Laboratórios de Engenharia Biomédica

Docente responsável: Susana Olhero

Grânulos de hidroxiapatite como

substituto ósseo

Bárbara Martins de Campos

NºMec.:99539

Mestrado em Biomaterias e Dispositivos Biomédicos

2023-2024
Abstract

Os ossos humanos encontram-se em constante renovação, porém quando um

defeito ósseo é muito extenso este processo torna-se muito limitado e surge a necessidade
de um tratamento. Atualmente, a HA é um material muito usado para reparação de
defeitos ósseos, devido à sua capacidade de estimular a regeneração óssea. Neste sentido,
nesta atividade laboratorial pretende-se formar e caracterizar grânulos de hidroxiapatite
(HA) para regeneração óssea. Para tal, foram preparadas soluções de alginato e de cloreto
de cálcio e uma suspensão de HA que através de um processo de pulverização da fase
líquida, seguida de cristalização por secagem ou arrefecimento. Alguns destes grânulos
foram então sinterizados a 950ºC e 1100ºC. Foram efetuadas várias análises de forma a
avaliar diversos parâmetros acerca dos grânulos. Uma distribuição granulométrica foi
realizada a partir de um método de peneiração e observou-se que os grânulos sinterizados
a 1100ºC possuem um tamanho menor. A morfologia dos grânulos foi estudada através
da lupa e por microscopia eletrónica de varrimento, mas os dados obtidos não foram muito
conclusivos. Realizou-se também uma difração de raios-X (DRX) que permitiu
identificar uma mudança de fases nos grânulos sinterizados a ambas as temperaturas.
Índice
Abstract .......................................................................................................................................... 2
Introdução .................................................................................................................... 4
Composição e estrutura óssea ................................................................................................. 5
Remodelação óssea................................................................................................................... 7
Fosfatos de cálcio: TCP e HA ................................................................................................. 8
Hidroxiapatite: aplicações e técnicas de fabrico dos grânulos .......................................... 10
Técnicas de fabrico de grânulos de HA ............................................................................... 11
Reação crosslinking alginato de sódio e cloreto de cálcio ................................................... 12
Procedimento Experimental .......................................................................................... 13
Caraterização da matéria-prima.......................................................................................... 13
Distribuição granulométrica .............................................................................................................. 13
DRX................................................................................................................................................... 13
Preparação dos grânulos ....................................................................................................... 13
Preparação de suspensão de HA........................................................................................................ 13
Preparação da solução de alginato de sódio ...................................................................................... 14
Preparação da solução de cloreto de cálcio ....................................................................................... 14
Reologia da suspensão....................................................................................................................... 14
Formulação dos grânulos ...................................................................................................... 15
Reologia da suspensão ........................................................................................................... 14
Caracterização dos grânulos ................................................................................................. 15
Distribuição granulométrica do pó de HA ........................................................................................ 15
Distribuição granulométrica dos grânulos de HA ............................................................................. 15
Morfologia dos grânulos ....................................................................................................... 16
Observação à lupa ............................................................................................................................. 16
Microscópio eletrónico de varrimento (MEV) .............................................................................. 16
DRX (Técnica de Difração de Raio-X) ............................................................................................. 16
Análise e Discussão dos Resultados .............................................................................. 17
Análise ao pó de HA .............................................................................................................. 17
Distribuição granulométrica .............................................................................................................. 17
Análise DRX ..................................................................................................................................... 18
Caraterização reológica da suspensão ................................................................................. 19
Distribuição granulométrica dos grânulos .......................................................................... 20
Análise à lupa ......................................................................................................................... 20
Análise SEM ........................................................................................................................... 22
DRX......................................................................................................................................... 24
 1. Introdução

As patologias no tecido ósseo afetam milhões de pessoas em todo o mundo,

afetando a qualidade de vida da população em questão. Defeitos ósseos ortopédicos e
dentários são problemas comuns que podem surgir devido a traumas, infeções, neoplasias,
ou simplesmente como parte do processo natural de envelhecimento.

De facto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de tratamentos

novos, eficazes e compatíveis para lesões ósseas. Prevê-se que os números de fraturas
relacionadas à idade aumentem nos Estados Unidos de 2,1 milhões em 2005 para mais de
3 milhões de fraturas em 2025, considerando apenas a população idosa/envelhecida em
risco. Na Europa, estima-se um aumento de 28% no número anual de fraturas entre 2010
e 2025, com um aumento absoluto de 3,5 milhões para 4,5 milhões de lesões,
respetivamente [1].

Normalmente, a reparação óssea é um processo eficaz, porém quando o defeito

ósseo é extenso a capacidade de regeneração é muito reduzida. Por este motivo, surgiram
inúmeros tratamentos, tais como: implantação de próteses, preenchimento de defeitos
com hidrogéis, micropartículas, bem como scaffolds [2]. A fixação de próteses revela ser
um processo crítico, dado que pode ocorrer a rejeição/incompatibilidade da prótese pelos
tecidos adjacentes. Desta maneira, a engenharia de tecidos mostra ser a chave para o
desenvolvimento de metodologias eficazes no que diz respeito ao substituto ósseo ideal.
Para tal é necessário o desenvolvimento de biomateriais promissores que possam ser
usados para este fim [3].
 1.1. Composição e estrutura óssea

O osso é um biomaterial estruturalmente complexo e dinâmico, superando todos

os outros materiais biocompatíveis em termos de resistência e tenacidade [4]. Além de
conferirem estrutura e suporte ao corpo, os ossos permitem mobilidade, protegem vários
órgãos, produzem células sanguíneas e armazenam minerais. Estas funções são possíveis
devido aos tecidos constituintes dos ossos.

O tecido ósseo é formado por células e uma matriz extracelular orgânica,

destacando-se pelo alto conteúdo de matérias inorgânicas em combinação com a matriz
orgânica. Os ossos são compostos por cerca de 70% de material mineral e 30% de material
orgânico. A componente inorgânica inclui cristais de cálcio e fósforo, conhecidos como
hidroxiapatite, além de alguns iões como sódio, flúor e magnésio [5].

Tabela 1. Composição óssea de adultos em percentagem [5]

A ação conjunta destes minerais confere ao osso maior dureza e rigidez. Por outro
lado, a componente orgânica consiste principalmente em fibras de colagénio, com uma
quantidade menor de glicoproteínas e proteoglicanos, proporcionando flexibilidade e
elasticidade. A composição óssea não é constante, pelo que pode variar ao longo do
tempo, sendo influenciada por fatores como a localização anatómica, idade e
metabolismo [6].
 Figura 1. Ilustração em escala intermédia do osso [7]

Macroscopicamente, o tecido ósseo é composto pelas seguintes camadas:

periósteo, membrana que reveste toda a superfície externa do osso, com exceção da região
da cartilagem e dos pontos de ligação dos tendões; osso cortical; endósteo, uma
membrana fina localizada entre osso cortical e osso trabecular; osso trabecular ou
esponjoso. a presença dessas camadas pode ser observada na figura 1.

O osso cortical, também conhecido como osso compacto, é o tipo de tecido ósseo
que forma a camada externa e mais densa dos ossos, constituindo 80% da sua massa total.
Este é caracterizado pela sua estrutura compacta e organização em unidades estruturais
designadas ósteons, que proporcionam proteção e rigidez mecânica aos ossos. Os canais
de Havers atravessam o centro do ósteon e permitem que as fibras nervosas e capilares
sanguíneos os atravessem e abasteçam o osso dos nutrientes que necessita.

O osso trabecular, também conhecido como osso esponjoso, está encapsulado pelo
osso cortical através do endósteo que forma a barreira entre estes tecidos ósseos. É mais
fraco e menos denso, mas mais flexível do que o osso cortical. O osso trabecular constitui
20% da massa total do sistema esquelético, mas tem aproximadamente uma área de
superfície dez vezes maior do que o osso cortical. Este tecido ósseo consiste numa rede
porosa, altamente vascularizada, organizada em unidades estruturais designadas
trabéculas, que são responsáveis pela estabilidade estrutural do osso e absorção de energia
(mecânica) [8].
 a) b)

b)

Figura 2. a) Curva tensão-deformação do osso cortical e trabecular; b) curva tensão-deformação (cerâmicas, metais e
polímeros [9]

Os ossos trabeculares e corticais são materiais anisotrópicos, o que significa que

as suas propriedades mecânicas são dependentes da direção. Esta característica permite
uma adaptação eficiente a cargas específicas que atuam em várias direções no corpo,
melhorando o seu desempenho para funções especificas.

Comparando as figuras X e Y observa-se uma relação de semelhança nas curvas

de tensão-deformação dos tecidos ósseos e outros materiais, nomeadamente as cerâmicas,
metais e polímeros. Nomeadamente, verifica-se que o osso cortical apresenta um
comportamento semelhante ao material cerâmico e o osso trabecular ao material
polimérico. A partir desta análise pode-se determinar que o tecido cortical é rígido, porém
frágil, enquanto o tecido trabecular é menos rígido, mais elástico e resiste bem a cargas
compressivas.

1.2. Remodelação óssea

Os ossos estão em constante renovação, contribuindo para a reparação de defeitos

nas microestruturas e adaptando a sua estrutura de maneira a corresponder a novas e/ou
diferentes necessidades mecânicas. A renovação contínua do osso caracteriza-se pela
reabsorção e, posterior formação de tecido ósseo com o auxílio de células especializadas.
Este processo tem a designação de remodelação óssea, onde a renovação do tecido ocorre
desde a superfície externa do osso (periósteo) progredindo para o interior, o endósteo.
Inicialmente, há uma destruição ativa ou reabsorção da matriz extracelular óssea
mineralizada preexistente pelos osteoclastos. Posteriormente, há a formação de novo osso
pelos osteoblastos. Estes eventos celulares ocorrem diariamente em alternância em todos
os ossos desde o nascimento até a morte [10].
 Quando há um aumento da reabsorção óssea que não é compensado por um
aumento proporcional de formação óssea, observa-se um desequilíbrio na remodelação
óssea. Consequentemente, a massa óssea diminui, e o risco de fraturas após um impacto
mínimo aumenta. Associado a esse desequilíbrio, surgem algumas doenças ósseas como
é exemplo a osteopenia que indica uma redução da massa óssea (ossos mais porosos e
frágeis). Se não for tratada, pode evoluir para osteoporose, caracterizada por uma
diminuição mais significativa da densidade óssea, acompanhada por uma alteração da
geometria óssea e maior risco de fraturas. A prevenção e o monitoramento são essenciais
para a saúde óssea ao longo do tempo [11], [12].

Alguns dos materiais usados para substituição e regeneração óssea incluem

polímeros, metais e cerâmicas. Para aplicações ortopédicas, o aço, o titânio e suas ligas
são os materiais metálicos preferidos para implantes. No entanto, as suas propriedades
mecânicas geralmente têm uma correspondência inadequada com as dos ossos. Isso pode
levar à rutura do implante devido à deslocação. Por outro lado, os polímeros geralmente
não oferecem resistência mecânica suficiente para tais aplicações e frequentemente estão
associados à "reação do corpo estranho". Além disso, os polímeros degradam-se por
hidrólise, e um ambiente de pH ácido pode ser criado, o que pode intensificar a
osteoclastogénese em detrimento da osteoblastogénese.

1.3. Fosfatos de cálcio: TCP e HA

Nesta vertente, os conceitos de osteocondução e osteointegração ganharam
visibilidade ao abordar a compreensão da interação entre biomateriais e tecidos vivos.
Uma pesquisa extensiva resultou no desenvolvimento de uma nova geração de
biomateriais que combina a reabsorção e bioatividade. Um dos materiais pertencentes a
esta nova geração são os fosfatos de cálcio.
 Tabela 2. Propriedades mecânicas de diferentes materiais [13]

Desta forma, devido à sua abundância no tecido ósseo endógeno, os fosfatos de cálcio
têm vindo a emergir como um biomaterial adequado para engenharia de tecidos [14].

Como o nome indica, os fosfatos de cálcio são minerais compostos por catiões de
cálcio e aniões de fosfato. No geral, estes possuem caraterísticas adequadas, como
rugosidade, solubilidade e porosidade que lhes conferem propriedades de osteoindução e
osteocondução.

Contudo nem todos os fosfatos de cálcio apresentam as mesmas propriedades, e é

imperativo escolher um fosfato de cálcio com caraterísticas físicas e químicas adequadas
para cada aplicação em específico [15].

Existem vários tipos de fosfato de cálcio, porém apenas o trifosfato de cálcio e a

hidroxiapatite apresentam caraterísticas desejáveis como biomateriais para medicina
regenerativa.

O trifosfato de cálcio apresenta um rácio Ca/P de 1.5 e pode ser subdividido em 2

fases que diferem na sua estrutura cristalina: α e β. O α-TCP apresenta um sistema de
cristalização monoclínico enquanto o β-TCP apresenta um sistema romboédrica o que o
garante uma estrutura mais estável e uma maior taxa de biodegradação. A estrutura nano-
porosa de β-TCP permite uma boa adesão das células o que ajuda a promover a
proliferação de células osteoprecursoras. Estas caraterísticas tornam o β-TCP muito
pretendido para produzir cimentos ósseos com fins regenerativos.

A hidroxiapatite é outro tipo de fosfato de cálcio que tem sido amplamente

estudada para a regeneração do tecido ósseo devido à sua semelhança química e biológica
com as fases inorgânicas dos ossos [16]. Esta biocerâmica representa mais de 50% dos
ossos, enquanto o colagénio e a água constituem cerca de 20% e 10%, respetivamente. A
associação da HA com fibras de colagénio confere um aumento na rigidez e na resistência
do tecido ósseo [17].

A HA de ocorrência natural possui cristalografia definida (estrutura hexagonal)

com a fórmula química de Ca10(PO4)6(OH)2, equiparando-se à hidroxiapatite sintética
que é, igualmente, osteocondutiva e termodinâmicamente estável, tendo sido também
utilizada para a substituição de tecidos ósseos e aplicações de reconstrução. Além disso,
a HA mostra-se promissora devido às seguintes características: excelente
biocompatibilidade (pouca reação tecidual), ausência de toxicidade local ou sistémica,
bioatividade (estabelecendo ligações químicas entre o material e o tecido ósseo) e
osteocondutividade (favorece o desenvolvimento ósseo, fazendo que ocorra sobre a
superfície ou através dos poros). Estas propriedades tornam a hidroxiapatite o melhor
fosfato de cálcio para regeneração óssea.

1.4. Hidroxiapatite: aplicações e técnicas de fabrico dos

grânulos
Segundo a base de dados Scopus, o número de publicações relacionadas à
hidroxiapatite e “aplicações biomédicas” mais que dobrou entre 2012 (99) e 2021 (247)
[18]. A área da medicina regenerativa tornou-se um tema amplamente reconhecido nas
últimas décadas, especialmente no que diz respeito a este biomaterial [19].
Atualmente, a HA é utilizada para reparo ósseo e regeneração óssea na forma de grânulos,
blocos e suportes, por si só ou como compósito com polímeros ou outras cerâmicas ou
como revestimentos em implantes ortopédicos ou dentários [20]. Eles estão
comercialmente disponíveis para uso em reparo, substituição e aumento ósseo e como
suportes em engenharia de tecidos para regeneração óssea [21].
 Recentes avanços têm sido feitos para o desenvolvimento de formulações
injetáveis para o preenchimento de defeitos ósseos, visto que estes podem ser aplicados
através de técnicas pouco invasivas. As formulações podem consistir essencialmente
numa pasta homogénea, normalmente denominada de cimento ou podem ser compostas
por micro ou nano partículas em suspensão, denominadas grânulos.

Os cimentos são menos invasivos, tendo como vantagem uma melhor adaptação
à geometria do defeito, do que os materiais cerâmicos, como os grânulos que são inseridos
como sólidos. No entanto, estes cimentos possuem baixa resistência mecânica, tornando-
se um bloco de material dentro do corpo, ao contrário dos grânulos. Para além disso, a
aplicação de grânulos, permite uma melhor circulação de células, devido ao espaço
existente entre eles, o que promove uma melhor regeneração óssea.

1.5. Técnicas de fabrico de grânulos de HA

O processo de granulação envolve uma série de processos fisico-químicos e

mecânicos em que o produto final são partículas ou grânulos com as caraterísticas
desejadas. As técnicas mais conhecidas para granulação de hidroxiapatite são:

(1) Pulverização de fase líquida, seguida de cristalização por secagem ou arrefecimento;

(2) Reação química numa mistura vapor-líquido;

(3) Reação química numa mistura vapor-líquido-sólido;

(4) Deposição de vapor com formação de grânulos sólidos;

(5) Aglomeração de pós na presença de fase líquida, seguida por peletização e

consolidação dos aglomerados aquando da remoção da fase líquida

(6) Prensagem de uma fase sólida, seguida de moagem de modo a se obterem grânulos de
tamanho pretendido
 Nesta atividade laboratorial, o método utilizado foi a pulverização de fase líquida,
seguida por cristalização por secagem ou arrefecimento, pois este permite a formação de
grânulos esféricos com um intervalo de diâmetros abrangente [5].

1.6. Reação crosslinking alginato de sódio e cloreto de cálcio

O alginato de sódio é um polímero aniónico natural de baixo custo com estrutura
linear, biodegradável, biocompatível, que proporciona resistência e flexibilidade ao
tecido, podendo ser utilizado em sistemas de entrega de fármacos (drug delivery systems)
por possuir propriedades gelificantes devido à sua capacidade de formar moldes
gelatinosos na presença de iões Ca2+ num processo designado crosslinking [22].

O processo de crosslinking envolve a formação de ligações iónicas entre os grupos

carboxílicos (-COOH) presentes no alginato de sódio e os iões de cálcio (Ca2+)
provenientes do cloreto de cálcio. A equação química simplificada para a reação de
crosslinking entre o alginato de sódio e o cloreto de cálcio está presente na figura 3.

Nesta reação, os iões de cálcio (Ca2+) substituem os iões de sódio (Na+) no

alginato, formando um gel tridimensional, em que os iões de cálcio encontram-se no meio
de 2 cadeias anti-parelas de alginato, numa estrutura semelhante a uma “caixa de ovos”.

O crosslinking do alginato com cloreto de cálcio melhora as propriedades mecânicas,

particularmente a resistência à tração, rigidez e durabilidade [23].

Figura 3. Reação de crosslinking entre alginato de sódio e cloreto de cálcio. [23]

 2. Procedimento Experimental
A formulação dos grânulos requere a preparação de uma suspensão de HA e de
soluções de alginato de sódio e cloreto de cálcio. Nas seguintes secções, encontram-se
descritos todos os materiais e procedimentos necessários para a sua preparação.

2.1. Caraterização da matéria-prima

Para a preparação dos grânulos de hidroxiapatite é necessário preparar a suspensão
de hidroxiapatite, uma solução de alginato de sódio e uma solução de cloreto de cálcio.
Nesta secção são descritos os métodos de preparação das soluções necessárias para a
formação dos grânulos de hidroxiapatite e posterioremente, como estes se caracterizaram.

2.1.1. Distribuição granulométrica

Determinou-se a distribuição granulométrica do pó inicial, utilizando um

distribuidor de partículas da marca COULTER, modelo LS230, em meio húmido.

2.1.2. DRX

Para a caracterização da microestrutura da hidroxiapatite, utilizou-se a técnica de

difração de raios-X (DRX), através do aparelho Panalytical X’Pert PRO 3 com 10º < 2θ
< 60º. A identificação foi feita recorrendo às referências indicadas na folha de resultados.

2.2. Preparação dos grânulos

2.2.1. Preparação de suspensão de HÁ

Pretende-se obter uma suspensão de hidroxiapatite em que 50 % do seu volume

seja sólido. Tendo em conta que a densidade da hidroxiapatite é 3,16 g/cm3 conseguimos
calcular a massa de hidroxiapatite a adicionar de forma a perfazer 30 mL de volume total:

15 mL de sólidos → 3,16 x 15 = 47,4 g de hidroxiapatite

Adicionou-se 15 mL de água à massa medida de HA e posterioremente adicionou-
se a o dispersante Targon 1128. A massa de Targon pode ser calculada a partir da massa
total de sólidos.

47,4 g x 0,008 = 0,3792 g de Targon

 Sendo que a solução de Targon é 36 % (w/v) a partir da massa podemos calcular
o volume a adicionar:

0,3792
= 1,053 mL
0,36

2.2.2. Preparação da solução de alginato de sódio

Foram dissolvidas 3 g de alginato de sódio num balão volumétrico de 100 mL de

forma a obter uma solução 3 % (w/v). Esta solução foi depois colocada sobre agitação
numa placa de agitação com aquecimento a 40º C.

2.2.3. Preparação da solução de cloreto de cálcio

Pretende-se obter uma solução de cloreto de cálcio 1M com 250 mL. Sabendo que
a massa molar do cloreto de cálcio é 110,984 g/mol, temos que:

n = c x V = 1 x 0,250 = 0,250 mol

m = n x M = 0,250 x 110,984 = 27,746 g

Dissolveu-se então 27,746 g de cloreto de cálcio em 250 mL de água.

2.3. Reologia da suspensão

Antes da caraterização dos grânulos, é importante caraterizar a suspensão de HA
que irá dar origem aos grânulos. Desta forma, procedeu-se primeiramente a uma análise
reológica da suspensão de HA, da suspensão de alginato e da mistura de HA + alginato,
com velocidades de corte iniciais e finais de 0.1 s-1 e 600 s-1, respetivamente durante
10 minutos, com recurso a um reómetro da marca NETZSCH, modelo KINEXUS.
 2.4. Formulação dos grânulos
Com a suspensão dos grânulos e as soluções de alginato de sódio e cloreto de
cálcio preparadas, procedeu-se então à preparação dos grânulos de hidroxiapatite por
pulverização da fase líquida, seguida de cristalização por secagem ou arrefecimento.

Misturou-se a suspensão de hidroxiapatite com a solução de alginato de sódio

numa proporção de 0.8 e agitou-se com um magnet numa placa de agitação até estar bem
misturado.

Posteriormente, com o auxílio de uma seringa e uma agulha, esta mistura foi
injetada gota a gota na solução de cloreto de cálcio e através da reação descrita
anteriormente formaram-se os grânulos de hidroxiapatite pretendidos. Estes grânulos
foram deixados em solução entre 30 minutos a 1 hora e posteriormente foram filtrados,
secados e parte destes foram sinterizados a diferentes temperaturas (950ºC e 1100ºC)
obtendo-se assim os grânulos de hidroxiapatite “verdes” e sinterizados para posterior
caracterização.

2.5. Caracterização dos grânulos

2.5.1. Distribuição granulométrica do pó de HÁ

A distribuição granulométrica do pó de hidroxiapatite foi efetuada com recurso a

um contador de Coulter. Este aparelho baseia-se no princípio de Coulter que não só
permite a contagem dos grãos como também mede o tamanho das partículas suspensas
em eletrólitos.

2.5.2. Distribuição granulométrica dos grânulos de HA

Realizou-se uma distribuição granulométrica para analisar o tamanho das

partículas. Recorreu-se a uma coluna de peneiros com tamanhos de malhas decrescente
(2mm, 1mm, 500µm, 355µm, 212µm, 125µm e 63µm). Primeiramente a massa total dos
grânulos foi medida e estes foram colocados no topo da coluna de peneiração. Esta coluna
é então agitada manualmente e os grânulos que permaneceram em cada malha após
agitação manual foram removidos e a sua massa pesada.
 2.6. Morfologia e composição dos grânulos
De seguida os grânulos foram separados consoante o seu tamanho e foi efetuada
uma análise da sua morfologia com recurso à lupa. Para as análises SEM e DRX os
grânulos foram sinterizados.

2.6.1. Observação à lupa

A observação à lupa foi efetuada na lupa Leica EZ4 HD com ampliações 8x e 16x
as amostras “verdes”, assim como as amostras sinterizadas.

2.6.2. Microscópio eletrónico de varrimento (MEV)

As imagens do microscópio eletrónico de varrimento (MEV, abreviatura

portuguesa de scanning electron microscope, SEM) foram adquiridas num microscópio
SEM Hitachi SU-70 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tóquio, Japão) operado a
15 kV. O microscópio SEM permite uma visualização direta de imagens de alta resolução
das amostras, revelando informações sobre a morfologia dos grânulos (tamanho, forma e
textura).

Uma única gota da amostra de grânulos foi espalhada sobre um suporte de

alumínio e revestida com carbono. O conteúdo restante resultante da evaporação do
solvente da gota é então analisado, permitindo a visualização dos grânulos. No entanto, a
microscopia eletrónica de varrimento oferece informações limitadas em termos de
distribuição de tamanho de partícula.

2.6.3. DRX (Técnica de Difração de Raio-X)

O aparelho utilizado para o DRX foi o Panalytical X’Pert PRO 3 com 10º < 2θ <
60º e as referências indicadas na folha de resultados foram utilizadas para identificação
dos materiais.

Com o intuito de facilitar a caraterização da estrutura cristalina dos grânulos de

hidroxiapatite, estes foram moídos após sinterização.
 3. Análise e Discussão dos Resultados

3.1. Análise ao pó de HA
Nesta secção analisamos as caraterísticas do pó de hidroxiapatite, em termos do seu
tamanho e da sua estrutura cristalina através de uma distribuição granulométrica por
peneiração e por DRX, respetivamente.

3.1.1. Distribuição granulométrica

Os resultados obtidos relativamente à distribuição granulométrica da HA encontram-se

na figura seguinte:

Figura 4. Gráfico representativo da distribuição granulométrica da HA.

O estudo da distribuição granulométrica do pó de hidroxiapatite é importante

pois o tamanho dos pós influencia as propriedades da suspensão. Fragmentos menores
podem ocupar os espaços vazios entre os fragmentos de maiores dimensões e
influenciar a solubilidade, viscosidade e estabilidade da suspensão.
 Verifica-se que a média de tamanhos dos grãos de pó foi de 1.733 µm e os
tamanhos variam entre 0.123 e 8.147 µm, o que pode ser considerado uma variação
ampla. A grande maioria dos grãos (90%) tem um tamanho menor que 3.363 µm, pelo
que os grãos com tamanho superior a este valor podem ser considerados outliers.

3.1.2. Análise DRX

Na figura 5, encontra-se representado o difratograma do pó de HA utilizado, com a

referência difratograma teórico da HA.

Figura 5. Difratograma do pó de hidroxiapatite utilizado (em cima) e da referência de HA (em baixo)

Através da comparação dos picos é possível observar que a hidroxiapatite é única

fase cristalina do fosfato de cálcio presente no pó. Assim podemos confirmar que o pó
não se encontra contaminado e podemos proceder a atividade laboratorial.
 3.2. Caraterização reológica da suspensão
Na figura 6, encontram-se representados os valores de viscosidade para a solução de
alginato, para a suspensão de HA sem alginato e para a suspensão de HA + alginato, em
função das tensões de corte aplicadas.

Figura 6. Variação da viscosidade em função da tensão de corte

Como se pode observar na figura, a viscosidade da solução de alginato não se altera

independentemente da tensão de corte aplicada. Já a viscosidade das suspensões de HA
com e sem alginato diminui à medida que a tensão de corte, uma caraterística típica de
fluidos pseudoplásticos. Esta diminuição aparenta abrandar com o aumento da tensão de
corte, o que indica que as suspensões tendem a estabilizar num determinado de
viscosidade.

As suspensões de HA e de HA + alginato comportam-se de forma semelhante, porém

é de notar que os gráficos se cruzam e a suspensão de HA + alginato, inicialmente menos
viscosa torna-se mais viscosa que a suspensão de HA com o aumento da tensão de corte.
Isto pode dever-se às cadeias de alginato que quando sujeitas à tensão elevada não ficam
orientadas no mesmo plano e oferecem mais resistência ao escoamento.
 3.3. Distribuição granulométrica dos grânulos
De forma a analisar os tamanhos dos grânulos obtidos realizou-se um ensaio de
peneiração, com os resultados obtidos disponíveis na figura 7.

Figura 7. Gráfico da distribuição granulométrica dos grânulos sinterizados

O resultado que mais sobressai no gráfico é que a grande maioria dos grânulos ficou
retido na peneira de 1-2 mm, indicativo que a maioria dos grânulos possui tamanho nesse
intervalo, independentemente da temperatura a que foram sinterizados.

Cerca de 10 % dos grânulos sinterizados a 950ºC ficaram retidos na peneira >2 mm

enquanto que praticamente nenhum grânulo sinterizado à temperatura superior de 1100
ficou retido na mesma. Isto acontece, pois, quando sujeitos a temperaturas de sinterização
maiores os grânulos perdem parte do seu conteúdo em água, o que provoca uma
diminuição do seu tamanho.

3.4. Análise à lupa

A Figura 8 exibe as representações visuais dos grânulos com auxílio da lupa em verde
e dos que foram sinterizados a 950ºC e 1100ºC, com ampliações de 8× e 16×.
 Grânulos em
verde

Grânulos
sinterizados
a 950ºC

Grânulos
sinterizados
a 1100ºC

Figura 8. Imagens obtidas através da lupa dos grânulos em verde, sinterizados a 950ºC e 1100ºC com ampliações 8x
e 16x

Através da lupa, verifica-se que os grânulos em verde apresentam uma cor branca
com ausência de uma superfície reluzente, com textura semelhante ao gesso. A mesma
opacidade é evidenciada nos grânulos sinterizados a 1100ºC só que com cor azulada. Por
sua vez, os grânulos sinterizados a 950ºC aparentam uma cor azulada como os grânulos
sinterizados a 1100ºC, porém destacam-se em relação às outras amostras pela sua
superfície brilhante.

Analisando cada imagem individualmente, observa-se uma diferença de tamanho

entre grânulos em todas as amostras de grânulos: verdes, sinterizados a 950ºC e 1100ºC.
Após a sinterização, nota-se um decréscimo de tamanho dos grânulos, porém esta
diminuição não é visualmente óbvia. Em geral, todos os grânulos apresentam forma de
gota que pode ser explicada pelo uso da seringa durante o processo de formulação de
grânulos de HA.
 Os dados obtidos através da visualização pela lupa não são suficientes para sustentar
confirmações acerca da morfologia dos grânulos. Deste modo, recorre-se ao SEM para
uma análise mais detalhada.

3.5. Análise SEM e espetroscopia de raios X por energia

dispersiva (EDS)
Através do SEM foi possível a visualização direta da morfologia dos grânulos,
verificando-se uma distinção nítida entre os grânulos sinterizados a diferentes
temperaturas (950ºC e 1100ºC). Numa ampliação 30×, verifica-se que os grânulos
sinterizados a 1100ºC, isto é, sinterizados a temperaturas superiores apresentam uma
geometria esférica mais regular (imagem b). No entanto, estes grânulos (imagem b)
apresentam uma maior rugosidade na sua superfície esférica em comparação aos da
imagem a), que aparentam uma superfície mais lisa.

Numa ampliação maior (250×), observam-se diferenças de superfície entre as

diferentes temperaturas. Analisando as imagens c) e d), ambas aparentam uma superfície
com “elevações”. Contudo, os grânulos sinterizados a 950ºC destacam-se pela sua
superfície rugosa e desorganizada com aparentes “elevações” predominantes.
 a) b)

c) d)

Figura 9. imagens dos grânulos (linha superior) e das suas superfícies (linha inferior) obtidas no SEM de grânulos
sinterizados a 950ºC (a e c) e 1100ºC (b e d)

A espetroscopia de raios-X por energia dispersiva permite-nos saber a composição dos

grânulos de HA. Ao analisar os espetros de EDS presentes na secção Anexos, podemos
verificar uma quantidade de cloro superior à esperada em HA, o que pode indicar uma
concentração de cálcio muito elevada.
 3.6. DRX
As figuras 10 e 11 encontram-se representados os difratogramas dos grânulos
sinterizados a 950 e 1100ºC em comparação com os difratogramas de referência da
hidroxiapatite e da cloroapatite.

Figura 10. Difratograma do pó de HA em comparação com o de difratograma de referência da hidroxiapatite

Figura 11. Difratograma dos grânulos sinterizados a 950ºC e 1100ºC em comparação com o de difratograma de
referência da hidroxiapatite
 Na figura acima, podemos observar que os picos dos difratogramas dos grânulos
sinterizados não correspondem com os picos da hidroxiapatite, o que indica que ocorreu
uma mudança da fase cristalina da hidroxiapatite em ambas as temperaturas de
sinterização.

Uma análise aos picos destes grânulos permitiu identificar que estes coincidem
com os picos típicos de cloroapatite. Efetivamente ao compararmos os picos dos
difratogramas dos grânulos com o difratograma de referência da hidroxiapatite
verificamos que estes coincidem, e, portanto, podemos afirmar a presença de cloroapatite
nos grânulos sinterizados.

Isto pode ser explicado através da reação de crosslinking entre o alginato de sódio
e o cloreto de cálcio que deu originou cloreto de sódio (NaCl) como subproduto. O cloro
depois reagiu com a hidroxiapatite e os iões hidróxido foram substítuidos por iões cloreto
na sua estrutura cristalina, originando cloroapatite.

Conclusão

Nesta atividade experimental foi possível mimetizar a técnica de fabrico de

grânulos de hidroxiapatite por pulverização de fase líquida, seguida de cristalização por
secagem ou arrefecimento, tendo-se, assim, obtido grânulos de HA. Após a produção de
grânulos foi feita a sinterização dos mesmos às temperaturas de 950ºC e 1100ºC.
Posteriormente, deu-se a caracterização dos grânulos: verdes, sinterizados a 950ºC e
sinterizados a 1100ºC.

Tendo em conta os resultados obtidos, verifica-se que pode haver melhorias a

nível da formulação de grânulos. De modo a regularizar a forma geométrica (esférica), a
controlar o tamanho e a uniformizar a superfície dos grânulos, poder-se-iam ter em
atenção os seguintes fatores: pressão colocada na seringa, distância da agulha à solução,
tal como a proporção de hidroxiapatite relativamente ao alginato de sódio.

A distribuição do tamanho do pó comercial de HA utilizado para sintetizar os

grânulos foi estudada, concluindo que os tamanhos variavam entre de 0.123 e 8.147 μm,
uma variação relativamente elevada, com quase 2 ordens de grandeza de diferença. A
reologia das diferentes suspensões de alginato, HA e HA + alginato foram analisadas e
verificou-se que a viscosidade de HA+alginato, menor a tensões de corte baixas, torna-se
mais viscosa do que a suspensão de HA a tensões de corte mais elevadas, o que pode ser
explicado pela maior tensão aplicada às cadeias de alginato que se deformam e oferecem
mais resistência ao escoamento.

Em relação à distribuição granulométrica, verificou- se que a maior parte dos

grânulos têm tamanho entre 1 e 2 mm para ambas as temperaturas de sinterização, porém
os grânulos sinterizados a temperaturas de 1100ºC são menores, pois ao contrário dos
grânulos sinterizados a 950ºC poucos ficaram retidos na peneira de 2 mm. Para a análise
visual e morfológica dos grânulos, recorreu-se à lupa e ao SEM. Com a lupa, verificou-
se uma superfície menos brilhante nos grânulos em verde e verificou-se que após
sinterização dos grânulos, há uma ligeira diminuição do diâmetro, uma vez que a
sinterização provoca uma diminuição da porosidade. No entanto, a fim de obter mais
informações, recorreu- se ao SEM. Aqui verificou-se que a 1100oC, os grânulos têm uma
superfície mais uniforme e ordenada.

A morfologia dos grânulos foi estudada através da lupa e SEM com a obtenção de
dados diretos e visuais. Através da lupa verificou-se uma maior opacidade nos grânulos
em verde, uma superfície brilhante nos grânulos sinterizados a 950ºC e diferença de
tonalidade dos grânulos em verde (tonalidade branca) e sinterizados (tonalidade azulada).
Além disso, verifica-se uma diminuição não significativa do tamanho dos grânulos. Para
complementar os dados morfológicos recorreu-se ao SEM, onde foi possível verificar
uma forma geométrica mais regular e uma superfície mais uniforme para os grânulos
sinterizados a 1100ºC.

O EDS revelou uma quantidade de cloro superior ao esperado o que pode ser
explicado por uma lavagem deficiente, ou então de uma concentração de cloreto de cálcio
superior à necessária. A análise DRX revelou que ocorreu uma mudança de fase nos
grânulos sinterizados, e a HA transformou-se em cloroapatite. Uma experiência futura
poderia ser feita para averiguar se com uma concentração mais baixa de cloreto de cálcio
iria ocorrer esta transformação de fase da HA.
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Anexos
Tabelas 3 e 4. EDS grânulo sinterizado a 1100ºC

Spectrum: foto1_ grânulo direita .spx

Element Series unn. C norm. C Atom. C Error (3 Sigma)
[wt.%] [wt.%] [at.%] [wt.%]
---------------------------------------------------------
Carbon K-series 19,75 19,79 32,32 8,69
Oxygen K-series 37,71 37,79 46,34 15,51
Magnesium K-series 0,45 0,45 0,36 0,17
Chlorine K-series 6,69 6,70 3,71 0,77
Calcium K-series 35,20 35,27 17,27 3,26
---------------------------------------------------------
Total: 99,80 100,00 100,00

Spectrum: foto1_grânulo esq.spx

Element Series unn. C norm. C Atom. C Error (3 Sigma)
[wt.%] [wt.%] [at.%] [wt.%]
--------------------------------------------------------
Carbon K-series 25,92 24,05 39,47 12,06
Oxygen K-series 32,24 29,91 36,85 14,17
Chlorine K-series 17,61 16,34 9,08 1,87
Calcium K-series 32,01 29,70 14,60 2,99
--------------------------------------------------------
Total: 107,77 100,00 100,00

Tabelas 5 e 6. EDS grânulo sinterizado a 950ºC

Spectrum: foto1_grânulo cima.spx

Element Series unn. C norm. C Atom. C Error (3 Sigma)
[wt.%] [wt.%] [at.%] [wt.%]
----------------------------------------------------------
Carbon K-series 16,86 17,97 31,06 7,82
Oxygen K-series 30,50 32,49 42,17 13,32
Magnesium K-series 0,49 0,52 0,44 0,19
Phosphorus K-series 3,01 3,21 2,15 0,45
Chlorine K-series 6,14 6,54 3,83 0,73
Calcium K-series 36,87 39,28 20,35 3,41
----------------------------------------------------------
Total: 93,86 100,00 100,00

Spectrum: foto1_grânulo debaixo.spx

Element Series unn. C norm. C Atom. C Error (3 Sigma)
[wt.%] [wt.%] [at.%] [wt.%]
----------------------------------------------------------
Carbon K-series 19,44 20,01 32,81 8,34
Oxygen K-series 35,97 37,03 45,57 14,79
Magnesium K-series 0,31 0,32 0,26 0,15
Phosphorus K-series 0,36 0,37 0,24 0,14
Chlorine K-series 5,26 5,42 3,01 0,63
Calcium K-series 35,80 36,86 18,11 3,31
----------------------------------------------------------
Total: 97,14 100,00 100,00