Traduzido do Francês para o Português - www.onlinedoctranslator.

com

PNAS PLUS
O gene do envelope retroviral captura esincitina
exaptação para placentação em marsupiais
Guillaume Cornelisabc, Cécile Vernocheta, b, Quentin Carradeca, b, Sylvie Souquerea, b, Baptiste Mulotd, François Catzeflise,
Maria A. Nilssonf, Brandon R. Menziesg, Marilyn B. Renfreeg, Gerard Pierrona, b, Ulrich Zellerh, Odile Heidmanna, b, Anne
Dupressoira,b,1e Thierry Heidmanna,b,1,2
Unidade de Retrovírus Endógenos e Elementos Retroides de Eucariotos Superiores, CNRS UMR 8122, Institut Gustave Roussy, Villejuif, F-94805, França;
Para
bUniversidade Paris-Sud, Orsay, F-91405, França;vsUniversidade Paris Denis Diderot, Sorbonne Paris-Cité, Paris, F-75013, França;dZooparc de Beauval e Beauval
Nature, Saint Aignan, F-41110, França;eLaboratório de Paleontologia, Filogenia e Paleobiologia, UMR 5554 CNRS, Universidade Montpellier II, Montpellier, F-34095,
França;fLOEWE Biodiversidade e Centro de Pesquisa Climática, Frankfurt am Main, D-60325 Alemanha;gDepartamento de Zoologia, Universidade de Melbourne,
Melbourne, VIC 3010, Austrália; ehZoologia Sistemática, Universidade Humboldt, 10099 Berlim, Alemanha

Editado por Stephen P. Goff, Columbia University College of Physicians and Surgeons, Nova York, NY, e aprovado em 16 de dezembro de 2014 (recebido para revisão em 3 de
setembro de 2014)

Sincitinassão genes de origem retroviral capturados por mamíferos
eutérios, com papel na placentação. Aqui mostramos que alguns
marsupiais - que são os parentes vivos mais próximos dos mamíferos
eutérios, embora tenham divergido destes últimos∼190 Mya - também
possuem umsincitinaenvergonhado. O gene identificado no gambá
marsupial sul-americano e apelidado desincitina-Opo1tem todas as
características de uma boa-fésincitinagene: É fusogênico em um ensaio de
fusão célula-célula ex vivo; expressa-se especificamente na placenta de
vida curta ao nível da interface feto-maternal sincicial; e é preservado em
um estado funcional em uma série deMonodelphisespécies. Além disso,
identificamos um gene de envelope retroviral não fusogênico que foi
conservado por mais de 80 milhões de anos de evolução entre todos os
marsupiais (incluindo o gambá e o tammar wallaby australiano), com
evidências para purificação da seleção e conservação de um domínio
imunossupressor canônico, mas com expressão limitada na placenta. Este
gene capturado incomum, juntamente com uma terceira classe de genes
de envelope de retrovírus endogenizados recentemente, exibindo forte
expressão nas glândulas uterinas onde partículas retrovirais podem ser
detectadas - corresponde plausivelmente aos diferentes status evolutivos
de um gene de envelope retroviral capturado, com apenassincitina-Opo1
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
capturados e “cooptados” por seu hospedeiro, muito provavelmente para
uma função na placentação, e que foram nomeadossincitinas (revisto nas
refs. 4 e 5). Em símios,sincitina-1 (6–9) e sincitina-2 (10, 11), como sincitinas
genuínas, entraram no genoma primata 25 e >40 milhões de anos,
respectivamente, retiveram sua capacidade de codificação em todas as
linhagens subsequentes, exibem expressão específica da placenta e são
fusogênicas em ensaios de fusão célula-célula ex vivo . Além disso, um
deles apresenta atividade imunossupressora (12). Um par de
Aproximadamentegenes de retrovírus endógenos (ERVs) também foram
identificados em Muroidea, denominadosincitina-Ae
-B,que compartilham propriedades funcionais estreitamente relacionadas,
embora tenham uma origem completamente distinta, mostrando uma
sequência divergente e uma localização genômica diferente em comparação
com o primatasincitinas (13, 14). Através da geração desincitinacamundongos
knockout, demonstramos inequivocamente que esses genes são realmente
essenciais para a placentação, com uma falta de fusão célula-célula observada in
vivo no nível da camada interhemal do sinciciotrofoblasto da placenta mutante,
resultando em trocas feto-maternas prejudicadas e desenvolvimento
embrionário e sobrevivência (15, 16). Recentemente,sincitinagenes foram

identificados em quatro outros clados entre os mamíferos eutérios - a saber, em

sendo a boa-fé atualsincitinaativo no gambá e espécies relacionadas. Este
lagomorfos, carnívoros, ruminantes e os
estudo, portanto, recapitularia a história natural dasincitinaexaptação e
evolução em uma única espécie, e definitivamente estende a presença de
tais genes a todos os principais clados de mamíferos placentários. Significado

Sincitinassão genes “capturados” de origem retroviral,

| |
retrovírus endógeno proteína do envelope atividade fusogênica | correspondendo ao gene fusogênico do envelope dos retrovírus
|
sinciciotrofoblasto marsupiais endogenizados. Eles estão presentes em uma série de mamíferos
eutérios, incluindo humanos e camundongos, onde desempenham um

M mamíferos arsupiais, como cangurus e gambás, são os papel essencial na placentação. Aqui mostramos que os marsupiais -
parentes vivos mais próximos dos mamíferos eutérios que divergiram dos mamíferos eutérios∼190 milhões de anos, mas

placentários (Fig. 1), dos quais, no entanto, divergiram∼190
milhões de anos atrás (Mya) (1, 2). Este último compreende
quatro clados principais: os Laurasiatheria (por exemplo, os
ruminantes e carnívoros), os Euarchontoglires (por exemplo,
primatas, roedores e lagomorfos), os Xenarthra e os
Afrotheria. Todos são animais vivíparos, que gestam seus
filhotes internamente com um órgão especializado de origem
fetal – a placenta – permitindo trocas prolongadas de
nutrientes e gases entre a mãe e o feto. A estrutura da
interface feto-maternal exibe fortes variações, desde
membranas maternas e fetais simplesmente apostas
(placenta epiteliocorial) até tecidos placentários altamente
MICROBIOLOGIA
ainda possuem uma placenta primitiva de vida curta (rapidamente
deixada pelo embrião para se desenvolver em uma bolsa externa) —
também capturaram esses genes. A atual caracterização dosincitina-
Opo1gene na placenta de gambá, juntamente com a identificação de
duas capturas endógenas adicionais de genes do envelope retroviral,
permitem uma recapitulação da história natural desses genes
incomuns e definitivamente estendem seu “nicho simbiótico” a todos
os clados de mamíferos placentários.
Contribuições dos autores: pesquisa planejada por GC, OH, AD e TH; GC, CV, QC, SS, GP, OH e
AD realizaram pesquisas; BM, FC, MAN, BRM, MBR e UZ contribuíram com novos reagentes/
ferramentas analíticas; GC, CV, QC, SS, GP, OH, AD e TH analisaram dados; e GC, AD e TH
escreveram o artigo.

invasivos banhados pelo sangue materno (placenta Os autores declaram não haver conflito de interesses.

hemocorial). Nos marsupiais, também é formada uma Este artigo é uma submissão direta do PNAS.
placenta de vida curta, Deposição de dados: As sequências relatadas neste artigo foram depositadas no banco de
dados Gen-Bank (números de acessoKM235324–KM235359).
1AD e TH contribuíram igualmente para este trabalho.

2Para quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail: heidmann@igr.fr.

Em mamíferos eutérios, estudos anteriores identificaram envelope ( Este artigo contém informações de suporte on-line emwww.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
Aproximadamente)genes de origem retroviral que foram independentemente 1073/pnas.1417000112/-/DCSupplemental.

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112 PNAS |Publicado online em 20 de janeiro de 2015 | E487–E496

 EU
II
IIEU
PLACENTA
4 Insetívora
MAMÍFEROS
200 150 100 50
trias jurássico Cretáceo Terciário
Figo. 1. Filogenia de mamíferos e previamente identificadossincitinaGénova.
Mamíferos compreendendo os monotremados, os marsupiais e os eutérios, este
último compreendendo os quatro grandes clados: Afrotheria (I), Xenarthra (II),
Euarchontoglires (III) e Laurasiatheria (IV) (dados da ref. 1). O comprimento do
ramo é proporcional ao tempo (em My), e o tempo de inserção dos diferentes
sincitinasidentificados até o momento são indicados com setas.
tenrecs afrotherianos primitivos (refs. 17–20; ver também ref. 21). Todos eles
não estão relacionados aos genes símios e murinos, mas muito provavelmente
compartilham com eles uma função na placentação.
Aqui, perguntamos se os marsupiais - apesar de sua placenta específica
de vida curta e sua divergência ancestral dos mamíferos eutérios -
também adquiriramsincitinagenes de origem retroviral, como os últimos.
Combinando (eu)uma busca in silico por genes candidatos em genomas
marsupiais sequenciados; (ii)ensaios para sua atividade transcricional in
vivo por RT-PCR entre um grande painel de tecidos que foram recuperados
do gambá cinza de cauda curta (Monodelphis domestica),incluindo a
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
placenta; (iii)clonagem dos genes candidatos desta espécie; e (4)hibridação
in situ (ISH) de seções de placenta com sondas apropriadas, identificamos
um VRE específico da placentaAproximadamentegene, exibindo todas as
características de uma boa-fésincitinagene, que de acordo com isso
nomeamossincitina-Opo1.É expresso especificamente dentro das
estruturas sinciciais na interface feto-maternal; é fusogênico em um
ensaio de fusão célula-célula ex vivo; e está preservado noMonodelphis
genes com evidências de seleção purificadora. Além disso, identificamos
um vírus retroviral capturado ancestralmenteAproximadamentegene,
conservado em todos os marsupiais e exibindo forte seleção purificadora,
conforme demonstrado pelo sequenciamento das cópias ortólogas em 26
espécies de marsupiais das linhagens australiana (por exemplo, wallaby) e
americana (por exemplo, gambá), datando assim sua captura entre 80 e
190 Mya. Este gene é não fusogênico porque não possui um domínio de
ancoragem transmembranar e, portanto, não pode estar envolvido na
formação do sinciciotrofoblasto. Embora não seja expresso em nível
significativo na placenta - pelo menos nos estágios pós-implantação -
possui um domínio imunossupressor canônico (ISD) e, como tal, ainda
pode estar envolvido na formação da placenta por meio desta última
função. Finalmente, um terceiro retroviralAproximadamentefoi
encontrado um gene expresso nas glândulas uterinas maternas,
pertencente a sequências pró-virais endógenas recentemente adquiridas,
possivelmente responsáveis pela formação das partículas semelhantes a
vírus que observamos por microscopia eletrônica nos mesmos locais.
Juntos, o presente estudo claramente estende a gama de mamíferos nos
quais os vírus retroviraisAproximadamentecapturas genéticas e, em
alguns casos, de boa-fésincitinaexaptações ocorreram no curso da
evolução, incluindo agora os marsupiais, além dos mamíferos eutérios. É
consistente comsincitinas desempenhando um papel no surgimento da
placentação de
E488 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112
Tenrecidae espécies que põem ovos, com os monotremados - por exemplo, o mamífero
Proboscidae ornitorrinco ovíparo - ainda existindo como seus raros descendentes hoje.
Dasypodidae
Bradypodidae Resultados
Lagomorfo
Pesquisa In Silico por RetroviralAproximadamenteGenes Dentro do Gambá
Roedores eutério (M. domestica)Genoma.Para identificar putativoAproximadamente-
mamíferos
derivadosincitina genes, fizemos uso da montagem do genoma do
Haplorrhini
Strepsirrhini gambá [6.8× montagem da cobertura doM domesticagenoma;
Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC) Broad Institute
Ruminância
perissodáctilo
MonDom5; Outubro de 2006]. Uma pesquisa BLAST para ORFs (do
carnívoro
Met start códon ao stop códon) > 450 aa foi realizada usando uma
série selecionada de sequências Env representativas de famílias
infecciosas e ERV, incluindo todas as sincitinas identificadas
didelfimorfia
marsupiais
(Métodos).Ele rendeu 76 sequências, incorporadas à árvore Env
Diprotodontia filogenética mostrada na Fig. 2contraAlgumas das sequências podem
Monotremados
ser agrupadas em famílias únicas, resultando finalmente em nove
famílias que denominamos Opo-Env1 a -Env9 (Fig. 2B).A análise da
0 meu
estrutura geral das nove famílias Env identificadas (Fig. 2) sugere
fortemente que elas de fato correspondem a proteínas Env retrovirais
genuínas, com algumas de suas características, incluindo um suposto
local de clivagem de furina delineando uma superfície (SU) e um
subunidade transmembranar (TM) e um motivo CXXC na subunidade
SU correspondente a um domínio de ligação entre as duas
subunidades. Os gráficos de hidrofobicidade identificam um peptídeo
de fusão hidrofóbico putativo no terminal N da subunidade TM, bem
como o domínio transmembranar hidrofóbico dentro das
subunidades TM necessários para ancorar a proteína Env dentro da
membrana plasmática, com exceção de Opo-Env2 (Fig. 2 eFigo. S1)
que contém um códon de parada prematuro antes desse domínio
transmembranar. Um peptídeo de sinal putativo pode ser previsto no
terminal N da maioria dos genes, com exceção de Opo-Env4 e
- Aprox6. Opo-Env1 a -Env7 contém um ISD canônico (12). Apenas oopo-env1,
-env2,e -aprox9os genes estão presentes como uma única cópia codificando
uma ORF completa. Finalmente, uma pesquisa BLAST revelou que apenas oopo-
env1e -env2famílias de genes estão presentes em um baixo número de cópias
(seis e uma, respectivamente), enquanto as outras sete Aproximadamente
famílias de genes exibem um número de cópias muito maior (entre 18 e 190;
Fig. 2B).
Análises de perfil de transcrição para a identificação de placenta
EspecíficoAproximadamenteGénova.Em seguida, examinamos os níveis de
transcrição dos nove candidatosAproximadamentefamílias de genes
na placenta de gambá e em um painel de outros tecidos. As análises
quantitativas de RT-PCR (qRT-PCR) foram realizadas usando primers
projetados para serem específicos para as sequências contendo ORF
dentro de cada família de elementos (Tabela S2). No gambá (M.
domestica),o tempo de gestação é de 15 dias, com uma placenta
transitória se estabelecendo pouco antes do parto, entre os dias 12 e
15. Devido à interpenetração dos dois tecidos, o útero e a placenta
aderida foram coletados como um todo, nos dias 12, 13 e 14.
Conforme ilustrado na análise qRT-PCR na Fig. 3, dois genes, ou seja,
opo-env1e -env3—são expressos em um nível significativo na
placenta e no útero, como esperado para candidatossincitina genes,
com expressão reduzida em outros órgãos (incluindo o útero de
mulheres não grávidas).Opo-env3é o gene mais expresso, até 60
vezes maior do que o gene da proteína ribossômica doméstica RPLP0,
e com expressão > 100 vezes maior no 13º dia de gestação do que
Aproximadamente1 (mas está presente em um número de cópias >
10 vezes maior do queopo-env1;Figo. 2). O outro Aproximadamente
genes, excetoopo-env6no fígado, mostrou nenhuma ou apenas
expressão limitada em todos os órgãos. Para aprofundar a análise da
expressão de ambosopo-env1e -aprox3na placenta, e mais
precisamente para determinar - especialmente no caso da multicópia
opo-env3ORF - se a expressão específica observada na placenta se
origina de cópias definitivas e/ou únicas, análises de RT-PCR foram
realizadas para separar os transcritos que codificam as proteínas
Env1 e Env3 na placenta, usando iniciadores projetados para
amplificar todas as proteínas Env. cópias de codificação.
Cornelis et ai.
 PNAS PLUS
NO SU
CC
SU MT
VS
ISD SU/TM Figo. 2. Estrutura de uma proteína Env retroviral canônica
fusão peptídica
local de clivagem Opo-Env1 Env1
MT sinal PERV-A e caracterização dos candidatos a gambás identificados. (NO)
extracelular peptídeo CXXC RXKR CC 0,5
5 4KoRV Representação esquemática de uma proteína Env retroviral,
plasma
membrana N-ter C-ter GalV
delineando as subunidades SU e TM. O local de clivagem da
intracelular Fusão ISD trans- 98 FeLV
peptídeo membrana mGLN furina (consenso: R/KXR/KR) entre as duas subunidades, o
MoMLV motivo CXXC envolvido na interação SU–TM, o peptídeo sinal
ORF 69
B 4
CWLC RVKR
(número da cópia)
Opo-Env3
9 7 (11 impressões)
Env3 hidrofóbico (roxo), o peptídeo de fusão (verde), o domínio
transmembranar (vermelho), e o ISD putativo (azul) junto com
1 95 Opo-Env4 o CX preservado06/05/07-C padrão são indicados. (B)
Opo-Env1 0 Env4
(6) (7 cópias)
Caracterização do gambá candidato (M domestica)Proteínas
-4 6 3Opo-Env6 (chr3)
100 200 300 400 500 Env6 aprox. (B, Esquerda)O perfil de hidrofobicidade de cada
FWVC RVHK Opo-Env6 (chr6)
3 76 9 9Opo-Env7 (chr3) candidato é mostrado com as características estruturais
1 Opo-Env7 (chr4) Env7
Opo-Env2 0 canônicas destacadas emNOposicionado, quando presente
(1) 99Opo-Env7 (chr1)
-3 (mesmo código de cores). (Brilhante)Número de comprimento
8 8Opo-Env5 (chr4-2)
100 200 300 400 97 Opo-Env5 (chr4-1)
Env5 totalAproximadamenteORFs de genes dentro de cada família
CWLC RVKR
4 100 BLV de elemento e número total de cópias genômicas (entre
Opo-Env3
11 60
HTLV-2
0 parênteses). (vs)Árvore filogenética baseada na proteína
(~85) BaEV
-3
97 RD114 Retroviral Env com os candidatos à proteína Opo-Env
100 200 300 400 500 600
CWLC RQKR MPMV identificados. As proteínas Env que foram agrupadas em
4 50 Syn-Ory1
7 54
ReVA famílias únicas de elementos são distinguidas pela indicação de
Opo-Env4 0
(37) 51 HERV-FRD (Syn-2) sua posição cromossômica (Tabela S1). Uma árvore de
-4 98Syn-A probabilidade máxima usando sequências de aminoácidos da
100 200 300 400 500
CWLC RWRR 89 Syn-B
4 HERV-W (Syn-1)
subunidade TM de sincitinas e uma série de retrovírus
2 HERV-V endógenos e infecciosos é mostrada. O comprimento do ramo
Opo-Env5 0 Opo-Env2 Env2
(~190) horizontal é proporcional à porcentagem de substituições de
-3 VLT
100 200 300 400 500 9 9 Ovis-Syn-Rum1 aminoácidos do nó (barra de escala à esquerda) e os valores
CWLC REKR 92 Bos-Syn-Rum1
3 percentuais de bootstrap
2 65 HERV-Rb
0 90 Felis-Syn-Car1 > 50% (obtidos de 1.000 réplicas) são indicados nos nós.
Opo-Env6 (~90)
-4 9 5 Canis-Syn-Car1 ALV, vírus da leucemia aviária; MPMV, vírus do macaco
100 200 300 400 500 600 HERV-Pb
CWLC RWKR Mason-Pfizer; Env-Cav1, “semelhante à sincitina”cavia
3 Env-Cav-1
porcellusproteína Env1; KoRV, retrovírus de coala; GaLV,
0 3 100 HERV-R (ERV-3)
Opo-Env7 (18) 70 Opo-Env8
vírus da leucemia do macaco gibão; PERV, retrovírus
-4
(48 cópias)
Env8 endógeno suíno; BaEV, vírus endógeno de babuíno; HIV1,
100 200 300 400 500 600
CTKC RSKR HERV-K HIV tipo 1; HERV, retrovírus humano endógeno; MoMLV,
4
48 100ENTV vírus da leucemia murina Moloney; HTLV-2, vírus T-
Opo-Env80 (90) JSRV linfotrópico humano tipo 2; BLV, vírus da leucemia bovina;
-3 MMTV
100 200 300 400 500 600 Opo-Env9 Env9 JSRV, retrovírus Jaagsiekte; MMTV, vírus de tumor
CLHC RKRR
4
HIV-1 mamário murino; miAPE,M. musculuspartícula
77 miAPE
1
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.

OLV intraesternal tipo A com um gene Env; FeLV, vírus da

Opo-Env9 0 BIV
(120) 89 leucemia felina; FIV, vírus da imunodeficiência felina;
-3 FIV
100 200 300 400 500 600 RD114, retrovírus tipo C endógeno felino.

O sequenciamento da maior parte dos produtos RT-PCR revelou apenas observado, formado pela fusão celular de células trofoblásticas fetais
uma cópia com uma ORF completa (sem polimorfismo detectável nas (22). Os núcleos dos sincícios são agrupados, formando “nós
transcrições amplificadas) para ambosopo-env1 (consistente com a análise sinciciais” de dois a cinco núcleos, separados por finas projeções do
in silico) e, mais inesperadamente, paraopo-env3.Isso sugere fortemente citoplasma dos sincícios (Fig. 4NO).O epitélio materno é invadido em
que, em ambos os casos, apenas uma cópia codificadora da proteína Env intervalos regulares pelo sinciciotrofoblasto que irá deslocar as
(entre as 11 cópias identificadas in silico paraopo-env3)é transcrito células uterinas sem degradá-las (Fig. 4NO eB).Nesses locais de
invasão, o sinciciotrofoblasto entrará em contato direto com os

MICROBIOLOGIA
ativamente, conforme confirmado pela subclonagem da maior parte dos
produtos RT-PCR e sequenciamento de uma série de clones moleculares. capilares maternos, formando regiões localmente semelhantes à da
Ao todo, as análises in silico combinadas com os ensaios RT- e qRT-PCR placenta endoteliocorial de mamíferos eutérios, onde a camada de
para o vírus retroviral de gambáAproximadamentegenes claramente sinciciotrofoblasto envolve os vasos maternos.
identificadosopo-env1e -aprox3candidatosincitinagenes (sequências aa Para avaliar a relevância fisiológica deopo-env1e -aprox3 expressão,
fornecidas emFigo. S1). realizamos experimentos de ISH em seções de parafina de placenta de
gambá. Ribossondas antisense marcadas com digoxigenina específicas
Hibridização in situ em seções de placenta.A placenta de gambá é foram sintetizadas para a detecção doopo-env1e -aprox3 transcritos, bem
um órgão transitório, durando apenas 4 dias entre a ruptura da casca como as ribossondas de sentido correspondentes para serem usadas
aos 11 dias pós-coito (dpc) e o nascimento aos 15 dpc (22). Aos 14 como controles negativos. Conforme ilustrado na Fig. 4vs,a marcação
dpc, a placenta definitiva é vascularizada, com vasos fetais entrando específica foi observada apenas com as sondas antisense, e não com as
entre a camada endodérmica interna e a camada trofoblástica sondas de controle para ambos os genes. Hibridização específica com o
externa da placenta, formando a chamada placenta “trilaminar”. Do opo-env1sonda anti-sentido foi observada na interface feto-maternal. Mais
lado materno também podem ser observadas três camadas, sendo, precisamente,opo-env1expressa-se ao nível do sinciciotrofoblasto
da mãe à placenta: (eu)o miométrio uterino, (ii)as glândulas uterinas multinucleado, observando-se uma forte marcação dos nós sinciciais, onde
endometriais trabeculares que secretam nutrientes no lúmen uterino, se agrupam os núcleos do sinciciotrofoblasto. Esta rotulagem é
e (iii)o epitélio uterino materno com capilares maternos subjacentes consistente com um papel paraopo-env1na formação do
(Fig. 4NO).Durante a gestação, o epitélio uterino prolifera, formando sinciciotrofoblasto. Em contraste comopo-env1, rotulagem específica com
vilosidades e criptas que serão posteriormente colonizadas pela oopo-env3sonda antisense não foi observada ao nível da interface feto-
crescente placenta fetal. Na interface feto-maternal, as estruturas maternal (Figo. S2), mas ao nível das glândulas endometriais uterinas (Fig.
sinciciais podem ser 4vs).Interessantemente,

Cornelis et ai. PNAS |Publicado online em 20 de janeiro de 2015 | E489

 65 conter códons otimizados para expressão em células humanas (gene
0,45
0,4 opo-env1 55
opo-env3
0,35 sintético;Métodos SI), aumentou ligeiramente a eficiência de fusão, como
0,3 45
0,25 35
esperado (Tabela S3). Digno de nota, nenhuma formação significativa de
0,2 25 sincício pode ser detectada para qualquer uma das outras linhagens de
0,15
0,1 15 células alvo usadas no ensaio, incluindo as células de rim de gambá (OK) (
0,05 5
0 Tabela S3), uma situação que lembra o que havia sido observado para a

m o
Co lo

Fí ão
nível de transcrição (opo-env/RPLP0)

ov tino
d12
d 3
Ú 14
sincitina-B fusogênica de camundongo, que induziu a formação de sincício

io
pu do
ús o

Ri lmã
o

b o
Co lo

te a
Fí ão

ov tino

d1
d12
d13
Ú 4

cu
io
pu do

aç

Be ço
M riã
ús o

Ri lmã

ár
ga

in xig
Em r
b o

te a
d1

cu
aç

Be ço
M riã

r
te
ár
ga

in xig
Em er

s
m

Ba
r

s
Ba
Placenta
t

Placenta in vivo (16), mas revelou-se fusogênica ex vivo com apenas uma linha
+ Útero + Útero
celular entre todas as testadas (células MDCK caninas; ref. 13). Essas
0,1
opo-env2 0,45 opo-env6
0,05 0,4 situações incomuns podem ser explicadas assumindo que os receptores
0,35
0 Em l
0,3 ainda a serem identificados para as proteínas Env correspondentes não
u

0,25
r

são - ou são apenas fracamente - expressos na maioria das linhagens de

d1 3

az
d12
4

h
Ki
Le

SP
e

li
C
d1

ot
m
Ei

O
0,2
c
pa

Pla+Ut 0,15 células testadas e/ou, no caso dos não marsupiais células, que as
0,15
0,1
opo-env4 0,1
0,05 interações Env-receptor foram prejudicadas devido a mutações específicas
0,05 0
da espécie. Embora uma compreensão completa do “padrão de fusão” de

Em l
0

u
r
d1 3

az
d12
4

h
Ki
Le

SP
te

li
C
d1

m
Ei

O
co
Em l

Opo-Env1 exija a identificação de seu receptor cognato, os presentes

u
r

pa
d1 3

az
d12
4

h
Ki
Le

SP
te

li
C
d1

m
Ei

Pla+Ut
O
co
pa

Pla+Ut
0,2
experimentos estabelecem que Opo-Env1 é uma proteína Env fusogênica,
opo-env5 0,15 opo-env8 que agora será denominada Sincitina-Opo1.
0,1 0,1
0,05 0,05
0 0
Em l

Em l
u

u
r
d1 3

r
az
d12
4

d1 3
h

Caracterização dosincitina-Opo1Locus Genómico.Como ilustrado

Ki
Le

SP

az
d12
4
e

h
Ki
Le

SP
li

te
C
d1

t
m

li
Ei

C
d1
co

m
Ei

O
co
pa

pa

Plana + C
Pla+Ut
na Fig. 6,sincitina-Opo1faz parte de uma sequência proviral com
0,1 opo-env7 0,1 opo-env9
0,05 0,05 repetições terminais longas (LTR) degeneradas, mas ainda identificáveis e
0 0
gag-polsequências de genes (Fig. 6NO).são 3′LTR é 5′-truncado, mas as
Em l
u
Em l
u

r
d1 3

az
d12
4

u
r

h
Ki
d1 3

Le

SP
e
az
d12
4

li
h
Ki
Le

SP

C
te

d1

t
m
Ei

O
li

co

sequências flanqueadoras do provírus revelam uma duplicação

C
d1

m
Ei

O
co

pa
pa

Pla+Ut
Figo. 3.Análise qRT-PCR em tempo real do candidatoopo-envtranscrições de
genes do gambá (M. domestica).Os níveis de transcrição são expressos como a
razão do nível de expressão de cadaopo-envgene ao doRPLP0 gene de controle (
Métodos SI). Devido à alta interpenetração dos tecidos maternos e fetais, os
tecidos placentários e uterinos são analisados como um todo em três datas
gestacionais (dias 12, 13 e 14). Os resultados obtidos com a mesma série de
tecidos para os noveAproximadamentecandidatos de gene são mostrados. Os
valores são as médias de duplicatas de três amostras±SEM.
como ilustrado emFigo. S3, a análise de microscopia eletrônica dessas
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
Pla+Ut
degenerada do sítio alvo (TSD) de quatro nucleotídeos, consistente com a
integração proviral (Fig. 6NO).Uma sequência de sítio de ligação do
iniciador (PBS) também pode ser identificada a jusante do 5′LTR, como
comumente observado para retrovírus, em que é usado para iniciar a
transcrição reversa, e é encontrado no presente caso como complementar
ao tRNA de prolina (Fig. 6NO).A origem retroviral do sincitina-Opo1gene é
ainda apoiado pela ocorrência de um modo retroviral de geração do gene
subgenômicoAproximadamente transcritos, com um local de splicing
aceitador putativo localizado logo a montante do códon de iniciação Env.
Sua posição e funcionalidade foram verificadas por análise RACE-PCR de
transcritos que codificam Sincitina-Opo1 na placenta, usando iniciadores

glândulas uterinas revelou a presença de partículas virais brotando no apropriados (Fig. 6NO).Curiosamente, em desacordo com a maioria
lúmen glandular. No meio extracelular, essas partículas exibem um núcleo sincitinagenes, o promotor responsável pela expressão placentária de
icosaédrico denso, como classicamente observado para partículas sincitina-Opo1 não parece estar localizado dentro dos 5′LTR da sequência
retrovirais maduras. proviral, mas sim dentro da sequência flanqueadora genômica, ∼10 kb 5′
Dada a proporção relativa das glândulas uterinas em relação ao vírus. Digno de nota, vários sítios de ligação putativos para células gliais
ao sinciciotrofoblasto fetal, esse padrão de expressão - comopo- ausentes 1 (GCM1), um fator de transcrição placentário conhecido por
env3 expressa nas glândulas uterinas eopo-env1expresso na regular a expressão de alguns humanos e murinossincitinas (revisado na
ref. 5), pode ser identificado próximo a este promotor placentário, o que
camada de sinciciotrofoblasto - é compatível com os níveis mais
pode ser responsável pela expressão placentária desincitina-Opo1.Como
altos de expressão deopo-env3comparado comopo-env1nos
mostrado na Fig. 6B,chásincitina-Opo1–contendo provírus está localizado
tecidos mistos de placenta e útero observados acima no
em uma região intergênica, entre os genes celulares MICAL3 e BCL2L13. A
experimento qRT-PCR. Juntos, esses dados defendem fortemente
análise in silico do locus sintênico nos genomas humano, camundongo,
opo-env1, mas nãoopo-env3,ser candidatosincitinagene no
coelho, cachorro, vaca, elefante, tenrec e tatu, usando a ferramenta de
gambá, desde que tenha atividade fusogênica.
construção de sintenia MultiPipMaker, revelou que tanto o provírus
quanto osincitina-Opo1gene ortólogo estão ausentes em todas essas
Env1 é uma proteína Env retroviral fusogênica.A funcionalidade do Opo-
espécies. Curiosamente, também não é encontrado nas espécies mais
Env1 como uma proteína Env fusogênica derivada retroviralmente foi
próximas de tammar wallaby e marsupial do diabo da Tasmânia usando a
ensaiada ex vivo conforme descrito na Fig. 5. Basicamente, testamos se a
mesma abordagem.
proteína Env do gambá poderia induzir a formação de sincícios em um
ensaio de fusão célula-célula. Um vetor de expressão paraenv1foi
construído (phCMV-env1;Métodos SI), que foi introduzido (junto com um Inserir Data e Conservação desincitina-Opo1em Marsupial
vetor nlsLacZ; Fig. 5) na linha celular 293T humana altamente Evolução.Para caracterizar ainda maissincitina-Opo1e determinar sua
transfectável. As células transfectadas foram então cocultivadas com data de inserção no genoma e status na evolução, buscamos o gene
células alvo de diferentes espécies (Métodos SI), e a fusão célula-célula foi ortólogo em espécies representativas doMonodelphisgênero e em
detectada após 48 h de cocultura, mediante coloração com X-gal para ramos relacionados de Didelphidae, bem como em outras espécies de
visualização dos sincícios formados entre as células que expressam Env e marsupiais (Fig. 7). Pares específicos de locus de primers de PCR
as células-alvo. Como mostrado na Fig. 5, expressão deopo-env1em células (primer direto upstream desincitina-Opo1e primer reverso a jusante
293T resultou em fusão célula-célula ao usar as células de hamster A23 do provírus no 3′sequência flanqueadora; Tabela S2) foram usados
como alvo, levando à formação de estruturas sinciciais multinucleadas. O para amplificar o DNA genômico de espécies representativas. Em
efeito não foi observado com um vetor "nenhum" vazio como controle. Monodelphisespécies, a amplificação por PCR mostrou o produto de
Curiosamente, o mesmoopo-env1construção de vetor de expressão, mas amplificação esperado com um tamanho conservado (exceto para os
modificado mais divergentesMonodelphis emiliaeespécies, para as quais o

E490 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112 Cornelis et ai.

 PNAS PLUS
NO sincronia tiotrofoblasto (st)
B mãe feto mãe feto
UE

placentário
fetal navio (fv)

vila
st em
fetal endoderma
mv
útero epitélio ne (ue)

útero
mastro vaso interno (mv)
útero não borlas
útero
placenta mio métrica
fv

VS vilosidades placentárias opo-env1

HES senso antissenso antissenso
sincicio- UE
trofoblasto (st)
mv
st
vaso fetal (fv)
vaso materno
uterino
epitélio

opo-env3
glândulas uterinas
HES senso antissenso antissenso

uterino glandular
epitélio (ge) gl gl
lúmen glandular idade

(gl)

Figo. 4.Estrutura do gambá (M domestica)placenta e ISH paraopo-env1e -aprox3expressão em cortes placentários. (NO)Representação esquemática da placenta do
gambá. (A, Esquerda)Visão geral de um útero grávido exibindo os tecidos maternos e fetais opostos. As áreas amarela e cinza representam os tecidos do feto e da
mãe, respectivamente. (A, Certo)Esquema detalhado da estrutura placentária definitiva. A placenta trilaminar (endoderme fetal, vasos fetais e camada de
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.

sinciciotrofolasto) é oposta ao epitélio uterino materno. Localmente, o epitélio materno é invadido por projeções da camada de sinciciotrofoblasto que entram em
contato direto com os vasos maternos. Uma grande malha trabecular de glândulas uterinas pode ser vista sob o epitélio uterino materno. (B)Seção semifina da
interface feto-materna, correspondendo à área delimitada emNO,com os vários constituintes descritos à direita. O sinciciotrofoblasto multinucleado (st, amarelo)
penetra no epitélio uterino (ue, cinza escuro) e entra em contato com o vaso materno (mv, rosa). (vs) seções de placenta coradas com hematoxilina eosina açafrão
(HES) e ISH em seções seriadas paraopo-env1 (Superior)ouroopo-env3 (inferior)transcritos placentários usando antisense marcado com digoxigenina ou ribossondas
de sentido revelados com um anticorpo antidigoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. (C, superior)Vilosidades placentárias. (C, Inferior)Glândulas uterinas. A
coloração específica é observada no nível da interface feto-materna das vilosidades placentárias paraopo-env1e ao nível das glândulas uterinas maternas paraopo-
env3 (vistas ampliadas emCerto). (Barra de escala: 10 μm.)

3′primer era interno ao provírus), sugerindo fortemente a presença do Opo1foi inserido no locus identificado após a divergência entre
ortólogosincitina-Opo1ao longo do Monodelphislinhagem. Este achado foi Monodelphidae e as duas últimas espécies - ou seja,∼20 milhões de anos.

confirmado pelo sequenciamento dos produtos de PCR (sequências
depositadas no GenBank; acesso nos. KM235324–29), que revelou a
presença de umsincitina-Opo1ortólogo nas espécies testadas (Fig. 7). A
análise das sequências dos genes revelou quesincitina-Opo1codifica uma
ORF completa nas três espécies intimamente relacionadas comM.
domestica (ou seja, em Monodelphis brevicaudata, Monodelphis
americana,eMonodelphis adusta;591–598 aa de comprimento). No
entanto, o gene não tem capacidade de codificação nos dois distantes
Monodelphis TheresaeM.emiliaeespécies. Finalmente, PCRs usando DNA
genômico de outras espécies de marsupiais (pertencentes à ordem
Didelphimorphia, ou a espécies mais distantes da superordem
Australidelphia) foram negativas. A ausência desincitina-Opo1foi
confirmado usando primers de PCR internos para osincitina-Opo1ORF,
colocados em posições onde todos os genes previamente sequenciados
mostraram uma sequência de nucleotídeos estritamente idêntica. Embora
não possamos excluir formalmente que as sequências podem ser muito
divergentes para permitir o recozimento de primers e a amplificação por
PCR, e apesar do fato de não podermos amplificar o “locus vazio” no
Micoureus demeraraee marmosa murinaespécies, os dados sugerem
fortemente quesincitina-
MICROBIOLOGIA
Finalmente, como ilustrado emFigo. S4, exame minucioso de todo o
comprimentosincitina-Opo1As ORFs identificadas acima demonstram altas
semelhanças, variando de 88,6% a 98,7% de identidade de aminoácidos, e
mostram sinais de seleção purificadora, com taxas de mutação não
sinônimas a iguais (dN/dS) entre todos os pares de espécies menores que
a unidade (ou seja, 0,40 < dN /dS < 0,61), como esperado para um gene
celular de boa-fé. Digno de nota, a árvore filogenética gerada a partir de
um alinhamento dessassincitina-Opo1sequências é congruente com a
árvore filogenética de Monodelphidae. Para avaliar ainda mais a
conservação funcional dosincitina-Opo1gene, um ensaio ex vivo para sua
atividade fusogênica, conforme já documentado na Fig. 5 paraM
domestica,foi realizada, com amplificação por PCR sincitina-Opo1genes
clonados no mesmo vetor de expressão eucariótico. O ensaio de fusão
célula-célula, como mostrado na Fig. 5 anosTabela S3, apresentou
resultados positivos para todas as espécies testadas, demonstrando a
conservação funcional desincitina-Opo1.
Juntos, os dados indicam quesincitina-Opo1integrado no
genoma do ancestral de Monodelphidae e que foi cooptado
para um papel funcional na placentação em um subgrupo de
espécies que não compreende oM.emiliaeeSr. Theresa

Cornelis et ai. PNAS |Publicado online em 20 de janeiro de 2015 | E491

 NOSyn-Opo1
Sem Env ou
nlsLacZ
ensaio de fusão célula-célula
co-cultura
transfecção
X-gal
células 293T
48h coloração
Células alvo
B M domestica
M domestica
otimizado
Sem ambiente
Syn-Opo1 Syn-Opo1
M. brevicaudata senhor americano senhor adusta
Syn-Opo1 Syn-Opo1 Syn-Opo1
Figo. 5. A sincitina-Opo1 é uma proteína Env retroviral fusogênica. (NO)Esquema
representação do ensaio de cocultura para fusão célula-célula com Sincitina-Opo1.
Células 293T humanas foram transfectadas com um vetor de expressão para Sincitina-
Opo1 (ou um vetor "No Env" vazio como controle) e um plasmídeo que expressa uma
beta-galactosidase nuclear (nlsLacZ). Após a transfecção, as células 293T foram
cocultivadas com células-alvo e coradas com X-gal 48 h depois. (B)Formação de sincício
(ver setas) com o Syncytin-Opo1 indicado, usando células A23 como alvo (sem sincício
com o controle No Env). (Barras de escala: 200 μm.)
espécies. A este respeito, seria de interesse determinar se as
duas últimas espécies carecem de uma estrutura sincicial na
interface feto-maternal.
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
Procure por mais genes Env marsupiais capturados ancestralmente:env2
Está Presente e Conservado em Toda a Linhagem Marsupial.Apesar de
inserir data desincitina-Opo1no clado marsupial, bem como sua
expressão tópica, é consistente com o surgimento de uma
interface feto-maternal placentária sincicializada emMonodelphis
Figo. 6.Caracterização do gambá (M. domestica) sincitina-Opo1
gene e seu local de integração proviral. (NO) Estrutura do
sincitina-Opo1sequência proviral e local de integração. Os
elementos móveis repetidos identificados pelo programa da
Web RepeatMasker são posicionados. De notar que o provírus
mostra sinais de degeneração, com uma deleção nos 3′LTR e
degeneradogag pol sequências, com a notável exceção do
syncytinopo1envergonhado. Iniciadores de PCR usados para
identificar osincitina-Opo1cópia ortóloga em outroMonodelphis
espécies são indicadas (meias setas pretas). o emendado
AproximadamenteO transcrito subgenômico conforme
determinado por RACE-PCR de RNA placentário de gambá é
indicado (nº de acesso do GenBank KM235357). Os sítios de
ligação GCM1 putativos são indicados como linhas verticais
azuis. Sequência do sítio de integração de sincitina-Opo1,
mostrando evidências para a integração retroviral, é fornecido
acima do provírus esquematizado: sequências características
são mostradas, incluindo LTRs (com bordas TG... CA), PBS para
um tRNA de prolina e TSD (caixas vermelhas). (B)Ausência de
Sincitina-Opo1nos genomas de espécies representativas de
linhagens de mamíferos. o ge-
lócus econômico desincitina-Opo1 (com oAproximadamentegene em vermelho), juntamente com oMICAL3eBCL2L13os genes foram recuperados do UCSC Genome Browser (
genoma.ucsc.edu/), juntamente com os loci sintênicos de marsupiais (ou seja, wallaby e demônio da Tasmânia) e genomas de mamíferos eutérios; éxons (linhas verticais) do
MICAL3eBCL2L13genes e o sentido da transcrição (setas) são indicados. A homologia dos loci sintênicos foi analisada usando a ferramenta de construção de alinhamento
MultiPipMaker. Regiões homólogas são mostradas como caixas verdes pálidas, e regiões altamente conservadas (>100 pb sem uma lacuna exibindo pelo menos 70% de
identidade) são mostradas como caixas verde escuras.
E492 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112
espécies, a questão da existência de outras espécies capturadas
Aproximadamente sequências que podem ser anterioressincitina-Opo1A
entrada pode ser avaliada – até certo ponto – por meio da busca de
sequências comuns a todos os genomas marsupiais sequenciados,
incluindo o do wallaby tammar mais distante. Na verdade, uma busca in
silico do BLAST por sequências entre os genomas do wallaby e do demônio
da Tasmânia comuns aos identificados no gambá revelou queenv2—e
somenteenv2—pode ser encontrado em todas as três espécies, com alto
nível de conservação de sequência (veja abaixo). Nas três espécies,env2faz
parte de uma sequência proviral altamente degenerada, sem LTR
identificável e apenas alguns remanescentes demordaçaepólo genes (Fig.
8NO).Análise do local de integração doenv2revela que este gene está
integrado no mesmo locus genômico ortólogo, dentro de uma região
intergênica entre os genes celulares FUT10 e PRSS12, em orientação
antisense comparada com o sentido de transcrição destes genes, como
comumente observado para ERVs (Fig. 8B).Este resultado indica que o
env2-contendo provirus tinha integrado no ancestral de todas as espécies
marsupiais, ou seja, entre 80 e 190 Mya. Este achado foi confirmado pela
análise de PCR de uma grande série de DNAs genômicos marsupiais,
compreendendo as espécies Ameridelphia e Australidelphia, usando
primers indicados na Fig. 8NO.Produziu em todos os casos um gene
ortólogo que nomeamos posteriormentepan-Mars-env2 (Figo. 7). Seu
sequenciamento revelou alta conservação em todos os casos da sequência
codificante (86–100% de identidade em aminoácidos; sequências
depositadas no GenBank, nº de acesso KM235331–56) (Fig. 8vs),com a
presença de um stop códon prematuro antes da parte transmembrana da
subunidade TM, em uma posição conservada para todos os genes, e 3′à
sequência ISD preservada. Resulta em uma proteína truncada,
provavelmente solúvel e inequivocamente não fusogênica (verFigo. S1para
a proteína gambá pan-Mars-Env2), conforme descrito anteriormente para
a proteína primata HERV-R Env (ERV3) (Discussão).No entanto, devido à
ancestralidade e à alta conservação da sequência de pan-Mars-env2,e
apesar da falta de um domínio transmembrana para esta proteína Env, ela
foi posteriormente analisada quanto à pressão seletiva a que pode ter sido
submetida na evolução. Curiosamente, a árvore filogenética gerada a
partir de um alinhamento dessas sequências (Fig. 8vs)é congruente com a
árvore filogenética marsupial na Fig. 7, com as sequências Ameridelphia e
Australidelphia se ramificando em dois grupos monofiléticos distintos. Um
exame mais detalhado revelou apenas pequenas diferenças dentro desses
grupos, que na verdade correspondem a nós com baixos valores de
bootstrap. ás
NO TSD 5'LTR PBS (Pro) 3' LTR truncadoTSD
GATGTA CAGG TGTAAAG..//..CGAACATTTTGGGGCTCGTCCGGGATTTCCTGACT..//..TAACTCCA..//..CGAACA AAGGGAAGGC
Gambá
(M. domestica) . . . GAGCagta... . . . aagGTTGA... 1kb
cr8,-,
120619991-120648126 LINHA LTR proviral iniciador de PCR Local de ligação GCM1
PECADO gag-pol degenerado transcrição vírus
elemento LTR Aproximadamente eliminação
B MICAL3 syn-opo1 BCL2L13
Gambá
Wallaby
demônio da Tasmânia
humano
Rato
Coelho
cachorro
vaca
Elefante
5kb
Tenrec
Tatu
Cornelis et ai.
 PNAS PLUS
pan-Marte opo
milhões de anos Sincitina-Opo1 - Env2 - Env3
200 150 100 50 0 ORF fusão ORF ORF
(aa) atividade (aa) (aa)
Opo-Env3
Monodelphis domestica* 597 + 493 622
Monodelphis brevicaudata 595 + 493 +/-
Sincitina-Opo1 Monodelphis americana 591 + 493
Monodelphis adusta 598 + 493
Monodelphis Theresa [nc] nº 493

didelfimorfia
Monodelphis emiliae [nc] nº 493
nº Figo. 7. Inserir data e conservação dosincitina-Opo1,
Micoureus demerarae 493
marmosa murina nº 492 pan-Mars-env2,eopo-env3durante a evolução marsupial. (esquerda)
Didelphis marsupialis 493 Árvore filogenética marsupial (dados das refs. 1 e 37–40). O
Didelphis virginiana 493
comprimento do ramo horizontal é proporcional ao tempo (barra
Philander opossum 493
493 de escala no topo), com exceção doMonodelphis linhagem onde
AustráliaElphia Ameri délfia

Metachirus nudicaudatus
Marmosops parvidens 493 nenhuma informação está disponível até o momento. Os nomes
pan-Mars-Env2 Hyladelphys kalinowskii 493 das 26 espécies de marsupiais testadas são indicados, juntamente
Caluromys philander 493
Sminthopsis crassicaudata 493 com os nomes das ordens correspondentes Ameridelphia e

Das. Por. Diprotodontia

Sarcophilus harrisii* nº 493 Australidelphia (Das., Dasyuromorphia; Per., Peramelemorphia). Os
MARSUPIAIS 493 asteriscos indicam espécies cujo genoma está disponível em
Isoodon macrourus 493
Perameles gunnii 493 bancos de dados genômicos. (Certo)O comprimento (em
Pseudocheirus peregrinus 493 aminoácidos) dos diferentesAproximadamentegenes que poderiam
Phascolarctos cinereus 493 ser identificados são indicados. [nc], presença de um não-
Potorous tridactylus 493
Dendrolagus matschei 493 codificação completosincitina-Opo1envergonhado; +/−, múltiplas
Macropus rufus 493 sequências mistas homólogas; −, nãoAproximadamentesequência
nº 493
MAMÍFEROS

Macropus eugenii*
homóloga identificada, por amplificação por PCR ou pesquisa no
homo sapiens nº banco de dados. A atividade de fusão para cadasincitina-Opo1gene
MAMÍFEROS EUTERIANOS mus musculus nº
canis familiaris nº clonado, conforme determinado pelo ensaio de fusão célula-célula,
bos taurus nº é indicado. nr, não relevante. As setas indicam as respectivas datas
MONOTREMATA
Ornithorhynchus anatinus nº de inserção dos diferentesAproximadamenteGénova.

parasincitina-Opo1,conservação através da evolução dopan-Marsenv2O retrovírus vírus primata (Figo. S6B). Embora apenas uma cópia que codifica
gene entre os marsupiais foi ainda analisado medindo a razão dN/dS entre o Opo-Env3 seja expressa no tecido uterino, sem polimorfismos
todos os pares de espécies. Consequentemente, toda aAproximadamente detectáveis nos transcritos amplificados, esse transcrito placentário,
gene exibiu seleção purificadora muito forte, com razões dN/dS todas <0,2 inesperadamente, não corresponde exatamente a nenhuma das
(Fig. 8vs).Para caracterizar ainda mais a conservação depan-Mars-env2, sequências de codificação genômica presentes no banco de dados
realizamos uma análise refinada das sequências, usando métodos genômico do gambá. A melhor cópia correspondente, localizada em Chr2,
baseados na taxa de não sinônimos vs. substituições dentro do conjunto apresenta apenas 99,6% de identidade com o transcrito placentário. Como
completo de sequências e permitindo que diferenças na pressão de a incompatibilidade entre a transcrição placentária do indivíduo gambá do
seleção entre diferentes domínios das proteínas sejam reveladas (seleção qual o RNA foi extraído e a cópia genômica do banco de dados gambá
específica do local). Tal análise, usando o pacote PAML (23), forneceu pode ser devido a polimorfismos específicos entre nosso animal objeto e
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.

suporte para um modelo (modelo M7) no qual todos os códons estão sob aquele usado como referência para o sequenciamento genômico (como
seleção purificadora (dN/dS < 0,7) (Figo. S5). Não houve suporte uma alternativa para cobertura incompleta do genoma), tentamos
significativo para um modelo de seleção positiva (modelo M8 vs. M7: Chi2 amplificar o correspondenteopo-env3 cópia em Chr2 no DNA genômico
= 2,8×10−4,df =2,P >0,99), sugerindo que nenhum sítio está sob seleção extraído de nosso indivíduo (usando um primer avançado localizado no
positiva. Análises usando o pacote HyPhy (24) com modelos específicos do provírus no 5′fim doAproximadamentegene e um primer reverso
local ligeiramente diferentes [verossimilhança de efeito fixo (FEL) e localizado a jusante do provírus no 3′sequência flanqueadora). No entanto,
probabilidade de efeito aleatório (REL)] levaram a conclusões semelhantes nenhum produto de amplificação pode ser obtido usando esta
(Figo. S5). Esta descoberta sugere fortemente quepan-Mars-env2é um combinação de primers, sugerindo a ausência da sequência proviral nesta
gene celular genuíno muito provavelmente dotado de uma função posição em nosso sujeito individual. Esta ausência foi confirmada pelo uso
fisiológica. Levando em consideração que não pudemos demonstrar – por de outro forward primer localizado no 5′sequência flanqueadora do pró-

MICROBIOLOGIA
qRT-PCR em uma série de tecidos de gambá e ISH em cortes placentários – vírus supostamente inserido. Um ensaio de PCR usando esta combinação
que o gene é expresso em um nível significativo (resultados negativos de primers resultou em um único produto de amplificação com o tamanho
semelhantes foram obtidos com amostras de placenta de tammar esperado para um locus vazio “livre de provírus”, e o sequenciamento
wallaby), permanece difícil para avaliar seu possível papel. Como seu ISD é confirmou a ausência de qualquer sequência proviral neste locus,
altamente conservado na evolução, pode-se supor que esse gene seja demonstrando assim um polimorfismo insercional entre o gambá
expresso nos estágios pré-implantação e esteja envolvido na tolerância individual usado aqui e o animal usado como referência para a sequência
materna durante os estágios iniciais da gravidez, mas essa hipótese ainda genômica. Tal polimorfismo insercional sugere (eu) que algunsopo-env3–
precisa ser demonstrada por meio da - difícil de realizar - recuperação de contendo provírus ainda pode ser replicativo e infeccioso no gambá, e (ii)
embriões nas etapas correspondentes. que o processo de endogeneização pode ser recente. Na verdade, uma
análise qRT-PCR do opo-env3associadomordaçaexpressão gênica exibiu
expressão específica dentro da placenta e tecidos uterinos, como
Opo-env3Faz parte de um ERV recentemente adquirido com evidências de observado paraopo-env3 (Figo. S6), enquanto uma análise RACE-PCR dos
locais polimórficos de inserção no gambá.Opo-env3é pré- transcritos correspondentes revelou a presença de proteína que codifica
ent em um alto número de cópias no genoma do gambá, com >85 cópias, entre gag proeAproximadamentetranscrições (números de acesso do GenBank
as quais 11 cópias possuem ORFs completos. Alguns deles fazem parte de KM235358–59), consistentes com a observação emFigo. S3de partículas
provírus contendo vírus retrovirais ainda identificáveis mordaça, pró, pol,e virais maduras dentro dos tecidos da glândula uterina (embora não
Aproximadamentegenes, juntamente com sequências LTR. Uma sequência de pudéssemos demonstrar formalmente que elas são realmente codificadas
consenso (Figo. S6NO) indica que este ERV (apelidado de Opo-Env3-ERV) tem pelo ERV identificado). Finalmente, consistente com uma endogenização
uma estrutura em mosaico, com um betaretrovírus pólogene, enquanto seu recente, procureopo-env3cópias dentro de espécies marsupiais, usando
Aproximadamentegene é o de um gamaretrovírus, como foi observado de pares
forma semelhante para o macaco Mason-Pfizer infeccioso

Cornelis et ai. PNAS |Publicado online em 20 de janeiro de 2015 | E493

 Gambá Figo. 8.Caracterização do marsupialpan-Mars-env2 gene e de seu
NO(M. domestica) sítio de integração proviral. (NO)Estrutura do gambá (M. domestica),
chr5,-,11250k Demônio da Tasmânia (S. Harrisii),e cangurus (M. eugenii) aprox2
demônio da Tasmânia sequências provirais e sítios de integração. Elementos móveis
(Sarcophilus Harrisii)
repetidos conforme identificados pelo programa da Web
chr6,-,1602k NN
RepeatMasker são posicionados. Digno de nota, os provírus mostram
Wallaby
(Macropus eugenii) NN NN sinais de degeneração, sem LTR identificável e altamente
GL095666,-,71k NN NN NN degeneradosgag polsequências. Iniciadores de PCR usados para
1kb identificar oenv2cópias ortólogas em espécies marsupiais são
LINHA PECADO elemento LTR gag-pol degenerado iniciador de PCR
Aproximadamente

indicadas (meias setas pretas). (B) Demonstração da ortologia de

B FUT10 pan-Mars-env2 PRSS12 env2 (apelidadopan-Marsenv2)nos genomas de espécies marsupiais

Gambá sequenciadas. O locus genômico do gambápan-Mars-env2 (em

vermelho), juntamente com os arredoresFUT10ePRSS12genes, foi
demônio da Tasmânia
recuperado do UCSC Genome Browser (genoma.ucsc.edu/),
Wallaby 5kb juntamente com os loci sintênicos dos genomas do wallaby e do

VS demônio da Tasmânia. O genoma do wallaby está incompletamente

Md Mb M.ad Mt Me Ma M.de Mm Dm Dv Po Mn Cp Hk Mp Im Pg Sc Sh Dg Vu Pp Pt D.ma Mr M.eu
89 Monodelphis domestica* 51 1000,07 0,09 0 0,04 0,07 0,08 0,06 0,04 0,03 0,02 0,08 0,08 0,09 0,04 0,11 0,11 0,16 0,15 0,15 0,15 0,11 0,15 0,14 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13
montado, e oFUT10ePRSS12genes estão localizados em dois
Monodelphis brevicaudata 99,8 100 0,1 0,02 0,06 0,08 0,09 0,07 0,05 0,04 0,03 0,08 0,09 0,09 0,05 0,11 0,12 0,17 0,16 0,16 0,16 0,11 0,15 0,13 0,1 3 0,13
71 Monodelphis adusta 99,4 99,2 100 0,06 0,09 0,12 0,11 0,09 0,07 0,06 0,05 0,1 0,11 0,1 0,07 0,12 0,12 0,17 0,16 0,16 0,15 0,12 0,15 0,14 0,13 0,13 andaimes distintos desmontados, compan-Mars-env2estando
0,01 72 Monodelphis Theresa 100 99,8 99,4 100 0,03 0,05 0,07 0,05 0,04 0,04 0,02 0,06 0,08 0,08 0,04 0,11 0,12 0,17 0,16 0,16 0,14 0,11 0,15
96 Monodelphis emiliae localizado no andaime contendo o PRSS12envergonhado. CháFUT10e
0,14 0,1 3 0,13 99,6 99, 07 0,05 0,04 0,03 0,08 0,09 0,09 0,04 0,11 0,12 0,17 0,16 0,16 0,12 0,15 0,14 0,13 0,13
94 Monodelphis americana 99,4 99,2 98,8 99,4 99 100 0,13 0,09 0,07 0,05 0,04 0,09 0,09 0,12 0,07 0,12 0,12 0,17 0,16 0,16 0,16 0,12 0,16 0,15 0,14 0,14 PRSS12genes não estavam localizados no mesmo cromossomo em
Micoureus demerarae 98,2 98 97,6 98,2 97,8 97,8 100 0,10,10,07 0,05 0,09 0,12 0,13 0,09 0,12 0,13 0,16 0,15 0,15 0,17 0,13 0,16 0,15 0,14 0,14
outras espécies de mamíferos eutérios, impedindo comparações
55 100 marmosa murina 98,8 98,6 98,2 98,8 98,4 98,4 98,6 100 0,06 0,05 0,05 0,06 0,09 0,09 0,07 0,11 0,12 0,16 0,15 0,15 0,15 0,12 0,14 0,13 0. 13 0,12
sintênicas. O mesmo código de cores e símbolos são usados como
55 Didelphis marsupialis 98,8 98,6 98,2 98,8 98,4 98,2 97,8 98,2 100 0,13 0,2 0,08 0,12 0,09 0,08 0,11 0,14 0,17 0,15 0,15 0,16 0,12 0,14 0,13 0,1 3 0,12 99
100 Didelphis virginiana 98,8 98,4 99 98,6 98,4 97,8 98,2 99,4 100 0,13 0,07 0,11 0,08 0,07 0,11 0,14 0,17 0,15 0,15 0,15 0,11 0,13 0,13 0,13 0,12 99,4 99,2 na Fig. 6. (vs)Conservação de sequências e evidências para
AMÉRI- 31 Philander opossum 98,8 99,4 99 98,8 98,4 98,6 99,2 99,4 100 0,08 0,09 0,09 0,07 0,11 0,13 0,17 0,15 0,15 0,15 0,12 0,14 0,13 0,13 0,12
DELPHIA
purificação da seleçãopan-Mars-Env2em marsupiais. (C, Esquerda)
94 Metachirus nudicaudatus 98,2 98 97,6 98,2 97,8 97,6 97,2 98,2 98,4 98,4 98,4 100 0,13 0,1 0,09 0,11 0,12 0,18 0,16 0,15 0,15 0,12 0,15 0,14 0,14 0,13
100 Caluromys philander 98,2 98 97,6 98,2 98 97,8 97 97,6 97,4 97,6 98 96,8 100 0,16 0,12 0,13 0,14 0,2 0,17 0,18 0,18 0,13 0,16 0,16 0,16 0,15 árvore filogenética pan-Mars-Env2 determinada usando o
58 Hyladelphys kalinowskii 97,4 97,2 96,8 97,4 97 96,8 96 97,2 97 97,2 97,2 96,8 96,8 100 0,13 0,11 0,12 0,16 0,14 0,15 0,15 0,12 0,14 0,13 0,13 0,1 3
alinhamento de aminoácidos das proteínas codificadas identificadas
marmosops parvidens 98,8 98,6 98,4 98,8 98,8 98,4 97,4 98 98 98,2 98,2 97,4 97,4 96,6 100 0,13 0,14 0,17 0,16 0,15 0,16 0,13 0,15 0,15 0,15 0 .14

100 Isoodon macrourus 88,5 88,3 88,3 88,5 88,1 88,1 87,3 88,7 88,3 88,5 88,5 87,9 87,1 89,1 88,1 100 0,06 0,08 0,08 0,07 0,08 0,08 0,1 0,09 0,0 9 0,08 na Fig. 7, pelo método da máxima verossimilhança. O comprimento e
Perameles gunnii 90,5 90,3 90,3 90,5 90,1 90,1 89,3 90,5 90,3 90,5 90,5 89,9 89,1 90,5 89,7 97,2 100 0,1 0,09 0,09 0,09 0,08 0,1 0,09 0,09 0,09 a escala do ramo horizontal indicam a porcentagem de substituições
Sminthopsis crassicaudata 88,5 88,3 88,3 88,5 88,1 88,1 87,7 88,9 88,9 88,9 88,9 88,7 87,3 88,7 88,1 93,2 91,7 100 0,1 0,06 0,07 0,07 0,11 0,1 0,09 0,08
100 de aminoácidos. Os valores de bootstrap percentuais obtidos de
100 Sarcophilus Harrisii* 87,7 87,5 87,5 87,7 87,3 87,3 86,9 88,1 88,1 88,1 88,1 87,9 86,9 88,3 87,3 93,2 91,3 98 100 0,15 0,08 0,06 0,08 0,09 0,08 0,07
100 87,9 87,7 87,7 87,9 87,5 87,5 87,1 88,3 88,3 88,3 88,3 88,1 86,7 88,1 87,5 93,4 91,5 98,6 99,4 100 0,07 0,06 0,08 0,08 0. 08 0,07 1.000 réplicas são indicados nos nós. (C, Direita)Tabela de entrada
54 Phascolarctos cinereus 87,5 87,3 87,3 87,5 87,3 87,1 86,3 87,1 87,3 87,5 87,5 86,9 86,1 88,1 87,1 93,2 91,7 93,8 93,4 93,8 100 0,08 0,09 0,08 0. 08 0,08
dupla para a porcentagem emparelhada de identidade de sequência
P. peregrinus 87,1 86,9 86,9 87,1 87,1 86,7 85,9 86,3 86,9 87,1 87,1 86,3 86,7 87,3 86,9 91,1 89,7 92,5 92,7 92,7 92,5 100 0,06 0,07 0. 07 0,06
95 Potorous tridactylus de aminoácidos entre os pan-Mars-env2gene entre as espécies
88,1 87,9 87,9 88,1 87,9 87,7 86,9 87,7 87,9 88,1 88,1 87,5 86,9 88,5 87,5 91,1 89,7 92,7 92,9 93,4 93,4 94 100 0,12 0,08 0,06
94 Dendrolagus matschei 88,5 88,3 88,3 88,5 88,3 88,1 87,3 88,1 88,3 88,5 88,5 87,9 87,3 88,9 87,9 91,9 90,3 93,2 92,9 93,4 94 93,8 98 100 0,1 0. 08 indicadas (triângulo inferior) e a taxa de taxa de mutação não-
AUSTRALI-10094 Macropus rufus 1 00 0,11
100 Macropus eugenii* sinônima de Nei–Gojobori par a par (dN/dS; triângulo superior). Um
DELPHIA 88,3 88,1 88,1 88,3 88,1 87,9 87,1 87,9 88,1 88,3 88,3 87,7 87,1 88,7 87,7 91,5 90,1 93,6 93,4 93,8 94,2 94,2 98,4 99,2 9 9.100
código de cores é fornecido para ambas as séries de valores.
Par a par % de identidade de sequência (em aminoácidos) Nei-Gojobori emparelhado dN/dS
70<%<80 80<%<89 90<%<99 100 0< dN/dS <0,3

de primers de PCR internos ao provírusAproximadamentegene, fora os mamíferos eutérios, para agora incluir os marsupiais, pelo menos
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.

demonstrou a presença deaprox3genes apenas dentro dos dois mais da linhagem americana. Estas espécies divergiram dos mamíferos eutérios
intimamente relacionadosM domesticaeM. brevicaudataespécies (Fig. 7). ∼190 milhões de anos e apresentam um modo de reprodução muito
específico, com apenas uma placenta de vida curta, com o feto sendo
Discussão liberado rapidamente na maioria dos casos em uma bolsa externa, onde
Aqui identificamossincitina-Opo1,cháAproximadamentegene de um se desenvolverá via lactação. Nas espécies aqui analisadas, a implantação
ERV que se integrou ao genoma de um ancestral gambá,∼20 Mya, e dura apenas do dia 12 ao 14, ainda com evidências de formação de sincício
foi mantido como um funcionalAproximadamente gene em um grupo (22), esincitina-Opo1foi precisamente encontrado para ser expresso
definido deMonodelphisespécies. Este gene exibe todas as nesses estágios e no local esperado para um papel na formação do
características canônicas de umsincitinaenvergonhado: (eu)apresenta sincício. Ao todo, os dados atuais - combinados com o fato de quesincitina-
atividade fusogênica, em ensaio de fusão célula-célula ex vivo; (ii) foi Opo1é diferente de todos os previamente identificadossincitinas—indique
submetido à seleção purificadora no curso da evolução, aquilosincitinaa captura tem sido um processo generalizado, que acaba
apresentando baixas taxas de substituições não-sinônimas para ocorrendo em várias linhagens amplamente separadas durante a radiação
iguais e conservação de sua propriedade fusogênica; e dos mamíferos. Pode-se então levantar a hipótese de que a notável
(iii)é expresso especificamente na placenta, conforme determinado variabilidade nas estruturas placentárias observada entre os mamíferos
por análises de RT-PCR e ISH de seções de tecido placentário. pode, em parte, resultar da diversidade dosincitinagenes que foram
experimentos ISH usandosincitina-Opo1sequências como uma sonda estocasticamente capturados no curso da evolução dos mamíferos (5).
mostram claramente que a expressão ocorre no nível da camada
sincicial da interface feto-maternal, consistente com um papel direto No entanto, uma questão importante ainda precisa ser respondida, se
desta fusogênicasincitinagene na formação do sinciciotrofoblasto. levarmos em conta a ocorrência relativamente recente desincitina-Opo1
Claramente,sincitina-Opo1acrescenta aosincitinagenes previamente captura, em comparação com o tempo de emergência de mamíferos
identificados nos mamíferos eutérios. No caso do murino sincitina-A e placentários (incluindo marsupiais) de animais em postura,∼200 milhões
-Bgenes, camundongos knockout demonstraram inequivocamente de anos. Havíamos proposto anteriormente (revisado nas refs. 4 e 5) que
que são absolutamente necessários para a placentação, com essa transição evolutiva foi provavelmente favorecida pela captura
evidência de um defeito na formação do sinciciotrofoblasto, primitiva de um ancestral retroviral “fundador”Aproximadamentegene que
resultando em diminuição da troca feto-materna e sobrevivência permitiu a retenção do embrião em crescimento dentro da mãe, apesar de
embrionária prejudicada (15, 16). Pode-se, portanto, propor que seu sistema imunológico, muito provavelmente graças à atividade
todos ossincitinas,incluindo o recém-descobertosincitina-Opo1, imunossupressora das proteínas retrovirais Env, permitindo o
provavelmente desempenham um papel semelhante na placentação estabelecimento de uma tolerância feto-materna primitiva. Neste cenário,
por estarem envolvidos na formação do sinciciotrofoblasto. foi ainda proposto que osAproximadamentea exaptação do gene pode
Um resultado importante da presente investigação é que a ocorrer naturalmente, porque a captura do ERV é um processo contínuo,
descoberta desincitina-Opo1estende a presença desincitinas resultando em “novos”

E494 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112 Cornelis et ai.


sincitinassendo retido devido a um benefício aumentado para o
hospedeiro em comparação com o primitivo, que seria então
simplesmente substituído e desapareceria. Um resultado interessante
da presente investigação é que este cenário hipotético pode ser
substanciado pela descoberta depan-Mars-env2.De fato, conforme
ilustrado aqui, descobrimos quepan-Mars-env2a captura é anterior à
divergência dos marsupiais americanos e australianos, pois pudemos
demonstrar que esse gene de origem retroviral está presente em
todos os marsupiais em que o procuramos. Além disso, esse gene é
(eu)localizado no mesmo locus ortólogo, (ii)divulga alta conservação
de sequência, e (iii)é submetido à seleção purificadora, com uma taxa
muito baixa de substituições não-sinônimas para sinônimas, como
esperado para um gene genuíno e como observado embora em uma
escala de tempo mais restrita - parasincitina-Opo1. No entanto, isso
AproximadamenteO gene tem uma característica estrutural
incomum, porque tem um códon de parada conservado logo acima
do domínio transmembranar da subunidade TM, resultando assim
em uma proteína não transmembranar solúvel. Embora rara, essa
característica estrutural não é única. Um retroviral primata capturado
ancestralmenteAproximadamente,ou seja, ERV3, tem uma estrutura
intimamente relacionada, sendo truncado de forma semelhante, e
esse truncamento também é “antigo”, porque é encontrado em todos
os primatas na mesma posição (25). Embora este ERV3 Env seja
altamente expresso na placenta (26-28) e tenha demonstrado ser
imunossupressor (12), não é encontrado no gorila (25) e um nocaute
natural do gene (através de um adicional mais códon de parada
prematura) no estado homozigoto foi identificado em 1% da
população humana (29), excluindo assim qualquer papel fundamental
na placentação, pelo menos em humanos. Anteriormente, havíamos
proposto que esse gene era provavelmente um gene “decomposto”
sincitina,agora substituído porsincitina-1e -2em primatas superiores
(30). Nessa linha, pode-se levantar a hipótese de quepan-Mars-env2
em marsupiais desempenha um papel próximo ao desempenhado
por ERV3 em primatas antes de ser funcionalmente substituído por
bona fidesincitinase que ambas as proteínas pan-Mars-Env2 e ERV3
estão - ou estiveram - envolvidas no estabelecimento da tolerância
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
materno-fetal, por meio de sua função imunossupressora comum. Tal
função explicaria a conservação de alta sequência de pan-Mars-Env2 -
incluindo o ISD - juntamente com a forte seleção de purificação acima
mencionada aplicada a ele. O truncamento pan-Mars-Env2 - que de
fato o torna não fusogênico - é consistente com o fato de que a
placenta do wallaby tammar não exibe nenhuma evidência de
formação de sincício (31) e que a ocorrência de um sincício no gambá
está ligada ao mais recente exaptação do fusogênicosincitina-Opo1.
Assim, verifica-se que a diversidade desincitinacapturas é
provavelmente responsável pela diversidade observada ao nível da
estrutura refinada das placentas correspondentes, como já
fortemente sugerido no caso dos mamíferos eutérios (5).
Finalmente, um terceiro resultado interessante da presente investigação é a
descoberta no gambá de partículas virais que são produzidas na placenta e,
mais precisamente, nas glândulas uterinas maternas. A ocorrência de partículas
virais placentárias tem sido descrita há muito tempo em uma série de espécies
de mamíferos, incluindo humanos, camundongos e ruminantes (por exemplo,
refs 32 e 33) - e pode, na verdade, ser minimamente atribuída à presença de um
agente retroviral ativo.mordaçagene, que é suficiente para produzir tais
partículas semelhantes a vírus. Na maioria dos casos, essas partículas são
defeituosas para replicação (sempólogene, não funcionalAproximadamente
gene), mas este provavelmente não é o caso do ERV atualmente identificado. De
fato, a presente pesquisa in silico identificou uma proteína codificadora de
comprimento totalAproximadamenteenvergonhado (aprox3)que parece ter
entrado no genoma do gambá muito recentemente porque só é encontrado no
M domesticaeM. brevicaudataespécies. Além disso, encontramos um
polimorfismo no locus de inserção de uma das cópias provirais, sugerindo que
os ERVs correspondentes são relativamente recentes e ainda podem estar
ativos. Consistentemente, as análises in silico revelamaprox3-cópias ERV
associadas com retroviral completogag-pro-polsequências de codificação, e pelo
menos Gag
Cornelis et ai.
PNAS PLUS
e os transcritos que codificam Pro provaram ser expressos na
placenta. Esses achados podem explicar a presença e a morfologia
das partículas virais - ainda não identificadas de forma inequívoca -
detectadas neste tecido, com evidências de maturação e condensação
do "núcleo", conforme observado classicamente para retrovírus
funcionais. Curiosamente, uma situação semelhante foi descrita em
ovinos para os ERVs endógenos do retrovírus Jaagsiekte (enJSRV), que
também são abundantemente expressos nas glândulas uterinas e no
trato genital e que podem ser transmitidos ao concepto e, portanto,
ainda são elementos retrovirais ativos, com evidências de
polimorfismo em sua posição genômica entre as espécies (33-35). Em
qualquer caso, é provável que a presença de partículas retrovirais na
placenta se deva a ERVs recentemente capturados, que por sua vez
podem fornecer novossincitinaou genes placentários por vir.
Conclusivamente, a presente investigação recapitularia o estilo de
vida completo dos retrovírus capturados, tendo como ponto de
partida o próprio processo de endogenização, resultando em
possivelmente provírus ainda ativos no caso doaprox3-elementos
associados, seguidos porAproximadamenteexaptação de genes no
caso deenv1eenv2, com o primeiro sendo uma boa-fésincitina
responsável pela emergência de uma organização sincicializada da
placenta do gambá e esta última possivelmente envolvida na
emergência da placenta ancestral marsupial >80 milhões de anos.
Métodos
Triagem de banco de dados e análises de sequência.endógeno retroviral
Aproximadamentesequências de genes foram pesquisadas por BLAST no genoma do
gambá (6,8×montagem da cobertura doM domesticagenoma; Ampla myDom5;
Outubro de 2006): Sequências contendo uma ORF >450 aa (do início ao final dos
códons) foram extraídas do banco de dados genômico monDom5 usando o programa
getorf do pacote EMBOSS (emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/getorf.html
) e traduzido em sequências de aminoácidos. Essas sequências foram submetidas a
BLAST contra as sequências de aminoácidos da subunidade TM de 35 glicoproteínas
Env retrovirais (de ERVs representativos - entre os quais sincitinas conhecidas e
retrovírus infecciosos) usando o programa BLASTP do NCBI (www. ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST). As sequências putativas da proteína Env foram então selecionadas com base
na presença de um domínio hidrofóbico (domínio transmembranar) localizado 3′para
um CX altamente conservado5,6,7-C padrão. As coordenadas de sequência de
codificação Env identificadas estão listadas emTabela S1.
O genoma do gambá foi rastreado secundariamente com as sequências de
glicoproteína Env identificadas usando os programas BLAST do NCBI (
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Múltiplos alinhamentos de sequências de aminoácidos
foram realizados usando o programa Seaview sob o protocolo ClustalW. Árvores
filogenéticas de máxima verossimilhança foram construídas com RaxML (Versão 7.3.2;
ref. 36), com porcentagens de bootstrap calculadas após 1.000 réplicas usando o
modelo GAMMA + GTR para o algoritmo de bootstrap rápido. PAML4 (23) foi usado
para executar testes de seleção específicos do local e obter razões dN/dS para todos
sincitina-Opo1sequências. Os modelos PAML analisados não assumiram nenhum
relógio molecular (relógio = 0) e um único dN/dS para todos os ramos da árvore
MICROBIOLOGIA
(modelo = 0), e usamos testes de razão de verossimilhança para comparar a melhoria
na probabilidade de um modelo (M8) permitindo resultados positivos seleção em
comparação com um modelo (M7) (local NS = 7-8) que não. Cada análise foi executada
até a convergência (Small_Diff = 0,5e-6) e o arquivo de controle está disponível
mediante solicitação. HyPhy (24) foi usado no servidor web datamonkey (
www.datamonkey.org) para executar os modelos FEL e REL específicos do local.
O wallaby Tammar (Macropus eugenii;UCSC/Baylor Institute macEug2;
setembro de 2009; 2×cobertura), o diabo da Tasmânia (Sarcophilus harrisii;
UCSC/NCBI; sarHar1; fevereiro de 2011), o humano (Homo sapiens;UCSC
GRCh37/hg19; 2009), o rato (Mus musculus;UCSC GRCM38; 2011), o coelho (
Oryctolagus cuniculus;UCSC/BroadoryCun2.0; 2009; 7.48×cobertura), o cão (
Canis lupus familiaris;UCSC/Broad CanFam3.1; 2011), a vaca (Bos taurus;UCSC/
Baylor bosTau7; 2011), o elefante (Loxodonta africana;UCSC/BroadloxAfr3; 2009;
7×cobertura), o tenrec (Echinops telairi;UCSC/Broad echTel2; 2012) e o tatu (
Dasypus novemcinctus;UCSC/Baylor dasNov3; 2011) também foram rastreados
quanto à presença dossincitina-Opo1–contendo a sequência do provírus, usando
regiões genômicas sintênicas do navegador do genoma da UCSC (
genoma.ucsc.edu/). As análises das sequências sintênicas conservadas em cada
genoma foram realizadas usando a ferramenta de alinhamento MultiPipMaker (
pipmaker.bx.psu.edu) com a sequência do genoma do gambá como referência.
Procurarsincitina-Opo1, pan-Mars-env2,eOpo-env3em Outras Espécies.As PCRs
foram realizadas em 100 ng de DNA genômico, usando Accuprime Taq DNA
PNAS |Publicado online em 20 de janeiro de 2015 | E495
 Polimerase (Invitrogen). Um protocolo de PCR touchdown altamente sensível foi
realizado (tempo de alongamento a 68 °C, com hibridização de 30 s em
temperaturas variando de 60 °C a 50 °C, -1 °C por ciclo por 10 ciclos, seguidos de
40 ciclos a 55 °C vs). Os DNAs genômicos foram amplificados provisoriamente,
conforme indicado emResultadoscom primers externos ao provírus (locus
primers;Tabela S2), perto dos códons de início e fim dosincitinaORF (iniciadores
ORF;Tabela S2), ou interno à ORF e conservado entre todos os genes
sequenciados (primers internos;Tabela S2). Os produtos de PCR foram
sequenciados diretamente sem clonagem para evitar mutações de baixo nível
introduzidas por PCR.
Materiais, RT-PCR em tempo real, hibridização in situ, microscopia eletrônica e
Sincitina-Opo1Vetor de Expressão e Ensaio de Fusão.VerMétodos SI. A
manutenção e experimentos em animais foram realizados sob
1. Meredith RW, e outros. (2011) Impactos da Revolução Cretácea Terrestre e extinção do KPg
na diversificação dos mamíferos.Ciência334(6055):521–524.
2. Luo ZX, Yuan CX, Meng QJ, Ji Q (2011) Um mamífero jurássico eutério e divergência de
marsupiais e placentários.Natureza476(7361):442–445.
3. Freyer C, Zeller U, Renfree MB (2003) A placenta marsupial: uma análise filogenética. J Exp
Zoolog A Comp Exp Biol299(1):59–77.
4. Dupressoir A, Lavialle C, Heidmann T (2012) De retrovírus infecciosos ancestrais a genes
celulares genuínos: Papel das sincitinas capturadas na placentação.Placenta 33(9):663–671.
5. Lavialle C, et al. (2013) Paleovirologia de 'sincitinas', genes retrovirais env extraídos para um
papel na placentação.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci368(1626):20120507.
6. Loiro JL, et al. (2000) Uma glicoproteína de envelope do retrovírus endógeno humano HERV-
W é expressa na placenta humana e funde células que expressam o receptor de retrovírus
de mamífero tipo D.J Virol74(7):3321–3329.
7. MiS, e outros. (2000) A sincitina é uma proteína do envelope retroviral cativa envolvida na
morfogênese da placenta humana.Natureza403(6771):785–789.
8. Mallet F, et al. (2004) O locus retroviral endógeno ERVWE1 é um gene genuíno envolvido na
fisiologia placentária hominóide.Proc Natl Acad Sci EUA101(6):1731–1736.
9. Cáceres M, Thomas JW; Programa de Sequenciamento Comparativo NISC (2006) O gene de
origem retroviral Syncytin 1 é específico para hominóides e é inativo em macacos do Velho
Mundo.J Hered97(2):100–106.
10. Blaise S, de Parseval N, Bénit L, Heidmann T (2003) A triagem genômica para envelopes de
retrovírus endógenos humanos fusogênicos identifica a sincitina 2, um gene conservado
na evolução dos primatas.Proc Natl Acad Sci EUA100(22):13013–13018.
11. Blaise S, Ruggieri A, Dewannieux M, Cosset FL, Heidmann T (2004) Identificação de uma
proteína de envelope da família FRD de retrovírus endógenos humanos (HERV-FRD)
conferindo infecciosidade e conservação funcional entre símios.J Virol78(2): 1050–1054.
Baixado de https://www.pnas.org por 45.179.170.37 em 18 de maio de 2023 do endereço IP 45.179.170.37.
12. Mangeney M, et al. (2007) Sincitinas placentárias: disjunção genética entre a atividade
fusogênica e imunossupressora das proteínas do envelope retroviral.Proc Natl Acad Sci
EUA104(51):20534–20539.
13. Dupressoir A, et al. (2005) Sincitina-A e sincitina-B, dois genes de envelope murino específicos da
placenta fusogênicos de origem retroviral conservados em Muridae.Proc Natl Acad Sci EUA
102(3):725–730.
14. Vernochet C, et al. (2014) Os genes Syncytin-A e Syncytin-B capturados do envelope
retroviral são conservados em Spalacidae juntamente com a placentação hemotricorial.
Biol Reprod,10.1095/biolreprod.114.124818.
15. Dupressoir A, et al. (2009) Camundongos knockout para sincitina-A demonstram o papel crítico na
placentação de um gene de envelope derivado de retrovírus endógeno fusogênico.Proc Natl Acad
Sci EUA106(29):12127–12132.
16. Dupressoir A, et al. (2011) Um par de genes de sincitina do envelope retroviral cooptados é
necessário para a formação do sinciciotrofoblasto placentário murino de duas camadas.
Proc Natl Acad Sci EUA108(46):E1164–E1173.
17. Heidmann O, Vernochet C, Dupressoir A, Heidmann T (2009) Identificação de um gene de
envelope retroviral endógeno com atividade fusogênica e expressão específica da placenta
no coelho: uma nova “sincitina” em uma terceira ordem de mamíferos.Retrovirologia6:107.
18. Cornelis G, et al. (2012) Captura ancestral de sincitina-Car1, um gene de envelope retroviral
endógeno fusogênico envolvido na placentação e conservado em Carnivora.Proc Natl Acad
Sci EUA109(7):E432–E441.
19. Cornelis G, et al. (2013) Capturou o gene sincitina do envelope retroviral associado à
estrutura placentária única de ruminantes superiores.Proc Natl Acad Sci EUA110(9): E828–
E837.
E496 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1417000112
registro do Escritório Estatal responsável de Saúde e Assuntos Sociais de Berlim
(LaGeSo), Alemanha.
AGRADECIMENTOS.Agradecemos a J. Zeller, Humboldt University, pela
assistência técnica; A. Billepp e P. Grimm, Humboldt University, pela assistência
no cuidado e criação deM. domestica;A. Janke, LOEWE Biodiversity and Climate
Research Centre, por fornecer alguns DNAs genômicos marsupiais; C. Conroy,
Museu de Zoologia de Vertebrados, pela doação de váriosMonodelphistecidos;
A. Leskowicz e V. Marquis, UMR5503, pela doação de células OK; Dr. R. Potier,
ZooParc de Beauval, para amostras de sangue; O. Bawa, Institut Gustave
Roussy, pela contribuição nas análises histológicas; e C. Lavialle, Institut Gustave
Roussy, pela discussão e leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi
financiado pelo CNRS e por bolsas da Ligue Nationale Contre Le Cancer (Labeled
Team) (para TH) e Agence Nationale de la Recherche (Retro-Placenta) (para TH).
20. Cornelis G, et al. (2014) Captura de sincitina do envelope retroviral em um clado de
mamíferos ancestralmente divergido para placentação nos tenrecs afrotherianos
primitivos.Proc Natl Acad Sci EUA111(41):E4332–E4341.
21. Dunlap KA, et al. (2006) Os retrovírus endógenos regulam o crescimento e a diferenciação
placentária periimplantação.Proc Natl Acad Sci EUA103(39):14390–14395.
22. Zeller U, Freyer C (2001) Ontogenia precoce e placentação do gambá cinza de cauda curta,
Monodelphis domestica (Didelphidae: Marsupialia): Contribuição para a reconstrução do
morfotipo marsupial.J Zoological Syst Evol Res39(3):137–158.
23. Yang Z (2007) PAML 4: Análise filogenética por máxima verossimilhança.Mol Biol Evol
24(8):1586–1591.
24. Kosakovsky Pond SL, Frost SDW (2005) Não é tão diferente afinal: Uma comparação de
métodos para detectar sítios de aminoácidos sob seleção.Mol Biol Evol22(5): 1208–1222.
25. Hervé CA, Forrest G, Löwer R, Griffiths DJ, Venables PJW (2004) Conservação e perda do
quadro de leitura aberta ERV3 em primatas.Genômica83(5):940–943.
26. Kato N, et al. (1987) Expressão específica de tecido do mRNA do provírus ERV3 humano na
placenta humana: Dois dos três mRNAs do ERV3 contêm sequências celulares humanas.
J Virol61(7):2182–2191.
27. Boyd MT, Bax CM, Bax BE, Bloxam DL, Weiss RA (1993) O retrovírus endógeno humano ERV-3 é
regulado positivamente na diferenciação de células trofoblásticas da placenta.Virologia 196(2):905–
909.
28. Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT (1995) A abundância de uma
proteína de envelope retroviral endógena em trofoblastos placentários sugere uma função
biológica.Virologia211(2):589–592.
29. de Parseval N, Heidmann T (1998) Nocaute fisiológico do gene do envelope do retrovírus
endógeno humano ERV-3 de cópia única em uma fração da população caucasiana.J Virol
72(4):3442–3445.
30. Esnault C, Cornelis G, Heidmann O, Heidmann T (2013) Destino evolutivo diferencial de um
gene de envelope de retrovírus endógeno primata ancestral, a sincitina EnvV, capturada
para uma função na placentação.Gerador PLoS9(3):e1003400.
31. Freyer C, Zeller U, Renfree MB (2002) Ultraestrutura da placenta do tammar wallaby,
Macropus eugenii: comparação com o gambá cinza de cauda curta, Monodelphis
domestica.J Anat201(2):101–119.
32. Harris JR (1998) Retrovírus endógeno placentário (ERV): significado estrutural, funcional e
evolutivo.BioEnsaios20(4):307–316.
33. Black SG, e outros. (2010) Partículas virais de betaretrovírus endógenos são liberadas no útero da
ovelha e infectam o trofectoderma do concepto em um modelo de transferência de embriões
transespécies.J Virol84(18):9078–9085.
34. Chessa B, et al. (2009) Revelando a história da domesticação de ovelhas usando integrações
de retrovírus.Ciência324(5926):532–536.
35. Palmarini M, et al. (2001) Expressão de betaretrovírus endógenos no útero ovino: Efeitos da
idade neonatal, ciclo estral, gravidez e progesterona.J Virol 75(23):11319–11327.
36. Stamatakis A (2006) RAxML-VI-HPC: análises filogenéticas baseadas em probabilidade
máxima com milhares de táxons e modelos mistos.Bioinformática22(21):2688–2690.
37. Bininda-Emonds ORP, et al. (2007) O aumento tardio dos mamíferos atuais.Natureza
446(7135):507–512.
38. Nilsson MA, et al. (2010) Rastreamento da evolução marsupial usando inserções arcaicas de
retroposons genômicos.PLoS Biol8(7):e1000436.
39. por A Carvalho B, et al. (2011) Relações filogenéticas e padrões filogeográficos em
Monodelphis (Didelphimorphia: Didelphidae).J Mamífero92(1):121–133.
40. Solari S (2010) Uma perspectiva molecular sobre a diversificação de gambás de cauda curta.
Mastozoologia Neotropical17(2):317–333.
Cornelis et ai.