FLUXOGRAMA DA PRODUÇÃO DE SUBUNIDADES FIMBRIAIS DE FORMA RECOMBINANTE:

1) Amplificação por PCR dos genes das subunidades de fimbriais tipo I (fimA e fimH) e
tipo III (mrkD, mrkA) (genes de interesse ou insertos) a partir do DNA genômico de
Klebsiella pneumoniae (uma reação de PCR para cada gene a ser amplificado, com
primers específicos)
2) Eletroforese em gel de agarose para checar se a PCR funcionou (resultado positivo é
indicado pela presença de bandas de DNA de tamanho correspondente a cada gene
amplificado).
3) DNA cortado da agarose e purificado (kit GFX). Também pode ser urificado diretamente
da solução de PCR (maior rendimento) se a reação ficar limpa com apenas uma banda
de DNA.
4) Ligação dos insertos (genes purificados) aos vetores de clonagem (pGEM-T easy ou
pCR), também chamados de plasmídeos. Esses vetores vêm abertos e com
nucleotídeos “T” nas extremidades, para ligação aos genes amplificados pela enzima
Taq polimerase, que adiciona “A” no final das fitas).
5) Transformação de E.coli DH5-α com o DNA recombinante (produto da ligação dos
insertos aos vetores) e plaqueamento.
6) Isolamento de colônias da placa de E.coli DH5-α em meio líquido LBamp* (LB acrescido
de ampicilina a 50 ug/ml).
7) Confirmação da presença dos insertos no vetor de clonagem por PCR(pode ser feita a
partir do meio liquido ou diretamente nas colônias da placa).
8) Miniprep (purificação dos vetores contendo insertos)- kit 2 (isolamento de DNA
plasmidial).
9) Digestão do pGEM.T_inserto (mrkA, mrkD, fimA ou fimH) e pAE (ou pQE) vazio com
enzimas de restrição adequadas. As enzimas de restrição irão cortar o DNA de forma
controlada, liberando os insertos. A seleção das enzimas é definida pelos sítios de
restrição adicionados aos primers. Ver com Lucas e Barbara as duplas de enzimas
usadas em cada gene de interesse.
10) Eletroforese em agarose para separar os fragmentos da digestão.
11) Purificação dos DNAs (mrkA, mrkD, fimA, fimH, pQE vazio e pAE vazio).
12) Ligação dos insertos aos vetores (gerando pAE_mrkA, pAE_mrkD, pAE_fimA e
pAE_fimH, e o mesmo para pQE).
13) Transformação de E.coli DH5-alfa com os produtos das ligações.
14) Confirmação da presença dos insertos por PCR de colônias
15) Isolamento de colônias em meio líquido LBamp.
16) Miniprep dos vetores finais (pAE e pQE contendo os insertos).

Aqui termina a Clonagem.

PRODUÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES (SUBUNIDADES FIMBRIAIS) EM E. coli:

1) Transformação de E. coli BL21DE3 (pAE) ou M15 (pQE) com os vetores contendo os

insertos.
2) Isolar 4 colônias em meio líquido (5mL) pré-inóculo.
3) Cultivo overnight.
4) Transferir 200µL para 5mL de meio novo.
5) Cultivo até DO. 0,6-0,8.
6) Separar 1mL (não induzido).
7) Indução (adicionar IPTG).
8) Incubar 3hs, separar 1mL e descartar o resto.
9) Centrifugar amostras induzidas e não induzidas.
10) SDS-PAGE (gel de acrilamida) para analisar a expressão.
11) Selecionar 1 colônia com maior expressão (comparando não induzido x induzido) e
transferir para 20mL de meio líquido.
12) Incubar overnight.
13) Passar tudo para 400mL de meio limpo.
14) Passos 5, 6 e 7, mas não descarta, centrifuga tudo!

LBamp* - meio LB acrescido de ampicilina (1uL/mL)

AS ETAPAS SEGUINTE SERÃO DE PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS PRODUZIDAS EM E. coli