INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica

LABORATORIO DE MÉTODOS DE

ANÁLISIS

Reporte de la Práctica No.7 “Separación de una

mezcla de azul de metileno y fluoresceína usando
cromatografía por adsorción”
5QV2

Profesor:
  Objetivos
 Separar dos colorantes por medio de una cromatografía de adsorción.
 Comprobar la separación con base en el perfil de elución.

 Fundamento
La cromatografía por adsorción se basa en la diferencia en el grado de adsorción de cada
compuesto orgánico sobre la superficie de una sustancia químicamente inerte (adsorbente), de tal
modo que el compuesto se ve atraído a zonas polares de la superficie del adsorbente por fuerzas
electroestáticas, quedando reversiblemente ligado a la misma. Es necesario un disolvente o una
mezcla de disolventes que interaccionen con el adsorbente y con los compuestos de la mezcla, la
interacción soluto-disolvente-adsorbente estable las proporciones relativas en que se fijan y
migran, a través del adsorbente, los diferentes solutos, determinando así la separación entre los
mismos.

Tabla 1. Valores de absorbancia obtenidos para la separación de fluoresceína y azul de metileno

Volumen de elución (mL) A493 A668

Figura 1. Perfiles de
3 0.014 0.008
elución de la
6 0.076 1.39
fluoresceína y
9 0.094 1.56
el azul de metileno.
12 0.014 0.159
15 0.01 0.044
18 0.009 0.021
 21 0.008 0.018 Discusión
24 0.007 0.013
27 0 0.002
Se sabe que el 30 0.001 0.002 objetivo
principal si fue 33 0.467 0.002 cumplido, esto
se comprueba 36 1.557 0.005 visualmente al
observar en la 39 0.421 0.005 columna la
separación de los colorantes,
42 0.15 0.007
donde primero se va a
45 0.026 0.002
recuperar uno de los
48 0.016 0.002
51 0.011 0.001
54 0.009 0.001
57 0.015 0.004
60 0.016 0
colorantes hasta que su color deje de salir y a continuación comience a recuperarse el segundo
colorante que posee una coloración diferente. También se comprueba con el perfil de elusión, ya
que como se muestra en la figura1 primero se obtiene un máximo que después regresa a su línea
base y después vuelve a subir, en otras palabras, se visualizan dos máximos totalmente definidos y
separados, cada uno perteneciente a su respectivo colorante.

Figura 2. Estructuras químicas del azul de metileno (A) y la fluoresceína (B)

Para explicar el proceso de esta cromatografía realizada es necesario tener en cuenta los tres
factores fundamentales de los que dependen las interacciones: estructura molecular de los
componentes involucrados, afinidad por la fase móvil y competencia por los sitios activos de la
fase estacionaria. El eluato es el líquido colectado por elución por cromatografía en columna,
mientras que la elusión es la migración de los solutos a lo largo de la columna desde el punto de
aplicación hasta la salida de estos la cual es ocasionada por el flujo de un eluyente, dicho eluyente
también recibe el nombre de fase móvil.

La alúmina ácida de Brockman debido a su estructura posee una carga positiva en su superficie,
recordando que cumple con el papel de la fase estacionara en la cromatografía. Cuando se tiene
un compuesto en medio ácido se van a protonar por lo que tendrá una carga positiva. Como se
muestra en la figura 2, en las estructuras de los colorantes hay grupos específicos en los que sus
cargas van a ser fundamentales para llevar a cabo la cromatografía, como lo son el ácido
carboxílico en la fluoresceína y el grupo amino en el azul de metileno.

La primera fase móvil utilizada fue agua destilada, por lo que es una fase móvil polar y los
compuestos que eluirán más fácilmente en ella van a ser polares, uno de los dos colorantes es más
polar que el otro, sin embargo, lo que aquí tiene mayor influencia son las cargas. La fase
estacionaria va a retener a la fluoresceína debido a la carga negativa que posee esta última, por lo
que el primer colorante en eluir va a ser el azul de metileno debido a que no posee ninguna
afinidad por la alúmina, pero si mayor afinidad por la fase móvil a pesar de no ser el colorante más
polar (cargas de diferente polaridad si se atraen).

Posteriormente para tener fuerzas de desorción y poder separar la fase móvil y la fluoresceína se
cambió la fase móvil, en este caso de agregó un regulador de K2HPO4 pH=12, al cambiar el pH a
uno básico se está cambiando la carga o desprotonando los compuestos, específicamente se está
cambiando la carga de la superficie de la alúmina y cambia a negativa, por lo que la fluoresceína ya
no tiene una especificidad para seguir atraída a la fase estacionaria, además el K2HPO4 va a
competir por los sitios activos para quedarse unido a la fase estacionaria debido a la cantidad y a la
constante elución del regulador de fosfatos, es así como la fluoresceína va a ser el siguiente
colorante en eluir. Una vez obtenidos los eluatos es posible construir el perfil de elusión de los
colorantes separados, esto por medio de su lectura a diferentes longitudes de onda, con esta
característica se identifica cada colorante, pues el azul de metileno tiene una longitud de
absorbancia máxima de 664 nm.

Conclusiones
 La fluoresceína y el azul de metileno fueron separados.
 La separación de los colorantes es comprobada visualmente en la columna de
cromatografía y con los perfiles de elución.
 La alúmina ácida va a tener mayor afinidad por la fluoresceína al tener agua destilada
como fase móvil.
 El azul de metileno va a ser el primer colorante en eluir en la cromatografía.
 El pH provoca una protonación o desprotonación cambia la carga estructural de los
compuestos.
 La elución del azul de metileno se da por desprotonación y competencia de sitios activos
con el regulador de fosfatos.

 Referencias
 Chaparro, C.V.,Cabanzo, R., Mejía, O.E., et al. (s.f.). Estudio de la adsorción de azul de
metileno sobre óxido de grafeno. Revista Colombiana de Materiales, vol.1 (5): 131-139.
Disponible en: https://revistas.udea.edu.co/index.php/materiales/article/download/
19442/16603/0#:~:text= Los%20experimentos%20de%20adsorci%C3%B3n%20se,adsorci
%C3%B3n%20del%20 %C3%B3xido%20de%20grafeno.
 Molina, B.P., Gomez, A.L., Velasco, L.M., et al. (1989). Prácticas de química orgánica.
Universidad de Murcia. pp. 22 -O’Neil,