UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Centro de tecnologia – Escola de Química

BIOPROCESSOS UTILIZANDO A SACAROSE DO CALDO DE

CANA DE AÇÚCAR COMO SUBSTRATO

Relatório de Fundamentos de Engenharia Bioquímica Experimental

Aliane Zamorano DRE: 105.0434.94

Diego Trica DRE: 106.031.026
Fernando Frenkel DRE: 108.043.956
Filipe Müller DRE: 107.351.568
Gabriela Jacoby DRE: 108.043.930
Karen Guimarães DRE: 108.095.741
Mayara Paes DRE: 108.044.122
Rodrigo Ferreira DRE:
Rodrigo Fernandes DRE: 108.044.203
Vitor Bartolini DRE: 105.056.497

15/12/2011

Trabalho apresentado à Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro como

uma das formas de avaliação na disciplina Fundamentos de Engenharia Bioquímica
Experimental.

DOCENTES: PRISCILLA AMARAL E ELIANA ALHADEF

1.
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

1. INTRODUÇÃO

1.1.CULTIVO DA CANA-DE-AÇÚCAR

Desde o período colonial a cana-de-açúcar tem um papel fundamental na economia

brasileira, e hoje em dia o país é o principal produtor mundial dessa matéria prima. Por ter se
adaptado perfeitamente ao solo e clima do Brasil, a cana tornou-se a principal fonte de renda
para os colonos portugueses e holandeses que moravam no país de meados do século XVI até
o XVII. A cana é produzida em todos os estados brasileiros, mas temos São Paulo como
principal produtor, sendo responsável por 40% de todo plantio nacional. Em seguida temos os
estados de Pernambuco com 20% e Alagoas com 17%. Na tabela abaixo temos alguns dados do
cultivo da cana no Brasil.

Como é possível observar na tabela, o faturamento total obtido com a cana é

significativo em relação ao PIB, principalmente quando relacionamos apenas esse produto com
o PIB dos agronegócios em geral. Mesmo com toda essa importância no mercado, a cana-de-
açúcar ainda vai crescer muito no cenário nacional. Com a produção de etanol crescendo em
todo o país, e o interesse de aumentar a quantidade de álcool na gasolina, ou até mesmo
substituir um combustível pelo outro, o cultivo de cana e o desenvolvimento de novas técnicas
relacionadas ao uso dessa matéria-prima ganharam grande destaque no mercado.
Em termos de mercado internacional, o Brasil é o único exportador significativo de
etanol, apesar de os EUA serem o maior produtor mundial com elevados subsídios a sua
produção.

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

1.2.CARACTERÍSTICAS DA MATÉRIA-PRIMA
A composição química da cana de açúcar é muito variável em função de diversos
fatores, como condições climáticas, propriedades físicas, químicas e microbiológicas do solo,
tipo de cultivo, variedade, entre outros. Hidrogênio, oxigênio e carbono são responsáveis por
cerca de 99% da composição da cana em todos os tipos e espécies. O colmo, parte principal da
cana, possui em média 75% de água e 25% de compostos orgânicos.
As frações mais utilizadas da cana são a fibra e o caldo, sendo o último a grande
matéria prima para fabricação de açúcar e álcool. As fibras podem ser utilizadas para diversos
fins em outros ramos da indústria, e agora estão sendo intensificados os estudos com etanol
de segunda geração gerado a partir de bagaço de cana.
O caldo, parte utilizada nas fermentações realizadas no laboratório, pode ser definido
como uma solução impura de sacarose, glicose e frutose. Possui 82% de água e o restante de
sólidos solúveis ou Brix, sendo estes agrupados em açúcares orgânicos, não açúcares e
compostos inorgânicos.
Os açúcares são representados pela sacarose, glicose e frutose. A sacarose, como o
componente mais importante, tem um valor médio de 14%, enquanto os demais, dependendo
do estado de maturação, 0,2 e 0,4%, respectivamente para a frutose e glicose. Os açúcares
redutores – glicose e frutose – quando em teores elevados, além da presença de outras
substâncias indesejáveis ao processamento, mostram um estágio pouco adiantado de
maturação da cana. No entanto, em cana madura, os açúcares redutores contribuem, embora
com uma pequena porcentagem, para o aumento do teor de açúcar total. Os compostos
orgânicos não açúcares são constituídos de substâncias nitrogenadas (como proteínas e
aminoácidos) e ácidos orgânicos. As substâncias inorgânicas, representadas pelas cinzas, têm
como componentes principais: sílica, fósforo, cálcio, sódio, magnésio, enxofre, ferro e
alumínio.
Entre as vantagens do uso da cana como matéria-prima, em relação a outras fontes,
como o milho, podemos citar alguns fatores como tempo de processamento, produtividade e
custo. Por ter um açúcar simples (sacarose) como base, a cana tem um tempo de processo
muito menor já que pula uma etapa do processo, além de não precisar gastar nada com a
hidrólise do amido, o que é um grande problema para as outras fontes por ter alto custo,
tendo em vista que em grande parte dos casos essa hidrolise é enzimática. A cana consegue
produzir entre 7 e 8 mil litros de etanol por hectare, enquanto o milho, por exemplo, produz
apenas 3,5 mil litros. O custo do litro do álcool de cana é estimado em R$ 0,90, enquanto que
o álcool de milho tem um preço de R$ 1,10. Todos esses fatores mostram que a cana possui

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

um potencial muito grande como matéria-prima para processos fermentativos, e que ainda
existe muito a ser estudado para que todo seu potencial seja aproveitado.

1.3.CARACTERÍSTICAS DO FERMENTO BIOLÓGICO

O conhecido fermento biológico na verdade se trata de um organismo vivo. Este é a

levedura Saccharomyces cerevisiae. Como toda levedura, pertence ao reino dos fungos e se
trata de um microrganismo unicelular eucariótico. É um organismo anaeróbio facultativo, que
tem como fontes principais de carbono: glicose, maltose ou trealose; de nitrogênio: amônia e
uréia; apresenta também necessidade de fósforo e enxofre, assim como de micronutrientes
como magnésio e cálcio.
Suas aplicações industriais clássicas se dão na indústria de bebidas, de etanol e de
panificação. Sua atuação se dá devido à produção de etanol através do processo metabólico
denominado fermentação alcoólica. Neste processo, na ausência de oxigênio como aceptor
final de elétrons, a glicose não é completamente oxidada a água e gás carbônico. O que ocorre
é a oxidação parcial da glicose, gerando como produto o etanol e um rendimento energético
menor. A reação química que descreve esse processo pode ser observada abaixo:

C6H12O6 → 2 CO2 + 2 C2H5OH + Energia

No caso das indústrias de bebidas e etanol combustível o produto da reação acima é o

próprio produto da unidade, no caso o etanol. Já nas indústrias de panificação (o qualquer
indústria alimentícia que utilize fermento biológico), não há interesse na recuperação do
álcool. Na realidade, ao emprego do microorganismo é justificado pela formação de gás
carbônico devido ao metabolismo da levedura, o qual é responsável pelo crescimento e
aeração da massa.
Outra aplicação industrial de S. cervisiae se dá exatamente na indústria de produção
de fermento biológico. Nela, as condições de processo são ajustadas (principalmente
concentração de substrato e aeração) de forma que favoreça o metabolismo aeróbio do
organismo, de tal forma que seja realizada o processo catabólico de respiração celular, ao
invés da fermentação alcoólica. Assim sendo, há um maior rendimento em células, já que o
rendimento energético do processo de respiração é maior, favorecendo a multiplicação das
células de levedura, as quais são normalmente liofilizadas e embaladas para venda.
Além das aplicações clássicas, a levedura S. cerevisiae vem apresentando grande
potencial para emprego em processos biotecnológicos inovadores. Isso é explicado pelo fato
dessa levedura ter sido o primeiro organismo eucariótico a ter seu genoma seqüenciado,
sendo assim o modelo de organismo eucariótico em pesquisas que envolvem biologia

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

molecular. Assim, engenharia genética vem sendo empregada para inserção de genes que
possibilitem a produção de diversos produtos de interesse por esse organismo.

1.4.PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL

Entre as diversas aplicações da levedura Saccharomyces cervisiae industrialmente, sua

principal se dá na produção de álcool. A reação química que representa o processo metabólico
de fermentação alcoólica – o qual é responsável pela geração do etanol – está representada na
sessão acima.
O primeiro grande fator que diferencia os processos de produção de etanol se dá na
fonte de carbono. Essa é função do clima regional onde a usina é instalada. Assim sendo, em
países de clima preferencialmente tropical, como Brasil e Índia, a fonte de carbono para o
processo catabólico é normalmente a cana-de-açúcar. Já em países de clima temperado como
EUA e países europeus, a matéria-prima normalmente é milho ou beterraba. A grande
diferença entre as matérias-primas acima citadas é o tipo de açúcar disponível. No caso da
cana-de-açúcar e beterraba, o açúcar disponível nos vegetais é a própria sacarose, a qual é
facilmente absorvida e metabolizada pelo agente biológico. Já no caso do milho, por exemplo,
o açúcar se encontra na forma de polímeros de glicose denominado amido. Assim, há
necessidade da instalação de operações unitárias responsáveis pela hidrólise dessas cadeias
poliméricas em dissacarídeos fermentescíveis, aumentando os custos de investimento e
operacional da usina a ser instalada. Atualmente, uma nova fonte de carbono vem sendo
pesquisada para produção de álcool. Estes são os materiais lignocelulósicos, mais conhecidos
como bagaço da cana ou palha do milho. Assim como o amido, lignina e celulose são também
polímeros cujos monômeros são monossacarídeos. Todavia, a hidrólise dessas cadeias é bem
mais difícil. De qualquer forma, pesquisas vêm sendo desenvolvidas de forma que espera-se
que em médio a curto prazo um processo economicamente viável para esse processo –
denominado de bioetanol de segunda geração –já esteja disponível em larga escala.
De todas as formas, como o curso utilizou caldo de cana como matéria-prima e essa é a
fonte das usina brasileiras, focar-se-á no processo industrial de produção de etanol que utiliza
essa fonte de carbono. O fluxograma abaixo descreve a produção de etanol (integrada à
produção de açúcar) numa usina comum:

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Como pode ser observado, a cana-de-açúcar recém colhida é lavada e encaminhada

para sessão de extração do caldo de cana. Nessa sessão, os colmos do vegetal são picados,
desfibrados e passam por um eletroímã (de forma a retirar vestígios de material metálico que
possa eventualmente estar presente). Os pedaços de cana são levados à moagem em cerca de
cinco rolos compressores, no qual são esmagados, separando o caldo que contém os açucares
do bagaço. Água é adicionada ao bagaço antes dos últimos rolos – processo denominado
embebição – de forma a aumentar o rendimento de caldo extraído.
O bagaço residual é queimado em caldeiras, gerando vapor o qual movimenta
turbinas. Esse processo gera energia, a qual muitas vezes é gerada em quantidade suficiente
não só para a manutenção da operação da usina como também é sobressalente para venda
para a rede.
Após extração do caldo, este necessita ser clarificado para que a levedura consiga
fermentar os açúcares presentes. Esse processo se dá na área de tratamento do caldo.
Primeiramente, o caldo passa pelos processos de sulfitação e caleagem, onde são adicionados
respectivamente SO2 e Ca(OH)2, que são responsáveis pela coagulação de material coloidal o
qual arrasta impurezas e inibem reações de formação de cor no caldo. Após esses processos, o
caldo é levado aos processos de decantação e filtragem, cujo produto é denominado caldo
clarificado.
Na sessão de fermentação, o caldo é corrigido adicionando-se fosfato e nitrato quando
necessário, além de ajuste de pH. Já no fermentador, o inoculo de levedura é adicionado e o
processo de fermentação ocorre, convertendo os açucares em etanol e CO 2. Apesar de já haver
destilarias de álcool cuja fermentação ocorre em processo contínuo, o processo normalmente
ocorre em bateladas. O tempo de uma batelada fica entre quatro e doze horas, apresentando

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

o meio fermentado uma concentração de 7 a 10% de etanol. Cabe ressaltar que devido a
exotermia da reação, é necessário que os fermentadores sejam providos com sistemas de
resfriamento, de forma a manter a temperatura ótima de fermentação (aproximadamente
32ºC).
O mosto fermentado é então centrifugado, de forma a remover as células (as quais
podem ser reaproveitadas numa batelada posterior). O meio fermentado livre de células é
encaminhado para sessão de recuperação do etanol. Esta ocorre em três etapas de destilação,
denominadas: destilação, retificação e desidratação. Na primeira, uma corrente rica em etano
(cerca de 40 a 50%) e retirada no topo da coluna, sendo a corrente de fundo denominada
vinhaça. Essa corrente rica em etanol é encaminhada à etapa de retificação, onde se obtém o
azeótropo água-etanol (96% de etanol). Para obtenção do etanol anidro (99,7%), é necessário
o emprego de destilação azeotrópica na etapa de desidratação. A substância utilizada para
quebrar o azeótropo normalmente é o ciclo-hexano.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1.CLARIFICAÇÃO DO CALDO DE CANA

Inicialmente, a cana de açúcar é lavada e processada por picadores e trituradores que

a preparam para a moagem. No processo de moagem o caldo é extraído pela passagem da
cana através de uma série de moendas, onde é esmagada mediante forte pressão. O líquido
obtido após o processo de moagem apresenta alto grau de impurezas, as quais precisam ser
removidas do meio. Dentre os sólidos presentes no caldo de cana estão presentes proteínas,
clorofila, antocianinas e polifenóis. Esses três últimos compostos são os que conferem a
coloração escura do caldo após a moagem. Na prática realizada ao longo do período o caldo
utilizado foi comprado em estabelecimento comercial, sendo coado na hora da compra, e
efetuou-se apenas a etapa de clarificação.
Na etapa de clarificação o caldo de cana moído e coado foi transferido para um
erlenmyer, onde foi feita a adição de CaO. O CaO promove a coagulação do material coloidal
presento no meio, ajudando na precipitação dos sólidos e ajustando o ph da solução. Durante
essa etapa parte do material corante torna-se insolúvel e precipita-se. Posteriormente foi feita
a adição de terra diatomácea (0,2 g/L) como auxiliar a etapa de filtração. O caldo de cana
então foi submetido a tratamento térmico em autoclave durante dez minutos em vapor
fluente. O aquecimento acelera as reações que levam a formação dos compostos insolúveis e
promove a coagulação das proteínas. Após o tratamento térmico o caldo foi acondicionado em
geladeira onde permaneceu por 12h para decantar o material insolúvel formado nos

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

tratamentos aplicados. Depois desse período foi realizada filtração à vácuo do caldo decantado
para a remoção dos sólidos mais finos. O processo foi conduzido em dois frascos de kitassato,
conectados a duas bombas, utilizando-se funil de buchner e papel de filtro. Durante o
manuseio do erlenmeyer para passar o caldo de cana no funil ocorreu uma leve ressuspensão
dos sólidos e precisou-se centrifugar o caldo para acelerar a filtração.

2.2.QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS

A quantificação de células foi feita através da leitura de absorbância. Inicialmente foi

feito o preparo de uma solução mãe para elaboração da curva padrão. Foram transferidos para
um balão de diluição 50 gramas de fermento prensado, aferindo-se o balão com água
destilada. Efetuou-se em quadriplicata a filtração de 2 ml da solução utilizando-se filtros de
acetato de celulose previamente tarados em placas de petri. As membranas foram colocadas
nos suportes e levadas para secagem em infravermelho, realizando-se pesagens a cada um
minuto, para determinação do peso seco de levedura. Com a determinação da concentração
da solução mãe, realizou-se diferentes diluições para 8 alíquotas retiradas da solução mãe, em
duplicata, para leitura da absorbância. A concentração dessas soluções foi determinada
dividindo-se a concentração da solução mãe pelo fator de diluição. Com os dados de
concentração (X) e de absorbância (Abs) foi feita a regressão linear entre os pares (X,Abs) para
obtenção do coeficiente linear da reta gerada.
Para quantificação da concentração no reator ao longo do tempo, foram retiradas
alíquotas de 5 mL do sistema de fermentação através de pipeta e colocadas em tubos
plásticos. As alíquotas foram centrifugadas a 1000 x g por 8 a 10 minutos e o precipitado
(leveduras) foi ressuspendido com água destilada. Procedeu-se então a leitura de absorbância
das amostras em comprimento de onda de 570 nm, utilizando-se como branco, a água
destilada. A concentração foi obtida utilizando a equação abaixo:
(|∙| F )
XC=
α
Onde, Xc é a concentração da solução; Abs é a absorbância; F é o fator de diluição da
amostra; α é o coeficiente angular da curva padrão.

2.3.QUANTIFICAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS

Neste método é determinada, através da redução por hidrólise ácida e por

espectroscopia, a concentração de Açúcares Redutores Totais (ART).

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

2.3.1. MATERIAIS E REAGENTES

 Balão volumétrico
 Balança analítica
 Béquer
 Espátula
 Provetas
 Banho
 Pipetas volumétricas
 Solução de HCl 2N
 Solução de NaOH 1N
 Reagentes de Somogyi
 Tubo de ensaio
 Termômetro

2.3.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE SOMOGYI

Solução A: Em três béqueres foram dissolvidos separadamente 16 g de NaHCO 3

(Bicarbonato de sódio), 12 g de tartarato de sódio e potássio (sal de Rochelle), 144 g de Na 2SO4
anidro, 24 g Na2CO3 anidro. Após a dissolução, as soluções foram misturadas e completou-se o
volume a 800 mL.
Solução B: 36g de Na2SO4 anidro foi dissolvido em 100ml de uma solução de
CuSO45H2O a 4% P/V e em seguida completou-se o volume a 200ml com H 2O destilada.
Solução C: Dissolveu-se 25g de (NH4)6Mo7O24H2O em 450ml de água destilada.
Adicionou-se 21 ml de H2SO4 concentrado e foi realizada a homogeneização. Em seguida, uma
solução contendo 3g de Na 2HASO47H2O (arseniato de sódio) foi adicionada e a solução final foi
diluída em 25 ml de água destilada. Depois de realizada a homogeneização, o frasco foi
mantido em ambiente escuro a 37°C por aproximadamente 7 dias.

2.3.3. PROCEDIMENTO

Hidrólise ácida:
Em um tubo de ensaio adicionou-se 1 ml da amostra e 1ml de HCl 2N. Posteriormente
a solução foi aquecida a 70°C por 10 minutos em banho. Por fim realizou-se o resfriamento e
neutralizou-se a solução com 3 ml de NaOH 1N. Transferiu-se o material para um balão
volumétrico e diluiu-se até completar o volume 500 ml.

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Preparação para Leitura:

Com o volume de 1 ml da amostra diluída, em um tubo de Folin Wu, adicionou-se 1ml
de uma mistura dos reagentes de Somogyi A e B (4 volumes de A para cada volume de B).
Aqueceu-se o tubo em banho maria a 100°C por 10 minutos. Resfriou-se a amostra e foi
acrescido 2 ml do reagente de Somogyi C. Foi realizado a agitação em vortex até expulsão de
gás e completou-se o volume para 25ml com água destilada. Por fim procedeu-se a leitura da
absorbância em um espectroscópio com comprimento de onda de 540nm.

2.3.4. RESULTADOS

Inicialmente prepararam-se os padrões a partir da solução de glicose (20g/L). Assim

preparamos soluções cujas concentrações, após a diluição, variavam de 0 a 0,2 g/L. Todas as
medidas foram feitas em duplicata.
TABELA 1 DADOS EXPERIMENTAIS DA CURVA PADRÃO DE GLICOSE
Concentração de glicose [g/L] Absorbância média (540 nm)
0,00 0,00
0,02 0,05
0,04 0,11
0,06 0,16
0,08 0,21
0,10 0,25
0,12 0,31
0,14 0,37
0,16 0,41
0,18 0,47
0,2 0,51

Plotando-se os dados da tabela 1, temos:

Curva padrão de glicose

0.6
0.5
Absorbância (540 nm)

f(x) = 2.58415584415584 x
0.4 R² = 0.9998679273118
0.3
0.2
0.1
0.0
0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3
Concentração de glicose [g/L]

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

2.4.DESTILAÇÃO DO MEIO FERMENTADO PARA QUANTIFICAÇÃO DO ETANOL

2.4.1. MANUAL PARA O USO DO DESTILADOR

2.4.2.

1
5

1 – Válvula de descarte 4 – Reservatório de alimentação

2 – Válvula do balão caldeira 5 – Coletor de destilado
3 – Válvula de alimentação 6 – Balão caldeira

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

1º Passo Preparação do Equipamento

 Verificar se a torneira da pia está conectada ao

condensador pelo auxílio de mangueiras para
circulação de água de resfriamento. Deixar
direcionado a pia a mangueira de descarte de água de
circulação (OBS: Prestar atenção para que o fluxo de
água seja de baixo para cima.).

 Se o nível de 6 estiver baixo:

o Abrir válvula 2;

o Preencher 6 com H2O destilada. Atentar para

não ultrapassar o nível máximo do balão;

o Fechar válvula 2.

____________________________________________________________________________
2º Passo Limpeza e aquecimento do equipamento

 Abrir a torneira de água para iniciar a circulação pelo condensador. Verificar se a

circulação está ocorrendo adequadamente (caso necessário, ajustar o fluxo de água
pela abertura da torneira).

 Verificar se todas as válvulas 1,2 e 3 estão devidamente fechadas.

 Adicionar aproximadamente 10 mL de H 2O destilada no reservatório 4.

 Abrir válvula 3.

 Esperar que a H2O destilada escoe por completo.

 Fechar válvula 3.

 Ligar a resistência

 Regular o controle analógico para “10”. Esta magnitude de aquecimento é utilizada

para aquecer o mais rápido possível a água no balão caldeira 6.

 Colocar um bécher de 100 mL no coletor de destilado 5. Este bécher será usado como
descarte.

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

 Aguardar a evaporação e passagem de água pelo equipamento até coleta de

aproximadamente 10-20 mL de água.

 Abrir válvula 1 com o intuito de descartar a água residual.

 Aguardar o descarte da água residual até que vapor fluente esteja passando pela
válvula 1 (é possível verificar a passagem de vapor fluente pela percepção de ruído
característico).

 Fechar válvula 1.

_____________________________________________________________________________
3º Passo Destilação da amostra

 Regular o controle analógico da resistência para “5”.

 Verificar se válvula 3 está devidamente fechada.

 Adicionar aproximadamente 10 mL de meio fermentado ao reservatório 4, com o

auxílio de uma proveta.

______________

OBS: Caso não seja utilizado 10 mL de meio, deve-se utilizar um fator de correção para o
cálculo do percentual de álcool (% v/v) no meio:

V coletado (mL )
f CORRE ÇÃ O=
V meio (mL)
Onde V coletado é o volume de destilado coletado após a destilação e V meio é o volume de meio
adicionado ao reservatório 4.

______________
 Verificar se as válvulas 1 e 2 estão devidamente fechadas.

 Com a mesma proveta utilizada anteriormente, preencher esta com aproximadamente

10 mL de H2O destilada e guardá-la para posterior uso.

 Proceder da seguinte forma, sem intervalo entre cada etapa:

o Abrir válvula 3;

o Assim que o meio fermentado escoar por completo do reservatório 4,

adicionar os 10 mL de H2O destilada da proveta ao reservatório 4 com a válvula
3 aberta;

o Esperar a H2O destilada escoar por completo;

13
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

o Fechar válvula 3.

 Trocar o béquer de descarte, no coletor de destilado 5, por uma proveta de 10 mL.

______________

OBS: A partir de agora foi iniciada a destilação do meio fermentado. Esta operação é em
batelada e utiliza vapor de arraste (gerado pelo balão caldeira) para aquecer o meio. O
componente mais volátil (no caso, álcool) é continuamente vaporizado e vai sendo separado
do meio fermentado, que se mantém no estado líquido. Pode-se assumir que todo o álcool
existente na alíquota de 10 mL de meio fermentado é vaporizado.

______________

 Aguardar a destilação do meio fermentado verificando-se até coleta de

aproximadamente 10 mL de destilado na proveta.
 Retirar a proveta com o destilado coletado e colocar o bécher de descarte no
coletor 6.
 Transferir o destilado coletado na proveta para um tubo de ensaio com tampa.
 Realizar a análise de álcool ou armazenar o destilado no freezer.

____________________________________________________________________________

4º Passo Preparo do equipamento para nova amostra

 Verificar se as válvulas 1,2 e 3 estão devidamente fechadas.

 Regular o controle analógico da resistência para “8”. Isto é feito para que haja uma
boa vazão de vapor de arraste para posteriormente efetuar o descarte de meio
residual.
 Abrir válvula 3.
 Abrir válvula 1 com o intuito de descartar o meio residual, com válvula 3 aberta.
 Aguardar o descarte da água residual até que vapor fluente esteja passando pela
válvula 1 (é possível verificar a passagem de vapor fluente pela percepção de ruído
característico).
 Fechar válvulas 1 e 3.

______________

OBS: Quando estão sendo efetuadas destilações de várias amostras consecutivamente, o nível
do balão caldeira 6 vai diminuindo e este deve ser preenchido com H 2O destilada. Para isto,
devem ser seguidos os seguintes procedimentos:

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 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

 Desligar a resistência elétrica

 Abrir válvula 2;

 Preencher 6 com H2O destilada. Atentar para não ultrapassar o nível máximo do balão;

 Fechar válvula 2.

 Regular o controle analógico para “10”. Esta magnitude de aquecimento é utilizada

para aquecer o mais rápido possível a água no balão caldeira 6.

 Proceder para a destilação de uma nova amostra conforme o 3º Passo.

____________________________________________________________________________

5º Passo Desligamento do equipamento

 Proceder para a limpeza do equipamento conforme o 2º Passo.

 Desligar a resistência.

 Fechar a torneira da pia.

2.5.QUANTIFICAÇÃO DO ETANOL: MÉTODO DO DICROMATO PARA DOSAGEM DE

ETANOL

2.5.1. PREPARO DOS REAGENTES

Escrever aqui como foram preparados os reagentes, conforme roteiro da aula.

2.5.2. EXECUÇÃO

Escrever aqui como o método foi executado.

2.6.CONDIÇÕES DE PROCESSO

2.6.1. PROCESSOS AERÓBIOS

2.6.1.1. BATELADA SIMPLES

Inicialmente foi preparado 3000 mL de meio para batelada simples com caldo de cana
clarificado que tem a seguinte composição: sacarose (20g/L), KH 2PO4 (1 g/L), (NH4)2SO4 (4 g/L),
NaCl (1 g/L) e extrato levedura (2 g/L), e ajustou-se o pH do meio para 7,0. Após faz-se a
esterilização a 0,5 atm por 15 min de 2.800 mL do meio em erlenmeyer de 6 L e 200 mL de
meio em erlenmeyer de 500 mL.
No dia anterior do início do processo fez-se a ativação do inóculo suspendendo
20g(peso úmido) de levedura em 200 mL de meio estéril e incubar a 28°C e 100 rpm em

15
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

shaker. No Biorreator Newbrunswik, colocou-se 2800 mL de meio estéril, adicionou-se a

suspensão de células e ajustou-se as condições do processo para 1vvm e 400 rpm.

2.6.1.2. BATELADA ALIMENTADA

Inicialmente foi preparado 2000 mL de meio para batelada simples inicial com caldo de
cana clarificado que tem a seguinte composição: sacarose (20g/L), KH 2PO4 (1 g/L), (NH4)2SO4 (4
g/L), NaCl (1 g/L) e extrato levedura (2 g/L), e ajustou-se o pH do meio para 7,0. Após fez-se a
esterilização a 0,5 atm por 15 min de 1.800 mL do meio em erlenmeyer de 4 L e 200 mL de
meio em erlenmeyer de 500 mL.
Preparou-se também 1100 mL de meio concentrado para adição em tempos
determinados com a seguinte composição: sacarose (200g/L), KH 2PO4 (10 g/L), (NH4)2SO4 (40
g/L), NaCl (10 g/L) e extrato levedura (20 g/L), e ajustou-se o pH do meio para 7,0. Fez-se
também a esterilização a 0,5 atm por 15 min do meio sendo o mesmo distribuído em
erlenmeyers de 500 mL com os seguintes volumes: 230, 250, 280 e 310 mL; e em erlenmeyer
de 100 mL o meio restante.
No dia anterior do início do processo fez-se a ativação do inóculo suspendendo
20g(peso úmido) de levedura em 200 mL de meio estéril e incubar a 28°C e 100 rpm em
shaker. No Biorreator Newbrunswik, colocou-se 1800 mL de meio estéril, adiciona-se a
suspensão de células e ajustou-se as condições do processo para 1vvm e 400 rpm.

1.1.1. PROCESSOS ANAERÓBIOS

1.1.1.1. FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Inicialmente foi preparado 3000 mL de meio para batelada simples com caldo de cana
clarificado que tem a seguinte composição: sacarose (150g/L), KH 2PO4 (1 g/L), MgSO4.7H2O(0,7
g/L), NaCl (1 g/L) e extrato levedura (1 g/L), espumante(1 gota/L) e justou-se o pH do meio
para 4,5(ajuste com H2SO4 concentrado). Após fez-se a esterilização a 0,5 atm por 15 min de
2.500 mL do meio em erlenmeyer de 4 L e 500 mL de meio em erlenmeyer de 1000 mL.
No dia anterior do início do processo fez-se a ativação do inóculo suspendendo
300g(peso úmido) de levedura em 500 mL de meio estéril e incubar a 28°C e 100 rpm em
shaker. No Biorreator Newbrunswik, colocou-se 2500 mL de meio estéril, adicionou-se a
suspensão de células e ajustou-se as condições do processo para 400 rpm e sem aeração.

2. RESULTADOS E DISCUSSÕES

16
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

2.1.PROCESSOS AERÓBIOS

2.1.1. BATELADA SIMPLES

Na tabela abaixo estão os dados experimentais obtidos:

TABELA 3 DADOS EXPERIMENTAIS DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO
Tempo (h) Concentração de células, X[g/L] Substrato [g/L]
0,00 3,03 19,54
0,17 4,48 18,43
0,67 5,06 16,06
0,97 5,69 17,80
1,67 6,70 14,67
2,67 8,08 15,83
3,67 10,13 9,00
4,67 13,08 4,33
6,67 15,12 0,36
7,67 15,10 0,07
8,58 15,10 0,07

A Figura 1 mostra a análise da cinética de crescimento. As amostras foram analisadas em

duplicata.

17
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Cinética do bioprocesso
20.0 Concentração de células (X)
Substrato [g/L]

16.0
Concentração [g/L]

12.0

8.0

4.0

0.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
Tempo de cultivo (h)

Figura 1 Cinética do crescimento celular.

A fase de latência que corresponde ao período de adaptação das células não foi
observada no experimento, uma vez que o meio de cultivo foi similar ao utilizado no preparo
do inoculo, as células não passaram pela fase de adaptação. Na fase de transição ocorre o
início da reprodução havendo um aumento gradual do crescimento, já no fim desta fase toda a
população começa a se dividir em um intervalo regular médio de tempo. A fase Log foi
observada no período de 0,6 a 6 horas. Nesta fase a curva apresentou uma inclinação
acentuada, atribuída a fatores e condições favoráveis ao metabolismo, onde a formação de
unidades funcionais celulares é máxima. O consumo de substrato também é máximo nesta
fase, pois visa suprir as necessidades celulares para a divisão e multiplicação.

3.0

2.3 f(x) = 0.227740930717419 x + 1.49675665733698

R² = 0.996109480652455
1.5
Ln X

0.8

0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Tempo de cultivo (h)

Figura 2 Cálculo de µX. Relação de massa seca e tempo de cultivo na região linear de crescimento
exponencial.

18
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

De acordo com a literatura, sob condições similares, a taxa específica de crescimento

celular para a Saccharomyces boulardii é de 0,34 h-1. Essa levedura é uma cepa tropical,
inicialmente isolada dos frutos da lichia. Tecnologicamente é utilizada em produtos probióticos
por sua capacidade de sobrevivência em meios ácidos, tal qual o ácido gástrico no estômago.
Os dados permaneceram na mesma ordem de grandeza do encontrado na literatura.

2.1.2. CÁLCULOS DOS PARÂMETROS DE CRESCIMENTO CELULAR

O fator de conversão de substrato em células ou fator de rendimento de células em

relação ao substrato (YX/S) expressa a massa celular produzida em relação à massa de ART
consumida. Este parâmetro fornece a quantidade de massa celular produzida por grama de
açúcar. Conforme abaixo:

massa de c é lulas formadas ( X f −X i)

Y X / S= =
massa de substrato consumido −( S f −Si )

Considerando a região linear de crescimento exponencial, temos:

(15,10−3,03 ) 12,07 g de c é lulas
Y X / S= = =0 , 62
( 19,54−0,07 ) 19,47 g de glicose

Considerando a região linear de crescimento exponencial (gráfico 2), pode-se estimar a

taxa de crescimento celular em relação à biomassa:
−1
μ X =0 , 23 h

Com o valor da taxa de crescimento, pode-se obter o tempo de duplicação, que é o

tempo necessário para que a biomassa dobre na fase exponencial.
ln 2
t D= =3 ,0 h
μX

Na prática, esse tempo significa maior produtividade em células, porque a velocidade de

crescimento celular aumenta à medida que diminui o tempo de duplicação, o que pode ser
compreendido pela equação anterior. A produtividade pode ser expressa por μ.X [g/litro.hora]
conforme abaixo:
g
μ X ∙ X =0,23∙ 15,10=3 , 47
L∙h

Finalmente a taxa específica de consumo de substrato pode ser calculada:

μ X 0,23 g deglicose
qS= = =0 , 37
Y X / S 0,62 g de c é lulas ∙h

19
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

2.1.3. BATELADA ALIMENTADA

Abaixo seguem os dados experimentais:

TABELA 4 DADOS EXPERIMENTAIS DE BATELADA ALIMENTADA

Concentração de células
Tempo (h) Substrato [g/L]
(X)
0,17 7,25 19,45
1,50 9,60 11,95
3,00 12,85 7,24
4,50 17,08 0,27
6,00 18,37 0,09
7,50 18,66 0,10
8,02 18,66 0,12
8,25 17,21 23,03
24,13 26,77 0,75
24,25 25,29 3,90
25,50 29,48 3,41
27,50 31,87 0,35
28,50 39,55 0,23
28,83 29,29 15,29
30,00 33,23 4,64
31,00 31,29 0,42
32,00 34,77 0,26
32,25 33,29 12,87
48,00 35,61 0,78

Abaixo segue o gráfico da cinética da batelada alimentada obtida através dos dados
experimentais.

25.0 Batelada Alimentada

20.0

15.0
Concentração de células
Substrato
10.0

5.0

0.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0

Figura 3 Cinética de crescimento celular. Este gráfico representa a cinética de crescimento celular inicial
em batelada simples.

20
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

3.1.4 Cálculos dos parâmetros da batelada alimentada

Já mencionado anteriormente, o fator de conversão de substrato em células (Y X/S) pode ser

calculado conforme abaixo, calculado antes da primeira alimentação:
( 18,66−7,25 ) g de células
Y X / S= =0,59
−( 0,12−19,45 ) g de glicose

Valor do fator de conversão de substrato (YX/S) calculado entre a primeira e a segunda

alimentação:
( 26,77−17,21 ) g de células
Y X / S= =0,43
−( 0,75−23,03 ) g de glicose

Valor do fator de conversão de substrato (YX/S) calculado entre a segunda e a terceira

alimentação:
( 29,29−25,29 ) g de células
Y X / S= =1,09
−( 0,23−3,90 ) g de glicose

Valor do fator de conversão de substrato (YX/S) calculado entre a terceira e a quarta

alimentação:
( 34,77−29,29 ) g de células
Y X / S= =0,36
−( 0,26−15,29 ) g de glicose

Valor do fator de conversão de substrato (YX/S) calculado a quarta alimentação:

(35,61−33,29 ) g de células
Y X / S= =0,19
−( 0,78−12,87 ) g de glicose
Valor do fator de conversão de substrato (YX/S) médio:
g de células
Y X / S=0,53
g de glicose

Cálculo do valor de µx da batelada inicial:

21
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Ln X x Tempo (h)
3
2.5 f(x) = 0.197283977848991 x + 1.95653866743885

2
X
L
n

1.5
1
0.5
0
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Tempo de cultivo (h)

Figura 4 Cálculo de µX. Relação de massa seca e tempo de cultivo na região linear de crescimento
exponencial para a fase de batelada simples.

O coeficiente angular da reta fornece o valor da taxa específica de crescimento:

−1
μ X =0,20 h

25.0
Substrato x Tempo
20.0

15.0
bst

(g/
Su

L)
ra
to

10.0

5.0

0.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0
Tempo (h)
Figura 4 Cinética de consumo do substrato para as etapas em batelada alimentada.

É observado um fator de conversão de substrato médio menor do que o obtido na

baletada simples, porém um coeficiente específico de crescimento µx menor e maior
concentração de células foi obtida, o que é esperado para a batelada alimentada, conhecida
por acumular, no final do bioprocesso, uma concentração de células elevada, sendo usada
assim para o cultivo e crescimento de biomassa, quando essa biomassa é o produto final
desejado.

2.2.PROCESSO ANAERÓBIO

2.2.1. FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

22
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Abaixo seguem os dados experimentais:

TABELA 5 DADOS EXPERIMENTAIS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Concentração de células
Tempo (h) Etanol [g/L] Substrato [g/L]
(X)
0,20 0,00 72,65 154,99
0,70 2,69 73,55 143,96
1,20 7,29 80,65 132,16
1,70 11,04 94,84 120,36
2,12 12,88 106,84 71,59
3,28 16,77 101,94 28,59
4,12 37,45 111,74 7,44
5,12 27,60 102,71 0,72
6,12 40,77 105,81 0,47
7,28 32,55 106,19 0,46
Abaixo segue o gráfico da cinética da fermentação obtida através dos dados
experimentais.

Fermentação alcóolica
160.0 Concentração de células (X)

140.0 Substrato [g/L]

Etanol [g/L]
120.0
Concentração (g/L)

100.0

80.0

60.0

40.0

20.0

0.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
Tempo de fermentação (h)

Considerando a região linear de crescimento exponencial:

23
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

4.7
f(x) = 0.307404588386253 x + 4.02380347383368
4.6 R² = 0.998736594351848
4.5
Ln X

4.4
4.3
4.2
1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2
Tempo de fermentação (horas)

2.2.2. CÁLCULOS DOS PARÂMETROS DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

Já mencionado anteriormente, o fator de conversão de substrato em células (Y X/S) pode

ser calculado conforme abaixo:
( 106,19−72,65 ) g de c é lulas
Y X / S= =0 , 22
−( 0,46−154,99 ) g de glicose

O fator de conversão de substrato em etanol (Y P/S) representa a quantidade de etanol

formada por unidade de açúcar consumido. Conforme abaixo:

produto formado ( P f −Pi )

Y P/ S = =
massa de substrato consumido −( S f −Si )

( 32,55−0,00 ) g de etanol
Y P/ S = =0 , 21
− ( 0,46−154,99 ) g de glicose

Considerando a região linear de crescimento exponencial, pode-se estimar a taxa de

crescimento celular em relação à biomassa:
−1
μ X =0 , 30 h

Finalmente o fator de rendimento de produto em relação ao crescimento celular Y P/ X ,

pode ser calculado:

Y P / S 0,21 g de etanol
Y P/ X = = =0,95
Y X / S 0,22 g de c é lulas

A eficiência do bioprocesso pode ser calculada aplicando-se a fórmula abaixo:

( Y P/ S ) processo
Ef=
( Y P / S )te ó rico

Onde o ( Y P /S )te ó rico é calculado a partir da estequiometria do processo:

24
 Bioprocessos utilizando a sacarose do caldo de cana de açúcar como substrato 2011

Glicose →2 Etanol+2 C O2

180 g→ ( 2 ∙ 46 g ) + ( 2∙ 44 g )

( Y P /S )te ó rico =0 , 511 g etanol / g de glicose consumida

Finalmente:
0,21
Ef= ∙ 100=41 %
0,511

A produtividade (g/L.h) pode ser calculada considerando-se o etanol produzido em

relação ao tempo total de fermentação (horas):

32,55 g/ L g
Produtividade= =4,85
6,70 h L∙h

3. CONCLUSÃO

Escrever uma pequena conclusão, ressaltando o que foi aprendido durante o curso, os
pontos fortes e fracos dos experimentos e o que pôde ser observado, de forma geral.

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 MULLER, J. L. et al. Comparação do crescimento de Saccharomyces boulardii em

fermentador por batelada tipo Air-lift e shaker. Ciência Tecnologia de Alimentos, v. 27,
n. 4, p. 688-693, 2007.

 MULLER, J. L. Cultivo da Saccharomyces boulardii em biorretator tipo air-lift e em

frascos agitados mecanicamente. Dissertação de mestrado. Universidade do Vale do
Itajaí. 2006.

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