Sistemas de clonagem

● Enzimas com atividade exo 5’ 3’ é aquele que consegue degradar uma fita existente
e sintetizar uma nova ao mesmo tempo. O que dá a característica proofreading é a
atividade exo 3’5’. “ Da ré e degrada o que ela fez de errado” por isso ela é fiel.
● A escolha da enzima depende do que iremos realizar.
● Não utilizamos o proofreading quando queremos variabilidade na sequência
artificialmente.
● Canônico: Clássico

Kits vendidos comercialmente

● Sistema TA vector: Baseado no comportamento da polimerase e quando o inserto é

um produto de PCR.
● Sistema TU vector
● Observar a característica da enzima: Se ela faz uma ponta cega ou uma ponta
protundente
● Para as enzimas fies quase todas farão uma ponta cega
● Para as enzimas mais processivas como a taq, será feito um overhang de A. O que
poderia ser um problema, mas criaram os vetores com overhang de T ou U.
● Dessa forma, não seria necessário o uso de enzimas de restrição para qualquer
produto de PCR que tenham um overhang de A e garantir a ligação.
● Posso fazer a ligação com uma T4 DNA ligase.
● Serão ligações não direcionais !

Sistema blunt

● Vetores que apresentam partes cegas, para clonar sequências cegas

● Usados quando queremos uma sequência muito fiel, utilizando enzimas
proofreading.
● Clonagem não direcional
 ● O cassete em azul codifica um gene de uma toxina para a bactéria.
● Portanto, se o vetor fechar sozinho, sem o inserto, o cassete será reconstituído e
bactérias que apresentarem o vetor vazio não irão crescer.
● Todas as bactérias que estão no meio apresentam o vetor recombinante.
● O produto (proteína) do gene eco47IR é tóxico para a bactéria receptora do
plasmídeo. Sobrevivência exclusiva para as bactérias com inserto clonado na ORF
de eco47IR

Topo cloning :

● Topoisomerase: Desfazem a torção da abertura de fitas do DNA, quebrando uma

das fitas.
● Proposta do vetor topo cloning
● Como se apresenta o vetor comercial: Ele vem linearizado, podendo apresentar
pontas coesivas com timinas nas extremidades ou pontas cegas. E ligados
covalentemente em ambas as extremidades do vetor - topoisomerases.
● Quando ocorre a hibridação vetor-inserto A-T há a restauração da ligação
fosfodiéster pela topoisomerase. A topoisomerase é liberada do vetor e permanece
no meio aquoso.

● As empresas entregam o vetor com uma topoisomerase pendurada no polylinker

● Vetor que tem conjugado na região do polylinker a enzima topoisomerase.
● Irei entregar para o sistema um produto fosforilado de tal forma que quando a
topoisomerase que esta na ponta do seu vetor quebrar ela pode religar com a ponta
do produto. ???????????
● Posso ter o topo cloning com overhang de T ou cego
● O papel da topoisomerase nos kits é substituir a ligase.
● Topoisomerase nas duas pontas.

Sistema Gateway de clonagem

Fago capaz de infectar procariotos.

attP: motivo de recombinação no genoma do fago.

● No evento de recombinação e inserção do genoma do fago no genoma de um

hospedeiro como bactérias, há uma recombinação com um motivo chamado attB no
genoma da célula hospedeira, que leva a inserção do genoma viral e a produção de
novos sítios de recombinação , denominados de attL e attR.
● Nesse contexto, o fago pode promover uma integração no genoma ou em condições
propícias de propagação, uma excisão e produção de novas partículas virais.
● Resumindo, os sítios attP e attB se recombinam, formando os sítios attL e attR.
 ● O sistema gateway de clonagem e utilizado juntamente com a presença de um gene
que codifica para uma toxina na sequência do vetor
● Toxina ccdB que inibe a topoisomerase e consequentemente quando esse
plasmídeo está presente nas bactérias leva à morte celular.

● Como o sistema funciona em termos práticos?

1. Amplicon que apresenta em suas extremidades sítios attB. (Basta inserir no
desenhos de primers a sequência referentes ao motivo attB)
2. Esse amplicon vai ser mesclado in vitro com o vetor doador com o motivo attP e a
toxina
3. Na presença da enzima BP clonase que realiza a recombinação entre o motivo attB
e attP , teremos a entrada do gene no vetor gerando o vetor de entrada
(recombinante) com sítios attL e como subproduto da reação a toxina flanqueada por
motivos attR

● Uma segunda possibilidade visa a utilização da enzima LR clonase

1. Temos o vetor de entrada contendo o gene de interesse flanqueado com os sítios
attL e esse vetor é mesclado in vitro com um vetor de destino o qual contém a toxina
e motivos attR
2. Recombinação LR utilizando a RL clonase
3. Os fragmentos serão trocados entre os dois vetores (inserto e toxina)
4. Teremos então um subproduto tóxico e motivos attP
5. O vetor de destino terá o inserto flanqueado com os motivos attB.

● Há também a possibilidade desses vetores serem comercializados com a

topoisomerase. Podemos ver um vetor de destino contendo sítios attL fornecido de
forma linear e apresenta em suas extremidades as enzimas topoisomerases e uma
sequência simples fita.

Sistema de clonagem por Gibson Assembly

● Nesse sistema, deve-se desenhar primers de forma que os primers desenhados

para o fragmento de interesse carreiam nas extremidades sequências dupla fita que
é idêntica a extremidade do vetor no qual será realizada a clonagem.
● Vetor já linearizado
● Evento de recombinação
● Tratar com enzimas de restrição e deixar o amplicon com pontas coesivas que pode
hibridar com o vetor.
● Agora teremos o preenchimento dos nucleotídeos faltantes com uma polimerase.
● Dna ligase para realizar as ligações
● Em resumo: Exonuclease para promover pontas coesivas com o amplicon de
interesse o qual irá hibridar com o vetor. Pela ação da polimerase para preencher os
nt faltantes e a ação da ligase.
● Vantagem no sistema Gibson: Combinar muitos fragmentos de DNA uma única vez: