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Manuscrito aceito

Associação entre o polimorfismo do gene CLEC4E de Mincle e a infecção

por tuberculose pulmonar em uma população do norte da China

Kabuye Deo, Yang Chu, Gonting Lao, Guojiang Jin, Hui Kang

Informações de identificação pessoal: S0378-1119(19)30473-1

DOI: https://doi.org/10.1016/j.gene.2019.05.011
Referência: GENE 43860

Aparecer em: Gene

Data de recebimento: 27 de agosto de 2018

Data revisada: 24 de abril de 2019

Data aceita: 6 de maio de 2019

Como citar este artigo: K. Deo, Y. Chu, W. Lao, et al., Associação entre o polimorfismo do
gene CLEC4E de Mincle e a infecção por tuberculose pulmonar em uma população do norte
da China, Gene,https://doi.org/10.1016/j.gene.2019.05.011

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 MANUSCRITO ACEITO

ASSOCIAÇÃO ENTRECLEC4EPOLIMORFISMO GÊNICO

INFECÇÃO POR TUBERCULOSE MÍNCULA E PULMONAR
EM UMA POPULAÇÃO DO NORTE DA CHINESA

Kabuye Deo1,Yang Chu1, Indo para o Laos1, GuojiangJin1, Hui Kang1*

1Departamento de Medicina Laboratorial, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica da

China, Shenyang, 110001, Província de Liaoning, China

*
Autor correspondente, Tel: +86 13804904390

Endereço de e-mail: kanghui65@sina.com

TO
Endereço de email:

KabuyeDeo: ssekitodeo@gmail.com
EI
Yang Chu: chuyang0703@163.com
AC

Indo para o Laos: laowenting128@sina.com

O

GuojiangJin: jguojiang@163.com
IT
CR
US
AN
M
 MANUSCRITO ACEITO

Abstrato

Fundo: Pulmonar tuberculose causado por um intracelular

patógeno,Mycobacteriumtuberculosiscontinua a existir como uma doença perigosa para a vida

humana em todo o mundo. Os polimorfismos genéticos regulam a resistência e a suscetibilidade à

tuberculose. O receptor de lectina tipo C do membro da família 4 E (CLEC4E) confere proteção

contra a tuberculose em animais de laboratório, mas a sua função em influenciar a exposição ou

resistência à tuberculose pulmonar (TBP) em humanos permanece obscura.

Mirar:Conduzimos esta pesquisa para analisar os efeitos ou a concomitância deCLEC4E

variações genéticas com suscetibilidade à tuberculose pulmonar em uma população do norte

da China.

TO
Método:Neste estudo, foram incluídos 202 participantes com tuberculose pulmonar e 214

controles sem TBP. Dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) para CLEC4Eno
EI
cromossomo 12 foram selecionados com uma frequência alélica menor> 0,05. Todos os SNPs

foram genotipados usando análise de fusão de alta resolução – PCR.

AC

Resultados:Estimamos e comparamos dois SNPs, rs10841845 e rs10841847. A partir dos

O

resultados do nosso estudo,CLEC4Ers10841845 conferiu proteção contra o desenvolvimento

de TB pulmonar com valor P inferior a 0,05 e razão de chances inferior a 1 para todos os
IT

modelos de herança genética.

CR

Os genótipos CLEC4E rs10841847 nos modelos e alelos co-dominantes, recessivos e

US

dominantes tiveram uma diferença estatística significativa entre pacientes e controles

associados à resistência contra o desenvolvimento de TBP (P<0,05e OU <1).

AN

Conclusão:Nossas descobertas sugerem que variações em rs10841845 e rs10841847 de

CLEC4Egenes estão associados ao aumento da proteção individual contra TBP.

M

Palavras-chave: Lectina tipo C, Humano, Genótipo, Intervalo de Confiança, Frequência Alelica,

Cromossomo 12.
 MANUSCRITO ACEITO

1.0 introdução

A tuberculose pulmonar é uma doença contagiosa transmitida pelo ar, causada por

Mycobacteriumtuberculosis, uma bactéria patogênica intracelular. Apesar de muitos anos de

investigação e da introdução de um tratamento eficaz e de técnicas de diagnóstico

melhoradas para a TBP, esta continua a ser uma causa de morbilidade e mortalidade à escala

global [1]. Perto de 2 mil milhões de pessoas em todo o mundo vivem latentemente com

tuberculose pulmonar; 5–10% desenvolvem doenças activas, das quais 2 milhões de pessoas

morrem todos os anos [2-4]. Acredita-se que factores genéticos, patogénicos e ambientais do

hospedeiro determinem a progressão da doença [1, 5].M. tuberculose,iniciada por fagócitos

alveolares e células apresentadoras de antígenos, macrófagos, células dendríticas e

neutrófilos que possuem receptores de reconhecimento de padrões que reconhecem ligantes

TO
microbianos[6]. No entanto, no curso da TB pulmonar, a imunidade adotiva do hospedeiro

também desempenha um papel fundamental na infecção[7].

EI
Os receptores de reconhecimento de padrões podem ser expressos superficialmente na
AC

membrana de uma célula ou dentro da matriz celular [8]. Os receptores de lectina do tipo C

indutíveis por micrófagos (Mincle) são receptores transmembranares do tipo II dependentes

O

de cálcio com domínios de reconhecimento de carboidratos categorizados principalmente no

IT

receptor de lectina do tipo C. grupo[6, 9]. Esses receptores detectam vários ligantes, desde

fungos, autoligantes, bem como o ligante glicolipídico micobacteriano conhecido como

CR

trealose 6,6 dimicolato (TDM) na parede celular e seu análogo fabricado, conhecido como

strehalosedibehenato [10]. Estudos genéticos revelaram que variações genéticas nos

US

receptores de células mieloides influenciam a suscetibilidade ou resistência do hospedeiro à

AN

tuberculose pulmonar. A proteína Mincle possui 219 aminoácidos, está localizada no

cromossomo 12p13 e é essencialmente encontrada em macrófagos, neutrófilos e dendritos.

fragmento cristalizável do receptor gama acoplado ao motivo de ativação baseado em

M

tirosina do imunorreceptor, seguido pelo recrutamento da tirosina quinase do baço após a

fosforilação [11]. Isso resulta na indução de sinais descendentes em uma cadeia de proteínas

citosólicas, como a proteína 9 do domínio de recrutamento de caspases, linfoma de células B

10 , proteína 1 do tecido linfóide associada à mucosa e, em seguida, fator nuclear kappalight-

chainenhancer de células B ativadas [12] para o núcleo para transcrição. Isso leva à produção

de citocinas e quimiocinas que circulam dentro do

 MANUSCRITO ACEITO

microambiente de células T virgens para produzir células auxiliares efetoras TH1 e TH17 para

conter a infecção [13].

Muitos estudos relataram que Mincle reconhece vários ligantes de patógenos e inicia uma

resposta imune corporal eficaz.--/-camundongos mostraram produção prejudicada de

interleucina-6 juntamente com fator de necrose tecidual quando expostos aMalasseziaspp.que

posteriormente prejudicou sua depuração [11]. Outro estudo demonstrou como camundongos

com deficiência de Mincle sofreram um altoCandida albicanscarga em comparação com

camundongos positivos para Mincle[9].Miyake et al. relataram a falha de camundongos deficientes

em Mincle em reconhecer o TDM, um importante glicolipídeo da parede celular micobacteriana

[14]. Na verdade, a falha na formação de granuloma pulmonar foi observada em Mincle−/−

camundongos em resposta ao TDM em comparação com camundongos do tipo selvagem [15].

TO
Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) são antecedentes cardinais de variabilidade

individual específica que determinam a expressão e função genética. Os SNPs são usados
EI
como biomarcadores para rastrear a herança de doenças nas famílias. Um estudo foi
AC

realizado para investigar a associação de polimorfismos para o receptor Mincle e tuberculose

pulmonar, mas tal estudo nunca foi realizado anteriormente em uma população chinesa.
O

Portanto, em nosso estudo, investigamos a associação deCLEC4Epolimorfismos genéticos

IT

com infecção por tuberculose pulmonar em uma população chinesa.

2.0Métodos
CR

2.1 População do estudo e critérios de exclusão

US

Neste estudo, um total de 202 casos de tuberculose pulmonar (TBP) foram recrutados no
AN

Instituto de Pesquisa de Tuberculose do Décimo Hospital Popular de Shenyang. A detecção e

confirmação da tuberculose pulmonar foram feitas por meio de exames clínicos, radiografias
M

e baciloscopias juntamente com culturas. Um chip genético foi usado em esfregaços positivos

para identificação de cepas. Um grupo de 214 participantes saudáveis foi recrutado no

centro de exames médicos do primeiro Hospital da Universidade Médica da China, que

combinou os casos de acordo com sexo, localização geográfica, idade e raça. Todos os

participantes eram de etnia chinesa do norte da China. Tubos de coleta de sangue contendo

anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) foram utilizados para coleta de

amostras por punção venosa e amostras armazenadas a -20ºC antes da extração do DNA.
 MANUSCRITO ACEITO

Critérios de exclusão: Participantes com vírus da imunodeficiência humana e outras

doenças ou condições imunossupressoras, como leucemia, diabetes ou outras doenças

pulmonares, não foram incluídos no estudo. Este estudo de pesquisa foi aceito e

garantido pelo Primeiro Comitê de Pesquisa Hospitalar afiliado à China Medical

University.

2.2 Isolamento de DNA

O DNA para esta pesquisa foi separado de 200 L de sangue total de amostras
anticoaguladas com EDTA usando um micro kit de DNA genômico QIAamp (Qiagen,
Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e
pureza do DNA foram analisadas utilizando um espectrofotômetro, e o DNA extraído
foi diluído e armazenado a -80ºC.óC até ser testado.

2.3Seleção e genotipagem de SNP

TO
EI
Os sites SNP estudados para oCLEC4EO gene foi selecionado do banco de dados do Centro
AC

Nacional de Informações sobre Biotecnologia para variação genética. Com base na literatura

então disponível, dois SNPs foram selecionados, rs10841845 nas três regiões principais não

traduzidas (3'UTR) e rs10841847 em uma região de íntron. foi considerada frequência > 0,05
O

em CHB. PCR com análise de fusão de alta resolução (HRM) (Roche Applied Science,
IT

Mannheim, Alemanha) foi utilizado como técnica ou método para genotipagem de amostras
CR

de estudo de DNA de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. uma

temperatura de recozimento de 55ºC a 65ºC e um tamanho de amplicon de 100–200 pb

US

foram projetados usando o software Primer Premier 6 (Tabela 1). O processo de PCR em

tempo real e as análises de HRM foram feitos usando um sistema Light Cycler Z480 (Roche
AN

Applied Science). de 20-L foi usado, 10-L

master mix L verde, 2 L de cloreto de magnésio, 5 L de água, 1 L de primer reverso,

M

1-Lforward primer e 1-Ltemplate DNAset em uma placa multi-poços de 96 PCR.

Tabela 1.Lista de primers utilizados na genotipagemCLEC4Epolimorfismos genéticos.

SNP Sequência 5' a 3' Comprimento Amplicão Recozimento (ºC)

Tamanho temperatura
Rs10841845
Avançar ACCTCCACGACATGAGTTTACCT 23 57,6
123
Reverter AAGCGAACATTCATTCCCACACTT 24 57,5
 MANUSCRITO ACEITO

Rs10841847
Avançar CACACTCATACCTCATATCGGCTT 24 56,8
105
Reverter ATGCTGCTTCACTACCACACTG 22 57

Os parâmetros de ciclagem para amplificação por PCR foram os seguintes: 95ºC por 2 min

seguido de 10 s a 95ºC, recozimento a 60ºC por 30 s e extensão a 72ºC por 30 s. Após a

amplificação por PCR, a análise HRM começou, o aquecimento preciso dos amplicons de DNA

de PCR de 50ºC–95ºC foi realizado. À medida que a temperatura aumentava, o DNA de cadeia

dupla desnaturava-se e derretia-se, fazendo com que a fluorescência desaparecesse. Os

resultados foram analisados usando o software de varredura genética Light Cycler Z 480

(Roche Applied Science).

TO
2.4Análise estatística
As frequências alélicas e genotípicas foram calculadas com precisão por contagem
EI
individual. Um teste qui-quadrado (X2) foi utilizado para estabelecer a diferença estatística
AC

entre os grupos de pacientes e controle. Para comparações estatísticas envolvendo

variáveis contínuas foi utilizado o teste de Mann-Whitney. CLEC4Epolimorfismos

O

genéticos e tuberculose pulmonar, a razão de chances (OR) e o intervalo de confiança (IC)

de 95% foram calculados. Todos os SNPs estavam em Hardy-Weinberg.APvalor inferior a

IT

0,05 foi considerado significativo. Todo o trabalho de cálculo foi realizado com um
CR

Statistical Package for the Social Sciences(SPSS) versão 20,

IBM, Armonk, NY, Estados Unidos da América

US

3.0Resultados

Os genótipos foram analisados com base em modelos genéticos predominantemente

AN

codominantes, recessivos ou dominantes. Num modelo co-dominante, cada genótipo ou

alelo tem um efeito independente no fenótipo. Nos modelos recessivos, ambos os alelos
M

devem ser homozigotos polimórficos para ter efeito, enquanto no modelo dominante, o

efeito do fenótipo é expresso mesmo que um dos alelos seja polimórfico; também foram

considerados alelos que são formas diferentes do gene no mesmo locus de um cromossomo.

Nossos achados indicaram que para o SNP r10841845, o alelo G ocorreu com mais

frequência no grupo controle (44,2%) do que no grupo de pacientes (29,1%), reduzindo

assim a suscetibilidade dos indivíduos à doença TBP(P<0,001, OR=0,516, IC95%=0,387–

0,687). O mutante heterozigoto AG (P=0,015, OR=0,59, IC 95%=0,39–0,90) juntamente

com o mutante homozigoto GG(P=<0,001, OR=0,24, IC95%=0,21–0,46) mostrou um

 MANUSCRITO ACEITO

diferença estatisticamente significativa entre os grupos de pacientes e controle. Além disso, o

modelo recessivo(GG vs. AA+AG;P=<0,001, OR=0,31 IC95%=0,17–0,58) e modelo dominante

(AG+GG vs. AA;P=<0,001, OR=0,49, IC 95%=0,33–0,72) foram significativamente associados

para conferir resistência à infecção por TBP (Tabela 2).

De acordo com a variação genética em rs10841847, o heterozigoto AG (P: 0,002, OR:

0,534, IC 95%: 0,356–0,800) e mutante homozigoto AA (P: 0,004, OR: 0,279, IC 95%:
0,112–0,690) foram observados de forma mais significativa no grupo controle do que
nos pacientes. Da mesma forma, foi verificado que o aleloA (P: <0,001, OR: 0,556 IC
95%: 0,407–0,760) foi significativamente mais frequente no grupo controle do que no
grupo de pacientes (32,7% vs. 21,3%), sugerindo proteção para o desenvolvimento
de TBP. GG+AG;P= 0,023, OR: 0,368, IC95%: 0,151–0,896) e o modelo genético
dominante (AG+AA vs. GG;P=<0,001, OR: 0,494, IC 95%: 0,334–0,730), o alelo A foi

TO
significativamente associado a um efeito protetor ou resistência contra infecção por
tuberculose pulmonar (Tabela 3).
EI
AC
O
IT

Mesa 2.Genótipos e frequências alélicas do rs10841845CLEC4Evariante genética em

pacientes com tuberculose pulmonar e controles saudáveis
CR

CLEC4Egene Casos (%) Controles X2 P OU IC 95%

SNP N=202 N=214(%)
US

Rs10841845
Genótipos
Co-dominante
AN

AA 100(49,5) 69(32,2) Referência -

AG 87(43,1) 101(47,2) 5.933 0,015 0,594 0,391-0,904
GG 15 (7,4) 44(20,5) 19.925 <0,001 0,235 0,121-0,456
M

Recessivo
AA+AG 187(92,5) 170(79,4) Referência -
GG 15 (7,4) 44(20,5) 14.730 <0,001 0,310 0,166-0,577

Dominante
AA 100(49,5) 69 (32,2) Referência -
AG+GG 102(50,5) 145(67,8) 12.837 <0,001 0,485 0,236-0,723

Alelos
A 287(71,4) 239(55,8) Referência -
G 117(29,1) 189(44,2) 20.646 < 0,001 0,516 0,387-0,687
 MANUSCRITO ACEITO

Pvalor inferior a 0,05 apresentou significância estatística. Odds ratio (OR) < 1 protetor e OR > 1 aumenta a suscetibilidade. IC, intervalo de
confiança.

Tabela 3.Genótipos e frequências alélicas do rs10841847CLEC4Evariante genética em

pacientes com tuberculose pulmonar e controles saudáveis

CLEC4Egene Casos (%) Controles X2 P OU IC 95%

SNP N=202 N=214 (%)
Rs10841847
Genótipos
Co-dominante
GG 123(60,9) 93 (43,5) Referência -
AG

TO
72 (35,6) 102(47,7) 9.339 0,002 0,534 0,356-0,800
AA 7 (3,5) 19 (8,9) EI 8.413 0,004 0,279 0,112-0,690

Recessivo
GG+AG 195(96,5) 195(91,1) Referência -
AA 7 (3,5) 19 (8,9)
AC

5.197 0,023 0,368 0,151-0,896

Dominante
GG 123(60,9) 93 (43,6) Referência -
O

AG+AA 79 (39,1) 121(56,5) 12.651 < 0,001 0,494 0,334-0,730

IT

Alelos
G 318(78,7) 288(67,3) Referência -
CR

A 86 (21,3) 140(32,7) 13.707 < 0,001 0,556 0,407-0,760

Pvalor inferior a 0,05 mostra significância estatística, (OR) odds ratio< 1 protetor e OR > 1 aumenta a suscetibilidade, IC,
US

intervalo de confiança,
AN
M

4.0Discussão

O desenvolvimento da tuberculose ativa difere das pessoas principalmente devido aos

fatores genéticos do hospedeiro que são cruciais na determinação da resistência ou

suscetibilidade do indivíduo à TBP[16].CLEC4Etem uma função importante na

patogênese imunológica de diversas doenças, incluindo a tuberculose.CLEC4Ecodifica

receptores Mincle em macrófagos, células dendríticas, monócitos e neutrófilos. No

entanto, a proteína Mincle raramente é encontrada em células em repouso.

 MANUSCRITO ACEITO

de polimorfismos de nucleotídeo únicoCLEC4Egene em rs10841845 e rs10841847,

responsável pela suscetibilidade ou resistência à tuberculose pulmonar na
população chinesa.

Os resultados do presente estudo mostraram que todos os genótipos SNP e alelos do gene Mincle

CLEC4Esão significativamente protetores contra a tuberculose pulmonar nas populações

estudadas. Em disparidade com nossos achados, não foi encontrada associação significativa entre

MincleTB genética e pulmonar em pessoas da África do Sul [18]; essa discrepância se deve à

influência das diferenças genéticas e da raça na população estudada. Em correlação com nossos

achados, Wu et al. demonstraram que o alelo G em rs10841845 conferiu um papel protetor em

homens contra a artrite reumatóide [19]. Encontrada principalmente em pesquisas genômicas,

uma amostra escolhida que possui significância estatística é influenciada principalmente pelas

TO
frequências alélicas e seus efeitos associados [20].

CLEC4EO SNPS rs10841845 é encontrado no 3'UTR. Embora o 3'UTR possa não

EI
influenciar o mecanismo de tradução, ele possui regiões que regulam a adição de
AC

caudas de adenina ao mRNA e a tradução e qualidade do mRNA. A 3'UTR contém regiões

silenciadoras que se ligam à proteína repressora e ao microRNA, inibindo a expressão do

O

mRNA e afetando a expressão gênica por degradação do transcrito. Muitos estudos

relataram os efeitos de variações genéticas nas regiões 3'UTR na tuberculose pulmonar

IT

e estes foram encontrados para contribui para a resposta imune contra PTB [22, 23];
CR

semelhante aos achados do nosso estudo, este local confere proteção contra infecção

por PTB. Rs10841847 é encontrado em uma região de íntron, que é considerada uma
US

região não codificadora. Embora os polimorfismos genéticos na região do íntron não

alterem os aminoácidos codificados, estes podem impactar o splicing, o curso da

AN

transcrição e a expressão gênica. A partir de nossos resultados, observou-se que os

polimorfismos do íntron mantêm a função do íntron.CLEC4Egene para exibir maior

M

resistência à tuberculose pulmonar.

Além dissona Vivoestudos em animais mostraram quePneumonia por Klebsiella, e o

glicosildiacilglicerol deStreptococcus pneumoniae,foram reconhecidos pelos receptores

Mincle quando camundongos deficientes em Mincle foram expostos a uma alta carga

bacteriana [28]; no entanto, o ser humanoCLEC4Ea variação genética pode expressar um

efeito positivo contra patógenos. Da mesma forma, os neutrófilos alveolares de indivíduos

pneumocócicos tinham receptores Mincle distintos em comparação com aqueles da corrente

sanguínea geral [29], indicando que Mincle estimulou a resposta imune eficaz quando
 MANUSCRITO ACEITO

encontrando ligantes patogênicos. Foi demonstrado que as células epiteliais da córnea

exibiam receptores Mincle em resposta à infecção fúngica [30], e camundongos

deficientes em Mincle exibiram uma reação imunológica falha ao ligante da parede

celular micobacteriana caracterizada pela ausência de granulomas pulmonares [31].

Variações noCLEC4Eforam associados a várias doenças, incluindo alergias inflamatórias

e cutâneas [17, 32], principalmente através da produção de citocinas e quimiocinas

eficazes [33]. Foi relatado que polimorfismos genômicos e hormônios esteróides sexuais

influenciam a suscetibilidade à TBP baseada no sexo [34]. discordou de nossos achados,

onde todos os genótipos e alelos do SNP eram protetores para todos os pacientes.

Consequentemente, parece que a imunidade do hospedeiro contra a tuberculose

pulmonar é determinada principalmente pela transdução de sinal de Mincle em

macrófagos que leva à produção de citocinas e quimiocinas inflamatórias que induzem a

TO
morte de macrófagos infectados e maturação de linfócitos T [11].

5. Conclusão
EI
Portanto, concluímos de nossas descobertas queCLEC4Epolimorfismos genéticos em
AC

rs10841845 e rs10841847 aumentam a resposta de macrófagos e outras células

mieloides à resistência/proteção contra tuberculose pulmonar em uma amostra da

O

população chinesa. Parece provável que os polimorfismos nestes locais possam ser
IT

usados como alvo para o desenvolvimento eficaz de medicamentos. Mincle

polimorfismos genéticos e infecção por TB pulmonar, mais estudos precisam ser

CR

realizados, principalmente em relação à investigação de haplótipos.

US

Interesse concorrente
AN

Nenhum interesse conflitante declarado pelos autores.

Reconhecimento
M

Agradecemos a todos os sujeitos que voluntariamente participaram do estudo.

Referências

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 MANUSCRITO ACEITO

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 MANUSCRITO ACEITO

Contribuições dos autores

1. KabuyeDeo;Projetou o estudo de pesquisa, coleta de amostras, isolamento de DNA,

design principal, realizou os experimentos, analisou os dados e escreveu o

manuscrito.

2. Yang Chu; Auxiliou na coleta de amostras, auxiliou na extração de DNA e auxiliou

no design de primers

3. Indo para o Laos; Auxiliou na coleta de amostras, auxiliou na extração de DNA e

auxiliou no design de primers

4. GuojiangJin; Auxiliou na redação do manuscrito.

5. HuiKang; Auxiliou no projeto de primers, experimentos dirigidos e extração de DNA.

Todos os autores aprovaram o manuscrito final.

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lista de abreviações

MINUTO; Receptor de Lectina Tipo C Induzível por Macrófagos

CLEC4E; SNPs E de membros da família 4 do domínio de lectina tipo
C; Polimorfismos de Nucleotídeo Único
PCR; Reação em Cadeia da Polimerase
TDM; trealose 6, 6' dimicolato PTB;
Tuberculose pulmonar

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 MANUSCRITO ACEITO

Destaques

- Os genótipos Rs10841845 e rs10841847 conferiram proteção contra

tuberculose.

- Os SNPs são alvos potenciais para diagnóstico e tratamento da tuberculose pulmonar.

- Os receptores Mincle são importantes para o reconhecimento de TDM micobacteriano e citocinas

Produção.

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