alteração genética é sempre
clonal e adquirida, sendo limitada às células malignas do organismo. As alterações que
conduzem ao processo neoplásico podem ocorrer em quatro diferentes grupos de genes:
genes de reparação do DNA, genes que interferem com a apoptose, genes que
interferem com o Ciclo Celular, genes que controlam a proliferação celular (Proto-
Oncogenes – genes que estimulam a proliferação celular – ou Genes Supressores
Tumorais – genes que inibem a proliferação celular). Os estudos moleculares são
imprescindíveis nas alterações neoplásicas hematológicas. Revelam-se excelentes
marcadores de diagnóstico, prognóstico, orientação terapêutica, avaliação de doença
residual mínima e avaliação de resposta/resistência à terapêutica instituída.
As amostras de sangue e medula óssea processadas no Laboratório de Genética

Molecular do IPO Porto são colhidas em EDTA (a heparina inibe a reacção de PCR). O
processo de extracção do material genético (DNA e RNA) é feito por salting-out, sem
recurso a kits de colunas hidrofílicas. O material genético extraído é analisado com
recurso às técnicas que seguidamente se descrevem.
4.1.1. PCR
4.1.1.1.Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction)
Uma reacção de PCR Simples é um processo automatizado que envolve a

amplificação de “genes” in vitro. A reacção necessita essencialmente do seguinte:
- Sequência de DNA que se pretende amplificar (DNA molde);
- Um par de primers (RNA primases) sintéticos de cadeia simples e
complementares às extremidades 3’ dos fragmentos de DNA molde;
- Nucleótidos livres (dNTPs);

- Enzima para a síntese do DNA (DNA Polimerase), resistente a altas

temperaturas;
- MgCl2 – cofactor da DNA Polimerase;
- Tampão de reacção ideal ao funcionamento da DNA Polimerase utilizada.
Consiste numa série de ciclos, cada um dos quais envolvendo reacções
efectuadas a temperaturas diferentes. Cada ciclo de PCR envolve os seguintes passos:
- Desnaturação da dupla cadeia de DNA (94 a 96ºC, 2 a 5 minutos);
- Emparelhamento (annealing) dos primers foward e reverse (55 a 70ºC
consoante os primers utilizados, 30 segundos a 1 minuto); os primers vão emparelhar
com as cadeias simples de DNA porque estão presentes em concentração muito elevada
em relação à concentração de DNA existente no meio reaccional;
- Síntese de DNA por acção da DNA Polimerase (polimerização), que usa como
molde a cadeia simples de DNA a que cada primer está emparelhado (1 a 2 minutos, 72
a 74ºC - temperatura mais elevada que para o emparelhamento mas variável consoante a
enzima utilizada - 72ºC para a Taq Polimerase).
O ciclo é repetido várias vezes no aparelho de PCR, demorando cada ciclo
apenas alguns minutos e, por isso, todo o processo é muito rápido. O resultado é a
grande amplificação das sequências de DNA delimitadas pelos dois primers usados na
reacção. Cada n ciclos leva à produção de 2^n moléculas de DNA. No final da reacção o
termociclador mantém-se a 4ºC a fim de conservar o produto de reacção. A quantidade
de DNA que se obtém é suficiente para que este seja directamente visualizado num gel
de agarose, sem recurso a técnicas mais sensíveis.
Se a reacção de PCR for contaminada com DNA estranho, este pode emparelhar
com os primers, mesmo que só parcialmente, e ser amplificado. Para que se evitem
contaminações devem respeitar-se as seguintes condições:
- A área de trabalho deve ser arejada (ar condicionado ou janela) e não ter
ligação com áreas de contaminação;
- A sala de pipetagem dos reagentes, a sala de PCR e a sala de electroforeses
(que está sempre ultra-contaminada) deverão ser isoladas umas das outras;
- As bancadas de trabalho deverão ser descontaminadas com álcool a 100%;
- Todo o material utilizado terá de ser esterilizado, podendo para isso utilizar-se
uma câmara de UV; trabalhar numa câmara de UV é sobretudo importante quando se
manipula produtos de PCR, cujos aerossóis podem contaminar o meio; o operador
deverá mudar de luvas regularmente;

- Todo o material utilizado para PCR (exº: micropipetas) não deverá ser utilizado
para outros fins;
- As micropipetas deverão ser resistentes à formação de aerossóis quando se
trabalha com produtos de PCR;
- Os reagentes devem ser congelados em alíquotas individualizadas para evitar
perdas de actividade e contaminações que iriam fazer perder todo o material;
- Os reagentes deverão estar em gelo durante todo o processo de pipetagem,
sobretudo se se trabalhar com RNA porque trata-se de uma molécula mais facilmente
degradável que o DNA e porque no frio as RNAses (existentes em todo o ambiente e
sem necessidade de co-factor para actuarem) não têm actividade;
- A DNA Polimerase deverá ser o último reagente pipetado;
- Para mix’s que serão distribuídas por 10 amostras, será conveniente pipetar
reagentes para 11 amostras; para 20 amostras, pipetar reagentes para 22 amostras; etc;
- Evitar vortexar os tubos de PCR, agitando os reagentes da reacção com o
auxílio do dedo indicador;
- Para controlo de cada reacção de amplificação deverá sempre utilizar-se um
controlo negativo (feito com tudo excepto com o DNA a amplificar cujo volume é
substituído por água) e um controlo positivo (fornecido pela casa comercial ou com um
resultado fortemente positivo anterior).
4.1.1.2.RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
A reacção de RT-PCR é utilizada sempre que se pretende trabalhar com RNA

em vez de DNA. Tal poderá ser vantajoso porque o RNA não contém os intrões que o
DNA possui, amplificando-se uma zona menor do material genético. Para tal, apenas
tem que se utilizar uma outra enzima, a Transcriptase Reversa (e os respectivos
primers), que converte o RNAm em DNA complementar (cDNA). A partir daí, o cDNA
é amplificado da mesma forma que o DNA por PCR.
4.1.1.3.RT-PCR Nested
O RT-PCR Nested envolve uma primeira reacção de RT-PCR normal em que se

utilizam os chamados primers externos. Segue-se uma segunda reacção de RT-PCR -
realizada com o produto da primeira reacção mas num tubo diferente - em que se

utilizam primers mais internos em relação aos utilizados na primeira reacção; esta
segunda reacção designa-se por Nested.
Este segundo conjunto de primers utilizado na segunda reacção funciona como
um controlo extra ou uma confirmação do primeiro RT-PCR, aumentando a
sensibilidade da reacção aproximadamente de 1:1000 para 1:1x10^6. Ou seja, poderá
acontecer que os primers na primeira reacção se liguem a uma zona diferente
(inespecífica) da que se pretende amplificar, mas nesse caso o segundo conjunto de
primers (mais internos) não se irá ligar ao produto da primeira reacção não havendo
amplificação do sinal; se se fizesse correr num gel de agarose, o produto da primeira
reacção visualizar-se-ia como uma banda (que até poderia apresentar o mesmo peso
molecular que a banda esperada), mas ao se fazer correr noutro gel o produto da
segunda reacção não se obteria qualquer banda.
Também a especificidade do processo aumenta, passando a visualizar-se muito
menos bandas inespecíficas no gel de agarose realizado para o produto da segunda
reacção.
4.1.1.4.PCR Específico de Alelo (ASO-PCR)
Trata-se de uma variação à reacção de PCR utilizada para pesquisar mutações

pontuais. Utiliza um conjunto de primers em que um deles se liga especificamente à
zona de uma mutação pontual no caso de esta estar presente; assim, só nesse caso
haverá amplificação do sinal. Utiliza-se como controlo um terceiro primer (que faz
“pare” com o primer que se liga fora do local da mutação) que se liga a uma zona fora
do local da mutação e que, portanto, deverá amplificar um sinal independentemente de
existir ou não mutação. Como tal, caso haja mutação obter-se-ão duas bandas no gel de
agarose, enquanto que se não houver mutação apenas se obterá uma banda
correspondente ao controlo.
4.1.1.5.PCR de Longa Distância (PCR-LD)
Trata-se de uma variação à reacção de PCR que utiliza uma DNA Polimerase
(com actividade de proofreading) que tem a capacidade de amplificar um fragmento
muito maior de DNA, de 5 kb a 40 kb.

4.1.1.6.PCR em Tempo Real (Real Time-PCR) – PCR Quantitativo
O PCR/RT-PCR determina se o DNA/cDNA em pesquisa está ou não presente

na amostra (avaliação qualitativa). O PCR em Tempo Real determina a quantidade de
DNA/cDNA presente na amostra (avaliação quantitativa).
Teoricamente, a quantidade de produto de PCR obtida duplica no final de cada
ciclo de amplificação (relação exponencial), o que pressupõe que a reacção ocorra com
100% de eficácia em todos os ciclos de amplificação. Contudo, a existência de
inibidores de reacção altera este pressuposto. Para além disso, amplificações tardias são
realizadas com menos eficácia que as primeiras amplificações. Assim, a reacção não é
eternamente exponencial, exibindo uma fase linear e, no final, uma fase de plateau.
Figura 10 – Diferentes fases de uma reacção de PCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética,
IPO Porto).
Na fase exponencial de reacção o produto de PCR obtido duplica ao fim de cada

ciclo (100% eficácia); a reacção é muito específica e precisa. Na fase linear os
componentes da reacção começam a esgotar e a reacção começa a abrandar; o produto
de PCR já não duplica no final de cada ciclo. Na fase de plateau os componentes
esgotam-se, não se forma mais produto de PCR, a reacção pára e os produtos de PCR
começam a degradar-se.
Numa reacção de PCR/RT-PCR qualitativo avalia-se o DNA/cDNA obtido no
final da reacção (fase de plateau). Essa avaliação é feita por observação de uma banda
num gel de agarose; contudo, a espessura da banda não permite quantificar o
DNA/cDNA obtido (baixa sensibilidade), apenas permitindo dizer se houve ou não

amplificação, isto é, se o DNA/cDNA está ou não presente na amostra. O PCR

quantitativo avalia a quantidade de DNA/cDNA formada, não na fase de plateau, mas
antes na fase exponencial (específica e precisa), através do uso de um sistema
informático, por análise da cinética da reacção de PCR.
Para quantificação do material genético da amostra pode utilizar-se a técnica de
FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer). Esta técnica baseia-se no princípio de
que quando uma fonte de energia elevada está próxima de uma fonte de energia mais
baixa, haverá transferência de energia da primeira para a segunda.
Segundo esta técnica, um oligonucleótido (sonda TaqMan) é adicionado à mix
de reagentes de PCR/RT-PCR. A sonda é desenhada de forma a ligar-se
especificamente a uma sequência do DNA/cDNA molde entre o primer foward e o
reverse. Assim, a sonda encontrar-se-à no caminho da DNA Polimerase quando esta
começar a copiar o DNA/cDNA. A sonda é desenhada com uma extremidade 5’ de alta
energia (Reporter) e uma extremidade 3’ de menor energia (Quencher). Quando a sonda
está intacta e é excitada por uma fonte luminosa, o Reporter fornece parte da sua energia
ao Quencher, dada a proximidade existente entre ambos, e assim o Reporter não emite
quase nenhuma fluorescência (abaixo do limiar de detecção do instrumento). Quando a
sonda é clivada pela DNA Polimerase a distância entre o Reporter e o Quencher
aumenta, o Reporter deixa de conseguir transferir a sua energia ao Quencher e passa a
emitir toda a sua energia sob a forma de fluorescência. O aumento de fluorescência
emitida pelo Reporter atinge um nível que consegue ser detectado pelo instrumento,
dando origem a uma curva de amplificação.
forward R Q R
pr Q
5primer 3 5' 3'
3 ob 5 3' 5'
'5 ' 3 3'
' e '5 5' 5'
reverse
1.' '
primer ' 2. strand displacement
polymerisatio
n
R
R Q
Q
5' 3'
3' 5' 5'
3' 5'
5' 3'
5' 5' 3'
3' 5'
3. cleavage
4. polymerisation completed
Figura 11 – Esquema de actuação da sonda TaqMan no decurso de uma reacção de PCR/RT-

PCR (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).

A curva de amplificação contém informação essencial para a quantificação de

DNA/cDNA da amostra. A linha “threshold” correponde ao ponto em que a reacção
atinge uma intensidade de fluorescência detectada pelo aparelho. Esta linha atinge-se na
fase exponencial da reacção de PCR/RT-PCR. O ciclo ao qual a amostra atinge este
nível designa-se por “Cycle Threshold” (CT). Teoricamente, existe uma relação
quantitativa entre a altura em que a amplificação entra em fase exponencial e a
quantidade de DNA/cDNA da amostra; isto é, quanto maior a quantidade de
DNA/cDNA que a amostra contiver, mais rapidamente a sua amplificação entra em fase
exponencial, maior o aumento da fluorescência emitida pelo Reporter e menor o CT da
amostra.
fluorescent signal
End point
not quantitative
quantiquantitative
) threshold of
detection
detection
PCR cycles (
Low C CT High CT
(high copy T no.) (low copy no.)
T
T
Figura 12 – Leitura do produto Tde PCR na fase exponencial (threshold of detection); quanto mais
cedo o produto entrar na fase exponencial, maior o número de cópias, maior a quantidade inicial de
material genético da amostra (imagem cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
A quantidade de DNA/cDNA na amostra a analisar é calculada com base numa

curva de calibração, construída a partir de padrões de concentração rigorosamente
conhecida, que correm na reacção de PCR em Tempo Real ao mesmo tempo e nas
mesmas condições que a amostra.

4.1.2. Restrição Enzimática
A ocorrência de uma mutação pontual pode originar a criação ou a abolição de

um local de restrição (local de corte do DNA por uma enzima de restrição) e essa
característica pode ser usada para diagnóstico da mutação.
O método consiste na amplificação por PCR Single da região do DNA a
analisar, utilizando-se para isso primers que flanqueiam a região de interesse. O produto
da amplificação é então digerido com a enzima de restrição e os diferentes fragmentos
resultantes da digestão (RFLPs) são separados por electroforese de acordo com o seu
tamanho. Por exemplo, se a mutação não estiver presente a enzima não corta e obtém-se
apenas um fragmento correspondente ao DNA amplificado não digerido; se a mutação
estiver presente a enzima corta e obtêm-se dois fragmentos. Para indivíduos
heterozigóticos obter-se-ão 3 fragmentos, um correspondente ao produto de PCR não
digerido (cromossoma/gene normal) e os outros dois correspondentes ao produto da
digestão enzimática (cromossoma/gene alterado).
4.1.3. Electroforese
4.1.3.1.Electroforese em Gel de Agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa

solução tampão e deixando polimerizar numa “forma” apropriada. Colocando
previamente um pente, obtém-se um gel contendo uma fileira de poços numa das
extremidades, onde posteriormente serão colocadas as amostras a analisar.
O gel é colocado num tanque de electroforese, imerso em tampão, ficando entre
dois eléctrodos posicionados paralelamente à fileira de poços do gel. Cada amostra é
colocada num poço do gel e, com a aplicação de um campo eléctrico, vão migrar para o
pólo positivo (ânodo), uma vez que os ácidos nucleicos têm carga negativa em pH
neutro.
A agarose funciona como uma peneira, deixando passar mais facilmente as
moléculas mais pequenas que, assim, vão migrar mais do que as moléculas maiores; a
migração é inversamente proporcional ao tamanho. A relação entre o peso molecular do
DNA e a distância percorrida no gel é aproximadamente linear, sendo possível estimar o

tamanho de fragmentos de DNA obtidos quando parando a sua migração em gel com a
migração de fragmentos cujo tamanho é conhecido (marcador de peso molecular, que se
faz correr como uma amostra).
As moléculas do mesmo tamanho migram conjuntamente e formam bandas que
podem depois ser visualizadas com o auxílio de luz ultravioleta num transiluminador.
Para tal, é necessário incluir no gel brometo de etídio, uma substância mutagénica que
se intercala nas cadeias de DNA e que, após exposição a raios UV, emite fluorescência
alaranjada.
Figura 13 – Electroforese em gel de agarose. Marcador de peso molecular à esquerda (imagem

cedida pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
4.1.3.2.Electroforese Capilar
 Sequenciação Automática
Trata-se de um método automático que permite determinar a sequência de

nucleótidos que compõem um fragmento de DNA.
O primeiro passo da reacção de PCR de Sequenciação (feita numa aparelho de
PCR normal, com recurso ao kit próprio para sequenciação) é a desnaturação da dupla
cadeia de DNA. Em seguida, um primer é emparelhado numa zona do DNA cuja
sequência é conhecida. Uma DNA Polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir
da zona de ligação do primer. Contudo, em vez de se adicionar ao meio reaccional
apenas dNTPs normais, adicionam-se também e em excesso derivados didesoxi dos

nucleótidos normais (ddNTPs) que, não possuindo o grupo OH na posição 3’ da

desoxirribose, impedem as ligações fosfodiestéricas do DNA e, assim, que a cadeia de
DNA continue a ser sintetizada.
Cada ddN está marcado com um fluorocromo de cor diferente; isto é, por
exemplo, os ddA estão marcados com um fluorocromo amarelo, os ddC com um
fluorocromo azul, os ddG com um verde e os ddT com um vermelho. Cada ddN está
presente numa proporção que permite que, de quando em quando, seja incorporado no
DNA em vês do dNTP normal correspondente e termine a síntese da cadeia de DNA.
Assim, vão ser sintetizadas uma série de cadeias de DNA com, sucessivamente um
nucleótido de diferença. A relação entre a quantidade de dNTPs e ddNTPs presentes no
meio reaccional é muito importante, sendo essencial que os ddNs estejam em excesso
em relação aos dNTPs para que se obtenham produtos de PCR mais curtos, com apenas
um nucleótido de diferença entre as diferentes cadeias formadas.
Fazendo também uma reacção de sequenciação com um primer que emparelha
com a outra cadeia de DNA, é possível ler a sequência de ambas as cadeias, o que é
sempre aconselhável para evitar erros resultantes de ligações inespecíficas. Assim, para
o PCR de Sequenciação prepara-se uma mix com o tampão, a DNA Polimerase, os
dNTPs, os ddNTPs e a água e essa mix é distribuída por dois tubos – um que leva o
primer foward e outro que leva o primer reverse.
Uma posterior reacção de electroforese irá separar as diferentes cadeias de DNA
formadas de acordo com o seu tamanho. A electroforese capilar apresenta sensibilidade
suficiente para separar cadeias de DNA que apenas diferem em peso 1 bp. As cadeias de
DNA formadas, com carga negativa devido aos grupos fosfato, irão passar através de
um capilar migrando do cátodo para o ânodo devido a uma diferença de potencial que é
gerada pelo aparelho. Os produtos mais leves serão os primeiros a serem transferidos,
conseguindo-se, assim, a separação pretendida. O capilar funciona aqui como o gel de
agarose – polímero que permite a separação.
Por outro lado, o aparelho emite um laser que é feito incidir sobre as cadeias de
DNA à medida que estas passam ao longo do capilar. O laser vai excitar o fluorocromo
a que está ligado o ddNTP terminal de cada cadeia, havendo uma emissão de
fluorescência cujo comprimento de onda (cor) depende do ddNTP em causa. Os sinais
de fluorescência emitidos são detectados, processados e interpretados pelo sistema
informático acoplado ao instrumento. A sequência é automaticamente lida e o resultado
final é um gráfico de “picos” (cromatograma) cada um correspondente a um nucleótido

do DNA sequenciado. Quanto mais altos e agudos forem os picos mais qualidade
apresentam.
Figura 14 – Esquema que representa o processo de Sequenciação Automática (imagem cedida

pelo Serviço de Genética, IPO Porto).
Contudo, quando o DNA que se pretende sequenciar provém de uma prévia

reacção de PCR, antes de se realizar a sequenciação, é necessário remover todos os
“resíduos” da reacção de PCR que iriam interferir com o processo de sequenciação,
como os primers utilizados (para evitar múltiplas sequenciações), os dNTPs (para
manter uma ideal relação dNTPs/ddNTPs), os sais (interferem com a acção da DNA
Polimerase) e produtos de PCR inespecíficos que eventualmente se tenham formado
(para evitar artefactos na sequenciação). Para purificar o produto de PCR inicialmente
feito basta utilizar uma coluna hidrofílica que irá agarrar as moléculas de DNA pela sua
carga negativa e deixar passar todos os “resíduos”; depois basta eluir as moléculas de
DNA. Só no fim desta purificação é que se realiza, então, o PCR de Sequenciação.
Por outro lado, depois de se realizar o PCR de Sequenciação e antes de se
realizar a electroforese capilar, também é necessário executar uma segunda purificação
a fim de se eliminarem os ddNTPs soltos (que iriam interferir com a leitura no aparelho
de sequenciação) e os sais (que iriam interferir com a injecção electrocinética do
aparelho).
 Análise de Fragmentos
O processo de separação é idêntico ao utilizado para a sequenciação automática.

Cada pico obtido no cromatograma também corresponde a um fragmento de DNA, seja

ele resultante de digestão enzimática ou o produto inteiro de PCR. Contudo, neste caso
os fluorocromos estão agarrados aos primers que se utilizam na reacção de PCR prévia.
No Anexo 1 encontram-se descritas as alterações genéticas associadas a

determinados processos neoplásicos hematológicos que são pesquisadas no Laboratório
de Genética Molecular do IPO Porto.
No Anexo 2 encontram-se descritos os estudos moleculares realizados no
Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.

Genética Molecular Humana – Citogenética
4.2. Citogenética
4.2.1. Citogenética Clássica
A Citogenética Clássica é a ciência que estuda o DNA da célula através da

observação individualizada dos cromossomas.
Durante a interfase do Ciclo Celular o material genético da célula está relaxado
e os cromossomas não se conseguem observar individualizados. É só durante a mitose
que o material genético se condensa e conseguem observar-se os cromossomas
individualizados. Das diferentes fases que constituem a mitose, é na metafase que os
cromossomas atingem o máximo de condensação e o centrómero e os dois cromatídeos
de cada um são perfeitamente visíveis ao microscópio óptico. Assim, é apenas neste
período que a análise por Citogenética Clássica detalhada pode ser efectuada, sendo
para isso necessário que as células entrem em divisão celular.
O posterior tratamento e coloração (obtenção de padrões de bandeamento,
definindo-se uma banda como uma parte do cromossoma que é claramente distinta dos
segmentos adjacentes por aparecer mais clara os mais escura) dos cromossomas,
permitem a construção do cariograma - desenho esquemático dos cromossomas
metafásicos da célula do indivíduo, agrupados aos pares e dispostos de acordo com o
seu tamanho, posição do centrómero e padrão de bandas - e a elaboração do cariótipo -
nomenclatura utilizada para descrever a constituição cromossómica, normal ou anormal,
constitucional ou adquirida, do indivíduo.
Tanto o cariograma como o cariótipo fornecem informação acerca do número de
cromossomas por célula, da composição dos cromossomas sexuais (XX para mulher e
XY para homem) e identificam anomalias cromossómicas numéricas ou estruturais,
constitucionais (congénitas) ou adquiridas (alteração neoplásica).
Figura 15 – Cariograma normal do sexo masculino (46,XY) (imagem cedida pelo Laboratório de
Citogenética do IPO Porto).

Figura 16 - Cariótipo com S. Down (47,XY,+21) à esquerda - anomalia numérica constitucional.

Cariótipo com cromossoma Ph - t(9;22)(q34;q11.2) à direita - anomalia estrutural adquirida (imagem
cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Figura 17 – Terminologia dos cromossomas e numeração de bandas (imagem cedida pelo

Laboratório de Citogenética do IPO Porto).

Os estudos citogenéticos clássicos envolvem a análise dos cromossomas

encontrados no sangue periférico (cariótipos constitucionais), na medula óssea
(leucemias), em gânglios linfáticos (linfomas), em biopsias de tumor (tumores sólidos)
ou em líquido amniótico (suspeita de invasão o LCR por células neoplásicas). A
colheita é feita em heparina de lítio.
4.2.2. FISH (Fluorescente in situ Hibridization)
A Citogenética Clássica permite visualizar todo o cariótipo de um indivíduo,

detectando quer as alterações genéticas de que o clínico à partida desconfia, quer outras
imprevistas. Contudo, esta técnica não consegue, por si só, identificar todo o tipo de
alterações genéticas até hoje já descritas. As alterações não visualizadas por esta técnica
designam-se por alterações “crípticas” para Citogenética Clássica. Para estas só uma
técnica de Citogenética mais sensível, como o FISH, as consegue detectar.
O FISH (Fluorescente in situ Hibridization – Hibridação Fluorescente in
situ) pode definir-se como a localização morfológica de sequências genéticas, com
recurso a técnicas de fluorescência.
O seu objectivo consiste na determinação da presença ou ausência de fragmentos
específicos de DNA ou RNA e na localização desses fragmentos particulares no
material genético. A identificação de sequências específicas de genes ao longo do
material genético consegue-se explorando as propriedades fundamentais do material
genético, isto é, a sua capacidade de emparelhar de uma maneira específica formando
híbridos entre uma cadeia natural e uma cadeia artificial de ácidos nucleicos, em que a
cadeia artificial constitui a chamada sonda.
Assim, os requisitos básicos para a realização da técnica são a utilização de uma
sonda complementar para a sequência de material genético de interesse e o uso de um
fluorocromo ligado a essa sonda, a fim de que se permita a sua detecção.
Para que a técnica se realize é necessário, antes de mais, ligar o DNA alvo à
superfície de uma lâmina de vidro a fim de manter a estrutura morfológica do material
genético. Segue-se a desnaturação do DNA, por forma a que uma cadeia simples do
DNA alvo e a cadeia simples da sonda complementar à sequência de genes de DNA que
se pretende pesquisar hibridizem (“annealing” da sonda). Segue-se a lavagem do
excesso de sonda, não ligada ao material genético, podendo-se, por fim, detectar o sinal

de fluorescência (emitida pelo fluorocromo ligado à sonda) num microscópio de

fluorescência.
O FISH pode ser utilizado para analisar uma grande variedade de material
biológico, como sangue, medula óssea, gânglios linfáticos, biopsias e até a partir de uma
lâmina de esfregaço de sangue periférico ou medula óssea. Não necessita que o material
genético esteja em metafase, podendo interfases ser analisadas.
Segue-se uma breve explicação de cada um dos tipos de sonda existentes.
Sondas de “Painting” (WCP)

Trata-se de muitas sondas específicas que se unem ao longo de um cromossoma,
parecendo pintar todo o cromossoma.
Figura 18 – FISH, Sondas de Painting para os cromossomas 19, a verde, permitindo confirmar a
presença de material deste cromossoma num cromossoma marcador (imagem cedida pelo Laboratório de
Sondas Alfa-Satélite
O DNA alfa-satélite é composto por elementos de sequência repetitiva,
localizado junto aos centrómeros. Na maioria das vezes, trata-se de sequências
repetitivas específicas de cada cromossoma.
As sondas alfa-satélite vão-se ligar a estes locais, perto dos centrómeros.
Consoante a sua sequência, vão-se ligar especificamente a um determinado
cromossoma. São utilizadas para determinar a ploidia.

Figura 19 – FISH, Sondas Alfa-Satélite para os cromossomas 4, 6, 17, 10, 18 e 21; observa-se
trissomia dos cromossomas 4, 6, 17, 18 e 21 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO
Porto).
Sondas de Sequência Única

São sondas que se ligam a sequências específicas dos cromossomas, sendo úteis
no estudo de micro-delecções.
D5S721/D5S722
EGR1
Figura 20 – FISH, Sondas de Sequência Única. Uma sonda verde ligada a 5p15.2 (região génica
D5S721 e D5S722) e outra vermelha ligada a 5q31 (região génica EGR1) do cromossoma 5. No exemplo
dado existe delecção do braço longo (q) de um cromossoma 5 - SMD com del(5q) - de onde resulta a
ausência de um sinal vermelho para 5q31 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO
Porto).

Dual Color, Single Fusion

Neste caso os alvos das sondas utilizadas flanqueiam os pontos de quebra de
uma translocação. São úteis na detecção de translocações específicas quando elevadas
percentagens de células apresentam essa translocação.
Figura 21 – FISH, Sondas Dual Color, Sigle Fusion. Uma sonda flanqueia a região 9q34 do
cromossoma 9 (sinal a vermelho) e outra flanqueia a região 22q11.2 do cromossoma 22 (sinal a verde).
Sempre que existe LMC com t(9;22)(q34;q11.2) com genes de fusão BCR-ABL, em 22q11.2 e em 9q34
respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a sonda verde, originando um sinal de fusão amarelo.
“Dual color” (vermelho e verde) corresponde aos cromossomas 9 e 22 não translocados; cor “single”
(amarelo, junto com o sinal vermelho e verde) corresponde a “fusion” dos outros dois cromossomas 9 e
22 (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
ES (Extra Signal)
Com recurso às sondas dual color, single fusion muitas vezes obtêm-se falsos
resultados positivos porque pode acontecer que haja sobreposição casual do sinal
vermelho e verde, originando um sinal amarelo, se os cromossomas estiverem
sobrepostos sem que, no entanto, exista translocação.
Para que se reduza a frequência de falsos positivos devido a co-localização
acidental dos sinais, recorre-se a sondas extra signal; isto é, utiliza-se uma sonda
idêntica à utilizada nas sondas dual color, single fusion (que flanqueia o ponto de
quebra de um gene) e outra sonda grande que, em vez de flanquear o ponto de quebra do
outro gene, cobre / ultrapassa o ponto de quebra. Assim, sempre que ocorrer

translocação, para além do sinal de fusão terá de se observar também um sinal extra que
corresponde ao bocado da sonda grande que partiu como resultado da translocação.
TEL
AML1
Figura 22 – FISH, Sondas Extra Signal. Uma sonda flanqueia a região 12p13 do cromossoma 12
(sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra 21q22 do cromossoma 21 (sinal vermelho). Sempre que
existe LMA com t(12;21)(p13;q22), com genes de fusão TEL-AML1 nas regiões 12p13 e 21q22
respectivamente, a sonda vermelha funde-se com a verde dando origem a um sinal de fusão amarelo no
cromossoma translocado e a um sinal extra vermelho que resulta da quebra da sonda que cobre a região
21q22. Serão ainda visíveis outro sinal verde e vermelho que correspondem aos cromossomas 12 e 21 não
translocados, respectivamente. Na imagem não se consegue visualizar o sinal verde individualizado do
cromossoma 12 não translocado (imagem cedida pelo Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Dual Color, Dual Fusion

Trata-se de duas sondas grandes que cobrem os dois pontos de quebra
envolvidos numa translocação em particular. São sondas com elevada especificidade,
reduzindo muito falsos resultados positivos, tal como as sondas extra sinal. Para além
disso, apresentam elevada sensibilidade, uma vez que detectam percentagens baixas de
núcleos com translocação envolvida.

Figura 23 – FISH, Sondas Dual Color Dual Fusion. Uma sonda cobre o ponto de quebra na
região 14q32 do cromossoma 14 (sinal a verde) e outra cobre o ponto de quebra na região 18q21 do
cromossoma 18 (sinal a vermelho). Sempre que existe LNH Folicular com t(14;18)(q32;q21), com genes
de fusão IgH-Bcl2 nas regiões 14q32 e 18q21 respectivamente, metade da sonda verde funde-se com a
sonda vermelha e a outra metade da sonda verde funde-se com a outra metade da sonda vermelha,
originando dois sinais de fusão. O outro cromossoma 14 não translocado dará origem a um sinal verde,
enquanto que o outro cromossoma 18 não translocado originará um sinal vermelho (imagem cedida pelo
Laboratório de Citogenética do IPO Porto).
Dual Color, Break Apart

Este tipo de sonda é útil nos casos em que há vários parceiros possíveis
associados com um ponto de quebra conhecido. É o caso do gene MLL em 11q23 que
pode fundir-se com inúmeros parceiros. Utilizam-se duas sondas de cores diferentes que
flanqueiam o ponto de quebra conhecido, havendo sobreposição do sinal entre elas.
Figura 24 – FISH, Sonda Dual Color, Break Apart para o gene MLL em 11q23, com ligeira
sobreposição das cores verde e vermelha da sonda. O cromossoma 11 não translocado apresenta um sinal

de fusão amarelo. O cromossoma 11 translocado origina a quebra do gene MLL e, assim, das duas
sondas, levando à separação da sonda, com consequente observação de um sinal verde e outro vermelho
separados. Não se sabe com que gene o MLL está translocado (imagem cedida pelo Laboratório de
4.2.3. Alterações Citogenéticas Frequentes em Neoplasias
Nas últimas décadas numerosas alterações cromossómicas específicas foram

detectadas em neoplasias. Hoje sabe-se que certas alterações citogenéticas estão na
própria origem do próprio processo tumoral. A análise citogenética nas alterações
neoplásicas revela-se importante para o diagnóstico, prognóstico, orientação e
monitorização terapêutica, identificação precoce de recaída e evidência de progressão
tumoral.
Em seguida descrevem-se as alterações citogenéticas mais características de
neoplasias em particular, detectadas por técnicas de citogenética.
Leucemia Mielóide Crónica (LMC)

Translocação entre a banda q34 do cromossoma 9 e a sub-banda q11.2 do
cromossoma 22, envolvendo a fusão dos genes BCR do cromossoma 22 e ABL1 do
cromossoma 9. A presença desta translocação confere bom prognóstico na LMC. A
translocação é identificável por Citogenética Clássica e por FISH com recurso a uma
sonda dual color, single fusion.
LMA com t(8;21)(q22;q22); ETO-AML1

Translocação que envolve a fusão dos genes ETO do cromossoma 8 e AML1 do
cromossoma 21. Encontra-se em cerca de 5% das LMAs e em cerca de 10% das LMA-
M2 da antiga classificação FAB e tem bom prognóstico nas LMAs.É observada por
Citogenética Clássica.
LMA com inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11

Inversão que envolve a fusão dos genes CBFB e MYH11 ambos no cromossoma
16. Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M4eos da
antiga classificação FAB. Confere bom prognóstico. É necessário que as metafases
estejam muito boas (cromossomas bem separados) para que esta alteração seja visível

por citogenética clássica, sendo por isso sempre necessária a avaliação por FISH no
diagnóstico.
Leucemia Promielocítica Aguda com t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

Translocação com fusão dos genes PML em 15q22 e RARA em 17q12.
Encontra-se em 5 a 8% de todas as LMAs e corresponde à antiga LMA-M3 (clássica e
variante hipogranular) da antiga classificação FAB. Actualmente todas as antigas LMA-
M3 estão associadas a esta alteração citogenética. Confere bom prognóstico. Alguns
casos são crípticos por citogenética clássica. Nos casos em que há suspeita da
translocação mas ela não é detectada por citogenética clássica a pesquisa é feita por
FISH.
LMA com t(9;11)(p22;q23); AF9-MLL

Translocação com fusão dos genes AF9 em 9p22 e MLL em 11q23. Está
presente em 9-12% das LMAs de crianças e 2% das LMAs de adultos. Está, sobretudo,
relacionada com as antigas LMA-M4 e LMA-M5 da classificação FAB, mas também
por vezes associada às antigas LMA-M1 e LMA-M2. Confere prognóstico intermédio.
O gene MLL pode fundir-se com inúmeros parceiros. As translocações que
envolvem o MLL mais frequentes dão-se com o gene AF9 já descrito (resultando
predominantemente em LMA) e com o gene AF4 (resultando sobretudo em LLA),
embora existam muitas outras. Um terço das translocações que envolvem o gene MLL
não são detectadas por Citogenética Clássica, tendo que ser identificadas por FISH.
Assim, sempre que se suspeita de uma LMA e a Citogenética Clássica não identifica
nenhuma alteração característica, recorre-se ao FISH, utilizando-se para isso uma sonda
dual color, break apart que flanqueia a região 11q23, onde se encontra o gene MLL.
LLA/Linfoma com t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1

Esta translocação é semelhante à que ocorre na LMC, não sendo as duas
situações distintas por citogenética clássica. Só a análise por RT-PCR confere a sua
distinção, por síntese de diferentes transcriptos. Neste caso, a presença da translocação
confere mau prognóstico.

LLA/Linfoma com t(v;11q23); rearranjos do MLL

Tal como já referido, é possível que o gene MLL localizado em 11q23 se
recombine com inúmeros. A fusão que mais frequentemente conduz ao
desenvolvimento de uma LLA dá-se entre o gene MLL e o gene AF4 em 4q21,
originando a t(4;11)(q21;q23). Confere mau prognóstico. Sempre que se suspeita desta
alteração, faz-se por FISH uma sonda dual color, break apart para o gene MLL em
11q23.
LLA/Linfoma com t(12;21)(p13;q22); TEL-AML1

Esta alteração é críptica por Citogenética Clássica, sendo necessário recorrer a
FISH para detectá-la, com uma sonda extra signal para esta translocação. Com esta
sonda é também possível observar a ploidia do cromossoma 21; assim, caso se verifique
hiperploidia deste cromossoma, realiza-se o painel hiperdiplóide para LLA’s
recorrendo a sondas alfa satélite para os cromossomas 4, 6, 10, 17, 18 e 21. É frequente
este tipo de translocação estar associado a triploidias dos cromossomas referidos.
LLA/Linfoma com t(1;19)(q23;p13.3); E2A-PBX1

Translocação que envolve os genes de fusão E2A em 1q23 e PBX1 em 19p13.3,
constituindo 6% dos casos de LLA-B em crianças. Associada a prognóstico
intermédio. Observável por Citogenética Clássica, não sendo pesquisada por FISH.
Leucemia Linfocítica Crónica B (LLC-B)

As alterações citogenéticas mais características são trissomia 12, del(11q22-
23), del(17p13), del(6q21) e del(13)(q14.3). Todas estas alterações são visíveis por
Citogenética Clássica, excepto a del(13)(q14.3). Contudo, sempre que se suspeita de
LLC faz-se o seguinte painel por FISH: trissomia 12, del(11)(q23), del(17)(p13) e
del(13)(q14.3). Para avaliar a trissomia 12 recorre-se a uma sonda alfa satélite. Para
avaliar a del(11)(q23), a del(17)(p13) e a del(13)(q14.3) utilizam-se sondas de
sequência única dirigidas a essas regiões.

Mieloma Múltiplo (MM)

A alteração mais frequentemente detectada envolve uma translocação em 14q32
(gene IgH) conferindo mau prognóstico – t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16.3;q32),
t(14;16)(q32;q23), t(6;14)(p21;q32) e t(14;20)(q32;q11).
Os MM que apresentam uma destas translocações geralmente são não
hiperdiplóides, estando associados a pior prognóstico. Os restantes geralmente são
hiperdiplóides, com ganhos frequentes nos cromossomas 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 ou 21, e
sobrevidas mais longas. Monossomia do cromossoma 13 é detectada em muitos casos,
conferindo mau prognóstico, bem como del(13)(q14) e a del(17)(p13), esta última
associada a progressão da doença.
A t(4;14)(p16.3;q32), a del(13)(q14) e a del(17)(p13) são crípticas por
Citogenética Clássica; a t(14;16)(q32;q23) é muito difícil de visualizar por esta técnica.
Assim, sempre que se desconfia desta patologia faz-se o seguinte painel por FISH:
del(13)(q14) e del(17)(p13) com sondas de sequência única para estas regiões. Recorre-
se também a uma sonda dual color, break apart para a região 14q32 e no caso desta
última dar como resultado a existência de uma translocação envolvendo o cromossoma
14, pesquisam-se as translocações t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16.3;q32) e
t(14;16)(q32;q23) por sondas dual color, dual fusion. Para além disso, sempre que a
Citogenética Clássica revela um cariótipo hiperdiplóide, utiliza-se um kit para a
pesquisa de hiperploidia nos cromossomas 5, 9 e 15.
Linfoma Folicular
Este linfoma caracteriza-se por rearranjos no gene Bcl2 em 18q21, sobretudo
pela t(14;18)(q32;q21) (gene IgH), observável por Citogenética Clássica. Contudo,
sempre que há suspeita de um LNH Folicular, utiliza-se também por FISH uma sonda
dual color, dual fusion para a t(14;18)(q32;q21).
Linfoma do Manto
A alteração citogenética mais característica é a t(11;14)(q13;q32), estando
presente na maioria dos casos e sendo considerada a anomalia primária. Contudo, esta
alteração não é patognomónica da patologia, podendo aparecer noutras alterações
neoplásicas. Esta alteração é observável por Citogenética Clássica. No entanto, sempre
que há suspeita de um LNH do Manto, utiliza-se também por FISH uma sonda dual
color dual fusion para esta translocação.

Linfoma Difuso de Grandes Células B

Cerca de 30% dos casos apresentam anomalias em 3q27, envolvendo o gene
Bcl6, como a t(3;14)(q27;q32) (gene IgH em 14q32). Translocações envolvendo o gene
Bcl2 em 18q21, como a t(14;18)(q32;q21) característica também de linfoma folicular,
estão presentes em 20 a 30% dos casos. Estas duas translocações são observáveis por
Citogenética Clássica. Contudo, sempre que há suspeita deste LNH pesquisam-se
alterações envolvendo o gene Bcl6 em 3q27 com recurso a uma sonda dual color, break
apart, e pesquisa-se a t(14;18)(q32;q21) com recurso a uma sonda dual color, dual
fusion por FISH.
Linfoma de Burkitt
A maioria dos casos apresenta rearranjos do gene MYC em 8q24, originando a
t(8;14)(q24;q32) (gene IgH em 14q32) ou, mais raramente, a t(8;22)(q24;q11) (gene
IgL κ) ou a t(2;8)(p12;q24) (gene IgL loci), todas elas visíveis por Citogenética
Clássica. Sempre que se suspeita deste tipo de linfoma faz-se também por FISH a
pesquisa de alterações envolvendo o gene MYC em 8q24, utilizando-se uma sonda dual
color, break apart.

5. Bioquímica Clínica e Endocrinologia
Os estágios decorreram no Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão

Pinto, SA, em Lisboa, na secção de Bioquímica Clínica, durante os meses de Julho e
Agosto, sob a orientação da Drª Margarida Baptista. Os estágios perfizeram um total de
344 horas (264 horas de Bioquímica Clínica e 80 horas de Endocrinologia).
No Laboratório Reymão Pinto a secção de Bioquímica Clínica compreende as

áreas de Bioquímica, Endocrinologia, Serologia, Imunologia e Alergologia. O
laboratório recebe, em média, 500 amostras por dia.
Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,

tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Bioquímica
Clínica I e II, Fisiopatologia, Imunologia, Virologia e Métodos Instrumentais de Análise
do Mestrado de Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de
2008 a trabalhar nesta secção do Laboratório.
A estagiária percorreu todas as fases do processo laboratorial - pré-analítica,

analítica e pós-analítica -, debruçou-se sobre os fundamentos de funcionamento e a
manutenção de todos os equipamentos, sobre os métodos bioquímicos que apoiam as
determinações analíticas e sobre a validação dos diferentes parâmetros analíticos.
Participou, ainda, nos programas de controlo de qualidade interno e externo.
5.1. Equipamentos, Fundamentos e Parâmetros Doseados
5.1.1. Modular Hitachi SWA, Roche
Analisador especificamente adaptado para a quantificação de parâmetros

imunológicos (Módulos E) e bioquímicos (Módulos P e ISE) e. Aplica métodos de
medição por Potenciometria, Espectrofotometria, Imunoturbidimetria e
Quimioluminescência.

Bioquímica Clínica e Endocrinologia
 Módulos E:
Parâmetro Método Amostra
Ac Anti-HAV Totais Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ac Anti-HAV IgM Electroquimioluminescência (Captura) Soro/Plasma
Ac Anti-HBe Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ac Anti-HBc Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ac Anti-HBs Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Ac Anti-HCV Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Ac Anti-Tiroglobulina (Anti-Tg) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ac Anti-Peroxidase (Anti-TPO) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ag HBe Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
AgHBs Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
CA 19-9 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
CA 125 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
CA 15-3 Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
CEA Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Estradiol (E2) Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Ferritina Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Folato Electroquimioluminescência (Competição) Soro
FSH Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
FT3 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
FT4 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
LH Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Prolactina (PRL) Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
Progesterona Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
PSA Livre Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
PSA Total Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
T3 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
T4 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma
Tiroglobulina (Tg) Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
TSH
Electroquimioluminescência (Sandwich) Soro/Plasma
(hormona estimuladora da tiróide)
Vitamina B12 Electroquimioluminescência (Competição) Soro/Plasma

 Módulos P:
Parâmetros Método Amostra
Ácido Úrico Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma/Urina
Albumina Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma
Aldolase Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma
Amilase Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma
Aminotransferase Alanina (ALT) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma
Aminotransferase Aspartato (AST) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma
Ac. Anti-estreptolisina O (ASLO) Imunoturbidimetria Soro/Plasma
Bilirrubina Directa Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma
Bilirrubina Total Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma
Cálcio Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep/Urina
Colesterol HDL Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma Hep.
Colesterol LDL Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma Hep.
Colesterol Total Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma
Creatina Cinase (CK) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma
Creatinina Espectrofotometria (M. Cinético) Soro/Plasma/Urina
Desidrogenase Láctica (LDH) Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma
Factor Reumatóide Imunoturbidimetria Soro/Plasma
Ferro Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep
Fosfatase Alcalina (ALP) Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma Hep.
Fósforo Espectrofotometria (UV) Soro/Plasma/Urina
Frutosamina Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma
Gama Glutamil Tranferase (GGT) Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma
Glucose Espectrofotometria (M. Enzimático UV) Soro/Plasma /Urina/LCR
IgA Imunoturbidimetria Soro/Plasma
IgG Imunoturbidimetria Soro/Plasma
IgM Imunoturbidimetria Soro/Plasma
Magnésio Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma /Urina
Microalbuminúria (MAU) Imunoturbidimetria Urina
Proteína C Reactiva (PCR) Imunoturbidimetria Soro/Plasma
Proteínas Totais Espectrofotometria (M. Colorimétrico) Soro/Plasma
Proteínas Totais na urina e LCR Imunoturbidimetria Urina/LCR
Transferrina Imunoturbidimetria Soro/Plasma Hep.
Treponema Pallidum (TPLA) Imunoturbidimetria Soro
Trigliceridos (TG) Espectrofotometria (M. Enzimático) Soro/Plasma
Ureia Espectrofotometria (M. Cinético UV) Soro/Plasma /Urina

 Módulo ISE:
Parâmetros Método Amostra
Ionograma (Sódio, Potássio e Cloro) Pontenciometria Indirecta com Eléctrodos Selectivos Soro
Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche
5.1.2. Cobas Integra 400 Plus, Roche
Sistema que permite consolidar todos os testes de bioquímica clínica – enzimas,

substractos, iões, drogas de abuso e terapêuticas e proteínas específicas – com rapidez e
facilidade. Integra quatro métodos diferentes: absorvância fotométrica para enzimas e
substractos; imunoturbidimetria para proteínas específicas; fluorescência polarizada
para drogas terapêuticas; potenciometria, com eléctrodo selectivo para iões.
Ácido Valpróico Fluorescência Polarizada Soro
Alfa1-Antitripsina Espectrofotometria Soro
Apoliporoteína A Imunoturbidimetria Soro
Apoliporoteína B Imunoturbidimetria Soro
C3 Imunoturbidimetria Soro
C4 Imunoturbidimetria Soro
Carbamazepina Fluorescência Polarizada Soro
Digoxina Fluorescência Polarizada Soro
Enzima Conversão Angiotensina (ECA) Espectrofotometria Soro
Fenitoína Fluorescência Polarizada Soro
Hemoglobina A1C Imunoturbidimetria Sangue Total EDTA
Lipase Espectofotometria Soro
Lítio Potenciometria Soro
Tabela 2 – Parâmetros e Métodos Analíticos Cobas Integra 400 Plus, Roche
5.1.3. Hydrasys Sebia, Phadia
Permite processar de um modo semi-automático análises electroforéticas de

proteínas humanas no soro e urina.

Técnica Método Amostra
Electroforese de zona em gel de agarose 8 g/L,

Electroforese das Proteínas Soro
com tampão tris-barbital pH 9.2
Tabela 3 - Parâmetros e Métodos Analíticos Hydrasys Sebia, Phadia
5.1.4. Urisys 2004, Roche
É um fotómetro de reflectância totalmente automatizado, para medições semi-

quantitativas in vitro de tiras teste de urina.
Densidade Específica Refracção Fotométrica
Turvação Transmitância Fotométrica
Cor
pH
Nitritos
Proteínas
Urina
Tiras
Glicose
Reflectância Fotométrica
Cetonas
Urobilinogénios
Bilirrubinas
Leucócitos
Eritrócitos
Tabela 4 - Parâmetros e Métodos Analíticos Urisys 2004, Roche
5.1.5. Immulite 2000, Amerlab
Equipamento que efectua imunoensaios por quimioluminescência,

automatizando todo o procedimento.

Amostra
Parâmetro Método
ACTH Plasma EDTA
Fetoproteína (AF) Soro/Liquido Amniótico
Calcitonina Soro/Plasma Hep.
Cortisol Soro
Creatina Quinase-MB (CK-MB) Soro/Plasma Hep.
Delta–4–Androstenediona Soro
Estriol Livre Soro
Fosfatase Ácida Prostática (PAP) Soro
Globulina de transporte das hormonas sexuais (SHBG) Soro
Gonadotropina Coriónica Humana (β – HCG) Soro/Urina

Fotoquimioluminescência
Gonadotrofina Coriónica Humana Livre (Sandwich)
Soro
(β – HCG livre)
Homocisteina Plasma/Soro
Insulina Soro/Plasma Hep.
Péptido C Soro/Plasma Hep.
Proteína A do plasma associada à gravidez (PAPP–A) Soro
PTH Plasma EDTA /Soro
Somatomedina (IGF-1, Factor de Crescimento I da Insulina) Soro/Plasma Hep.
Somatotrofina (hGH, Hormona do Crescimento Humano) Soro
Sulfato de De-hidroepiandrosterona (DHEA-SO4) Soro
Testosterona Total Soro
(Testosterona Total/SHBG)
Testosterona Livre Soro
x100
Tabela 5 - Parâmetros e Métodos Analíticos Immulite 2000, Amerlab
5.1.6. Vidas, bioMérieux
É um sistema multiparamétrico de imunoensaio cujo princípio de doseamento

associa o método imunoenzimático sandwich em duas etapas com uma detecção final
em fluorescência (ELFA- Enzyme Linked Fluorescent Assay).

 Testes de Diagnóstico:
β2–Microglobulina
Citomegalovirus IgG
Citomegalovirus IgM
Citomegalovirus IgG Avidez

Helicobacter pylori IgG (Sandwich) Soro/Plasma
HIV Duo (I e II) ELFA
Mioglobina
NT-ProBNP
Toxoplasmose IgG Avidez
Troponina I
 Testes Confirmatórios:
Ac Anti-HBc
Ag HBs
Rubéola IgG
(Sandwich) Soro/Plasma
Rubéola IgM
ELFA
Toxoplasmose IgG
Toxoplasmose IgM
Tabela 6 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidas, bioMérieux
5.1.7. Vidia, bioMérieux
Equipamento de imunoensaio que utiliza a tecnologia de

fotoquimioluminescência, recorrendo a diferentes métodos, todos baseados na
tecnologia ELISA. Para os parâmetros realizados no laboratório Reymão Pinto utiliza o
método da ELISA Indirecta na detecção de IgG’s e o método de Imuno-Captura na
detecção de IgM’s.
Rubéola IgG Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto) Soro/Plasma
Rubéola IgM Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura) Soro/Plasma
Toxoplasmose IgG Fotoquimioluminescência (ELISA Indirecto) Soro
Toxoplasmose IgM Fotoquimioluminescência (Imuno-Captura) Soro
Tabela 7 - Parâmetros e Métodos Analíticos Vidia, bioMérieux

5.1.8. Serologia Manual
Parâmetro Agente/Patologia Método Amostra
Reacção de Wuddleson / Reacção de

Brucella abortus
Wright, BioSystems
Aglutinação Soro
Reacção de Rosa de Bengala, Weybridge Brucella abortus
Células LE / LE Teste, Omega Diagnostics Lúpus Eritematosos Sistémico (LES)
Soro/ Plasma/
MonoTeste / Paul Bunnell, Innovacon Mononucleosa Infecciosa Cromatografia
Sangue total
Reacção de Weil Félix, BioSystems Proteus
Salmonella typhi e Salmonella Soro

Reacção de Widal, BioSystems
paratyphi Aglutinação
RPR / VDRL / Reacção de Wassermann,

Treponema pallidum Soro/Plasma
Bio Rad
Tabela 8 – Parâmetros Analíticos de Serologia Manual
Todas as reacções serológicas, à excepção do teste para diagnóstico da

mononucleose infecciosa, têm como princípio reacções de aglutinação entre o antigénio
do reagente e os anticorpos da amostra.
5.2. Métodos Analíticos
5.2.1. Potenciometria
Potenciometria é a medida da diferença de potencial eléctrico entre dois

eléctrodos, numa célula electroquímica. Baseia-se na medição do potencial de um
eléctrodo indicador (eléctrodo constituído pelo elemento que se deseja determinar) em
relação a um eléctrodo de referência (eléctrodo para o qual o potencial eléctrico é, por
definição, igual a zero), quando não passa corrente através da solução em que estão
mergulhados. Este potencial depende das actividades das espécies que entram nas
reacções redox correspondentes, através da equação de Nernst.

5.2.2. Fotometria
A fotometria é um método de medição que consiste na determinação da

intensidade da luz absorvida pela amostra a um determinado comprimento de onda da
radiação incidente.
A absorvância varia linearmente com a concentração da amostra. A
determinação da concentração da amostra é feita por extrapolação gráfica, a partir da
absorvância lida pelo aparelho, com base na Lei de Lambert Beer.
Abs= K.[ ]. l
sendo, Abs, a absorvância calculada pelo aparelho
K, a constante de absortividade molar (valor tabelado)
l, a espessura do percurso óptico
[ ], a concentração que se pretende calcular
O Método Colorimétrico é o método que quantifica a intensidade da cor
formada por um composto. Trabalha-se, para isso na zona do visível, entre os 400 e os
800 nm.
Os métodos de determinação que envolvem enzimas incluem a determinação da
actividade enzimática a um tempo fixo (Método Enzimático) e a monitorização
contínua da actividade enzimático (Método Cinético). O Método Enzimático mede a
actividade de uma enzima baseado apenas nos pontos inicial e final da reacção. O
Método Cinético monitoriza a velocidade de aparecimento ou de desaparecimento de
um determinado composto, sendo mais preciso e sensível que o Método Enzimático.
5.2.3. Electroforese
Refere-se à migração de solutos ou partículas com carga, num meio líquido, sob
a influência de um campo eléctrico (mobilidade electroforética). Na electroforese de
zona a migração faz-se sobre um suporte sólido poroso, que poderá ser um gel de
agarose. As moléculas que possuam uma carga eléctrica em virtude da ionização
movem-se para o cátodo ou para o ânodo no sistema de electroforese, dependendo do
tipo de carga que apresentem; a migração dar-se-á para o pólo de sinal contrário à sua
carga. O tampão tem não só a função de conferir carga às partículas, como também a de
conduzir a corrente eléctrica. A mobilidade electroforética é inversamente proporcional

ao tamanho da molécula. O electroretrograma gerado é identificado por corantes

específicos e susceptível de ser quantificado.
5.2.4. Imunoturbidimetria
A turvação causa diminuição da intensidade de um feixe de luz quando este

passa através de uma solução de partículas. A turbidimetria é uma medida da
diminuição da intensidade da luz incidente causada pela dispersão, reflecção e absorção
do feixe de luz incidente de uma dada intensidade. A turvação é medida a 180º em
relação ao feixe incidente, o que significa que o detector está na mesma direcção que o
feixe de luz incidente (diferença em relação à nefelometria).
A Imunoturbidimetria é um método de medição da taxa de formação de
imunocomplexos Ag/Ac in vitro, com misturas mais concentradas de reagentes, de
forma a que os imunocomplexos tornem a solução suficientemente turva. Utiliza-se uma
quantidade constante e em excesso de anti-soro específico e, ao se adicionar a amostra
com Ag, vai-se medindo a formação progressiva de imuncomplexos numa célula
fotoeléctrica, na forma de densidade óptica.
5.2.5. Aglutinação
Os ensaios de aglutinação que pesquisam a presença de Ac dependem da

disponibilidade de uma partícula recoberta com o Ag apropriado (reagente). A partícula
pode consistir num eritrócito, exibindo os seus Ag naturais, ou numa partícula sintética
(por exemplo, uma partícula de látex) que é artificialmente recoberta com Ag. Na
presença do Ac específico no soro do doente, as partículas sofrem agregação. A
formação de agregados pode ser visualizada numa simples lâmina de vidro.
O processo pode ser invertido e utilizado para a detecção de Ag. Neste caso, a
partícula é coberta com Ac específicos.
5.2.6. Fluorescência Polarizada
O fenómeno de fluorescência corresponde à emissão de radiação sob a forma de

luz de um dado composto. Pressupõe, portanto, a prévia absorsão de radiação. Assim,

ao ser excitado, o composto fluorescente absorve radiação de uma determinada energia

e a um determinado c.d.o; ao passar ao estado fundamental liberta energia sob a forma
de radiação/luz/cor (fluorescência), sendo essa libertação menos energética que a
absorção de radiação prévia e, portanto, a radiação será emitida a um c.d.o. superior ao
c.d.o. da absorção.
Na fluorescência polarizada mede-se a mudança na despolarização de
fluorescência após reacções imunológicas. Se o relaxamento de um composto for mais
lento que o seu tempo de declínio de fluorescência (como é o caso de moléculas grandes
marcadas com fluoróforos), a fluorescência emitida será polarizada. As pequenas
moléculas têm tempos de relaxamento mais curtos que os seus tempos de declínio de
fluorescência. Como tal, a fluorescência emitida é despolarizada. Contudo, se essa
molécula for ligada a uma grande molécula ou se for colocada numa solução viscosa,
emitirá luz polarizada.
5.2.7. ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay)
Trata-se de ensaios imunoenzimáticos que funcionam por fixação de Ag ou Ac a

uma superfície sólida, como, por exemplo, um orifício de uma placa de microtitulação
ou uma partícula de plástico (esfera, cone, etc). A amostra é aplicada e os Ac ou os Ag
em pesquisa, vão-se ligar especificamente aos Ag ou Ac da superfície sólida,
respectivamente, durante um período de incubação. Segue-se uma lavagem da superfície
sólida para que o material não ligado seja retido do meio reaccional. O material ligado é
depois detectado por um segundo Ac marcado com uma enzima. O conjugado que não
estiver ligado é removido com uma segunda lavagem. A revelação final é feita por
acção posterior da enzima sobre um substrato, em que o produto da reacção origina cor
ou quimioluminescência. Os resultados são interpretados após leitura utilizando um
espectrofotómetro de absorvância (quando o produto da reacção é corado) ou de
emissão (quando o produto da reacção emite radiação/fluorescência). A
absorvância/fluorescência será proporcional à quantidade de Ag ou de Ac específico
presente na amostra testada.
Os testes de ELISA possuem muitas variações. Descrevem-se seguidamente as
mais utilizadas e aplicadas no laboratório Reymão Pinto.

5.2.7.1.ELISA para a detecção de Ag
ELISA Sandwich
Trata-se da versão mais comum de ELISA. Um Ac monoclonal é fixado à

superfície sólida. Adiciona-se posteriormente a amostra com os Ag em pesquisa,
incuba-se e lava-se. Junta-se depois ao meio reaccional um Ac secundário específico
para o Ag em pesquisa (que pode ser o mesmo que o Ac ligado à superfície sólida)
conjugado com a enzima. Finalmente, após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o
substrato sobre o qual a enzima ligada vai actuar, originando um produto corado ou
quimioluminescente.
ELISA de Competição
A amostra é incubada inicialmente com uma solução que contém Ac específicos

para o Ag em pesquisa. Seguidamente esta mistura é incubada com a superfície sólida
revestida com Ac. Os Ag da amostra que previamente se tiverem ligado ao Ac da
solução já não se irão ligar aos Ac da superfície sólida. Segue-se uma lavagem que irá
remover os complexos Ag/Ac em solução, não removendo, no entanto, os complexos
formados na superfície sólida. Um Ac secundário marcado enzimaticamente é depois
adicionado, indo ligar-se aos Ag da amostra fixados à superfície sólida. Finalmente,
após lavagem do meio reaccional, adiciona-se o substrato sobre o qual a enzima ligada
vai actuar, originando um produto corado ou quimioluminescente. Assim, no ensaio
competitivo quanto maior a concentração de Ag na amostra inicial, menor será a
absorvância ou fluorescência lida.
5.2.7.2.ELISA para a detecção de Ac
ELISA Indirecta
É o método mais utilizado para a detecção de Ac. Consiste na sensibilização da

superfície sólida com um Ag específico para o Ac em pesquisa. Posteriormente

adiciona-se a amostra, indo os Ac presentes ligar-se especificamente aos Ag

imobilizados na superfície sólida e não serão removidos na lavagem. Seguidamente
adiciona-se o Ac secundário marcado enzimaticamente que apresenta especificidade de
ligação para o Ac em pesquisa (trata-se de um anti-Ac). Incuba-se, lava-se novamente e
adiciona-se por último o substrato sobre o qual a enzima vai actuar.
ELISA de Competição
Funciona como a Elisa de Competição para pesquisa de Ag, mas neste caso a
amostra é previamente incubada com uma solução com Ag específicos para os Ac em
pesquisa, sendo superfície sólida revestida com Ag.
ELISA de Captura de Ac
A superfície sólida é recoberta com anti-IgM ou anti-IgG, resultando na

captação de toda a IgM ou IgG do paciente, respectivamente. Seguidamente adiciona-se
ao meio reaccional uma solução com Ag específico na ligação aos Ac IgM ou IgG do
paciente. Segue-se a incubação, a lavagem e a adição de um Ac monoclonal secundário
enzimaticamente marcado específico para o Ag da solução.

6. Microbiologia
O estágio decorreu:
- Na Maternidade Alfredo da Costa, no Serviço de Procriação Medicamente
Assistida, durante a segunda quinzena do mês de Outubro, sob a orientação da Drª Sónia
Correia. O estágio perfez um total de 80 horas.
- No Laboratório de Análises Clínicas Dr. Manuel Reymão Pinto, SA, em
Lisboa, na Secção de Microbiologia, durante os meses de Novembro e Dezembro de
2009 sob a orientação da Drª Margarida Baptista. O estágio perfez um total de 320
horas.
Antes da realização do estágio, a estagiária já tinha algum conhecimento da área,

tanto a nível teórico, com os conhecimentos adquiridos nas valências de Microbiologia,
Parasitologia, Micologia e Anatomofisiologia (espermogramas) do Mestrado de
Análises Clínicas, como a nível prático, dado que passou todo o ano de 2007 a trabalhar
na secção de Microbiologia do Laboratório Dr. Manuel Reymão Pinto, SA.
A necessidade sentida por parte da estagiária em aperfeiçoar a técnica de
realização de espermogramas, feita, regra geral, com muito mais pormenor e com outros
critérios, sobretudo morfológicos, na área da Fertilização in Vitro, fê-la recorrer à
Maternidade Alfredo da Costa, especificamente com esse fim. Assim, os aspectos
descritos relacionados com a realização de espermogramas são os aplicados na
Maternidade.
O Laboratório Reymão Pinto, SA, recebe em média 150 amostras

microbiológicas diariamente.
Na Maternidade Alfredo da Costa analisam-se 8 espermogramas por dia.
Na área da Microbiologia o principal objectivo é fornecer informação relevante e

válida, que dê ao clínico ferramentas para o processo de diagnóstico de uma doença
infecciosa, o que significa detectar e identificar o agente causal, para que seja possível
estabelecer o diagnóstico e o tratamento adequado à infecção

Microbiologia
6.1. Meios de Cultura
C.P.S. ID3: Meio cromogénico usado para o isolamento, identificação e contagem das
colónias das bactérias presentes na urina; E. coli (produtoras de ß-glucuronidase):
coloração vermelho escuro; Enterococcus (produtor de glucosidase): coloração
turquesa; Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) (exprimem ß-
Glucosidase): coloração verde a castanha esverdeada; Proteae (exprime desaminase):
coloração castanha.
COLUMBIA ANC + 5% DE SANGUE (CNA): Meio selectivo que permite o

desenvolvimento das bactérias Gram (+); a presença de sangue permite a expressão da
hemólise.
CHOCOLATE POLYVITEX (PVX): Meio selectivo para o isolamento do género

Neisseria, Haemophilus e Streptococcus pneumoniae.
CHOCOLATE POLYVITEX + VCAT: Meio selectivo para o isolamento da

Neisseria gonorrhoeae.
CHOCOLATE HAEMOPHILUS: Meio selectivo para o isolamento do género

Haemophilus.
MacCONKEY: Meio selectivo para o isolamento das bactérias Gram negativas; tendo
cristal de violeta, permite evidenciar a fermentação de lactose pela viragem do vermelho
neutro; os microorganismos que fermentam a lactose originam colónias rosas ou
vermelhas; os outros originam colónias incolores ou ligeiramente beges.
CHAPMAN (Manitol Salgado): Meio selectivo para o isolamento do Staphilococcus

aureus.
GELOSE SS: Meio selectivo para o isolamento do género Salmonella e Shigella;
SM ID 2 (SM2): Meio selectivo cromogéneo para identificação de Salmonelas que

aparecem com coloração rosa pálido a roxo.

Microbiologia
CALDO de TODD – HEWITT: Meio de enriquecimento para Streptococcus spp. Os

antibióticos presentes inibem a maioria dos microorganismos Gram (-).
LOWENSTEIN – JENSEN: Meio selectivo em tubo, para o isolamento do género

Mycobacterium;
ALBICANS ID 2 (CAN2): Meio selectivo, cromogéneo, para isolamento dos fungos e

identificação imediata da Candida albicans (colónias azuis); as restantes colónias do
género Candida são pigmentadas de rosa.
6.2. Condições de Incubação das Sementeiras
Estão disponíveis comercialmente geradores que permitem obter as diferentes

atmosferas necessárias para a cultura de microrganismos patogénicos em laboratório:
CO2, microaerofília e anaerobiose.
A temperatura óptima para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos
ronda os 35-37ºC; alguns, contudo, podem desenvolver-se a temperaturas mais baixas,
como a Listeria spp. (4ºC), e outros a temperaturas mais elevadas, como o
Campylobacter spp. (42ºC).
A maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma
humidade igual ou superior a 70%. Para manter a humidade numa estufa pode colocar-
se um recipiente com água no seu interior.
6.3. Equipamentos
6.3.1. Sistema VITEK2 Compact, bioMérieux
Utilizam-se as seguintes cartas de identificação:

 Cartas de Identificação de Gram-Negativos (GN);
 Cartas de antibiograma Gram-Negativos (AST-N020);
 Cartas de identificação Gram-Positivos (GP);

Microbiologia
 Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P534), para analisar a

sensibilidade aos antibióticos dos estreptococos dos grupos B e
enterococos;
 Cartas de antibiograma Gram-Positivo (AST-P536), para analisar a
sensibilidade aos antibióticos dos estafilococos;
 Cartas de identificação bioquímica das Leveduras (YST).
6.4. Técnicas utilizadas na identificação de microorganismos
6.4.1. Galeria API NH do Sistema MiniApi, bioMérieux
Utilizada para a identificação de Neisseria, Haemophylus e Moraxella

catarralis. Permite fazer a fenotipagem do Haemophylus influenza e do Haemophylus
parainfluenza, bem como detectar a presença da penicillinase.
6.4.2. Coloração de Gram
De acordo com as diferenças estruturais da parede celular, existem bactérias que

retêm o complexo cristal de violeta - Iodo, após descoloração com uma mistura de
Álcool - Éter, ficando com uma cor púrpura (Gram-Positivas), enquanto que outras
não o retêm ficando com a coloração dada pelo corante de contraste utilizado, vermelho
(Gram-Negativas).
6.4.3. Coloração de “ZIEHL - NEELSEN” (Método de coloração de

Kinyoun modif. ou de Tan - Thiam - Hok)
O método baseia-se na capacidade de alguns microrganismos, designadamente o

género Mycobacterium e algumas espécies do género Nocardia (N. asteroides, N.
brasiliensis e N. caviae), em virtude das composição da sua parede celular em ácidos
micólicos, em reterem a Fucsina básica fenicada. Esta não é removida pela acção de
uma mistura descorante, constituída por Etanol e um Ácido mineral forte. Assim, os
bacilos álcool-ácido-resistentes coram de vermelho sobre um fundo azul, dado pelo
corante de contraste (solução aquosa de azul de metileno).

Microbiologia
6.4.4. Teste da Catalase
A catalase desdobra o peróxido de hidrogénio (3%) em água e oxigénio. O teste

é positivo se se observar a formação de bolhas oxigénio.
6.4.5. Prova da Coagulase
A coagulase é uma enzima termoestável produzida principalmente pelas estirpes

de S. aureus, servindo a prova para identificar esta espécie. A prova é positiva no caso
de se observar a existência de coagulação.
6.4.6. SLIDEX Strepto Plus
Este teste identifica o grupo a que a estirpe de Streptococcus pertence.
6.4.7. Teste do Tubo Germinal
Prova da filamentação para identificação de Candida albicans.
6.4.8. Técnica de Contraste Negativo com Tinta da China
Permite a visualização de espiroquetas e das cápsulas de Cryptococcus

neoformans.
6.5. Microorganismos a Valorizar nos Diferentes Produtos

Biológicos:
6.5.1. Urina Asséptica
Enterobacteriaceae; Enterococcus; Pseudomonas sp.; Acinetobacter sp.;

Staphylococcus aureus, S. saprophyticus, Mycobacterium sp. e Candida albicans.

Microbiologia
6.5.2. Exsudado Uretral e Vaginal
Trichomonas vaginalis; Gardnerella vaginalis (só vaginal); Candida albicans;

Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus do Grupo-B de Lancefield (só vaginal em
grávidas). Outros microorganismos patogénicos são Treponema pallidum sp.,
Haemophilus ducrey e Calymatobacterium granulomatis.
6.5.3. Exsudado Nasofaríngeo
Streptococcus - hemolíticos. Quando solicitado ou em cultura abundante

valorizar também Streptococcus pneumoniae; Haemophilus influenzae e H.
parainfluenzae; Staphylococcus aureus; Corynebacterium diphtheriae; Neisseria
meningitidis; Bordetella pertussis.
6.5.4. Expectoração
Streptococcus pneumoniae; H. influenzae e H. parainfluenzae; Mycobacterium

sp.; apenas nos bronquíticos crónicos e/ou quando é isolada em cultura predominante ou
pura Nocardia sp. e Branhamella catarrhalis.
6.5.5. Fezes
Salmonella sp. (S. typhi; S. cholerasuis; S. enteritidis); Shigella sp.;

Campylobacter fetus spp. jejuni; Yersinia enterocolitica.
6.5.6. Hemoculturas
Streptococcus - hemolítico (se for S. pneumoniae, houver endocardite ou se

voltar a ser isolado numa segunda hemocultura); Staphylococcus epidermidis (se houver
material de prótese implantado no doente).

Microbiologia
No Anexo 3 encontra-se um resumo da selecção de agentes anti-microbianos

feita para os diferentes microorganismos na secção de Microbiologia do Laboratório
Reymão Pinto, SA.
6.6. Espermogramas
6.6.1. Avaliação Macroscópica Inicial
- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora
após a colheita;
- Entre a colheita e a análise o esperma poderá ficar à temperatura ambiente
(preferencialmente) ou na estufa a 37º (diminui mais a motilidade);
- Homogeneizar gentilmente o esperma no recipiente original; não vortexar e,
em caso de se utilizar uma pipeta, optar pelas de grande calibre;
6.6.1.1.Liquefacção e Viscosidade
- Uma amostra normal liquefaz no máximo em 60 minutos; caso o esperma

forme um fio com mais de 2 cm considerar “liquefacção incompleta” e “aumento da
viscosidade”;
- O aumento da viscosidade poderá estar associado a diminuição da motilidade
ou da concentração de espermatozóides e poderá dever-se a:
 Presença de auto-Ac;
 Infecção do tracto reprodutor masculino;
 Disfunção prostática (o líquido prostático é responsável pela liquefacção
espermática);
- Em caso de liquefacção incompleta/aumento da viscosidade deverá proceder-se
gentilmente a liquefacção mecânica (com uma seringa e agulha) ou adicionar-se ao
esperma uma enzima digestiva.

Microbiologia
6.6.1.2.Aparência
- Aparência normal: opalescente;

- Aparência anormal:
 Transparente: baixa concentração espermática;
 Esbranquiçado: presença de leucócitos;
 Avermelhado: presença de eritrócitos;
 Amarelado: icterícia ou toma de vitaminas.
6.6.1.3.Volume
- Medido por pipeta de vidro elevado calibre (o plástico interfere com a

motilidade espermática);
- 2 mL < Valores de Referência < 5,0 mL.
6.6.1.4.pH
- Medido com papel indicador, ao fim de 30 segundos;

- 7.2 < pH Valores de Referência < 8.3;
- pH baixo é sugestivo défice de liquido das vesículas seminais (confere pH
alcalino); pH elevado é sugestivo de défice de líquido prostático (confere pH ácido).
6.6.2. Avaliação Microscópica Essencial
- Deverá ser feita logo que o esperma esteja liquefeito e, no máximo, uma hora
após a colheita;
- Realizada preferencialmente num microscópio de contraste de fase;
6.6.2.1.Estimativa da Concentração Espermática
- Preparação a fresco;
- Serve para decidir a diluição que será feita, a fim de determinar posteriormente
a concentração espermática;

Microbiologia
Nº de spz por campo de 40x Diluição
1-2 -
3 - 15 1:5
15 – 40 1:10
40 – 200 1:20
> 200 1:50
Tabela 9 – Diluições utilizadas para determinação da concentração espermática.

-
Amostras com 1 – 2 spz / campo deverão ser centrifugadas (600 RPM; 15
minutos), rejeitando-se o sobrenadante, a fim de se avaliar posteriormente a motilidade
e morfologia; a concentração será dada como < 2x10^6;
- Amostras sem espermatozóides deverão ser centrifugadas (3000 RPM; 15
minutos), rejeitando-se o sobrenadante; só se considera que a amostra é azoospérmica se
em todo o sedimento obtido não se visualizar nenhum espermatozóide; se se
visualizarem espermatozóides a concentração será dada como < 1x10^6;
- Para ejaculados sem espermatozóides deverão fazer-se os seguintes testes
subsequentes:
 Teste da Frutose (fornece energia aos espermatozóides, entrando no
conteúdo das vesículas seminais);
 Exame de esperma numa urina após masturbação (possível ejaculação
retrógrada).
6.6.2.2.Motilidade
- Preparação a fresco de duas lâminas;

- Avaliar, no mínimo, 5 campos por lâmina;
- Classificação dos espermatozóides (dar valor percentual):
 (a) Motilidade progressiva rápida (≥ 4 cabeças/segundo);
 (b) Motilidade progressiva lenta;
 (c) In situ;
 (d) Imóveis (se >50% deve fazer-se o teste da vitalidade).
- Valores de Referência:
 a + b > 50% ou
 a > 25%

Microbiologia
6.6.2.3.Presença de Elementos Celulares para além dos Espermatozóides
- Poderão estar presentes:

 Células Epiteliais;
 Eritrócitos (hematospermia);
 Leucócitos (leucocitospermia para > 5 leucócitos/campo);
 Células Germinativas Imaturas;
 Cristais;
 Microorganismos:
o Gardnerella vaginalis;
o Leptotrix vaginalis;
o Trichomonas vaginalis;
o Candida albicans;
o Sarcoptes scabiei;
o Pthirus púbis.
6.6.2.4.Agregação e Aglutinação
- Agregação: aderência de espermatozóides imóveis entre si ou de

espermatozóides móveis a outras células que não espermatozóides;
- Aglutinação:
 Aderência de espermatozóides móveis entre si, agarrados cabeça a
cabeça, cauda a cauda ou uma mistura das duas aparências;
 Poderá indicar a presença de:
- Infecção, geralmente associada a leucocitospermia;
- Auto-Ac anti-espermatozóides, devendo fazer-se o teste da
sua presença.
6.6.2.5.Concentração Espermática
- Efectuar a diluição pré-determinada numa solução feita com:

 Formol 5 mL;
 Azul de Metileno 2,25 mL;

Microbiologia
 NaCl 0,9% 42,75 mL.

- Agitar mediante vórtex a mistura durante pelo menos 15 segundos;
- Encher a Câmara de Neubauer (em cima e em baixo) com a diluição preparada
e aguardar 5 minutos para que a amostra sedimente;
- Contar os espermatozóides inteiros e as cabeças em:
 Todos os quadrados, se existirem menos de 10 espermatozóides por
quadrado;
 Dez quadrados, se existirem 10 a 40 espermatozóides por quadrado;
 Cinco quadrados, se existirem mais de 40 espermatozóides por quadrado.
- No mínimo deverão contar-se 200 espermatozóides em cada uma das duas
contagens; se as duas contagens derem valores muito diferentes, deverá fazer-se uma
nova diluição e contagem;
- Por cada quadrado, contar os espermatozóides que apenas se encontrem em
cima de duas linhas;
- Cálculo da Concentração Espermática (nº de spz/mL):
Nº espermatozóides contados x Nº de quadrados contados x Factor de Diluição x 1000

Nº de quadrados totais da Câmara de Neubauer
NOTA: 1000 tem em conta a espessura da Câmara de Neubauer.
- Valores de Referência:
 Concentração Espermática: ≥ 20x10^6 spz/mL;
 Número total de Espermatozóides: ≥ 40x10^6 por ejaculado
(concentração x volume ejaculado).
6.6.2.6.Morfologia
- Poderá ser feita directamente a partir da Câmara de Neubauer, embora se

prefira o recurso a uma técnica de coloração, como o Papanicolaou;
- Valor de referência: >15% de espermatozóides normais.
- Contar 200 espermatozóides com a objectiva de imersão de 100x, anotando os
espermatozóides:

Microbiologia
 Normais:
- Cabeça com comprimento 4-5 μm e largura 2,5-3,5 μm
(usar micrómetro), com relação comprimento/largura de 1,5 a
1,75;
- O acrossoma (contém enzimas que ajudam os spz a
penetrar na zona pelúcida dos óvulos) compreende 40 a 70% da
cabeça; a região pós-acrossómica contém o núcleo dos spz;
- Vacúolos ocupam menos de 20% do tamanho da cabeça;
- Gotas citoplasmáticas (resíduos da maturação
espermática; alteração da maturação final no epidídimo) ocupam
menos de 1/2 do tamanho da cabeça;
- Cauda 1,5 vezes maior que a cabeça, não enroladas e
mais fina que a peça intermédia.
 Com anomalia da cabeça:

- Alteração do tamanho (macrocéfalos, microcéfalos);
- Alteração da forma (piriforme, redonda, amorfo/forma
anormal);
- Com vacuolização que ocupe mais de 20% da cabeça;
- Acrossoma que ocupa menos de 40% da cabeça;
- Cabeças duplas;
- Pinhead (caudas sem cabeça; não contar; só referir se
forem muitos).
 Com anomalia da peça intermédia:

- Peça intermédia forma um ângulo de 90º com a cauda;
- Inserção assimétrica na cabeça;
- Partida (a cabeça descai);
- Estreita, grossa ou Irregular.
 Com a anomalia da cauda:

- Curta;

Microbiologia
- Múltipla;
- Partida,
- Enrolada;
- Gota citoplasmática que ocupa mais de 1/2 da cabeça.
 Com anomalia mista (associação de 2 ou mais defeitos em zonas

diferentes);
6.6.3. Avaliação Microscópica Complementar
6.6.3.1.Teste da Vitalidade
- Deve executar-se se a percentagem de espermatozóides imóveis exceder os

50%;
- Reflecte a percentagem de espermatozóides vivos;
- Devem contar-se 200 espermatozóides;
- Valor de Referência: ≥ 50% espermatozóides vivos.
- Técnicas existentes utilizadas:
 Teste da Eosina-Nigrosina:
- Misturar eosina, nigrosina e sémen; observar uma gota do preparado
ao microscópio;
- Os espermatozóides mortos (membrana rota) irão incorporar a eosina,
aparecendo vermelhos; os espermatozóides vivos manter-se-ão
incolores; a nigrosina origina um fundo escuro que facilita a
visualização da lâmina;
 Teste da Hipo-Osmolaridade (HOS):

- Mistura uma solução hipo-osmótica e sémen; observar uma gota do
preparado ao microscópio;

Microbiologia
- Os espermatozóides mortos não irão sofrer transformação; os

espermatozóides vivos, por estarem numa solução hipo-osmótica irão
entumescer e, consequentemente, enrolar a cauda;
6.6.3.2.Teste da Presença de Auto-Ac Anti-Espermatozóides
- Deverá ser feito sempre que se observe aglutinação entre espermatozóides

(móveis);
- Avalia a produção de IgA e IgG contra os espermatozóides do próprio;
- Os espermatozóides são antigénicos; geralmente existe uma barreira que evita
o seu contacto com o sangue; quando esta barreira se rompe (traumatismo,
infecção ou vasectomia) os linfócitos B entram em contacto com o sémen, o que
leva à produção de Auto-Ac. anti-espermatozóides;
- Contagem de 200 espermatozóides;
- Técnica efectuada:
 MAR Teste (Mixed Antiglobulin Reaction test):

- Misturar sémen e partículas de látex com Ig (IgA ou IgG); depois
adicionar o anti-soro anti-Ig (A ou G); ver ao microscópio 3 a 10
minutos depois;
- A presença de aglutinados entre espermatozóides e as partículas de
látex indica a presença de auto-Ac anti-Ig (A ou G);
- Valor de Referência: < 50% dos spz sem partículas de látex aderidas.
6.6.3.3.Testes Opcionais – Testes Bioquímicos
- Devem ser executados no líquido seminal desprovido de espermatozóides;

 Para a próstata:
o Zinco:
- Valor de Referência ≥ 2,4 μmol/ejaculado;
 Para as vesículas seminais:

o Fructose:
- Valor de Referência ≥ 13 μmol/ejaculado;

Microbiologia
 Para o epidídimo:
o α-glucosidase neutra;
- Valor de Referência ≥ 20 um/ejaculado;
6.6.4. Nomenclatura
NORMOZOOSPERMIA
Ejaculado normal definido pelos vários Valores de Referência.
ASPERMIA
Ausência de ejaculado.
HIPOSPERMIA
Volume de esperma abaixo dos Valores de Referência.
HIPERESPERMIA
Volume de esperma acima dos Valores de Referência.
AZOOSPERMIA
Ausência de espermatozóides no ejaculado.
POLIZOOSPERMIA
Concentração espermática > 250x10^6 spz/mL.
OLIGOZOOSPERMIA
Concentração espermática < 20x10^6 spz/mL.
OLIGOZOOSPERMIA GRAVE
Concentração espermática < 5x10^6 spz/mL.
ASTENOZOOSPERMIA
Motilidade abaixo dos Valores de Referência.

Microbiologia
TERATOZOOSPERMIA
Morfologia abaixo do Valor de Referência.
OLIGOASTENOTERATOZOOSPERMIA (OTA)
Combinação das 3 definições anteriores.
NECROZOOSPERMIA
Vitalidade abaixo do Valor de Referência.

7. Controlo de Qualidade
O processo de controlo da qualidade tem por objectivo prever os problemas que

possam alterar a estabilidade das amostras e dos reagentes e verificar o estado de bom
funcionamento dos sistemas analíticos, de forma a assegurar que os resultados obtidos
cumprem os requisitos de qualidade exigidos, para que tenham utilidade clínica.
O controlo da qualidade dos resultados inicia-se na fase pré-analítica com a
correcta preparação do doente, colheita das amostras biológicas, seu transporte e
conservação. Passa pela fase analítica através dos procedimentos de manutenção dos
equipamentos, controlo e calibração dos sistemas analíticos, avaliação dos métodos
utilizados, correlação entre dados clínicos e laboratoriais e ensaios inter-laboratoriais.
Engloba também a fase pós-analítica com uma adequada validação dos resultados.
7.1. Controlo de Qualidade Interno
O objectivo do controlo de qualidade interno é garantir a fiabilidade e

reprodutibilidade dos resultados diários do laboratório e indicar a possível necessidade
de efectuar acções correctivas em situações de não conformidade, de forma a permitir
que os resultados obtidos cumpram os requisitos de qualidade exigidos.
Para além do treino prévio do pessoal envolvido, compreende essencialmente
duas fases operacionais: o controlo interno e a calibração.
Para controlo interno recorre-se a um material de controlo, que é um produto
biológico com valores conhecidos usado na verificação do desempenho das técnicas,
reagentes e equipamentos usados para o diagnóstico analítico. O controlo interno é
efectuado diariamente de forma a garantir a qualidade dos resultados. É executado e
avaliado antes de se processarem as amostras e, periodicamente, no decorrer da fase
analítica. Os resultados são registados num gráfico e comparados com os Limites
Aceitáveis de Erro (média ± 2 desvios padrões), apenas sendo validado se os resultados
se encontrarem dentro do intervalo de confiança.
Quando um determinado parâmetro analítico está fora do controlo realiza-se
uma calibração e os resultados do controlo de qualidade desse analito são novamente
processados e analisados.

Controlo de Qualidade
A calibração dos parâmetros analíticos consiste num conjunto de operações que

estabelecem, em condições especificadas, a relação entre valores de grandeza indicados
por um instrumento de medição ou um material de referência e os correspondentes
valores obtidos através de padrões. Para tal recorre-se a um calibrador - um material de
referência de composição qualitativa ou quantitativa bem definidas, adequado para o
analito a analisar, adaptado ao método utilizado e aferido por padrões de referência.
A partir desta fase, o equipamento encontra-se pronto para processar as
amostras.
Para todos os aparelhos bioquímicos e hematológicos das instituições onde a

estagiária passou efectou-se no mínimo um nível de controlo interno diariamente antes
do início do trabalho e outro a meio do trabalho.
Para cada reacção de PCR realizada no Laboratório de Genética Molecular do
IPO Porto, utiliza-se um controlo negativo (água de PCR) e um controlo positivo.
Para cada série de lâminas de imunofluorescência utiliza-se um controlo interno
positivo e outro negativo no Laboratório de Imunologia do Hospital Curry Cabral.
Na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto, SA, utiliza-se um
controlo interno sempre que se executam os testes da catalase e coagulase.
Semanalmente utiliza-se um controlo interno para testar as colorações utilizadas. Para
verificar a validade do procedimento de determinação de Urinas Assépticas utilizam-se
semanalmente cartas de estirpe padrão para Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Escherichia coli (ATCC25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853).
7.2. Avaliação Externa da Qualidade (AEQ)
A Avaliação Externa de Qualidade é efectuada mediante a realização de ensaios

inter-laboratoriais, permitindo a cada laboratório avaliar a exactidão dos seus resultados.
O Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco Gentil participa em

ensaios inter-laboratorias a nível nacional com o INSA (Instituto Nacional de Saúde Dr.
Ricardo Jorge)1 e a nível internacional com o UK-NEQAS3 (United Kingdom National
External Quality Assessment Service).

Controlo de Qualidade
O Laboratório Reymão Pinto participa em ensaios inter-laboratorias a nível

nacional com o INSA e a nível internacional com o RIQAS (Randox International
Quality Assessment Sample), com o UK-NEQAS e com o Quality Club da Phadia.

ParteII
Auto-Imunidade
Metodologias Laboratoriais para

Diagnóstico e Seguimento
Terapêutico
Hospital Curry Cabral,
Serviço de Nefrologia
Laboratório de Imunologia
Orientadora Drª Maria do Céu Santos

Auto-Imunidade
1. Sistema Imunológico e Auto-Imunidade
A resposta imunológica é uma sequência complexa e regulada de eventos,

envolvendo vários tipos de células, que permite a eliminação de agentes invasores
estranhos ao organismo. Inicia-se quando um antigénio penetra no organismo e entra
em contacto com células apresentadoras de antigénio (APC); estas células possuem na
sua superfície antigénios leucocitários humanos (HLA II) e exibem a capacidade de se
ligar (através dos HLA II superficiais) e processar o antigénio exógeno de forma a que
este possa ser depois reconhecido por linfócitos T Auxiliares CD4 antigénio-
específicos. Estes linfócitos tornam-se activos e, por sua vez, promovem a activação de
outras classes de linfócitos, como os linfócitos T Citotóxicos CD8 e os linfócitos B.
Seguidamente, estes linfócitos activados executam as suas funções efectoras específicas
que, na maioria dos casos, eliminam com sucesso o antigénio. Os linfócitos T
Citotóxicos produzem enzimas (perforina e granzimas) que conduzem à morte por lise
de células do hospedeiro infectadas intracelularmente com o antigénio. Os linfócitos B,
por seu turno, produzem anticorpos, conduzindo à formação de imunocomplexos
(conjunto antigénio-anticorpo); os imunocomplexos formados neutralizam o antigénio
ou conduzem à activação do sistema do complemento ou à fagocitose do antigénio
(ADCC – Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos); em qualquer um dos três
casos, o resultado é sempre a inactivação/destruição do agente invasor. Em cada etapa
deste processo as células imunológicas comunicam entre si por contacto directo ou
através da produção de citocinas reguladoras. Todas as respostas são fisiologicamente
controladas com precisão e normalmente terminam após a eliminação do antigénio
estimulador.
Os HLA II exibidos na superfície das células APC de diferentes indivíduos são
ligeiramente diferentes, variando em alguns aminoácidos da sua estrutura. Estas
pequenas variações determinam que diferentes indivíduos respondam de forma desigual
quando expostos ao mesmo antigénio. Justificam, assim, a maior propensão que certos
indivíduos apresentam para resistir a determinados antigénios ou, pelo contrário, para
desenvolver certo tipo de patologias.
Cada anticorpo (imunoglobulina) produzido pelos linfócitos B é constituído por
duas cadeias leves iguais entre si (κ ou λ) e duas cadeias pesadas iguais entre si (γ, μ, ε,
α ou δ). Consoante o tipo de cadeias pesadas que constitui o anticorpo, assim a sua
classe: γ para IgG (os anticorpos mais abundantes), μ para IgM (os primeiros anticorpos
Auto-Imunidade
a serem produzidos durante a resposta imunológica), ε para IgE (os anticorpos

especialmente produzidos durante reacções alérgicas), α para IgA (os principais
anticorpos produzidos nas mucosas do organismo) e δ para IgD (sem grande função
reconhecida). A porção Fc do anticorpo determina as suas propriedades físicas e
biológicas, sendo igual para anticorpos da mesma classe; a porção Fab é aquela que se
liga, de forma específica, ao antigénio invasor. Designa-se por epítopo o grupo de
resíduos de aminoácidos do antigénio que se liga ao anticorpo e contra o qual a resposta
imunológica é dirigida.
Figura 25 – Estrutura dos anticorpos (imunoglobulinas). A verde representa-se as duas cadeias

pesadas e a azul as duas cadeias leves, unidas por pontes dissulfureto. A fracção Fab é a zona de ligação
ao antigénio. As regiões hipervariáveis da região Fab são as responsáveis pela maior especificidade na
ligação antigénio-anticorpo.
Toda a referida resposta imunológica é específica. Isto é, o sistema imunológico

tem a capacidade de detectar diferenças subtis entre inúmeros antigénios, respondendo a
cada um deles de forma individualizada e única; consoante o antigénio invasor, será
diferente a sua ligação ao HLA II das células APC, a sua ligação (depois de processado)
ao receptor TCR dos linfócitos T e a sua ligação ao anticorpo (tem de existir
complementaridade antigénio-anticorpo para que haja ligação). Por este motivo, o
sistema imunológico tem a capacidade de discriminar entre o próprio (“self”) e o não
próprio, de modo que em condições normais responde de forma vigoroso a antigénios
que lhe são estranhos, mas coexiste pacificamente com proteínas que compõem o
hospedeiro.

Auto-Imunidade
As Doenças Autoimunes (DAI) caracterizam-se por uma resposta imunológica

exagerada contra os antigénios do próprio indivíduo (perda do “self”), com consequente
formação excessiva de auto-anticorpos (anticorpos dirigidos contra antigénios
próprios), sem que se detecte a presença de um agente infeccioso ou antigénio tumoral.
Felizmente a prevalência destas doenças é baixa, sendo apenas de cerca de 5%.
O reconhecimento de auto-antigénios dentro de certos limites é fisiológico e até

essencial para o desenvolvimento de respostas imunes efectivas. Naturalmente
reconhece-se a presença de anticorpos circulantes que reconhecem auto-antigénios;
estes anticorpos designam-se por “auto-anticorpos naturais” e são geralmente IgG,
embora também possam ser IgA ou IgM.. Parecem ser essenciais para a manutenção da
vida (papel fisiológico da Autoimunidade controlada), uma vez que:
- Efectuam a clearance dos corpos apoptóticos que resultam da apoptose e dos
imunocomplexos formados;
- São importantes na vigilância imunológica de células cancerígenas;
- Desencadeiam uma resposta imune rápida, por reagirem rapidamente com
agentes patogénicos que exprimem epítopos semelhantes aos auto-antigénios (reacção
cruzada);
- Criam circuitos reguladores que evitam a Autoimunidade patogénica/excessiva
(como se explica, mais a diante).
Mas como é que surgem estes auto-anticorpos naturais?
Em circunstâncias normais, logo a nível dos órgãos linfóides primários, de entre

todos os linfócitos produzidos pelo organismo, são apenas seleccionados os que
apresentam receptores (BCR no caso dos linfócitos B e TCR no caso dos linfócitos T)
com afinidade média para os auto-antigénios. Assim, no timo, os linfócitos T com TCR
que confere:
- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, não
existe transmissão de sinal; este linfóctito T sem nenhuma reactividade ao “self” sofre
morte intra-tímica;
- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é
induzida uma força de sinalização excessivamente forte que conduz a um sinal
apoptótico; o linfócito T também sofre morte intra-tímica (Selecção Negativa);

Auto-Imunidade
- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – HLA da célula APC”, é

induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); são estes linfócitos T com alguma
afinidade para auto-antigénios que sofrem uma consequente maturação intra-tímica,
saindo depois para o sangue periférico.
Os linfócitos B, na medula óssea, com BCR que confere:
- Baixa afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, não
existe transmissão de sinal; estes linfócitos B sem nenhuma reactividade ao “self”
sofrem morte intra-medular;
- Elevada afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, sofrem
edição do receptor BCR (rearranjo genético do BCR que conduz à substituição de uma
fracção da porção Fab). Se a edição do receptor falhar, os linfócitos B também sofrem
morte intra-medular (Selecção Negativa). Se o rearranjo for bem sucedido, é induzido
um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma afinidade para
auto-antigénios sofrem consequente maturação intra-medular, saindo depois para o
sangue periférico;
- Média afinidade na ligação “anticorpo próprio – BCR do linfócito B”, é
induzido um sinal de sobrevida (Selecção Positiva); estes linfócitos B com alguma
afinidade para auto-antigénios também sofrem uma consequente maturação intra-
medualr, saindo depois para o sangue periférico.
Como nem todos os auto-antigénios são apresentados aos linfócitos no timo e
medula óssea, verifica-se a presença de linfócitos auto-reactivos no sangue periférico
que são depois sujeitos a uma Selecção Negativa nos órgãos linfóides secundários, a
nível dos quais os linfócitos que apresentam reactividade aos auto-antigénios aí
existentes também são eliminados (Tolerância Periférica).
Isto é, em circunstâncias normais, dentro dos precursores dos linfócitos T e B,
sobrevivem apenas os que reconhecem, dentro de certos limites, auto-antigénios.
Contudo, dois processos podem contribuir para a alteração dos fenómenos

imunológicos, conduzindo a um super-reconhecimento de auto-antigénios, surgindo
assim as DAI:
1- Disfunção do Sistema Imunitário (deficiência nos mecanismos de regulação
dos processos imunitários):
Normalmente os linfócitos B e T auto-reactivos existem mas estão inactivos em

circulação por estarem directamente ligados a certas citocinas ou ligados a linfócitos T
Auto-Imunidade
Reguladores; estas ligações directas conduzem à tradução de sinais inibitórios que

impedem a activação dos linfócitos auto-reactivos. Assim, distúrbios nas citocinas ou
falência na supressão podem conduzir à activação dos linfócitos auto-reactivos,
induzindo a uma Autoimunidade excessiva e patológica.
2- Reacções cruzadas por semelhança nos epítopos dos auto-antigénios e dos

antigénios estranhos:
As reacções cruzadas podem ocorrer por dois motivos:

- O antigénio estranho induz alterações celulares nos auto-antigénios que fazem
com que os linfócitos deixam de os reconhecer como próprios;
- O antigénio estranho mimetiza os auto-antigénios, estimulando directamente os
linfócitos auto-reactivos por ser molecularmente semelhante aos auto-antigénios.
A etiologia das DAI é geralmente multi-factorial, onde factores extrínsecos e

intrínsecos contribuem para a patogénese e progressão da patologia:
1. Factores Extrínsecos:
- Infecções (promovem alterações celulares);
- Tabaco;
- Drogas;
- Radiação UV;
- Metais pesados;
- Produtos químicos.
2. Factores Intrínsecos:
- Idade;
- Factores hormonais (embora a progesterona seja imunossupressora, os
estrogénios e a prolactina potenciam a resposta imunológica; daí que as DAI sejam,
regra geral, mais frequentes nas mulheres);
- Deficiências na via do Complemento (défice no C1q e C4 impedem a remoção
eficiente dos corpos apoptóticos) e nas células reguladoras (Imunodeficiência);
- Factores Genéticos (Predisposição Genética):
o Sistema HLA (a expressão de haplotipos particulares do Sistema HLA
aumenta a susceptibilidade para as DAI; praticamente todas as DAI
Auto-Imunidade
revelam uma associação com este Sistema; o mesmo é dizer que existem
genes de susceptibilidade à doença; por exemplo, quem expressa HLA
DR2 ou 3, apresenta uma maior proporção para o desenvolvimento de
Lúpus Eritematoso Sistémico);
o Activação e regulação celular (genes não HLA também regulam a
resposta imunitária, pelo que podem contribuir para uma predisposição
genética para certas DAI; por exemplo, genes localizados no
cromossoma X parecem desempenhar papel importante no
desenvolvimento das DAI);
o Apoptose (deficiência no gene Fas leva a que a apoptose não ocorra,
perpetuando-se o estado de proliferação);
Geralmente, nas DAI verifica-se a presença de “antigen speading” que se

define como a exposição de autoantigénios crípticos como consequência do
processoauto-imune, o que leva à presença de novos auto-anticorpos ao longo da
doença, com consequente aparecimento de novas DAI.

Auto-Imunidade
2. Doenças Auto-Imunes (DAI)

2.1. DAI Multi-Sistémicas
DAI Epidemiologia e Manifestações Clínicas e

Fisiopatologia Auto-anticorpos Presentes
Multi-sistémica Associação HLA Laboratório
Auto Ac. Principais:
- DNAds (elevada
especificidade, sendo critério de
diagnóstico; importante também
na monitorização porque se
relaciona com a actividade da
doença; pode surgir até 10
Geral envolvimento de anos antes do diagnóstico);
todos os orgãos: - Sm (elevada especificidade,
Os queratócitos que sofrem sendo critério de diagnóstico;
Lúpus Eirtematoso
apoptose geralmente concentram-se -Poliartrite (artralgias aparece em 30% dos casos
Sitémico mas só se manifesta nesta
em vesículas (corpos apoptóticos), simétricas) 90%;
(LES) evitando a sua exposição ao meio - Rubor e lesões cutâneas, patologia; aparece pouco antes
envolvente. fotossensibilidade, do diagnóstico; não serve para
Nos doentes com LES, por factores “butterfly rash” 85%; monitorização porque não varia
genéticos, existe comprometimento - Glomerulonefrite 70%; com a actividade da doença);
da remoção destes corpos - Atingimento do SNC Outros Auto Ac. Importantes:
apoptóticos (deficiente depuração), (AVC, intelecto, memória, - DNAss;
o que conduz à exposição de aprendizagem) 70%; - Histonas (LES induzido por
antigénios à superfície celular e à - Miopatias 30 a 50%; drogas);
sua acumulação em circulação. Com - Alterações do - Nucleossoma (importante na
Afecta 40 em 100 000 monitorização porque altos
o tempo estes antigénios sofrem parênquima pulmonar
pessoas. títulos relacionam-se com
alterações estruturais tornando-se 18%;
imunogénicos. Verifica-se, então, - Alterações do TGI (dor elevada actividade da doença e
Proporção envolvimento renal; aparece em
desenvolvimento de uma resposta abdominal) 20%;
mulheres:homens 9:1 (os indivíduos com LES sem
imunológica inespecífica de órgão, - Alterações cardíacas;
estrogénios aumentam a DNAds);
sendo activados linfócitos B, T e - Manifestações
formação de auto-ac anti- - SS-A (Ro) e SS-B (La)
células APC. Os linfócitos B hematológicas (anemia
DNA). (relacionam-se com Síndrome
produzem auto-anticorpos contra os hemolítica, linfopénia,
antigénios, formando-se trombocitopénia); de lúpus neonatal – bloqueio
Afecta todas as idades. congénito cardíaco em recém-
imunocomplexos (Ag-Ac). Os - Manifestações
imunocomplexos formados activam inespecíficas (fadiga, nascidos; presente em 50% dos
Afecta sobretudo negros. casos);
a via comum do complemeto, febre, anorexia, dor de
havendo deposição destes cabeça, queda de cabelo, - PCNA (elevada especificidade
HLA DR2 e DR3. mas aparece apenas em 3%
complexos a nível dos tecidos úlceras orais);
(glomerulonefrite). - (…) dos casos).
Os defeitos imunológicos combinam- - Scl-70;
se com factores ambientais, como Laboratório: - RNA Polimerase II e III;
- U1-snRNP;
infecções virais e radiações UV (daí - Hemograma: anemia - hn-RNP;
a fotossensibilidade). Estes agentes hemolítica, neutropénia, - Lâmina A, B, B2 e C;
aumentam o processo de apoptose linfopénia, - RNA Polimerase I;
Figura 26 – “Butterfly e favorecem alterações estruturais trombocitopénia; - NOR;
rash”, LES, DAI Multi- nos antigénios deficientemente - Diminuição do Fe sérico - RNA helicase II;
Sistémicas. depurados, exacerbando todo o e transferrina; - sp100 e PML;
processo pré-existente. - Urina: possível - Ku.
proteinúria e hematúria (se - Ribossomal (geralmente
glomerulonefrite envolvimento do SNC e sem
associada) DNAds);
- Mitocondrial;
- Golgi.
Outros Ac.:
- Anti-Cardiolipinas IgG e IgM;
- Anti-C1q (relaciona-se com
LES em risco de doença renal –
nefrite lúpica)

Auto-Imunidade
DAI Epidemiologia e Manifestações Clínicas e

Multi-sistémica Associação HLA Laboratório
Anticorpos anti-fosfolipídicos:
- Anti-Cardiolipina IgG e IgM
Afecta 40 em cada
Presença de auto-anticorpos - Tromboses arteriais e venosas (presentes em SFA mas
100 000 pessoas.
dirigidos contra a proteína β2- recorrentes; também em infecções);
Glicoproteina I. Esta proteína vai - Trombocitopénia; - Anti-β2-Glicoproteina I
Sobretudo
depois ligar-se à maioria das - Em grávidas conduzem a abortos (diferencia os ac. cardiolipina
mulheres entre 15 e
cargas negativas das cabeças dos repetidos, HTA, pré-eclampsia e relacionados com infecções
Síndrome Antifosfolipídico 30 anos ou acima
fosfolípidos, como a cardiolipina (é Diabetes gestacional. dos não relacionados com
(SAF) dos 60 anos.
co-factor da cardiolipina). Os infecções, embora um nº
fosfolípidos atacados encontram- Laboratório: significativo de doentes com
Afecta sobretudo
se, sobretudo, nas camadas - Hemograma: trombocitopénia infecções permaneça positivo
indivíduos com
endoteliais capilares e membranas moderada; também com β2-Glicoproteina
LES.
plaquetares. - Presença de anticoagulante I); só altos títulos
lúpico. correspondem a SAF,
podendo baixos títulos
corresponder a infecções;
- Sinovite (inflamação das
articulações) simétrica , sobretudo
Produção de auto-anticorpos anti- das mãos e pulsos, mas também
IgM (factor reumatóide), com pés, tornozelos, ombros e coluna;
consequente deposição de - Destruição das artticulações e Auto Ac. Principais:
Artrite Reumatóide Afecta 40 em cada
imunocomplexos nas articulações. formação de nódulos em torno das - Factor Reumatóide (baixa
(AR) 100 000 pessoas.
Segue-se um chamamento de articulações interfalângeas, com especificidade);
leucócitos a este local com dor crónica associada; - Anti-CCP “cyclic citrullinated
Sobretudo
produção de citocinas e - Anquilação (dificuldade de peptides” (especificidade de
mulheres, na
proliferação das células sinoviais movimento), sobretudo logo pela 95% para AR; a mesma
proporção de 3:1.
das articulações com formação do manhã; sensibilidade que FR; pode
panus (tecido granular que crece - Manifestações extra-articulares: aparecer anos antes das
Afecta todas as
tipo tumor benigno). Tal evento coração, pulmões, SNC, olho, manifestações clínicas).
idades.
leva à libertação de enzimas que músculos, rins, TGI, etc; Outros Auto Ac.:
Fig 27 – Sinovite das gradualmente vão destruindo a - Manifestações inespecíficas - hnRNP;
HLA DRB1 e DR4
mãos, AR, DAI Multi- cartilagem e o osso. As citocinas (febre, anorexia, fadiga, anemia). - RNA Polimerase I;
(80% dos casos).
Sistémicas. libertadas entram em circulação, - NOR.
sendo as responsáveis pelas Laboratório:
manifestações extra-articulares. - Hemograma: anemia
normocrómica e normocítica;
possível trobocitose e eosinofilia.
- Inflamação com aumento das
Síndrome de Sjögren (SS) glândulas salivares; redução da
salivação;
- Inflamação das glândulas Auto Ac. Principias:
lacrimais; olhos secos, com ardor - SS-A (Ro);
e sensíveis à luz; conjuntivite; - SS-B (La) (mais especifico
- Manifestações extra-glandulares: mas menos sensível que SS-
Sobretudo
Etiologia desconhecida. Os auto- envolvimento do SNC (depressão), A);
mulheres na
anticorpos atacam os tecidos envolvimento pulmonar,
proporção 9:1.
epiteliais glandulares (glândulas envolvimento renal (nefrite Outros Auto Ac.:
exócrinas salivares e lacrimais) e intersticial, glomerulonefrite), - RNA Polimerase II e III;
Aparecimento entre
extra-glandulares. envolvimento hepático - sp100;
os 30 e os 60 anos.
esplenomegália, linfoadenopatias, - Centrómero;
úlceras nas pernas; - Centríolo;
- Manifestações inespecíficas - Mitocôndria;
Fig 28– Aumento das (fadiga). - Golgi.
parótidas, SS, DAI Multi-
Sistémicas Laboratório:
- Crioglobulinas (20%).

Auto-Imunidade
Manifestações
DAI Epidemiologia e Auto-anticorpos
Fisiopatologia Clínicas e
Multi-sistémica Associação HLA Presentes
Laboratório
Auto Ac. Principais:
- centrómero (CENP)
- Fenómeno de Raynaud (elevada especificidade);
Limitada Cutânea (mãos e face)
(vasoespasmos dos Outros Auto Ac.:

dedos com inchaço mãos - AMA-M2 (maior
e face de manhã (1º susceptibilidade para
sintoma); CBP);
- Espessamento - Scl70 (raro);
(CREST)
esclerótido da pele; - RNA Polimerase II e III

Desordem do tecido conjuntivo com - Ulceração das (raro);
excesso de depósito de colagénio, impressões digitais; - U1-snRNP;
caracterizada por disfunção endotelial - Decréscimo na - Histonas;
(disfunção vascular, com alteração dos transpiração; - SS-A e SS-B;
vasos), fibrose e atrofia da maioria dos - Telangiectasia - hnRNP;
órgãos. (dilatação dos vasos - RNA helicase II;
superficiais, causando - centríolos;
(sub-divisão consoante a pele afectada)
marcas vermelhas na - Ku (polimiosite com

pele); escleroderma);
Sistémica ou Esclerodermia
Afecta 2 em 1000 000

- Rugas periorais - MSA-2.
Esclerose Progressiva
pessoas.
(“tobacco bag mouth”;
- Depósitos de cálcio na Auto Ac. Principias:
Sobretudo mulheres na - Scl-70 (elevada
pele;
proporção de 4:1. especificidade);
- Envolvimento vascular
de outros órgãos - RNA Polimerase II e III
Raça negra mais (relação com crise renal e
(músculos, ossos, TGI,
(progressão rápida dos dedos para o tronco)
afectada. hipertensão pulmonar);

pulmão, rim, coração),
sobretudo na forma - U1-snRNP;
Sobretudo 40 a 50 anos. - PM-Scl;
difusa.
Muito raro em crianças. -Fibrilharina (U3-nRNP)
CREST: (elevada especificidade,
embora presente em
Difusa Cutânea
- Calcinose cutânea
- Raynaud’s fenómeno menos de 12% dos
- Esofágica, disfunção casos);
(diminuição peristaltismo - RNA Polimerase I
esófago e refluxo Outros Auto Ac:
gastroesofágico) - AMA-M2 (maior
Fig 29 – Depósitos de cálcio nas - eSclerodactilia susceptibilidade para
(espessamento dedeos e CBP);
mãos, Esclerodermia, DAI Multi-
mãos, dobrando os - NOR;
Sistémicas. - centrómero (raro);
dedos)
- Telangiectasia - Histonas;
- SS-A e SS-B;
Laboratório: - hnRNP;
- Níveis do C diminuídos; - RNA helicase II;
- centríolos;
-ku;
-MSA-2.
Fenómeno de Raynaud
Fenómeno de Raynaud Primário (Doença de R):
-Aumento da actividade do SN
- Ataques com 1º palidez;
Simpático;
2º cianose periférica, 3º
- Elevada reactividade vascular dos
rubor das mãos e pés;
dedos a estímulos que conduzem à
- Dor ao fim de alguns
vasoconstrição (exº: frio e stress); O diagnóstico não é feito
ataques;
- Aumento de substâncias vasoactivas Sobretudo mulheres na por auto-anticorpos.
- Parestesias simétricas;
em circulação; proporção de 5:1. Contudo, os seguintes
Fenómeno de Raynaud
- Diminuição da pressão intravascular; podem estar presentes:
secundário (Síndrome
↓ Sintomas geralmente - Scl-70;
de R): associação com
Vasoespasmos das artérias e antes dos 40 anos. - NOR;
outras patologias como
arteríolas. Consequente destruição dos - Centrómero;
LES, AR, SS,
vasos sanguíneos com alteração do Sobretudo em países - Centríolo;
escleroderma e
fluxo sanguíneo, activação plaquetar, frios. - MSA-2;
polimiosite
aumento da fibrinólise, aumento da - Mitocôndria.
- Parestesias
viscosidade e do stress oxidativo.
assimétricas mais
Fig 30 – Necrose do dedo, intensas e dolorosas;
O Fenómeno de Raynaud Secundário
F. Raynaud, DAI - Ulceração e gangrena
advém de outras patologias.
MSSistémicas dos dedos das mãos e
pés

Auto-Imunidade
DAI Epidemiologia e Manifestações Clínicas e Auto-anticorpos

Fisiopatologia
Multi-sistémica Associação HLA Laboratório Presentes
- Fraqueza e dor aguda muscular

Auto Ac.
durante semanas ou meses; por
Principais:
vezes, fraqueza dos músculos
- SRP (elevada
respiratórios;
especificidade; pior
- Manifestações extra-musculares
2 a 8 casos por 1 prognóstico);
Miosites As fibras musculares expressam um mais raras que nas
000 000 pessoas. - Jo-1 (elevada
Polimiosites
MHC-I anormal, o que leva à invasão e dermatomiosites mas podem

(miopatias) activação local de linfócitos T CD8, com ocorrer manifestações cardíacas,
especificidade);
Sobretudo - PL-7, PL-12, EJ e
consequente destruição das fibras artralgias, doença intersticial
mulheres de meia OJ (específicos).
musculares. Uma vez activados, os pulmonar;
idade. Outros Auto Ac.:
linfócitos T produzem citocinas que - (Rara) associação com neoplasia
- SS-A (Ro);
perpetuam a resposta auto-imune. maligna da mama, pulmão ou TGI
Rara em crianças. - gp210;
- PM-Scl (“Overlap
Laboratório:
Syndrome”);
- CK aumento mais de 50x;
- Ku (polimiosite
- Possível aumento de AST, ALT,
com escleroderma).
LDH e aldolase.
Auto Ac.
Principais:
- 1º Rubor e lesões da pele - Mi-2 (específico;
(junções interfalângeas, joelhos e presente em 25%
outros ossos proeminentes, dos casos; associa-
pálpebras, cara, pescoço, peito e se à fase aguda, a
parte dos braços); úlceras digitais, um bom prognóstico
calcificação do tecido submucoso e a uma boa
2 a 8 casos por 1 - 2º Fraqueza e dor muscular resposta
000 000 pessoas. aguda (dias) ou insidiosa (meses); terapêutica);
Activação do complemento e depósito
Dermatomiosites
por vezes, fraqueza dos músculos - Jo-1 (elevada

do complexo C5b-C9 a nível dos
Sobretudo do pescoço, deixando cair a especificidade;
capilares, causando um infiltrado
Fig 31 – Músculo mulheres com uma cabeça, fraqueza dos músculos do presente em 10 a
inflamatório local, com consequente lise
proporção de 2:1. esófago e respiratórios 25% dos casos;
dos capilares e isquémia muscular. As
Estriado destruído, - Manifestações articulares, associado a fibrose
lesões cutâneas demonstram
Afecta tanto pulmonares, cardíacas e renais pulmonar e doença
Miosites, DAI inflamação perivascular com células
adultos, quanto (glomerulonefrite) como resultado severa);
Multi-Sistémicas CD4 na derme.
crianças. da mioglobinúria mantida -SRP (elevada
- Maior risco de desenvolver especificidade;
. neoplasia (30% de incidência) raramente
associado);
Laboratório: - PL-7, PL-12, EJ e
- CK aumento mais de 50x; OJ.
- Possível aumento de AST, ALT, Auto Auto Ac.:
LDH e aldolase. - SS-A (Ro);
- PM-Scl (“Overlap
Syndrome”).
Principais Auto
Muito variadas, mas mais Ac.:
frequentemente: - U1-snRNP (altos
- Fenómeno de Raynaud; títulos; não são
- Inchaço dos dedos; específicos).
Doença Mista do Tecido Síndrome de sobreposição de sintomas - Artrites; Outros Auto Ac.:
característicos de LES, escleroderma e - Miosites; - SS-A (Ro);
Conjuntivo (DMTC) polidermatomiosite, com quadro clínico - Disfunção esofágica; - SS-B (La);
ou Síndrome de Sharp indiferenciado. - Hipertensão pulmonar; - RNA Polimerase II
- Rash cutâneo; e III;
- Envolvimento cardíaco; - hnRNP;
- Geralmente, sem manifestações - RNA Polimerase I:
renais e neurológicas. - RNA Helicase II;
- Actina.

Auto-Imunidade
DAI Epidemiologia e Auto-anticorpos

Fisiopatologia Manifestações Clínicas e Laboratório
Multi-sistémica Associação HLA Presentes
A ocorrência de hemorragia e isquémia em
- pANCA (MPO)
Poliartrite Nodosa (PAN)
qualquer tecido conduz a múltiplas
(raramente);
Afecta sobretudo as artérias de tamanho manifestações clínicas possíveis:
- cANCA (PR3)
médio, mas também algumas de grande -Envolvimento dos nervos periféricos;
Doença muito rara. (raramente).
tamanho. - Envolvimento da pele (púrpura, nódulos
Essa destruição deve-se em parte à sub-cutâneos, Fenómeno de Raynaud,
Atinge os dois sexos e NOTA: Geralmente
presença de linfócitos CD4 e células isquémia digital)
todas as idades de os doentes não
dendríticas nas zonas vasculares. - Possível atingimento de TGI, rins
igual forma. manifestam ANCAs.
Muitas vezes associada a infecções (hematomas sem glomerulonefrite), coração e
virais (HBV, HCV, HIV, CMV, PVB19). SNC
- Manifestações inespecíficas (náuseas,
anorexia, febre, mialgia, artralgia)
- Envolvimento primário dos pequenos vasos
dos rins (desenvolvimento de glomerulonefrite
Poliangite Microscópica
de progressão rápida / crescêntica com

Afecta 20 em cada 1 proteinúria e hematúria) e pulmões (dispneia,
Afecta os pequenos vasos. 000 000 de pessoas. tosse, hemoptises)
Os ANCAs (MPO e PR3) activam os - Possível envolvimento de outros órgãos: - pANCA (MPO) em
(MPA)
neutrófilos para a produção de ROS e Sobretudo homens na pele (púrpura), nervos periféricos, fígado, 70% dos casos;
para a libertação de enzimas líticas, o proporção 2:1.. coração; - cANCA (PR3) em
que conduz à lise do endotélio dos - Manifestações inespecíficas (anorexia, 25% dos casos.
pequenos vasos. Pico de incidência aos febre, artralgia, mialgia)
60-65 anos.
Laboratório:
VASCULITES SISTÉMICAS (inflamação dos vasos)
- Urina: oligúria, proteinúria, hematúria

microscópica, cilindros celulares.
- Necrose dos pequenos e médios vasos;
Granulomatose de Weneger (WG)
- Formação de granuloma nos seguintes

tecidos:
Lesões granulomatosas inflamatórias
. Nariz (crosta, obstrução e hemorragia nasal,
com destruição tecidular local e
sinusite, destruição da cartilagem com - cANCA (PR3) em
procedem depois para uma fase Afecta 12 em cada 1
deformação do nariz); 95% dos casos com
sistémica, afectando os pequenos e 000 000 de pessoas.
. Rim (glomerulonefrite com proteinúria); doença generalizada
médios vasos.
. Pulmão (nódulos difusos, hemorragia e 50% dos casos
Deve-se aos auto-ac anti-PR3 que fazem Sobretudo homens na
alveolar, tosse seca); com doença
as células dendríticas apresentarem proporção 2:1.
- Possível envolvimento do SNC, dos olhos localizada;
MHC 1 aos linfócitos T, que se
(conjuntivite) e pele (úlceras, pápulas); (- Raramente
transformam em Th1. Os Th1 produzem Idade máxima 40 anos.
- Manifestações inespecíficas (febre, pANCA - MPO).
citocinas necessárias à formação do
anorexia, artralgias, miopatias).
granuloma.
Laboratório:
- Urina: proteinúria.
1ª fase: asma e manifestações alérgicas;
2ª fase: hipereosinofilia; os eosinófilos
Síndrome de Churg-
infiltram os tecidos, conduzindo a:

Afecta os pequenos e médios vasos. Afecta 4 em cada 1 000
- Infiltrados pulmonares;
Stauss (CSS)
Os eosinófilos libertam as suas enzimas 000 pessoas.

- Granulomas necrotizantes extravasculares
citotóxicas levando à lesão tecidular. - pANCA (MPO) em
(pele, músculos, TGI, rins, coração)
Nos doentes com auto-anticorpos anti- Idade máxima 50 anos. cerca de 40% dos
- Necrose vascular dos pequenos vasos
MPO, os auto-ac levam à libertação da casos
mieloperoxidase dos neutrófilos, o que Afecta os dois sexos de
Laboratório:
acentua a vasculite. igual modo.
- Hemograma: anemia, eosinofilia;
- IgE aumentada (75%);
- Factor reumatóide positivo (60%).
Doença de Goodpasture
(Doença anti-GBM)
Atinge 1 em cada 1 000

000 de pessoas. - Glomerulonefrite com micro-hematúria e
Presença de auto-anticorpos anti-GBM
falência renal progressiva rápida;
dirigidos contra as cadeias α3 do
Pico de incidência aos - Possível presença de hemorragia pulmonar.
colagénio tipo IV da membrana - Anti-GBM
30 e 70 anos.
glomerular basal dos nefrónios, o que
Laboratório:
causa glomerulonefrite.
Atinge tanto homens, - Urina: micro-hematúria.
como mulheres.
Tabela 10 – Doenças Auto-Imunes Multi-Sistémicas.

Auto-Imunidade
2.2. DAI Específicas de Orgão
DAI Endócrinas Epidemiologia e Auto-anticorpos

Fisiopatologia Manifestações Clínicas e Laboratório
Específicas de Órgão Associação HLA Presentes
Manifestações agudas:
- Aumento do glicogenólise:
hiperglicémia, glicosúria, desidratação,
poliúria, hipotensão, hipoperfusão,
extremidades frias, aumento da
pulsação, possível coma hiperosmolar;
- Aumento da proteólise: amoniémia,
vómito;
A presença de genes de susceptibilidade
- Aumento da lipólise: cetonémia,
ligados ao HLA conduzem à expressão de
acidose metabólica, disrritmias ou
baixos níveis de CD28 nos linfócitos T – uma
enfarto, possível coma cetogénico;
molécula superficial de regulação negativa
- Polidipsia, polifagia, perda de peso;
dos linfócitos T. Assim, surgem em circulação
- ICAs (ac anti-
mais linfócitos T auto-reactivos que atacam as
Manifestações crónicas: células dos
células β dos ilhéus de Langerhans do Manifesta-se na
- Dermopatia diabética (infecções ilhéus);
pâncreas. A destruição destas células expõe idade jovem.
cutâneas frequentes, ulceração, pé - IAAs (ac anti-
Diabetes Mellitus moléculas anteriormente “escondidas” no seu
diabético); insulina);
tipo 1 interior, o que conduz, por sua vez, à Associação a HLA
- Retinopatia diabética (glaucoma, - GAD (ac anti-
formação de auto-anticorpos anti-células β DR3 e DR4, DQ2 e
cataratas, cegueira); descarboxilase
(ICAs) pelos linfócitos B. Estes auto- DQ8.
- Nefropatia diabética (síndrome do ácido
anticorpos vão destruindo ainda mais células
nefrótico, insuficiência renal crónica, glutâmico).
β, com consequente diminuição progressiva
aterosclerose renal, pielonefrites
da síntese de insulina. Quando mais de 80%
frequentes)
das células β estão destruídas, instala-se a
- Macroangiopatia diabética (HTA,
Diabetes Mellitus tipo 1. Estes doentes são,
aterosclerose, claudicação)
portanto, todos insulino-dependentes.
- Neuropatia diabética (parestesias,
obstipação)
Laboratório:
- Sangue: hiperglicémia, HbA1c
aumentada, amoniémia, cetonémia,
acidose metabólica;
- Urina: glicosúria, poliúria, cetonúria.
- Por diminuição da aldosterona:
hipotensão arterial, hiponatrémia com
avidez por sal, hipercaliémia,
Presença de auto-anticorpos (ACAs), por desidratação com possível choque
diminuição de linfócitos T supressores, que hipovolémico e coma;
destroem todos as zonas do cortéx adrenal Afecta 1 em cada - Por diminuição de cortisol:
(supra-renais): zona externa glomerulosa com 8000 pessoas. hipoglicémia, anorexia, perda de
diminuição da produção de apetite, náuseas, vómitos, dor
mineralocorticóides (exº aldosterona), zona Sobretudo homens abdominal, febre, apatia, depressão;
Doença de Addison média fasciculada com diminuição da durantes as - Por diminuição dos androgénios nas
- ACAs (ac. anti-
produção de glucocorticóides (exº cortisol) e primeiras duas mulheres: diminuição da libido e da
Autoimune zona interna reticulada com diminuição da décadas de vida. pilosidade;
córtex adrenal)
(Addison Primário) (altos títulos)
produção de androgénios (exº DHEA, Mulheres após os 40 - Por aumento do ACTH:
androstenediona). Consequentemente, por anos. hiperpigmentação da pele.
feedback, verifica-se aumento da produção de
CRH (hipotálamo) e ACTH (hipófise). Associa-se a HLA Laboratório:
Por vezes a medula adrenal também é B8, DR3 e DR4. - Diminuição da aldosterona,
destruída deixando de haver produção de hiponatrémia, hipercaliémia;
catecolaminas (noradrenalina e adrenalina). - Diminuição do cortisol, hipoglicémia;
- Diminuição da DHEA e
androstenediona;
- Aumento de ACTH

Auto-Imunidade
DAI Hepatobiliares Epidemiologia e Manifestações Clínicas e Auto-anticorpos

Fisiopatologia
Específicas de Órgão Associação HLA Laboratório Presentes
- Icterícia;
- Hepatomegália;
Hepatite tipo1 (80% das
- Dor no quadrante direito acima
50 a 200 casos por 1 HCA):
do abdómen;
000 000 de pessoas. Principais Auto Ac..:
- Anorexia;
- Actina (elevados
- Fadiga;
Sobretudo em títulos).
- Possíveis complicações: ascite,
Inflamação hepática perpetuada no tempo (mais mulheres. Outros Auto Ac.:
hemorragia gastrointestinal,
de seis meses) de origem desconhecida, com - ANAs (DNAss,
Hepatite Crónica cirrose;
presença de auto-anticorpos hepáticos e HAI 1 sobretudo nucleossoma, histonas,
- Hepatite tipo 2 apresenta
Autoimune destruição da arquitectura hepática com fibrose. entre os 15 e 30
sintomas extra-hepáticos
SS-A, SS-B, lâminas A,
1, 2 e 3 A doença progride para cirrose. anos e depois dos B, B2 e C, p80 coilina)
(artralgias, glomerulonefrite,
Agentes ambientais, infecciosos e genéticos 50 anos. HAI tipo 2 Hepatite tipo 2 (10-15%
vitiligo, doença inflamatória
podem estar envolvidos na sua génese. sobretudo em das HAI):
crónica óssea).
crianças (50 a 75%). - LKM-1;
HAI tipo 3 em todas - LC-1.
Laboratório:
as idades. Hepatite tipo 3:
- Elevados níveis de bilirrubina
- SLA;
livre, trasaminases e γ-GT;
- LP.
- PAL ligeiramente aumentada;
- Assintomáticos (60%);
- Icterícia (por aumento da
bilirrubina não conjugada);
- Prurido (por regurgitação dos
sais biliares para o sangue);
- Hipercolestolémia (por
regurgitação do colesterol para o
sangue);
- Dor na zona superior direita do
abdómen; Principais Auto Ac.:
- Hepatoesplenomegália; - AMA-M2 (também M4,
A exposição a factores ambientais (bactérias,
- Fadiga; M8 e M9)
químicos) e factores genéticos diminuem a Sobretudo mulheres
Cirrose Biliar - Esteatorreia; Outros Auto Ac.:
tolerância ao self. Verifica-se infiltração de (mais de 90%).
- Osteopénia ou osteoporose; - gp 210;
Primária linfócitos B e T em torno dos canalículos biliares
- Hipertensão portal; - p80 coilina;
(CBP) do fígado, com consequente colestase e Sobretudo entre os
- Carcinoma hepatocelular; - sp100;
destruição dos hepatócitos com fibrose. A 40 e 60 anos.
- Cirrose; - PML;
doença progride para cirrose.
- Actina (elevados
Laboratório: títulos)
- Elevados níveis de bilirrubina
livre e PAL;
- Ligeiro aumento de
transaminases e γ-GT;
- Aumento dos sais biliares e do
colesterol;
- Aumento do TP;
- Fezes esteatorreicas e claras;
- Urina escura.

Auto-Imunidade
DAI Gastrointestinais Epidemiologia e Manifestações Clínicas e

Específicas de Órgão Associação HLA Laboratório
Gastrite Atrófica Crónica;

- Assintomática por muito
tempo;
Anemia Perniciosa:
- Anemia megaloblástica, com
consequente palidez e fadiga;
A Gastrite Atrófica Crónica - Glossite atrófica, com
Gastrite Autoimune do caracteriza-se por uma infiltração consequente perda de apetite
tipo A (Gastrite Atrófica celular inflamatória (linfócitos, e língua vermelha;
Crónica) granulócitos e plasmócitos) da - Alterações intestinais Gastrite Atrófica Crónica:
e Anemia Perniciosa mucosa gástrica devido à presença (diarreia) por falta de absorção - Ac. anti-células parietais
de auto-anticorpos anti-células da vitB12, com risco (APCA) (presentes em 90%
parietais. Esta reacção inflamatória aumentado para dos casos).
crónica vai aos poucos substituindo Anemia Perniciosa adenocarcinoma gástrico;
as células pépticas e parietais sobretudo - Desmielinização dos Anemia Perniciosa:
gástricas por células mucóides mulheres idosas neurónios por défice de vitB12, - Ac. anti-células parietais
(metaplasia gástrica). do norte da com consequente neuropatia (APCA) (presentes em 90%
Com o tempo, as células parietais Europa. periférica (tremores, dos casos; não presentes
deixam de produzir vitamina B12; diminuição dos reflexos, etc). em doença avançada);
por outro lado, surgem ac. anti-factor - Ac anti-factor intrínseco
Fig 32 – Glossite, Anemia intrínseco (FI) que impedem a Laboratório: (FI) (presentes em 70% dos
perniciosa, DAI Específica síntese gástrica de FI e a - Diminuição do HCl e do casos).
de Orgâo consequente absorção intestinal da pepsinogénio; aumento da
vitamina B12 exógena; desenvolve- gastrina;
se, assim, Anemia Perniciosa. - Hemograma: anemia
megaloblástica,
hipersegmentação neutrófilos,
leucopénia, trombocitopénia
(A. Perniciosa);
- Diminuição da vitB12 (A.
Perniciosa);
- Ac. anti-FI (A. Perniciosa)
A presença de certos HLA conduz a
incapacidade geneticamente - Ac anti-Endomísio EMA
determinada de induzir tolerância -Sintomas gastrointestinais IgA (trata-se dos ac mais
oral à gliadina – uma das fracções (diarreia, flatulência, enjoo, sensíveis 99% e específicos
do glúten, presente no trigo, cevada, vómitos, dor de estômago); 99% para a DC; contudo
Doença Celíaca centeio, aveia. Assim, no intestino - Distúrbios na reprodução têm que se analisar por
(DC) delgado – zona de maior contacto (distúrbios menstruais, IFA);
com a gliadina ingerida – após a sua adolescência atrasada, - Ac. anti-Transglutaminase
absorção na mucosa intestinal, a fertilidade diminuída, perda tTg IgA e IgG
gliadina é desaminada pela enzima fetal); (funcionalmente
Afecta 1 em cada
transglutaminase tecidular do - Distúrbios do sistema semelhantes aos EMA mas
100 pessoas.
endomísio (Tg), o que substitui esquelético e muscular (dor feitos por ELISA – técnica
resíduos de glutamina por resíduos óssea, artrites, nanismo, menos sensíveis 95% e
Actualmente
de ácido glutâmico. Esta destruição dentes, menos específica 90%,
afecta todas as
transformação conduz à formação osteoporose); embora não exija
idades.
de um infiltrado de macrófagos, - Alterações metabólicas visualização subjectiva por
células dendríticas e linfócitos B e T. (anemia, edema, hemorragias, IFA);
Associação HLA
As células APC processam e espasmos); - Ac anti-Gliadina AGA IgA e
DQ2 e DQ8, B8 e
apresentam os péptidos da gliadina - Alterações neuropsíquicas IgG (menos sensíveis 90% e
DR3.
Fig 33 – Intestino aos linfócitos T; por seu lado, os (neuropatia periférica, menos específicos 85% que
sem vilosidades, linfócitos B produzem auto-ac. anti- ansiedade, depressão, os ac Tg, com falsos
gliadina (sobretudo IgA) e ac. anti- epilepsia); positivos de 20% para IgG e
Doença Celíaca,
endomísio (incluem ac específicos - Erupção da pele; 3% para IgA; contudo, são
DAI Específica de contra complexos de gliadina e ac - Manifestações inespecíficas úteis no diagnóstico para
Orgâo anti-transglutaminase). Com o (mal estar, fraqueza, perda de pessoas que não têm ac. Tg
tempo esta reacção inflamatória peso, fadiga, mau e na avaliação da
conduz à destruição das vilosidades temperamento). progressão da patologia)
intestinais, com consequente
malabsorção dos alimentos.

Auto-Imunidade
DAI Neurológicas Epidemiologia e Manifestações Clínicas e Auto-anticorpos

Fisiopatologia
Específicas de Órgão Associação HLA Laboratório Presentes
Activação de linfócitos T
CD4, o que conduz à Atinge 20 em cada
activação de linfócitos B 100 000 pessoas.
com produção de auto- - Fraqueza muscular (músculo
anticorpos contra os Atinge 40% de esquelético), sobretudo durante o
receptores da pessoas com exercício físico, dos seguintes
acetilcolina, impedindo a timoma, com maior músculos:
- Anti-músculo estriado
ligação deste incidência em . Olho;
esquelético (presente
neurotransmissor ao seu mulheres. . Face;
em 80 a 90% dos
Myasthenia gravis receptor. Por outro lado, . Pescoço;
doentes com timoma;
a resposta imunitária Sobretudo na . Respiratórios (pode dificultar a
mau prognóstico);
conduz também à terceira década de respiração e levar à morte);
degradação da vida nas mulheres e . Cintura escapular e pélvica.
acetilcolina e à na terceira e sexta
destruição da fenda pós- década de vida nos Laboratório:
sináptico. Todos estes homens. - Ac. anti-receptores da acetilcolina
factores resultam em
deficiente transmissão HLA B8 e DR3.
neuromuscular.
Epidemiologia
DAI Cutâneas Auto-anticorpos
Fisiopatologia e Associação Manifestações Clínicas
Específicas de Órgão Presentes
HLA
Foliáceo
Pênfigo - Desmogleina 1
Produção de auto-
anticorpos (anti- Sobretudo idades
desmogleinas ou anti-BP) entre os 50 e 60 - Lesão inicial na mucosa orofaríngea;
contra proteínas da anos. Auto ac principal:
- Lesão secundária na pele (bolhas
- Desmogleina 3.
Vulgaris
epiderme, o que resulta flácidas que rebentam formando uma

na perda de adesão Distribuição igual Outros auto ac também
erosão larga e dolorosa), sobretudo
célula a célula. entre sexos. possivelmente
no couro-cabeludo, na cara e tronco;
As desmogleinas são presentes:
- Genitálias e conjuntivas
caderinas – proteínas Atinge uma em - Desmogleina 1.
possivelmente afectadas.
importantes na adesão cada 1 000 000 - Apresentação inicial tipo pápulas ou
celular. pessoas. placas, sobretudo nas extremidades e
Os antigénios BP são dobras, que causam comichão;
Fig 34 – Separação estruturas de adesão que O pênfigo vulgaris é - Aparecimento seguinte de bolhas
Bulhoso
da epiderme, ancoram as células o mais comum. - BP180 (colagénio tipo

sub-epidérmicas, com depósito de
Pênfigo, DAI basais da epiderme à XVII);
autoanticorpos, complemento e
derme. - BP230.
Específica de Orgâo polimorfonucleares na base da
epiderme; consequente separação da
epiderme da derme.
(- Melhor prognóstico)
Tabela 11 – Doenças Auto-Imunes Específicas de Orgão.
Figura 35 – Da esquerda para a direita, pênfigo foliáceo, vulgaris (duas imagens) e bulhoso.

Auto-Imunidade
3. Metodologias Laboratoriais
Em Imunologia a detecção de anticorpos e de antigénios depende sempre da

formação de imunocomplexos (ligação antigénio-anticorpo). Assim, no caso de se
pretender detectar um anticorpo utiliza-se como sonda para investigar a sua presença um
antigénio ao qual o anticorpo se ligue, e vice-versa. Com frequência, o anticorpo ou o
antigénio sonda é fixado a um suporte sólido, permitindo a separação do
imunocomplexo formado dos outros componentes da mistura de ligação. Seguidamente,
determina-se a presença/quantidade do complexo através de uma segunda reacção de
ligação com um reagente marcado.
As técnicas que a seguir se descrevem são utilizadas no Laboratório de

Imunologia do HCC para detectar a presença de auto-anticorpos reactivos no soro do
paciente. A sua pesquisa compreende uma série de procedimentos que diferem em
termos de métodos, sensibilidade, especificidade e correlação com a clínica. Trata-se de
testes úteis em DAI nas seguintes situações:
- Prognóstico das DAI: podem existir auto-anticorpos muito antes de se

manifestar a patologia; assim, sempre que auto-anticorpos são detectados com patologia
ausente deve-se fazer uma avaliação do título do auto-anticorpo em causa de seis em
seis meses e o paciente deverá adoptar medidas que previnam o aparecimento da
patologia;
- Diagnóstico / auxílio no diagnóstico das DAI: só alguns auto-anticorpos

servem de critério de diagnóstico para DAI; contudo, muitos outros podem auxiliar no
diagnóstico clínico;
- Monitorização das DAI: a repetição periódica de alguns auto-anticorpos é um

meio de monitorizar a actividade da doença, o envolvimento de órgãos / a falência
orgânica e a resposta à terapêutica instituída.
Estes métodos permitem actualmente a identificação simultânea de muitos auto-

anticorpos ao mesmo tempo num mesmo ensaio. Assim, por vezes os auto-anticorpos
detectados não são solicitados pelo clínico. Nesse caso, o achado só deverá ser
referenciado se o auto-anticorpo detectado tiver relevância clínica; isto é, se o título for
elevado ou se a presença do auto-anticorpo for critério de diagnóstico de uma DAI. Tal
Auto-Imunidade
é exigido porque a presença de auto-anticorpos nem sempre reflecte a presença de

patologia auto-imune; baixos títulos são frequentes em indivíduos saudáveis, sobretudo
idosos, ou em processos não auto-imunes, como infecções crónicas ou doenças
malignas. Mesmo tendo relevância clínica, o resultado deverá ser sempre confirmado
por um segundo método antes de se dar a informação ao médico. Muitas vezes, possuir
histórico do doente ou alguma informação clínica poderá ajudar na tomada de decisões
acertadas.
Assim, a utilização adequada destes testes é de extrema importância clínica;

contudo, a sua utilização inadequada poderá conduzir a um diagnóstico incorrecto e a
um aumento dos custos no tratamento das DAI. Exige-se, portanto, uma marcha
analítica metódica e rigorosa, executada por pessoal especializado na área.
3.1. Imunofluorescência Indirecta (IFA)
3.1.1. Fundamento
A técnica utiliza lâminas onde estão fixados os antigénios complementares aos

auto-anticorpos que se pretendem detectar. Assim, ao se adicionar à lâmina o soro do
doente (com diluição que varia segundo os auto-anticorpos em pesquisa), no caso dos
anticorpos em pesquisa estarem presentes na amostra, estes ir-se-ão ligar aos antigénios
da lâmina formando um imunocomplexo durante o período de incubação que se segue
em câmara húmida e à temperatura ambiente. Depois, a lâmina é abundantemente
lavada para que os componentes da amostra que não se ligaram à lâmina sejam
removidos. Seguidamente, adiciona-se um segundo anticorpo IgG* dirigido contra um
epítopo da região Fc do anticorpo em pesquisa no soro do doente; este segundo
anticorpo está marcado com um fluorocromo (Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) e o
conjunto “anticorpo-fluorocromo” designa-se por conjugado. Após uma segunda
incubação em câmara húmida à temperatura ambiente que permitirá que o conjugado se
ligue ao imunocomplexo, segue-se uma segunda lavagem para remoção de todos os
componentes que não estão ligados no meio reaccional. Monta-se depois uma lamela
com o auxílio de glicerina. As lâminas podem ser executadas manualmente ou
automaticamente.

Auto-Imunidade
Até serem observadas ao microscópio as amostras deverão ficar no frio numa

câmara húmida, a fim de se conservarem frescas.
Quando excitado com luz aproximadamente a 480-490 nm, o FITC emite

radiação sob a forma de luz por volta dos 530 nm (cor verde). Com o recurso a um
microscópio de fluorescência com um filtro que permita a visualização nesse
comprimento de onda é possível avaliar a presença do auto-anticorpo em pesquisa na
amostra do paciente.
Figura 36 – Esquema ilustrativo de uma reacção de imunofluorescência indirecta em lâmina.
O padrão de ligação dos auto-anticorpos do paciente aos antigénios fixados à

lâmina observado no microscópio de fluorescência (ampliação de 400x) correlaciona-se
com a especificidade particular do auto-anticorpo e com a presença de distúrbios auto-
imunológicos específicos.
Para se evitar falsos resultados, devem-se ter alguns cuidados durante a

execução da técnica:
- As lâminas devem estar congeladas ou refrigeradas conforme as indicações do

kit e devem estar à temperatura ambiente a quando da execução da técnica;
- Não tocar com as pontas das pipetas na lâmina, pois pode danificar o substrato
conduzindo a falsos resultados negativos;
- Os soros devem ser congelados, caso não se efectue a técnica no dia da

colheita;

Auto-Imunidade
- Antes de se iniciar a técnica os soros devem estar à temperatura ambiente e

homogeneizados;
- Verificar o pH da solução tampão;
- Proteger o conjugado e as lâminas após adição do conjugado da luz directa;
- As lavagens devem ser executadas correctamente e o número de vezes

requeridas; uma lavagem não cuidada pode provocar ruptura do substrato ou o
descoloramento do mesmo; lavagens insuficientes podem provocar falsos resultados
positivos, uma vez que o anticorpo do conjugado não é específico para o anticorpo em
pesquisa, podendo ligar-se a qualquer anticorpo presente no meio reaccional;
- Devem respeitar-se os tempos de incubação;
- Entre os diferentes passos da técnica nunca deixar que o substrato seque.
Por outro lado, antigénios mal fixados à lâmina logo durante o fabrico também
poderão conduzir a falsos negativos. A contaminação bacteriana das lâminas é outro
factor que poderá conduzir à visualização de padrões alterados; por exemplo, as células
HEp-2 contaminadas apresentam-se sem conteúdo nuclear, com um forte rebordo
citoplasmático e com algumas membranas que parecem rompidas; é de desconfiar desta
contaminação se no mesmo poçeto se apresentarem dois padrões distintos, sendo um
deles semelhante ao descrito.
A fim de se evitarem falsos resultados, além dos cuidados já descritos, para

cada sessão utiliza-se um controlo positivo e um controlo negativo. Uma amostra é
considerada positiva se o padrão de fluorescência observado for mais intenso que o
controlo negativo da série elaborada. É também importante visualizar-se o resultado no
centro do poçeto da lâmina, uma vez que os bordos podem conter anticorpos
inespecíficos não eliminados por lavagem insuficiente.
3.1.2. Aplicação
As técnicas de imunofluorescência indirecta são geralmente utilizadas como

técnicas de rastreio inicial das DAI, uma vez que são técnicas baratas e geralmente de
elevada sensibilidade, evitando falsos resultados negativos (a excepção são as células de

Auto-Imunidade
Crithidia luciliae, com elevada especificidade e baixa sensibilidade). Para além disso,
apresentam a vantagem de detectar qualquer tipo de auto-anticorpo presente no soro do
paciente (desde que o substrato escolhido seja o adequado) sendo este
identificável/conhecido ou não, tendo sido pedido pelo clínico ou não.
Contudo, exigem pessoal altamente qualificado para a sua interpretação e

exibem baixa especificidade, sendo necessário uma posterior confirmação dos
resultados positivos por outro método mais específico, que evite, portanto, falsos
resultados positivos.
Assim, no Laboratório de Imunologia do HCC quase todos os pedidos de

detecção/quantificação de auto-anticorpos são iniciados com uma técnica de
imunofluorescência indirecta, adequada ao auto-anticorpo em pesquisa. Só no caso
desta inicial técnica de rastreio dar positiva é que o estudo segue com outro tipo de
técnicas mais específicas.
3.1.3. Células e Tecidos Utilizados
3.1.3.1.Células Utilizadas para Ac. Anti-Nucleares (ANA): células HEp-2
O diagnóstico laboratorial das DAI geralmente inicia-se pela pesquisa de auto-

anticorpos dirigidos contra constituintes nucleares das células (ANA). Para esta
pesquisa recorre-se no Laboratório de Imunologia do HCC a células HEp-2.
Trata-se de células tratadas de carcinoma humano da laringe. As células crescem

em monocamada na lâmina de IFA, fornecendo um substrato altamente sensível para a
detecção dos ANA. São células vantajosas para a observação destes auto-anticorpos
uma vez que são de origem humana (maior especificidade do que as células de rato
previamente utilizadas), o seu núcleo é largo (possível observação de detalhes
nucleares) e apresentam uma actividade mitótica elevada, o que permite a observação de
células em todas as fases do ciclo celular. Esta última característica revela-se pertinente
uma vez que, embora quase todos os auto-anticorpos anti-nucleares se visualizem em
interfase, determinados ANA apenas se observam / são mais facilmente observáveis em
mitose – PCNA, centrómero, centríolo, tubulina, NuMa e Midbody.

Auto-Imunidade
A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:160 – título a partir do qual se

poderá considerar clinicamente significativa a presença de ANA por estudos feitos em
pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra
efectuada é necessário realizarem-se sucessivas diluições até que deixe de se observar
fluorescência, a fim de que se dê o título adequado: 1:160, 1:320, 1:640 ou > 1:640. A
titulação dos auto-anticorpos é dada pela maior diluição que ainda apresenta um
resultado positivo. O título é sempre dado comparando a fluorescência da amostra ao
padrão negativo e positivo da série de ensaios realizada.
Consoante o ANA envolvido na DAI, assim o padrão que se observa nestas

células ao microscópio de fluorescência. Estão descritos mais de 35 padrão de IFA
observados com células HEp-2, o que corresponde a mais de 100 auto-anticorpos
diferentes. Alguns padrões são específicos de determinados auto-anticorpos, mas muitos
auto-anticorpos diferentes originam o mesmo tipo de padrão. Por outro lado, o soro do
paciente frequentemente contém diferentes auto-anticorpos que resultam em padrões
mistos. Também é possível que a presença de um determinado padrão não permita a
visualização de outro padrão, que fica como que coberto pelo primeiro.
Para cada amostra dever-se-á também observar se os auto-anticorpos são

positivos em células em divisão celular, identificando-se o padrão como exibindo
cromossomas positivos (se os cromossomas apresentarem fluorescência) ou mitoses
positivas (se os restantes componentes celulares que não os cromossomas apresentarem
fluorescência quando em divisão celular). Esta indicação permite por vezes chegar a
algumas conclusões. Por exemplo, na presença conjunta de um padrão homogéneo e
granular, o primeiro poderá encobrir o segundo; contudo, a presença de mitoses
positivas em metafase é característica do padrão granular, enquanto que a presença de
cromossomas positivos em metafase é característico do padrão homogéneo; assim, se se
observar um padrão homogéneo com cromossomas e mitoses positivas, é provável que
o doente expresse também algum auto-anticorpo que exiba padrão granular. A
confirmação poderá ser feita por diluições sucessivas da amostra, o que permitirá
visualizar o padrão encoberto.
Para certas DAI a presença de determinados ANA é quase certo ou mesmo certo
da existência de patologia; contudo, para outras DAI a relação não é directa. É
importante reter que:
Auto-Imunidade
- Um teste positivo para um ANA raramente é diagnosticante, sendo o

diagnóstico quase sempre feito por critérios clínicos;
- Indivíduos com DAI podem ser ANA negativos;
- Os ANA podem ser positivos em indivíduos sem DAI, sendo que geralmente
estes ANAs não apresentam especificidade antigénica e são de títulos baixos;
- Os resultados dos ANA variam grandemente com o método utilizado na sua

detecção.
A grande vantagem na utilização deste substrato inespecífico para testes tão

importantes como os relacionados com as DAI é o seu valor de rastreio para os ANA.
As células HEp-2 são substratos altamente sensíveis que fornecem informação
qualitativa /semi-quantitativa (título determinado) que deverá ser utilizada como o passo
inicial para uma identificação mais específica e quantitativa dos ANA. Assim, sempre
que um resultado é positivo, o resultado deverá ser confirmado com um segundo teste
mais específico. A escolha do teste a realizar posteriormente é feita consoante o padrão
de fluorescência encontrado.
A visualização de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos também é possível neste

tipo de substrato. Contudo, muitos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos diferentes
podem parecer semelhantes e confundir-se por visualização das células HEp-2. Para a
sua identificação é sempre preferível o recurso a outros substratos mais adequados.
Assim, sempre que na pesquisa de um ANA se visualizam nas células HEp-2 aquilo que
parecer ser um auto-anticorpo anti-citoplasmático com significado clínico, a sua
pesquisa deverá ser feita com recurso a um substrato indicado.
A fim de se contornar um pouco esta limitação da técnica, no HCC recorre-se a

lâminas que incorporam dois tipos de células para cada doente: células HEp-2 para
melhor visualização dos ANA, e tecido de fígado de macaco para melhor visualização
de determinado tipo de auto-anticorpos que deixam algumas dúvidas quando
visualizados nas células HEp-2, tanto anti-nucleares, como anti-citoplasmáticos.

Auto-Imunidade
Figura 37 – Diferentes fases do ciclo celular. Durante a interfase a membrana nuclear está
delimitada, observam-se melhor os nucléolos e os organelos e fibras citoplasmáticos. A mitose inclui:
profase (a condensação do DNA permite a visualização individualizada dos cromossomas; formação do
fuso mitótico com visualização dos centríolos), metafase (rotura da membrana nuclear; cromossomas com
os seus centrómeros no plano equatorial), anafase (cada pare de cromatídeos separa-se pelo centrómero e
inicia a sua migração para pólos equatoriais opostos) e telofase (reconstrução da membrana nuclear em
torno de cada núcleo filho, reaparecimento dos nucléolos, descondensação dos cromossomas). À mitose
segue-se a citocinese, que ocorre na região “midbody”; enquanto a membrana citoplasmática invagina o
“midbody” vai progressivamente sendo constrito, até que desaparece quando se formam as duas células
filhas.
Figura 38 – A célula durante a Interfase. Boa visualização dos nucléolos e das proteínas do
citosqueletos: actina, tubulina, citoqueratina e vimentina; proteínas motoras, como a miosina e proteínas
de ancoragem, como a desmina; organelos e proteínas estruturais, como a clatrina e o Golgi.

Auto-Imunidade
Figura 39 – Estrutura do envelope nuclear. O envelope nuclear mantém a integridade do núcleo

durante a interfase. É constituído, de dentro para fora, por lâmina nuclear, membrana nuclear interna e
membrana nuclear externa. A heterocromatina (condensada) encontra-se perto da lâmina nuclear,
enquanto que a eucromatina (laxa) se encontra no centro do núcleo. Atravessando o envelope nuclear
estão os poros nucleares. O retículo endoplasmático liso é uma extensão do envelope nuclear. Os
ribossomas ligados ao retículo endoplasmático liso constituem o retículo endoplasmático rugoso.
Segue-se a descrição dos padrões observados nas células HEp-2 e no tecido

hepático (sempre que útil) e os auto-anticorpos que lhes poderão estar associados. As
patologias a negrito são as mais significativas para os auto-anticorpos mencionados.

Auto-Imunidade
PADRÕES NUCLEARES COM SIGNIFICADO CLÍNICO
1. Padrão Nuclear Homogéneo
Descrição do Padrão:
Células HEp-2:
Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células em interfase.

Cromossomas positivos em células em mitose (profase, metafase, anafase ou telofase).
Mitoses negativas; isto é, restantes constituintes nucleares que não os cromossomas,
positivos nas células em mitose.
Títulos muito elevados ou amostras envelhecidas podem apresentar mais

fluorescência à periferia do núcleo do que no centro (aquilo a que se chama padrão
Periférico Nuclear).
Este padrão pode encobrir outros padrões não permitindo a sua visualização.
Sempre que se desconfiar disso (por exemplo, se as mitoses estiverem positivas) dever-
se-á diluir a amostra, o que permitirá visualizar o outro padrão no caso deste estar
presente.
Figura 40 – Padrão homogéneo em células HEp-2. À esquerda, cromossomas positivos numa

célula em metafase e noutra em anafase. À direita, cromossomas positivos numa célula em anafase quase
terminada.

Auto-Imunidade
Figura 41 – Da esquerda para a direita, cromossomas positivos em profase, metafase, anafase e

telofase em células HEp-2. A positividade dos cromossomas de células em mitose é característica do
padrão homogéneo.
Tecido hepático de macaco:
Fluorescência difusa uniforme em todo o núcleo das células.
Figura 42 – Padrão homogéneo em tecido hepático de macaco.
Auto-Anticorpos Associados:
 DNAds (cadeia dupla de DNA);

 DNAss (cadeia simples de DNA);
 DNP (“DNA histone complexes” – histonas, sobretudo H2A e H2B;
 Nucleossoma.
Associação Clínica:
 LES;
 LES induzido por drogas;

Auto-Imunidade
 AR;
 Escleroderma;
 Hepatite Autoimune tipo 1.
Figura 43 – São as histonas que permitem o super-enrolamento do DNA. Quando o material

genético é semi-desenrolado verifica-se que só a histona H1 se localiza na zona linear do DNA. As
restantes histonas (H2A, H2B, H3 e H4) mantêm parte do DNA enrolado. O conjunto dessas histonas
(todas excepto a H1) com o DNA designa-se por nucleossoma.
2. Padrão Nuclear Fino Granular
2.1. Scl-70
Células HEp-2:
Destribuição uniforme de grânulos tão finos que por vezes pode parecer padrão
homogéneo em células em interfase. Os nucléolos podem os não estar positivos em
interfase. Durante a mitose o auto-anticorpo associa-se aos cromossomas (cromossomas
positivos, mitoses negativas).

Auto-Imunidade
Figura 44 – Padrão do auto-anticorpo Scl-70 em células HEp-2. Na imagem à esquerda os

nucléolos são negativos enquanto que na imagem à direita são positivos. Em ambas as imagens verifica-
se que o padrão é fino granular nuclear, com cromossomas positivos em células em mitose.
Auto-Anticorpo Associado:
 Scl-70 – Produto funcional da degradação da Topoisomerase I, cuja

função é desenrolar o DNA antes da actuação da DNA Polimerase.
 Escleroderma difusa;
 LES;
 Fenómeno de Raynaud.
2.2. Outros Auto-anticorpos
Células HEp-2:
Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células em

interfase. Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses positivas.

Auto-Imunidade
Frequentemente associado a padrão homogéneo, o que poderá encobrir o padrão

fino granular. Desconfiar da existência de padrão fino granular com homogéneo se as
mitoses forem positivas.
Figura 45 – Padrão fino granular em células HEp-2. Mitoses positivas mas cromossomas
negativos em duas células em metafase.
Distribuição uniforme de grânulos muito finos em todo o núcleo nas células ou

ausência de positividade.
A vantagem do uso deste tecido verifica-se quando pelas células HEp-2 não se
consegue perceber se se trata de um padrão homogéneo ou fino granular (a dúvida surge
sobretudo para títulos baixos de 1:160). Neste caso, se o núcleo das células hepáticas
não apresentar positividade, confirma tratar-se de um padrão fino granular, visto que o
padrão homogéneo é sempre positivo no fígado, enquanto que o padrão fino granular
pode ou não sê-lo.
 SS-A (Ro52 e Ro60) – Duas ribonucleoproteínas de 52 e 60 kDa

associadas a uma das quatro Y-RNAs; está envolvida no processamento
do RNAm. Por vezes desnatura durante a fixação das células HEp-2, não

Auto-Imunidade
sendo possível a sua visualização; uma boa fixação é exigida para a sua
visualização;
 SS-B (La) – Proteína de 48 kDa associada a vários RNAs. Envolvida na
transcrição da RNA polimerase III;
 Mi-2;
 RNA Polimerase II e III;
Figura 46 – Diagrama do complexo SS-A/SS-B. Estes auto-anticorpos estão frequentemente

associados.
 LES Neonatal (SS-A, SS-B);

 Síndrome de Sjögren (SS-A, SS-B, RNA Polimerase II e III);
 Escleroderma Difusa (RNA Polimerase II e III; SS-A; SS-B,);
 Dermatomiosite (Mi-2);
 AR;
 DMTC;
 Miosites;
 Hepatite Auto-Imune tipo 1.
3. Padrão Nuclear Granular
Células HEp-2:

Auto-Imunidade
Distribuição uniforme em todo o núcleo de grânulos médios ou grandes nas

células em interfase, sendo visível o contorno nuclear (o que é importante para a
distinção do padrão matriz). Em células em mitose cromossomas negativos e mitoses
positivas.
Figura 47 – Padrão granular em células HEp-2. Mitoses positivas e cromossomas negativos em

duas células em metafase e em uma célula em anafase.
Distribuição uniforme de grânulos médios ou grossos em todo o núcleo nas

células ou ausência de positividade.
 Sm – Constitui 8 polipéptidos do complexo Sm-U1-snRNP;

 U1-snRNP ou snRNP - “Small nuclear riboproteins”;
Figura 48 – Complexo Sm-U1-snRNP. Este complexo facilita a produção de RNAm maduro.

Auto-Imunidade
Figura 49 – Padrão Sm e/ou U1-snRNP em células HEp-2, visto que estes dois padrões são
indistintos, uma vez que os auto-anticorpos pertencem ao mesmo complexo nucleoproteico.
 LES (Sm – 99% de especificidade, encontrando-se em 20% dos

pacientes com LES, U1/2-snRNP);
 DMTC (U1-snRNP – 95-100%, ausência de Sm);
 Escleroderma (U1-snRNP).
4. Padrão PCNA
Células HEp-2
Padrão fino granular ou granular intensamente fluorescente em cerca de 60% das

células em interfase (fase S e G2). As restantes células em interfase (G1) não exibem
fluorescência. Nucléolos negativos. Mitose e cromossomas negativos em células em
divisão celular.

Auto-Imunidade
Figura 50 – Padrão PCNA em células HEp-2.
 PCNA (Ciclina) – “Proliferating cell nuclear antigen”. A sua produção

aumenta logo antes da fase S do ciclo celular, daí que as células em fase
S apresentem intensa fluorescência. Envolvida na replicação e reparação
do DNA.
 LES (PCNA só aparece em 3-6% de doentes com LES mas é muito

específico para LES) – frequentemente associado a glomerulonefrite.
5. Padrão Matriz Nuclear
Células HEp-2
Nas células em interfase grânulos grandes distribuídos pela zona central no

núcleo; a periferia do núcleo não apresenta fluorescência, não sendo visível o contorno
nuclear (ou contrário do que acontece no padrão granular). Assemelha-se a múltiplos
Auto-Imunidade
dots nucleares mas mais grossos ou a uma rede nuclear esponjosa. Nucléolos negativos
(mas vêem-se os contornos dos nucléolos, o que poderá distinguir este padrão do padrão
centrómeros, em que as células estão em divisão, não se visualizando por isso o
contorno dos nucléolos). Cromossomas negativos em células em mitose. Mitoses
positivas.
Figura 51 – Padrão matriz nuclear em células HEp-2. Reparar no detalhe da imagem à direita que
o contorno nuclear não é nítido, ao contrário do que se passa no padrão granular nuclear.
 hnRNP (A1, A2, B1, B2, C1 e C2) – Proteínas Ribonucleares

heterogéneas. Trata-se de um conjunto de proteínas nucleares insolúveis
resistentes a DNAses, RNAses e tratamento salino.
 LES;
 AR;
 Escleroderma;
 DMTC.

Auto-Imunidade
6. Padrão Membrana Nuclear
Células HEp-2
Fluorescência fina e linear da membrana nuclear presente nas células em

interfase e algumas células em mitose (profase e telofase). Nucléolos negativos. Células
em mitose com cromossomas negativos (distinção do Padrão Periférico Nuclear) e
mitoses positivas.
Figura 52 – Padrão Membrana Nuclear. Observa-se uma célula em telofase em que uma fina
membrana rodeia os dois núcleos jovens das futuras células filhas.
Este padrão é mais facilmente visível no tecido hepático do que nas células HEp-
2, onde se pode por vezes confundir o padrão membranar nuclear com o homogéneo
nuclear. No tecido hepático apenas se visualiza um halo em torno dos núcleos das
células.

Auto-Imunidade
Figura 53 – Padrão membranar nuclear em tecido hepático de macaco.
 Lâmina A, B1, B2, C – Sítios de ancoragem dos cromossomas durante a

interfase.
 LES associado a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);

 Vasculites associadas a outras patologias (distúrbios mistos crónicos);
 Hepatite Autoimune tipo 1.
7. Padrão Poros da Membrana Nuclear
Células HEp-2:
Membrana nuclear com grânulos finos ou mais grossos (tipo dots) nas células
em interfase que se observam focando e desfocando a preparação; é como se a
membrana nuclear apresentasse interrupções; padrão fino granular. Durante a mitose os
cromossomas são negativos e as mitoses são positivas, apresentando um padrão fino
granular denso. Auto-anticorpos anti-mitocondriais estão frequentemente associados
(padrão citoplasmático).

Auto-Imunidade
Figura 54 – Padrão Poros da Membrana Nuclear.
 gp210 – Glicoproteína de 210 kDa que entra na constituição do

complexo proteico que forma o poro nuclear, cuja função é a de permitir
o movimento de substâncias entre o núcleo e o citoplasma da célula;
 Nucleopurina p62 – Apresenta a mesma função que a gp210;
Figura 55 – Diagrama da membrana nuclear e do complexo que constitui o poro nuclear.
 Polimiosite (é raro estar presente);

 Cirrose Biliar Primária (doença mais avançada quando a gp210 está
presente, mas é raro estar presente).

Auto-Imunidade
8. Padrão Nucleolar
Qualquer sub-tipo de padrão nucleolar está geralmemte associado a esclerose

sistémica ou alguma patologia do mesmo forro clínico.
8.1. Padrão Nucleolar Homogéneo:
Células HEp-2:
Nucléolos positivos homogeneamente fluorescentes, associado a um padrão

fraco homogéneo ou fino granular do núcleo nas células em interfase. Em mitose os
cromossomas são negativos.
Por vezes associado a padrão centrómeros.
Figura 56 – Padrão Homogéneo Nucleolar em células HEp-2.
 PM-Scl – Complexo polipeptídico envolvido na biossíntese ribossomal.

Auto-Imunidade
 DMTC (25-50% dos casos), sendo menos frequente nas manifestações

isoladas destas patologias;
 Escleroderma Difusa com envolvimento renal.
8.2. Padrão Nucleolar Clumpy:
Células HEp-2:
Largos grânulos agrupados em cada nucléolo com aspecto homogéneo nas

células em interfase. Geralmente não existe fluorescência do restante núcleo, embora
dots nucleares possam ser visíveis. Em mitose os cromossomas são positivos.
Figura 57 – Padrão Clumpy Nucleolar nas células HEp-2. Visualiza-se uma célula em mitose
com os cromossomas positivos.
 Fibrilharina 1 (U3-nRNP) – Subunidade proteica das pequenas

ribonucleoproteinas nucleolares (snoRNP); envolvida no processamento
do RNA ribossómico.

Auto-Imunidade
 Escleroderma Difusa (presente em 5-10% dos casos, sendo altamente

específico), sobretudo em homens jovens.
8.3. Padrão Nucleolar Fino Granular
Células HEp-2
Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose

visualizam-se raros pontos brilhantes na zona dos cromossomas. Frequentemente
associado a padrão granular no resto do núcleo.
Figura 58 – Padrão Nucleolar Granular em células HEp-2.
 RNA Polimerase I (RNAP I) – Enzima localizada no nucléolo.

Transcreve genes para moléculas precursoras do RNA ribossómico.
Frequente reacção cruzada com RNAP II e III (localização nuclear).

Auto-Imunidade
 Escleroderma Difusa (30% dos casos, sendo altamente específico para

esta patologia), sobretudo com envolvimento cutâneo, dos rins e do
coração;
 LES;
 AR;
 DMTC.
8.4. Padrão Nucleolar Fino Granular com Dots Mitóticos
Células HEp-2:
Nucléolos com padrão granular nas células em interfase. Durante a mitose

visualizam-se vários pontos brilhantes na zona dos cromossomas – local que se designa
por NOR, “Nucleolar Organising Regions” (local onde os nucléolos se organizam
depois da mitose).
Figura 59 – Padrão Nucleolar Granular com Dots Mitóticos em células HEp-2.

Auto-Imunidade
 NORs (RNA Polimerase I, NOR-90 – factor de transcrição da RNA

Polimerase I, ASE-1).
 LES;
 AR;
 Escleroderma;
 Escleroderma com Fenómeno de Raynaud;
8.5. Padrão Nucleolar Granular
Células HEp-2:
Nucléolos com granulação grosseira, podendo parecer homogéneo.
Figura 60 – Padrão nucleolar granular em células HEp-2.
 RNA Helicase II – Responsável pelo enrolamento do DNA.

Auto-Imunidade
 LES;
 Escleroderma;
 DMTC.
9. Padrão Dots Nucleares (NSP1 – “Nuclear Speckled type 1”)
9.1. Poucos Dots Nucleares
Células HEp-2:
Dois a seis dots (pontos) nucleares discretos em células em interfase,

frequentemente perto dos nucléolos. Células em mitose com cromossomas negativos e
mitoses frequentemente negativas.
Geralmente associado a padrões granulares ou nucleolares nucleares ou a

padrões citoplasmáticos (mitocondrial ou actina), embora seja um padrão muito raro.
Figura 61 – Padrão poucos dots nucleares em células HEp-2.

Auto-Imunidade
 p80-coilina – snRNP associado a fibrilarina; maturação do snRNP e seu

transporte do núcleo para o citoplasma.
 Hepatite Autoimune tipo1;

 Cirrose Biliar Primária (30% dos casos) (frequentemente associado a padrão
mitocondrial).
9.2. Múltiplos Dots Nucleares
Células HEp-2:
Mais de seis dots nucleares (geralmente até dez) por cada célula HEp-2 em
interfase, geralmente separados dos nucléolos. Células em mitose com mitoses positivas
mas com cromossomas negativos, o que permite a sua distinção do padrão centrómeros
onde os cromossomas são positivos.
Por vezes associado a padrão mitocondrial.
Figura 62 – Padrão múltiplos dots nucleares em células HEp-2. Nas células em mitose observam-
se cromossomas negativos (ao contrário do que acontece no padrão centrómeros) e mitoses positivas.

Auto-Imunidade
 sp100 – Proteína de função desconhecida;

 PML (“Promyelocytic Leukaemia Protein”).
 Cirrose Biliar Primária (>30% dos casos) (frequentemente associado a

padrão mitocondrial);
 LES;
 Síndrome de Sjögren, sobretudo se associado a Cirrose Biliar Primária;
 Colangite Esclerosante Primária.
10. Padrão Centrómeros
Células HEp-2:
Muitos dots discretos distribuídos por todo o núcleo das células em interfase.
Células em mitose com os cromossomas positivos, mas como que às riscas,
correspondendo à zona dos centrómeros dos cromossomas condensados (característica
única deste padrão).
Figura 63 – Padrão centrómeros em células HEp-2. Para além dos múltiplos dots nucleares em
células em interfase, verifica-se que os cromossomas são positivos mas tracejados (característica única
deste padrão) em células em mitose.

Auto-Imunidade
 Centrómeros (ACA – “anti-centromere antibody”) – Zona central dos

cromossomas. Existem quatro tipos de proteínas centroméricas: CENP-
A, CENP-B (mais frequentes) e CENP-C e CENP-D (mais raras). O
padrão não é visível por existência de auto-anticorpos anti-CENP-F.
Figura 64 – Diagrama ilustrativo da localização das proteínas centroméricas. A localização do

CENP-D não está definida.
 CREST (em 55% dos casos);

 Síndrome de Sjögren (infrequente);
 Esclerose Difusa;
11. Padrão Centríolos/Centrossomas
Células HEp-2:
Em células em interfase visualiza-se um ou dois pontos no citoplasma junto ao

núcleo. Células em metafase exibem dois pontos, um em cada pólo do núcleo.

Auto-Imunidade
Figura 65 – Padrão centríolos em células HEp-2.
 Centríolo / Centrossoma – Conjunto de proteínas (PCM-1, pericentrina,

Cep250) importantes na organização do citosqueleto em interfase; sítio a
partir do qual os microtúbulos se polimerizam para formar o fuso
acromático.
 Síndrome de Sjögren;
 Escleroderma;
NOTAR que muitas vezes este padrão surge após uma infecção viral.

Auto-Imunidade
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS COM SIGNIFICADO CLÍNICO
1. Padrão Mitocondrial
Células HEp-2:
Citoplasma rendilhado, como as contas de um rosário.
Figura 66 – Padrão citoplasmático mitocondrial.
 Mitocôndrias, das quais a M2 (inclui o complexo piruvato desidrogenase – PDC

– e outras proteínas) é a mais frequentemente detectada, mas também se detecta
M3 e M6 (M1 e M5 não são detectados em células HEp-2).
 Cirrose Biliar Primária (95% dos doentes apresentam M2);

 LES induzido por drogas (M3 e M6);
 Síndrome de Sjögren;
 Escleroderma;
Auto-Imunidade
2. Padrão Actina
Células HEp-2:
Finas fibras fluorescentes que atravessam o núcleo e o citoplasma das células.

Frequentemente associado a dots nucleares. Dificilmente visível nestas células, devendo
utilizar-se outro substrato para se confirmar um caso suspeito. Semelhante aos padrões
tropomiosina, vinculina, vimentina e citoqueratina, todos sem significado clínico.
Figura 67 – Padrão Actina nas células HEp-2. Geralmente a imagem ao vivo não é tão evidente
como a aqui ilustrada, sendo facilmente confundida com os padrões tropomiosina, vinculina, vimentina e
citoqueratina.
 Actina – Subunidade dos microfilamentos do citoesqueleto, envolvidos nos

movimentos celulares, como a contracção muscular e movimentos
intracitoplasmáticos.
 Hepatite Auto-Imune tipo 1;

 DMTC;
 Cirrose Biliar Primária.

Auto-Imunidade
NOTAR que apenas títulos elevados são significativos, já que baixos títulos podem
relacionar-se com uma infecção viral (exº: mononucleose).
3. Padrão Jo-1:
Células HEp-2:
Finas granulações dispersas por todo o citoplasma, sendo menos evidentes na

periferia do mesmo e mais evidentes junto ao núcleo.
Difícil de visualizar em células HEp-2. Semelhante aos padrões lisossomal e

peroxissomal, ambos sem interesse clínico.
Figura 68 – Padrão Jo-1 em células HEp-2. Este padrão é por vezes confundido com os padrões
lisossomal e peroxissomal.
 Jo-1 (anti-PL1) – Enzima citoplasmática responsável pela ligação da

histidina ao RNA transferência (sintetase do RNAt).
 Polimiosites (20 a 40% dos casos);

Auto-Imunidade
 Dermatomiosites, mais raramente.

Sobretudo associado a doença intersticial pulmonar.
4. Padrão SRP (“Signal Recognition Particle”)
Células HEp-2:
Citoplasma com padrão fino granular ou granular, sem fluorescência do núcleo ou

nucléolos.
Figura 69 – Padrão SRP em células HEp-2.
 Signal Recognition Particle (SRP) – Complexo ribonucleoproteico que

direcciona proteínas recém-formadas para o retículo endoplasmático; trata-se
de um receptor para os péptidos proteicos localizado no retículo
endoplasmático.
 Polimiosites;
 Dermatomiosites.

Auto-Imunidade
5. Padrão Ribossomal
Células HEp-2:
Citoplasma com padrão fino granular, granular ou quase homogéneo, muito denso
(quase totalmente preenchido), com acentuação perinuclear. Fluorescência nucleolar
com núcleos sem fluorescência.
Figura 70 – Padrão ribossomal em células HEp-2.
 Ribossomais – Três fosfoproteínas ribossomais (P0, P1 e P2) existentes nos

nucléolos e transferidas para o citoplasma. Formam um domínio GTPase
numa subunidade dos ribossomas.
 LES (10-20% dos casos, por vezes sem DNAds), sobretudo com
envolvimento do SNC.

Auto-Imunidade
PADRÕES CITOPLASMÁTICOS SEM SIGNIFICADO CLÍNICO
1. Padrão Complexo de Golgi
Células HEp-2:
Padrão composto por largos grânulos irregulares e polares na parte mais interna do
citoplasma adjacentes a uma parte do núcleo.
Figura 71 – Padrão Complexo de Golgi em células HEp-2.
 Golgi – Conjunto de proteínas com interesse na organização das membranas

do Golgi.
 LES (raramente associado);

 Síndrome de Sjögren (raramente associado).

Auto-Imunidade
2. Padrão Tropomiosina
Células HEp-2:
Fibras citoplasmáticas tipo Actina parecendo manter a célula sob tensão.
Figura 72 – Padrão tropomiosina em células HEp-2.
 Tropomiosina – Associada à actina, sendo importante na contracção muscular.
3. Padrão Vinculina
Células HEp-2:
Fibras citoplasmáticas semelhantes à actina. Nas células em mitose o padrão é

citoplasmático granular, descartando-se, assim, a hipótese de se tratar de uma actina.

Auto-Imunidade
Figura 73 – Padrão vimentina em células HEp-2. Observa-se uma célula em mitose com o
citoplasma granulat, afastando-se a hipótese de se tratar de uma actina.
 Vinculina – Proteína localizada nas junções aderentes, sendo importante na

ligação dos microfilamentos à membrana celular.
4. Padrão Vimentina
Células HEp-2:
Abundante quantidade de fibras citoplasmáticas, que parecem ligar-se à membrana

nuclear e citoplasmática.
Figura 74 – Padrão Vimentina em células HEp-2.

Auto-Imunidade
 Vimentina – Filamento do citosqueleto de função desconhecida.
5. Padrão Citoqueratina
Células HEp-2:
Filamemtos citoplasmáticos de forma reticular nas células em interfase. Nas células

em mitose os filamentos partem-se, apresentando aspecto granular.
Figura 75 – Padrão Citoqueratina em células HEp-2.
 Citoqueratina.
6. Padrão Desmina
Células HEp-2:

Auto-Imunidade
Finos filamentos citoplasmáticos que parece formarem uma malha de suporte à

maquinaria contráctil da célula. Mitoses positivas em células em mitose.
Figura 76 – Padrão Desmina em células HEp-2.
 Proteína filamentosa tipo III
7. Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto
Células HEp-2:
Extensões fibrosas curtas do citoplasma das células, ligando os filamentos do

citosqueleto à membrana plasmática da célula e à matriz extracelular de células
vizinhas.
Figura 77 – Padrão Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto em células HEp-2.

Auto-Imunidade
 Proteínas de Ancoragem do Citosqueleto (Tensina, Paxilina, Zixina) – Proteínas

importantes na adesão celular, na morfogénese, na motilidade celular e na
regulação de estruturas membranares.
8. Padrão Lisossomal
Células HEp-2:
Granulação grande e irregular distribuída por todo o citoplasma.
Figura 78 – Padrão Lisossomal em células HEp-2.
 Anticorpos anti-lisossomais.
9. Padrão Peroxissomal
Células HEp-2:

Auto-Imunidade
Granulação fina e uniforme distribuída aleatoriamente no citoplasma.
Figura 79 – Padrão Peroxissomas em células HEp-2.
 Desconhecidos.

Auto-Imunidade
Patologia(s)
Auto-Ac Nuclear Padrão Nuclear Outras Patologias Outras Situações
de Maior Interesse
Homogéneo
DNAds LES AR Tratamento com TNFα
(cromossomas +)
DNAss e Homogéneo LES; Hepatite Auto-Imune
Tratamento com TNFα
Nucleossoma (cromossomas +) 1
Homogéneo LES induzido por LES; Escleroderma;
DNP (histonas) Tratamento com TNFα
(cromossomas +) drogas Hepatite Auto-Imune 1
Fino Granular
Escleroderma LES; CREST; Fenómeno de
Scl-70 (nucléolos +/-;
Difusa Raynaud;
cromossomas +)
LES; Escleroderma;
Fino Granular Doenças Sistémicas;
SS-A (Ro) LES Neonatal; SS Miosites; DMTC; Hepatite
(mitoses +) Paragem Cardíaca
Autoimune 1
LES; Escleroderma;
Fino Granular Doenças Sistémicas;
SS-B (La) LES Neonatal; SS DMTC; Hepatite
(mitoses +) Paragem Cardíaca
Autoimune 1
RNA Polimerase Fino Granular Escleroderma LES; AR; SS; CREST;
II e III (mitoses +) Difusa DMTC
Fino Granular
Mi-2 Dermatomiosite
(mitoses +)
Granular
Sm LES
(mitoses +)
Granular
U1-snRNP DMTC LES; Escleroderma
(mitoses +)
Fino Granular /
Hepatite Crónica B ou C;
PCNA Granular (interfase + /-; LES
Linfomas
mitoses +)
Matriz LES; AR; Escleroderma;
hnRNP
(mitoses +) DMTC
LES; Vasculites associadas Trombocitopénia; Anemia;
Lâmina A, B, Membranar Nuclear
a outra patologia; Hepatite Síndrome de Cansaço
B2, C (mitoses +)
Auto-Imune 1 Crónico
gp210 e Poros Membrana
Polimiosite; Cirrose Biliar
nucleopurina Nuclear
Primária
p62 (mitoses +)
Escleroderma Difusa com
PM-Scl Nucleolar Homogéneo DMTC
envolvimento renal
Fibrilharina 1 Nucleolar Clumpy Escleroderma
Carcinoma Hepatocelular
(U3-nRNP) (cromossomas +) Difusa
Nucleolar Fino
RNA Polimerase Granular Escleroderma
LES; AR; DMTC
I (poucos dots nos Difusa
cromossomas)
Nucleolar Fino
LES; AR; Escleroderma
Granular com Dots Neoplasias (sobretudo
NOR Difusa; Fenómeno de
(muitos dots nos hepatocelular)
Raynaud
cromossomas)
Ectasia Gástrica Vascular
RNA Helicase II Nucleolar Granular LES; Escleroderma; DMTC
Antral
Hepatite Crónica
NSP1 (poucos dots
p80-coilina Autoimune 1; Cirrose Biliar Doença Viral Hepática
nucleares)
Primária
NSP1 (muitos dots
Cirrose Biliar LES; SS; Colangite
sp100 e PML nucleares)
Primária Esclerosante Primária
(mitoses +)
ACA Centrómeros SS; Esclerose Difusa;
CREST
(centrómeros) (cromossomas + riscas) Fenómeno de Raynaud
SS; Escleroderma; Infecção viral (EBV,
Centríolo Centríolo
Fenómeno de Raynaud CMV); Diversas Afecções
LES; Polimiosite com
Ku Ku
Escleroderma
Escleroderma; Fenómeno de
MSA-2 Midbody Estado Inflamatório
Raynaud;
Tabela 12– Resumo dos ANAs clinicamente significativos. A azul apontam-se as patologias para as quais
os ANAs são específicos.
Auto-Imunidade
Auto-Ac Padrão
Patologia Interesse Outras Patologias Outras Situações
Citoplasmático Citoplasmático
LES; SS;
Mitocôndrias Cirrose Biliar Escleroderma;
Mitocondrial
(M2; M3; M6) Primária Fenómeno de
Raynaud;
Hepatite Autoimune DMTC; Cirrose
Infecção viral (baixos
Actina Actina 1 Biliar Primária
títulos)
(elevados títulos) (elevados títulos)
Polimiosite;
Dermatomiosite,
Jo-1 Jo-1
sobretudo com
fibrose pulmonar
Polimiosite;
SRP SRP Dermatomiosite
(rara associação)
Ribossomal Sintomas
Ribossoma LES
(nucléolos +) Neuropsiquiátricos?
Doenças Crónicas
Reumáticas;
Desgenerescência
Golgi Golgi LES; SS
(Esclerose Múltipla);
Ataxia Cerebral;
Neoplasias
Tabela 13– – Resumo dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos clinicamente significativos. A

azul apontam-se as patologias para as quais os auto-anticorpos anti-citoplasmáticos são específicos.
3.1.3.2.Células Utilizadas para Ac. Anti-DNAds: células Crithidia luciliae
Os auto-anticorpos anti-DNAds são específicos para o LES, raramente estando

presentes em doentes com outras DAI. O título destes auto-anticorpos está directamente
relacionado com a actividade da doença, tendendo a desaparecer durante os tratamentos
imunossupressores e durante a remissão clínica, daí a sua importância para o
diagnóstico e monitorização clínica. Outros auto-anticorpos presentes no LES não são
específicos da patologia podendo manifestar-se noutras doenças, ou o seu título não se
relaciona com o estado da doença.
As células HEp-2 podem ser utilizadas para a pesquisa de auto-anticorpos anti-

DNAds, como já referido, mas os padrões raramente são específicos. O padrão
homogéneo, característico dos auto-anticorpos anti-DNAds, também ocorre para os
auto-anticorpos anti-DNAss, anti-histonas e anti-nucleossoma – auto-anticorpos que não
só se podem manifestar no LES como em outras patologias. Assim, sempre que o
clínico faz um pedido específico de auto-anticorpos anti-DNAds, em vez de se recorrer
às células HEp-2 como substrato de imunofluorescência indirecta, no HCC recorre-se às
lâminas com Crithidia luciliae.

Auto-Imunidade
A Crithidia luciliae é um protozoário unicelular e uniflagelado que apresenta

uma mitocôndria gigante – o cinetoplasto – que contém apenas elevadas quantidades
DNAds, e não DNAss, histonas ou nucleossoma. Assim, recorrendo-se a este organismo
como substrato antigénico da imunofluorescência indirecta, no caso do cinetoplasmo
apresentar fluorescência garante-se a presença de auto-anticorpos anti-DNAds no soro
do doente. Trata-se, portanto, de um ensaio altamente específico para a pesquisa destes
auto-anticorpos (95%), embora pouco sensível (70%).
Para além do cinetoplato, o protozoário apresenta um núcleo, onde se pode

encontrar tanto DNAds, como outro tipo de material genético. Assim, se o núcleo
apresentar fluorescência o resultado não é necessariamente positivo para DNAds. Não é
também invulgar a zona de inserção do flagelo brilhar, podendo este brilho confundir-se
com o cinetoplasto. Assim, importa, esclarecer que só se o cinetoplasto brilhar,
independentemente do núcleo ou zona de inserção do flagelo brilharem ou não, o
resultado é positivo para DNAds.
Se 2/3 dos cinetoplastos das células da lâmina apresentarem fluorescência o

resultado é dado como positivo; se apenas 1/3 brilhar o resultado é dado como negativo;
se 1/2 brilhar é conveniente repetir o ensaio.
A amostra do doente é inicialmente diluída de 1:10 – título a partir do qual se

poderá considerar clinicamente significativa a presença de DNAds por estudos feitos em
pessoas saudáveis. No caso do resultado ser positivo para a diluição da amostra
efectuada poder-se-iam efectuar diluições sucessivas até que se deixasse de observar
fluorescência, a fim de se obter uma quantificação semi-quantitativa do DNAds. No
entanto, sempre que um resultado é positivo por imunofluorescência indirecta, dado a
elevada relação entre os títulos de DNAds e a actividade do LES, opta-se no HCC por
se fazer uma posterior quantificação rigorosa por métodos de ELISA.
Base de inserção do
flagelo
Cinetoplasto (só Flagelo

DNAds)
Núcleo
Figura 80 – Esquema representativo do protozoário Crithidia luciliae. O cinetoplasto localiza-se

no terço superior da Crithidia luciliae, quase junto à zona de inserção do flagelo. O núcleo, de maiores
dimensões, localiza-se numa zona mais inferior do organismo.

Auto-Imunidade
Figura 81 – À esquerda, imagem de um resultado positivo para DNAds; verifica-se fluorescência

em todos os cinetoplastos das células de Crithidia luciliae (o núcleo e a zona de inserção do flagelo
também brilham, neste caso). À direita, resultado negativo; geralmente a zona de inserção do flagelo
brilha quando os resultados são negativos.
3.1.3.3.Tecidos Utilizados para Ac. Anti-Citoplasmáticos
Para a pesquisa de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos as células HEp-2 não

constituem o substrato ideal. O ideal é recorrer a tecidos onde geralmente se encontrem
os auto-anticorpos que se pretende identificar. Isto é, por exemplo, se se pretender
averiguar a presença de auto-anticorpos anti-células parietais deve utilizar-se como
substrato tecido gástrico, onde se encontram as células parietais.
O tecido utilizado poderá ser de rato ou de macaco. O tecido de rato apresenta a

desvantagem de não ter uma homologia elevada em relação ao tecido humano, o que
significa que a ligação “antigénio do tecido de rato – IgG do soro do paciente” não é
perfeita; pode, portanto, verificar-se a ligação de anticorpos inespecíficos (heterófilos)
humanos aos antigénios do tecido do rato, o que conduzirá a falsos resultados positivos
(fluorescência inespecífica). O tecido de macaco, por apresentar elevada homologia com
o humano, garante que só as IgG do soro do paciente elevadamente complementares aos
antigénios do tecido de macaco se liguem; observa-se, assim, menos fluorescência de
fundo inespecífica.
Tecido hepático, renal e estomacal constituem os substratos tradicionais para a

pesquisa inicial de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos, onde se pode avaliar a presença
destes auto-anticorpos mais frequentes e com maior significado clínico.

Auto-Imunidade
No HCC, sempre que é feito um pedido de pesquisa de auto-anticorpos anti-

citoplasmáticos, recorre-se a um kit que apresenta em cada poçeto da lâmina seis tecidos
diferentes: células Hep-2, tecido hepático de macaco, tecido hepático de rato, tecido
renal de rato, tecido gástrico de rato e células VSM47.
Cada amostra é diluída a 1:40 e, depois de se realizar a técnica de

imunofluorescência indirecta, a amostra é avaliada em cada um destes seis tipos de
tecidos. A fluorescência que o conjunto dos seis tecidos apresentarem irá permitir
identificar o auto-anticorpo anti-citoplasmático eventualmente presente. No caso de se
verificar a presença de um ANA nas células HEp-2, tal também é mencionado ao
clínico.
Para cada um dos auto-anticorpos anti-citoplasmáticos com interesse clínico,

segue-se a descrição do padrão de fluorescência característico para cada tecido negativo.

Auto-Imunidade
Células HEp-2 Tecido hepático

de macaco
Tecido renal Tecido hepático de

de rato rato
Tecido gástrico
de rato Células VSM47
Células parietais
Trabéculas
Muscularis
mucosa
Figura 82 – Esquema que ilustra a posição dos seis tipos de tecidos em cada poçeto da lâmina.
As imagens correspondem aos tecidos sem fluorescência (negativos).

Auto-Imunidade
1. Auto-Anticorpos Anti-Mitocondriais (AMA)
Os auto-anticorpos anti-mitocondriais (AMA) constituem a marca de uma

Cirrose Biliar Primária. 95% dos pacientes com esta patologia apresentam elevados
títulos destes anticorpos.
De entre os nove tipos de AMA existentes (M1 a M9), os auto-anticorpos anti-

M2 contra o complexo enzimático da desidrogenase láctica são os mais importantes,
uma vez que estão presentes em cerca de 96% dos casos de Cirrose Biliar Primária,
estando presentes em não mais de 30% de outras patologias hepáticas crónicas. Para
além dos M2, também os auto-anticorpos anti-M4, M8 e M9 se associam à mesma
patologia, embora estejam presentes numa menor percentagem de casos.
Os títulos de AMA não se correlacionam com o estadio da doença ou com o seu

prognóstico, não tendo, por isso, significado a sua quantificação.

Auto-Imunidade
AMA Patologias Associadas Prevalência
LES 50%
M1
AR, Esclerose Sistémica, S. Sjögren, S.
5 – 15%
Sharp
Cirrose Biliar Primária > 96%
M2 Outras doenças crónicas hepáticas 30%
Esclerose Sistémica 7 – 25%

Síndrome Pseudo-Lúpus; LES induzido
M3 100%
por drogas
M4 Cirrose Biliar Primária > 55%
M5 Doenças do Colagénio raro

Hepatite induzida por iproniazida; LES
M6 100%
induzido por drogas
Miocardite aguda 60%
M7
Cardiomiopatias 30%
M8 Cirrose Biliar Primária > 55%
Cirrose Biliar Primária 37 – 82%

M9
Hepatites 3 – 10%
Tabela 14 – Associação Clínica e prevalência dos diferentes auto-anticorpos anti-mitocondriais

(AMAs).
Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de

tecidos para os AMA.

Auto-Imunidade
Padrão
citoplasmático
rendilhado
Tecido renal
de rato
Glomérulo
negativo
Hepatócitos com
Túbulos com fluorescência
fluorescência granular granular
basal
Tecido gástrico Células VSM47

de rato
Células parietais
positivas
Trabéculas
negativas
Muscularis
Padrão
mucosa citoplasmático
rendilhado
negativa
Figura 83 – Padrões de fluorescência caraterísticos para os AMA. Células HEp-2 e VSM47

com padrão citoplasmático rendilhado, fazendo lembrar um rosário; não é invulgar a associação deste
padrão citoplasmático com a presença de dots nucleares nas células HEp-2, também característico de
Cirrose Biliar Primária. Tecidos hepáticos com o citoplasma dos hepatócitos com padrão granular
(muitos pontinhos). Tecido renal com túbulos com fluorescência granular (sobretudo os distais, embora
na prática, não dê para distinguir e todos pareçam brilhar); brush border (contorno interno dos túbulos)
negativa; glomérulos com fraca ou nenhuma fluorescência. Tecido gástrico com células parietais
positivas; muscularis mucosa negativa; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares)
negativas.
155 |
Auto-Imunidade
2. Auto-Anticorpos Anti-Músculo Liso (ASMA)
Existem vários tipos de fibras que constituem o músculo liso: fibras de actina,
vimentina, vinculina, desmina, citoqueratina, tubulina, entre outras. Os auto-anticorpos
dirigidos contra este tipo de células designam-se, na sua generalidade, por ASMAs.
ASMAs em elevados títulos encontram-se presentes em cerca de 90% dos

pacientes com Hepatite Autoimune tipo I. Contudo, à excepção dos auto-anticorpos
anti-actina, os restantes ASMAs são inespecíficos, podendo encontrar-se em inúmeras
diferentes patologias reumáticas e doenças inflamatórias, bem como em indivíduos
normais.
Assim, só os auto-anticorpos anti-actina apresentam interesse no diagnóstico da

Hepatite Autoimune tipo 1 e se presentes em títulos elevados (> 1:40) são suficientes
como critério de diagnóstico. Por isso, é importante semi-quantificar títulos positivos de
ac. anti-actina em 1:40 ou > 1:40, observando particularmente as células VSM47 – o
substrato ideal para visualizar estes anticorpos.
Na figura seguinte descrevem-se os padrões característicos dos seis tipos de

tecidos para os auto-anticorpos anti-actina.

Auto-Imunidade
Vasos com média

intensamente
corada
Padrão
citoplasmático
fibroso
Tecido renal de rato
Hepatócitos com
Glomérulos áreas forma poligonal
positivos peritubulares por coloração
positivas canalicular
Tecido gástrico de rato Células VSM47
Muscularis mucosa positiva
média positiva
íntima negativa
Trabéculas positivas
Células parietais negativas Vasos de tecido gástrico de rato
Figura 84 – Padrões de fluorescência característicos para os anticorpos anti-actina. Células HEp-2 com fibras no
citoplasma que atravessam o núcleo; este substrato não é específico para Ac. anti-actina, podendo confundir-se com outros
ASMAs. Tecido hepático com coloração da actina dos canalículos que rodeiam os hepatócitos, conferindo contornos
poligonais aos hepatócitos (diagrama artificial na imagem); vasos com a média intensamente corada. Tecido renal negativo;
para títulos elevados pode existir reacção cruzada com a tubulina do glomérulo (glomérulos positivos) e as áreas
peritubulares podem apresentar fluorescência às pintinhas ou mesmo tipo espículas (diagrama artificial na imagem). Tecido
gástrico com a Muscularis mucosa positiva; trabéculas (fibras contrácteis de actina inter-glandulares) positivas; células
parietais negativas; vasos com a íntima (dentro) negativa e a média intensamente positiva. Células VSM47 (substrato ideal
para os ac. anti-actina) com fibras citoplasmáticas marcadas que atravessam o núcleo da célula; o mesmo não se verifica para
os restantes ASMAS.
Auto-Imunidade
3. Auto-Anticorpos Anti-Microssomais (LKM – “Liver & Kidney

Microssomes”)
Os auto-anticorpos anti-microssomais são invulgares, podendo encontrar-se em

vários tipos de hepatites; são úteis para a classificação da patologia hepática.
Embora também possa estar presente em caso de hepatite C, o LKM-1 é

considerado o marcador de Hepatite Autoimune tipo II; os ANA e ASMA são
geralmente negativos para este tipo de hepatite autoimune. O LKM-2 está presente em
caso de hepatite induzida por ácido tienílico (fármaco já retirado do mercado). O LKM-
3 manifesta-se nalguns pacientes com Hepatite Autoimune II e hepatite crónica D. Os
títulos de LKM em hepatites virais tendem a ser mais baixos que os títulos presentes em
hepatites autoimunes.
Qualquer tipo de LKM conduz à fluorescência do tecido hepático (L=liver) e

renal (K=kidney). Contudo, diferentes LKMs conduzem a diferentes tipos de padrões de
fluorescência nestes dois tecidos.
A figura que se segue evidencia o padrão característico do LKM-1 nos seis

tecidos diferentes utilizados, uma vez que este é dos três o LKM com maior interesse
clínico.

Auto-Imunidade
Negativas
Tecido renal
de rato
Túbulos distais
negativos
Túbulos proximais
positivos
Hepatócitos com
citoplasma
positivo e núcleo
negativo
Brush border dos Células VSM47

túbulos proximais
positiva
Tecido gástrico
de rato
Células parietais
negativas
trabéculas
Muscularis negativas
Negativas
mucosa
negativa
Figura 85 – Padrões de fluorescência característicos para o LKM1. Tecido hepático com o

citoplasma dos hepatócitos completamente fluorescente (mais ainda que o padrão granular
característico das M2); núcleo negativo. Tecido renal com glomérulos negativos e apenas alguns
túbulos positivos - os túbulos proximais e, portanto, os túbulos mais largos, embora a diferenciação seja
difícil de se fazer. Brush border (contorno interno) dos túbulos proximais fortemente positiva (em
pormenor em baixo do tecido renal). Células HEp-2, células VSM47 e tecido gástrico negativos.
Auto-Imunidade
4. Auto-Anticorpos Anti-Células Parietais (APCA)
Os auto-anticorpos anti-células parietais estão presentes em quase todos os

doentes que apresentam Gastrite Autoimune do tipo A – Gastrite Atrófica Crónica – e
em cerca de 90% dos doentes com Anemia Perniciosa, sendo úteis no diagnóstico
destas patologias. A presença de auto-anticorpos anti-células parietais vai diminuindo
com a progressão da patologia, daí poderem estar ausentes em alguns casos de doença
avançada.
Contudo, estes auto-anticorpos também estão frequentemente presentes em

várias endocrinopatias (exª Tiroidite de Hashimoto, Doença de Graves, Diabetes
Mellitus) e até em indivíduos saudáveis, apresentando, portanto baixa especificidade.
Como tal, o diagnóstico da Gastrite Atrófica Crónica e Anemia Perniciosa deverá
sempre incluir também a pesquisa da presença de auto-anticorpos anti-factor intrínseco.
A figura que se segue evidencia o padrão característico destes auto-anticorpos

nos seis tecidos diferentes utilizados.

Auto-Imunidade
Tecido renal
Tecido gástrico
Células parietais
positivas Células VSM47
Muscularis mucosa
negativa
Trabéculas negativas
Figura 86 – Padrões de fluorescência característicos para os auto-anticorpos anti-

células parietais (APCA). Só o citoplasma das células parietais do estômago apresenta
positividade (padrão granular). Todas as outras estruturas do tecido gástrico e todos os outros
tecidos são negativos. Contudo, é importante a sua observação (sobretudo das restantes
estruturas gástricas e da brush border do tecido renal) devido à possível presença de anticorpos
heterófilos. Assim, se as células parietais brilharem tanto quanto a Muscularis mucosa no
estômago ou a brush border nos túbulos renais, não se deverá considerar o resultado como
positivo. Também não se deverá considerar uma amostra como positiva se for o núcleo, e não
o citoplasma, das células parietais a apresentar fluorescência; se tal acontecer provavelmente
estra-se-à na presença de um ANA ou de um anticorpo heterófilo.

Auto-Imunidade
3.1.3.4.Tecidos Utilizados para Auto-Anticorpos Específicos
1. Auto-Anticorpos Anti-Ductos Salivares
Os auto-anticorpos dirigidos contra o citoplasma das células epiteliais das

glândulas salivares estão presentes em cerca de 50% dos pacientes com Síndrome de
Sjögren e menos frequentemente em pacientes com AR (20%), LES (20%) e outros
tipos de DAI. O seu significado clínico é, contudo, incerto. Outros tipos de auto-
anticorpos frequentemente coexistem, como ANAs (SS-A e SS-B).
O tecido eleito para a sua pesquisa é de glândula paratiroideia de macaco, sendo

este o tecido utilizado no kit executado no HCC. A imagem que se segue ilustra o
padrão característico.
Figura 87 – Padrão de fluorescência característico para auto-anticorpos anti-ductos salivares.
Os auto-anticorpos ligam-se a grânulos no citoplasma das células epiteliais dos

ductos salivares, particularmente do lado do lúmen, mas não às células dos ácinos.
Como os doentes frequentemente têm ANAs associados, é possível que o núcleo das
células também apresente fluorescência.

Auto-Imunidade
2. Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de Langerhans (ICAs)
Os auto-anticorpos anti-ilhéus de Langerhans no pâncreas são geralmente

encontrados em doentes com Diabetes Mellitus tipo 1, estando envolvidos na
patogénese da doença. Estão presentes em 70 a 80% dos diagnósticos de novo da
Diabetes Mellitus tipo 1, sobretudo em crianças e desaparecem ao fim de algum tempo
após o diagnóstico. Alguns parentes dos doentes também apresentam estes auto-
anticorpos.
Para pesquisa dos ICAs utiliza-se no HCC pâncreas de macaco. A figura

seguinte ilustra um resultado positivo.
Figura 88 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-ilhéus de

Langerhans em pâncreas de macaco.
Existem vários tipos de anticorpos que se podem utilizar. Os da figura são

anticorpos dirigidos contra todo o ilhéu (células β, α e δ). No HCC, os anticorpos
utilizados são apenas dirigidos contra as células β; assim, a fluorescência não é tão
abrangente resumindo-se a conjuntos de cerca de 3 a 4 células.

Auto-Imunidade
3. Auto-Anticorpos Anti-Supra-Renais (ACAs)
Os auto-anticorpos anti-glândulas supra-renais (adrenais) estão na origem de

cerca de 60 a 80% dos casos de Doença de Addison Primária, em que estes auto-
anticorpos destroem todo o córtex adrenal, instalando-se, assim, insuficiência cortico-
supra-renal global.
Os auto-anticorpos contra o córtex adrenal são detectados em cerca de 80% dos

pacientes com Doença de Addison, não se correlacionando com a evolução clínica da
doença.
Para pesquisa destes auto-anticorpos o HCC recorre a um kit com tecido de

córtex adrenal de macaco. A imagem seguinte ilustra um resultado positivo.
Cápsula de tecido
conjuntivo
Zona glomerulosa
(aldosterona)
Zona fasciculada
(cortisol)
Figura 89 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-supra-renais em

córtex adrenal de macaco.
Verifica-se fluorescência, de fora para dentro da glândula, na zona glomerulosa e

na zona fasciculada do córtex adrenal. O corte também inclui a zona reticulada (não
visível na figura); fluorescência nessa zona obriga ao despiste da presença de AMA, que
conferem um padrão semelhante (granular a fino granular) nessa zona.

Auto-Imunidade
4. Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)
O endomísio é uma estrutura de suporte, que rodeia as fibras de músculo

estriado e liso de uma parte do esófago, sendo constituído por reticulina e colagénio. Os
auto-anticorpos dirigidos contra esta estrutura (EMA) encontram-se em várias partes do
corpo humano, como a nível do esófago, estômago, jejuno e fígado.
Os EMA da classe IgA (e raramente da classe IgG e IgM) são altamente

específicos (99%) para doentes com Doença Celíaca não tratada e Dermatite
Herpetiforme de Duhring (geralmente associada com enteropatia sensível ao glúten). A
sua sensibilidade também é elevada (99%), uma vez que raramente são detectados em
indivíduos saudáveis e em doentes com outras patologias intestinais. Revelam-se,
portanto, muito úteis no diagnóstico destas patologias.
Para avaliação da presença dos EMA recorre-se no HCC a um kit que utiliza
como substrato esófago de macaco – tecido onde é mais fácil de interpretar o resultado
do que no estômago. O kit detecta em simultâneo IgA, IgG e IgM.
A figura seguinte ilustra um resultado positivo.
Epitélio negativo
Endomísio positivo
(ninho de abelha)
Muscularis
mucosa negativa
Figura 90 – Padrão de fluorescência característico dos Auto-Anticorpos Anti-Endomísio (EMA)

em esófago de macaco.
O endomísio brilha, apresentando a forma característica de um ninho de abelha.

Localiza-se internamente ao epitélio da membrana mucosa e rodeando a camada de
fibras de músculo liso e estriado que constitui a Muscularis mucosa.

Auto-Imunidade
5. Auto-Anticorpos Anti-Músculo Estriado Esquelético
Os auto-anticorpos anti-músculo estriado esquelético reagem com os elementos

citoplasmáticos contrácteis do músculo. Encontram-se em cerca de 80 a 90% dos
doentes com Myasthenia gravis, sobretudo se acompanhados de timoma. No entanto, só
elevados títulos são relevantes para o diagnóstico, visto também se poderem encontrar
em várias outras formas de miopatia e na doença de Chagas.
O kit utilizado no HCC para a detecção destes auto-anticorpos utiliza músculo

esquelético de macaco. Um resultado positivo aparece como descrito na figura seguinte.
Figura 91 – Padrão de fluorescência característico dos auto-anticorpos anti-músculo estriado em

músculo esquelético de macaco.
Visualiza-se um padrão fluorescente de estriação típica no citoplasma das fibras

do músculo esquelético. Para além disso, poderá observar-se o contorno fluorescente
das fibras, o que não é característico de positividade, visto também poder ocorrer em
caso de um resultado negativo.

Auto-Imunidade
3.2. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Qualitativo, ensaio

em “Sanduíche”
3.2.1. Fundamento
As técnicas de ELISA (Enzyme linked immunoabsorbent assays) são semelhantes

às técnicas de IFA. O suporte sólido é aqui uma placa de microtitulação, em vez de ser
uma lâmina, onde são fixados (em vez dos extractos das células HEp-2) os antigénios
complementares aos auto-anticorpos que se pretendem pesquisar. Os passos da reacção
também incluem a adição da amostra, seguida de incubação e lavagem. Depois
adiciona-se de igual forma o conjugado à amostra, mas desta vez, em vez da anti-IgG
estar ligada a um fluorocromo, está ligada a uma enzima; segue-se nova incubação e
lavagem. Seguidamente adiciona-se à amostra um substrato sobre o qual a enzima tem
capacidade de actuar transformando-o, durante a terceira incubação do processo, num
produto com cor. Por fim adiciona-se uma solução stop a fim de que a reacção de
conversão do substrato em produto da reacção pare simultaneamente para todas as
amostras e as posteriores leituras espectrofotométricas possam ser uniformizadas. O
processo pode ser feito manualmente ou de forma automatizada.
Figura 92 – Esquema Ilustrativo de uma reacção de ELISA. À direita, placa de ELISA.

Auto-Imunidade
A medição espectofotométrica da intensidade da cor produzida a um

determinado comprimento de onda permite relacionar a extensão da reacção e,
consequentemente, a quantidade de auto-anticorpos presentes na amostra do doente.
Num ELISA qualitativo, juntamente com as amostras dos doentes, analisa-se no

mesmo ensaio um calibrador que funciona como “cut-off”. Assim, as amostras que
apresentarem valores iguais ou acima do calibrador são consideradas positivas (valor
amostra/valor calibrador = ou > 1), enquanto que as que apresentarem valores abaixo do
calibrador são consideradas negativas (valor amostra/valor calibrador < 1).
Falsos resultados poderão surgir por lavagem insuficiente (falsos positivos) ou

por problemas impossíveis de controlar pelo executor, como a má fixação dos
antigénios à placa de ELISA ou a aderência dos auto-anticorpos da amostra à película
utilizada para ligar os antigénios ao poçeto da placa (e não aos próprios antigénios).
3.2.2. Aplicação
Relativamente aos testes de IFA, os testes de ELISA requerem menos pessoal

especializado, sendo passíveis de automatização completa, mas são mais dispendiosos
que os testes de IFA. Por outro lado, relativamente à sua sensibilidade e especificidade:
- Em comparação aos testes de IFA para células HEp-2, os ELISA são testes
menos sensíveis mas mais específicos. Assim, sempre que um resultado é considerado
positivo por IFA em células HEp-2 justifica-se a confirmação da sua positividade por
um teste de ELISA.
- Em comparação aos testes de IFA para células de Crithidia luciliae, os testes

de ELISA são mais sensíveis e menos específicos, visto que podem ocorrer falsos
resultados positivos para DNAds por ELISA, por desnaturação espontânea do DNAds
em DNAss e consequente quantificação do DNAss como DNAds.
No HCC, sempre que um teste de IFA para células HEp-2 ou células de

Crithidia luciliae é considerado positivo, segue-se a realização de um teste de ELISA
qualitativo (ver Observações e Sugestões 1). Neste teste, cada poçeto da microplaca
está revestido com uma poll de antigénios, considerados os principais marcadores das
DAI. Se o teste for positivo significa que a amostra do doente contém pelo menos um
Auto-Imunidade
dos auto-anticorpos em pesquisa. Este rastreio irá detectar a maioria dos ANAs, mas
haverão sempre algumas amostras com ANAs não contidos no poll que não serão
detectados e que podem ter sido visualizados previamente por IFA.
3.2.3. Ensaios Executados
3.2.3.1.ANA Screen
O teste de ELISA qualitativo utilizado no HCC designa-se por ANA Screen.

Neste teste, para o qual as amostras são diluídas de 1:200, cada poçeto da placa de
ELISA está revestido com uma pool dos antigénios considerados os principais
marcadores das DAI:
- DNAds (LES);
- Histonas (LES Induzido por drogas);
- Scl-70 (Escleroderma Difusa);
- SS-A e SS-B (Síndrome de Sjögren);
- Sm (LES);
- nRNP ou U1snRNP (DMTC);
- Centrómero (CREST);
- Jo-1 (Polimisosites e Dermatomiosites).
Para além destes antigénios, que qualquer teste screening de ELISA contém, o
teste ANA Screen inclui também:
- Proteínas P-Ribossomais ou hnRNP (LES).
Outros testes semelhantes mas de outras casas comerciais contêm, por vezes,
para além dos antigénios principais:
- PCNA (LES);

Auto-Imunidade
- PM-Scl (“Overlap Syndrome: LES, Miosite e Escleroderma);
- Fibrilarina (Escleroderma Difusa);
- Ku (LES; Polimiosite com Escleroderma).
De todos os auto-anticorpos que os testes de ELISA Screen pesquisam, aqueles

para os quais os testes são mais sensíveis são os ENA – anticorpos contra antigénios
nucleares extraíveis (“Extractable Nuclear Antigens”): Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-
snRNP e Jo-1. Trata-se de componentes nucleares e citoplasmáticos solúveis que,
tirando o Jo-1, aparecem em IFA com padrão fino granular.
Se a amostra for fracamente positiva por IFA (1:160 para padrões homogéneos e
1:160 ou 1:320 para padrões finos granulares) e negativa para ANA Screen, a marcha
analítica termina por aqui e o resultado é dado como negativo ao clínico. Tal verifica-se
porque, por vezes, em IFA, a observação em ambiente escuro artificial pode conduzir à
sobrevalorização de padrões de fraca intensidade de fluorescência, sendo difícil
distinguir-se um resultado negativo de um fracamente positivo. A aceitação de um
resultado de 1:320 por IFA para um padrão fino granular como negativo se der negativo
por ANA Screen deve-se à elevada sensibilidade deste teste para os ENA.
Em todas as outras situações a marcha analítica prossegue com Immunoblotting

(ver Observações e Sugestões 2).
3.3. Immunoblotting - Imunodot’s
3.3.1. Fundamento
Trata-se de um ensaio de Western blot, em que as proteínas (antigénios)

extraídas de culturas celulares são separadas por electroforese num gel de
poliacrilamida, sob condições desnaturantes (presença de SDS). As proteínas no gel são
depois electrotransferidas para um papel de nitrocelulose que proporciona um suporte
sólido para os antigénios. O papel de nitrocelulose é seguidamente cortado em tiras de
forma a que cada tira contenha um conjunto de antigénios individualizados (para os

Auto-Imunidade
quais se pretendem pesquisar os respectivos anticorpos) e um controlo interno. Para

cada amostra é, assim, utilizada uma destas tiras.
Vários métodos podem depois ser utilizados a fim de se detectar a ligação

antigénio-anticorpo, nomeadamente um ELISA, como é o caso dos kits utilizado no
HCC.
Nestes kits, as tiras de nitocelulose já vêm preparadas, bastando, apenas, que

sejam hidratadas com tampão por cinco minutos, colocando-se para isso cada tira (uma
para cada amostra e outra para um controlo externo) num dos canais do aparelho.
Segue-se a pipetagem das amostras (diluídas previamente de 1:100) e do controlo
externo. Depois todo o processo é automatizado: incubação de trinta minutos, lavagem
das tiras, segunda incubação de trinta minutos com um conjugado com enzima, nova
lavagem, adição do substrato da reacção e nova incubação de 10 minutos e, por último,
adição de uma solução stop. Após a secagem das tiras, os resultados são lidos num
scanner automático que os quantifica como -, +, ++, ou +++, consoante a intensidade da
coloração negra obtida para cada antigénio. Assim, é possível identificar-se os auto-
anticorpos presentes na amostra do doente.
Os resultados só serão válidos se para cada tira a zona do controlo interno

apresentar coloração negra e se a tira do controlo externo apresentar coloração para os
auto-anticorpos descritos na bula como pertencentes ao controlo externo.

Auto-Imunidade
Figura 93 – Exemplo de tiras utilizadas para vários doentes do kit de Immunoblotting “ANA
Profile”; verifica-se que para todas as tiras o controlo interno está positivo o que permite a aceitação dos
resultados; para o primeiro doente, por exemplo, verifica-se a presença do auto-anticorpo PCNA (tira
negra na zona do respectivo antigénio).
3.3.2. Aplicação
Os dot’s permitem a identificação dos auto-anticorpos presentes na amostra de

um doente. De uma maneira geral, são executados no HCC nas seguintes situações:
 Para pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células de

Crithidia luciliae por IFA:
- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a
identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA
Screen;
- Se a amostra for fortemente positiva por IFA (>1:160), mesmo que seja
negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)
presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem
identificáveis por dot’s;
- Se a amostra for negativa para ANA Screen (independentemente do título

obtido por IFA) mas se se tiver informação clínica do doente que possa indiciar
uma possível positividade por Immunoblotting (por exemplo se o doente tiver
uma miosite, o que pode ser detectado por Immunoblotting e não ser detectado
por ANA Screen, uma vez que o perfil de antigénios pesquisados para miosites
por dot’s é mais alargado que o simples Jo-1 pesquisado por ANA Screen).
 Para pesquisa prévia de auto-anticorpos anti-citoplasmáticos em seis tipos

diferentes de tecidos por IFA:
- Se se visualizar a presença de algum auto-anticorpo de interesse (AMA,
LKM ou APCA).

Auto-Imunidade
3.3.3. Perfis Executados
Existem vários tipos de tiras (dot’s) que podem ser utilizadas para pesquisa de
auto-anticorpos. Cada tipo/perfil de tira contém um determinado conjunto de antigénios.
Os perfis são escolhidos de acordo com os auto-anticorpos que se desconfia que o
doente possa ter.
3.3.3.1.Perfil ANA (“ANA Profile 3”)
É realizado no HCC sempre que se desconfia que o doente tenha um ANA. Isto
é, para a pesquisa prévia de auto-anticorpos em células HEp-2 e/ou células Crithidia
luciliae por IFA:
- Se a amostra for positiva para ANA Screen, uma vez que permite a
identificação de quais os auto-anticorpos responsáveis pela positividade do ANA Screen;
- Se a amostra for fortemente positiva para um ANA por IFA (>1:160), mesmo
que seja negativa para ANA Screen, uma vez que é possível que o/os auto-anticorpo(s)
presente(s) na soro do doente possam não constar no ANA Screen e serem identificáveis
na ANA Profile 3.
ANA Screen ANA Profile Patologia
DNAds DNAds LES

Histonas Histonas LES induzido por drogas
Nucleossoma LES
Scl-70 Scl-70 CREST, Escleroderma II
SS-A SS-A Síndrome de Sjögren
SS-B SS-B Síndrome de Sjögren
Sm Sm LES
U1-snRNP U1-snRNP DMTC
PCNA LES
hn-RNP hn-RNP LES
PM-Scl Miosite com Escleroderma
Centrómeros CENP-B CREST; Escleroderma I
AMA-M2 Cirrose Biliar Primária
Jo-1 Jo-1 Polimiosite
Tabela 15 - Antigénios contidos na placa de ELISA do ANA Screen e antigénios contidos na tira
do ANA Profile 3.

Auto-Imunidade
Uma vez que o ANA Profile 3 possui mais quatro antigénios que o ANA Screen
(nucleossoma, PCNA, PM-Scl e AMA-M2), é possível que um prévio resultado
negativo por ANA Screen dê positivo no ANA Profile para estes auto-anticorpos.
O contrário também se poderá eventualmente verificar, uma vez que a

sensibilidade do ANA Screen para os ENA (Scl-70, SS-A, SS-B, Sm, U1-snRNP e Jo-1)
é maior que a sensibilidade do ANA Profile. Tal poderá acontecer uma vez que no
processo de desnaturação proteica que os Immunobloting’s envolvem, poder-se-á
destruir a estrutura nativa dos antigénios mais sensíveis ao processo de desnaturação, o
que conduzirá a falsos resultados negativos, uma vez que o auto-anticorpo de soro do
doente poderá não se ligar convenientemente ao antigénio alterado fixado na tira de
nitrocelulose.
3.3.3.2.Perfil Hepático “Liver Profile”
É executado no HCC sempre que:
 Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes

padrões:
- Poros da Membrana Nuclear (possível gp210);
- Múltiplos dots nucleares (possível sp100 ou PML);
- Mitocondrial citoplasmático (possível AMA-M2).
 Por pesquisa anterior em tecidos de auto-antigénios citoplasmáticos se

identificam padrões nos seis tecidos característicos de:
- AMA-M2;
- LKM-1.
 O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil

identifica;
 Se sabe que o doente tem uma patologia hepática.

Auto-Imunidade
Perfil Hepático “Liver Profile”
Outras Patologias
Antigénios Patologia de Interesse Outras Patologias
Hepáticas
AMA-M2
M2-3E
(sub-unidade da M2 que é o principal Hepatite C Esclerose Sistémica
auto-antigénio da CBP; maior
Cirrose Biliar Primária
sensibilidade que M2)
gp210 Colangite Esclerosante
LES; S. Sjögren; DMTC
sp100 Primária
PML Polimiosite; Colangite
LES; AR; Esclerose
Cirrose Biliar Primária
Ro-52 (parte do SS-A) Hepatite Viral Crónica Sistémica;S. Sjögren;
Hepatite Autoimune I
DMTC; Polimiosite
LKM-1 Hepatite C
Hepatite Autoimune II
LC-1
(crianças, sobretudo)
(“cytosolic liver antigen type 1”)
SLA/LP
(”soluble liver antigen/liver-pancreas Hepatite Autoimune III
antigen”)
Tabela 16– Antigénios contidos no “Liver Profile” e patologias a eles relacionadas.
3.3.3.3.Perfil Miosites (“Myosite Profile 3”)
É executado no HCC sempre que:
 Por pesquisa anterior em células HEp-2 se identifica um dos seguintes

padrões:
- Padrões nucleolares (possível PM-Scl) (ver Observações e Sugestões 3);
- Padrão nuclear Ku;
- Padrão citoplasmático Jo-1;
- Padrão citoplasmático SRP.
 O pedido médico é específico de algum dos auto-anticorpos que este perfil

identifica;
 Se sabe que o doente tem uma (poli)miosite.
Auto-Imunidade
Perfil Miosites “Myositis Profile 3”

Antigénios Nucleares Patologia de Interesse Outras patologias
LES; AR; DMTC; Esclerose
Ro-52 Miosites Sistémica;; S. Sjögren; Cirrose Biliar
Primária; Hepatite Autoimune
Mi-2
Dermatomiosite
PM-Scl 75 “Overlap Syndome” (polimiosite, Escleroderma com envolvimento
PM-Scl100 dermatomiosite e esclerose sistémica) renal
Ku Polimiosite com Escleroderma LES
Antigénios Citoplasmáticos Patologia de Interesse Outras Patologias
Polimiosite; Dermatomiosite, sobretudo com
Jo-1
doença intersticial pulmonar
SRP Polimiosite; Dermatomiosite (raramente)
PL-7
PL-12
Miosites
EJ
OJ
Tabela 17 – Antigénios contidos no perfil miosites e suas patologias associadas (ver

Observações e Sugestões 4).
Excepto o Ro-52 que pode estar presente numa grande variedade de DAI, todos
os outros antigénios apresentam elevada especificidade para miosites.
3.3.3.4.Perfil Gástrico
É executado no HCC sempre que nos seis tecidos executados para rastreio de auto-
anticorpos citoplasmáticos se desconfia da presença de um APCA.
O teste permite a identificação não só de auto-anticorpos anti-células parietais

(APCA), como de auto-anticorpos anti-factor intrínseco (FI).

Auto-Imunidade
3.4. Ensaio Imunoenzimático – ELISA Quantitativo, ensaio

em “Sanduíche”
3.4.1. Fundamento
Os ensaios de ELISA quantitativos são feitos exactamente da mesma forma que
os ELISA qualitativos. A única diferença é que, em vez de se utilizar apenas um
calibrador que serve nos ELISA qualitativos como “cut-off”, utilizam-se vários
calibradores de concentração rigorosamente conhecida que são processados em
simultâneo com as amostras. Com os valores de absorvância obtidos para os diferentes
calibradores é, assim, possível traçar-se uma curva de calibração (absorvância vs
concentração). Determinando-se a absorvância de cada uma das amostras analisadas, é
possível por extrapolação gráfica (manual ou automática) determinar-se a sua
concentração rigorosa.
Absorvância
Figura 94 – Exemplo de uma curva de calibração absorvância vs concentração.

Auto-Imunidade
3.4.2. Aplicação
Só para alguns auto-anticorpos é conhecida uma relação directa quantificação /

influência na actividade da patologia. Só para estes auto-anticorpos se justifica utilizar
um ensaio de ELISA quantitativo. Para todos os outros, os ensaios de identificação já
descritos são suficientes.
Justifica-se realizar um ELISA quantitativo só para os auto-anticorpos

seguidamente mencionados:
3.4.2.1.Ac. anti-DNAds
A sua quantificação é importante para o diagnóstico e monitorização de doentes

com LES. A sua presença é indispensável ao diagnóstico da patologia. O seu título está
directamente relacionado com a actividade da doença.
3.4.2.2.Ac. anti-Nucleossoma
A sua quantificação é importante para a monitorização de doentes com LES.

Elevados títulos relacionam-se com elevada actividade da doença e, geralmente, com
envolvimento renal. Por outro lado, 18% dos doentes com LES apresentam este auto-
anticorpo e não apresentam DNAds.
3.4.2.3.Ac. anti-cardiolipina e Ac. anti-β2-glicoproteína I IgG e IgM
A sua quantificação é importante no diagnóstico do Síndrome Anti-fosfolipídico.

Só elevados títulos destes auto-anticorpos se relacionam com SAF; baixos títulos poder-
se-ão relacionar com infecções e outras DAI, como LES, AR, SS, escleroderma e
miosites.
3.4.2.4.Ac. anti-Proteinase 3, PR3 ou cANCA

Auto-Imunidade
Estes auto-anticorpos manifestam-se nas vasculites, como no Granulomatose de

Wegener e, por vezes, na Poliangite Microscópica e Poliartrite Nodosa. A sua
quantificação é indispensável na Granulomatose de Wegener. Uma persistência de
cANCA positivo ou um aumento deverá influenciar a terapêutica.
3.4.2.5.Ac. anti-Mieloperoxidase, MPO ou pANCA
Estes auto-anticorpos manifestam-se em algumas vasculites como na Poliangite

Microscópica e Síndrome Churg-Strauss; por vezes também estão presentes na
Granulomatose de Weneger e Poliartrite Nodosa (ver Observações e Sugestões 5).
3.4.2.6.Ac. anti-CCP
Os auto-anticorpos anti-CCP (“Cyclic Citrullinated Peptides”) são dirigidos contra

péptidos citrulinados cíclicos, para os quais a arginina é substituída pela citrulina. Estão
associados a doentes com AR, apresentando uma sensibilidade de cerca de 78% e uma
especificidade de 98%. Podem aparecer no soro muitos anos antes da instalação da
doença. A sua quantificação é importante para monitorização da doença.
A sua importância enquanto marcadores serológicos é muito maior que o outro

marcador de AR, o Factor Reumatóide (FR), uma vez que as suas sensibilidades para a
patologia são semelhantes, enquanto que a especificidade do anti-CCP é muito mais
elevada, uma vez que o FR está presente em muitas outras situações.
3.4.3. Outros Ensaios Executados
Para além dos auto-anticorpos cuja quantificação tem interesse clínico, o HCC
quantifica outros auto-anticorpos (ver Observações e Sugestões 6).
3.4.3.1.Ac. anti-ICC e anti-C1q

Auto-Imunidade
Sempre que existem ICC (Imuno-Complexos Circulantes), isto é, um antigénio

ligado ao anticorpo complementar em circulação, a fracção C1q do complemento tem a
capacidade de se ligar ao ICC, activando a via comum do complemento. Os ICC não
são específicos de nenhuma patologia, podendo estar presentes em caso de LES, mas
também em caso de doenças reumáticas e outras DAI, doenças infecciosas, alergias ou
neoplasias hematológicas, uma vez que são formados sempre que o sistema imunitário é
activado. Contudo, os auto-anticorpos anti-C1q são específicos de LES.
O presente kit utilizado pelo HCC utiliza como antigénio ligado à placa de ELISA
C1q, detectando em simultâneo ICCs e Ac. anti-C1q. Não apresenta, portanto, grande
valor clínico uma vez que não é específico de LES.
Contudo, existe já no mercado um kit que apenas detecta Ac. anti-C1q, específicos
de LES, sendo este muito mais útil do ponto de vista clínico. Um objectivo futuro do
HCC passa por substituir o kit ICC/C1q pelo kit C1q.
3.4.3.2.Ac. anti-GBM
Os auto-anticorpos anti-GBM (“Glomerular Basement Membrane”) são dirigidos

contra o colagénio tipo IV da membrana basal glomerular renal. Estão associados a
qualquer tipo de glomerulonefrite, incluindo o Síndrome de Goodpasture.
3.4.3.3.Ac. anti-Gliadina AGA e anti-Transglutaminase tTG (IgG e IgA)
Os anticorpos anti-endomísio (EMA) são, sem dúvida os anticorpos que apresentam

maior sensibilidade e especificidade para a Doença Celíaca, na ordem dos 99%.
Contudo, a sua análise é feita por IFA, o que implica experiência na técnica.
Os anticorpos anti-Tg são um tipo de EMA, podendo, no entanto, ser determinados

por ELISA (IgA e IgG). A sua sensibilidade (90 a 99%) e especificidade (85 a 99%)
são, contudo, um pouco mais baixas. Ainda assim, são essenciais no diagnóstico da
Doença Celíaca.
Auto-Imunidade
Os anticorpos anti-gliadina IgA e IgG foram os primeiros (dos três referidos) a

surgir no mercado. Apresentam menor sensibilidade (90%) e especificidade (85 a 88%)
que os anti-Tg. Contudo, são ainda úteis no diagnóstico desta patologia uma vez que
crianças com menos de dois anos frequentemente não apresentam EMA nem anti-tTg.
São ainda importantes na monitorização da progressão da patologia e na sua relação
com a dieta instituída.
No HCC sempre que o pedido médico inclui EMA, anti-Tg e anti-Gliadina, caso os
anti-Tg IgA já tenham sido feitos e se derem positivo, já não se pesquisam os EMA por
IFA, dando-se o resultado como positivo ao clínico (ver Observações e Sugestões 7).
3.4.3.4.Ac. anti-Desmogleinas 1, 3 e BP180
A desmogleina 1 e 3 são caderinas expressas no epitélio escamoso estratificado. A

desmogleina 1 é o antigénio contra o qual anticorpos são dirigidos no pênfigo foliáceo,
embora também se detecte em 60% dos casos de pênfigo vulgaris. A desmogleina 3 é o
antigénio contra o qual os anticorpos são dirigidos no pênfigo vulgaris, não se
encontrando em doentes com pênfigo foliáceo.
No pênfigo bulhoso verifica-se a produção de auto-anticorpos contra a base da

lesão na pele, como os auto-anticorpo BP 180.

Auto-Imunidade
4. O Futuro…
Actualmente, uma vez iniciada a resposta autoimune, a única maneira disponível de

a atenuar/bloquear é por imunossupressão inespecífica.
O objectivo no futuro passa por realizar individualmente para cada doente estudos
proteómicos que permitam:
- Detectar um perfil de auto-anticorpos que representem a “impressão digital” do

doente autoimune, o que pode ser útil para classificar doentes em diferentes sub-
populações com diferentes prognósticos;
- Monitorizar o “antigen spreading” que pode conduzir a DAI progressiva e mais

severa, a fim de se melhorar o conhecimento sobre o prognóstico do doente;
- Determinar a especificidade da resposta do auto-anticorpo, o que poderá conduzir

ao aparecimento de terapêuticas específicas para um determinado antigénio;
- Em última instância, identificar um componente celular ou sérico só por si com

potencial para conduzir ao aparecimento posterior de um auto-anticorpo importante para
o diagnóstico de uma DAI, a fim de se ser capaz de evitar (talvez por vacinação) que a
resposta autoimune para um dado antigénio ocorra.
No futuro, pertende-se que aumente o nosso conhecimento sobre a predisposição

genética, sobre biomarcadores precoces que identifiquem indivíduos e populações em
risco e sobre os mecanismos gerais que regulam a resposta imunológica. O verdadeiro
sucesso no tratamento das DAI só virá com estes conhecimentos acrescidos, pois só eles
permitirão que, com uma intervenção precoce, se possa estabelecer a homeostase
imunológica antes que ocorra a destruição tecidular irreversível.
Muito ainda há por saber e fazer…

Auto-Imunidade
5. Observações e Sugestões
1. Os testes de ELISA para DNAds são mais sensíveis e menos específicos que as
células de Crithidia luciliae por IFA para pesquisa do DNAds. Assim, a estagiária
considera que fazer um teste de ANA Screen após um resultado positivo para DNAds
em células Crithidia luciliae revela-se desnecessário. O posterior teste de ELISA
quantitativo é, obviamente, importante.
2. Sempre que um padrão por IFA dá 1:320 / 1:640 / > 1:640 homogéneo ou 1:640 /
> 1:640 fino granular, independentemente do teste de ANA Screen dar positivo ou
negativo, é feito sempre a seguir um Immunoblotting para a amostra. Assim, a
estagiária sugere que nos referidos casos não se realize o teste de ANA Screen e se
passe de imediato ao teste de Immunoblotting adequado à situação.
3. O único auto-anticorpo associado a miosites com padrão nucleolar (nucleolar

homogéneo) é o PM-Scl. Uma vez que este antigénio, embora não esteje incluído no
poll de antigénios do ANA Screen, está incluído no ANA Profile, a estagiária considera
que sempre que se tem um padrão nucleolar poderá optar-se por se fazer ou o ANA
Profile ou o Liver Profile, não sendo necessário realizar os dois ensaios.
4. Uma vez que o antigénio Mi-2 poderá estar associados a miosites e os testes ANA
Screen e ANA Profile não o pesquisam, sempre que o padrão obtido por IFA é fino
granular e os testes ANA Screen e ANA Profile dão ambos negativos poder-se-ia fazer
um Myosite Profile para despiste de um eventual Mi-2.
5. Os ANCAs (anticorpos dirigidos contra os grânulos citoplasmáticos dos

neutrófilos) são clinicamente importantes na assistência a doentes com desordens
vasculares. Existem lâminas no mercado para a sua pesquisa por IFA.
Em lâminas fixas com etanol, os cANCAs (anticorpos anti-citoplasmáticos dos

neutrófilos: Proteinase 3) conferem fluorescência ao citoplasma dos neutrófilos,
enquanto que os pANCAs (anticorpos anti-perinucleares dos neutrófilos:
mieloperoxidase, lactoferrina, elastase, catepsina, lisozima e β-glucuronidase) conferem
fluorescência em torno do núcleo dos neutrófilos.

Auto-Imunidade
Figura 95 – ANCAs. À esquerda cANCA. À direita pANCA.
Alguns padrões de ANA (homogéneo nuclear; membranar nuclear) podem, no

entanto, também conferir o mesmo padrão perinuclear, podendo assim confundir-se um
ANA com um pANCA. Assim, sempre que os neutrófilos apresentam fluorescência
perinuclear em lâminas fixas com etanol testa-se a mesma amostra numa lâmina fixa
com formol. O formol irá fazer com que os pANCA se passem a observar-se como
cANCA, com o padrão citoplasmático dos neutrófilos; pelo contrário, o formol não irá
surtir nenhum efeito nalguns ANA (o padrão pANCA mantém-se) e irá destruir outros
ANAs (deixa de se visualizar fluorescência). Assim, só se o padrão perinuclear passar a
padrão citoplasmático na lâmina fixa com formol é que se considera que o doente tem
um pANCA.
A pesquisa de ANCAs por IFA não permite a sua quantificação nem a identificação
da MPO como sendo o pANCA eventualmente presente. Contudo, tratando-se de um
método mais sensível e barato que um teste de ELISA quantitativo, permite um rastreio
inicial, possibilitando que depois só as amostras positivas por IFA sejam quantificadas
por ELISA.
6. Os mesmos kits que são utilizados como ELISA Quantitativos podem ser
utilizados como ELISA Qualitativos, bastando para isso utilizar-se no ensaio apenas um
calibrador (o calibrador recomendado pelo fornecedor), em vez de se utilizarem todos
os calibradores necessários para se traçar a curva de calibração. No caso dos auto-
anticorpos cuja quantificação não tem interesse clínico (ICC, CCP, GBM, Gliadina e

Auto-Imunidade
Transglutaminase), a estagiária sugeriria a utilização de apenas o calibrador necessário a

um ELISA Qualitativo.
7. A especificidade dos anti-Tg IgA por ELISA (85 a 99%) é mais baixa que a
especificidade dos EMA por IFA (99%). Assim, é possível obter-se um resultado
positivo para anti-Tg IgA que não seja positivo para EMA.

Auto-Imunidade
Bibliografia
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7. Dieusaert P., Como Prescrever um Exame Laboratorial – Guia Prático de Análises

Médicas, segunda edição, Andrei, 2001
8. Gillespie, Stephen H., Hawkey, Peter M, Principles and Practice of Clinical

Bacteriology, second edition, Wiley, 2006
9. Hagemann P., Kimling H., Zawta B., Fundamental of Laboratory Testing – Urine,
Roche Diagnostics, 2003
10. http://atlasgeneticsoncology.org.
11. http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman.
12. Murray, Patrick R., Medical Microbiology, fifth edition, Elsevier Mosby, 2005
13. Oliveira J., Exames Laboratoriais para o Clínico, segunda edição, Medsi, 2003
14. Parslow T.G., Stites D.P., Terr A.I., Imboden J.B., Imunologia Médica, décima
edição, Guanabara Koogan, 2001
15. Rautenstraub B., Liehr T., FISH Technology, Spinger Lab Manual, 2002

Auto-Imunidade
16. Shaffer Lisa G., Tommerup Niels, An International System for Human Cytogenetic
Nomenclatura - Cytogenetic and Genome Research, ISCN, 2005
17. Shoenfeld Y., Cervera R., Gershwin M.E., Diagnostic Criteria in Autoimmune
Diseases, Humana Press, 2005
18. Steven H. Swerdlow, Elias Campo; WHO Classification of Tumours of

Haematopoietic and Lymphoid Tissues, International Agency for Research on Cancer,
2008
19. Sverre Heim, Felix Mitelman; Wiley-Liss, Cancer Cytogenetics – Chromosomal and
Molecular Genetic Aberrations of Tumor Cells, Elsevier, 1995
20. www.ii.bham.ac.uk

Agradecimentos
A todos os trabalhadores do Laboratório Reymão Pinto, aos

trabalhadores dos diferentes Laboratórios do IPO Porto e aos trabalhadores
do Laboratório de Imunologia do Serviço de Nefrologia do Hospital Curry
Cabral, o meu obrigado pelo tempo dispensado e pelos conhecimentos
transmitidos.
Agradeço também a todos os professores do Mestrado de Análises

Clínicas da Faculdade de Farmácia de Lisboa, sem os quais não teria tido a
hipótese de realizar este estágio, que em muito contribuío para a minha
formação académica.

Anexo 1
Alteração molecular e Efeito da Alteração
Função gene
Grupo da Neoplasia citogenética Genética Prognóstico
Ganho de função de
proto-oncogene; Sobrevida média > 10
PV
vantagem anos.
A proteína JAK2
proliferativa:
cinase está
Na presença da
intracelularmente Sobrevida média de 3 a
MFP Mutação pontual mutação V617F a
ligada ao receptor da 7 anos.
V617F no gene JAK2 proteína JAK2 cinase é
EPO e TPO. Quando a
(troca de uma Valina hiper-activada
EPO ou TPO se ligam
por uma Fenilalanina (hipersensibilidade das
SMP aos seus receptores a
na posição 617) na células à EPO e TPO),
proteína JAK2 é
stem cell, estando conduzindo à
fosforilada,
presente em todas as proliferação celular Sobrevida média de 10
conduzindo à
TE células mielóides. descontrolada. a 15 anos (~ à da
transcrição nuclear e
O rácio população geral).
consequente
JAK2V617F/JAK2
proliferação celular.
wild-type determina o
fenótipo de SMP (PV,
MFP ou TE).
proto-oncogene;
Translocação entre o vantagem
gene ABL do O gene BCR tem proliferativa e
cromossoma 9 em 9q34 função desconhecida. alteração da apoptose:
e o gene BCR do O gene ABL conduz à A fusão do gene ABL
cromossoma 22 em transcrição de uma com o gene BCR
LMC 22q11.2 – proteína cinase que: conduz à formação de Bom prognóstico.
ABL-BCR; - induz a proliferação uma proteína quimérica
t(9;22)(q34;q11.2). celular; p210, que aumenta a
Resulta no cromossoma - exibe actividade anti- actividade da tirosina
de Philadelphia 22 - apoptótica. cinase, induzindo:
der(22q) - Aumento da
proliferação celular;
- Bloqueio da apoptose.
Translocação entre o
gene ETO do
cromossoma 8 em 8q22
e do gene AML1 do
cromossoma 21 em
21q22 – Ganho de função de
ETO-AML1; proto-oncogene;
t(8;21)(q22;q22) bloqueio da
O gene AML1, CBFβ e
Translocação ou diferenciação:
RARα conduzem cada
inversão entre o gene A fusão ETO-AML1,
um deles à síntese de
CBFβ do cromossoma CBFβ-MYH11 ou
uma proteína que, ao
16 em 16p13.1 e do PML-RARα conduz à
se ligar a factores de
gene MYH11 do formação de uma
LMAs* trancrição leva à Bom prognóstico.
cromossoma 16 em proteína quimérica que
trancrição de genes
16q22 – atrai co-repressores da
importantes para a
CBFβ-MYH11; inv(16) transcrição (Sin3A,
diferenciação
(p13.1q22) ou NCoR e HD),
mielóide.
t(16;16)(p13.1 ;q22) impedindo assim a
Translocação entre o transcrição de genes
gene PML do importantes para a
cromossoma 15 em diferenciação mielóide.
15q22 e do gene RARA
do cromossoma 17 em
17q12 –
PML-RARα ;
t(15 ;17)(q22 ;q12)
Translocação entre o O gene BCR tem Ganho de função de
gene ABL do função desconhecida. proto-oncogene;
cromossoma 9 em 9q34 O gene ABL do vantagem
e o gene BCR do cromossoma 9 conduz proliferativa e
LLAs B cromossoma 22 em à síntese de uma alteração da apoptose: Mau prognóstico.
22q11.2 – proteína cinase que: A fusão do gene ABL
ABL-BCR; - induz a proliferação com o gene BCR
t(9;22)(q34;q11.2). celular; conduz à formação de
Resulta no cromossoma - exibe actividade anti- uma proteína quimérica

de Philadelphia 22 - apoptótica. p190 ou p210, que
der(22q) aumenta a actividade da
tirosina cinase,
induzindo:
- aumento da
proliferação celular;
- bloqueio da apoptose.
proto-oncogene;
Translocação entre o vantagem
O gene AF4 conduz à
gene AF4 do proliferativa:
síntese de uma
cromossoma 4 em 4q21 Na presença de
proteína que activa a
e o gene MLL do translocação do gene
transcrição genética.
cromossoma 11 em MLL com outro gene, a Mau prognóstico.
O gene MLL conduz à
11q23 – proteína é hiper-
síntese de uma
AF4-MLL; activada, conduzindo à
proteína que regula a
t(4;11)(q21;q23) transcrição nuclear e
transcrição genética.
consequente
proliferação celular
descontroladas.
proto-oncogene;
bloqueio da
Translocação entre o O gene AML1 conduz diferenciação:
gene TEL do à síntese de uma A fusão TEL-AML1
cromossoma 12 em proteína que, ao se conduz à formação de
12p13 e o gene AML1 ligar a factores de uma proteína quimérica
Bom prognóstico.
do cromossoma 21 em transcrição, leva à que atrai co-repressores
21q22 – transcrição de genes da transcrição (Sin3A,
TEL-AML1; importantes para a NCoR e HD),
t(12;21)(p13;q22) série linfóide. impedindo assim a
transcrição de genes
importantes para a
diferenciação linfóide.
proto-oncogene;
vantagem
Os genes E2A e PBX1 proliferativa:
Translocação entre o
conduzem cada um à A fusão E2A-PBX1
gene E2A do
síntese de uma conduz à formação de
cromossoma 1 em 1q23
proteína que, ao se uma proteína quimérica Prognóstico Intermédio
e o gene PBX1 do
ligar a factores de que: (antigamente associada
cromossoma 19 em
transcrição, leva à - Activa o processo de a mau prognóstico).
19p13.3 –
transcrição de genes transcrição nuclear;
E2A-PBX1;
importantes para a - Interfere no normal
t(1;19)(q23;p13.3)
série linfóide. funcionamento dos
factores de transcrição
codificados pelos genes
E2A e PBX1.
proto-oncogene;
vantagem
O gene TAL1 conduz proliferativa:
Delecção no à formação de factores A fusão SIL-TAL
cromossoma 1 em de transcrição conduz à formação de
T 1p32, que origina o importantes na uma proteína quimérica Mau prognóstico.
gene de fusão SIL- diferenciação e que leva à expressão
TAL1. proliferação de células aberrante do gene
da série linfóide. TAL1, o que se traduz
na alteração da
diferenciação e
proliferação linfóides.
O gene IgH é
responsável pela Ganho de função de
Translocação entre o síntese constitutiva da proto-oncogene;
gene MMSET do IgH – cadeias pesadas vantagem
cromossoma 4 em das Imunoglobulinas proliferativa:
MM
4p16.3 e o gene IgH do nos linfócitos B. A translocação faz com Sobrevida média ~ à da
Linfoma B
cromossoma 14 em O gene MMSET é que o gene MMSET população geral.
14q32 – expresso de forma passe a ser controlado
MMSET-IgH; indutiva, induzindo a pelo promotor da IgH,
t(4;14)(p16.3;q32) proliferação e passando a ser expresso
sobrevivência constitutivamente.
celulares.

O gene IgH é
Translocação entre o responsável pela
Bloqueio da apoptose:
gene IgH do síntese constitutiva da
A translocação faz com
L. Folicular
cromossoma 14 em IgH – cadeias pesadas
que o gene Bcl2 passe a Trata-se de um linfoma
14q32 e o gene Bcl2 do das Imunoglobulinas
ser controlado pelo de baixo grau.
cromossoma 18 em nos linfócitos B.
promotor da IgH, Prognóstico variável.
18q21 – O gene Bcl2 é
passando a ser expresso
IgH-Bcl2; responsável pela
constitutivamente.
t(14;18)(q32;q21) síntese da proteína
anti-apoptótica Bcl2.
O gene IgH é
Alteração do Ciclo
responsável pela
Translocação entre o Celular:
síntese constitutiva da
gene Bcl1 (Ciclina D1) A translocação faz com
IgH – cadeias pesadas
do cromossoma 11 em que o gene Bcl1 passe a Trata-se de um linfoma
L. Manto
das Imunoglobulinas
11q13 e o gene IgH do ser controlado pelo de baixo grau.
nos linfócitos B.
cromossoma 14 em promotor da IgH, Sobrevida média de 3 a
O gene Bcl1 (Ciclina
14q32 – passando a ser expresso 5 anos.
D1) é responsável pela
Bcl1-IgH; constitutivamente. Há
entrada da célula em
t(11;14)(q13;q32) desregulação do Ciclo
fase S do Ciclo
Celular.
Celular.
O gene IgH é
responsável pela
Translocação entre o proto-oncogene; Trata-se de um linfoma
síntese constitutiva da
gene MYC do vantagem de alto grau.
IgH – cadeias pesadas
cromossoma 8 em 8q24 proliferativa: Bom prognóstico
L. Burlitt
das Imunoglobulinas
e do gene IgH do A translocação faz com quando detectado
nos linfócitos B.
cromossoma 14 em que o gene MYC passe precocemente.
O gene MYC é
14q32 – a ser controlado pelo Mau prognóstico
expresso de forma
MYC-IgH; promotor da IgH, quando detectado em
indutiva levando à
t(8;14)(q24;q32) passando a ser expresso fase avançada.
síntese de factores de
constitutivamente.
transcrição.
proto-oncogene;
vantagem
proliferativa:
A fusão ALK-NPM1
conduz à formação de
O gene ALK codifica
uma proteína
uma proteína cinase
quimérica. A proteína
pertencente a um
Translocação entre o NPM1, uma vez
receptor de insulina,
gene ALK do fundida com a proteína
sendo geralmente
cromossoma 2 em 2p23 ALK, mimetiza o
silenciado nos Mau prognóstico.
e do gene NPM1 do ligando da ALK,
T linfócitos. Sobrevida média de 5
cromossoma 5 em 5q35 activando-a /
O gene NPM1 modula anos ou menos.
– ALK-NPM1; t(2;5) sobrerregulando-a. A
supressores tumorais
(translocação típica de ALK activada nos
no núcleo e controla a
L. Anaplásico T) linfócitos exibe
duplicação dos
propriedades
centrossomas durante
oncogénicas.
o ciclo celular .
A fusão da NPM1 com
outras proteínas resulta
também na activação
do potencial
oncogénico dos
parceiros de fusão.
Tabela 18 – Alterações genéticas associadas a processos neoplásicos pesquisadas no Laboratório de

Genética Molecular do IPO Porto. (SMP = Síndomes Mieloproliferativos. PV = Policitémia Vera. MFP = Mielofibrose
Primária. TE = Trombocitémia Essencial. EPO = Eritropoietina. TPO = Trombopoietina. LMC = Leucemia Mielóide Crónica. LMA
= Leucemia Mielóide Aguda. LLA= Leucemia Linfoblástica Aguda.)
* Para além das translocações e inversões primárias que caracterizam as LMAs, também podem associadamente ocorrer mutações
pontuais secundárias à patologia, como mutações no gene FLT3. Estas mutações conferem mau prognóstico nas LMAs.

Anexo 2
Material Genético Revelação do
Neoplasia Suspeita Pesquisa Técnica Molecular
Utilizado Material Genético
Síndrome
- mutação pontual - (só) Diagnóstico: Electroforese em gel de
Mieloproliferativo DNA
V617F no gene JAK2 ASO-PCR agarose 2%
(PV; MFP; TE)
- Diagnóstico: RT- - RT-PCR e Nested

- BCR-ABL1; t(9;22) PCR e PCR Tempo PCR: Electroforese em
Real gel de agarose 2%
RNA
(transcrito b2a2 ou - Follow-up: Nested - PCR Tempo Real:
LMC b3a2; proteína p210) PCR e PCR Tempo FRET com sonda
Real TaqMan
- mutações pontuais no Sequenciação

RNA Electroforese capilar
gene ABL Automática
- Diagnóstico: RT-
PCR e PCR Tempo - RT-PCR e Nested
- ETO-AML1; t(8;21)
Real PCR: Electroforese em
- CBFB-MYH11;
- Follow-up: gel de agarose 2%
inv(16) ou t(16;16) RNA
1º Nested PCR - PCR Tempo Real:
- PML-RARA ;
LMA 2º (só se Nested der FRET com sonda
t(15 ;17)
positivo) PCR Tempo TaqMan
Real
- mutações ITD e - (só)Diagnóstico: PCR
mutação pontual D835 DNA Single / Restrição Electroforese capilar
no gene FLT3 Enzimática (RFLPs)
- BCR-ABL1; t(9;22)
(transcrito b2a2 ou
b3a2; proteína p210; - Diagnóstico: RT-
transcrito e1a2; PCR e PCR Tempo
B Real
proteína p190) - RT-PCR e Nested
- AF4-MLL; t(4;11) - Follow-up:
PCR: Electroforese em
- TEL-AML1; t(12;21) 1º Nested PCR
gel de agarose 2%
LLA - E2A-PBX1; t(1;19) RNA 2º (só se Nested der
- PCR Tempo Real:
positivo) PCR Tempo
FRET com sonda
Real
TaqMan
NOTA: para SIL-TAL1
T - SIL-TAL1; del1p32 não se faz PCR Tempo
Real
- Suspeita MM:
MMSET-IgH; t(4;14)
- Suspeita L. Folicular:
IgH-Bcl2; t(14;18) PCR Single
B DNA
- Suspeita L. Manto: (MYC-IgH: PCR-LD)
Bcl1-IgH; t(11;14) Electroforese em gel de
Linfoma
- Suspeita L. Burkitt: agarose 2%
MYC-IgH; t(8;14)
T - NPM1-ALK; t(2;5) RNA - RT-PCR
Tabela 19 – Estudos moleculares realizados no Laboratório de Genética Molecular do IPO Porto.

Anexo 3
Selecção de agentes anti-microbianos feita para os diferentes microorganismos
na secção de Microbiologia do Laboratório Reymão Pinto:
ENTEROBACTERIACEAE
Produto 1ª Linha 2ª Linha

Ampicilina
Amoxicilina+Ác.Clavulânico
Cefoxitina ou Cefuroxime; Gentamicina
Cotrimoxazol;
Urina Amicacina
Nitrofurantoina
Norfloxacina
Ácido Nalidíxico
Cefalotina
Ampicilina Gentamicina;
Amoxicilina + Ác.Clavulânico Amicacina;
Carbenicilina Imipenem
Pus, Expectoração e Hemoculturas Cotrimoxazol; Ofloxacina
Cefalotina; Aztreonam
Cefoxitina ou Cefuroxime; Piperacilina
Ceftazidima; Ceftriaxona
Cloranfenicol
Abcesso Cerebral
Cefalotina;
Ampicilina
Coproculturas Amoxicilina + Ác.Clavulânico Ofloxacina;
Cotrimoxazol;
Cloranfenicol;
Ampicilina;
Salmonella typhi Amoxicilina+Ác.Clavulânico
Cotrimoxazol;
Ofloxacina;
Ampicilina
Gentamicina;
Amicacina;
Liquor
Cloranfenicol;
Cotrimoxazol;
Ceftriaxona;
Tabela 20 – Selecção de agentes anti-microbianos para Enterobacteriaceae.

PSEUDOMONAS SPP. e ACINETOBACTER SPP.:
1ª Linha 2ª Linha
Ceftazidima
Carbenicilina; Imipenem
Gentamicina; Piperacilina
Amicacina; Norfloxacina
Aztreonam
Tabela 21 – Selecção de agentes anti-microbianos para Pseudomonas spp e Acinetobacter spp.
HAEMOPHILUS SPP

Ampicilina;
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Eritromicina;
Pus, Expectoração Cloranfenicol; Ceftriaxona;
Tetraciclina;
Cotrimoxazol;
Ofloxacina
Ampicilina Ceftriaxona;
Hemoculturas e Liquor
Cloranfenicol; Ofloxacina
Tabela 22 – Selecção de agentes anti-microbianos para Haemophilus spp.
NEISSERIACEAE
Microorganismo 1ª Linha 2ª Linha

Penicilina;
Meningococcus Cloranfenicol;
Sulfadiazina
Cefalotina;
Penicilina (ß-Lactamase neg.) Eritromicina;
Gonococcus Tetraciclina Cefoxitina ou Cefuroxime;
Espectinomicina Ceftriaxona;
Ofloxacina
Moraxella catarrhalis Antibioticos idênticos aos usados p/ Haemophilus sp
Tabela 23 – Selecção de agentes anti-microbianos para Neisseriaceae.

STAPHYLOCOCCUS SPP

Penicilina Gentamicina;
Cefalotina; Amicacina;
Pus, Expectoração e Hemoculturas Oxacilina Ofloxacina;
Eritromicina; Vancomicina;
Tetraciclina Rifampicina
Penicilina
Cefalotina;
Abcesso Cerebral
Ácido fusídico
Oxacilina
Penicilina
Exsudado Nasal Eritromicina;
Oxacilina
Penicilina
Nitrofurantoina;
Cotrimoxazol;
Sulfafurazol;
Urina
Norfloxacina
Amoxicilina+Ác. Clavulânico Vancomicina
Novobiocina (S. saprophyticus são resistentes)
Oxacilina
Penicilina
Cloranfenicol;
Gentamicina;
Amicacina;
Liquor
Oxacilina
Cotrimoxazol;
Rifampicina;
Vancomicina
Tabela 24 – Selecção de agentes anti-microbianos para Staphylococcus spp.
LISTERIA MONOCITOGENES
1ª Linha
Ampicilina
Gentamicina
Cotrimoxazol
Ofloxacina
Tabela 25 – Selecção de agentes anti-microbianos para Listeria Monocitogenes.

STREPTOCOCCUS SPP
Microorganismo Produto 1ª Linha 2ª Linha

Penicilina
S. viridans
Gentamicina Vancomicina
Oxacilina
Expectoração e
Eritromicina
Exsudados
S. pneumoniae Tetraciclina
Oxacilina
Hemoculturas e Liquor Ceftriaxona; Vancomicina
Cloranfenicol
Ampicilina
Amoxicilina + Ác.Clavulânico
Pús
Cotrimoxazol; Estreptomicina
Gentamicina
Ampicilina
Enterococcus Amoxicilina+ Ác.Clavulânico
Urina
Cotrimoxazol; Nitrofurantoina;
Norfloxacina;
Ampicilina
Estreptomicina
Hemoculturas e Liquor Gentamicina;
Vancomicina;
Tabela 26 – Selecção de agentes anti-microbianos para Streptococcus spp.
CORYNEBACTERIUM SPP
1ª Linha
Tetraciclina
Eritromicina
Cefuroxime;
Gentamicina;
Amicacina;
Ceftazidima;
Ceftriaxona;
Ofloxacina;
Vancomicina;
Tabela 27 – Selecção de agentes anti-microbianos para Corynebacterium spp.

EXSUDADOS OCULARES (conjuntivais):
Microorganismos 1ª Linha
S. pneumoniae; S. aureus; H. influenzae; H. Cloranfenicol
aegiptius Tetraciclina
Cloranfenicol
Tetraciclina
Enterobacteriaceae
Colistina
Gentamicina
Colistina
Pseudomonas sp
Gentamicina
Tabela 28 – Selecção de agentes anti-microbianos para exsudados oculares.

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes

INSTITUTO PORTUGUÊS DE ONCOLOGIA DO PORTO, DR. FRANCISCO

ORIENTAÇÃO: DR. CARLOS MENDES, SERVIÇO HEMATOLOGIA CLÍNICA, IPO PORTO

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes

O presente trabalho consiste no relatório de estágio curricular, efectuado como

ANA • Análises Clínicas • Auto-Anticorpos Anti-Citoplasmáticos • Auto-

The present work represents a curriculum internship report, made conclusive as

In Part II of this report there’s a development on the laboratory methodologies

ANA • Anti-Citoplasmatic Auto-Antibodys • Anti-Nuclear Auto-Antibodys •

Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Bibliografia ................................................................................................................................ 186

Parte I - Apreciação Global dos Estágios Realizados ................................................................... 1

Parte II - Auto-Imunidade, Metodologias Laboratoriais para Diagnóstico e Seguimento

Todas as figuras da Parte II têm como fonte os pontos 3 e 4 da Bibliografia:

Tabela 1 – Parâmetros e Métodos Analíticos Modular Hitachi SWA, Roche .............................. 58

Apreciação Global dos Estágios

O estágio decorreu no Posto de Colheitas Eça de Queiroz do Laboratório

Para a colheita de sangue periférico total, deverão encher-se os tubos

No que respeita as provas de tolerância aos hidratos de carbono:

A optimização das condições de colheita de produtos para exame

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 2|

contaminação da amostra a estudar com anti-sépticos, com flora saprófita do doente ou

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 3|

- Expectoração: em jejum, depois de o utente fazer a sua higiene oral e se

Segue-se a descrição para as condições de colheita de espermogramas:

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 4|

 A colheita de esperma tem que ser completa; a perda da primeira fracção

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 5|

O estágio decorreu no Instituto Português de Oncologia do Porto Francisco

Trata-se de uma Entidade Pública Empresarial, de prestação de serviços de

No Serviço de Hematologia Clínica procede-se à elaboração e interpretação de

Para o estágio realizado foi de extrema utilidade para a estagiária os

Assim, o estágio decorreu maioritariamente na área destinada à validação dos

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 6|

rotina laboratorial diária e também lâminas de arquivo do Instituto. Visualizaram-se

Síndromes Mielodisplásicos vários (subclassificação é impossível pelo sangue

Leucemias Mieloblásticas Agudas (LMA):

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 7|

Neoplasias de Precursores Linfóides:

Neoplasias de Células B Maturas:

Neoplasias de Células T e NK Maturas:

Houve também oportunidade para realizar colorações citoquímicas (Fosfatase

Durante o estágio, a estagiária reorganizou ainda os dossies de arquivo do

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 8|

lâminas relevantes, a fim de criar um arquivo de imagens com patologias diagnosticadas

Pela experiência adquirida durante o estágio, os parâmetros definidos para

2.1. Equipamento – Sysmex XE 2100

Utiliza os seguintes métodos para determinação dos vários parâmetros:

Todas as células da amostra passam individualmente entre dois pólos, criando

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 9|

2. Método de Capacitância Eléctrica / Medição de Resistência Eléctrica (fluxo

As células da amostra são colocadas individualmente num espaço entre dois

A formação de um composto corado é medida em solução por determinação

4. Método de Impedância Eléctrica (método RF-DC):

A amostra de sangue (mau condutor de corrente eléctrica) é diluída numa

A análise dos diferentes parâmetros é feita em 7 câmaras de detecção distintas:

Utiliza a técnica de citometria de fluxo.

Vera Lúcia da Silva Fragoso Lopes 10 |

Figura 1 – Localização das diferentes populações leucocitárias na câmara DIFF do aparelho