Parte 2 - Análise de Regressão e Validação

15/10/2019
QA 483 – Estatística aplicada à

Química Analítica
Profa. Márcia C. Breitkreitz

Departamento de Química Analítica IQ/Unicamp
marciacb@unicamp.br
Auxiliar didático (PAD): Igor Bassetto

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igor.bassetto21@gmail.com
Validação
 O que é a validação?
• Conjunto de testes experimentais realizados após o

desenvolvimento/adaptação de um método analítico.
Realizada de acordo com alguma resolução, guia ou protocolo.
 E para que serve ?

“A validação deve garantir, através de estudos experimentais,
que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados” (ANVISA).
“A Validação deve demonstrar que um método analítico, nas

condições em que é praticado, tem as características
necessárias para a obtenção de resultados com a qualidade
exigida” (INMETRO).
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QA 483 Estatística aplicada– Profa Márcia Cristina Breitkreitz
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Validação
 No Brasil a ANVISA, o INMETRO e o MAPA
disponibilizam guias e resoluções para a validação:
• ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária):

RDC 166: Guia para a validação de métodos analíticos;
• INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial): DOQ-CGCRE-008
Orientação sobre validação de métodos analíticos.
• MAPA (Ministério
da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento): Validação e Controle de Qualidade
Analítica.
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Validação
 Outros guias:
• US-FDA (United States Food and Drug Administration):

Guidance for industry: Analytical procedures and
method validation.
• ICH (International Conference on Harmonisation):
Validation of analytical procedures Q2A e Q2B.
• Eurachem Working Group: The Fitness for purpose of
analytical methods - A Laboratory guide to method
validation and related topics.
• EPA (Environmental Protection Agency): Guias para
validação de métodos na área ambiental.
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Algumas referências
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Parâmetros de validação
 Os principais parâmetros de validação (Figuras de

mérito) são:
 Linearidade, Sensibilidade, faixa de trabalho (ou
intervalo) e faixa linear;
 Exatidão;
 Precisão (repetibilidade, precisão intermediária,
reprodutibilidade);
 Limite de Detecção;
 Limite de Quantificação;
 Seletividade/Especificidade;
 Robustez.
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Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de

demonstrar que os resultados obtidos são diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro
de um intervalo especificado;
• É preciso conhecer a relação entre o sinal analítico (sinal do

detector da técnica utilizada) e a concentração do analito.
Curva Analítica
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Linearidade
 Pontos importantes:
1) Relação linear aparente;

2) Coeficientes linear e angular: significância e Intervalo de
confiança;
3) Coeficientes de correlação e determinação;
4) Homogeneidade dos resíduos;
5) Detecção de amostras anômalas.
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Linearidade
• Número de pontos = 5 (mínimo):
Variável y
Variável y
Variável y
Variável x Variável x Variável x
Impossível identificar a Relação linear Relação quadrática
relação entre as variáveis aparente
aparente
É o que queremos
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Linearidade
• “Zoom” da curva analítica:
Como determinar a
reta que passe o mais
próximo possível de
todos os pontos?
Resposta
Método dos Mínimos

Quadrados
Concentração
• “Passar o mais perto possível” de todos os pontos significa
minimizar a soma dos quadrados dos resíduos.
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Coeficientes da regressão
• Coeficiente linear “a” ou intercepto: Valor de y quando a
concentração é zero. Idealmente deve próximo a zero;
• Coeficiente angular “b” ou inclinação: O quando a variável
y aumenta quando se aumenta 1 unidade na variável x.
y = a + bx
Área
Concentração
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 Cálculo dos coeficientes: É preciso definir as Somas

Quadráticas Sxx e Sxy:
𝑦 é a média global de
- todos os valores de y;
𝑥 é a media global de
todos os valores de x.
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• Como expressar o resultado: Intervalo de confiança (I.C.)
I.C. = Coeficiente ± t,95% * Erro coeficiente
valor tabelado da distribuição t com n-2 graus de liberdade
• O intervalo de confiança é uma faixa de valores, contidos

entre um limite inferior e superior.
• Ele representa os valores possíveis dos coeficientes,
considerando os erros envolvidos.
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• O I.C para o intercepto deve passar pelo zero pois quando a

concentração é zero, a área deve ser zero.
O software fará o cálculo, mas cabe a você a tarefa de

interpreta-lo!
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Resíduos
• Resíduos (ei): distâncias entre os pontos experimentais (𝑦𝑖 ) e
os valores previstos pela regressão:
Soma dos Quadrados

dos resíduos (SQr):
𝑆𝑄𝑟 = (𝑦𝑖 − 𝑦𝑖 )2
Resíduo 𝑖=1
• A Soma Quadrática dos resíduos (SQr) é a medida da variação

nos valores observados da variável dependente (valores de y),
que não é explicada pela relação linear entre x e y.
15
Desvio padrão da regressão

• Desvio padrão da regressão (s): Mede o desvio médio entre
os valores reais de 𝑦𝑖 e os valores estimados 𝑦𝑖 (= desvio médio
dos resíduos):
𝑁
− 𝑦𝑖 )2 SQr
𝑖=1(𝑦𝑖
𝑠=
𝑛−2
nº de graus de liberdade
Resíduo
A razão SQr/Nº graus de
liberdade é chamada Média
Quadrática dos resíduos (MQr)
• De uma maneira geral: “s” é uma maneira de

expressar os resíduos com um único 𝑠= 𝑀𝑄𝑟
número.
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Resíduos
 Formato do gráfico de resíduos:
• Resíduos devem ser distribuídos de forma aleatória

ao redor do zero sem tendências:
Resíduos adequados: Resíduos tendenciosos:
Heteroscedasticidade Modelo inapropriado

(existem testes estatísticos
para comprovar)
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Resíduos
• Utilizando os resíduos para identificar amostras
anômalas:
Curva Analítica
46200000,00
y = 2E+08x + 764814
41200000,00 R² = 0,9955
36200000,00
31200000,00
26200000,00
Área
21200000,00
16200000,00 Será que devo retirar
11200000,00
6200000,00
esta amostra?
1200000,00
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
Concentração (mg/mL)
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Gráfico de resíduos
• Gráfico de resíduos: Concentração vs resíduos:
Gráfico de Resíduos
1,00E+06
Resíduos do Ajuste Linear
5,00E+05
0,00E+00
-5,00E+05
-1,00E+06
-1,50E+06
-2,00E+06 Amostra anômala

-2,50E+06
0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3
• Mas qual seria o limite de aceitação para amostras

anômalas?
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Resíduos
• Resíduos padronizados (Rp): resíduos divididos pelo desvio
padrão da regressão (“s”);
• Limite de Rp = 3: os resíduos passam a ser medidos em

unidade de desvio-padrão e assim, 99,7 % dos pontos devem
estar dentro do limite de ± 3 desvios-padrão.
3,5 Gráfico de Resíduos padronizados

Resíduos padronizados
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3
20
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• Intervalo de Confiança para os coeficientes sem

retirar a amostra anômala:
Coef. Valor Erros Valor de t t*erro
b 1,53*108 1,77*106 2,042 3,61*106
a 7,65* 105 2,95*105 Inserir valor 6,03 *105
tabelado
• Como expressar os resultados:
Coeficiente angular: 1,53*108 ± 3,61*106

Usar notação científica
Coeficiente linear: 7,65*105 ± 6,03*105
não passou pelo zero...

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 A amostra anômala esta “puxando” o coeficiente linear par
cima. Após a sua retirada temos que:
Coeficiente linear: 4,46*105 ± 6,80*105
Passou pelo zero!
• Consequências de um intercepto significativo: Erro sistemático

na quantificação (“bias”):
y = a + bx
(y – a)/b = x
y = a + bx
Este valor vai se propagar (será
subtraído) em toda quantificação
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Coeficiente de correlação
•“r” é o coeficiente de correlação linear (de Pearson) e

indica o quanto uma variável está linearmente
relacionada com a outra. Cálculo de r:
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r = +1 Correlação perfeitamente positiva
0 < r < 1 correlação positiva; -1 < r < 0 correlação negativa
r = -1 correlação perfeitamente negativa
r = 0 não existe relação linear entre as duas variáveis (mas pode
existir outro tipo de correlação)
A ANVISA
recomenda um
coeficiente de
correlação igual a
0,99 e o
INMETRO um
valor acima de
0,90.
24
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Atenção! r = 0 pode significar duas coisas:
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• Importante apresentar sempre junto com a curva
analítica (r sozinho não diz nada sobre s dados):
Ajuste quadrático seria

melhor apesar do alto
valor de r
Todos estes conjuntos de dados
apresentam r = 0,82 !!
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Coeficiente de determinação
• O coeficiente de determinação, R2, é a porcentagem da

variação da variável dependente (y) explicada pela variável
independente (x).
• Um R2 de 0,60 indica que as variáveis independentes

explicam 60 % da variação observada na variável dependente.
• Quanto mais próximo de 1,00 melhor (indica que grande
parte da variação em y é devido à variação em x).
27
ANOVA aplicada à Regressão

 Método baseado na estatística F para avaliar a
significância da Regressão do modelo construído por
Mínimos Quadrados.
Princípio: Dividir a variação total de um conjunto de dados

nas suas diversas fontes e utilizá-las para verificar hipóteses
pré-estabelecidas (testes de hipótese ou testes de
significância).
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 A diferença entre qualquer observação e a média global das
respostas (𝑦) pode ser dividida em duas parcelas:
Vamos olhar este ponto aqui
1) parcela devido
aos resíduos:
yi  yˆ i
2) parcela devido a
regressão:
ˆi  y
y
29

 O quadrado destas diferenças são somados gerando as
Somas Quadráticas (SQs).
Soma Quadrática da Soma Quadrática dos
Regressão: resíduos:
ni = número de observações no nível i; m= número de níveis da

variável.
• Cada SQ tem um número de graus de liberdade, ,

associado (número de observações necessárias para
determiná-la):
 SQR = p-1, sendo p = número de parâmetros no modelo

 SQr = n – p, sendo n = número total de observações 30
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 Dividindo as SQs pelos respectivos graus de liberdade,
temos as Médias Quadráticas (MQs):
MQR da regressão: MQR = SQR/p-1
MQr dos resíduos: MQr = SQr/n-p
• MQs são utilizadas para fazer testes de hipótese para

tomar decisões sobre os resultados e sobre o modelo
escolhido;
31
Significância da regressão
 Enunciando as hipóteses:
H0: variância devido à variação em x é equivalente ao erro

experimental, ou seja, não há efeito da variável x;
Ha: variância devido à variação em x não é equivalente ao
erro experimental.
• Seleção do teste estatístico: teste F pois vamos avaliar

variâncias;
Teste F:
Fcal = MQRegressão/MQresíduos
Comparar com Ftab com graus de liberdade de MQRegressão e

MQresíduos e nível de confiança desejado.
32
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• Se Fcalculado > Ftabelado = Rejeita-se H0
Conclusão:
 Ao rejeitar H0 consideramos a Regressão significativa ou

seja, MQR é diferente da MQr;
 Isto significa que a variação observada no conjunto de dados
não é apenas devido ao erro aleatório, ela se deve à variação
nos níveis do fator estudado (variável x), ou seja, que a
inclinação é significativa!
33
Linearidade – Parâmetros
relacionados
Estão diretamente relacionados à linearidade:
Faixa de trabalho
Sensibilidade (ou intervalo)
• A sensibilidade está relacionada ao incremento de sinal

observado de acordo com o incremento de concentração;
• É portanto o coeficiente angular da curva analítica:
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Sensibilidade
Método A é mais sensível que método B.
35
Faixa de trabalho ou intervalo
 A faixa de trabalho ou intervalo depende da finalidade

do método e é especificada pelos guias das diversas
áreas. Por exemplo (Tabela 3 RDC 166 da ANVISA):
• A concentração esperada (100 %) deve estar no centro

da curva analítica (ou próximo dele);
• A curva analítica deve ser linear ao longo da faixa de
trabalho;
• Não confundir faixa de trabalho com faixa linear.
36
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Adição de padrão
 Método utilizado quando não é possível ter um
branco (amostra isenta do analito) e para minimizar
efeitos de matriz.
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Padronização interna
 Método para melhorar a repetibilidade e minimizer varições
instrumentais não relacionadas ao analito (por exemplo:
volume de injeção muito pequeno em cromatografia gasosa;
injeções manuais).
Etapas: Preparação das soluções dos padrões de calibração

contendo a mesma concentração do padrão interno e leitura
do sinal.
38
19
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Padronização interna
 Na escolha de um composto como padrão interno

deve-se observar que o pico referente ao padrão
esteja bem resolvido dos demais picos dos
componentes da amostra e elua próximo ao sinal do
analito;
 O padrão interno deve, ainda, ser altamente puro,

não reagir com nenhum dos componentes da amostra
e ser quimicamente similar ao analito de interesse.
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Padrão interno
• Construção da curva analítica:
Atenção aqui!
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Padrão interno
• Preparação das amostras de concentração
desconhecida contendo a mesma concentração do
padrão interno e leitura do sinal.
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Padrão interno
• Determinação da concentração da amostra
desconhecida (x) pela curva analítica.
42
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Exercícios no Excel
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Seletividade/Especificidade
 Uma amostra, de uma maneira geral consiste em:
A = Analito
A D
Matriz B, C, D = outros compostos
B C (componentes da matriz)
• RDC 166: “Seletividade/Especificidade é a capacidade que

um método possui de medir exatamente um composto na
presença de outros componentes”
• O uso indistinto dos termos seletividade/especificidade pode

gerar confusão pois a rigor temos que:
• método específico: produz resposta para apenas um analito;
• método seletivo: produz respostas para vários analitos (mais
comum)
44
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• Para validação deste parâmetro é necessário demonstrar a
capacidade de quantificação inequívoca do analito na
presença de outros compostos existentes na amostra.
• Exemplo: Método quantitativo para determinação de um
fármaco em um medicamento por Cromatografia Líquida.
Componentes de Fármaco
um comprimido:
Excipientes
Impurezas de síntese do fármaco
Produtos de degradação do fármaco
45
• Como demonstrar a seletividade/especificidade:
• Análise do placebo: Excipientes não devem apresentar o

mesmo tempo de retenção do fármaco;
• Injeção de padrões de impurezas do fármaco: As
impurezas não devem apresentar o mesmo tempo de retenção
do fármaco;
• Análise de amostras de estudos de estabilidade (stress
conditions): produtos de degradação não devem apresentar o
mesmo tempo de retenção do fármaco.
Como saber se não existe algum composto

“escondido” sob o pico do fármaco?
46
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• Detector espectrofotométrico:
Observação dos
B espectros Uv/Vis nos
pontos A, B e C
Eles devem ser iguais,

A C demostrando a
presença de um único
componente eluído
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Exatidão e precisão
 Exatidão: Descreve a diferença entre o resultado
encontrado e um valor de referência (conhecido ou
tomado como verdadeiro, p.e. padrão certificado);
• Precisão: Descreve a concordância de resultados de
medidas replicadas da mesma amostra.
Método exato e
preciso
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Lembrando
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Exatidão e precisão
 Exatidão: Avaliada pela medida de erro:
Erro relativo percentual = (xe – xv)/xv * 100
Onde xe = valor encontrado (normalmente a média) e xv = valor

tomado como real (aceito).
OBS: O erro tem sinal!
 Precisão: Avaliada pela medida de desvio padrão (s) ou

pelo coeficiente de variação (CV):
CV = s/xm * 100
onde: xm = x médio
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Exatidão
 Como demonstrar a Exatidão:
1) Análise de uma substância de pureza conhecida (padrão);

- Existem várias entidades que fornecem padrões com
concentração “conhecida”: USP, NIST, Sigma-Aldrich etc;
2) Comparação dos resultados com outro método, bem

estabelecido (p.e farmacopéico), cuja exatidão seja conhecida;
3) Ensaios de adição e recuperação:

- Adição de quantidade conhecida do analito ao branco.
- P.e.: adição do fármaco ao placebo.
51
Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos
resultados obtidos em uma série de medidas de uma
mesma amostra. É considerada em 3 níveis:
1) Repetibilidade (precisão): concordância entre os resultados
dentro de um curto período de tempo, com o mesmo analista e a
mesma instrumentação:
Resposta Nove determinações

contemplando o intervalo do
método (3 em concentrações
baixas, 3 em conc. médias e 3
y = a + bx em conc. altas), com 3 réplicas
cada;
Ou no mínimo 6 determinações
no 100% do teste.
Concentração
xt1 xt2 xt3 52
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Precisão
2) Repetibilidade (precisão intermediária): concordância
entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias
diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos
diferentes;
3) Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial):
concordância entre resultados obtidos em laboratórios diferentes
(estudos colaborativos), geralmente aplicados à padronização da
metodologia analítica (p.e. inclusão de metodologia na
farmacopeia).
• A precisão pode ser expressa como o desvio padrão ou desvio

padrão relativo (coeficiente de variação);
• O valor máximo aceitável deve ser determinado de acordo com
a concentração do analito na amostra:
53
Precisão
54
27
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Precisão
 A trombeta de Horwitz :
55
Limite de detecção (LD)
 É a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não
necessariamente quantificado, sob condições
experimentais estabelecidas.
• Para métodos não instrumentais (p.e. titulação), o LD

pode ser estimado visualmente, onde o LD é o menor valor
de concentração capaz de produzir o efeito esperado
(turvação, mudança de cor etc);
• No caso de métodos instrumentais, existem duas
maneiras de estimar o LD:
56
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Limite de detecção (LD)

1) Pela equação: Onde: sb = Desvio padrão do
branco OU erro do intercepto
da curva analítica;
LD = 3* sb/S
S = Sensibilidade do método.
2) Pelo método da relação sinal/ruído:
Quando é possível
medir o ruído na
linha base:
LD = 3 * ruído
57
Limite de quantificação (LQ)

 É a menor quantidade do analito em uma amostra
que pode ser determinada com exatidão e precisão
aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas;
Normalmente é expresso pela equação:
LQ = 10* sb/S
 Pode também ser expresso pelo método do

sinal/ruído. Neste caso a relação é: LQ = 10* ruído
 LQ é importante para métodos de determinação de

analitos em concentrações baixas (impurezas, produtos
de degradação de fármacos, resíduos de agrotóxicos etc).
58
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Robustez
 É a capacidade do método em resistir a pequenas
variações experimentais que podem acontecer na sua
rotina de execução;
 Parâmetros a serem avaliados dependem do método:
59
30

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QA 483 – Estatística aplicada à

Profa. Márcia C. Breitkreitz

Auxiliar didático (PAD): Igor Bassetto

• Conjunto de testes experimentais realizados após o

 E para que serve ?

“A Validação deve demonstrar que um método analítico, nas

• ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária):

• US-FDA (United States Food and Drug Administration):

 Os principais parâmetros de validação (Figuras de

É a capacidade de uma metodologia analítica de

• É preciso conhecer a relação entre o sinal analítico (sinal do

1) Relação linear aparente;

• Número de pontos = 5 (mínimo):

• “Zoom” da curva analítica:

Método dos Mínimos

 Cálculo dos coeficientes: É preciso definir as Somas

I.C. = Coeficiente ± t,95% * Erro coeficiente

valor tabelado da distribuição t com n-2 graus de liberdade

• O intervalo de confiança é uma faixa de valores, contidos

• O I.C para o intercepto deve passar pelo zero pois quando a

O software fará o cálculo, mas cabe a você a tarefa de

Soma dos Quadrados

• A Soma Quadrática dos resíduos (SQr) é a medida da variação

Desvio padrão da regressão

• De uma maneira geral: “s” é uma maneira de

• Resíduos devem ser distribuídos de forma aleatória

Resíduos adequados: Resíduos tendenciosos:

Heteroscedasticidade Modelo inapropriado

-2,00E+06 Amostra anômala

• Mas qual seria o limite de aceitação para amostras

• Limite de Rp = 3: os resíduos passam a ser medidos em

3,5 Gráfico de Resíduos padronizados

• Intervalo de Confiança para os coeficientes sem

• Como expressar os resultados:

Coeficiente angular: 1,53*108 ± 3,61*106

não passou pelo zero...

Coeficiente linear: 4,46*105 ± 6,80*105

Passou pelo zero!

• Consequências de um intercepto significativo: Erro sistemático

•“r” é o coeficiente de correlação linear (de Pearson) e

Ajuste quadrático seria

• O coeficiente de determinação, R2, é a porcentagem da

• Um R2 de 0,60 indica que as variáveis independentes

ANOVA aplicada à Regressão

Princípio: Dividir a variação total de um conjunto de dados

ANOVA aplicada à Regressão

ANOVA aplicada à Regressão

ni = número de observações no nível i; m= número de níveis da

• Cada SQ tem um número de graus de liberdade, ,

 SQR = p-1, sendo p = número de parâmetros no modelo

ANOVA aplicada à Regressão

MQR da regressão: MQR = SQR/p-1

MQr dos resíduos: MQr = SQr/n-p

• MQs são utilizadas para fazer testes de hipótese para

H0: variância devido à variação em x é equivalente ao erro

• Seleção do teste estatístico: teste F pois vamos avaliar

Comparar com Ftab com graus de liberdade de MQRegressão e

ANOVA aplicada à Regressão

• Se Fcalculado > Ftabelado = Rejeita-se H0

 Ao rejeitar H0 consideramos a Regressão significativa ou

Estão diretamente relacionados à linearidade:

• A sensibilidade está relacionada ao incremento de sinal

Método A é mais sensível que método B.

Coeficiente angular: 1,53108 ± 3,61106

Coeficiente linear: 4,46105 ± 6,80105