1

ANÍBAL GIL LOPES

________________________________________

OBSERVAÇÕES SOBRE O
EFEITO DE DIURÉTICOS NA
REATIVIDADE DO CORPO CAVERNOSO
DE CAMUNDONGOS ESTUDADOS IN VITRO

Monografia apresentada à
Academia de Medicina do Estado do Rio de Janeiro
para admissão como Membro Titular

RIO DE JANEIRO - MAIO DE 2014

 2

FICHA CATALOGRÁFICA

Lopes, Aníbal Gil.

Observações sobre o efeito de diuréticos na reatividade do corpo
cavernoso de camundongos estudados in vitro / Aníbal Gil Lopes. -
2014.
80f. : il.

Monografia (Membro Titular) – Academia de Medicina do

Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2014.
Referências bibliográficas: f. 66-80.

1. Diuréticos. 2. Corpo Cavernoso. 3. Lopes, Aníbal Gil, 4.

Academia de Medicina do Estado do Rio de Janeiro. I. Título.

ÍNDICE

RESUMO.......................................................................................................... 07
..
ABSTRACT...................................................................................................... 08
..
INTRODUÇÃO................................................................................................ 09
..
PLANO DA 10
MONOGRAFIA...........................................................................
CONCEITO DE 10
DIURÉTICO........................................................................

PRIMEIRA PARTE: O TRATAMENTO DO EDEMA E O

DESENVOLVIMENTO DOS DIURÉTICOS AO LONGO DA 12
HISTÓRIA........................................................................................................
.
1) O EDEMA E SEU TRATAMENTO NA ANTIGUIDADE...................... 13
 3

2) DESENVOLVIMENTO MÉDICO NO SÉCULO 15

XVI............................
3) AVANÇOS OBTIDOS NO SÉCULO 17
XVII..............................................
4) AVANÇOS VERIFICADOS NO SÉCULO XIX...................................... 18
5) DESENVOLVIMENTO DOS DIURÉTICOS NO SÉCULO 21
XX.............
a) Diuréticos 21
Mercuriais.............................................................................
b) As sulfanilmidas e os Inibidores da Anidrase 25
Carbônica......................
c) Os 33
tiazídicos...........................................................................................
d) Diuréticos de alça (Furosemida e ácido 38
etacrínico)...............................
e) Diuréticos poupadores de 42
potássio.........................................................

SEGUNDA PARTE: EFEITO DA HIDROCLOROTIAZIDA NA

ATIVIDADE CONTRÁTIL DA MUSCULATURA LISA DO CORPO 47
CAVERNOSO DE
CAMUNDONGO..............................................................
1) Revisão da 48
literatura...................................................................................
2) 51
Objetivos.....................................................................................................
3) Materiais e 52
métodos....................................................................................
a) 52
Animais..................................................................................................
b) Preparação de corpo cavernoso in 52
vitro.................................................
c) As curvas de resposta à 53
concentração....................................................
d) Estimulação de campo 53
elétrico..............................................................
e) Tratamento crônico com 54
hidroclorotiazida............................................
f) Determinação da hidroclorotiazida no plasma por espectrometria de
massa em tandem (LC- 55
MS/MS).................................................................
As amostras de 55
plasma..........................................................................
As amostras 55
padrão...............................................................................
A concentração plasmática de 56
hidroclorazida......................................
g) 57
Materiais................................................................................................
h) Análise 57
 4

estatística...................................................................................
4) 58
Resultados...................................................................................................
a) Efeitos de diuréticos sobre as contrações induzidas por 58
fenilefrina......
b) Participação da NO sintase e ciclooxigenase nas contrações
induzidas por 61
fenilefrina.............................................................................................
c) Respostas das tiras de músculo liso de corpo cavernoso à
estimulação de campo elétrico 62
(EFS).............................................................................
d) Efeitos do tratamento crônico in vivo com a hidroclorotiazida sobre
a contratilidade de tiras de músculo liso do corpo cavernoso de
camundongos............................................................................................ 63
..
e) Concentração plasmática HTZ em tratamento 64
crônico..........................

DISCUSSÃO E 65
CONCLUSÕES......................................................................
AGRADECIMENTOS..................................................................................... 70
.
BIBLIOGRAFIA.............................................................................................. 71
.

FIGURAS E TABELAS

Figura 1 – Reprodução de página iluminada do manuscrito do século VI,

copiado do original do Século I, do De Materia Medica (Περὶ ὕλης ἰατρικῆς,
no original grego) de Pedanius Dioscorides (Codex medicus graecus 1 der
Österreichischen Nationalbibliothek, fol 83 14
recto)..............................................
Figura 2 – Reprodução da página inicial da primeira edição de Syphilis sive
morbus gallicus publicada em Verona em 15
1530..................................................
Figura 3 – Reprodução da primeira página da edição de 1568 da obra
intitulada Philosophiae et Medicinae Utriusque Universae Compendium de
Paracelso, publicada na 16
Basiléia..........................................................................
Figura 4 – Primeira página da obra de William Withering publicada em 17
1785.
Figura 5 – Conjunto de cânulas de Southey dispostas em uma armação de
metal................................................................................................................... 19
.
Figura 6 – Reprodução de fotografia que ilustra o uso de cânulas de 19
Southey..
Figura 7 – Página inicial do segundo volume da Green's Encyclopedia and
Dictionary of Medicine and Surgery, 20
1909.........................................................
 5

Figura 8 – Reprodução do gráfico da diurese diária do paciente descrito por

Alfred 22
Vogl..........................................................................................................
Figura 9 – Observação do efeito de Salyrgan sobre o fluxo o fluxo urinário. 24
Figura 10 - Estruturas químicas de diuréticos 28
sulfonamídicos...........................
Figura 11 – Ilustração dos mecanismos envolvidos na reabsorção de
bicarbonato de sódio no túbulo 32
proximal............................................................
Figura 12 - Diferença na pressão diastólica entre indivíduos com SG e seus
parentes 36
normais..................................................................................................
Figura 13 – Transportadores presentes no ramo ascendente grosso da alça de
Henle.................................................................................................................. 41
..
Figura 14 - Tipos de células responsáveis pelo transporte de NaCl e K+ ao
longo de néfron distal sensível a 45
aldosterona......................................................
Figura 15 - Curvas de resposta à contração por fenilefrina antes ou após pré-
incubação com diuréticos 58
sulfonamídicos...........................................................
Figura 16 - Curvas de resposta à contração por fenilefrina antes ou após pré-
incubação com diuréticos poupadores de potássio............................. 59

Tabela 1 - Potência (pEC50) e a resposta máxima (Emax) obtidas a partir de

curvas de resposta à contração por fenilefrina na ausência e na presença de
diuréticos no músculo liso do corpo cavernoso de 60
camundongo........................
Figura 17 - Curvas de resposta à contração por fenilefrina na ausência ou na
presença de hidroclorotiazida e/ou L-NAME ou hidroclorotiazida e/ou
indometacina...................................................................................................... 61
..
Tabela 2 - Potência (pEC50) e resposta máxima (Emax) obtidas a partir de
curvas de resposta à contração por fenilefrina (10 µM-100 µM) na ausência e
na presença de hidroclorotiazida (100 M), L-NAME e indometacina no
músculo liso do corpo cavernoso de 62
camundongo..............................................
Figura 18 - Respostas contrácteis de tiras de músculo liso do corpo
cavernoso de camundongo à estimulação de campo elétrico (EFS, 1-32 63
Hz)......................
Figura 18 - Curvas de resposta à contração por fenilefrina em diferentes
condições e respostas de relaxamento à estimulação de campo elétrico 64
(EFS)..

RESUMO
 6

Objetivo: Caracterização dos efeitos da hidroclorotiazida e outros diuréticos tiazídicos

na musculatura lisa do corpo cavernoso de camundongo in vitro.

Métodos: Tiras de corpo cavernoso de camundongo foram dissecadas e montadas em

banhos para órgãos e superfundidas com solução de Krebs-Henseleit. Na presença ou

ausência dos diuréticos estudados foram registradas curvas de resposta à estimulação

com fenilefrina (10nM-100M) e à estimulação de campo elétrico (EFS; 1-32 Hz).

Também foram estudadas in vitro tiras de corpo cavernoso de camundongos tratados

cronicamente com hidroclorotiazida ou com hidroclorotiazida junto com amiloride.

Resultados: A adição in vitro de hidroclorotiazida (30 e 100 M), clorotalidona (3 e 10

) e indapamida (1, 3 e 10 M) aumentou as respostas máximas (Emax) a fenilefrina

quando comparadas aos valores controle. O uso de amilorida (100 M), triantereno (100

M) e furosemida (100 M) causou desvios para a direita significativos em curvas de

concentração-resposta à fenilefrina, sem afetar o Emax. A potenciação induzida pela

hidroclorotiazida nas contrações por fenilefrina não foi afetada pela indometacina

(5M), mas não ocorreu nas tiras tratadas com L-NAME (100 M). As respostas

contráteis a EFS também foram potenciadas pela hidroclorotiazida (100 M). Após o

tratamento hidroclorotiazida in vivo (6mg/kg/dia; 4 semanas) foi observado um aumento

significativo no Emax à fenilefrina em tiras de corpo cavernoso. Curiosamente, após

tratamento in vivo com hidroclorotiazida + amiloride (6 mg/kg/dia e 0,6 mg/kg/dia,

respectivamente, por 4 semanas), as respostas contrácteis foram afetadas.

Conclusões: Os diuréticos tiazídicos, em concentrações usadas terapeuticamente,

potenciaram a contração do músculo liso do corpo cavernoso de camundongo. Estes

resultados podem explicar por que diuréticos tais como a hidroclorotiazida são

associadas com a disfunção erétil.

ABSTRACT
 7

Aims: To characterize the effects of hydrochlorothiazide and other diuretics on the

smooth muscle of the mouse corpus cavernosum in vitro.

Methods: Mouse corpus cavernosum strips were dissected and mounted in organ baths

containing Krebs-Henseleit solution. Stimulation-response curves to phenylephrine

(10nM-100 µM), or to electrical field stimulation (EFS; 1-32 Hz) were constructed,

with or without different diuretics. Strips of corpus cavernosum from mice after

chronic hydrochlorothiazide treatment alone or with amiloride in vivo were also studied.

Results: Hydrochlorothiazide (30 and 100 µM), chlorthalidone (3 and 10µM) and

indapamide (1, 3 and 10µM) added in vitro, increased maximal responses (Emax) to

phenylephrine, compared with control values. Amiloride (100µM), triamterene

(100µM) and furosemide (100µM) caused significant rightward shifts in concentration-

response curves to phenylephrine, without affecting the Emax. Hydrochlorothiazide-

induced potentiation of contractions to phenylephrine was unaffected by indomethacin

(5 µM) but did not occur in L-NAME (100 µM) treated strips. Contractile responses to

EFS were also potentiated by hydrochlorothiazide (100 µM). After hydrochlorothiazide

treatment in vivo (6mg/kg/day; 4 weeks), a significant increase in Emax to phenylephrine

in corpus cavernosum strips was observed. Interestingly, after hydrochlorothiazide +

amiloride treatment in vivo (6 mg/kg/day and 0.6 mg/kg/day respectively; 4 weeks) the

contractile responses were unaffected.

Conclusions: Thiazide diuretics, at concentrations achieved therapeutically, potentiated

contraction of smooth muscle from mouse corpus cavernosum. These findings may

explain why diuretics such as hydrochlorothiazide are associated with erectile

dysfunction.
 8

INTRODUÇÃO
 9

PLANO DA MONOGRAFIA

Inicialmente, na primeira parte deste trabalho, será apresentada uma análise

histórica, recriando algumas etapas dos avanços terapêuticos da manipulação da

excreção renal de água e eletrólitos, o que permitirá compreender a própria evolução do

conhecimento nesta área específica.

Na segunda parte serão apresentados dados inéditos referentes a estudos

delineados com a finalidade de explorar os mecanismos envolvidos na disfunção erétil

causada por diuréticos.

CONCEITO DE DIURÉTICO

No sentido amplo, diuréticos são os agentes que atuam no rim promovendo

direta ou indiretamente o aumento do fluxo urinário, incluindo não somente fármacos

que inibem a reabsorção tubular de água e eletrólitos, mas tanto a água, os sais de sódio,

e outras substâncias que podem produzir aumento indireto da diurese pela alteração do

volume ou composição dos fluidos corpóreos. Todavia, é usual entre os fisiologistas,

farmacologistas e clínicos limitar essa definição para as drogas que agem nos rins

causando perda de solutos, especialmente de sais de sódio, com consequente redução do

volume extracelular. As drogas que aumentam a excreção de sódio são usualmente

chamadas de natriuréticvs.

Independentemente da ingestão de água e eletrólitos, os rins ajustam a excreção

de sódio de modo a manter o Volume de fluido extracelular (VEC) de limites estreitos.

Em diferentes condições fisiopatológicas pode ocorrer alteração da do VEC, causando,

por exemplo, edema, como ocorre nas doenças cardíacas congestivas, cirrose hepática,

síndrome nefrótica e insuficiência renal.

 10

Nos últimos vinte anos, avanços no entendimento dos mecanismos moleculares

envolvidos no transporte renal de água e osmólitos permitiu que a ação dos diuréticos

fosse mais bem compreendida.

Não há um único sistema de classificação dos diuréticos. Tais fármacos podem

ser classificados, por exemplo, a partir de suas estruturas químicas, sítio de ação ou

mecanismos moleculares envolvidos.

Os estudos de diferentes doenças genéticas que levam à perda ou ganho de

função de proteínas transportadoras específicas responsáveis pelo transporte de água e

osmólitos ao longo do néfron trouxeram uma contribuição extraordinária para a

compreensão dos mecanismos envolvidos na ação dos diuréticos.

A introdução de diuréticos eficazes, seguros e de baixo custo foi uma das mais

impactantes medidas terapêuticas responsáveis pelo aumento da qualidade de vida e

sobrevida da população mundial.

 11

PRIMEIRA PARTE:
O TRATAMENTO DO EDEMA E
O DESENVOLVIMENTO DOS DIURÉTICOS
AO LONGO DA HISTÓRIA
 12

1) O EDEMA E SEU TRATAMENTO NA ANTIGUIDADE

Desde a antiguidade o edema foi bem descrito por médicos da Suméria, do

Egito, Grécia e Roma (EKNOYAN, 1997).

No Evangelho de Lucas (14:1-6), encontra-se a seguinte narrativa de um dos

milagres de Jesus, a cura de um homem que sofria de hidropisia:

"Aconteceu que, num dia de sábado, Jesus foi comer na casa de um dos chefes

dos fariseus. E eles o observavam. Diante de Jesus, havia um hidrópico. Tomando a

palavra, Jesus falou aos mestres da Lei e aos fariseus:

“A Lei permite curar em dia de sábado, ou não?”

Mas eles ficaram em silêncio. Então Jesus tomou o homem pela mão, curou-o e

despediu-o."

É sabido que os egípcios e outros povos da antiguidade utilizavam fitoterápicos

como diuréticos. Esses conhecimentos foram reunidos no início da era cristã pelo grego

Pendamius Dioscorides, que se tornou médico de Nero, no livro De Materia Medica,

dividido em 5 tomos, que foi utilizado durante 15 séculos pelos gregos, romanos, árabes

e turcos (BHATTARAM et al, 2002; ALVES, 2013). A Figura 1 reproduz uma página de

um manuscrito do Século VI, conservado na Biblioteca de Viena, desse extraordinário

livro.

Desde a antiguidade clássica até a primeira metade do século XX, o tratamento

do edema também envolvia o uso de sangrias, sanguessugas e ventosas.

 13

Figura 1 – Reprodução de página iluminada do manuscrito do século VI, copiado do original do

Século I, do De Materia Medica (Περὶ ὕλης ἰατρικῆς, no original grego) de Pedanius Dioscorides
(Codex medicus graecus 1 der Österreichischen Nationalbibliothek, fol 83 recto).

De acordo com George (2011), o conhecimento sobre as propriedades do

mercúrio tem uma história venerável, sendo que os historiadores têm especulado sobre o

seu uso terapêutico no antigo Egito, China, Índia, Grécia e Roma. Médicos árabes e

persas, no entanto, certamente o utilizaram nos tempos medievais, sendo suas aplicações

mais importantes as relacionadas ao trato urinário: al-Kindi (800-870) relata ter

introduzido compostos mercuriais na uretra de um paciente para o tratamento de

corrimentos. Rhazes (850-923) por outro lado, o administrava como um agente anti-

inflamatório tanto por via oral como em ambos os ouvidos. Ele também o utilizou

experimentalmente em macacos. Avicena (980-1037) o aplicou em lesões da pele

(GOLDWATER, 1972). Alguns médicos daquele tempo tinham preocupações sobre sua

segurança. Avicena, em particular, acreditava que alguns de seus compostos eram muito

venenosos. Seu uso terapêutico, todavia, se desenvolveu durante o Renascimento,

principalmente através de aplicação tópica para tratar infecções. Paracelsus (1493-

1541), que exerceu influência considerável sobre prática terapêutica, elogiou tanto seu
 14

uso tópico como por via oral. A administração parenteral foi introduzida mais tarde,

inicialmente sob a forma de injeções subcutâneas, em 1826.

2) DESENVOLVIMENTO MÉDICO NO SÉCULO XVI

A introdução da sífilis na Europa durante o século 16, por muitos atribuída ao

retorno dos marinheiros das expedições de Cristóvão Colombo ao Caribe, gerou uma

demanda por tratamentos eficazes dessa doença, o que deu novo uso aos mercuriais.

Pomadas à base de mercúrio ganharam popularidade após Giralomo Fracastoro as ter

elogiado em seu poema Syphilis sive morbus gallicus (Sífilis ou a Doença Francesa)

(FRACASTORO, 1530). O nome da sífilis deriva de Syphilis, pastor protagonista desse

poema. Nessa obra é sugerido que mercúrio e guáiaco serviriam para a cura da doença.

Desde então os mercuriais foram amplamente utilizados e se constituíram no principal

tratamento das doenças venéreas e outras enfermidades infecciosas até o inicio do uso

da penicilina, em 1941. A Figura 2 apresenta a primeira página da primeira edição dessa

obra.

Figura 2 – Reprodução da página inicial da primeira edição de Syphilis sive morbus gallicus
publicada em Verona em 1530.
 15

Paracelso, como ficou conhecido Theophrastus Bombastus von Phillippus

Aureolus Hohenheim (1493 e 1541), foi extraordinário alquimista, médico e botânico

que contribuiu marcadamente para o surgimento de uma nova medicina no período

renascentista. Foi ele quem introduziu no ocidente o uso do cloreto de mercúrio (HgCl,

calomelano) para o tratamento da sífilis, que foi utilizado até o século XX para alivio

dessa terrível doença. Paracelso também introduziu o cloreto de mercúrio para o

tratamento da hidropsia, o que já era conhecido na antiguidade egípcia devido às suas

propriedades diuréticas. Na Figura 3 é reproduzida a primeira página de sua importante

obra intitulada Philosophiae et Medicinae Utriusque Universae Compendium, publicada

na Basiléia em 1568.

Figura 3 – Reprodução da primeira página da edição de 1568 da obra intitulada Philosophiae et

Medicinae Utriusque Universae Compendium de Paracelso, publicada na Basiléia.

O uso dos sais de mercúrio como diuréticos foram um grande avanço em relação

ao que era utilizado desde a época da Roma antiga para o tratamento do edema. Mesmo

tendo sido usado ao longo dos séculos, o mercúrio inorgânico era mal tolerado e havia

controvérsia quanto à sua efetividade (VEJUX-TYRODE; NELSON, 1903).

 16

3) AVANÇOS OBTIDOS NO SÉCULO XVII

Um avanço médico importante ocorrido no final do Século XVIII foi a

verificação realizada por William Withering (1741-1799) de que extrato de folhas da

dedaleira (Digitalis purpurea) era eficiente para o tratamento da insuficiência cardíaca.

WITHERING (1785) observou que uma de suas pacientes com insuficiência

cardíaca apresentou grande melhora dos sintomas com o uso de um extrato de plantas

conhecido em sua cidade como remédio para o alivio de situações semelhantes. A partir

dessa observação, estudou sistematicamente o extrato utilizado e descobriu que a

substância ativa responsável, que passou a ser chamada de digitalina, se encontrava nas

folhas da dedaleira (Digitalis purpurea). Em 1785 publicou um trabalho intitulado An

account of the foxglove and Some of its Medical Uses, que contém informações sobre as

provas clínicas e notas sobre a toxicidade da digitalis, cuja página inicial está

reproduzida na Figura 4. O texto completo da edição original da obra pode ser

encontrado em http://www.gutenberg.org/files/24886/24886-h/24886-h.htm).

Figura 4 – Primeira página da obra de William Withering publicada em 1785.

 17

4) AVANÇOS VERIFICADOS NO SÉCULO XIX

No final do século XIX os médicos estavam aptos a ser bastante práticos nos

esforços para ajudar seus pacientes, que muitas vezes eram amigos e vizinhos. Isso

frequentemente envolvia desenvolver por conta própria algum dispositivo ou

procedimento terapêutico. Esse tempo foi marcado pelo grande desenvolvimento e

construção de aparelhos mecânicos, razão pela qual havia um grande número de

fabricantes de instrumentos para uso médico nas grandes cidades, como Londres.

Normalmente, o médico experimentava uma ideia usando equipamento caseiro e,

eventualmente, contratava um dos fabricantes de instrumentos para fazer um ou dois

protótipos bem acabados. Se o instrumento em questão se mostrasse eficiente ou se o

seu desenvolvedor fosse prestigiado, as cópias poderiam ser adquiridas através do

fabricante. Dentro desta perspectiva histórica é que foram desenvolvidas as cânulas de

Southey para o tratamento do edema e que se tornaram de uso comum por algumas

décadas.

Reginald S. Southey, médico inglês que viveu de 1835 até 1899, era filho de um

médico e sobrinho do famoso poeta Robert Southey. Como membro da equipe do

London’s Hospital for Diseases of the Chest, seu interesse clínico estava voltado para as

doenças renais e estava familiarizado com o sofrimento e os problemas causados por

anasarca. É provável que o edema grave dos membros inferiores de um paciente tenha

sido a motivação para buscar uma solução prática, que se traduziu na inserção de uma

cânula rígida por via subcutânea para permitir que o líquido intersticial pudesse escorrer

através de um tubo de borracha em uma bacia ao lado da cama do paciente.

Aperfeiçoamentos posteriores levaram à introdução de múltiplos orifícios ao longo da

cânula para facilitar a drenagem do fluido intersticial, tornando-a mais eficiente para o

alívio dos sintomas do edema. A Figura 5 reproduz as imagens da cânula de Southey. Na

 18

figura 6 é mostrada uma fotografia onde cânulas de Southey estão sendo utilizadas. Por

não corrigir a causa do edema, este voltava a ser formado e a ser drenado. Mesmo

assim, esse tratamento aliviava o sofrimento do paciente.

Figura 5 – Conjunto de cânulas de Southey dispostas em uma armação de metal. A pega é de

marfim, com um parafuso de ajuste para o comprimento da agulha. Equipamento fabricado pela
Medical Supply Association (cerca de 1880). Imagem obtida do The Museum of Historical Medical
Artifacts (www.mohma.org).

Figura 6 – Reprodução de fotografia que ilustra o uso de cânulas de Southey.

Entre 1906 e 1911 Ballantyne editou a Green's Encyclopedia and Dictionary of

Medicine and Surgery, publicada em onze volumes por William Green & Sons, que
 19

constitui hoje uma das janelas mais úteis para o entendimento da prática médica entre o

final da era vitoriana e a I Grande Guerra (Ballantyne, J.W. (Ed.) Green's Encyclopedia

and Dictionary of Medicine and Surgery. William Green & Sons, Edinburgh & London,

1906-1911). A figura 7 reproduz a folha inicial do volume II dessa obra.

Figura 7 – Página inicial do segundo volume da Green's Encyclopedia and Dictionary of Medicine
and Surgery, 1909.

Essa obra, além da descrição das cânulas de Southey, dá informações sobre suas

aplicações terapêuticas. O texto é bastante significativo ao apresentar seu uso na

paracentese:

“A paracentese pode ser realizada por um processo rápido – o uso de uma

cânula (cânula de Southey) – quando é desejável promover a fuga muito gradual do

fluido. Este processo tem as vantagens da simplicidade, é menos terrível para o

paciente, e a tendência para a síncope é reduzida. A cânula de Southey consiste de uma

cânula muito fina com cerca de dois centímetros de comprimento, perfurada

lateralmente por pequenas aberturas, e finalizada por uma pequena proteção através

da qual é unida a uma extremidade de um tubo de borracha, sendo que a outra

 20

extremidade se estende para a bacia receptora colocada sob o leito do paciente. Toda a

operação deve ser realizada com rigorosas precauções assépticas. Após a retirada da

agulha (trocater) de seu interior, a cânula é fixada em posição por cintas e pode ser

mantida por 12-24 horas. O uso de um curativo abdominal é útil tanto para fixar a

cânula como para evitar fuga de fluidos. Após a retirada da cânula deve ser aplicado

um curativo de colódio. De modo geral, as cânulas de Southey são claramente

preferíveis ao aspirador para os casos de ascite.".

Este procedimento permitia o escoamento de grandes quantidades de fluido, em

alguns casos até seis litros em 24 horas ou quinze litros em 3 a 4 dias.

5) DESENVOLVIMENTO DOS DIURÉTICOS NO SÉCULO XX

a) Diuréticos Mercuriais

Só algumas décadas depois do invento da cânula de Southey que seu uso foi

sendo paulatinamente abandonado diante de observações irretorquíveis de que os

compostos mercuriais apresentavam efeito diurético eficaz.

Paracelso sugeriu que os sais de mercúrio também apresentavam ação diurética,

o que levou ao seu uso no tratamento de doenças do trato urinário e edema. Vários

autores do século XIX, entre os quais John Blackall, observaram os sais de mercúrio

agiam, pelo menos em certas circunstâncias, como um diurético (BLACKALL, 1813;

GEORGE, 2011).

Um grande avanço no uso dos mercuriais como diurético ocorreu em 1918,

quando Alfred Vogl, um jovem americano estudante de medicina na Clínica

Wenckebach em Viena, por acaso descobriu que merbaphen (Novasurol), um agente

mercurial orgânico (sal duplo de oximercuriclorfeniloxiacetato de sódio e ácido

 21

dietilbarbitúrico), então recentemente desenvolvido pela empresa farmacêutica Bayer

para o tratamento da sífilis, aumentava drasticamente a produção de urina.

O fato se deu da seguinte maneira: o Professor Paul Saxl (1880-1932) lhe pediu

para prescrever esse medicamento para uma jovem que sofria de sífilis congênita, mas

por um erro de Vogl na prescrição, ocorreu um grande atraso no fornecimento da

medicação, o que irritou profundamente seu professor. Um médico da reserva do

Exército Austríaco, ao visitar a Clínica, teve pena da situação do jovem estudante e lhe

forneceu algumas ampolas de Novosurol para uso intramuscular. Vogl, ao analisar as

anotações dos dados de diurese feitas pela enfermeira, observou que a paciente

apresentava grande diurese após cada injeção. Vogl mostrou tais resultados ao Professor

Saxl e então mais dois pacientes com edema advindo de insuficiência cardíaca, um dos

quais sem qualquer evidência de sífilis, receberam a mesma terapia. Tendo confirmado

os dados iniciais, publicaram os resultados, o que levou à ampla adoção do Novosurol

como diurético. Ao narrar sua descoberta, Vogl (1950) deu crédito à enfermeira que

meticulosamente registrou através de um gráfico a diurese diária do paciente,

apresentado na Figura 8.

Figura 8 – Reprodução do gráfico da diurese diária da paciente descrita por Alfred Vogl.
 22

Esse surpreendente achado levou à analise da urina, tendo sido verificado que a

diurese era acompanhada por um aumento da excreção de sódio. Após a publicação de

suas observações em 1920, os diuréticos mercuriais tornaram-se amplamente utilizados

no tratamento da insuficiência cardíaca, cirrose hepática, e síndrome nefrótica

(MARVIN, 1926; SPRAGUE; GRAYBIEL, 1931).

Os diuréticos mercuriais são compostos derivados do mercuripropanol, entre

eles o meraluride, mercurofilina, mersalil, meretoxilina, mercumatilina, mercaptomerina

e clormerodrina. A via mais eficaz para a administração desses diuréticos é a parenteral.

A taxa de filtração glomerular destes compostos é muito baixa, pois se ligam fortemente

às proteínas plasmáticas, sendo a secreção tubular sua principal via de excreção.

Quando administrado por via oral, sua ação se inicia entre 1 e 2 horas depois de

ingerido, atingindo o pico de ação dentro de 6 a 7 horas.

Merbaphen, o mercurial orgânico usado por Vogl, por ser tóxico e de aplicação

dolorosa foi logo substituído por salyrgan e, posteriormente, por outros agentes que

eram mais potentes e mais bem tolerados (SPRAGUE; GRAYBIEL, 1931). No entanto,

os novos mercuriais só podiam ser administrados por via parenteral e apresentavam

efeitos adversos graves, incluindo estomatite, colite, proteinúria e a hematúria, e a sua

eficácia era reduzida por alcalose metabólica (VOGL, 1955).

Posteriormente, vários outros mercuriais orgânicos foram utilizados para uso

intravenoso, intramuscular, subcutâneo, via oral e intraperitoneal. Entre estes estava o

mersalil (Salyrgan), que por apresentar efeitos adversos menos intensos foi muito

utilizado antes do advento dos novos diuréticos, ou seja, até a década de 1960. Seu

efeito foi descrito por Agnew (1928), sendo que na Figura 9 é reproduzido um dos

gráficos apresentados em seu trabalho.

 23

Figura 9 – Observação do efeito de Salyrgan sobre o fluxo urinário. Retirado de Agnew, G.H.
Salyrgan as a diuretic. Can. Med. Assoc. J.; 18: 45–48, 1928.

O debate inicial sobre os mecanismos de ação diurética dos mercuriais girou em

torno de se dar através de um possível efeito sistêmico ou pela ação direta sobre os rins.

Foi somente em 1932 que Edward Bartram, de Boston, demonstrou que seu efeito se

dava diretamente nos rins através da injeção da droga na artéria renal (BARTRAM,

1932). No mesmo número do Journal of Clinical Investigation foram publicados dois

trabalhos de Schmitz, um dos quais tinha como escopo esclarecer o mecanismo de ação

dos mercuriais (SCHMITZ, 1932).

Schmitz, utilizando metodologia científica clara e objetiva, mostrou que salyrgan

eleva o fluxo urinário e diminui a reabsorção tubular do sódio filtrado sem alterar o

ritmo de filtração glomerular, medido através do uso de creatinina. Comparando com

euphylin, uma xantina, grupo de fármacos que também foram populares no tratamento

do edema, observou aumento do fluxo urinário acompanhado de aumento do ritmo de

filtração glomerular.

O mecanismo de ação dos diuréticos mercuriais, todavia, só foi esclarecido

depois da descoberta de que as aquaporinas são inibidas por HgCl2 (NIEMIETZ;

 24

TYERMAN, 2002), o que justifica sua grande eficiência na eliminação de água, já que

fica bloqueada a reabsorção de água necessária para a concentração urinária.

Após o aparecimento de novos fármacos menos tóxicos, esta classe de diuréticos

deixou de ser utilizada na clínica pelos seus graves efeitos adversos, tais como o

desenvolvimento de alcalose metabólica hipoclorêmica, arritmias cardíacas,

insuficiência renal aguda, reações de hipersensibilidade, febre, náuseas e vômitos.

b) As sulfanilmidas e os Inibidores da Anidrase Carbônica

A sulfanilamida foi sintetizada pela primeira vez por Gelmo em 1908, mas sua

ação antibacteriana só foi descoberta em 1935. Posteriormente, foi detectada sua ação

diurética.

Gerhard Domagk (1895-1964) era estudante de medicina em Kiel quando em

1914 se iniciou a Primeira Guerra Mundial e alistou-se no exército Alemão. Lutou na

primeira Batalha de Ypres e depois foi transferido para o front oriental, onde foi ferido

na perna. Ao recuperar-se, retornou como médico assistente nos hospitais localizados

nos campos de batalha e viu como os soldados feridos contraiam facilmente infecções

bacterianas. Depois disso, jurou que faria tudo que podia para curar essas infecções.

Depois da Guerra, Domagk voltou para Kiel e se formou em 1921. Ele se tornou

professor universitário e depois passou a dirigir um laboratório especializado em

patologia experimental na I.G. Farbenindustrie, em Elberfeld, Alemanha. Ele pesquisava

moléculas ativas contra infecções por estreptococos utilizando corantes azoicos como

agentes quimioterápicos. Sua equipe testou centenas de substâncias e, depois de 5 anos

de trabalho, no final do ano de 1932, descobriu que o agente KL730, posteriormente

conhecido como Prontosil, combatia as infecções por estreptococos em ratos de

laboratório (in vivo), mesmo em doses bem baixas, porém, não funcionava in vitro.
 25

Os testes em humanos com infecção por estreptococos – para a qual não havia

nenhum outro tratamento - foram bem sucedidos, e a droga foi patenteada no final de

1934 e começou a ser utilizada. O primeiro artigo publicado por Domagk sobre o

Prontosil foi publicado em Fevereiro de 1935.

Em dezembro de 1935, Hildegarde Domagk, filha de seis anos de Gerhard

Domagk, sofreu um acidente em casa que resultou em uma infecção por estreptococo. A

infecção se espalhou por seu braço e os médicos diziam que ela teria que amputá-lo.

Gerhard Domagk tratou sua filha com o Prontosil e a infecção foi vencida. Um dos fatos

que tornou o Prontosil muito famoso foi a cura de Franklin Roosevelt Jr., filho do

Presidente dos EUA.

Em novembro de 1935, a equipe de Daniel Bovet, do Instituto Pasteur em Paris,

descobriu que a sulfanilamida (4-aminobenzenosulfonamida) era ativa tanto in vitro

quanto in vivo. Enzimas intestinais no corpo humano convertiam o Prontosil em

sulfanilamida, que era a molécula ativa. Isso explicava o porquê do Prontosil não ser

ativo in vitro. A sulfanilamida havia sido sintetizada pela primeira vez em 1908 por Paul

Gelmo e patenteada em 1909. Quando a equipe de Bovet fez a descoberta, sua patente já

tinha expirado. Por suas contribuições, Bovet recebeu o premio Nobel de Fisiologia e

Medicina em 1957.

A sulfanilamida foi um grande sucesso, porém, sua história foi manchada em

1937 por um cientista americano que criou o "elixir de sulfanilamida". Ele dissolveu a

sulfanilamida em dietilenoglicol e adicionou um corante e fragrância de framboesa.

Esse "elixir" foi comercializado para tratamento de infecções da garganta. Não foi feito

nenhum teste animal nem foi verificado na literatura se estavam usando alguma

substância tóxica. Como resultado, 107 pessoas, a maioria crianças, morreram depois de

utilizar o "elixir". Anos mais tarde, Frances Oldham Kelsey descobriu que a substância
 26

responsável pelas mortes não era a sulfanilamida, mas o solvente dietilenoglicol. As

manifestações populares resultaram, em 1938, na aprovação da Lei Federal de

Alimentos, Medicamentos e Cosméticos dos Estados Unidos (The United States Federal

Food, Drug, and Cosmetic Act), que estabeleceu as normas regulatórias que regem a

introdução de novas drogas no mercado. Antes, um fabricante não precisava provar que

seu produto era seguro, mas após o Ato, o Food and Drug Administration (FDA) passou

a revisar os resultados dos testes com o poder de exigir testes extras, além de impedir a

comercialização do produto.

O mecanismo de ação antibacteriana da sulfanilamida só foi descoberto em 1940

por Donald Woodsm. Este cientista verificou que a estrutura química da sulfanilamida

era muito semelhante à do ácido para-aminobenzóico (PABA) e com ele competia pela

enzima dihidropteroato sintetase, inibindo assim a produção do ácido dihidrofólico.

Este é fundamental na produção de outras moléculas, inclusive as bases purínicas, razão

pela qual impede a síntese do DNA bacteriano. Por inibir a multiplicação e crescimento

das bactérias, o sistema imune consegue combater eficazmente a infecção.

Entre os efeitos colaterais da sulfanilamida, foi descoberta sua ação diurética, o

que o levou a ser utilizado para tratar o edema (SCHWARTZ, 1949).

Três grupos de drogas derivadas da sulfonamida apresentam ação diurética: os

inibidores da anidrase carbônica (entre os quais a sulfanilamida e a acetazolamida), os

tiazídicos (como a clorotiazida e a clortalidona), e a furosemida. Cada um desses

grupos, todavia, apresentam maior especificidade para transportadores iônicos

diferentes. Na Figura 10 são mostradas as estruturas químicas de vários desses

diuréticos para evidenciar as analogias existentes entre eles.

 27

Sulfanilamida Acetazolamida Clorotiazida Furosemida

Figura 10 - Estruturas químicas de diuréticos sulfonamídicos.

Dentro da história do desenvolvimento de novos fármacos, se destacam os

estudos de Southworth (1937) e Strauss e Southworth (1938) mostrando que a

sulfonilamida produzia acidose metabólica associada com a produção de urina alcalina e

aumento da excreção urinária de bicarbonato. Posteriormente, Mann e Kielin (1940)

demonstraram que essa droga e outras sulfonamidas inibiam a anidrase carbônica e

Davenport e Wilhelmi (1941) verificaram que essa enzima se encontrava em altas

concentrações no tecido renal.

Revendo a sequência dos fatos, deve ser lembrado que em 1940, na

Universidade de Cambridge, Thaddeus Mann e David Keilin (MANN; KIELIN, 1940)

estudaram a razão pela qual as sulfonamidas causavam queda da pCO2 sanguínea, tendo

verificado que sua causa era a inibição da anidrase carbônica. Na mesma época Horace

Davenport determinou a presença de anidrase carbônica no tecido renal, o que levou

Rudolf Höber a correlacionar o aumento da excreção de sódio urinário em pacientes

utilizando sulfanilamida com a inibição da reabsorção tubular de bicarbonato. Diante

dessa hipótese, Davenport procurou um inibidor mais potente da anidrase carbônica, o

que foi conseguido por Roblin e Clapp (1950), da Lederle Division da American

Cyanamid Company, que sintetizaram várias moléculas semelhantes, uma das quais foi

o tiophen-2-sulfonamida, que se mostrou 40 vezes mais potente que a sulfonamida.

 28

Posteriormente, sintetizou a acetazolamida (Diamox), 330 vezes mais potente e com

baixa toxicidade (ROBLIN; CLAPP, 1950).

Diferentes formas da anidrase carbônica são expressas em eritrócitos, rins,

intestino, corpo ciliar, plexo coroide e células gliais.

A anidrase carbônica (AC), enzima que contém zinco na sua estrutura química,

catalisa a hidratação reversível do dióxido de carbono. Há três famílias evolutivamente

independentes de AC, designadas alfa, beta e gama. Todas as ACs conhecidas do reino

animal são do tipo alfa. Sete isoenzimas, denominadas AC I – VII, são encontradas nos

mamíferos e apresentam diferentes distribuições nos tecidos e espaço intracelular.

O íon zinco situa-se numa cavidade em forma de cone, coordenado aos três

resíduos histidil e uma molécula de solvente. Os inibidores se ligam ao centro metálico

através de uma ligação de hidrogênio dos resíduos Glu-106 e Thr-199. O mecanismo

catalítico de CA II foi estudado detalhadamente. Ele envolve um ataque à OH- ligada ao

zinco sobre uma molécula de CO2 fracamente ligada a uma região hidrofóbica. O íon

bicarbonato coordenado ao zinco é deslocado do íon metálico por H2O. O passo

limitante de velocidade é a transferência intramolecular de prótons da molécula de zinco

ligada a água para a His-64, que serve como um transporte de prótons entre o centro

metálico e as moléculas de tampão no meio de reação (LINDSKOG, 1997; SUPURAN,

2007).

A administração de seus inibidores inicialmente causa uma diurese alcalina com

aumento da excreção dos íons Na, K, HCO3 e PO4, enquanto que as excreções de acidez

titulável e do íon NH4 caem drasticamente. Em tratamentos prolongados não se observa

hipocalemia devido à redistribuição dos íons H e K entre os compartimentos intra e

extracelulares.
 29

Ainda que seu sítio de ação principal se localize nas porções iniciais do túbulo

proximal, região onde ocorre intensa reabsorção de água e sal, seu efeito é modesto

tendo em vista várias causas. Entre elas, as mais importantes são: 1) a inibição do

transporte de bicarbonato não impede a reabsorção de sódio por outros mecanismos; 2)

o remanescente do bicarbonato de sódio não reabsorvido no túbulo proximal,

dependendo das condições do equilíbrio acidobásico e hidrossalino, poderá ser

reabsorvido em porções posteriores do néfron, minimizando, portanto seu efeito inicial.

Ainda que o efeito diurético do Diamox seja modesto, esse fármaco se mostrou

de grande utilidade médica para o tratamento do glaucoma, tendo em vista que a

formação do humor aquoso depende de transporte de bicarbonato de sódio.

Como sua ação sobre a excreção de água e eletrólitos é modesta, atualmente tais

diuréticos são unicamente utilizados para o tratamento do glaucoma, como será

explicado mais adiante.

Os mecanismos de ação da acetazolamida têm sido objeto de contínuos estudos,

tendo sido descobertos outros sítios sobre os quais atua.

Ao lado da acetazolamida ter sido amplamente utilizada como um inibidor

seletivo da anidrase carbônica, muitos estudos foram realizados sobre suas propriedades

sobre a vasculatura, particularmente na circulação do cérebro (KRASNEY et al, 1973;

FUJII et al, 1990) e da retina (RASSAM et al, 1993; JOSEFSSONA et al, 2004).

É sabido que a acetazolamida exerce um efeito vasodilatador direto em artérias

de resistência isoladas de cobaia. Este efeito está associado com uma mudança no pH

celular do músculo liso e subsequente abertura de canais de potássio ativados por cálcio

(canais KCa), o que foi evidenciado pelo fato da vasodilatação induzida pela

acetazolamida ser inibida por caribdotoxina, um bloqueador altamente seletivo deste

canal (PICKKERS et al, 1999). Abertura dos canais de potássio vasculares hiperpolariza
 30

a membrana celular, conduzindo ao fechamento de canais de cálcio dependentes de

voltagem. A redução do influxo de cálcio e consequente diminuição nos seus níveis

citoplasmáticos levam ao relaxamento vascular (PICKKERS et al, 1995).

Nos últimos anos tem havido um crescente interesse no papel de canais de

potássio no sistema cardiovascular (BRAYDEN; NELSON, 1992). O canal KCa está

presente no músculo liso vascular humano e sua importância fisiológica na regulação do

tônus arterial sendo que o tonus miogênico (NELSON; QUAYLE, 1995) e a

vasodilatação mediada por fluxo (COOKE et al, 1991) são regulados por o canal KCa em

muitos tecidos.

A ação dos inibidores da anidrase carbônica, enzima presente tanto na borda em

escova (AC IV) como no interir das células do túbulo proximal (AC II), se dá através do

bloqueio de sua ação na desidratação catalítica do ácido carbônico luminal e da hidratação

intracelular do CO2, o que leva à menor formação do íon H no interior celular, necessário

para a reabsorção do íon sódio através do cotransportador Na/H presente na membrana

luminal. Esse mecanismo desempenha papel fundamental na secreção de ácido no túbulo

proximal e recuperação do tampão bicarbonato, desempenhando papel crucial no equilíbrio

acidobásico. A figura 11, retirada de WAGNER et al, 2004, ilustra os mecanismos

envolvidos na reabsorção indireta do íon bicarbonato, responsável por parcela da reabsorção

do íon sódio nesse segmento do néfron.

Com a inibição das AC (tanto a II como a IV), presentes quer nas células do túbulo

proximal como nas células intercalares do tipo alfa do ducto coletor, haverá menor

formação dos íons H e HCO3 no interior celular, já que essas enzimas aceleram em

cerca de 400 vezes a velocidade da reação de hidratação do CO2. Como consequência,

haverá uma menor secreção de H+, seja através no permutador Na+/H+, seja através das

ATPases transportadoras de próton, levando, portanto, a uma perda da capacidade de

 31

acidificação urinária. No túbulo proximal, a menor formação intracelular de HCO3- leva

a uma redução do transporte desse íon através do cotransportador de HCO3/Na (NBC1)

presente na membrana basolateral e, assim, uma redução de sua reabsorção. Nas células

intercalares do tipo alfa, por outro lado, a menor formação intracelular do íon HCO3

leva a uma redução da atividade do permutador AE1, responsável por mediar a troca do

íon Cl pelo íon HCO3, reduzindo, assim, a reabsorção desse íon. Devido à redução da

atividade da H+/K+-ATPAse decorrente da menor oferta do íon H, também haverá uma

redução da reabsorção do íon K, diminuindo também sua transferência para o meio

interno através do cotransportador K+/Cl- (CKC4) presente na membrana basolateral,

levando, em última análise à hipocalemia.

Figura 11 – Ilustração dos mecanismos envolvidos na reabsorção de bicarbonato de sódio no túbulo

proximal. CA II e CA IV representam as anidrases carbônicas do tipo II e IV, respectivamente
(retirada de WAGNER et al, 2004).

c) Os tiazídicos

Ao longo das pesquisas visando ao desenvolvimento de drogas inibidoras da

anidrase carbônica, a clorotiazida foi sintetizada em 1957 (NOVELLO; SPRAGUE,

1957) e logo em seguida suas ações fisiológicas foram descritas (BEYER, 1958).

Os diuréticos tiazídicos foram desenvolvidos durante a década de 1950, quando os

químicos e fisiologistas na Merck Sharpe e Dohme testaram derivados de inibidores da

anidrase carbônica à base de sulfonamidas com o objetivo de descobrir drogas que

 32

aumentassem a excreção de sódio de cloreto em vez de bicarbonato de sódio. Esses

diuréticos rapidamente se tornaram populares, pois foram os primeiros agentes ativos com

efeitos benéficos comprovados para reduzir a pressão arterial em pacientes com hipertensão

arterial (HOLLANDER et al, 1958). Ainda hoje os tiazídicos constituem a primeira linha

farmacológica para o tratamento de hipertensão arterial (CHOBANIAN et al, 2003; V

Diretrizes Brasileiras de Hipertensão da Sociedade Brasileira de Hipertensão, 2006).

Embora o principal local de ação dos diuréticos tiazídicos seja o rim, o maior

efeito hipotensor dos tiazidas durante a administração prolongada se deve à

vasodilatação e não à salurese ou perda de água livre (CONWAY; LAUWERS, 1960;

VAN BRUMMELEN et al, 1980; VARDAN et al, 1983).

Embora estas drogas reduzam a pressão arterial de forma eficaz, seus mecanismos

de ação não foram até hoje completamente compreendidos (HUGHES, 2004).

Os tiazídicos reduzem de forma aguda o débito cardíaco, o volume do fluido

extracelular (VEC) e o volume plasmático, mas, com o uso crônico, o volume do VEC

retorna aos valores basais e ocorre vasodilatação (PECKER, 1990).

Tendo em vista esses dados e a dificuldade da detecção de qualquer redução do

VEC durante o tratamento crônico, muitos pesquisadores têm considerado que o

principal mecanismo pelo qual os tiazídicos reduzem a pressão arterial envolve um

efeito direto sobre a vasodilatação, talvez mediado por alterações no transporte iônico

no tecido vascular (KAPLAN, 2002; PAPADEMETRIOU et al. 2003; SICA, 2008). Por

outro lado, outros enfatizam que a depleção de sal é necessária, sugerindo que a

vasodilatação é secundária à contração do volume VEC (PECKER, 1990). Evidências

neste mesmo sentido foram obtidas em estudo que mostra que os tiazídicos não são

eficazes na fase final da doença renal (BENNETT et al, 1977).

 33

Muitos estudos têm sido realizados com a finalidade de determinar os mecanismos

pelos quais os tiazídicos dilatam os vasos sanguíneos. Uma possibilidade é que as drogas

alterem o fluxo de íons na membrana celular do músculo liso vascular. In vitro, os tiazídicos

abrem os canais de potássio de alta condutância ativados por cálcio, o que hiperpolarizaria

as células do músculo liso vascular causando, assim, relaxamento vascular (PICKKERS,

1995). In vivo, foi observado que a hidroclorotiazida causa leve dilatação dos vasos

sanguíneos do antebraço humano, mas este efeito é obtido com uma concentração maior

que a alcançada durante o uso oral da droga em situações terapêuticas (PICKKERS et

al, 1998). O efeito parece estar relacionado, pelo menos em parte, com a capacidade de

a hidroclorotiazida inibir a anidrase carbônica, o que alcaliniza a célula (PICKKERS et

al, 1999). Como a potência inibidora da anidrase carbônica de diferentes diuréticos

congêneres varia, o mesmo é esperado para seus efeitos vasculares.

A ação dos diuréticos tiazídicos sobre o VEC decorre da inibição direta do

cotransportador Na-Cl (NCC; produto de gene SLC12A3) ao longo do túbulo

contornado distal (DCT) do rim. Os tiazídicos atuam como inibidores bastante

específicos desta proteína, uma vez que não inibem o cotransportador Na-K-2Cl

sensível à furosemida ou o canal de Na sensível ao amiloride (VELÁZQUEZ;

WRIGHT, 1986; ELLISON et al, 1987). O NCC é expresso nas células do túbulo

contornado distal de roedores, coelhos e humanos (OBERMÜLLER et al, 1995;

BACHMANN et al, 1995). Embora exista evidência de que o NCC possa ser expresso

em osso e intestino, não ocorre no tecido muscular liso vascular e no músculo cardíaco

(DVORAK et al, 2007; BAZZINI, et al, 2005; GAMBA et al, 1994).

Mutações no gene SLC12A3 causam a síndrome de Gitelman (SG), doença

caracterizada por hipocalemia e alcalose (SIMON et al, 1996). Estas mutações, que

levam à perda da função do NCC, reduzem a pressão arterial em 8 mmHg, efeito

 34

semelhante ao observado com o tratamento da hipertensão com diuréticos tiazídicos,

como mostrado na Figura 1 (KUNCHAPARTY et al, 1999; SARTORI et al, 2007;

CRUZ et al, 2001).

Surpreendentemente, no entanto, a hipotensão na SG é mediada pela

vasodilatação e não por redução do VEC, embora o gene SLC12A3 seja expresso por

células renais e não por células do músculo liso vascular. Indivíduos com SG têm

suprarregulação da produção de NO, redução da resistência periférica e hiporeatividade

vascular (CALO, et al, 1996; 2000; 2001; 2002). A sinalização da angiotensina II é

prejudicada, com expressão reduzida da subunidade ligadora de proteína Gq, e redução

dos eventos celulares subsequentes, por exemplo, a liberação intracelular do íon Ca e do

inositol trifosfato (CALO et al, 2002).

Embora a deficiência de potássio tenha sido sugerida como elemento importante

para esta vasodilatação, parece pouco provável que seja a causa predominante, pois é

sabido que o aumento da ingestão de potássio normalmente dilata os vasos e reduz a

pressão sanguínea (GELEIJNSE, et al, 2003). Assim, parece muito provável que a

pressão arterial na SG seja baixa porque a perda renal de sal de alguma forma causa

vasodilatação secundária.

Uma descoberta molecular e genética adicional destacou o impacto de alterações

do transporte renal de sódio na resposta vascular humana. A hipertensão hipercalêmica

familiar (FHHt, também chamado pseudohipoaldosteronismo tipo 2 ou síndrome de

Gordon) é uma doença autossômica dominante rara na qual há aumento da funcional do

NCC. Uma das características clínicas da Síndrome de Gordon é a alta sensibilidade aos

diuréticos tiazídicos para a redução da pressão arterial. Embora na hipertensão essencial

os tiazídicos reduzam a pressão sistólica de 8 a 10 mm Hg, na FHHt essa redução é da

ordem de 40 mm de Hg (MAYAN et al, 2002). Na Figura 12 são apresentados os dados

 35

retirados da literatura por Ellison e Loffing (ELLISON; LOFFING, 2009) comparando a

diferença na pressão diastólica entre indivíduos com SG (que apresentam perda

funcional do cotransportador Na-Cl sensível a tiazídicos) e seus parentes normais

(coluna indicada como Gitelman); as diferença entre esses parâmetros observada em

hipertensos essenciais antes e durante o tratamento com um tiazídico (Tz in HtnN) e

entre os indivíduos afetados com FHHt antes e durante o tratamento com um tiazídico

(Tz in FHHt).

Figura 12 - Diferença na pressão diastólica entre indivíduos com SG (que apresentam perda
funcional do cotransportador Na-Cl sensível a tiazídicos) e seus parentes normais (coluna indicada
como Gitelman), entre hipertensos essenciais antes e durante o tratamento com um tiazídico (Tz in
HtnN) e entre os indivíduos afetados com FHHt antes e durante o tratamento com um tiazídico (Tz
in FHHt). Os dados são apresentados como média±s.e. Retirado DE ELLISON; LOFFING, 2009.

Todavia, como na SG, aFHHt é uma doença que afeta o DCT, neste caso causada

pelo ganho de função do NCC (YANG et al, 2007; LALIOTI et al, 2006). No entanto, a

hipertensão em FHHt é mediada, pelo menos em parte, por uma maior vasoreatividade,

pois estes indivíduos demonstram uma resposta exagerada ao "teste de pressão a frio"

(PAVER; PAULINE, 1964). E sabido que a retenção tubular de sal em condições

estacionárias provoca vasoconstrição e, nesta situação, a ação redutora da pressão

arterial dos tiazídicos é maior.

 36

É evidente que estas observações em síndromes genéticas não excluem um efeito

direto dos tiazídicos sobre os vasos sanguíneos como forma de promover sua ação

hipotensora. Contudo, estas observações indicam que não é necessário haver um efeito

direto sobre o músculo liso vascular para explicar a vasodilatação que se observa

durante a sua utilização crônica. Em vista que a proteína que apresenta perda de função

na SG é hiperfuncional na FHHt e não é expressa no músculo liso vascular ou nas

células endoteliais (GAMBA et al, 1994), as observações de reatividade vascular

alterada em tais estados indica existir um mecanismo pelo qual a perda renal de sal

relaxa indiretamente os vasos sanguíneos. Este modelo é compatível com o conceito de

auto-regulação postulado por Tobian (TOBIAN, 1967) e Shah (SHAH et al, 1978) e

evidenciado, em parte, no trabalho de Manning e cols. (MANNING et al, 1980).

Agudamente, quando a depleção do VEC ocorre devido à perda de sal, o débito

cardíaco tende a diminuir, resultando em vasoconstrição reativa. Cronicamente,

entretanto, o débito cardíaco (perfusão tecidual) é regulado de acordo com as

necessidades metabólicas (HALL; JACKSON, 1998) e ocorre vasodilatação, retornando

o débito cardíaco aos valores basais; isso transforma a hipotensão hipovolêmica em

hipotensão causada por vasodilação.

Os dados discutidos até agora permitem inferir que os tiazídicos reduzem a

pressão arterial primariamente pela inibição do NCC presente no rim. Dados mais

diretos foram obtidos em indivíduos com SG, que apresentam perda funcional do NCC,

tendo sido observado que neles os tiazídicos aumentam a excreção de NaCl, embora em

pequena quantidade (COLUSSI et al, 2007). Embora isso possa refletir a perda

incompleta da função do NCC, na maioria dos mutantes da SG o NCC é completamente

inativo (KUNCHAPARTY et al, 1999). Uma explicação possível seria a de que os

efeitos observados na SG resultariam da inibição da anidrase carbônica, tendo em vista

 37

que os tiazídicos também inibem esta enzima (GOLDFARB et al, 1991). Outra

possibilidade seria um efeito no duto coletor, onde a inibição do transporte de sódio pela

tiazida foi encontrada por Terada e Knepper (TERADA; KNEPPER, 1990), mas não por

Rouch e cols. (ROUCH et al, 1991).

Posteriormente, vários aspectos foram elucidados a partir de observações

realizadas em pacientes com Síndrome de Gordon, doença caracterizada por pressão

arterial elevada associada à hipercalemia e à acidose metabólica renal (GORDON et al,

1970). Duas características específicas desta síndrome são a redução da secreção de

renina e uma extraordinária sensibilidade para compostos tiazídicos. O fato de estes

pacientes exibirem o fenótipo oposto ao apresentado pelos portadores da Síndrome de

Gitelman sugeriu que suas características clínicas decorriam da retenção renal de NaCl

no túbulo contornado distal, no entanto, as mutações responsáveis pela SG não foram

identificadas no gene do NCC, mas no das cinases WNK1 e WNK4 da família WNK –

abreviatura de With No lysine Kinase (WILSON et al, 2001). Estes aspectos serão

abordados ao se analisar os diuréticos poupadores de potássio.

d) Diuréticos de alça (furosemide e ácido etacrínico)

O ácido etacrínico e o furosemide foram sintetizados, quase que

simultaneamente, pela Merck, Sharp and Dohme Research Laboratories e Farbwerke

Hoechst, respectivamente.

Como vimos anteriormente, um marco importante no desenvolvimento das

sulfonamidas foi a descoberta de clorotiazida em 1957. Manipulação molecular

subsequente da estrutura benzotiadiazina hidrogenada deu origem a muitos agentes

tiazídicos e “tiazídicos-like” com menor capacidade de inibir a anidrase carbônica. Em

seguida, abrindo o anel de tiadiazina e explorando os derivados do ácido antranílico,

 38

surgiu a furosemida no início dos anos 1960 (LANT, 1981). A descoberta do ácido

etacrínico, por outro lado, foi fruto de uma linha de pesquisa distinta (FEIT, 1979).

Estes fármacos apresentaram rápido efeito salurético, com grande aumento do

fluxo urinário e perda da capacidade de concentração do fluido urinário que se torna

praticamente isotônico ao plasma. O desenvolvimento dessas drogas foi um dos grandes

avanços médicos da medicina moderna, tendo transformado radicalmente o tratamento

dos edemas.

Só no final da década de 1980, com a caracterização do cotransportador

eletroneutro de Na:K:2Cl, que os mecanismos de ação desses fármacos foi

compreendido. Estudos posteriores de genética molecular da Síndrome de Bartter

revelaram o complexo arranjo de transportadores envolvidos em sua ação.

No ramo ascendente grosso da alça de Henle ocorre cerca de 20% da reabsorção

do NaCl e 70% do íon magnésio ultrafiltrados. Neste segmento do néfron há a

dissociação entre a reabsorção de soluto e água, o que lhe confere a capacidade de diluir

o fluido tubular. Paralelamente e em consequência da diluição do fluido luminal, ocorre

a concentração do interstício medular. Esta etapa é necessária para a reabsorção de água

no túbulo coletor, a qual se dá pela inserção de aquaporina do tipo 2, via ação do ADH

na membrana luminal das células principais desta porção do néfron. De fato, a perda da

capacidade de diluição do fluido tubular no ramo grosso ascendente tem como

consequência a impossibilidade de a urina ser concentrada, pela falta da reabsorção de

água no coletor.

O arranjo de diferentes transportadores iônicos nas membranas luminal e

basolateral confere às células tubulares do ramo grosso ascendente características

funcionais muito particulares. O cotransportador eletroneutro Na:K:2Cl (NKCC2),

 39

presente na membrana luminal, é fundamental neste processo. Através dele, os íons Na,

K e Cl entram para a célula, movidos pelo gradiente eletroquímico favorável à entrada

do íon Na, o qual é gerado pela Na+/K+-ATPase presente na membrana basolateral.

Esses três íons tomam caminhos distintos para saírem da célula. Enquanto o íon Na sai

para o interstício através da Na+/K+-ATPase, o íon Cl atravessa a membrana basolateral

via canais ClC-Ka e ClC-Kb. O íon K, por sua vez, pode retornar para a luz tubular

através dos canais ROMK presentes na membrana luminal. Isto tem duas consequências

da maior importância. Primeiro, a recirculação do íon potássio na membrana luminal é

fundamental para que ocorra o transporte através do cotransportador NKCC2. A

magnitude da afinidade desse cotransportador ao potássio exige concentrações luminais

adequadas desse íon para que, com todos os sítios de ligação aos três íons ocupados, o

cotransportador possa sofrer as mudanças conformacionais que levam ao transporte

iônico eletroneutro através da membrana luminal. Em segundo lugar, o vazamento do

íon potássio para a luz tubular hiperpolariza a membrana luminal, contribuindo para a

eletropositividade da luz em relação ao interstício. Isto gera parte do gradiente

eletroquímico favorável à reabsorção dos íons Ca e Mg através da via paracelular. Deve

ser lembrado que, sendo o ramo grosso ascendente impermeável à água, a reabsorção de

NaCl gera um gradiente transcelular de Na+, o que leva a um retorno paracelular desse

íon e geração de parte desse potencial transepitelial lúmen-positivo.

Do ponto de vista termodinâmico, é interessante observar o fluxo de energia que

ocorre através dos sucessivos processos de transporte iônico. Inicialmente, o gasto de

energia metabólica através da Na+/K+-ATPase gera um gradiente de concentração do íon

sódio, o qual, via cotransportador NKCC2, forma, por sua vez, um maior gradiente

químico para o íon potássio, cujo retorno para a luz tubular, via canais ROMK, origina
 40

um gradiente elétrico a ser utilizado para a reabsorção de magnésio e cálcio, pela via

paracelular.

A síndrome de Bartter, causada por mutações genéticas que codificam os

transportadores iônicos presentes no ramo ascendente grosso permitiram o

entendimento dessa complexa organização molecular, delineada na Figura 13.

Figura 13 – Transportadores presentes nas células tubulares do ramo grosso ascendente da alça de
Henle e as alterações de função que originam os diferentes tipos da Síndrome de Bartter.
Reproduzido de HERBERT, 2003.

Atualmente, sabe-se que esses genes são:

1) gene SLC12A1, que codifica o transportador apical NKCC2, cujas mutações

causam a síndrome de Bartter tipo I.

2) gene KCNJ1, que codifica o canal luminal de K+ (tipo ROMK), cujas mutações

causam a síndrome de Bartter tipo II.

3) genes da família CLC, que codificam os canais basolaterais de Cl- (ClC-Ka e

 41

ClC-Kb), cujas mutações causam a síndrome de Bartter tipo III.

4) gene BSND, que codifica a subunidade ß dos canais basolaterais de Cl- (ClC-K)

(denominada barttina), cujas mutações causam a síndrome de Bartter tipo IV,

associada à surdez neurossensorial, e

5) genes que codificam o receptor de cálcio (CaSR) na membrana basolateral,

cujas mutações levam à hiperfunção desse receptor e causam a síndrome de

Bartter tipo V.

Na síndrome de Bartter tipo I, diferentes mutações homozigóticas determinam

diminuição da função do cotransportador NKCC2. Este defeito no cotransportador

tríplice produz os mesmos efeitos advindos do uso de diuréticos de alça (como

furosemida e ácido etacrínico). Os pacientes apresentam grande perda de cloreto de

sódio e de potássio, hipopotassemia grave, alcalose metabólica, hipercalciúria,

nefrocalcinose e perda da capacidade de concentração urinária, podendo evoluir para

insuficiência renal. Esses são exatamente os efeitos observados com o uso desses

diuréticos.

e) Diuréticos poupadores de potássio

Há dois grupos de diuréticos que impedem a perda de potássio e atuam através

de mecanismos diferentes no mesmo segmento do néfron: os antagonistas da

aldosterona e os inibidores do ENaC (trianterene e amiloride). A espironolactona, por

apresentar estrutura química semelhante à da aldosterona, atua como seu antagonista

competitivo, bloqueando os receptores específicos desse hormônio no segmento distal

do néfron (JACOBSON; KOKKO, 1976).

O amiloride (N-amidino-3,5-diamino-6-chloropyrazinecarboxamide) e o

trianterene (6-fenilpteridina-2,4,7-triamina) são compostos aromáticos policíclicos que

 42

contém pteridina, que consiste de uma pirimidina ligada a um anel pirazina formando

pirimido(4-5-b)pirazina. A ação diurética dessas moléculas se deve à inibição que

exercem sobre o canal epitelial de sódio (ENaC).

Como apresentado na Figura 14, o túbulo coletor possui dois tipos celulares:

células principais e intercalares alfa e beta. As células principais expressam o canal

ENaC na membrana luminal, o que permite a passagem do íon Na da luz tubular para

dentro da célula a partir do gradiente eletroquímico gerado pela Na +/K+-ATPase,

localizada na membrana basolateral. Pela despolarização da membrana luminal, o

influxo celular de sódio gera uma diferença de potencial elétrico transtubular com a luz

negativa, o que favorece a secreção de K+ pelo canal ROMK. Logo, fatores que

estimulam a síntese ou a atividade do ENaC, como aldosterona e corticóides,

favorecem a reabsorção de Na+ e a excreção de K+, enquanto fatores que inibem o

ENaC, como os diuréticos amiloride e trianterene, possuem efeitos natriuréticos e

poupadores de potássio.

O canal ENaC (sensível ao amiloride) é um heteromultímero composto por

quatro subunidades: duas alfa, uma beta e uma gama. Seus domínios regulatórios estão

presentes nos segmentos amino- e carboxi-terminais localizados na porção

citoplasmática. Mais recentemente, foi determinado que mutações nos genes que

codificam as subunidades beta ou gama (tal como a alteração do aminoácido prolina na

posição 616 da subunidade beta) acarretam ativação contínua do ENaC. Tal ativação

gera maior reabsorção de Na+ nas células principais do túbulo coletor, o que eleva a

massa corpórea de sódio e aumenta o volume de fluido extracelular, causando os

transtornos que caracterizam a síndrome de Liddle, doença autossômica dominante

causada por mutações em genes localizados no cromosssoma 16 (SHIMKETS, 1994).

Na síndrome de Liddle a alteração genética causa a formação defeituosa de duas das três
 43

subunidades que compõem a proteína reguladora do canal epitelial de sódio (ENaC) do

néfron distal levando à absorção excessiva de sódio. Opostamente, as mutações que

inibem a atividade do ENaC geram nefropatias perdedoras de sal, causando, por

exemplo, o pseudo-hipoaldosteronismo autossômico recessivo tipo I.

Cabe considerar que as mutações responsáveis pela Síndrome de Gordon não

foram identificadas no gene do NCC, como inicialmente foi cogitado, mas no das

cinases WNK1 e WNK4 da família WNK – abreviatura de With No lysine Kinase

(WILSON et al, 2001). Os membros desta família de cinases são caracterizados pela

ausência de lisina no sítio catalítico, em contraste com as "clássicas" serina-treonina

cinases. Como revisto recentemente (ELADARI; CHAMBREY, 2007), vários estudos

foram realizados para determinar a localização e os efeitos das WNKs em vários

transportadores e há evidências de que WNKs regulam o transporte transcelular e

paracelular de íons em diferentes epitélios.

A WNK4 é expressa ao longo de todo o néfron distal sensível a aldosterona

(ASDN), agindo sobre três diferentes mecanismos de transporte iônico. Por meio de um

mecanismo dependente de cinase inibe a reabsorção eletroneutra de sódio pelo NCC no

túbulo contornado distal (DCT); por meio de um mecanismo independente de cinase

atua sobre a secreção de K+ através do canal ROMK (Renal Outer Medullary K+

channel) presente na medula externa; por mecanismo não esclarecido aumenta a

permeabilidade paracelular ao íon Cl.

O esquema apresentado na figura 14 mostra os 3 tipos de células responsáveis

pelo transporte de NaCl e K+ ao longo de néfron distal sensível a aldosterona (ASDN).

O cotransportador Na+/ Cl- (NCC) por onde se dá a reabsorção eletroneutra de NaCl no

túbulo contornado distal (DCT) e o canal epitelial de Na+ (ENaC), via da reabsorção

eletrogênica de Na+ que gera o gradiente eletroquímico responsável pela reabsorção do

 44

íon Cl e secreção do íon K pela via paracelular. No final do DCT (DCT2), as duas vias

coexistem nas mesmas células. Variações na permeabilidade da via paracelular podem

alterar o transporte iônico. O aumento da permeabilidade causa redução da voltagem

transepitelial e consequente diminuição da secreção do íon K. A WNK4 pode diminuir a

atividade do NCC, do ENaC e do canal ROMK e aumentar a permeabilidade paracelular

ao íon Cl.

Figura 14 – Neste esquema

são mostrados os 3 tipos de
células
responsáveis pelo transporte
de NaCl e K+ ao longo de
néfron distal sensível a
aldosterona e os possíveis
mecanismos de controle
envolvidos no transporte
iônico. Retirada de
ELADARI;
CHAMBREY, 2007.

Essas ações

envolvem diferentes

mecanismos

moleculares que

podem ocorrer de forma independente. Sabe-se que a WNK1 possui duas isoformas:

uma longa (long WNK1, L-WNK1) que pode ativar o cotransportador NCC, o canal

epitelial de sódio (ENaC – epithelial sodium channel) e inibir o canal de potássio

ROMK, e uma isoforma renal (kidney specific WNK1 – KS-WNK1) que pode regular a

atividade da isoforma longa, através de um mecanismo dominante-negativo. A L-

WNK1 é um fator de regulação negativa da WNK4. No DCT2, a L-WNK1 pode ser

inibida pelo efeito negativo dominante da sua variante de processamento curto - cinase

deficiente KS- WNK1.

 45

A cinase L-WNK1 é expressa ao longo do néfron e é um fator estimulante para o

transporte de Na mediado pelo ENaC e pelo NCC, ao mesmo tempo em que inibe a

secreção de K via canal ROMK . A KS-WNK1 tem um padrão muito mais restrito de

expressão (predominante no final do DCT e diminuindo progressivamente ao longo do

CNT e a jusante do ducto coletor cortical - CCD).

Há evidências de que a KS-WNK1 inibe o NCC e estimula o canal ROMK

através do seu efeito negativo dominante sobre a L-WNK1; este também inibe o ENaC

por um mecanismo diferente.

Outra característica da Síndrome de Gordon é a presença de acidose renal; no

entanto, os efeitos das WNKs sobre transportadores envolvidos no transporte

acidobásico, em particular a próton ATPase vacuolar, permanecem desconhecidos.

Estas observações levam à melhor compreensão dos mecanismos de ação do

amiloride e do trianterene, que atuam no ENaC, transportador que é regulado pelas

cinases acima discutidas.

 46

SEGUNDA PARTE:

EFEITO DA HIDROCLOROTIAZIDA NA ATIVIDADE

CONTRÁTIL DA MUSCULATURA LISA DO CORPO
CAVERNOSO DE CAMUNDONGO

1) Revisão da literatura

Como revisto acima, embora o principal local de ação dos diuréticos tiazídicos

seja o rim, seu maior efeito hipotensor durante a administração em longo prazo é devido
 47

à vasodilatação e não à salurese ou perda de água livre (CONWAY; LAUWERS, 1960;

VAN BRUMMELEN et al, 1980; VARDAN et al, 1983). Os tiazídicos causam

relaxamento de vasos sanguíneos de resistência tanto in vitro (CALDER et al , 1992a;

1992b; 1993; PICKKERS et al, 1998) como in vivo (PREZIOSI et al, 1961;

GILLENWATER et al, 1962; PICKKERS et al, 1998), e os mecanismos propostos para

esta ação não estão relacionados com os efeitos natriuréticos destes diuréticos (inibição

do cotransportador NaCl). Por exemplo, a vasodilatação da artéria braquial humana in

vivo induzida por hidroclorotiazida também ocorre em pacientes com síndrome de

Gitelman (SIMON et al, 1996), na qual ocorre a perda da função do cotransportador de

NaCl sensível aos tiazídicos.

Inicialmente foi descrito que os diuréticos tiazídicos causavam alterações na

homeostase de canais iônicos (ZSÓTER; SUFFIAD, 1973; MOURA; WORCEL, 1982;

CALDER et al, 1993) e o relaxamento vascular que provocava eram mediados por

canais de K+ ativados por Ca2+. Também foi verificado que Indapamida agia como um

potente antagonista do cálcio (CALDER et al, 1993) e o efeito relaxante da

hidroclorotiazida em pequenas artérias mesentéricas isoladas de cobaia foi associado

com uma diminuição da concentração intracelular de cálcio (PICKKERS; HUGHES,

1995).

Vários são os relatos que relacionam os diuréticos tiazídicos com a disfunção

sexual masculina em humanos, especialmente quando associada com altas doses de

diuréticos e hipertensão arterial (CHANG et al, 1991; PRISANT et al, 1994;

BURCHARDT et al, 2000; MOULIK; HARDY, 2003; BÖHM et al, 2007; KLONER,

2007).

Como revisto por Böhm (2001), a impotência pode ocorrer em duas formas. A

primeira, denominada de coeundi impotentia, também conhecida como disfunção erétil

 48

(DE), refere-se à incapacidade de realizar o ato sexual. Esta é a forma comumente

referida como impotência. A segunda forma, menos conhecida, é a impotencia

generandi, também conhecida como infertilidade ou esterilidade, e refere-se à

incapacidade de procriar filhos, como resultado de alterações patológicas do esperma.

A impotência, na forma de disfunção erétil, é caracterizada pela incapacidade

consistente ou recorrente de o homem não pode atingir ou manter uma rigidez do pênis

suficiente para realizar o ato sexual (HATZIMOURATIDIS; HATZICHRISTOU, 2007).

Esta definição enfatiza especialmente a capacidade de realizar o ato sexual. A rigidez

prejudicada que ainda permite a relação sexual, consequentemente, não é designada

como disfunção erétil. Impotentia coeundi é considerado como tal apenas se persistir ao

longo de um período de pelo menos 6 meses. Falta de libido não é relevante nesta

definição: a libido pode ser totalmente não comprometida apesar da disfunção erétil. No

caso de falta de libido, por outro lado, a ereção pode não ocorrer.

A disfunção erétil ocorre com relativa frequência e torna-se mais prevalente com

o aumento da idade. Trata-se de doença comum, com uma prevalência entre 10 a 30%

de todos os homens; mais de 50 % dos homens entre 50 e 70 anos são incapazes de

conseguir uma ereção satisfatória para si ou para os seus parceiros, ou de manter uma

ereção na relação sexual (NIH Consensus on Impotence, 1993; KLONER et al, 2001;

DUSING, 2005). Entre os homens com hipertensão arterial, 67-68% têm algum grau de

disfunção erétil. Vários fatores médicos, psicológicos e de estilo de vida têm sido

implicados na sua patogênese. Diabetes, hipertensão, hiperlipidemia, obesidade,

tabagismo e falta de atividade física são fatores de risco estabelecidos para disfunção

erétil (Kloner, 2007). Entre as pessoas com diabetes mellitus ou com insuficiência renal

grave, a prevalência é maior do que entre os homens saudáveis da mesma faixa etária.
 49

A hipertensão arterial é um dos fatores etiológicos mais importantes para a

disfunção erétil. A prevalência da disfunção erétil está correlacionada com o nível de

pressão arterial sistólica (GRIMM et al, 1997). Entre os indivíduos hipertensos não

tratados, a prevalência varia de 7 a 14%; entre os tratados, varia de 16 a 58 %

(ROSENKRANZ; ERDMANN, 2001). A relação entre a disfunção erétil e a hipertensão

arterial resulta de danos no endotélio, com a redução da síntese de NO e aumento da

produção de endotelina (FERRO; WEBB, 1997).

Esta relação também ocorre na terapia anti-hipertensiva (EKMAN et al, 2010).

Os betabloqueadores, especialmente os não-seletivos, os diuréticos triazídicos e

aldactone podem levar à disfunção erétil (GRIMM et al, 1997; RERKPATANAPIPAT et

al, 2001).

É sabido que os medicamentos podem ter efeitos adversos sobre a função sexual

em várias dimensões: efeitos centrais de sedação e perda da libido, efeitos centrais e

periféricos, influenciando neurotransmissores e receptores (STADLER et al, 2006). O

uso dos anti-hipertensivos tem sido associado com a disfunção erétil (KLONER et al,

2003), embora a relação com os diuréticos tenha sido contestada (PAPATSORIS;

KORANTZOPOULOS, 2006). Também tem sido sugerido que os bloqueadores do

receptor tipo 1 da angiotensina II afetam a função sexual menos do que outros

tratamentos anti-hipertensivos (REFFELMANN; KLONER, 2006) havendo dados

indicando que a função sexual e a disfunção erétil podem melhorar durante o tratamento

com bloqueadores do receptor tipo 1 da angiotensina II (FOGARI et al, 2001;

LLISTERRI et al, 2001; DELLA CHIESA, 2003).

Até o momento, todavia, os possíveis mecanismos subjacente ao efeito não-

diurético sobre a disfunção erétil não estão claramente definidos. A ereção peniana é

uma reação vascular complexa e muitos trabalhos têm-se centrado sobre as alterações
 50

nos vasos sanguíneos. No entanto, as mudanças nos tecidos vasculares são

acompanhadas por relaxamento do corpo cavernoso do músculo liso trabecular,

resultando em um aumento do fluxo sanguíneo para os espaços trabecular do corpo

cavernoso (BURNETT et al, 1992; ANDERSSON; WAGNER, 1995).

O óxido nítrico (NO), liberado em terminações nervosas (do tipo não-

adrenérgicas, não colinérgicas (NANC) e nas nitrérgicas), e no endotélio é o mediador

mais importante para o relaxamento do músculo liso do corpo cavernoso (LUE, 2000).

Em contraste, a noradrenalina, liberada nos nervos adrenérgicos é o principal mediador

da contração do corpo cavernoso do pênis (SAENZ DE TEJADA et al, 1988). Assim,

um desequilíbrio entre os mecanismos de contração e relaxamento do músculo liso não

vascular poderia contribuir significativamente para a disfunção erétil observada após o

tratamento com tiazidas (ANDERSSON; WAGNER, 1995).

2) Objetivos

O objetivo deste trabalho foi o de investigar os efeitos de hidroclorotiazida e

outros diuréticos sobre a contração induzida por fenilefrina ou campo de estimulação

elétrica no músculo liso do corpo cavernoso de camundongos.

 51

3) Materiais e métodos

Animais

Todos os procedimentos experimentais foram devidamente aprovados e

conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e os Princípios Éticos na

Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA).

Camundongos da cepa C57BL/6 (tipo selvagem) com 25 - 30g , machos, foram

obtidos do Biotério da Universidade de Campinas (UNICAMP). Os animais foram

alojados em instalações com temperatura controlada em um ciclo claro-escuro de 12

horas com acesso a ração e água ad libitum.

Preparação de corpo cavernoso in vitro

Os animais foram atordoados por inalação de CO2 e sacrificados por

decapitação. Os pênis foram removidos cirurgicamente e colocados imediatamente em

solução de Krebs gelada com a seguinte composição (mM): NaCl, 118; NaHCO3, 25;

glicose, 5,6; KCl, 4,7; KH2PO4 , 1,2; MgSO4 7H2O, 1,17 e CaCl2 2H2O, 2,5.

As tiras do corpo cavernoso foram obtidas após a dissecção da túnica albugínea

e tecidos conjuntivos circundantes. As tiras de corpo cavernoso dos camundongos foram

então montadas em banhos para órgãos com volume de 10 ml contendo solução de

Krebs a 37°C continuamente borbulhada com uma mistura de 95% de O2 e 5 % de CO2

(pH 7,4) e suspensas verticalmente entre dois ganchos metálicos.

Um gancho foi ligado a um transdutor de força (ADInstruments, MA, EUA) e o

outro foi utilizado como ponto de fixação. Uma vez montados no aparelho de registro

de força, os tecidos foram estirados até uma tensão de repouso de 4 mN e deixados a

 52

equilibrar durante 60 min. Variações da força isométrica foram registradas usando um

PowerLab 4/30 do sistema de aquisição de dados (Software Gráfico, versão 7.0;

ADInstruments, Colorado Springs, MA , EUA).

As curvas de resposta a concentração

Curvas de resposta a concentração de fenilefirna (10nM - 10 M) foram obtidas

em tiras de corpo cavernoso na ausência (controle) ou presença de hidroclorotiazida (10,

30 e 100 µM), clortalidona (3 e 10 µM), indapamida (1, 3 e 10 µM), amilorida,

furosemida, triamterene e metazolamida (100 µM) adicionadas 30 minutos antes da

fenilefirna. Além disso, curvas de resposta a concentrações cumulativas de fenilefirna

foram obtidas na ausência e na presença de hidroclorotiazida (100 µM) e N)-nitro-L-

arginina metil ester (L-NAME) na concentração de 100 µM (RANDI; LI, 1993) ou

indometacina na concentração de 5 µM (ECKENFELS; VANE, 1972) para avaliar os

efeitos da NO e das ciclooxigenases, respectivamente.

Curvas de resposta a concentrações cumulativas para acetilcolina (Ach; 0,001-10

µM) foram obtidas em tiras de corpo cavernoso na ausência (controle) ou presença de

hidroclorotiazida (100 µM). Todos os dados de resposta a concentração foram avaliados

através do ajuste a funções logísticas e por análise de regressão não-linear para

determinar os parâmetros Emax (resposta máxima), log EC50 (log da metade da

concentração eficaz máxima) e n através do uso do programa GraphPad Prism

(GraphPad Software Inc., CA, USA).

Estimulação de campo elétrico

A estimulação de campo elétrico foi aplicada às tiras colocadas entre dois

elétrodos de platina ligados a um estimulador Grass S88 (Astro-Med Industrial Park,

 53

MA, EUA). A estimulação foi realizada com trens de estímulos com duração de 10

segundos com pulsos de 50V e 1 ms de duração e frequências entre 1 e 32 Hz (1, 2, 4,

8, 16 e 32 Hz). Curvas de resposta para frequência de estimulação de campo elétrico

foram obtidas para avaliar mudanças no tonus basal das tiras submetidas à estimulação

na ausência e na presença de L-NAME (100 μM) e/ou hidroclorotiazida (100 μM). A

fim de obter respostas mediadas por NO (respostas nitrérgicas), o corpo cavernoso dos

camundongos foram pré-tratados com guanetidina (30 μM) e atropina (1 μM) para

eliminar os efeitos dos neurônios adrenérgicos e colinérgicos. Os tecidos cavernosos

foram contraídos com U46691 (100 μM) e quando alcançados níveis de contração

estáveis, foi promovida uma série de relaxamentos induzidos por estimulação de campo

elétrico com 1 a 32 Hz, na ausência e na presença hidroclorotiazida na concentração de

100 μM (TEIXEIRA et al, 2004; SAENZ DE TEJADA et al, 2004).

Tratamento crônico com hidroclorotiazida

O tratamento crônico foi realizado durante 4 semanas por adição de

hidroclorotiazida na água de beber na concentração de 50 mg/L, o que proporcionava

uma ingestão diária de cerca de 6 mg/kg/dia. Curvas de resposta a concentrações

cumulativas de fenilefrina (10 μM-100 uM) e acetilcolina (10 μM -10 μM) foram

obtidas em tiras de corpo cavernoso, tal como descrito acima. Foram obtidos

relaxamentos ou contrações dependentes de frequência (estimulação de campo elétrico;

1-32 Hz). Também foi avaliado o tratamento crônico por adição de hidroclorotiazida +

amiloride (6 mg/kg/dia e 3 mg/kg/dia, respectivamente) na água de beber, durante 4

semanas.
 54

Determinação da hidroclorotiazida no plasma por espectrometria de massa em

tandem (LC-MS/MS)

As amostras de plasma

Os animais foram anestesiados por inalação de isoflurano (5%) e 1 mL de

sangue foi colhido por punção da aorta abdominal. O plasma foi obtido por

centrifugação das amostras de sangue a 2000 g durante 10 min e mantidos congelados a

-20 °C até a quantificação.

As amostras padrão

Como padrão interno foram utilizadas solução estoque de clortalidona (1000

ng/mL) e soluções de trabalho (1000 ng/mL) para a calibragem e controle de qualidade.

Essas soluções foram inicialmente preparadas em metanol:água (1:1, v/v ) e mantidas

em congelador. A curva padrão foi construída diariamente para analisar as amostras de

plasma com quantidades conhecidas de hidroclorotiazida e o padrão interno. Alíquotas

(1:10) dos padrões de calibração de trabalho e padrões de controle de qualidade

utilizadas para obter a curva de calibração entre 5 ng/mL-5000 ng/mL e três níveis de

controle de qualidade (15, 150 e 4000 ng/m). A linearidade da curva de calibração foi

desenvolvida para atender aos critérios usuais de bom controle de qualidade.

O limite de quantificação foi definido tendo em conta a sensibilidade do método,

a precisão e a exatidão. Os seguintes critérios foram cumpridos para aprovar o valor

final: nenhuma interferência presente em espaços em branco no tempo de retenção do

analito; pico identificável do analito, discreto e com uma precisão entre 80% - 120% em

relação à concentração nominal standard, precisão (CV%) e exatidão de 20%,

calculados entre duplicatas quando ambas aprovadas pelos critérios de qualidade.

 55

A concentração plasmática de hidroclorotiazida

Cem µL de plasma foram introduzidas em tubos de vidro seguidos de 50 mL da

solução de padrão interno (1000 ng/mL de clortalidona em metanol:água 1:1, v/v). As

amostras foram misturadas em vótex durante aproximadamente 10s. Então eram

acrescentados 4 mL de dietil-etér/diclorometano (70:30, v/v) a todos os tubos e os

mesmos foam agitados em vórtex durante 1 min. As amostras foam então centrifugadas

a 3400 g durante 2 min a 4 °C. Após a centrifugação os tubos foram congelados durante

20 min a -80 °C. A fase orgânica superior foi transferida para outro conjunto de tubos de

vidro limpos e evaporada até secar sob N2 a 40 °C. Os resíduos secos foram dissolvidos

com 200 mL da fase móvel (acetonitrilo/água (70:30), v/v + hidróxido de amônio 2

mM), misturados em vórtex durante 20 s para reconstituir os resíduos e então foram

transferidos para frascos, utilizando pipetas automáticas com ponteiras de plástico

descartáveis.

Uma alíquota de 15 µl foi injetada numa coluna cromatográfica Genesis de fase

reversa (C18 4μm - 100 milímetros x 2,1 mm) operando a 50 °C. A taxa de fluxo foi de

0,350 mL/ min splitless (contínuo, sem interrupção). A temperatura do amostrador

automático foi mantida a 5 °C e o tempo de reação foi de 2 min. Sob estas condições, os

tempos de retenção típicos padrão foram de 0,8 min ± 0,2 para ambos os compostos, e

observaram-se valores de volta à pressão de aproximadamente 65 bar. Foi conferida a

inexistência de interferência entre os canais utilizados.

O espectrômetro de massa (Quattro Micro / Waters Micromass, Milford, MA,

EUA), equipado com uma fonte de electrospray em execução no modo negativo (ES-),

foi preparado para a função Multiple Reaction Monitoring (MRM), monitorando as

transições 295,8>77,7 para hidroclorotiazida e 336,8>146,1 para clortalidona.

 56

A fim de otimizar todos os parâmetros da espectroscopia de massa, soluções

padrão dos analitos e padrões internos foram infundidas no espectrômetro de massa. A

temperatura do bloco de origem foi fixada em 150 °C e a temperatura de dessolvatação

em 350 °C. O capilar foi ajustado para 3,2 kV e o cone em 28V para ambos os

compostos. A energia de entrada e de saída foram 10V e a energia de colisão foi de 25V

para todas as transições. Os dados foram adquiridos por meio da interface MassLynx

v4.0 SP4 (Waters Micromass, Milford, MA, EUA).

Materiais

Acetilcolina, amilorida, atropina, clortalidona, furosemida, hidroclorotiazida,

indapamida, indometacina, triamtereno, metazolamida, L-NAME, fenilefrina, U46619

(9,11-didesoxi-11α,-9α epoxymethanoprostaglandin F2a) e guanetidina foram obtidos

de Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO, EUA).

Acetilcolina, U46619, amilorida, atropina, guanetidina, KCl, L-NAME,

triamtereno e fenilefrina, foram dissolvidos em água e os outros fármacos foram

dissolvidos em etanol. As concentrações finais de etanol (<0,1%) utilizadas não

afetaram as respostas do corpo cavernoso do músculo liso.

Análise estatística

Todos os dados são expressos como média ± s.e. (n). Foi utilizado o programa

Instat (GraphPad software) para a análise estatística. Foi realizada análise de variância

(ANOVA) para medidas repetidas e o método de Bonferroni foi escolhido como pós-

teste. Teste t não pareado de Student foi utilizado quando apropriado. P < 0,05 foi aceito

como significante. Os valores de EC50 são apresentados como o logaritmo negativo

(pEC50).
 57

4) Resultados

Efeitos de diuréticos sobre as contrações induzidas por fenilefrina

A adição cumulativa de fenilefrina (10nM - 10µM) induziu contrações

dependentes de concentração no músculo liso do corpo cavernoso de camundongo. A

hidroclorotiazida (10-100 uM, n = 4), indapamida (1-10 uM, n = 4), e clortalidona (3 e

1µM, n = 3-7), causou um aumento significativo das contrações dependentes da

concentração de fenilefrina, em comparação com os valores observados com fenilefrina

por si só (grupo controle; Figuras 15A-C, Tabela 1). Clortalidona (3 e 10 µM) também

provocou um desvio para a esquerda de forma significativa na curva de resposta a

concentração para contrações induzidas pela fenilefrina (6,00 e 4,47 vezes,

respectivamente), quando comparado com os valores de controle (Figura 15C, Tabela

1). Em concentrações mais baixas (0,01 e 0,1 µM), nem indapamida (Emax = 0,45 ± 0,04

e 0,44 ± 0,06, 0,01 e 0,1 por mN, respectivamente) nem clortalidona (Emax = 0,49 ± 0,04

e 0,47 ± 0,05 mN; 0,01 e 0,1 µM, respectivamente) causou alterações significativas nas

contrações induzidas por fenilefrina em comparação com o controle (0,44 ± 0,05 mN,

sendo mN a concentração máxima induzida por fenilefrina).

Figura 15 - Curvas de resposta à concentração de fenilefrina (PE; 10; 30 e 100 µM) obtidas em tiras
de músculo liso de corpo cavernoso de camundongo antes ou após pré-incubação com diuréticos
sulfonamídicos: (A) Hidroclorotiazida (10-100 mM); (B) Indapamida (1; 3 e 10 µM); (C)
Clortalidona (3 e 10 uM). Os valores experimentais foram calculados em relação às contrações
máximas (nM) produzidas por fenilefrina em cada tecido. Dados apresentados como média ± s.e. de
4-6 experimentos.
 58

Em contraste com os diuréticos tiazídicos, a amilorida (100 µM, n = 4; Figura

16A), triamtereno (100 µM, n = 3; figura 16B) e furosemida (100 µM, n = 4; Figura

16C) atenuaram significativamente as contrações induzidas por fenilefrina na

musculatura lisa do corpo cavernoso, quando comparadas às obtidas nos grupos

controle correspondentes (Tabela 1). Concentrações mais baixas destes diuréticos (10

µM) não alteraram a contração induzida pela fenilefrina (dados não mostrados). O

inibidor de anidrase carbônica, metazolamida (100 µM, n = 3), não provocou qualquer

alteração significativa nos parâmetros analisados quando comparados com o grupo

controle (Tabela 1). Em contraste com a modulação clara das contrações, a

hidroclorotiazida não afetou o relaxamento com U 46619 de tiras de corpo cavernoso

pré-contraídas pela ação de acetilcolina (ACh), tendo sido observado EC50 (metade da

concentração eficaz máxima) de 7,26 ± 0,29 e 7,97 ± 0,29 para controle e ACh,

respectivamente, n = 5.

Figura 16 - Curvas de resposta à concentração de fenilefrina (PE; 10; 30 e 100 µM) obtidas em tiras
de músculo liso de corpo cavernoso de camundongo antes ou após pré-incubação com diuréticos
poupadores de potássio: (A) Amilorida (100 µM); (B) Triamtereno (100 µM); e (C), Furosemida
(100 µM). Os valores experimentais foram calculados em relação às contrações máximas (Mn)
produzidas por fenilefrina em cada tecido. Dados apresentados como média ± S.E.M. de 4-7
experimentos.
 59

Tabela 1 - Potência (pEC50) e a resposta máxima (Emax) obtidas a partir de curvas de resposta à
concentração de fenilefrina (10 µM - 100 µM) na ausência e na presença de diuréticos no músculo
liso do corpo cavernoso de camundongo.

Fenilefrina

pEC50 Emax (mN) N

Controle 6.20 ± 0.15 0.44 ± 0.05 8

Hidroclorotiazida 10 µM 6.31 ± 0.11 0.54 ± 0.06 6

Hidroclorotiazida 30 µM 6.56 ± 0.04 0.69 ± 0.02* 4

Hidroclorotiazida 100 µM 6.37 ± 0.11 0.72 ± 0.07** 7

Controle 6.38 ± 0.09 0.44 ± 0.04 4

Indapamina 1 µM 6.55 ± 0.05 0.65 ± 0.02* 4

Indapamina 3 µM 6.45 ± 0.05 0.65 ± 0.02* 4

Indapamina 10 µM 6.76 ± 0.15 0.62 ± 0.07* 4

Controle 6.16 ± 0.19 0.44 ± 0.05 7

Clortalidona 3 µM 6.97 ± 0.03* 0.56 ± 0.06 5

Dados apresentados como média ± s.e. de n experimentos. Potência (pEC 50) representada
como -log da concentração molar para produzir 50% da resposta máxima de contração
Clortalidona 10 µM 6.86 ± 0.09* 0.60 ± 0.10 7
induzida por agonista em relação às contrações induzidas por fenilefrina. Resposta máxima
(Emax) calculada como mN de contração em relação a alterações máximas de resposta
Controleproduzida pela fenilefrina. *6.04
contráctil ± 0.03
P <0,05 0.44 ±controle;
comparado ao grupo 0.05 7
** P <0,01
comparado ao grupo controle; *** P <0,001 em relação ao grupo controle.
Amilorida 100 µM 5.46 ± 0.07*** 0.44 ± 0.05 4

Triamterene 100 µM 5.56 ± 0.10** 0.46 ± 0.08 4

Furosemida 100 µM 5.65 ± 0.15* 0.36 ± 0.06 4

Participação da NO
Metazolamida sintase e ciclooxigenase
100 µM 6.02 ± 0.17 nas contrações
0.49 ± 0.09 induzidas
4 por
fenilefrina
Controle 6.33 ± 0.10 0.48 ± 0.06 10
O inibidor da NO(6mg/kg/day)
Hidroclorotiazida sintase, L-NAME
6.38 ± (100
0.11 µM, n = 6), provocou
0.77 ± 0.10* um desvio
4 para a

esquerda nas contrações induzidas pela fenilefrina (Figura 17A, Tabela 2). A adição de

hidroclorotiazida (100 µM, n = 6), na presença de L-NAME, não alterou as contrações

induzidas por fenilefrina em tiras de músculo liso do corpo cavernoso de camundongo

(Figura 17A, Tabela 2).

O inibidor de ciclooxigenase, indometacina (5 µM, n = 4), provocou uma

significativa mudança para a direita nas curvas de resposta à concentração de fenilefrina

 60

em comparação com o grupo controle (Figura 17B, Tabela 2), mas não alterou o tonus

basal (não mostrado). No entanto, a presença de indometacina (5 µM) não afetou o

deslocamento para a esquerda induzido por hidroclorotiazida nas curvas de resposta à

concentração de fenilefrina (Figura 17B, Tabela 2).

Figura 17 - Curvas de resposta à concentração de fenilefrina (PE; 10; 30 e 100 µM) obtidas em tiras
de músculo liso de corpo cavernoso de camundongo na ausência ou na presença de (A)
hidroclorotiazida (100 µM) e/ou L-NAME (100 µM); ou (B) ) hidroclorotiazida (100 µM) e/ou
indometacina (5 µM). Os valores experimentais foram calculados em relação às contrações
máximas (Mn) produzidas por fenilefrina em cada tecido. Dados apresentados como médias ± s.e.
de 4-7 experimentos.
 61

Tabela 2 - Potência (pEC50) e resposta máxima (E max) obtidas a partir de curvas de resposta à
concentração de fenilefrina (10 µM-100 µM) na ausência e na presença de hidroclorotiazida (100
M), L-NAME e indometacina no músculo liso do corpo cavernoso de camundongo.

Fenilefrina

pEC50 Emax (mN) N

Controle 6.24 ± 0.14 0.46 ± 0.02 5

L-NAME 100 µM 6.89 ± 0.14* 0.65 ± 0.05* 6

Hidroclorotiazida (HCT) 100 µM 6.20 ± 0.13 0.61 ± 0.02* 4

HCT 100 µM + L-NAME 100 µM 6.79 ± 0.16 0.60 ± 0.04* 6

Controle 6.25 ± 0.14 0.46 ± 0.02 5

Indometacina 5 µM 5.69 ± 0.11* 0.49 ± 0.02 7

HCT 100 µM 6.37 ± 0.11 0.72 ± 0.07* 7

HCT 100 µM + Indometacin 5 µM 6.19 ± 0.05# 0.60 ± 0.05*,# 7

Dados apresentados como média ± s.e. de n experimentos. Potência (pEC 50) representada como -log da
concentração molar para produzir 50% da resposta máxima de contração induzida por agonista em relação às
contrações induzidas por fenilefrina. Resposta máxima (E max) calculada como mN de contração em relação a
alterações máximas de resposta contráctil produzida pela fenilefrina. * P <0,05 comparado ao grupo controle;
** P <0,01 comparado ao grupo controle; *** P <0,001 em relação ao grupo controle.

Respostas das tiras de músculo liso de corpo cavernoso à estimulação de campo

elétrico (EFS)

Em condição controle, as tiras de músculo liso de corpo cavernoso responderam

à estimulação de campo elétrico (EFS) com contrações dependentes da frequência

(Figura 18 A). A exposição das tiras de músculo liso de corpo cavernoso à

hidroclorotiazida (100 µM), durante 30 min antes e durante a EFS aumentou claramente

as respostas contráteis (Figura 18 A). Na presença de L-NAME (100 µM) não houve

alteração no tonus basal, mas as respostas ao EFS foram aumentadas. Importante

observar que, na presença de L-NAME, a hidroclorotiazida deixou de potencializar as

 62

respostas para EFS (Figura 18C). Em tiras de músculo liso de corpo cavernoso pré-

contraídas com U 46619 (100 µM), a EFS provocou relaxamento dependente da

frequência que foi afetado pela adição de hidroclorotiazida (Figura 18B).

Figura 18 - Respostas contrácteis de tiras de músculo liso do corpo cavernoso de camundongo à

estimulação de campo elétrico (EFS, 1-32 Hz) na: (A) ausência (controle) ou presença de
hidroclorotiazida (100 µM); (B) presença de L-NAME e (A) hidroclorotiazida (100 uM) e/ou L-
NAME (100 µM). Os dados apresentados como média ± s.e. de 7 experimentos.

Efeitos do tratamento crônico in vivo com a hidroclorotiazida sobre a

contratilidade de tiras de músculo liso do corpo cavernoso de camundongos

Tiras de músculo liso de corpo cavernoso de camundongos que receberam a

hidroclorotiazida (6 mg/kg/dia) por 4 semanas mostraram uma mudança significativa na

resposta máxima à fenilefrina (Figura 19A; Tabela 1). No entanto, o mesmo tratamento

induziu uma redução significativa dos relaxamentos evocados por estimulação de

campo elétrico (EFS) (Figura 19B), sem afetar as respostas contráteis induzidas por EFS

(dados não mostrados). O tratamento crônico também não afetou o relaxamento por Ach

em tiras de músculo contraídas por U 46619 (CE50 7,33 ± 0,13 e 7,38 ± 0,16 para o

controle e tratamento, respectivamente, n = 5). Curiosamente, essas mudanças na

resposta máxima à fenilefrina e redução de relaxamentos evocados por EFS evocados

não foram observadas em tiras de músculo liso de corpo cavernoso que receberam a

hidroclorotiazida + amiloride (6 mg/kg/dia, e 0,6 mg/kg/dia, respectivamente) durante 4

semanas (Quadro 2 ), e também não afetou o relaxamento induzido por acetilcolina das
 63

tiras contraídas pela ação de U46619 (EC50 7,7 ± 0,11 e 7,8 ± 0,2 para o controle e

tratamento, respectivamente, n = 5).

Figura 19 - (A) curvas de resposta à concentração de fenilefrina (PE) nas concentrações de 0,01 a
100 µM em músculo liso do corpo cavernoso obtido de animais tratados com a hidroclorotiazida (6
mg/kg/dia) durante 4 semanas. (B) respostas de relaxamento à estimulação de campo elétrico (EFS)
de 1-32 Hz obtidas em preparações semelhantes. (C) curvas de resposta à concentração de
fenilefrina (PE) nas concentrações de 0,01 a 100 µM em músculo liso do corpo cavernoso obtido de
animais tratados com hidroclorotiazida (6 mg/kg/dia) e amilorida (0.6mg/Kg/dia) durante 4
semanas. (B) respostas de relaxamento a estimulação elétrica de campo (EFS, 1-32 Hz) obtidas em
preparações semelhantes. Os dados apresentados são meios ± s.e. de 4-10 experimentos. * P <0,05
comparado ao grupo controle.

Concentração plasmática HTZ em tratamento crônico

A concentração plasmática dos animais que receberam hidroclorotiazida (6

mg/kg/dia) na água de beber foi 149 ± 56 ng/ml (n = 6).

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Nossos resultados demonstram claramente que hidroclorotiazida e outros

diuréticos tiazídicos, como a clortalidona e indapamida, potencializam a contração de

tiras de músculo liso do corpo cavernoso de camundongos induzida tanto por fenilefrina
 64

como por estimulação de campo elétrico (EFS). Este efeito também foi observado ex

vivo, após o tratamento crônico com hidroclorotiazida.

Esta ação parece ser específica para esta classe de diuréticos, pois não foi

observada com furosemida, clássico diurético de alça, com diuréticos poupadores de

potássio, como amilorida e triantereno, nem com metazolamida, diurético inibidor da

anidrase carbônica.

Tais potencializações são surpreendentes, pois as tiazidas são bem conhecidas

por induzir o relaxamento do músculo liso vascular através de diferentes mecanismos.

Estudos anteriores mostraram que a tiazida tanto in vivo como in vitro atenua a

ação vasoconstritora induzida por agonista por dessensibilização das células do músculo

liso vascular ao cálcio através da via da cinase Rho-RhoA (ZHU et al, 2005). Também

foi anteriormente observado que hidroclorotiazida relaxa a artéria mesentérica isolada

de cobaia pela abertura de canais de K+ ativados por Ca2+, o que leva à hiperpolarização

da célula (PICKKERS; HUGHES, 1995). Mais ainda, o relaxamento induzido por

hidroclorotiazida em pequenos vasos sanguíneos de cobaias foi bloqueado por

caribdotoxina, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ (CALDER et al,

1993).

Nossa observação de que a tiazida potencializa as contrações do músculo liso do

corpo cavernoso foi, assim, inesperada e, pelo menos em termos de fluxos iônicos,

exige novos estudos para a sua compreensão.

O tônus do músculo liso e as respostas elicitadas por agonistas são conhecidos

por serem influenciados por níveis de produtos endógenos da ciclooxigenase

(ROBINSON et al, 2001; FÉLÉTOU et al, 2010; WONG et al, 2010). A inibição de

ciclooxigenases por diclofenaco (50 mg) ou rofecoxib (25 mg) reduziu

significativamente os efeitos diuréticos e natriuréticos da hidroclorotiazida em seres

 65

humanos (KNAUF et al, 2006), indicando um possível papel das prostaglandinas nos

efeitos renais das tiazidas. Mais próximo do presente contexto, indometacina potencia o

relaxamento do corpo cavernoso de coelho induzido pela acetilcolina (MINHAS et al,

2001), indicando a presença de produtos de ciclooxigenase relacionados com a

contração.

Isto seria compatível com nossa observação de que a indometacina causou um

deslocamento para a direita da curva das contrações induzidas por fenilefrina, sugerindo

fortemente a perda de um produto da ciclooxigenase indutor de contração. No entanto, a

hidroclorotiazida não potencializou as contrações induzidas por fenilefrina em tiras de

músculo liso do corpo cavernoso tratados com indometacina, descartando um possível

mecanismo baseado em produtos de ciclooxigenase como explicação da potenciação

induzida pela hidroclorotiazida.

Outro importante modulador endógeno da contratilidade do músculo liso é o NO

e a inibição de sua biossíntese é conhecida por aumentar as respostas contráteis em

muitas preparações de músculo liso (SAENZ DE TEJADA et al, 1988; 2004;

IGNARRO, 1989; AZADZOI; SAENZ DE TEJADA, 1991; JEREMY; MICHAÏLIDIS,

1998). No entanto, os diuréticos tiazídicos não potenciaram o relaxamento induzidos

por acetilcolina em aorta de ratos (ZHOU et al, 2008), indicando que a sua ação sobre

os vasos sanguíneos pode ser independente da liberação de NO.

Curiosamente, nos nossos experimentos, a hidroclorotiazida falhou em potenciar

as contrações induzidas pela fenilefrina na presença de L-NAME, um inibidor da síntese

de NO, o que sugere um envolvimento do NO nesta via de potenciação. No entanto, a

hidroclorotiazida não afetou nem o relaxamento induzido pela acetilcolina nem o

induzido por estímulo de campo elétrico na musculatura lisa do corpo cavernoso de

camundongo, afastando qualquer envolvimento na sua ação. Uma possível explicação é

 66

que o desvio para a esquerda da curva causada pela inibição por NO "supera" outros

mecanismos devido ao importante papel do NO como agente de relaxamento neste

tecido.

Estes resultados podem ser clinicamente importantes, já que a disfunção erétil

foi relatada após tratamento in vivo com a hidroclorotiazida (CHANG et al, 1991;

PRISANT et al, 1994; BURCHARDT et al, 2000; MOULIK; HARDY, 2003; BÖHM et

al, 2007; KLONER, 2007). A ereção peniana é uma resposta neurovascular complexa

que envolve sistemas adrenérgicos, colinérgicos e não adrenérgicos/não colinérgicos –

NANC (SAEZ DE TEJADA et al, 1988), que agem no sentido de aumentar o fluxo

sanguíneo para o pênis e diminuir o fluxo de saída. Acopladas a esta combinação de

vasodilatação e vasoconstrição, existem alterações equivalentes no músculo liso não

vascular do tecido peniano. Ativações de nervos simpáticos liberam noradrenalina para

induzir a contração da musculatura lisa do corpo cavernoso. Nervos parassimpáticos

medeiam o relaxamento do músculo liso trabecular, resultando em um aumento do fluxo

sanguíneo para os espaços trabeculares do corpo cavernoso (LUE; TANAGHO, 1987;

BURNETT et al, 1992; ANDERSSON; WAGNER, 1995). O NO liberado a partir de

terminações nervosas adrenérgicas/não colinérgicas e nitrérgicas e a partir do endotélio

é o mediador mais importante no relaxamento do músculo liso do corpo cavernoso

(LUE, 2000). Em contraste, a noradrenalina, liberada a partir de nervos adrenérgicos, é

o principal neurotransmissor da contração do corpo cavernoso (SAEZ DE TEJADA et

al, 1988). Assim, a disfunção erétil resultaria claramente de uma perturbação desse

equilíbrio entre mecanismos de contração e de relaxamento (ANDERSSON; WAGNER,

1995).

A disfunção erétil está relacionada com o uso de hidroclortiazida em pacientes e,

a partir da discussão anterior, é razoável supor que a contração do músculo liso não
 67

vascular do corpo cavernoso poderia comprometer os efeitos de vasodilatação e, assim,

enfraquecer a resposta erétil. As concentrações de hidroclortiazida alcançadas

terapeuticamente - cerca de 130 ng/mL após um comprimido 25mg (PATEL et al, 1984)

- estão próximas das que encontramos ser capazes de potencializar as contrações

induzidas por fenilefrina in vitro. Assumindo que camundongo e humano têm

biodisponibilidade e volume de distribuição de hidroclorotiazida semelhantes, as

concentrações plasmáticas alcançadas com o tratamento crônico dos camundongos deve

ter sido em torno de 20 µM. Nesta concentração in vitro, observou-se um aumento de

aproximadamente 50% do Emax. É importante notar que a disfunção erétil causada por

hidroclorotiazida é mais evidente com doses mais elevadas do diurético (PRISANT et

al, 1994; KLONER, 2007).

Outra observação importante foi a atenuação da contração induzida pela

fenilefrina causada pela amilorida. Normalmente, este diurético não é usado

clinicamente como um agente único e não há, portanto, dados disponíveis sobre seu

efeito na função erétil. No entanto, é usado rotineiramente em combinação com a

hidroclorotiazida e não existe qualquer evidência clínica de que esta combinação esteja

associada com a disfunção erétil. Curiosamente, o tratamento crônico de camundongos

com hidroclorotiazida + amilorida não mostrou ex vivo potenciação das contrações do

corpo cavernoso induzidas por fenilefrina.

Em conclusão, nossos resultados demonstram claramente que os diuréticos

tiazídicos in vitro e após a exposição in vivo, potencializam a contração da musculatura

lisa do corpo cavernoso de camundongos em concentrações alcançadas

terapeuticamente. Estes resultados podem explicar por que esta classe de diuréticos está

associada com a disfunção erétil no homem.

68
 69

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq Grant n ° 470099-2007-0) e PRONEX

(CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de

Janeiro) pelo apoio financeiro.

Ao Professor Gilberto de Nucci pela intensa colaboração que permitiu a realização deste

trabalho.
 70

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