Espectroscopia Molecular

Parte II

Claudimir Lucio do Lago

claudemi@iq.usp.br
 Lei de Beer
Lei de Beer-Lambert
Lei de Beer-Lambert-Bouguer

𝑇 = 10−𝜀⋅𝑏⋅𝑐 𝐴 = − log( 𝑇) 𝐴 =𝜀⋅𝑏⋅𝑐

Modelando a absorção de luz por um
corpo

I0
I0 I

𝐼
transmitância 𝑇=
𝐼0
9
𝑇= = 64.3%
14
 b

• A probabilidade de absorção de um fóton ao longo do

percurso depende de:
concentração • Número de centros absorventes (N)
depende da • Área de seção transversal de captura (a)
natureza química
da espécie • Probabilidade de ocorrer uma transição eletrônica (p)
parâmetro instrumental • Extensão do percurso óptico (b)
I0 I1 I2 I3 ... I

S S

d
a
0 b a

Se o diâmetro (d) da espécie for de 500 pm e o caminho ótico

for de 1 cm, então o número de fatias seria de 20 000 000 !!

n – número de centros absorventes por fatia

 na  p – probabilidade de ocorrer uma transição
Probabilidade de absorção em uma fatia infinitesimal: P(absorção)    p a – área de seção transversal de captura
 S 
S – área de incidência do feixe de luz
 I0 I1 I2 I3 ... I

Probabilidade de não absorção após

todas as camadas = Transmitância

252 fótons/s
𝑇=
1000 fótons/s

d
0 1 cm
 na 
P(absorção)    p
 S 
Qual a probabilidade de um fóton “sobreviver” a todas as camadas?
Se o diâmetro da espécie for de 500 pm, a
concentração do analito for de 100 µmol/L e 20000000
 1 
probabilidade de ocorrer uma transição for de 12/1000:  1    0.999999931220000000  0.252
 14530000 
1 12 1
𝑃(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜) ≅ 𝑃(𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜) ≅ T = 25.2%
170000 1000 14530000
 I0 I1 I2 I3 ... I

Série de Mercator:
𝑥2 𝑥3 𝑥4
𝑙𝑛 1 + 𝑥 = 𝑥 − + − +⋯
2 3 4
−1 < 𝑥 ≤ 1
d
0 b
numa fatia: 𝑛𝛼 1
𝑛𝛼 𝑥=− 𝑝 𝑥=− = −0.000000068
𝑃 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 = 𝑝 𝑆 14530000
𝑆
𝑛𝛼 somatória
𝑃 𝑛ã𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 = 1 − 𝑝
𝑆 -6.88231E-08 1 -6.88231E-08 -6.88231E-08
4.73662E-15 2 2.36831E-15 -6.88231E-08
após todas as fatias: -3.25989E-22 3 -1.08663E-22 -6.88231E-08
2.24356E-29 4 5.6089E-30 -6.88231E-08 𝑏 𝑛𝛼
𝑏 -1.54409E-36 5 -3.08818E-37 -6.88231E-08 𝑙𝑛 𝑇 = −𝑝
𝑇 = 𝑃 𝑛ã𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 𝑑 𝑑 𝑆
quando |x| é muito pequeno:
𝑏
𝑛𝛼 𝑑 𝑙𝑛 1 + 𝑥 = 𝑥
𝑇 = 1− 𝑝
𝑆
n – número de centros absorventes por fatia
𝑏 𝑛𝛼 p – probabilidade de ocorrer uma transição
𝑙𝑛 𝑇 = 𝑙𝑛 1 − 𝑝 𝑏 𝑛𝛼 a – área de seção transversal de captura
𝑑 𝑆 𝑙𝑛 𝑇 = − 𝑝
𝑑 𝑆 S – área de incidência do feixe de luz
d – espessura da fatia
 I0 I1 I2 I3 ... I

𝑆 𝑙𝑛 (𝑇)
d 𝑙𝑜𝑔 𝑇 =
𝑙𝑛 (10)
0 b
𝑉 =𝑑∙𝑆
𝑏 𝑛𝛼 𝑛
𝑙𝑛 𝑇 = −𝑝 𝑁
𝑑 𝑆 𝑐= 𝐴
𝑑∙𝑆 𝑑
𝑙𝑛 𝑇 = −𝑝𝛼𝑁𝐴 𝑏𝑐

𝑝𝛼𝑁𝐴
𝑙𝑜𝑔 𝑇 = − 𝑏𝑐
ln(10)
n – número de centros absorventes por fatia
absortividade molar: p – probabilidade de ocorrer uma transição
absorbância:
a – área de seção transversal de captura
𝑝𝛼𝑁𝐴 S – área de incidência do feixe de luz
𝜀= 𝐴 = 𝜀𝑏𝑐
ln(10) d – espessura da fatia
c – concentração (mol/L)
𝑙𝑜𝑔 𝑇 = −𝜀𝑏𝑐 𝐴 = −log(𝑇) V – volume
𝑁𝐴 – número de Avogadro
 Validade da Lei de Beer

• O meio deve ser homogêneo.

• A luz deve ser monocromática .
• Os centros absorvedores têm que atuar de forma individual.
• A luz incidente não pode alterar a espécie que está absorvendo.
I0 I
𝑏
𝑛𝛼 𝑑
𝐼
𝑇 = 1− 𝑝 𝑇=
𝑆 𝐼0

20000000
 1 
 1    0.999999931220000000  0.252
 14530000 
 I0 I1 I2 I3 ... I numa fatia: S
𝑛𝛼
𝑃 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 = 𝑝
𝑆
𝑛𝛼
𝑃 𝑛ã𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 = 1 − 𝑝
𝑆
𝑛𝑥 𝛼𝑥 𝑛 𝑦 𝛼𝑦
𝑃 𝑛ã𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟çã𝑜 = 1 − 𝑝𝑥 1− 𝑝𝑦
d 𝑆 𝑆
0 b
após todas as fatias:
𝑏 𝑏
𝑛𝛼 𝑑 𝑛𝑥 𝛼𝑥 𝑛𝑦 𝛼𝑦 𝑑
𝑇 = 1− 𝑝 𝑇= 1− 𝑝𝑥 1− 𝑝𝑦 𝐴 = ෍ 𝜀𝑖 𝑏𝑐𝑖 ou 𝐴 = ෍ 𝐴𝑖
𝑆 𝑆 𝑆 𝑖 𝑖

𝑏 𝑛𝛼 𝑏 𝑛𝑥 𝛼𝑥 𝑏 𝑛𝑦 𝛼𝑦
𝑙𝑛 𝑇 = 𝑙𝑛 1 − 𝑝 𝑙𝑛 𝑇 = 𝑙𝑛 1 − 𝑝𝑥 + 𝑙𝑛 1 − 𝑝𝑦
𝑑 𝑆 𝑑 𝑆 𝑑 𝑆
...
... n – número de centros absorventes por fatia
p – probabilidade de ocorrer uma transição
𝐴 = 𝜀𝑏𝑐 𝐴 = 𝜀𝑥 𝑏𝑐𝑥 + 𝜀𝑦 𝑏𝑐𝑦 a – área de seção transversal de captura
S – área de incidência do feixe de luz
d – espessura da fatia
𝑝𝛼𝑁𝐴 𝑝𝑦 𝛼𝑦 𝑁𝐴 c – concentração (mol/L)
𝑝𝑥 𝛼𝑥 𝑁𝐴 V – volume
𝜀= 𝜀𝑥 = 𝜀𝑦 =
ln(10) ln(10) ln(10) 𝑁𝐴 – número de Avogadro
Extração com solvente
 HA ⇌ H+ + A- pKa = 9,0

HA A-
1.0 1.0

99,9%
0.8 0.8
99%
fração molar

fração molar
0.6 0.6
90%
50%
0.4 0.4

0.2 0.2

0.0 0.0

6 8 10 12 6 8 10 12

pH pH

pH αHA αA- 𝛼
pKa 0,5 0,5 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔
1−𝛼
pKa – 1 0,909 0,091
pKa – 2 0,990 0,010 10𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎
pKa – 3 0,999 0,001 𝛼=
1 + 10𝑝𝐻−𝑝𝐾𝑎
Extração com solvente
coeficiente de distribuição

𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑜𝑐𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝑙𝑜𝑔𝐷 = 𝑙𝑜𝑔
𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 á𝑔𝑢𝑎
 Tensoativos aniônicos
• Formação de par iônico com azul de metileno e extração
em clorofórmio (l = 652 nm).

azul de metileno
sem com
tensoativo tensoativo

H2O
dodecil sulfato de sódio
CHCl3

O método não é específico para um determinado tipo de tensoativo.

 Barbituratos em plasma

barbital

fenobarbital

pentobarbital
 Barbituratos em plasma

barbital fenobarbital pentobarbital

• Todos possuem um mesmo grupo cromóforo.

• Procedimento:
• Os barbituratos são extraídos do plasma com CHCl3.
• Retornam ao meio aquoso com NaOH 0,45 mol/L (pH ~ 13)
• A absorbância é medida a 260 nm (ApH13)
• O pH é reduzido para 10 com NH4Cl
• A absorbância é novamente medida (ApH10). Os barbituratos não
absorvem a 260 nm em pH 10.
• Abarbituratos = ApH13 – ApH10’
A    i bci
i
Efeito da diluição

A1  bc1
v A0  bc0

V0 V0  v
Se a absorbância for medida após a diluição (A1),
como saber a absorbância original?

c0 V0  c1 V0  v A0  bc0 A0  bc1

V0  v  A0 
V0  v  A
1
V0 V0
c0  c1
V0  v 
V0

• Procedimento:
•
•
...
A absorbância é medida a 260 nm (ApH13) Abarbituratos  ApH 13 
V
amostra  vNH 4Cl A
pH 10
• O pH é reduzido para 10 com NH4Cl Vamostra
• A absorbância é novamente medida (ApH10). Os
barbituratos não absorvem em pH 10.
 Determinação de ferro e cobre

• Hexacianorrutenato (II), Ru(CN)62-, forma um complexo púrpura

com Fe3+ e verde com Cu2+.
Fe3+ Cu2+ A
ε550 nm / M-1 cm-1 9970 34 0,183

84 856 0,109 𝐴550 = 𝜀𝐹𝑒_550 𝑏𝑐𝐹𝑒 + 𝜀𝐶𝑢_550 𝑏𝑐𝐶𝑢

ε396 nm / M-1 cm-1
𝐴396 = 𝜀𝐹𝑒_396 𝑏𝑐𝐹𝑒 + 𝜀𝐶𝑢_396 𝑏𝑐𝐶𝑢
• Um excesso de Ru(CN)6 foi adicionado a uma amostra.
2-

• As absorbâncias foram medidas em uma cela de 1,0 cm de

caminho óptico. 0.183 = 9970𝑐𝐹𝑒 + 34𝑐𝐶𝑢

0.109 = 84𝑐𝐹𝑒 + 856𝑐𝐶𝑢

𝐴 = 𝜀𝑏𝑐
Determinação de
púrpura de metacresol
pH

HIn In-
434 nm 578 nm

In−
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾2 + 𝑙𝑜𝑔
HIn
𝑝𝐾2 = 8.32

𝐴1 = 𝜀𝐻𝐼𝑛1 𝑏 HIn + 𝜀𝐼𝑛1 𝑏 In−

𝐴2 = 𝜀𝐻𝐼𝑛2 𝑏 HIn + 𝜀𝐼𝑛2 𝑏 In−

Desvios da Lei de Beer
• Desvios reais (fundamentais)
• Mudanças do índice de refração
• Desvios químicos
• Formação de dímeros
faixa linear
• Equilíbrio ácido-base
• Complexação
• Desvios instrumentais
• Radiação policromática
• Luz espúria
100 µM
Formação de dímeros

10 µM

azul de metileno
Verde de indocianina (ICG)

𝐴 = 𝜀𝑏𝑐

𝜀
 Por que luz monocromática?
filtro cubeta
I0 ' I'
detector TA absorbância medida (Am)
I0" I"
I ' I "  I ' I " 
Tm  Am   log  
I 0 ' I 0 " I '
 0 0 I "

I
T  10 A I '  10 A' I 0 ' I "  10 A" I 0 "
I0

 I 0 '10 A'  I 0 "10 A"   I 0 '10 'bc  I 0 "10 "bc 

Am   log   A'   ' bc A"   "bc Am   log  
 I ' I "  I 0 ' I 0 "
0 0  
filtro cubeta
I0 ' I'
detector TA absorbância medida (Am)
I0" I"

 I 0 '10 'bc  I 0 "10 "bc 

Am   log  
 I 0 ' I 0 " 

Am   ' bc

• Quando I0”  0 (luz monocromática)

• Quando c  0 
• Quando ”  ’
 σ𝜆 𝐼0𝜆 10−𝜀𝜆 𝑏𝑐
𝐴𝑚 = −log
σ𝜆 𝐼0𝜆

• A lei de Beer será válida:

• Se a concentração for baixa
• Se a intensidade em um segundo comprimento de onda for zero (I0” = 0)  luz
monocromática
• Se na região do espectro detectado a absortividade molar for constante (” = ’) 
luz suficientemente monocromática
O processo de absorção de
radiação
Radiação eletromagnética e processos atômicos e
moleculares

energia de dissociação de
ligação química
transições eletrônicas
vibração molecular
rotação molecular
 Moléculas vibram e rodam

Deformação simétrica
Estiramento simétrico Estiramento assimétrico
no plano (scissoring)

https://youtu.be/b0IbXG0hnOk

https://youtu.be/3RqEIr8NtMI

Deformação assimétrica Deformação simétrica Deformação assimétrica

no plano (rocking) fora do plano (wagging) fora do plano (twisting)
Absorção Atômica

Espectro de absorção atômica

absorbância linhas de absorção

285 330 590

comprimento de onda / nm

Diagrama de energia para transições do

elétron de valência do átomo de sódio
Absorção Molecular

transição
eletrônica +
vibracional +
transição rotacional
eletrônica +
vibracional
transição
eletrônica

transição
transição
vibracional +
vibracional
rotacional
Espectro molecular (fase gasosa e baixa pressão)

10000 S2
250 nm
população absorvedora

8000

6000

4000 S1
2000 350 nm

0
200 250 300 350 400
comprimento de onda / nm
S0
Quando os vizinhos interferem...
3p 3p 3p 3p
energia

590 nm 590 nm 590 nm 590 nm

3s 3s 3s 3s

Na Na Na Na

3p
3p 3p
3p
• Processos de absorção de
energia

590 nm 591 nm 589 nm 590 nm fótons de energia

diferentes (≠λ).
3s 3s 3s 3s

Na Na Na Na
 10000
vácuo 400
1

população absorvedora
população absorvedora

8000

6000

4000 200
Espectro molecular
2000

0 0
(efeito do ambiente)
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
comprimento de onda / nm comprimento de onda / nm

2 3
400 200
população absorvedora

população absorvedora
200 100

0 0
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
comprimento de onda / nm comprimento de onda / nm Simulação com ~35000 moléculas
4 100 5 a diferentes pressões
população absorvedora

população absorvedora

100 80

60

50 40

20

0 0
200 250 300 350 400 200 250 300 350 400
comprimento de onda / nm comprimento de onda / nm
 Efeito do solvente

tetrazina
 Desativação do estado excitado

A – absorção
singleto tripleto
R – relaxação

CI – conversão interna

F – fluorescência

CIS – cruzamento intersistemas

P – fosforescência

CE – conversão externa: transferência de energia vibracional e rotacional para energia

translacional (energia cinética)  aumento de temperatura do meio
Relaxação e Fluorescência

10-15 10-11 10-10 10-5

tempo / segundos
Rendimento Quântico de Fluorescência
Fluorescência:

S  S  h
*  
d S*
 
 k F S *
dt
kF
F 
Processos não radiativos: k F  knr

S  S  Ek
*  
d S*
 
 knr S *
dt

• Favorecem a fluorescência:
• maior rigidez da molécula (diminuição da conversão interna)
• líquidos de alta viscosidade ou meio sólido (diminuição da
conversão externa)
Fluorimetria
 Fluorescência e Concentração
• Só há fluorescência, se um fóton for absorvido.
circuito
potência absorvida: PA  P0  P eletrônico

fluorescência total: FT   F P0  P 

fluorescência detectada: F  pc  F P0  P  P0 P

onde
ΦF é o rendimento quântico de fluorescência (0,0 ... 1,0)
pc é a fração de cobertura do detector (0,0 ... 1,0)

P
T
F  K ' P0  P 
P0
P  P010 A 
F  K ' P0 1  10 A 
T  10 A
Fluorescência e Concentração

F  K ' P0 1 10 A  Fluorescência não varia linearmente com a concentração!


xn x 2 x3 x 4
10 z  e 2,3 z função exponencial: e    1  x     
x

n  0 n! 2! 3! 4!


F  K ' P0  2,3 A 
 2,3 A  2,3 A  2,3 A
2

3

4

 
 2! 3! 4! 

lim F  2,3K ' P0 A Para valores baixos de absorbância (A < 0,05)

A 0

F  2,3 pc  F P0bc F  K c
Fluorescência varia linearmente com concentração
somente para baixas concentrações!!!
Fluorescência direta

S2

S1
λ2
Quinina

S0 grupo cromóforo
λ3 λ1 λ3 λ1 λ2 grupo fluoróforo
Fluorimetria indireta

l = 470 nm

l = 500 nm

detector

maior rigidez da molécula

Método dos mínimos quadrados
 1.0
4 𝐴 𝑐 = 𝑎𝑐
0.8

absorbância
0.6
2 erro (e3)

0.4
3
𝑒32 = 𝑎𝑐3 − 𝐴3 2

0.2
1

0.0
0 2 4 6 8 10

concentração

2 2 2 2
𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑎𝑐1 − 𝐴1 + 𝑎𝑐2 − 𝐴2 + 𝑎𝑐3 − 𝐴3 + 𝑎𝑐4 − 𝐴4
𝑒𝑖 pode ser positivo ou negativo

𝑒𝑖2 será sempre positivo

𝑁 𝑁 Qual o valor de a que
será sempre positivo e pode ser usada
෍ 𝑒𝑖2 ෍ 𝑎𝑐𝑖 − 𝐴𝑖 2 minimiza o erro total
como medida de “ajuste” da função
𝑖=1 𝑖=1 acumulado?

𝐴 = 𝜀𝑏𝑐  𝐴 𝑐 = 𝑎𝑐
Modelo genérico: 𝑦 𝑥 = 𝑎𝑥
 1.0
4 𝑦 𝑥 = 𝑎𝑥
0.8
𝑁
0.6 2
2 erro (e3) 𝑔 𝑎 = ෍ 𝑎𝑋𝑖 − 𝑌𝑖
y
0.4 𝑖=1
3
O erro acumulado g é
0.2
uma função de a.
1
0.0 O menor valor de
0 2 4 6 8 10
x erro acumulado será
aquele cujo a
0.7
corresponde à
400
0.6 derivada zero.
0.5
300
0.4
200
0.3

g
g

𝑑𝑔(𝑎)
100 0.2 =0
𝑑𝑎
0.1
0
0.0
0.0 0.4 0.8 1.2 0.40 0.42 0.44 0.46 0.48 0.50
a a
 𝑁
𝑁
2
𝑔 𝑎 = ෍ 𝑎𝑋𝑖 − 𝑌𝑖
෍ 𝑎𝑋𝑖 2 − 𝑋𝑖 𝑌𝑖 = 0
𝑖=1
𝑖=1

𝑑𝑔(𝑎)
=0
𝑑𝑎 𝑁 𝑁

෍ 𝑎𝑋𝑖 2 − ෍ 𝑋𝑖 𝑌𝑖 = 0
𝑁 𝑖=1 𝑖=1
𝑑𝑔(𝑎)
= ෍ 2 𝑎𝑋𝑖 − 𝑌𝑖 𝑋𝑖
𝑑𝑎
𝑖=1
𝑁 𝑁

𝑁 𝑎 ෍ 𝑋𝑖 2 − ෍ 𝑋𝑖 𝑌𝑖 = 0
෍ 2 𝑎𝑋𝑖 2 − 𝑋𝑖 𝑌𝑖 = 0 𝑖=1 𝑖=1

𝑖=1

𝑁 σ𝑁
𝑖=1 𝑋𝑖 𝑌𝑖
2
𝑎= 2
2 ෍ 𝑎𝑋𝑖 − 𝑋𝑖 𝑌𝑖 = 0 σ𝑁
𝑖=1 𝑋𝑖
𝑖=1
 σ𝑁
𝑖=1 𝑋𝑖 𝑌𝑖
𝑎= 2
σ𝑁
𝑖=1 𝑋𝑖

X Y X2 XY

2.00 0.18 4.00 0.36

4.00 0.45 16.00 1.80

6.00 0.43 36.00 2.58 verdadeira (0.1)

8.00 0.84 64.00 6.72 1.0
1.0

soma 120.00 11.46

0.8
0.8

absorbância
obtido por mínimos

absorbância
11.46 0.6
0.6
𝑎= quadrados (0.0955)
120.00 0.4
0.4

0.2
0.2
𝑎 = 0.0955
0.0
0.0
0
0 2
2 4
4 6
6 8
8 10
10

concentração
E se o modelo corresponder a uma reta completa?

𝑦 𝑥 = 𝑎𝑥 + 𝑏

𝑔 𝑎, 𝑏 = ෍ 𝑎𝑋𝑖 + 𝑏 − 𝑌𝑖 2

𝑖=1

𝜕𝑔
=0
𝜕𝑎

𝜕𝑔
=0
𝜕𝑏
 E se o modelo corresponder a um polinômio?

𝑦 𝑥 = 𝑎𝑥 2 + 𝑏𝑥 + 𝑐 risco de sobreajuste (overfitting)!!!

𝐴 = −1.1 + 1.013𝑐 − 0.216𝑐 2 + 0.015𝑐 3
𝑁 1.0
2
𝑔 𝑎, 𝑏, 𝑐 = ෍ 𝑎𝑋𝑖 2 + 𝑏𝑋𝑖 + 𝑐 − 𝑌𝑖
0.8
𝑖=1

absorbância
0.6

𝜕𝑔
=0 0.4
𝜕𝑎
0.2

𝜕𝑔
=0 0.0
𝜕𝑏 0 2 4 6 8 10

concentração
𝜕𝑔
=0
𝜕𝑐
 50

fluorescência / u.a.
40

30

20

10

0
0 1 2 3 4 5
concentração / mmol L-1

50 50
fluorescência / u.a.

fluorescência / u.a.
40 40

30 30

20 𝑦 = 9.20𝑥 20
𝑦 = 8.73𝑥 + 1.73
10 10

0 0
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
concentração / mmol L-1 concentração / mmol L-1
 100 100
90 90
fluorescência / u.a.

fluorescência / u.a.
80 80
70 70
60 60
50 50
40 40 𝑦 = 𝑏 1 − 10−𝑎𝑥
30 30
20 20
10 10
0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
concentração / mmol L-1 concentração / mmol L-1

100 100
90 90
fluorescência / u.a.

fluorescência / u.a.
80 80
70 70
60 60
50 50
40 𝑦 = 𝑎𝑥 40
30 30
𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏
20 20
10 10
0 0
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
concentração / mmol L-1 concentração / mmol L-1
Calibração Externa
curva de calibração

emissão de
fluorescência
água
branco

padrão 𝑐𝑓
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

amostra concentração do analito / mg/L

𝑉𝑓
𝑉𝑎
𝑉𝑓
𝑐𝑎 = 𝑐𝑓
𝑉𝑎