1 Consumo de açúcar da infância à idade adulta: relação entre

2 potenciais vias moleculares e carcinogênese prostática em

3 animais ao envelhecimento.
4

5 Cecilia Luvizutti Ferreira da Silva¹, Ketlin Thassiani Colombelli1, Sergio Alexandre

6 Alcantara Santos1, Matheus Naia Fioretto1, Ana Carolina Lima Camargo1, Flávia Bessi

7 Constantino1, Luiz Marcos Frediani Portela1, Fernanda Mani², Luis Antonio Justulin¹.

8
1
9 Departmento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biociências,

10 Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), Botucatu 18618-689, São Paulo, Brasil.
2
11 Departmento de Ciências Químicas e Biológicas, Instituto de Biociências,

12 Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), Botucatu 18618-689, São Paulo, Brasil.

13 Correspondência: l.justulin@unesp.br Tel.: (14-3880-0481)

14
15 cecilia.luvizutti@unesp.br (Silva CLF); ketlin.colombelli@unesp.br (Colombelli KT);
16 sergio.santos@unesp.br (Santos SAA); matheus.fioretto@unesp.br (Fioretto M);
17 carolina.camargo@unesp.br (Camargo ACL); flavia.bessi@unesp.br (Constantino
18 FB); frediani.portela@unesp.br (Portela LMF); fernanda.mani@unesp.br (MANI, F);
19 l.justulin@unesp.br (Justulin LA)*.

20 Palavras chave: Consumo de açúcar; Disordens prostáticas; Análises globais.

21

22

23

24

25

26

27

28

29
30 Resumo
31 O consumo de alimentos industrializados com alta quantidade de “açucares de adição”

32 está aumentando na população, principalmente da infância até a vida adulta. Alimentos

33 adoçados artificialmente potencializam o risco da incidência de doenças metabólicas e

34 desenvolvimento de câncer ao envelhecimento. Dados ainda não publicados do nosso

35 grupo de pesquisa demonstram que o consumo de açúcar da infância até a vida adulta

36 leva à incidência de diferentes lesões prostáticas e do desenvolvimento do câncer de

37 próstata (CaP) no envelhecimento. Neste contexto, investigamos quais os efeitos do

38 consumo de açúcares de adição no envelhecimento e inflamação intra-prostática e

39 sistêmica nos ratos machos envelhecidos. Para isso, ratos Sprague Dawley machos e

40 fêmeas foram submetidos ao acasalamento e receberam água ad libitum e ração

41 normoproteica (17% de proteína) durante a gestação e lactação. Após o desmame, a

42 prole masculina foi dividida em 2 grupos experimentais (n=10/grupo), onde todos

43 receberam ração normoproteica: Controle (CTR) consumiram água normal do dia pós-

44 natal (DPN) 21 até o DPN 90 e Açúcar (AÇU) consumiram solução de açúcar (10%

45 diluído em água) do DPN 21 ao DPN 90. Após o DPN 90 até o final do experimento os

46 animais consumiram água normal. No DPN 540, os animais foram pesados e

47 eutanasiados, o plasma sanguíneo foi coletado para análises bioquímicas séricas e a

48 próstata ventral para avaliação de estresse oxidativo e análise global do perfil

49 proteômico. Estes resultados foram comparados com dados de carcinoma prostático,

50 disponíveis em banco de dados, além de auxiliarem na construção de redes de interação

51 e de vias de sinalização possivelmente relacionadas ao CaP. Com isso, através da

52 identificação das proteínas AKT1, POLR2A, RAB1A e ITGA5 que estavam

53 diferencialmente expressas no grupo AÇU, obtivemos uma visão global dos efeitos do

54 consumo pós-natal de açúcar sobre a próstata ventral de ratos envelhecidos.

55

56

57
58 1. Introdução

59 Obesidade em crianças e adolescentes é um importante problema de saúde nos

60 países desenvolvidos e em desenvolvimento (LEE; YOON, 2018). O excesso de peso

61 e a obesidade associados a hábitos de vida sedentários durante a infância até a vida

62 adulta podem levar ao desenvolvimento de síndromes metabólicas (SMs), que são um

63 conjunto de doenças crônicas como diabetes tipo 2, hipertensão, doenças

64 cardiovasculares e resistência à insulina (LANKTREE; HEGELE, 2020; REILLY;

65 KELLY, 2011; PEREIRA; ODEGAARD, 2013; LOBSTEIN; BAUR; UAUY, 2004;

66 BROEK et al., 2015) . Um dos fatores que aumentam o risco de desenvolvimento de

67 SMs é a dieta rica em “açúcares de adição”, que são carboidratos simples adicionados

68 artificialmente ao processo industrial dos alimentos (NARAIN; KWOK; MAMAS,

69 2017). A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que o consumo desses

70 açúcares de adição não ultrapasse 5% do total de calorias diários (WORLD HEALTH

71 ORGANIZATION., 2015) e segundo o Mistério da Saúde, a população brasileira

72 consome 50% a mais desses carboidratos do que é recomendado pela OMS, por isso foi

73 realizado um acordo no país com a indústria alimentícia para reduzir a quantidade de

74 açúcares em alguns produtos até 2022. A estimativa é que seja reduzido 144 mil

75 toneladas de açúcar nos alimentos (MS, 2018).

76 Além de estar associado à incidência de SMs, o consumo exacerbado de

77 açúcares de adição, presentes em bebidas adoçadas artificialmente e alimentos

78 industrializados, está relacionada ao desenvolvimento de câncer (MILES;

79 NEUHOUSER; ZHANG, 2018). Otto Warburg demonstrou que células cancerígenas

80 se aglutinam em maior quantidade para consumir o açúcar, ou seja, consomem mais

81 glicose que células normais, ação conhecida como efeito de Warburg (SIDNEY WEIN

82 HOUSE, OTTO WARBURG, 2016). Este é discutido em muitos tipos de canceres, no

83 câncer de próstata (CaP) que é o câncer não-cutâneo mais comum entre os homens do

84 mundo, sendo a quinta principal causa de morte entre o sexo masculino (BRAY;

85 FERLAY; SOERJOMATARAM, 2018), sabe-se que as células alteram o metabolismo

 86 energético, que é reduzido em células prostáticas normais e elevado em células

87 cancerígenas alterando principalmente os processos catabólicos e anabólicos

88 (CUTRUZZOLÀ et al., 2017).

89 O desenvolvimento do CaP é grandemente estudado, uma vez que ele afeta uma

90 das principais glândulas acessórias exócrinas do sistema genital masculino, responsável

91 por produzir aproximadamente 30% do líquido seminal, com a principal função de

92 liquefazer o sêmen, ativar a motilidade espermática e proteger os espermatozoides

93 contra danos imunológicos causados pelo sistema genital feminino (ZENZMAIER;

94 UNTERGASSER; BERGER, 2008). O desenvolvimento prostático é andrógeno

95 dependente, e em roedores o processo se inicia na gestação e é finalizado quando os

96 animais atingem a maturidade sexual, com aproximadamente 90 dias de idade

97 (AUMÜLLER; SEITZ, 1990; MARKER et al., 2003; UNTERGASSER;

98 MADERSBACHER; BERGER, 2005; VERZE; CAI; LORENZETTI, 2016). Portanto

99 insultos sofridos durante esse processo de desenvolvimento são decisivos para a correta

100 funcionalidade da próstata. Além de que condições pós-natais desfavoráveis ao longo

101 da vida podem agravar ainda mais estes efeitos. Estudos epidemiológicos demonstram

102 que o alto consumo de produtos adoçados artificialmente com açúcares de adição da

103 infância até a idade adulta está relacionado diretamente com o desenvolvimento de SMs

104 que contribuem no progresso, na agressividade e na mortalidade do CaP

105 (SELAHATTIN et al., 2019; MAKAREM et al., 2018; MILES; NEUHOUSER;

106 ZHANG, 2018). Outra condição que é considerada fator de risco é o processo de

107 envelhecimento, uma vez que as principais patologias que acometem a próstata, como

108 o CaP, alterações proliferativas tanto benignas quanto malignas ocorrem

109 principalmente acima de 65 anos (BRAGA; DE SOUZA; CHERCHIGLIA, 2017).

110 Os últimos anos foram marcados por grandes avanços nos estudos de

111 sequenciamento em larga escala baseadas na combinação de “omas” (transcriptoma,

112 microRoma, metiloma e proteoma). Análises integrativas destes dados utilizando

113 ferramentas de bioinformática, associadas a parâmetros clínicos têm auxiliado na

114 elucidação de redes moleculares envolvidas na patogênese de várias doenças, além de

115 servir como importante ferramenta para identificação e seleção de potenciais alvos

116 terapêuticos (SOOKOIAN et al., 2013). Além disso, estudos recentes têm utilizado a

117 análise proteômica para explorar o desenvolvimento e progressão dos tumores de

118 próstata, tanto em cultivos celulares, tecidos animais e amostras humanas (CHA et al.,

119 2017; TANASE et al., 2017; ZHANG et al., 2011).

120 Com isso, o objetivo desse trabalho foi analisar os efeitos do consumo de açúcar

121 da infância até a idade adulta na glândula prostática de ratos machos envelhecidos, e

122 através de análises de proteômica investigar os possíveis mecanismos moleculares

123 envolvidos no desenvolvimento e progressão dos tumores de próstata.

124

125 2. Resultados

126 2.1 Análises de TTGO e metabólicas

127 Na análise do teste de tolerância a glicose oral (TTGO) não houve diferença

128 estatística entre os grupos experimentais (Figura 01 – A e B).

129
130 Figura 01 – A: Gráfico representativo do Teste de Tolerância a Glicose Oral (TTGO)
131 dos animais no dia pós-natal (DPN) 540. B: Gráfico representativo da Área sob a curva
132 (AUC) dos animais no dia pós natal (DPN) 540. Grupo CTR – Controle. Grupo AÇU -
133 Açúcar.
134
135 Nas análises para os parâmetros bioquímicos de glicose, proteínas totais e

136 triglicerídeos não foram constatadas diferenças estatísticas entre os grupos

137 experimentais no dia pós-natal (DPN) 540 (Tabela 01).

138 Tabela 01: Parâmetros séricos da prole no DPN 540.

DPN 540
Parâmetros
CTR AÇU

Glicose (mg/dL) 208,00 ± 20,91 207,60 ± 16,77

Proteínas totais (mg/dL) 8,89 ± 1,13 7,97 ± 0,53

Triglicerídeos (mg/dL) 231,50 ± 77,21 228,20 ± 32,8

Dados são expressos com média ± desvio padrão. CTR - grupo
Controle; AÇU - grupo Açúcar; DPN - Dia pós-natal.
139

140 2.2 Parâmetros biométricos

141 Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos CTR e AÇU

142 para os parâmetros biométricos analisados no DPN 540 (Tabela 02).

143
144 Tabela 02: Parâmetros biométricos da prole no DPN 540.
DPN 540
Parâmetros
CTR AÇU

Peso corpóreo (g) 613,70 ± 21,89 653,00 ± 18,76

Distância ano-genital (cm) 32,53 ± 1,24 34,81 ± 1,05
Gordura visceral (g) 12,23 ± 1,31 14,50 ± 1,10
Gordura retroperitoneal (g) 18,70 ± 1,41 23,04 ± 2,03
Gordura epididimária (g) 16,90 ± 1,11 19,54 ± 1,94
Gordura total (g) 51,10 ± 4,36 54,80 ± 4,61
Índice de Lee (g/cm) 3,17 ± 0,08 3,20 ± 0,04
IMC (g/cm) 0,91 ± 0,05 0,95 ± 0,02
Peso absoluto PV (g) 0,47 ± 0,04 0,49 ± 0,03
Peso relativo PV1 0,83 ± 0,05 0,75 ± 0,05
145 Dados são expressos com média ± desvio padrão. 1 Dados multiplicados por 1000.
146 CTR - grupo Controle; AÇU - grupo Açúcar; DPN - Dia pós-natal. IMC - Índice
147 de Massa Corporal; PV - Próstata Ventral.
148
149 2.3 3 Alterações morfológicas da próstata ventral

150 Foram observadas em ambos os grupos experimentais as seguintes alterações

151 histopatológicas: atrofia epitelial, hiperplasia fisiológica periférica, hiperplasia atípica

152 (Figura 02). Alterações como a neoplasia intra-epitelial prostática (PIN, do inglês

153 prostatic intraepithelial neoplasia) e carcinoma in situ (Figura 03) foram observadas

154 predominantemente no grupo AÇU.

155
156 Figura 02 – Fotomicrografias do lobo prostático ventral (PV) coradas com
157 Hematoxilina-Eosina do grupo CTR. A e B - atrofia epitelial indicada pelas setas. C e
158 D - hiperplasia fisiológica periférica indicado pelas setas. E e F - hiperplasia atípica
159 indicada pelas setas; L = lúmen; E = estroma; EP = epitélio. Barra: figuras A, D e E,100
160 µm, figuras B e F, 50 µm, figura C, 200 µm.
161

162
163 Figura 03 – Fotomicrografias do lobo prostático ventral (PV) coradas com
164 Hematoxilina-Eosina do grupo AÇU. A e B – neoplasia intra-epitelial prostática
165 indicado pelas setas; C e D – carcinoma in situ indicado pelas setas. Círculos indicam
166 microácinos e asteriscos apontam vasos sanguíneos. L = lúmen; E = estroma; EP =
167 epitélio. Barra: figuras A, 100 µm, figuras B e D, 50 µm, figura C, 200 µm.
168

169 2.4 Análises de estresse oxidativo.

170 Não houve diferença estatística nas atividades das enzimas catalase (CAT),

171 glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD) (Tabela 03) entre o

172 grupo CTR e AÇU.

173
174 Tabela 03: Dados de estresse oxidativo da prole no DPN 540.
Parâmetros DPN 540
 CTR AÇU

CAT (%) 26,54 ± 7,10 22,22 ± 8,69

SOD (%) 6,73 ± 1,70 6,78 ± 1,78

GSH (%) 0,08 ± 0,03 0,11 ± 0,1

175 Dados são expressos com média ± desvio padrão. CTR - grupo
176 Controle; AÇU - grupo Açúcar; DPN - Dia pós-natal.
177 2.5 Perfil proteômico dos animais no DPN 540

178 A partir da análise proteômica foram identificadas um total de 5443 proteínas nas PVs.

179 Para as análises das proteínas diferencialmente expressas (PDE) entre o grupo CTR e

180 AÇU foi considerado Log2 de Fold Change 0,66 e p< 0,05. tivemos um total de 75

181 PDE, sendo 32 proteínas que foram up reguladas e 33 down reguladas (Tabela 04).

182

183 Tabela 04: Proteínas diferencialmente expressas up e down reguladas.

UP DOWN

AABR07012129.1 Fkbp8 Ab1-233 Itga5

AABR07051707.1 Fxr1 Acss2 Klk1c8

Akt1 Get4 Agt Nhlrc3
Ankrd52 Kif16b Amy1a Pex5
B4galt6 Lpcat3 Apoc3 Ro60
Brd3 Mrpl46 Atp6v1f Serpina1
Cmas Pdrg1 Bola1 Slc27a4
Col14a1 Polr2a Casq1 Steap3
Col5a1 Prpf3 Ccdc124 Timm8a1

Dhx38 Rab1b Crtc1 Timm9

Dis3l2 Rcor1 Dhps Trim33
Dnajc17 Smg5 Fibp Tspo
Eef2k Trappc9 Fkbp15 Vamp2
Emilin3 Trim3 Gar1 Vapa
Farp1 Uhrf1bp1 Gc Vps37c
 Fem1a Ulk1 Hmgn2 Wdr55
Igfbp4

184

185 2.6. Análises de enriquecimento demonstraram vias moleculares alteradas nas

186 PVs dos animais do grupo AÇU.

187 Das análises de enriquecimento das proteínas up reguladas utilizando a ferramenta

188 enrichr e o banco de dados BioPlanet 2019 foram encontrados termos enriquecidos

189 relacionados à proteínas integrais na angiogênese, via de sinalização mTOR, telômeros,

190 telomerase, envelhecimento e imortalidade celular, sinalização mTOR, via do Sindecan

191 1, processamento de RNA mensageiro, biossíntese de colágeno e de enzimas

192 modificadoras, regulação da telomerase, sinalização da AMPK e sinalização de G beta-

193 gamma através de PI3K (Figura 04). Em relação as proteínas down reguladas do banco

194 de dados Gene Ontologie Molecular Function 2018 foram identificados termos

195 enriquecidos associados a ligação de colesterol e de esterol, atividade inibidora da

196 endopeptidase do tipo serina, ligação ao receptor 2 do fator de crescimento endotelial

197 vascular (VEGF), ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina II (IGF-II),

198 atividade transportadora de ácidos graxos, elemento de resposta ao AMPc, atividade

199 inibidora de endopeptidase, ligação ao receptor do VEGF, atividade da oxidoredutase,

200 íons metálicos oxidantes, NAD ou NADP como aceitador (Figura 05).
201

202 Figura 04 – Análise de enriquecimento da ferramenta Enrichr das proteínas up

203 reguladas.

204

205 Figura 05 - Análise de enriquecimento da ferramenta Enrichr das proteínas down

206 reguladas.

207 2.7. Rede de interação entre proteínas

208 As análises da rede de interação das proteínas resultaram em diversos clusters para

209 as proteínas desreguladas. Foram identificados três principais clusters para as proteínas

210 up reguladas no DPN 540 (Figura 06 - A): (1) Rab (Member RAS Oncogene Family)

211 1a, Trappc9 (Trafficking Protein Particle Complex 9) e Kif16B (Kinesin Family
212 Member 16B); (2) Prpf3 (Pre-mRNA Processing Factor 3) e Dhx38 (DEAH-Box

213 Helicase 38); (3) Col14a1 (Collagen Type XIV Alpha 1 Chain) e Col5a1. Para as down

214 reguladas foram encontrados dois clusters predominantes (Figura 06 - B): (1) Timm

215 (Translocase Of Inner Mitochondrial Membrane) 9, Timm8a1 e

216 ENSRNOG00000043480 (Timm9); (2) Pex5 (Peroxisomal Biogenesis Factor 5),

217 ENSRNOG00000010407 (Pex5) e Agxt (Alanine-Glyoxylate And Serine-Pyruvate

218 Aminotransferase)

219
220 Figura 06 – Redes de interação proteína-proteína obtida pela ferramenta String das
221 proteínas diferencialmente expressas entre os dois grupos experimentais. A – Proteínas
222 up reguladas. B – Proteínas down reguladas.
223 2.8. Análises de validação no The Human Protein Atlas em amostras humanas de

224 CaP

225 Ao comparar as proteínas desreguladas encontradas com dados de pacientes com

226 PCa no The Human Protein Atlas (HPA), foram identificadas três proteínas up

227 reguladas (AKT1, POLR2A e RAB1A) que demonstraram aumento de

228 imunomarcações em PCa quando comparado com tecidos prostático normais. Na

229 análise da proteína ITGA5 down regulada não foi detectada marcação positiva no CaP,

230 enquanto no tecido normal é possível identificar imunomarcão (Figura 07).

231
232 Figura 07 – Imagens representativas retiradas do Human Protein Atlas
233 (https://www.proteinatlas.org/) de reação de imunohistoquímica das proteínas up
234 reguladas AKT1, POLR2A e RAB1A, e da proteína down regulada ITGA5
235 comparando imunomarcações positivas em tecido normal e em adenocarcinoma na
236 próstata de diferentes pacientes homens.

237

238 3. Discussão
239 Diante do que foi exposto pode se observar que o consumo de altas quantidades

240 de açúcares da infância até a idade adulta pode acarretar alterações metabólicas

241 corpóreas e levar ao desenvolvimento de carcinoma in situ na próstata de animais ao

242 envelhecimento.

243 Em relação aos dados biométricos o consumo pós-natal de açúcar não alterou

244 os parâmetros analisados. Dados semelhantes foram descritos por FRANKLIN et al.,

245 (2017) que após fornecer solução de água com sacarose diluída por 26 dias, os animais

246 na idade adulta não apresentaram diferenças no peso corpóreo entre os grupos

247 experimentais. Assim como no trabalho de NOBLE et al., (2017) no qual foram

248 fornecidas aos animais soluções com açúcar diluído a 11% e quando adultos os animais

249 não apresentaram diferenças significativas no peso corpóreo e índices de gorduras

250 corporais. Esses resultados podem estar relacionados com o fato de que os ratos

251 supostamente equilibram o excesso de energia obtida da solução açucarada reduzindo

252 o consumo de alimento sólido (AVENA; RADA; HOEBEL, 2009; FRANKLIN et al.,

253 2016). Além disso não encontramos alterações nos parâmetros bioquímicos que foram

254 analisados, ZHANG et al., (2018) com um estudo com consumo de solução de açúcar

255 no período pós-natal também não visualizaram efeitos nos níveis séricos de glicose e

256 triglicerídeos, resultados que corroboram com os nossos.

257 A literatura demonstra resultados divergentes quanto ao teste de tolerância a

258 glicose em animais que consumiram solução de açúcar. Em roedores no DPN 112,

259 ZHANG et al., (2018) demonstraram que animais tratados apresentaram resistência à

260 glicose no tempo de 30 minutos, entretanto quando repetido o experimento no DPN 168

261 não houve diferença significativa no teste de tolerância a glicose entre os dois grupos.

262 Resultados semelhantes foram visualizados por SHENG et al., (2017) onde não

263 observaram diferença nesses parâmetros em roedores com 126 dias. Em animais

264 envelhecidos, MCDONALD, (1990) não encontrou diferenças significativas nos níveis

265 de glicose sanguínea e no teste de tolerância a glicose após submeter ratos velhos (DPN

266 645) à dieta com alta concentração de sacarose.

267 As análises morfológicas da PVs dos animais experimentais demonstraram

268 alterações típicas do envelhecimento como: atrofia epitelial, hiperplasia fisiológica

269 periférica, hiperplasia e neoplasia intra-epitelial prostática (SHAPPELL et al., 2004).

270 O carcinoma in situ é a lesão potencialmente precursora do adenocarcinoma invasivo

271 (BAALBERGEN; HELMERHORST, 2014). Este tumor se desenvolve a partir de uma

272 proliferação epitelial interalveolar, que pode preencher completamente a luz de um ou

273 mais alvéolos prostáticos. Alterações na arquitetura alveolar e compressão de tecidos

274 adjacentes são características deste tipo de lesão, há grande variação morfológica em

275 lesões mais severas (BOSLAND et al., 1992; SHAPPELL et al., 2004).

276 Apesar do consumo de açúcar até idade adulta, os animais do grupo AÇU não

277 apresentaram diferença nas vias de estresse oxidativo, isso pode estar relacionado com

278 uma recuperação dos parâmetros oxidativos sofrida pelos animais até o

279 envelhecimento. QI et al., (2020) evidenciou que roedores após serem submetidos à

280 dois insultos: dieta rica em gorduras e exercícios de natação demonstraram alterações

281 na via de estresse. Por outro lado, estudos realizados em pacientes com Hiperplasia

282 Prostática Benigna (HPB) e CaP não demonstraram alterações na maioria dos níveis de

283 estresse oxidativo (AYDIN et al., 2006; KAYA et al., 2017; KUCUKDURMAZ et al.,

284 2017).

285 A partir da análise de proteômica das amostras prostáticas dos animais

286 experimentais foram identificadas proteínas desreguladas associadas a mecanismos

287 moleculares que estão envolvidos na homeostase do tecido. A Akt1 é um proteína

288 kinase que tem papel fundamental na regulação do crescimento celular, proliferação,

289 diferenciação e mediação da apoptose (CHU et al., 2018; MANNING; TOKER, 2017;

290 HIXON; BOEKELHEIDE, 2003). Estudos relacionados com roedores submetidos a

291 insultos no periodo perinatal demonstraram alterações na via da Akt. XU; JIANG;

292 DING, (2015) após fornecer dieta rica em gorduras (high-fat diet) para ratos

293 transgênicos demonstraram que imunomarcações positivas para Akt no tecido

294 prostático foram significativamente maiores quando comparados ao grupo controle. O

295 trabalho de MARTIN-GRONERT et al., (2016) submeteu as ratas mães à alimentação

296 com baixa quantidade de proteína durante os períodos de gestação e lactação e

297 evidenciou que o tecido adiposo da prole de ratos machos apresenta maior expressão

298 proteica da Akt1. Em relação ao CaP, LIAO et al., (2003) demonstraram que a Akt está

299 up regulada em CaP humano e sua alta expressão está relacionada com a progressão da

300 lesão. Já em roedores os mesmos autores relacionaram a via da Akt com a redução de

301 receptores de andrógenos (AR), as regiões de lesões de roedores que tiveram o CaP

302 induzido apresentaram aumento de imunomarcações da Akt na forma forforilada

303 enquanto marcações positivas para AR foram reduzidas no adenocarcinoma quando

304 comporados a regiões prostáticas normais e essas alterações estão relacionadas com

305 processos de angiogênese, proliferação e apoptose (LIAO et al., 2005).

306 Outra proteína que está sendo estudada em diversos tipos de células

307 cancerígenas e que está up regulada nos animais do grupo AÇU é a POLR2A, que é

308 uma unidade catalítica do complexo da RNA polimerase II e possui um papel

309 fundamental na coordenação da transcrição, mediando a regulação gênica a partir do

310 processamento de mRNA (HOU et al., 2019; SALDI et al., 2016). LI et al., (2018)

311 demonstraram que a atividade da POLR2A pode estar envolvida com a proliferação

312 celular, a sobrevivência e o crescimento do tumor em casos de CaP. YAMADA et al.,

313 (2013) relacionou a proteína à contribuição no desenvolvimento de mesotelioma

314 maligno e consequentemente, o bloqueio da expressão da POLR2A leva a inibição do

315 crescimento das celulas cancerígenas deste tipo de neoplasia. Além disso tivemos a

316 proteína RAB1A up regulada que pertence a super família de oncogenes Ras, , que

317 conta com pelo menos 30 proteínas diferentes como as proteínas Rab, as quais têm a

318 função de facilitar a identificação de vesículas e/ou a fusão com células-alvo

319 (NOVICK; BRENNWALD, 1993). A superexpressão da proteína RAB1A está

320 intimamente envolvida na tumorigênise e progressão de diversos tipos de lesões,

321 incluindo câncer cervical (NIKOSHKOV et al., 2015), câncer de mama (XU et al.,

322 2017), câncer colorretal (WANG et al., 2018) e entre outros. No CaP o papel da RAB1A
323 deve ser aprofundado, ABD ELMAGEED et al., (2014) demonstraram em estudos

324 in vitro que através da ação de vesículas, a RAB1A é capaz de atuar em células tronco

325 derivadas do tecido adiposo para atraí-las às células do CaP, aumentando a incidência

326 de proliferação celular na lesão.

327 Entre as alterações descritas na carcinogênese estão as interações entre as

328 células epiteliais glandulares e a matriz extracelular, essas interações são reguladas por

329 moléculas de adesão celular como a integrina α-5 (ITGA5) (DRIVALOS et al., 2016)

330 que podem estar relacionada à sobrevivência das células tumorais (STUPACK;

331 CHERESH, 2002). Diversos estudos indicam que a ITGA5 pode ser regulada

332 positivamente (WANG et al., 2011; YU et al., 2019) ou negativamente (HUANG; IP,

333 2001; VARNER; EMERSON; JULIANO, 1995) em células de diferentes tipos de

334 tumor, em comparação com células normais. Em relação ao CaP estudos divergem

335 sobre a regulação positiva/negativa da proteína, REN; JOSHI; MATHEW, (2016)

336 demonstraram que em linhagem de células prostáticas cancerígenas a ITGA5 está up

337 regulada e ao reduzir sua atividade houve uma resposta apoptótica nas células

338 diminuindo a viabilidade celular. Em contrapartida DRIVALOS et al., (2016) e CHEN

339 et al., (2006) evidenciaram baixa expressão da ITGA5 em amostras de CaP humano,

340 resultados que corroboram com os nossos. A ITGA5 está relacionada com a montagem

341 da matriz extracelular do tecido (HSIA; NAIR; CORBETT, 2014), sendo assim, a

342 redução da atividade dessa integrina é capaz de danificar a estabilidade célula-célula da

343 matriz levando a uma degradação celular, o que pode facilitar o processo de

344 infiltração e de metástase do carcinoma (DRIVALOS et al., 2016).

345 Assim acreditamos que principalmente a up regulação da AKT1, POLR2A e

346 RAB1A e a down regulação de ITGA5 que foram evidenciados pelas nossas análises

347 podem estar envolvidas com o desenvolvimento do carcinoma in situ observado em

348 nossos animais ao envelhecimento.

349

350 4 - Conclusão
351 Podemos concluir que cuidados alimentares, principalmente em períodos de alta

352 vulnerabilidade como a infância são de suma importância para a prevenção de doenças

353 que podem ocorrer na vida adulta. Sendo assim, a partir dos resultados obtidos nesse

354 trabalho foi possível obter uma visão global dos efeitos do consumo pós-natal de açúcar

355 sobre a próstata ventral de ratos envelhecidos, as análises realizadas permitiram

356 identificar as proteínas desreguladas como a AKT1, POLR2A, RAB1A e ITGA5 que

357 possivelmente estão envolvidas no desenvolvimento do carcinoma in situ prostático e

358 que a partir de estudos futuros podem ser possíveis alvos terapêuticos para o câncer de

359 próstata.

360

361 5. Materiais e Metódos

362 5.1 Acasalamento e consumo de açúcar pós-natal

363 Foram utilizados ratos machos e fêmeas Sprague Dawley adultos fornecidos

364 pelo Centro de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP. Os

365 animais e suas proles foram mantidos no Biotério de Pequenos Mamíferos do

366 Departamento de Morfologia, em caixas de polietileno, dois animais por caixa, com

367 substrato de maravalha autoclavada, em condições controladas de luminosidade (12

368 horas de fotoperíodo) e temperatura entre 220C e 250C, sendo fornecida água filtrada e

369 ração ad libitum.

370 As ratas foram submetidas ao acasalamento e após ser constatada a prenhes pela

371 presença de espermatozoide visualizado no lavado vaginal, as ratas receberam ração

372 normoproteica (17% de proteína) e água ad libitum durante toda a gestação e lactação.

373 No desmame, no dia pós natal (DPN) 21 os animais machos foram separados em 2

374 grupos experimentais: grupo Controle (CTR) que recebeu água normal durante todo o

375 período experimental e grupo Açúcar (AÇU) que recebeu açúcar refinado diluído a 10%

376 na água a partir do DPN 21 até o DPN 90. Após o DPN 90 receberam água normal ad

377 libitum e foram eutanasiados no DPN 540 (Figura 08).

378
379 Figura 08 - Delineamento experimental. CTR - Grupo Controle; AÇU – Grupo
380 Açúcar; DG- dia gestacional; DPN- dia pós-natal (DPN).
381
382 Dentre os vários tipos de açúcares foi escolhido o açúcar refinado por ser o tipo

383 mais consumido e de fácil acesso da população. Foi utilizado o açúcar refinado

384 comercializado de uma mesma marca para todo o experimento. A concentração de 10%

385 de sacarose foi escolhida a partir de dados publicados por KENDIG et al., (2015) que

386 demonstraram que a prole masculina de ratas submetidas ao consumo de sacarose na

387 concentração de 10% quando expostas na vida adulta à mesma concentração de açúcar

388 com ou sem atividade física apresentaram aumento da sensibilidade à insulina

389 produzida pelo exercício se comparada ao grupo controle, além de maiores níveis de

390 glicemia em jejum em animais nascidos de mães que consumiram açúcar na gestação

391 comparada aos animais provenientes de gestação normal.

392 Durante o tratamento do DPN 21 até o DPN 90 foram acompanhados os pesos

393 corpóreos, o consumo de ração e água dos machos. No DPN 540, os animais foram

394 pesados e eutanaziados. Amostras do plasma sanguíneo foram coletadas para análises

395 bioquímicas séricas (glicose, triglicerídeos e proteínas totais) e os lobos prostáticos

396 ventrais (PV) foram pesados e coletados para análises hisopatológicas, estresse

397 oxidativo e de perfil proteômico que estão descritas abaixo detalhadamente.

398 Os procedimentos experimentais estão de acordo com os Princípios Éticos na

399 Experimentação Animal adotado pelo Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de

400 Laboratório (SBCAL) e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais

401 do Instituto de Biociências de Botucatu (CEUA-951)

402

403 5.2 Curva glicêmica

404 O teste de tolerância a glicose oral (TTGO) foi realizado seguindo o protocolo

405 de RAKVAAG et al. (2019) sendo feito uma semana antes do DPN 540. Após 10 horas

406 de jejum os ratos receberam uma solução de glicose diluída em água (200g/L) através

407 de gavagem (2g/kg de peso corpóreo) (t=0 minutos). As amostras sanguíneas para as

408 determinações glicêmicas foram obtidas através da ponta da cauda usando o

409 glicosímetro One Touch nos tempos de 30, 60 e 120 minutos pós gavagem. As

410 mudanças na glicose sanguínea durante o TTGO foram avaliadas pelo cálculo da área

411 sob a curva (AUC).

412 5.3 Análises Metabólicas

413 Os parâmetros bioquímicos foram avaliados no DPN 90 e 540 no plasma

414 sanguíneo por métodos colorimétricos. Todas as análises foram realizadas em

415 colaboração com a Profa. Dra. Fernanda Mani, do Departamento de Ciências Químicas

416 e Biológicas do Instituto de Biociências de Botucatu.

417 Determinação da concentração de proteínas totais

418 Foi realizada pelo método do biureto, o qual consiste na associação do íon

419 cúprico com as ligações peptídicas das proteínas em meio alcalino, resultando em um

420 complexo de cor violeta, com intensidade proporcional à concentração de proteína e

421 com máximo de absorção a 540 nm. As medidas espectrofotométricas foram realizadas

422 utilizando-se filtro de 540 nm (BURTIS; BURNS, 2016).

423 Determinação da concentração de glicose

424 A glicose sanguínea é oxidada a ácido glicônico por ação da glicose-oxidase e

425 forma peróxido de hidrogênio. Este peróxido de hidrogênio (H2O2) formado reage com

426 4-aminoantepirina e com 2-4 dinitrofenol, na presença de peroxidase e antipirilquinona,

427 de cor vermelha. A intensidade de cor formada é proporcional à concentração de

428 glicose. Leituras espectrofotométricas foram realizadas a 510 nm (BARBOSA et al.,

429 1993).

430

431 Determinação da concentração de triglicerídeos

432 Os triglicérideos são hidrolisados enzimaticamente por uma lipase específica,

433 produzindo glicerol e ácidos graxos. O glicerol se oxida a formaldeído na presença de

434 ácido, que é quantificado colorimetricamente a 410 nm como 3,5-diacetil-1,4-

435 diidrolutidina. (BURTIS; BURNS, 2016).

436 5.4 Morfologia

437 Os antímeros direitos dos lobos prostáticos ventrais dos animais do DPN 540

438 foram fixados em Methacarn (70% de metanol + 20% de clorofórmio + 10% ácido

439 acético) por 4 horas (PUCHTLER et al., 1970). Após a fixação, o material foi

440 desidratado em série crescente de etanóis, diafanizado em xilol e incluído em Paraplast

441 (Sigma). Cortes foram produzidos em micrótomo rotativo com 5µm de espessura,

442 coletados em lâminas silanizadas e corados pela Hematoxilina-Eosina para a análise

443 geral da estrutura glandular.

444 5.5 Análises de estresse oxidativo

445 Com o antímero esquerdo da PV foram realizadas as análises de estresse

446 oxidativo para glutationa reduzida (GSH- PX), superóxido dismutase (SOD) e catalase

447 (CAT) nos animais no DPN 90 e 540. Estes parâmetros foram feitos em parceria com

448 a Prof. Dr. Clélia A. H. Lima, do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional do

449 Instituto de Biociências de Botucatu.

450 Determinação da atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px– EC 1.11.1.9)

451 A atividade da glutationa peroxidase foi determinada segundo método de

452 NAKAMURA; HOSODA; HAYASHI (1974), na presença de peróxido de hidrogênio.

453 A mistura da reação foi preparada com tampão fosfato de sódio, NADPH2, azida

454 sódica, EDTA, glutationa reduzida (GSH) e glutationa redutase. Através da oxidação

455 do NADPH2, a 340 nm, na presença da glutationa redutase, a qual catalisa a redução

456 da glutationa oxidada (GSSG), se determinou a atividade da GSH-Px, expressa em

457 U/mL.

458 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD– EC 1.15.1.1)

459 A atividade da superóxido dismutase foi determinada pela técnica de CROUCH

460 et al. (1981), tendo como base a capacidade de a enzima inibir a redução do

461 nitrobluetetrazólico (NBT) por radicais livres gerados pela hidroxilamina em meio

462 alcalino (pH 10). A hidroxilamina gera fluxo de O2 do NBT para blue-formazana em

463 temperatura ambiente. Quando a amostra foi adicionada, a velocidade de redução do

464 NBT foi inibida, conforme a atividade da SOD na amostra. A atividade da enzima foi

465 expressa em U/mg de proteínas totais.

466 Determinação da atividade da catalase (CAT) (CAT- EC 1.11.1.6)

467 A atividade da catalase foi determinada segundo o método (AEBI, 1984). O

468 homogenato de amostras de próstata ventral foi adicionado a uma solução de H2O2

469 (0,010 mol em tampão fosfato salino, PBS, 0,05 mol a pH 7). A determinação da

470 absorbância foi feita em espectrofotômetro a 540 nm.

471 5.6 Análises estatísticas

472 Os resultados obtidos foram primeiramente submetidos a um teste de

473 normalidade Shapiro-Wilk e posteriormente foi feito o test T de Student. As diferenças

474 foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05. As análises

475 estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prisma (versão 8.0; GraphPad,

476 Inc., San Diego, CA, USA).

477 5.7 Expressão proteica global por espectrometria de massas

478 As análises proteômicas realizadas fazem parte de um projeto BEPE de

479 doutorado (Processo FAPESP 2019-00690-3) feitas em parceria com o professor Dr.

480 Thomas Kislinger, do Departamento de Biofísica Médica, Centro Princess Margaret

481 Cancer da Universidade de Toronto, Toronto-Ontario, Canada.

482 Inicialmente para a extração das próstatas ventrais foi usado 100 µL da solução

483 de 50% trifluoroetanol (TFE) + 50% de solução de bicarbonato de amônia a 100Mm.

484 Antes da digestão das proteínas pela tripsina, as amostras foram sonicadas e

485 quantificadas pelo método de BCA, o qual padronizamos e utilizamos uma

486 concentração de 100 µg de proteína por amostra. Em seguida foi adicionado 4 µL de

487 SUC2, que é uma proteína de levedura para controle de qualidade de preparação das

488 amostras juntamente com 1 µL de ditiotretol 5 mM (DTT) para a redução das ligações

489 de dissulfeto por 30 min a 56⁰C. Posteriormente foi adicionado 10 µL iodacetamida

490 (IAA) 25 mM durante 30 minutos, a temperatura ambiente no escuro, para evitar que

491 as pontes de dissulfeto se refizessem.

492 As amostras foram diluídas em 400 µL de tampão ABC e adicionados 2 µL de

493 tripsina para digestão das proteínas + 1µL cloreto de cálcio a 2M, que é um cofator

494 enzimático overnight. Posteriormente as amostras foram liofilizadas no Speec Vacum

495 e os peptídeos resultantes foram resuspendidos em 50 µL de ácido trifluoacético (TFA)

496 a 0,1%. A dessalinização foi feita em colunas C18. Os solventes foram removidos por

497 centrifugação a vácuo e eluídos em uma solução de 0.1% TFA em 80% de acetronitrila

498 (AcN). Em seguida as amostras foram liofilizadas, resuspendidas em uma solução de

499 0,1% de ácido fórmico e padronizadas em uma concentração de 0,2 µg/Ul de peptídeos.

500 Um total de 2 μg de peptídeos foram usados em cada análise de proteômica.

501 Todas as amostras foram separadas cromatograficamente usando um sistema de

502 cromatografia nano liquida EasyLC-1000 (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)

503 com uma nano-UHPLC aquecida (coluna de fase reversa C18 de 50 cm, EasySpray

504 803, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA), em interface com um espectrômetro de

505 massa tandem Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Os dados gerados

506 foram processados pelo MaxQuant (Versão: 1.5.3.8) usando um banco de dados de

507 sequência FASTA-proteína de sequência de proteínas de ratos do UniProt (Cox; Mann,

508 2008). As proteínas foram identificadas com um mínimo de dois peptídeos únicos que

509 foram direcionados para análises adicionais. A abundância proteica foi analisada por

510 quantificação livre de marcadores (LFQ) ou quantificação absoluta baseada em

511 intensidade ajustada pela mediana (iBAQ).

512 5.8 Análises Integrativas

513 Enrichr (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr) foi a ferramenta utilizada para a

514 análise de enriquecimento e foram escolhidos os 10 termos mais enriquecidos com p-

515 value < 0,05 (KULESHOV et al., 2016). A ferramenta STRING (http://string-db.org/)

516 foi utilizada para a construção da rede de interação entre as proteínas desreguladas

517 encontradas no trabalho. Para evitar interações falso positivas, foi selecionada uma

518 pontuação de alta confiança (0,7) associada a experimentos e banco de dados como dois

519 canais de evidência rigorosos (SZKLARCZYK et al., 2015).

520 Para validação das proteínas desreguladas no CaP humano foi utilizado o banco

521 de dados do Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) para demonstrar a

522 distribuição e localização por imuno-histoquímica das proteínas em tecido normal e em

523 amostras de CaP.

524

525 Abreviações
526 AÇU = Grupo Açúcar
527 AKT1 = Proteína Kinase B 1Caloric restriction
528 AR = Receptor de Andrógeno
529 AUC = Área sob a Curva
530 CaP = Câncer de Próstata
531 CAT = Catalase
532 CEUA = Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biociências de Botucatu
533 CTR = Grupo Controle
534 DPN = Dia pós natal
535 DTT = Ditiotretol
536 GSH-Px = Glutationa Peroxidase Reduzida
537 IAA = Iodacetamida
538 iBAQ = Intensidade Ajustada pela Mediana
539 IMC = Índice de Massa Corporal
540 ITGA5 = Integrina α-5
541 LFQ = Quantificação Livre de Marcadores
542 NBT = Nitrobluetetrazólico
543 OMS = Organização Mundial da Saúde
544 PBS = Tampão Fosfato Salino
545 PDE = Proteínas Diferencialmente Expressas
546 PIN = Neoplasia Intraepitelial Prostática
547 POLR2A = Subunidade A da RNA polimerase II
548 PV = Próstata Ventral
549 RAB1A = Proteína Relacionada à Ras
550 SBCAL = Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
551 SMs = Síndromes Metabólicas
552 SOD = Superóxido Dismutase
553 TFA = Trifluoacético
554 TFE = Trifluoroetanol
555 TTGO = Teste de Tolerância à Glicose Oral
556

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