UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ – UECE

FACULDADE DE EDUCAÇÃO DE ITAPIPOCA – FACEDI

CURSO DE LICENCIATURA EM QUÍMICA

ANÁLISE FITOQUÍMICA E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA

DA ESPÉCIE PIPER HISPIDIVERVUM C.DC.

KAROL PÂMERA CORDEIRO ALVES

Orientadora: Profa. Dra. Jane Eire Silva Alencar de

Menezes
INTRODUÇÃO

A utilização de plantas medicinais para fins

terapêuticos, tem sido largamente difundida pelo
mundo, devido à importância do estudo
fitoquímico, pois este reflete o potencial
fitoterápico destas plantas nos tratamentos de
doenças.
A flora nordestina é rica em espécies etnofarmacologica,
devido a variedade de plantas já estudadas, através do
conhecimento popular.
O estudo das plantas medicinais tem motivado
pesquisadores do mundo para a utilização de medicamentos
de origem natural, como também os custos dos tratamentos
da medicina moderna contribuem para que mais pessoas
procurem uma alternativa no tratamento de suas
enfermidades.
OBJETIVOS
 Objetivos Gerais
 Estudo químico e biológico da espécie Piper hispidinervum C.DC.
 Objetivos Específicos
Fornecer conhecimento sobre os compostos de origem natural;
Através dos testes fitoquímicos identificarem vários compostos orgânicos;
Verificar a presença ou a ausência de fenólicos, taninos, flavonoides,
saponinas etc., na matéria prima.
Submeter os óleos essenciais da espécie a bioensaios de atividade
acetilcolinesterase, antioxidante, citotóxica.
LEVANTAMENTO BIBLIOGRAFICO

Família Piperácea

A família Piperácea compreende cerca de 14 gêneros

distribuídos em 2000 espécies sendo estas encontradas nas
regiões tropicais e subtropicais do globo, 1 porém somente
170 encontram-se no Brasil . 2

1 (MABBERLEY, 1997.) 2 (JARAMILLO et al., 2001)

 A família Piperácea tem-se revelado bastante
promissora, pois algumas de suas espécies como Piper
nigrum L., Piper aduncum L. e a Piper hispidinervum C.
DC., têm demonstrado excelentes resultados em pesquisas
que avaliam suas potencialidades como plantas possuidoras
de atividades controladoras de pragas 3. Devido a sua
importância econômica, ecológica e medicinal um grande
número de espécies desta família têm sido fitoquimicamente
investigadas.

3 (VENDRAMIM, 1997).
 GÊNERO PIPER

O gênero Piper possui aproximadamente 2000 espécies

distribuídas em diversas partes do mundo. Este gênero, além
de Peperomia, Zippelia e Manekia, pertence à família
Piperaceae (ordem Piperales). Diversas espécies têm
demonstrado diferentes tipos de atividades biológicas, como
por exemplo, antifúngica, inseticida, bactericida, anti-
helmíntica, antitumoral e repelente de insetos .4

(4ALÉCIO et al., 1998; BALDOQUI et al., 1998; ORJALA et al.,1993; NAVICKIENE et al., 2000; SILVA et al., 2002) .
ESPÉCIE PIPER HISPIDINERVUM C.DC

A espécie Piper hispidinervum

C.DC. (Figura 1), popularmente conhecida
como pimenta-longa, safrol ou sassafrás,
é uma planta arbustiva aromática cujo
óleo essencial extraído de suas folhas e talos são ricos em safrol, com
demanda crescente por parte da indústria química devido à obtenção de
heliotropina e butóxido de piperonila (PBO) ingredientes essenciais à
produção de fragrâncias e inseticidas biodegradáveis 5.

5 (GUEDES et al., 2007).

 O Brasil possui tradição no cultivo de plantas aromáticas e
na produção de óleos essenciais, proporcionando divisas de
exportação, sendo crescente a absorção desses produtos por
diversos ramos industriais como nos de alimentos, fármacos,
perfumes e cosméticos, inseticidas, detergentes e desinfetantes.
Isto favorece a pesquisa e o desenvolvimento de novos processos
e/ou técnicas de obtenção de tais produtos.
Dentre as matérias-primas para a produção de óleos
essenciais que despertaram interesse em passado recente, pode-se
citar as piperáceas.
CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS
DA ESPÉCIE PIPER HISPIDINERVUM
C.DC.
A importância do estudo de óleos essenciais esta relacionada
às suas inúmeras aplicações, dentre dos quais se destaca, o Safrol
(extraído das folhas e talos do óleo essencial de P. hispidinervum),
é um componente químico aromático utilizado pela indústria como
matéria prima na manufatura de heliotropina (fixador de
fragâncias) e butóxido de piperolina (agente sinergístico nos
inseticidas e pesticidas naturais à base de Piretrum).
 A isomerização do óleo essencial de pimenta-longa a cis, trans–isosafrol
(Figura 2) foi executada em um balão de fundo redondo de 250 mL,com
condensador de refluxo, posteriormente aquecido e agitado por meio de uma manta
aquecedora da FISATOM.

Figura 2 - Isomerização do óleo essencial de pimenta-longa.

ÓLEOS ESSENCIAIS

Os óleos essenciais compreendem mais de 60 componentes

individuais. Os principais podem constituir até 85% do óleo,

posto que outros componentes estão presentes somente como

traço 6 . Seus constituintes variam de hidrocarbonetos terpênicos,

alcoóis simples e terpênicos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres,

entre outros.

6 (SANATORE, 1996)
 Considerando que os compostos terpênicos

constituem a maioria dos óleos essenciais, os

monoterpenos mais comuns encontrados nos óleos

voláteis são: linalol, geraniol, tujona, cânfora, limoneno

e outros. Já entre os sesquiterpenos mais comuns,

encontram-se: farnesol, neurolidol, bisaboleno, entre

outros 7. Representados na figura 3.

7(SIMÕES et al., 2003).
FIGURA 3. ESTRUTURAS DE MONOTERPENOS, FENILPROPANÓIDES E
SESQUITERPENOS ENCONTRADOS NOS ÓLEOS ESSENCIAIS.
ANÁLISE FITOQUÍMICA
Para algumas substâncias, em certos vegetais, podem-se
realizar reações de caracterização diretamente sobre os tecidos do
material vegetal. Entretanto na maioria das vezes, para se proceder à
caracterização de um determinado grupo de substâncias presentes
em um vegetal, deve-se primeiro extrair essas substâncias com um
solvente adequado, para, então, caracterizá-las com extrato. A
realização das reações de caracterização diretamente no extrato
bruto, pode eventualmente mascarar o resultado.
ESTRUTURAS

OH O

N O

Alcaloides Polifenois Flavonóides

O
O

OH
O O

OH Antraquinonas
Saponinas Taninos
INIBIÇÃO A ENZIMA ACETILCOLINESTERASE

A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa,

progressiva, que afeta principalmente a população idosa, responsável por
50-60% dos casos de demência em pessoas com mais de 65anos de idade.
Os principais sintomas associado a DA envolve deficiência orgânica
cognitiva, principalmente perda de memória. Outras características
associadas com os estágios avançados de DA inclui déficit na linguagem,
depressão, problemas de comportamento, inclusive agitação, alterações de
humor e psicose.
 Em nível celular, a doença está associada à redução de acetilcolina (ACh)
no processo sináptico, reduzindo também a neurotransmissão colinérgica cortical.
A formação de placas amilóides extracelulares (depósitos de proteína B-amilóide) e
microtúbulos e emaranhados neurofibrilares intraneuronais são também
características do mal de Alzheimer. As regiões do cérebro mais afetadas são o
córtex frontal e o hipocampo. 8

8 (VIEGAS JR et al., 2004).

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Nos últimos anos, uma substancial quantidade de

evidências tem indicado o papel chave dos radicais livres e outros
oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e
pelas doenças degenerativas associadas ao envelhecimento, como
câncer, doenças cardiovasculares, catarata, declínio do sistema
imune e disfunções cerebrais.
 A produção de radicais livres é controlada nos seres
vivos por diversos compostos antioxidantes, tais como: ácido
ascórbico (vitamina C), tocoferóis (vitamina E), polifenóis,
selênio e carotenoides.
Os tocoferóis (um tipo de vitamina E lipossolúvel) são
encontrados em quatro formas na natureza: α, β, γ e δ-
tocoferol. Sendo o α-tocoferol (Figura 13) a forma
antioxidante mais importante e amplamente distribuída nos
tecidos e no plasma 9 . O potencial antioxidante dos tocoferóis
em meio biológico é diferente, sendo α >> γ > δ > β 10 .

9 (BIANCHI & ANTUNES, 1999); 10 . (CERQUEIRA et al., 2007).

ATIVIDADE CITOTÓXICA

Artemia Salina Leach (Figura 16), é um crustáceo da ordem

Anostraca (sem carapaça) que vive em lagos de água salgada de todo
o mundo, estando adaptada para sobrevivência em corpos de água
que sofrem grandes variações sazonais, podendo tolerar salinidades
que flutuam de 3,5 a 70%.

FIGURA 16. Nauplio Artemia salina

 Por ser amplamente utilizada como alimento vivo para peixes e
outros crustáceos, seus ovos podem ser encontrados com facilidade em
lojas de aquaristas. Além disso, os ovos não eclodidos são
metabolicamente inativos, e podem ser conservados por longos
períodos se mantidos desidratados e de preferência em vácuo e a baixas
temperaturas.
Quando reidratados os ovos de Artemia eclodem em cerca de 24
horas, se em condições ambientais adequadas, chegando à fase adulta
com 20 a 30 dias de vida. Esse ciclo de vida relativamente curto
favorece seu uso em testes de toxicidade aguda.
METODOLOGIA

A espécie Piper hispidinervum C. DC., foi coletada na

localidade de São Daniel a 20 Km de Itapipoca, estado do
Ceará, Brasil em fevereiro e março de 2011. Sua exsicata,
ainda sem número, encontra-se em fase de identificação e
está depositada no Herbário Prisco Bezerra do
Departamento de Biologia da Universidade Federal do
Ceará.
METODOLOGIA

FLUXOGRAMA 1. Obtenção do óleo essencial das folhas Piper hispidinervum C. DC

 Análise Fitoquímica I

Alcalóides I Saponinas
Reativo de Espumídicas
Bouchädart Agitar
HCl a 5% Esperar por 30
Cor: Laranja min
avermelhada

Ácidos Orgânicos
Reativo de Pascová Polissacarideos
AeB Reativo de Bouchädart
descoloração Cor: Azul
 Análise Fitoquímica II

Antraquinonas Taninos e fenóis

livres Solução alcoólica de
Solução de FeCl3 a 1%.
NH4OH O teste em branco (água
Cor: Rósea ou + Solução de FeCl3).
avermelhada

Glicosideos
antraquinônicos e Flavonóides
dímeros HCl conc. + raspas de
EtOH 25% magnésio.
Cor: Rósea ou Cor: rósea
avermelhada
 Análise Fitoquímica III

Classes de Flavonóides Leucoantocianidinas,

pH 3, 8 e 11 catequina(taninos) e
Cor: vermelha, lilás ou Flavanonas
azul; cor: amarela; ou pH 1 e 3; 11
vermelha ou vermelha Cor: meio ác. Vermelho
púrpura; ou vermelho Meio básico amarelho
laranja claro
Lactonas
Sol. Alcoólica H3NO.HCl Esteróides e triterpenos
a 10% + Sol. Metanólica Anidrido acético
de KOH a 10% Ác. Sulfurico conc.
HCl a 1M Cor: Variante entre Azul
FeCl3 a 1%. ao Verde.
Cor: Violeta
INIBIÇÃO DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE
1. Preparação da solução 2. 19,8 mg de DTNB em
tampão 50 mM de pH 8,0 50mL solução tampão =
1mM do reagente de
Ellman.
3. Enzima AchE + na
solução tampão e o iodeto
4. Padrão fisostigmina foram
de acetiltiocolina (ATCI) 1
solubilizados em
mM foi dissolvido em água
diclorometano,na concen-
milipore.
APLICAÇÕES: tração de 2 mg/mL.
1.Padrão nas placas de
CCD
2. O padrão Fisostigmina
Sol. em dicloro- metano.
3. E aguarda-se a 1. Espera -se1 0 min.
evaparação dos sol.
2. Leitura dos halos

1.Borrifa-se o reagente de
Ellman.
2. Espera-se alguns minutos

3. Borrifa na placa a
solução de AChE.

DTNB: Reagente de Ellman (ác. 5,5’-ditiobis-[2-nitroenzóico]; ACTI: iodeto de acetilcolina.

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
2,6 mg de DPPH AMOSTRAS: Transferiu 3,9 mL de
em 100mL óleo + metanol DPPH + 0,1mL de
metanol metanol

Transfere para os tubos de ensaio as

soluções de óleo + amostra + 3,9 de
PI = ADPPH - AAMOSTRA x 100
ADPPH
DMSO nas respectivas conc.10000;
5000;1000;100;50;10;1

Espera-se 30
minutos

LEITURA EM ESPECTROFOTÔMETRO A 517 nm

ATIVIDADE CITOTÓXICA
Os cistos de Artemia salina
foram colocados em um Após 48 h de incu-
aquário com água do mar sob bação, as larvas foram
aeração e após 48 h de retiradas para o ensaio
incubação sob aeração .

Foram realizadas diluições

Após 24hs conta-gem seriadas dos óleos
do numero de larvas essenciais das folhas em
sobrevivente. vidros de 10mL

Vidros
Transferência 5,0mL de água Solução Controle
das larvas para marinha + 3 gotas de DMSO + Água do mar
os vidros DMSO
RESULTADOS
TESTE PIPER HISPIDINERVUM C. DC.
Alcaloides I +++
Saponinas Espumídicas +++
Ácidos orgânicos ++
Polissacarídeos +
Antraquinonas Livres -
Glicosídeos antraquinônicos e dímeros +
Taninos e Fenóis ++
Flavonoides -
Antocianinas -
Antocianoidinas -
Flavonas +++
Flavonóis +++
RESULTADOS

Xantonas +++
Chalconas -
Auronas -
Flavononóis -
Leucoantocianidinas -
Catequinas (taninos) +++
Flavanonas -
Lactonas -
Triterpenos -
PARÂMETROS: ausentes (-); suspeitos (S); fraco (+); médio (++); forte (+++).
RESULTADOS

Inibição da enzima acetilcolinesterase

Amostras Halos de inibição (mm)

OEFPH 8
Padrão – fisostigmina 9

*Concentração das amostras e padrão = 2mg/mL

TABELA 2. Dados da inibição da enzima acetilcolinesterase em ensaios do

óleo essencial das folhas de Piper hispidinervum.
RESULTADOS

Atividade Antioxidante

O óleo essencial das folhas de Piper

hispidinervum C.DC, através do teste frente ao
DPPH não apresentou atividade antioxidante, já que
valor apresentado é em torno de 4,49%, quando
comparados com o padrão ácido ascórbico 43,8%.
RESULTADOS
Atividade Citotóxica

% da média
Concentrações Mortos Média de morte
de morte

1000 (3) 30 10 100%

100 (3) 24 8 80%

10 (3) 14 4,6 46%

1 (3) 13 4,3 43%
 y = ln % morte
log Con.
Concentração (ppm) % morte 100 – %morte
(x)

1000 3,00 100% 9,21

100 2,00* (x2 ) 80% 0,6* (y2)
1,00*(x1)
10 46% -0,16*(y1)

1 0 43% -0,28
y = mx + b ( Equação geral de uma reta) m = ( y2 – y1 ) m = ( 0,12 + 0,82 ) m = 0,76
( x2 – x1 ) ( 3 – 2)
b1 = y1 – m . x1 b1 = – 0,92
b2 = y2 – m . x2 b2 = – 0,92  b = – 0,92 ( Média)
y = 0,76x – 0,92 ( Equação da reta obtida pela regressão linear do gráfico)
A DL50 será o ponto em que a reta corta o eixo x, ou seja, quando y = 0:
Sendo y = 0 0,76x – 0,92 = 0 x = 1,21 A DL50 será o exponencial desse valor:
log DL50 = 1,21 DL50 = 10 1,21 DL50 = 16,22 ppm
CONCLUSÃO
Os resultados apresentados neste trabalho ressaltam o potencial
anticolinesterásico do óleo essencial de Piper hispidinervum C. DC
como fonte potencial na elaboração de drogas naturais que possam vir a
auxiliar no tratamento do mal de Alzheimer e neste contexto, os estudos
in vitro e in vivo são justificados para avaliar o papel dos óleos no
tratamento da doença de Alzheimer.
Assim, a busca por substâncias capazes de inibir a ação dessa
enzima vem se alargando, principalmente as provenientes de produtos
naturais que oferecem menos ou nenhum efeito colateral.
 A análise da atividade antioxidante realizada com a espécie
Piper hispidinervum C.DC não apresentou potencial em sequestrar
radicais livres, já que compostos com atividade antioxidante são
capazes de interceptar os radicais livres gerados pelo metabolismo
celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os
lipídeos, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos
graxos poli-insaturados e as bases do DNA, evitando a formação
de lesões e perda da integridade celular.
 A análise da atividade de toxicidade realizada com o
óleo essencial de Piper hispidinervum C.DC das folhas da
espécie em estudo, apresentam uma excelente toxicidade
para Artemia salina. Portanto o óleo essencial da espécie
em questão tem atividade citotóxica, sugerindo que
poderiam igualmente apresentar ação antitumoral.
 Estudos fitoquímicos realizados com Piper hispidinervum C.DC.,
tem mostrado a presença forte para alcaloides, comprovando a literatura
consultada, que ao lado de amidas apresentam propriedades para serem
utilizadas como inseticidas e antifúngicos. Comprovou-se também que a
espécie em estudo apresentou forte presença de Saponinas Espumídicas,
Flavonas, Flavonóis, Xantonas e Catequinas (taninos). Já para
flavonoides os resultados foram ausentes, tanto para a análise
fitoquímica, quanto para a atividade antioxidante, contrapondo-se com a
literatura que caracteriza a que espécie Piper apresenta flavonoides e
atividade antioxidante.
AGRADECIMENTOS
MENSAGEM FINAL

Quero, um dia, poder dizer às pessoas que nada foi em vão…

que o AMOR existe, que vale a pena se doar às amizades a às pessoas,
que a vida é bela sim, e que eu sempre dei o melhor de mim…
e que valeu a pena!
Mário Quintana