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Tuberculose 115 (2019) 56–62

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Tuberculose
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Aspectos Imunológicos

Associação entre polimorfismos de genes de citocinas e secreção de IL-12p70,

IL-18 e IL-27 por células dendríticas em pacientes com tuberculose pulmonar

O. I. Urazovaa, E. G. Churinaa,b,∗, R. R. Hasanovaa, V. V. Novitskiya, VS Poléticaa

aInstituição Educacional de Ensino Superior do Orçamento do Estado Federal “Universidade Médica do Estado Siberiano” do Ministério da Saúde da Federação Russa, Tomsk, Federação Russa

bInstituição Educacional Autônoma do Estado Federal de Ensino Superior “National Research Tomsk State University”, Tomsk, Federação Russa

INFORMAÇÕES DO ARTIGO ABSTRATO

Palavras-chave: Sabe-se que as citocinas pró-inflamatórias desempenham um papel crucial na patogênese da tuberculose, e demonstrou-se
Tuberculose pulmonar que os polimorfismos genéticos nas regiões promotoras dos genes das citocinas influenciam substancialmente a capacidade
Resposta imune secretora das células imunes. No presente estudo analisamos a associação entre polimorfismos do IL12B, IL18,eIL27genes e a
Polimorfismo do gene da citocina
secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-12р70, IL-18 e IL-27 pelas células dendríticas mieloides (mDCs) em pacientes com
Células dendríticas
tuberculose pulmonar (TBP). O estudo envolveu 334 pacientes com TBP infiltrativa e disseminada recém-diagnosticada. O
Citocinas
cultivo de mDCs foi realizado a partir de progenitores não proliferantes de CD14+monócitos sanguíneos. A secreção de
citocinas foi avaliada medindo a concentração de citocinas nos sobrenadantes da cultura mDC utilizando ensaio de
imunoabsorção enzimática (ELISA). Para estudar os polimorfismos dos genes das citocinas, foram realizadas reação em cadeia
da polimerase (PCR) e análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP). A secreção reduzida de
IL-18 e IL-27 por mDCs em pacientes com TBP foi associada a polimorfismos 105A/C doIL18gene e 2905T/G, 4730T/С e −964A/
G doIL27gene, respectivamente. O polimorfismo IL12B/inserção teve influência bidirecional na secreção de IL-12p70, estando
associado à diminuição dos níveis da citocina na TBP infiltrativa e aos níveis aumentados nos pacientes com TBP disseminada.

1. Introdução CD4+Linfócitos Т durante a invasão primária do patógeno no

A tuberculose (TB) é uma doença multifatorial que se desenvolve como
resultado da interação de uma infinidade de genes, muitos dos quais estão
envolvidos na regulação da resposta imune. Polimorfismos em tais genes
podem influenciar substancialmente o grau de resistência do hospedeiro à
infecção micobacteriana, bem como a gravidade e duração da doença.
Assim, vários estudos demonstraram a associação de polimorfismos do
gene das citocinas com a suscetibilidade à infecção tuberculosa.1–4].
A maioria dos indivíduos infectados comMycobacterium tuberculose (MBT)
desenvolvem uma resposta imunitária completa envolvendo a realização de
mecanismos inatos e adaptativos, e apenas em 3-5% dos pacientes a resposta
imunitária contra a infecção tuberculosa revela-se ineficaz, resultando na
reactivação de uma infecção latente e no desenvolvimento de uma infecção activa.
formas de TB. O início de uma resposta imune antituberculose adequada depende
fortemente da atividade das células dendríticas (DCs), leucócitos apresentadores
de antígenos especializados que apresentamBTTantígeno para ingênuo
organismo hospedeiro [5–7].
É geralmente aceito que as DC representam um elo crucial entre a
imunidade inata e a adaptativa, uma vez que são responsáveis pela
ativação da resposta imune específica do antígeno e estão criticamente
envolvidas na ocorrência de anergia das células T ou de uma resposta imune
ativa a um antígeno. induzido [8,9]. Além disso, foi demonstrado que, no
contexto da resposta imune antituberculosa, é necessária uma secreção
adequada de citocinas pró-inflamatórias pelas DCs ativadas para a ativação
de linfócitos T virgens e sua subsequente diferenciação em células T
auxiliares tipo 1 (Th1), enquanto uma secreção reduzida dessas citocinas
pode diminuir a defesa imunológica do hospedeiro contraMtb [8,9]. Ao
mesmo tempo, se o padrão de secreção de citocinas derivadas de DC na TBP
é geneticamente predeterminado ou surge como consequência da
desregulação do sistema imunológico induzida pelo agente causador, ainda
precisa ser totalmente elucidado [10,11].
Como as sequências de éxons dos genes das citocinas são muito conservadoras,

∗Autor correspondente. Instituição Educacional de Ensino Superior do Orçamento do Estado Federal “Universidade Médica do Estado Siberiano” do Ministério da Saúde

da Federação Russa, Tomsk, Federação Russa. Tel.: +7913 8060700.

Endereço de e-mail:urazova72@yandex.ru (O.I. Urazova),Lena1236@yandex.ru (EG Churina).

https://doi.org/10.1016/j.tube.2019.02.003
Recebido em 17 de junho de 2018; Recebido em formato revisado em 30 de janeiro de 2019; Aceito em 3 de fevereiro de 2019
1472-9792/ © 2019 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
OI Urazova et al.
e dado o papel central das regiões promotoras na regulação da
expressão gênica, o objetivo do estudo foi investigar a associação de
polimorfismos de regiões promotoras de genes de citocinasIL12Â, IL18,
e IL27com a secreção de citocinas derivadas de mDC em pacientes com
tuberculose pulmonar.
2. Materiais e métodos
2.1. População do estudo
A população do estudo incluiu 334 pacientes (220 homens e 114
mulheres) com idades entre 23 e 50 anos (idade média 43,10 ± 10) com TB
recentemente diagnosticada, atendidos no Centro Médico
Phthisiopulmonological de Tomsk. O diagnóstico de TBP foi confirmado com
base em cultura e/ou baciloscopia positiva paraMtb,e apresentação clínica e
radiográfica consistente com TBP. Todos os participantes foram examinados
antes da quimioterapia antituberculosa específica. Os pacientes cadastrados
foram classificados em dois grupos de acordo com a forma clínica da
doença: 177 com TB infiltrativa e 157 com TB disseminada. Foram excluídos
do estudo indivíduos com as seguintes condições: 1) câncer, diabetes
mellitus, asma brônquica, doenças autoimunes e alérgicas, infecção pelo
vírus da hepatite, vírus da imunodeficiência humana; 2) tratamento com
medicamentos antituberculose e imunossupressores. Também foram
incluídos 183 controles saudáveis com idades entre 23 e 50 anos (130
homens e 53 mulheres) sem TB ativa, sem histórico de TB e pareados com
casos por sexo e idade (idade média 41,31 ± 7,47). O consentimento
informado por escrito foi obtido de cada sujeito.
2.2. Cultivo de células dendríticas
Os mDCs foram cultivados a partir de progenitores não proliferantes de CD14+
monócitos sanguíneos. O sangue venoso total coletado de pacientes com TB foi
usado para isolar células mononucleares por centrifugação em gradiente a 1.500
rpm por 20 min usando gradiente de urografina ficoll (ρ =1,077 g/m²3; PanEco,
Rússia). Em seguida, os monócitos foram isolados da suspensão de células
mononucleares adquiridas por centrifugação em gradiente a 4000 rpm durante 45
min utilizando solução isotónica padrão de Percoll. Uma expressão de receptores
CD14 em monócitos foi avaliada através de citometria de fluxo utilizando
anticorpos monoclonais CD14-PE de acordo com o protocolo do fabricante (BD
Pharmingen™,EUA).
O cultivo de mDCs a partir de suspensão adquirida de monócitos
sanguíneos foi realizado conforme descrito anteriormente [12]. O 1×106
suspensão de células contendo monócitos foi adicionada a cada poço da
placa de fundo plano de 24 poços em combinação com 1 ml de meio
nutriente completo. As placas com suspensão celular foram então colocadas
em CO2incubadora por 1 hora a 37oCe 5% CO2, e então o meio nutriente
completo foi adicionado novamente à suspensão na mesma quantidade,
juntamente com 20 ng/ml de GM-CSF e IL-4 (Sigma, EUA). No terceiro dia de
incubação, 75% do meio foi removido e igual quantidade do meio de cultura
completo com citocinas recombinantes foi adicionada à suspensão.
Após dois a três dias de estimulação de monócitos com GM-CSF e
IL-4 no meio de cultura, mDCs redondos imaturos com abundante
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citoplasma e dendrócitos pouco desenvolvidos foram identificados na
cultura celular (Figura 1a). No quinto dia de incubação, o meio nutriente foi
renovado e foram adicionados 5 ng/ml de lipopolissacarídeo (Sigma, EUA).
No sétimo dia de incubação, o fenótipo dos mDCs maduros (Figura 1b) e a
concentração de citocinas nos sobrenadantes foram avaliadas. A viabilidade
dos mDCs foi examinada pela coloração combinada com anexina V-FITC
(Beckman Coulter, EUA) e corante vital intranuclear 7-ААD (7 amino-
actinomicina) (BDPharmingen, EUA) usando FACSCanto™Citômetro de fluxo
II (BD, EUA) A população viável de mDCs gerados sobem vitroas condições
no sétimo dia de cultivo variaram entre 83 e 89%. O fenótipo das DCs
obtidas foi estudado por citometria de fluxo. As células foram coradas com
anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo para CD 209, TLR-2,
HLA-DR, CD80 e CD86 («eВioscience», EUA) e analisadas em FACSCanto™
Citômetro de fluxo II («BD», EUA) (Suplemento 1: Figura 1-1 – 1-3).
2.3. Avaliação dos níveis de citocinas em sobrenadantes de suspensões de cultura de células
dendríticas geradas in vitro a partir de monócitos sanguíneos
Para medir as concentrações de IL-18, IL-12p70 e IL-27 em
sobrenadantes de suspensões de cultura de mDC, foi realizado um
ensaio imunoenzimático (ELISA) de acordo com as recomendações do
fabricante (para IL-18 e IL-12p70 – Bender MedSystems, Áustria; para
IL-27 – eBioscience, EUA). A densidade óptica do conteúdo do poço da
placa foi registrada utilizando o analisador fotômetro Multiscan EX
(Finlândia) no comprimento de onda de 450 nm. As concentrações de
citocinas (pg/ml) foram calculadas com base na curva de calibração.
2.4. Extração de DNA e genotipagem do polimorfismo do gene de citocinas
O DNA foi isolado de 20 ml de sangue venoso total usando o
método fenol-clorofórmio de acordo com as instruções do fabricante
(InterLabService, Rússia).
As amostras de DNA extraído foram digitadas para os seguintes
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs):IL12Âpolimorfismo genético
(IL12B/inserção);IL18polimorfismo do gene 105C/A (rs549908);IL27
polimorfismos do gene 2905T/G (rs17855750), 4730T/C (rs181206) e
− 964A/G (rs153109) (tabela 1).
Os SNPs foram selecionados usando o banco de dados Online Mendelian
Inheritance in Man (OMIM) e o banco de dados do National Center for
Biotechnological Information. A amplificação do DNA foi realizada via reação
em cadeia da polimerase (PCR) no amplificador Tercik MC2 (DNAtechnology,
Rússia). A identificação dos polimorfismos dos genes das citocinas
escolhidos foi realizada via PCR e análise do polimorfismo de comprimento
de fragmentos de restrição (RFLP) de acordo com as recomendações do
fabricante (Syntol, Rússia; Sibenzyme, Rússia; New England Biolabs, Reino
Unido). A estrutura dos primers, temperatura de recozimento, enzimas de
restrição e comprimentos dos fragmentos de hidrólise são apresentados em
tabela 1[13–16].
Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1%.
Para análise RFLP, os produtos de amplificação foram clivados por
endonucleases (tabela 1). Os produtos de restrição foram separados com
Figura 1.Geração de células dendríticas a partir de
monócitos sanguíneos (ampliação × 250)em vitro:a –
células dendríticas imaturas em meio de crescimento
completo no terceiro dia de cultivo; b – células
dendríticas maduras em meio nutriente completo no
sexto dia de cultivo. A análise da população celular
foi realizada via análise FACS utilizando FACSCanto™
Citômetro de fluxo II (BD, EUA).
OI Urazova et al.
tabela 1
Sequências iniciadoras e condições de detecção de polimorfismos de genes de citocinas.
Gene Mutação (método) Primeiras, 5'-3'
IL12Â IL12B/inserção (PCR) TGGATTGTGAAGTGGGACAT
TAATGTGGTCATTGGCAGGT
IL18 rs549908 (RFLP) CCTCTACAGTCAGAATCAGT
TGTTTATTGTAGAAAACCTGGAATT
IL27 rs17855750 (RFLP) ATCTCGCCAGGAAGCTGCGC
CTGTTAGTGGGGGCCAGAAGGGA
rs181206 (RFLP) GCTTCAGCCCTTCCATGCCC
TCTACCTGGAAGCGGAGGTGCC
rs153109 (RFLP) CTGATCCTGACCTCACTCAACGC
CTGACTGGGACTGGGACTCAGC
Nota: PCR – reação em cadeia da polimerase, RFLP – polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição.
eletroforese em gel de poliacrilamida 8% a 200 V por 2 h e visualizada no espectro
ultravioleta (Suplemento 2: Figura 2-1 – 2-4). O plasmídeo pUC19 clivado porMSPA
Istrictase («Sibenzym», Rússia) foi utilizada como marcador do comprimento do
ADN. Os comprimentos do fragmento de hidrólise são apresentados emtabela 1.
2.5. Análise estatística
Para avaliar a normalidade da distribuição dos dados amostrais, foi realizado
o teste de Kolmogorov–Smirnov. Como as características quantitativas nos grupos
de comparação não apresentaram distribuição normal, foi utilizado o teste não
paramétrico de Mann-Whitney para comparação de amostras independentes.
Para todas as características quantitativas nos grupos comparados foram
calculadas a mediana e os quartis 25% e 75%.
A distribuição genotípica de cada SNP foi analisada para o equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Nos controles saudáveis, todas as frequências genotípicas
estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para comparar as frequências
alélicas entre os grupos, foi utilizado o teste do χ2 com correção de Yates
para continuidade. A associação dos polimorfismos com o TBP foi concluída
com base no valor do odds ratio (OR) com cálculo de intervalo de confiança
de 95%. OR < 1 foi considerado associação negativa e OR > 1 foi considerado
associação positiva entre os parâmetros avaliados. Os resultados foram
considerados significativos quando P < 0,05.
3. Resultados
3.1. Associação do polimorfismo IL18 105 A/C com secreção de IL-18 por mDCs
em TBP
Houve diferença estatisticamente significativa nas frequências
genotípicas dosIL18105 Polimorfismo A/C entre pacientes com TBP
infiltrativa e doadores saudáveis (χ2= 20,53 (p < 0,001)). Por outro lado,
em pacientes com TBP disseminada, as frequências genotípicas não
diferiram significativamente em comparação ao grupo controle, mas
diferiram dos pacientes com TBP infiltrativa (χ2= 18,73 (p < 0,001)).
Houve também associação do genótipo homozigoto CC (OR = 1,50
(0,83–2,70)) e do alelo C (OR= 1,13 (0,83–1,53)) do polimorfismo 105A/C
com a incidência da forma disseminada de TBP. Além disso, o
transporte do genótipo AA homozigoto (OR = 2,61 (1,70–4,00)) e do
alelo A (OR = 1,75 (1,28–2,39)) do polimorfismo 105A/C foi um fator
predisponente de TBP infiltrativa (Suplemento 3, Tabela 3-1).
Em portadores do alelo C e dos genótipos AC e CC doIL18 105
polimorfismo A/C com PTB disseminado, o nível de secreção de IL-18
derivada de mDC foi menor (30,2% (p1< 0,05), 29,4% (p1< 0,05) e 25% (p1
< 0,05), respectivamente) em comparação com os doadores saudáveis
(Figura 2). Em pacientes com TBP infiltrativa, independentemente do
transporte de alelos e genótipos do polimorfismo 105A/C, o nível de
secreção de IL-18 (32,56 (16,51-34,54) pg/ml) foi comparável ao de
doadores saudáveis.
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Recozimento t, °С Enzima de restrição Fragmentos
55 – a, sem inserção: 158 pb A, inserção: 162 pb
50 TaqEU R: 148 pb
C: 123 + 25 pb
67 MelhorIU T: 120 pb
G: 100 + 20 pb
62 MSPEU T: 132 pb
C: 111 + 21 pb
61 MelhorIU R: 468 pb
G: 343 + 125 pb
Figura 2.Associação entre secreção de IL-18 por mDCs e polimorfismo do gene
IL18 105A/C em doadores saudáveis e pacientes com TBP disseminada. Nota: HD
– doadores saudáveis, ITB – tuberculose infiltrativa, DTB – tuberculose
disseminada. Os resultados são apresentados como mediana, quartis inferior e
superior. Na legenda: AA, AC, CC – genótipos do polimorfismo 105A/C; A, C – alelos
do polimorfismo 105A/C.
3.2. Associação do polimorfismo do gene IL12 IL12B/inserção com secreção de
IL-12p70 por mDCs em TBP
Genotipagem paraIL12polimorfismo IL12B/inserção mostrou que
em pacientes com TBP infiltrativa houve aumento na frequência do
genótipo Aa (χ2= 24,35 (p < 0,001)), enquanto nos pacientes com TBP
disseminada o genótipo aa foi observado com maior frequência (χ2=
36,49 (p < 0,001)). O genótipo Aa heterozigoto (OR= 2,08 (1,36–3,20)) e
um alelo (OR = 1,07 (0,79–1,46)) foram associados à TBP infiltrativa,
enquanto o genótipo aa homozigoto (OR= 3,30 (2,11–5,16)) e um alelo
(OR = 2,91 (2,01–4,21)) foram associados à TBP disseminada (
Suplemento 3, Tabela 3-2).
Em pacientes com TBP infiltrativa, os níveis de IL-12p70 em portadores de
ambos os genótipos (Aa e aa) e alelos (A e a) estavam diminuídos em comparação
com o grupo de doadores saudáveis. Em contraste, em pacientes com TBP
disseminada, o nível de secreção de IL-12p70 foi maior do que nos controles (p1<
0,05–0,001) (Figura 3). Entre os pacientes com TBP infiltrativa portadores do
genótipo Aa e do alelo A, a concentração de IL-12p70 foi significativamente menor
em comparação aos portadores do genótipo aa e de um alelo do polimorfismo de
inserção IL12B/ (41,2% (pAa/aa< 0,05) e 47,1% (pA/
a< 0,001), respectivamente). Em pacientes com TBP disseminada, entretanto,
foi observado padrão oposto, uma vez que o nível de secreção de IL-12p70
em portadores do genótipo aa e alelo foi significativamente diminuído em
comparação aos portadores do genótipo Aa e alelo A (32,2% (pAa/
ah< 0,001; pUm/um< 0,05)) (Figura 3).
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Figura 3.Associação entre secreção de IL-12 por mDCs e polimorfismo do gene
IL12B/inserção em doadores saudáveis e pacientes com TBP infiltrativa e
disseminada. Nota: HD – doadores saudáveis, ITB – tuberculose infiltrativa, DTB –
tuberculose disseminada. Os resultados são apresentados como mediana, quartis
inferior e superior. Na legenda: Aa, aa. – genótipos de IL12B/polimorfismo de
inserção; Um, um. – alelos de IL12B/polimorfismo de inserção.
Figura 4.Associação entre secreção de IL-27 por mDCs e polimorfismo do gene
IL27 2905T/G em doadores saudáveis e pacientes com TBP infiltrativa e
disseminada. Nota: HD – doadores saudáveis, ITB – tuberculose infiltrativa, DTB
– tuberculose disseminada. Os resultados são apresentados como mediana, quartis
inferior e superior. Na legenda: TT, TG, GG – genótipos do polimorfismo 2905T/G; T, G –
alelos do polimorfismo 2905T/G.

3.3. Associação dos polimorfismos IL27 2905 T/G, 4730T/C e

−964A/G com secreção de IL-27 por mDCs na TB

Análise da distribuição de frequência alélica deIL27O polimorfismo

2905 T/G revelou alta incidência de portadores do genótipo
homozigoto TT entre pacientes com TBP infiltrativa e disseminada (χ2=
165,55 e χ2= 188,76 (p < 0,001), respectivamente). O genótipo TT e o
alelo T do polimorfismo foram associados à incidência tanto de TBP
infiltrativa (OR = 27,14 (15,47–47,62) e OR = 11,25 (7,53–16,81)) quanto
disseminada (OR= 52,09 (26,55–102,22) e OR= 18,72 (11,38–30,79)) (
Suplemento 3, Tabela 3-3).
IL-27O polimorfismo 2905T/G foi associado a uma diminuição na
secreção de IL-27 derivada de mDCs em comparação com o grupo controle
em pacientes com TBP infiltrativa e disseminada, independentemente de
alelos e genótipos (p1< 0,001). Ao mesmo tempo, não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre pacientes com TBP infiltrativa e
disseminada com diferentes alelos e genótipos do polimorfismo 2905T/G. (
Figura 4).
O espectro de frequência dos genótipos doIL27O polimorfismo
Figura 5.Associação entre secreção de IL-27 por mDCs e polimorfismo do gene
4730 T/C em pacientes com TBP infiltrativa apresentou diferenças
IL27 4730T/C em doadores saudáveis e pacientes com TBP infiltrativa. Nota: HD –
estatisticamente significativas tanto em comparação ao grupo controle
doadores saudáveis, ITB – tuberculose infiltrativa, DTB – tuberculose disseminada.
(χ2= 39,06 (p < 0,001)) e aos pacientes com TBP disseminada (χ2= 28,59 Os resultados são apresentados como mediana, quartis inferior e superior. Na
(p < 0,001)). Portadores do genótipo CC foram significativamente mais legenda: TT, TC, CC – genótipos do polimorfismo 4730T/C; T, C – alelos do
frequentes entre os pacientes com TBP infiltrativa, e esse genótipo foi polimorfismo 4730T/C.
associado de forma confiável à forma infiltrativa de TBP (OR = 3,48
(2,19–5,55)), enquanto nenhuma associação com TBP disseminada foi
o polimorfismo foi significativamente diminuído (4730T/С:pTT/СС< 0,05 e
identificada (Suplemento 3, Tabela 3-3). A análise dos genótipos e
pT/С< 0,05; -964A/G: рAA/GG< 0,05) em comparação com outros alelos e
frequências alélicas dosIL27o polimorfismo do gene −964A/G não
genótipos (Figos. 5 e 6).
revelou diferença significativa entre pacientes com TBP infiltrativa e
disseminada. Porém, em pacientes com TBP infiltrativa, a distribuição
dos genótipos do polimorfismo foi diferente daquela de doadores 4. Discussão
saudáveis (χ2= 9,53 (p = 0,009)). Além disso, foi identificada a associação
do genótipo GG do polimorfismo −964A/G com o desenvolvimento de Um dos principais mecanismos subjacentes à função imunorreguladora
TBP infiltrativa (OR = 1,65 (1,05–2,59)) (Suplemento 3, Tabela 3-3). das DCs é a sua capacidade de produzir citocinas pró-inflamatórias, criando
O nível de secreção de IL-27 derivada de mDC em pacientes com assim um ambiente específico de citocinas num local inflamatório e
TBP infiltrativa, independentemente dos genótipos e alelos doIL27 influenciando significativamente o caminho de uma resposta imunitária.
polimorfismos do gene 4730T/C e −964A/G, foi menor (p1< (0,05–0,001)) Assim, a diferenciação de células T virgens em linfócitos Th1, que é
do que no grupo controle (Figos. 5 e 6). Ao mesmo tempo, a secreção particularmente importante para uma resposta imune anti-tuberculose
de IL-27 pelos mDCs em portadores do genótipo CC e do alelo C do bem-sucedida, requer a presença das citocinas da família IL-12, IL-12, IL-23 e
polimorfismo 4730T/C, bem como doGGgenótipo de −964A/G IL-27, que são produzido principalmente por DCs. Outra citocina pró-
inflamatória, a IL-18, atua em sinergia com a IL-12, aumentando

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polimorfismo, o nível de secreção de IL-12p70 foi maior em comparação

Figura 6.Associação entre secreção de IL-27 por mDCs e polimorfismo do gene
IL27 −964A/G em doadores saudáveis e pacientes com TBP infiltrativa. Nota: HD –
doadores saudáveis, ITB – tuberculose infiltrativa, DTB – tuberculose disseminada.
Os resultados são apresentados como mediana, quartis inferior e superior. Na
legenda: AA, AG, GG – genótipos do polimorfismo −964A/G; A, G – alelos de
− Polimorfismo 964A/G.
com o de doadores saudáveis (Figura 3). Por um lado, isso indica a
associação doIL12Bpolimorfismo genético (IL12B/inserção) com a
variabilidade de secreção de IL-12p70 em TBP e apoia seu papel
predisponente no desenvolvimento de TBP infiltrativa (no caso do genótipo
Aa) e disseminada (no caso do genótipo aa). Por outro lado, estes dados
sugerem uma ligação entre o padrão de secreção de IL-12p70 derivada de
mDC e o desenvolvimento de uma forma clínica particular de TBP. Além
disso, é evidente que em pacientes com TB infiltrativa, uma diminuição na
produção de IL-12p70 pelos mDCs combinada com a secreção persistente de
IL-18 pode levar a um desfecho desfavorável da doença no caso de
predominância da resposta imune Th2 [4].
BTTé capaz de inibir a atividade secretora de citocinas das células
dendríticas, promovendo assim a supressão da resposta imune específica do
antígeno do CD4+Células T e mudando o equilíbrio para as vias Th2 e Treg [
22–24]. Aparentemente, um aumento na secreção de IL-12 derivada de mDC
em associação com uma redução geneticamente determinada da secreção
de IL-18 em pacientes com TB disseminada é definido apenas pela
predisposição genética ou tem natureza epigenética compensatória, por
exemplo, devido ao bacteremia maciça que frequentemente acompanha o
curso desta forma clínica de TBP. Madan-Lala et al. (2014) mostraram que a
cepa mutante hip 1 deBTTinduziu níveis aumentados de secreção da
principal citocina IL-12 indutora de Th1, bem como outras citocinas pró-
inflamatórias (IL-23, IL-6, TNFα e IL-1β) em cultura de DC através de uma
ativação de MyD88 e TLR2 Vias de sinalização dependentes de /9 [25].

seu efeito promotor na secreção de IFNγ pelas células do sistema

Os resultados do ELISA mostraram que em pacientes com TBP
imunológico inato e linfócitos T [17]. Ao mesmo tempo, foi demonstrado
infiltrativa, a secreção de IL-27, conhecido sinergista da IL-12 e membro da
que, na ausência de IL-12, a IL-18 induz a produção do antagonista de IFNγ,
família das citocinas IL-12, foi menor do que em doadores saudáveis,
IL-4, favorecendo assim o desenvolvimento da resposta imune Th2.17]. Em
independentemente dos genótipos e alelos de oIL27Polimorfismos 4730 T/C
nosso estudo, o alelo C e o genótipo CC doIL18105 O polimorfismo A/C foi
e 964A/G. Níveis mínimos de secreção de IL-27 foram associados ao
associado a uma redução considerável da secreção de IL-18 pelos mDCs em
genótipo homozigoto CC do polimorfismo 4730T/C e ao genótipo GG do
pacientes com TBP disseminada em comparação com indivíduos controle (
− Polimorfismo 964A/G, o que nos permite especular sobre o possível
Figura 2), sugerindo um papel predisponente desse polimorfismo no
papel predisponente destes polimorfismos no desenvolvimento de TBP
desenvolvimento da forma disseminada da TBP.
infiltrativa (Figos. 5 e 6). Além disso, foi identificada uma secreção
Semelhante à IL-18, a IL-12 é produzida predominantemente por células
reduzida de IL-27 em portadores daIL27Polimorfismo 2905 T/G com
apresentadoras de antígenos, nomeadamente células dendríticas e
TBP infiltrativa e disseminada. Ao mesmo tempo, não houve associação
macrófagos. Vários estudos investigaram uma associação entreIL-12B
entre a secreção de IL-27 e o espectro de frequência alélica e
polimorfismos genéticos e secreção de IL-12 pelas células do sistema
genotípica do polimorfismo 2905T/G, o que, no entanto, não refuta
imunológico, bem como uma suscetibilidade geral à TB [18,19]. P. Selvaraj e
totalmente o papel predisponente do alelo T e do genótipo TT deste
colegas mostraram que entre indivíduos saudáveis, o nível de IL-12p40 foi
polimorfismo no desenvolvimento de TB infiltrativa e disseminada (
significativamente menor em portadores do genótipo AA doIL12B
Figura 4).
polimorfismo genético (+1188) em comparação aos portadores do genótipo
O efeito primário da IL-27 gira em torno da promoção do CD4+Diferenciação
AC. Além disso, em pacientes com TB, o genótipo CC doIL12Bo polimorfismo
de células T em células Th1. No entanto, também foi demonstrado que a IL-27
genético (+1188) foi associado a um aumento nos níveis de IL-12p40 nos
atua como um fator supressor, uma vez que sua subunidade estrutural Ebi 3 é um
sobrenadantes da cultura de PBMC em comparação com os portadores de
alvo para o principal fator de transcrição das células T reguladoras, Foxp3.17,26].
outros alelos e genótipos [20], o que indica ainda um papel importante dos
Além disso, a IL-27, em contraste com a IL-12, pode aumentar a proliferação não
fatores hereditários na desregulação da imunidade adaptativa contraMt.
apenas de CD4 ativado, mas também de CD4 ingênuo.+Células T [17,27,28]. É
A IL-12 possui uma estrutura heterodimérica e sua atividade funcional está
possível que o desequilíbrio observado na secreção de citocinas pelos mDCs em
associada principalmente à subunidade p40 [21], cuja hiperprodução (2–3 vezes
pacientes com TBP se deva à capacidade das citocinas da mesma família de
maior em comparação com a produção de IL-12р70) é considerada um sinal de
replicar a função umas das outras. Aparentemente, na deficiência de IL-27, suas
uma resposta imune ativa. Ao mesmo tempo, um nível excessivo de secreção de
funções biológicas são substituídas pela IL-12. Além disso, podemos especular que
IL-12р40 pode resultar na formação de homodímeros р40- р40 inativos, que
a diminuição da secreção de IL-18 na TBP disseminada constitui um fator negativo
atuam como antagonistas ativos da IL-12р70 heterodimérica, bloqueando os
na patogênese desta forma clínica de tuberculose, pois, como indicado acima, a
receptores celulares de IL-12 [9,21]. No presente estudo focamos principalmente
IL-18 é capaz de sinergizar com a IL-12 para promover a secreção de IFNγ, um
no estudo da produção de IL-12p70, uma vez que, comparada à IL-12p40, a
mediador chave da imunidade antituberculosa. Assim, o polimorfismo IL12B/
secreção de IL-12 tem uma natureza mais induzível e é ativada em resposta à
inserção está associado a uma secreção intacta de IL-12 pelos mDCs e, portanto,
estimulação antigênica. Além disso, em contraste com outros estudos disponíveis,
representa um fator favorável na patogênese da TBP disseminada.
avaliamos a secreção de IL-12 por DCs diferenciadas (em oposição a culturas de
PBMC) em diferentes formas clínicas de TBP.
Apesar de uma quantidade substancial de pesquisas, o papel dos
As alterações na secreção de IL-12p70 pelos mDCs em pacientes com TB
polimorfismos dos genes das citocinas na patogênese da tuberculose pulmonar
foram multidirecionais. Verificou-se que em pacientes com TBP infiltrativa,
ainda precisa ser totalmente elucidado e, portanto, representa uma questão
tanto os genótipos (Aa e aa) quanto os alelos (A e a) doIL-12B polimorfismo
relevante no contexto dos estudos de imunidade antituberculose. Assim, E. Peresi
genético (IL12B/inserção) foram associados à diminuição do nível de
et al. (2013) investigaram e influência deIFNG, IL12B, TNF, IL17A, IL10e TGFB1
IL-12p70 em comparação ao grupo controle. Em contraste, em pacientes
polimorfismos genéticos na resposta imune em pacientes com TB em tratamento
com TBP disseminada portadores dos mesmos alelos e genótipos do
antituberculose. Os autores mostraram que

60
OI Urazova et al.
Os polimorfismos IFNG +874T/A, IFNG +2109A/G, IL12B + 1188 A/C, IL10
-819C/T e TGFB1 +21C/T foram associados às alterações na secreção de
citocinas correspondentes e, portanto, podem estar substancialmente
envolvidos na desenvolvimento da resposta imune contraBTT modulando a
secreção de citocinas, especialmente no contexto do tratamento da
tuberculose [29]. Em contraste, no presente estudo, a capacidade secretora
de citocinas das DCs foi investigada antes da administração de
medicamentos anti-tuberculose, uma vez que são conhecidas por exercerem
um efeito imunossupressor proeminente. Num outro estudo, Y. Hu e
colegas demonstraram uma associação positiva entre oIFNGpolimorfismo
do gene (-874) e a forma ativa da infecção por tuberculose, enquanto o
polimorfismo do gene da IL-10 foi associado à infecção latente [30]. Juntos,
esses dados, juntamente com os resultados do presente estudo,
substanciam ainda mais um importante papel dos polimorfismos do gene
das citocinas na etiologia e patogênese da tuberculose.
5. Conclusões
Em pacientes com TBP, o déficit de secreção de IL-18 pelos mDCs foi
associado aoIL18105 Polimorfismo A/C na forma clínica disseminada da
doença. O déficit de secreção de IL-27, por sua vez, foi associado a
polimorfismos doIL27gene: 4730T/С e −964A/G na TBP infiltrativa e
2905T/G em ambas as formas clínicas da doença. Ao mesmo tempo, o
nível de secreção de IL-12p70 em portadores de ambos os genótipos
(Aa e aa) e alelos (A e a) do polimorfismo IL12B/inserção com PTB
infiltrativo foi menor do que no grupo controle, enquanto em pacientes
com doença disseminada O TBP foi maior em comparação com o de
doadores saudáveis. Isto indica não apenas o efeito modulador do
IL12Bpolimorfismo genético em relação à secreção de IL-12p70
derivada de mDC, mas também sua associação com o desenvolvimento
de uma forma clínica particular de TBP. O genótipo Aa do polimorfismo
IL12B/inserção do IL12Bgene; Genótipo СС do polimorfismo 4730T/С e
genótipo GG do polimorfismo 964A/G doIL27gene, predispõe ao
desenvolvimento de TBP infiltrativa.
Por sua vez, a predisposição para o desenvolvimento da TB
disseminada está associada ao alelo C e ao genótipo CC doIL18105
polimorfismo A/C, bem como um alelo e um genótipo aa do
polimorfismo IL12B/inserção. O alelo T e o genótipo TT doIL27O
polimorfismo 2905 T/G predispõe ao desenvolvimento de ambas as
formas clínicas da doença em associação com a redução pronunciada
da secreção de IL-27 pelos mDCs.
Conflitos de interesse
Os autores declaram a ausência de conflitos de interesses óbvios e
potenciais relacionados à publicação do artigo.
Conformidade com a ética
O estudo clínico foi realizado de acordo com a Declaração de
Helsinque da Associação Médica Mundial “Princípios Éticos de Pesquisa
Médica Científica com Participação Humana”, conforme alterada em
2000, e as “Regras de Prática Clínica na Federação Russa” aprovadas
pelo Despacho nº 266 do Ministério da Saúde da Federação Russa,
19.06.2003. Todos os pacientes assinaram o consentimento informado
antes da participação no estudo, de acordo com o Protocolo nº 1.698,
datado de 15 de novembro de 2010, aprovado pelo comitê de ética
local da Siberian State Medical University.
Agradecimentos
A pesquisa foi realizada com o apoio financeiro do Conselho de
Subsídios do Presidente da Federação Russa para apoio estatal das
principais escolas científicas da Federação Russa sob as concessões
SS-7906.2016.7 “O papel das galectinas na patogênese de doenças malignas
tumores de sangue e outras localizações” (Chefe, Acadêmico RAS VV
61
Tuberculose 115 (2019) 56–62
Novitskiy) e SS-2690.2018.7 “Fatores moleculares de desregulação da
homeostase de células sanguíneas imunocompetentes em doenças
socialmente significativas” (Chefe, Membro Correspondente da RAS OI
Urazova). Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Aumento da
Competitividade da TSU.
Apêndice A. Dados suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em
https://doi.org/10.1016/j.tube.2019.02.003.
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Olga I. Urazova –doutor em ciências médicas, professor, membro
correspondente da RAS, chefe do departamento de
Fisiopatologia da Universidade Médica do Estado da Sibéria
(Tomsk, Rússia). Um dos principais especialistas em patologia
geral e fisiopatologia da Federação Russa. Interesses científicos:
mecanismos moleculares de lesão celular e morte de células
sanguíneas e imunitárias em doenças sociais de natureza
infecciosa (tuberculose, infecções virais) e não infecciosas,
desenvolvimento de novas estratégias para o seu diagnóstico,
prognóstico e terapia patogenética. Autor de 440 artigos
científicos, incluindo 13 monografias, 12 patentes, 1 livro
didático para médicos e 12 publicações educacionais para
estudantes. Sob a liderança de OI Urazova, nove subvenções
federais e dez contratos governamentais foram
conduzido; Foram treinados 8 doutores em ciências médicas e 32 candidatos em ciências
médicas. Endereço para correspondência: 2 Moskovsky Trakt, Tomsk, 634055, Rússia, Siberian
State Medical University, Departamento de Fisiopatologia, telefone de contato +7-903-913-1483,
emailurazova72@yandex.ru
Vyacheslav V. Novitskiy –doutor em ciências médicas, professor,
membro da RAS, Cientista Homenageado da Federação Russa,
professor do departamento de Fisiopatologia da Universidade
Médica do Estado da Sibéria (Tomsk, Rússia). Interesses
científicos: fisiopatologia do sistema sanguíneo,
oncofarmacologia. Autor de mais de 500 publicações, incluindo 1
atlas de células sanguíneas, 20 monografias, 1 livro didático para
médicos e 15 publicações educacionais para estudantes,
incluindo 5 edições do livro didático sobre fisiopatologia. Possui
17 certificados de direitos autorais e patentes de invenções.
Chefe da principal escola científica da Rússia, cuja equipe reúne
especialistas altamente qualificados na área de patologia do
sistema sanguíneo e medicina molecular.
Supervisionou 43 doutores e 105 candidatos a ciências. É membro do Presidium da
Academia Mundial de Medicina Albert Schweitzer e membro do comité científico
permanente da Academia Polaca de Medicina. Professor honoris causa de filosofia (em
humanidades) (Pollen, 2006). Premiado com a Ordem da Rainha Vitória “Por uma
contribuição pessoal integradora à ciência, cultura e política progressista” (Grã-Bretanha,
2005). Endereço para correspondência: 2 Moskovsky Trakt, Tomsk, 634055, Rússia,
Siberian State Medical University, Departamento de Fisiopatologia, telefone de contato
+7-913-829- 0979, e-mailkaf.pat.fiziolog@ssmu.ru
Vadim S. Poletika –Aluno do 1º ano de doutorado, assistente do
departamento de Fisiopatologia da Siberian State Medical
University (Tomsk, Rússia). Interesses científicos: imunologia
celular e molecular, oncologia molecular. Endereço para
correspondência: 2 Moskovsky Trakt, Tomsk, 634055, Rússia,
Siberian State Medical University, Departamento de
Fisiopatologia, telefone de contato +7-923-419-0906, e-mail
vpoletika@yandex.ru

Elena G. Churina –doutor em ciências médicas,

doutorimunologista, professor do departamento de
Fisiopatologia da Universidade Médica do Estado da Sibéria
(Tomsk, Rússia), professor do departamento de Química
Orgânica da Faculdade de Química da Universidade Estadual de
Pesquisa Nacional de Tomsk. Interesses científicos: imunologia
celular e molecular, imunidade inata, mecanismos moleculares
da inflamação crónica, terapia celular e imunitária, imunologia
regenerativa. Autor de 92 artigos científicos, incluindo 3
monografias e 3 patentes. Endereço para correspondência: 2
Moskovsky Trakt, Tomsk, 634055, Rússia, Siberian State Medical
University, Departamento de Fisiopatologia, telefone de contato
+7-913-806-0700, e-maillena1236@yandex.ru

Rezeda R. Smolyagina –candidato em ciências médicas

(PhD), geneticista, professor associado do Departamento
de Biologia da Siberian State Medical University (Tomsk,
Rússia), professor associado do Departamento de Educação
Física da National Research Tomsk Polytechnic University.
Interesses científicos: imunologia celular e molecular,
investigação de mecanismos genéticos moleculares de
estrutura, função e metabolismo de células
imunocompetentes na tuberculose pulmonar. Autor de 62
trabalhos científicos. Endereço para correspondência: 2
Moskovsky Trakt, Tomsk, 634055, Rússia, Siberian State
Medical University, Departamento de Biologia, telefone de
contato +7-906-957-6573, e-mailhasanova_rezeda@mail.ru

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