UFRJ – UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ANA CAROLINA PIRES E SILVA

Estudo da expressão e do papel do Complexo Imunoproteassoma na evolução clínica da

COVID-19

Rio de Janeiro

2022
Estudo da expressão e do papel do Complexo Imunoproteassoma na evolução clínica da
COVID-19

Plano de dissertação apresentado como requisito das

atividades no programa de Pós-graduação em Ciências
(Microbiologia).

Orientadora: Iranaia Assunção Miranda

Laboratório de Resposta Celular a Infecções Virais –

Departamento de Virologia do Instituo de Microbiologia
Paulo de Góes, CCS, UFRJ

Rio de Janeiro

2022
 ANA CAROLINA PIRES E SILVA

Estudo da expressão e do papel do Complexo Imunoproteassoma na evolução clínica da

COVID-19

Plano de Dissertação de Mestrado, submetido ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia) do

Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências (Microbiologia).

Rio de Janeiro

2022
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RESUMO

A COVID-19, doença causada pelo SARS-CoV-2, pode manifestar desde sintomas como
resfriado comum a síndrome respiratória aguda grave, caracterizada por uma inflamação
exacerbada e danos teciduais em órgãos-alvo. O complexo imunoproteassoma (IP) compõe uma
maquinaria proteolítica celular, que atua na homeostase proteica e apresentação antigênica via
MHC-I, exercendo papel importante na ativação da resposta imunológica mediada por
linfócitos T CD8+. O IP é formado por subunidades catalíticas β1i, β2i e β5i, que substituem as
subunidades constitutivas do proteassoma sob condições de estresse e por estímulos
inflamatórios, como IFN-γ e TNF-α. Dessa forma, a hipótese do presente estudo é de que a
ativação das subunidades do IP, diante do ambiente inflamatório induzido durante a infecção
pelo SARS-CoV-2, pode estar associada a uma ativação da resposta imunológica nos sítios-
alvo da infecção e em células circulantes e consequentemente, ao desfecho da COVID-19.
Desta forma, nosso objetivo consiste em estudar a ativação e o envolvimento do
imunoproteassoma na evolução clínica da COVID-19 através da análise de dados de
transcriptomas scRNA-seq disponíveis publicamente. Nosso primeiro passo foi investigar a
expressão de IP em células do lavado broncoalveolar (LBA) em pacientes com COVID-19. A
coorte inclui 3 amostras de LBA de indivíduos saudáveis, 3 amostras de pacientes com COVID-
19 moderada e 27 de pacientes com a forma grave da doença, que requeriam hospitalização.
Nós observamos um aumento da expressão das subunidades do IP em células mieloides CD14+
dos indivíduos infectados pelo SARS-CoV-2, tanto na forma moderada quanto grave da
COVID-19. Além disso, observamos uma maior expressão de β1i, β2i e β5i em células
apresentadoras de antígenos (APCs), como macrófagos alveolares, DCs e pDCs nos dois grupos
com COVID-19. Curiosamente, a expressão de subunidades do IP é significativamente maior
em macrófagos e pDCs de pacientes moderados do que em pacientes hospitalizados. Além
disso, conforme observado para a expressão de IP, os genes associados a apresentação
antigênica como MHC-I e PSME1 são mais expressos em casos moderados quando comparado
a casos graves em macrófagos e pDCs, enquanto TAP1 e TAP2 são mais expressos em casos
graves em DCs e pDCs. O próximo passo do nosso estudo visou comparar a expressão de IP
entre pacientes graves que sobreviveram (n=17) e que foram a óbito (n=10). Observamos uma
superexpressão de IP nos que sobreviveram em relação aos que não sobrevivem, tanto nas APCs
quanto em linfócitos CD8+. Desta forma, a superexpressão do IP no LBA sugere um papel
protetor na COVID-19. Uma vez que o IP está associado a um desfecho positivo, nós avaliamos
se o perfil de clivagem de peptídeos antigênicos pelo IP poderia estar ligado a patogenicidade
de diferentes variantes de SARS-CoV-2 circulantes. Vimos que o número de sítios de clivagem
por IP na proteína S da variante Ômicron - associada a casos menos graves de COVID-19- é
maior do que em outras variantes de SARS-CoV-2. Assim, nossos resultados preliminares
sugerem que um perfil de clivagem por IP mais eficiente pode se correlacionar com a redução
da patogenicidade viral.
 2

ABSTRACT

The disease caused by SARS-CoV-2, referred as COVID-19, range from a common cold to a
severe respiratory syndrome form, characterized by an exacerbated inflammation and extensive
damage in targets organs. The immunoproteasome complex (IP) composes cellular proteolytic
machinery responsible for protein homeostasis and antigen presentation by MHC-I, which is
fundamental in activation of immune response mediated by CD8+ T lymphocytes. It is formed
by catalytic subunits β1i, β2i and β5i, which replace the constitutive proteasome subunits in
stressful conditions and by inflammatory mediators, such as IFN-γ and TNF-α. Our hypothesis
was that IP subunits activation by inflammatory environment induced during SARS-CoV-2
infection, could contribute to immune activation and to COVID-19 outcome. So, we first
investigated IP expression in COVID-19 patients’ lung through transcriptomics analysis. We
analyzed the expression of IP subunits and genes associated with antigen processing and
presentation in different cell populations in scRNA-seq databases of bronchoalveolar lavage
fluid (BALF) in 3 samples of control groups compared with 3 samples of patients with mild
COVID-19 and 27 severe cases that required hospitalization. Our results demonstrate that
CD14+ cells were the main cell type in the COVID-19 patients' BALF. We observed an
overexpression of IP catalytic subunits β1i, β2i and β5i in antigen presenting cells, such as
alveolar macrophages, DCs and pDCs. Curiously, the expression of IP subunits was higher in
patients presenting moderate COVID-19 than to hospitalized patients with severe COVID-19.
In addition, as observed to IP expression, antigen presentation genes like PSME1 were higher
expressed in moderate cases than severe in macrophages and pDCs, while TAP1and TAP2 were
higher expressed in severe cases in DCs and pDCs, and HLA-A were higher expressed in
moderate cases than severe in macrophages, DCs and pDC. We also compared IP expression
between survivors (n=17) and dead (n=10) in COVID-19 severe patients’ group and found a
higher expression in the survivor’s outcome group. IP subunits overexpression in survival
group was also observed in CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Our results indicates that IP
overexpression has a protective role to disease progression, possibly due a more effective
antigen presentation. Next, we aimed to understand if immunoproteasome profile of cleavage
of antigenic peptides is linked to rise of variants in the population and the possible correlation
with viral pathogenicity. The prediction of IP cleavage sites in S protein of Omicron variant,
which is associated with high dissemination but with less severe cases in the population, was
higher than others pathogenic VOCs. Collectively, our results suggest that immunoproteasome
derived antigen presentation is associated with a protection during COVID-19, as well as its
efficiently cleavage profile could correlate to viral pathogenicity.
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
APC – Célula Apresentadora de Antígeno
CoV – Coronavírus
COVID-19 – Do inglês: Coronavirus disease
CTL – Células T Citotóxicas
DCs – Células dendríticas convencionais
ECA2 – Enzima conversora de angiotensina 2
HBV – Vírus da Hepatite B
HCoV – Coronavírus humanos
IFN – Interferon
IL – Interleucina
IP – Complexo Imunoproteassoma
IRF-1 – Fator regulador de interferon
LBA - Lavado broncoalveolar
LCMV – Vírus da coriomeningite linfocítica
LPS – Lipopolissacarídeo
MHC-I - Complexo de histocompatibilidade de classe I
NETs - Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos
NK – Células matadoras naturais
NSP – Proteínas não estruturais
OMS – Organização Mundial da Saúde
pDCs – Células dendríticas plasmocitóides
RBD – Domínio de ligação ao receptor
ROS – Espécies reativas de oxigênio
STAT-1 – Transdutor de sinal e ativador da transcrição 1
TAP – Proteína transportadora para processamento de antígeno
TNFα – fator de necrose tumoral alfa
UPS – Sistema ubiquitina-proteassoma
VOCs – Variantes de preocupação
VOIs – Variantes de interesse
WT – Tipo selvagem (do inglês, wildtype)
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 5

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 6
1.1. O SARS-CoV-2: Origem, estrutura e replicação ........................................................... 6
1.2. Epidemiologia e evolução do SARS-CoV-2 ................................................................. 10
1.3. COVID-19: transmissão e patogênese ......................................................................... 16
1.4. O sistema ubiquitina-proteassoma e o Complexo Imunoproteassoma (IP) .................. 20
1.4.1 O papel do IP nas infecções virais .................................................................................. 24
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 26
3. OBJETIVOS............................................................................................................... 27
3.1 Objetivo geral ............................................................................................................. 27
3.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 27
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 28
4.1 Análises de transcritos através de bancos de dados de scRNA-seq de fluido de lavado
broncoalveolar (LBA) de pacientes com COVID-19............................................................... 28
4.2 Predição de clivagem por proteassoma e imunoproteassoma ...................................... 29
4.3 Análise de transcritos através de bancos de dados de scRNA-seq de células
mononucleares de sangue (PBMC) por scRNA-seq ................................................................ 30
5. RESULTADOS PRELIMINARES ............................................................................. 31
5.1 Predomínio de células mieloides CD14+ no LBA de pacientes com COVID-19 ........... 31
5.2 Aumento da expressão das subunidades do IP em CD14 no LBA de pacientes com
COVID-19 ............................................................................................................................. 33
5.3 A indução da expressão de IP em macrófagos alveolares e pDCs está associada
principalmente a quadros de COVID-19 moderada ............................................................... 34
5.4 O aumento da expressão de IP se correlaciona com a maior processamento e
apresentação antigênica em macrófagos alveolares em pacientes com COVID-19 moderada. 37
5.5 Maior indução de imunoproteassoma em APCs associada à sobrevivência nos quadros
de COVID-19 grave ............................................................................................................... 39
5.6 Processamento e apresentação antigênica via MHC-I mais eficiente em macrófagos
alveolares associados a um desfecho positivo nos casos de gravidade ..................................... 41
5.7 Aumento da expressão de IP e genes associados à função efetora células T CD8 + no LBA
de pacientes graves ................................................................................................................ 42
5.8 Indução do imunoproteassoma em células CD8+ associadas à desfecho positivo......... 45
5.9 Aumento de sítios clivagem por imunoproteassoma na proteína S da variante Ômicron
associadas a menor patogenicidade ........................................................................................ 45
PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................................ 48
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 49
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1. INTRODUÇÃO
1.1. O SARS-CoV-2: Origem, estrutura e replicação

Os coronavírus pertencem à família Coronaviridae, que se apresenta em quatro gêneros

distintos, baseado em sua estrutura genômica: Alphacoronavirus e Betacoronavirus,

caracterizados por infectar mamíferos; Gammacoronavirus e Deltacoronavírus que infectam

aves (Stadler et al., 2003; Santos, Romanos e Wigg, 2015; Rabi et al., 2020). Especula-se que

os coronavírus humanos (HCoVs) descritos até hoje têm origem evolutiva a partir de morcegos

ou roedores, e as infecções podem variar de baixa a alta patogenicidade. Dentre eles, os mais

endêmicos são HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43 e HCoV-HKU1, descritos como

causadores de infecções de baixa patogenicidade no trato respiratório superior, associados a 10-

30% dos casos de resfriado comum (Hartenian et al., 2020).

Nas últimas duas décadas, foram descobertos coronavírus altamente patogênicos

pertencentes ao gênero Betacoronavirus, causando doenças respiratórias graves em humanos e

podendo levar a desfechos clínicos fatais (Hu et al., 2021). Dentre eles, estão o vírus da

síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV), descoberto em 2002, tendo acometido 8.000

casos de infecção com taxa de mortalidade de 10%; e o coronavírus da síndrome respiratória

do Oriente Médio (MERS-CoV) que causou mais de 2000 casos em 2012, com taxa de

mortalidade de 36%, sendo os dromedários os principais transmissores para os humanos (Mohd,

Al-Tawfiq e Memish, 2016). Esses dois vírus não apresentaram uma alta taxa de transmissão,

facilitando a contenção dos surtos. Porém, em dezembro de 2019, foram notificados casos de

indivíduos com sintomas de pneumonia altamente infecciosa, associados aos que frequentavam

o mercado de frutos do mar em Wuhan, província de Hubei, na China. Além dos quadros de

pneumonia, outros sintomas como febre, tosse seca e dispneia eram típicos entre os indivíduos

infectados. O número de casos aumentou também em extensão geográfica, tendo notificações

registradas em 10 países em janeiro de 2020 (Zhou et al., 2020). Durante o rastreamento do

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possível patógeno causador dessa enfermidade, os órgãos de saúde detectaram a presença de

um novo coronavírus, cuja sequência genômica possui cerca de 80% de similaridade com o

SARS-CoV-1 (Maldonado, Bertelli e Kamenetzky, 2021) e 96,2% de similaridade com a cepa

de SARS-CoV RaTG13 que infecta morcegos (Zhou et al., 2020). Dessa forma, o novo

coronavírus foi denominado SARS-CoV-2, causador da pandemia da Coronavirus Disease

(COVID-19). Diferentemente do SARS-CoV, o SARS-CoV-2 é mais transmissível, se

espalhando em poucos meses e acometendo uma crise sanitária e econômica a nível global

(Rossi et al., 2020). Segundo dados da Universidade de Hopkins, a COVID-19 soma mais de

538 milhões de indivíduos infectados e mais de 6 milhões de mortes ao redor do mundo desde

dezembro de 2019 até o período de junho de 2022. Além da circulação entre humanos, análises

filogenéticas a partir de anticorpos neutralizantes também identificaram a circulação desse vírus

em pangolins malaios, sugerindo que esses animais sejam reservatórios intermediários

(Wacharapluesadee et al., 2021). Contudo, estima-se que os reservatórios primários de SARS-

CoV-2 sejam morcegos Rhinolophus, pois diversos CoVs já detectados em humanos também

já foram rastreados nesses animais, que eram comercializados no mesmo mercado em Wuhan

(Vijaykrishna et al., 2007; Zhou et al., 2020) (Figura 1).

Figura 1. Representação da origem dos coronavírus que infectam humanos, representados de acordo com
sua patogenicidade. Em azul, os causadores de resfriados comuns e, em vermelho, os que causam doenças
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altamente patogênicas, bem como seus respectivos reservatórios primários e intermediários (Figura adaptada de
Rabi et al., 2020).

O SARS-CoV-2, assim como outros betacoronavírus, são vírus envelopados com RNA

de fita simples e polaridade positiva (+ssRNA) de aproximadamente 32Kb (Suhail et al., 2020).

O genoma do SARS-CoV-2 é composto por quatro proteínas estruturais: glicoproteína de

superfície S, acoplada ao envelope, proteína transmembrana (M), proteína do nucleocapsídeo

(N) e proteína do envelope (E) (Figura 2a). As proteínas estruturais estão localizadas na

extremidade 3’ do genoma viral e são codificadas na mesma região que as proteínas acessórias.

Essas, variam de espécie para espécie e não apresentam funções moleculares definidas para

SARS-CoV-2, mas são determinantes para a sua patogenicidade (V’kovski et al., 2021). Os

dois terços presentes na extremidade 5’ contém os quadros de leitura aberta (ORF) 1a e 1b, que

dão origem a duas poliproteínas denominadas pp1a e pp1b, codificando as 16 proteínas não

estruturais (NSPs) (Gordon et al., 2020; Kim et al., 2020, Zhu et al., 2020) (Figura 2b).

b
 9

Figura 2. Estrutura e genoma do SARS-CoV-2. (a) Estrutura do Coronavírus e mecanismo de ligação da

proteína S com receptor ECA2 da célula hospedeira durante a infecção (Min e Sun, 2021). (b) Estrutura genômica
do SARS-CoV-2. Adaptado de Gordon., et al. (2020).

A entrada do vírus na célula hospedeira ocorre mediante a ligação da proteína S viral

com receptores presentes na superfície celular, como o receptor de angiotensina 2 (ECA2) (Wu

et al., 2020). Para que essa ligação seja possível, a proteína S precisa ser clivada em duas

porções, S1 e S2. A porção S1 consiste no domínio N-terminal, domínio de ligação ao receptor

(RBD) e em dois subdomínios SD1 e SD2, que protegem S2, mantendo a porção de fusão

conservada (V’kovski et al., 2021). S1 se liga com ao receptor da célula hospedeira, enquanto

S2 medeia a fusão da membrana viral diretamente com a membrana da célula hospedeira ou

com a membrana da vesícula que se funde por endocitose. Há mudanças conformacionais que

resultam na exposição de S2 para que ocorra a fusão, o estado “down”, em que o RBD não se

liga ao receptor, ou o estado “up”, em que é possível se ligar ao receptor (Henderson et al.,

2020; Hoffman et al., 2020). A entrada da partícula viral diretamente na membrana celular

ocorre após a clivagem da proteína S pela protease TMPRSS2 (serino protease transmembranar

do tipo II) presente na superfície da célula, expondo S2, enquanto na entrada por endocitose, a

clivagem é mediada por catepsina (CatB e CatL).

Uma vez no citoplasma, o processo de replicação tem início a partir da liberação do

genoma viral, até então envolto pelo nucleocapsídeo. A tradução de ORF1a e ORF1b produz

as poliproteínas pp1a e pp1ab, respectivamente, sendo pp1ab oriunda de um frameshift – troca

de fase de leitura – resultante da sobreposição entre ORF1a e ORF1b (V’kovski et al., 2021).

As NSP1-11 são codificadas a partir de pp1a e NSP1-10 e NSP12-16 são codificadas por pp1ab,

após clivagem proteolítica por proteases de cisteína denominadas PLpro, semelhante a papaína

e proveniente de NSP3 e 3CLpro ou Mpro, semelhante de quimotripsina, proveniente de NSP5.

As NSPs e a RNA polimerase dependente de RNA (RdRP) formam o complexo replicase-

 10

transcriptase (RTC), que dará origem ao RNA genômino e subgenômico (V’kovski et al., 2021,

Jackson et al., 2022).

Para a formação do material genético dos novos vírions, há a formação de uma fita molde, de

polaridade negativa, que será transcrita para a formação da fita de polaridade positiva, no

citoplasma, pelo RTC. A RdRP sintetiza a fita molde negativa inteira, para produzir a fita de

polaridade positiva e fitas de tamanhos variados, para sintetizar os RNAs mensageiros

subgenômicos, que ao serem traduzidas, sintetizam as proteínas acessórias e NSPs. A

montagem e empacotamento do genoma dá origem ao nucleocapsídeo viral, que será

encaminhado para vesículas formadas no Complexo de Golgi, onde aderem ao envelope,

contendo as proteínas estruturais de superfície (Kim et al., 2020). Para a maturação dos vírions,

ocorre a interação entre as demais proteínas estruturais – M, E e S formando a partícula viral

completa e a proteína S é incorporada no envelope. Em seguida, uma vez que a partícula viral

já se encontra montada, são acumuladas em vesículas e posteriormente transportadas para a

superfície celular, onde serão liberadas por exocitose (Stertz et al., 2007; Schoeman e Fielding,

2019; Jackson et al., 2022).

1.2. Epidemiologia e evolução do SARS-CoV-2

Com a alta transmissão do SARS-CoV-2 ao redor do mundo, novas linhagens surgiram

ao longo dos últimos dois anos. Assim, em 2020, com o aumento crescente das infecções e com

a detecção das mutações do SARS-CoV-2, a OMS e demais órgãos de saúde pública passaram

a classificar as variantes desse vírus que representavam maiores risco à população mundial

como Variantes de Interesse (VOIs) e Variantes de Preocupação (VOCs). Essas classificações

se dão de acordo com a transmissibilidade e sua associação com a gravidade e letalidade da

COVID-19, mantendo a vigilância e o rastreio epidemiológico (Harvey et al., 2021). Para isso,

há sistemas de depósitos de sequências em tempo real, como o PANGO e o NexTStrain, nos

 11

quais é possível submeter novas sequências e monitorar a circulação de variantes pelas regiões

em que foram identificadas.

Com base nessas informações, um estudo realizado por Chan e colaboradores em 2022

descreveu que os continentes que apresentavam maior prevalência das variantes de preocupação

no período de agosto de 2020 a julho de 2021 foram África, Europa e América do Sul (Chan et

al., 2022). Segundo a OMS, as VOCs podem estar associadas ao aumento da transmissibilidade,

virulência e alterações clínicas da doença. Dentre essas, estão as variantes Alpha (B.1.1.7), Beta

(B.1.351), Gamma (P.1) e, em maior circulação nos últimos meses, segundo a OMS, estão a

Delta (B.1.617.2) e a Ômicron (B.1.1.529) (tabela 1). Enquanto as VOIs, Épsilon (B.1.427),

Zeta (P.2), Eta (B.1.525), Theta (P.3), Iota (B.1.526), Kappa (B.1.617.1), Lambda (C.37) e Mu

(B.1.621) já estiveram em circulação anteriormente e estão associadas a casos de menor

letalidade (tabela 2).

Tabela 1. Classificação das VOCs de SARS-CoV-2 segundo a Organização Mundial da Saúde

 12

Tabela 2. Classificação das VOIs de SARS-CoV-2 segundo a Organização Mundial da Saúde.

Estudos sugerem que as mutações, principalmente na proteína S, afetam o

reconhecimento imunológico mesmo após infecção natural ou vacinação (Wratil et al., 2022).

Além disso, as mutações são descritas como estratégias de adaptação para aumentar o fitness

viral (Giovanetti et al., 2021). As mutações deletérias são compensadas por outros mecanismos

relacionados à capacidade do vírus de se adaptar em um ambiente variável (Sanjuán e Domingo-

Calap, 2016). Já se sabe que a proteína S é o principal alvo de anticorpos neutralizantes após a

infecção pelo SARS-CoV-2 e é, portanto, componente de vacinas com tecnologia baseada em

mRNA e adenovírus (Piccoli et al., 2020; Harvey et al., 2021). Como consequência, as

mutações que afetam a antigenicidade da S são de relevância para controle das variantes. Uma

mutação já descrita por aumentar a infectividade viral é a D614G, que passou a ser comum em

sequências de Spike a partir de 2020, a medida em que o vírus se espalhava (Figura 3). Essa

variação da S contém uma substituição fora do domínio RBD, que causa a mudança

conformacional na proteína, aumentando a afinidade do SARS-CoV-2 pelo receptor hACE2, o

que implica em uma maior infectividade e replicação em células epiteliais das vias aéreas em

humanos.
 13

Porém, ainda não há evidências que associem essa mutação a letalidade (Hou et al., 2020;

Korber et al., 2020; Plante et al., 2021, Zhou et al., 2021). Com o aumento da disseminação de

casos de infecções por SARS-CoV-2, o vírus continua e sofrer modificações, culminando em

diversas variantes circulantes (Li e Li, 2022).

Figura 3: Mutações presentes na proteína Spike das VOCs (Alpha, Beta, Gamma, Delta e Ômicron).
Representação da ligação da proteína S com o receptor celular ECA2 e a localização das mutações na proteína S
em cada uma das variantes de preocupação (Adaptado de Aydodgu et al., 2022).

As VOCs têm um importante impacto na transmissibilidade do vírus e na redução da

eficiência de imunizantes (Aydodgu et al., 2022). No final do ano de 2020, a variante Alpha

(B.1.1.7) foi identificada pela primeira vez no Reino Unido e associada a alterações genéticas

e ao aumento da taxa de transmissão em 50% e, como consequência, a um aumento do risco de

hospitalização, com mortalidade diretamente ligada a idade (Davies et al., 2021).

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Indivíduos com mais de 70 anos apresentaram letalidade de 13,6% dentre os hospitalizados,

enquanto os com menos de 70 anos apresentavam uma taxa de 5,3% (Cetin et al., 2021). A

mutação N501Y está ligada ao aumento da afinidade com o receptor hACE-2, fazendo da

B.1.1.7 a variante com maior afinidade ao receptor descrita até o momento (Cameroni et al.,

2022). Outra mutação de relevância já descrita é a del69-70, correlacionada com a evasão do

sistema imunológico em pacientes imunossuprimidos (Davies et al., 2021). Porém, a variante

Alpha não demonstrou redução da eficácia de vacinas para prevenção da progressão a casos

graves decorrentes da infecção (Campbell et al., 2021; OMS, 2022).

Em um curto intervalo de tempo, linhagens de alta transmissão e com alterações

genéticas também foram identificadas e associadas ao aumento de casos: Beta e Gamma. A

variante Beta (B.1.351) chegou a uma prevalência de 87% dentre os casos notificados na África

do Sul, com aumento da letalidade chegando a 20% durante hospitalização (Campbell et al.,

2021; Tegally et al., 2021; OMS, 2022). Dentre as mutações presentes na proteína S dessa

variante, há três delas (K417N, N501Y e E484K) localizadas na região RBD, aumentando a

afinidade com o hACE-2 (Figura 3). Como consequência, podem afetar a resposta de anticorpos

monoclonais e a redução da eficácia de tratamentos com plasma convalescente, soro pós-

vacinação e terapia de anticorpos monoclonais (Wibmer et al., 2021). Essas mesmas três

mutações e suas consequências também são descritas na variante Gamma (P.1), identificada em

Manaus, no Brasil. Sua taxa de infecção chegou a 75% dos casos notificados na região. Porém,

apesar do potencial escape imunológico pós infecção, não houve impacto descrito na gravidade

da COVID-19 (Buss et al., 2021; Campbell et al., 2021; Faria et al., 2021; Tao et al., 2021).

No ano de 2020, a variante Delta (B.1.617.2) foi identificada na Índia e classificada como VOC,

relacionada a casos fatais de COVID-19. Em abril de 2021, a Delta foi considerada VOI, porém,

devido ao aumento exponencial do número de casos no Reino Unido, passou a ser considera

VOC em maio do mesmo ano. Quando comparada a Alpha, essa cepa se mostrou ainda mais
 15

transmissível e acometendo mais casos de COVID-19 grave (Salvatore et al., 2021; Bolze et

al., 2021). Um relatório publicado pelas autoridades de saúde da Inglaterra em 2021 comparou

as sublinhagens de B.1.617, algumas conhecidas como linhagens AY, e mostrou que as

mutações L452R e L478K estão correlacionadas a neutralização da resposta de anticorpos

induzidos por vacinas (Public Health England, 2021). Além disso, a mutação P861R na proteína

spike presente no local de clivagem de S1 e S2 por furina contribui para a replicação viral da

Delta, uma vez que facilita a entrada do vírus na superfície celular e consequente aumento do

fitness viral (Liu et al., 2022; Zhou et al., 2022).

Em novembro de 2021, foi identificada pela primeira vez na África do Sul uma nova

variante nomeada Ômicron (B.1.1.529), que se apresenta em quatro linhagens, BA.1, BA.2 e

BA.3, BA.4, BA.5 (Cameroni et al., 2022; OMS, 2022). Dentre as mutações presentes na

proteína S, seis delas G339D, N440K, S477N, T478K, Q498R, G496S e N501Y são descritas

por aumentarem a afinidade com hACE-2, enquanto K417N, G446S, E484A, Q493R, G496S,

Q498R e N501Y, todas no domínio RBD, estão diretamente ligadas à redução da neutralização

e a capacidade de escapar da imunidade por anticorpos monoclonais (mAbs) ou convalescentes

(Figura 4a) (Hoffmann et al., 22; Mannar et al., 2022; Planas et al., 2022) (Figura 4). A proteína

S da Ômicron possui maior interação com o receptor ACE da célula hospedeira, aumentando

sua infectividade, fazendo com que seja considerada uma VOC segundo a OMS (Yin et al.,

2022). Um estudo realizado por Hui e colaboradores em pulmão de ex vivo, destacou que a

Ômicron é capaz de infectar e se replicar até setenta vezes mais rápido do que a linhagem

ancestral Wuhan-Hu-1 (19A) (Hui et al., 2022).

Em relação à cobertura vacinal, estudos sugerem que a Ômicron possui redução na

neutralização em indivíduos que não foram vacinados, infectados previamente e os que

receberam até duas doses do imunizante (Netzl et al., 2022). Contudo, apesar de mais

contagiosa, a Ômicron já foi associada a infecções menos graves em comparação com outras
 16

cepas, como a Delta. Tal fato foi corroborado com a redução das internações por COVID-19

em países de grande circulação, como os EUA (Wang et al., 2022). Com isso, a disseminação

exponencial da Ômicron (Figura 4b) mesmo após ampla cobertura vacinal adotada por diversos

países no ano de 2021, evidencia seu potencial escape imunológico, ainda que as chances de

internação e complicações da COVID-19 seja significativamente reduzida na maioria dos casos

(Nealon e Cowling, 2022; Wolter et al., 2022).

Figura 4: Estrutura da proteína Spike da Ômicron e sua distribuição epidemiológica no período de março
2020 a junho de 2022. (a) Sequência da proteína S da variante Ômicron, destacando a localização de cada mutação
já descrita (adaptada de Cameroni et al., 2020). (b) Distribuição epidemiológica da Ômicron ao redor do mundo
no período de março a junho de 2022 em comparação às demais variantes do SARS-CoV-2. Dados obtidos através
da plataforma Nextrain (https://nextstrain.org/sars-cov-2/).

1.3. COVID-19: transmissão e patogênese

A transmissão do SARS-CoV-2 entre os humanos, segundo a Organização Mundial da

Saúde (OMS), ocorre através do contato direto ou indireto das vias aéreas com gotículas

expelidas por indivíduos infectados através de tosse, espirro ou saliva, que podem estar
 17

dispersas no ar em forma de aerossol (Liu et al., 2020). Nas vias aéreas do hospedeiro, tanto no

trato superior quanto inferior, o vírus é capaz de se replicar em células epiteliais, endoteliais e

macrófagos alveolares, sugerindo que o pulmão seja o seu tropismo primário (Harrison e Wang,

2020; Ziegler et al., 2020). Uma vez infectado, o período de incubação dura em média 5 dias e,

a partir disso, o hospedeiro pode se manter assintomático ou manifestar a COVID-19. Em

ambos os casos, é possível transmitir o vírus para outros indivíduos (Liu et al., 2020).

A COVID-19, na maioria dos casos, apresenta-se de forma leve a moderada,

caracterizada por febre, fadiga, dor muscular, tosse seca, perda de olfato e paladar (Darif et al.,

2021; Hu et al., 2021). Contudo, apesar do esforço da comunidade científica para implementar

estratégias de contenção do vírus, bem como o desenvolvimento de imunizantes já acessíveis

pela população, os mecanismos que levam à forma grave da COVID-19 ainda não são

totalmente compreendidos. Já se sabe que indivíduos com idade acima de 60 anos e/ou

portadores de comorbidades prévias como diabetes, doença renal crônica e imunossupressão

são considerados do que consideramos “grupos de risco”, ou seja, com maior propensão a

desenvolver a forma grave da doença (Kaeuffer et al., 2020). A piora do quadro clínico, que

ocorre em torno de 9 a 12 dias após o início dos sintomas, é caracterizada por falta de ar,

síndrome respiratória aguda grave, queda na saturação e necessidade de aporte de oxigênio

(Chan et al., 2020; Hu et al., 2021). Características como o aumento de indicadores

inflamatórios e de coagulação, linfopenia e neutrofilia também são prognósticos de gravidade,

e são diagnosticados com frequência nos que se incluem nos grupos de risco (Chen et al., 2020;

Harrison et al., 2020; Wang et al., 2020).

Estudos demonstram que os casos mais graves da COVID-19 estão associados a um

desbalanço nas respostas imunes inata, celular e humoral, tendo como consequência a supressão

da resposta antiviral e exacerbação da resposta inflamatória (Han et al., 2021). No sítio-alvo da

infecção, como o pulmão, a infecção pelo SARS-CoV-2 leva ao recrutamento de células como
 18

monócitos, macrófagos derivados de monócitos e neutrófilos (Liao et al., 2020). Essas células

passam a produzir mediadores pró-inflamatórios como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),

interleucina (IL)-1, IL-6 e quimiocinas para conter o avanço da infecção. Contudo, um

desbalanço na resposta imunológica na fase inicial da infecção pode levar a hiperativação

imune, onde há infiltração dessas células produzindo mediadores pró-inflamatórios de forma

exacerbada, fenômeno conhecido como tempestade de citocina (Harrison e Wang, 2020,

Schultze e Aschenbrenner, 2021) (Figura 5). Além disso, o aumento de neutrófilos e seus

mecanismos efetores, como marcadores de NETose, também são bem característica de

gravidade. A NETose é uma forma de morte de neutrófilos que pode ser desencadeada por

estímulo patogênico, causando liberação de cromatina extracelular e montagem de proteínas

antivirais, formando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (Gillot et al., 2021).

Estudos já mostraram que durante a infecção, há liberação excessiva de NETs por neutrófilos

circulantes ou infiltrados no sangue e no pulmão de pacientes com COVID-19 hospitalizados

(Leppkes et al., 2020; Veras et al., 2020; Gibbs, Zuo et al., 2020; Shreenivas e Hudock, 2022).

A ativação de NETs na circulação favorece quadros de coagulopatia, já relatados como

preditivo de gravidade e desfechos desfavoráveis na COVID-19 (Zhu, Chen e Liu, 2022).

Além do tempestade de citocinas, a gravidade de pacientes com COVID-19 também se

correlaciona com a alta expressão de IFNs do tipo I e III no pulmão (Broggi et al., 2020;

Harrison e Wang, 2020). Em contrapartida, um estudo realizado em 2020 por Hadjaj e

colaboradores incluindo 50 pacientes críticos com COVID-19, mostrou que esses indivíduos

apresentavam uma resposta de IFN-I prejudicada, onde havia inibição total de IFN-β e redução

nos níveis de IFN-α em células imunes do sangue periférico. Tal fato também foi associado a

uma carga viral persistente no sangue, que induzia a uma resposta inflamatória exacerbada

(Hadjaj et al., 2020). Assim, somada à produção excessiva de mediadores pró-inflamatórios, a

 19

supressão da resposta de IFN no sangue e superexpressão no sítio alvo são indicativos de

progressão da doença (Blanco-Melo et al., 2020, Schultze e Aschenbrenner, 2021).

Um dos biomarcadores de gravidade da COVID-19 é a redução do número de linfócitos,

comprometendo a resposta celular e agravando os quadros da doença (Zheng et al., 2020).

Alguns estudos compararam pacientes graves com os que se recuperaram mais rapidamente e

foi vista uma redução nas subpopulações de células T (CD4+, CD8+, Th1, Th17 e Treg),

principalmente nos mais críticos e com carga viral mais elevada (Yi et al., 2020; Caldrer et al.,

2021). A resposta comprometida de T CD4+ também foi associada a marcadores de exaustão,

enquanto em pacientes com a forma branda da doença, foi observada ativação de T CD8 + de

forma balanceada (Chen e John Wherry, 2020).

Estudos de transcriptoma a partir do sangue periférico de indivíduos buscaram

caracterizar o perfil de ativação de células imunes em diferentes quadros clínicos, comparando

as formas leve e grave doença. Foi visto uma redução considerável de monócitos clássicos

CD14+CD16- e monócitos não clássicos CD14-CD16+ em pacientes hospitalizados em

comparação àqueles que apresentaram sintomas leves e aos controles saudáveis na fase inicial

da doença (Wilk et al., 2020). Juntamente a isso, foi observada redução de subpopulações de

células imune inatas como linfócitos Tγδ, células dendríticas plasmocitóides (pDCs),

convencionais (DC) e células Natural Killer (NK) no soro de pacientes graves. Tal fato levou

os autores a considerarem que o agravamento do quadro também pode estar associado a uma

redução dessas células na fase inicial da COVID-19. Porém, nas fases mais tardias, os

monócitos CD14+CD16+ produtores de IL-6 estavam aumentados significativamente nos

pacientes em terapia intensiva, agravando a inflamação sistêmica (Bergamaschi et al., 2021;

Desterke et al., 2021).

Diante de todo o quadro de desbalanço da resposta imune para conter a infecção, uma

vez que o quadro inflamatório não seja revertido, danos mais graves como inflamação sistêmica
 20

e falência de múltiplos órgãos podem levar o indivíduo a óbito (Harrison e Wang, 2020; Tang

et al., 2020).

Figura 5: Representação da patogênese e resposta imune inata do hospedeiro ao SARS-CoV-2 em células

permissivas no pulmão. O vírus é reconhecido pelos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs) presentes
nas células epiteliais alveolares, ativando a resposta imune inata do hospedeiro. Como consequência, há o
recrutamento de células imunes como macrófagos e neutrófilos, que passarão a produzir mediadores pró -
inflamatórios de forma exacerbada nos tecidos alvo. A tempestade de citocinas, quando não controlada, pode
ocasionar dano tecidual e levar à falência de órgãos vitais (Harrison e Wang, 2020).

1.4. O sistema ubiquitina-proteassoma e o Complexo Imunoproteassoma (IP)

Dentre os mecanismos celulares envolvidos na ativação do sistema imune,

principalmente no contexto de doenças inflamatórias, é possível destacar o sistema ubiquitina-

proteassoma (UPS). Esse sistema é responsável pelo processamento e clivagem proteica em

células eucarióticas, de forma independente de lisossomos. Dentre suas funções de destaque, o

UPS é capaz de gerar peptídeos a serem apresentados pelo complexo de histocompatibilidade

de classe I (MHC-I); degradar proteínas danificadas por condições de estresse celular, como a

formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e degradação de proteínas para promoção da

 21

renovação regular e controle homeostático (Ferrington e Gregerson, 2012; McCarthy e

WeinBerg, 2015; Schneider, Lee e Nicola, 2021). As proteínas a serem degradadas por UPS

são conjugadas a ubiquitina, processo denominado ubiquitinação, permitindo que sejam

endereçadas e reconhecidas por esse sistema (Basler et al., 2021).

O proteassoma consiste em um complexo catalítico expresso no citosol e no núcleo da

maioria das células, composto por uma partícula central 20S. Sua estrutura é formada por um

complexo em forma de barril contendo 4 anéis heptaméricos, no qual a degradação proteica

ocorre de forma independente de ATP. As subunidades α1-7 (também identificadas pelos genes

PSMA1-7) compõem os dois anéis externos, que facilitam o reconhecimento da proteína a ser

degradada, além de recrutarem proteínas reguladoras (Krüger e Kloetzel, 2012). Já os dois anéis

internos, que apresentam as subunidades cataliticamente ativas, são compostos por β1-7 (genes

PSMB6, 7, 3, 4, 5, 1 e 2 respectivamente) (Johnston-Carey, Pomatto e Davies, 2016). Dessas,

β1, β2 e β5 exercem atividade proteolítica e são expressas de forma constitutiva nas células

(Groll et al,1997; McCarty e Weinberg, 2015). Essas três subunidades são responsáveis pela

atividade semelhante a caspase, tripsina e quimotripsina, respectivamente (Basler e Groettrup,

2021). Contudo, os anéis externos α podem se ligar a um ou dois complexos reguladores 19S

(também denominados PA700), formando o proteassoma 26S.

A estrutura 26S conta com receptores de ubiquitina, enzimas desubiquitilantes e um anel

ATPase, que desdobram a proteína para introduzi-la no núcleo 20S, de forma dependente de

ATP (Liu e Jacobson, 2013). Após a degradação proteica em múltiplas clivagens pelo

proteassoma, há a geração de peptídeos de tamanhos variados. Posteriormente, esses peptídeos

são transportados do citosol para o retículo endoplasmático (RE) pela proteína transportadora

para processamento de antígeno (TAP) - uma subunidade do MHC-I que agrupa as moléculas

envolvidas na apresentação -, visando aumentar a eficiência desse processo (Neefjes, Momburg

e Hämmerling, 1993). Em seguida, os peptídeos serão apresentados via MHC-I para células T
 22

CD8+, tanto na superfície de células infectadas quanto por células apresentadoras de antígenos

(APCs) (Neefjes, Momburg e Hämmerling, 1993; McCarty e Weinberg, 2015).

O complexo imunoproteassoma (IP) é induzido em células imunes e não imunes sob

estímulo inflamatório, como por interferon gama (IFN-γ) ou fator de necrose tumoral alfa

(TNF-α) e sob condições de estresse oxidativo (Johnston-Carey, Pomatto e Davies, 2016).

Nessas condições, as subunidades catalíticas β1, β2 e β5 são substituídas por subunidades

homólogas, que foram identificadas como β1i (gene PSMB9, low molecular weight protein 2,

LMP2), β2i (gene PSMB10, multicatalytic endopeptidase complex-like 1, MECL-1) e β5i (gene

PSMB8/LMP7 (Ortiz-Navarrete et al., 1991) (Figura 5). As subunidades β1i e β5i são

codificadas por genes da região do MHC-II (Aki et al., 1994; Tanaka, 1994; McCarty e

Weinberg, 2015).

Figura 6. Estrutura do proteassoma e a formação do Complexo Imunoproteassoma. O proteassoma

constitutivo, formado pela estrutura 20S tendo suas subunidades catalíticas substituídas por subunidades induzidas
sob estímulo inflamatório por IFN-γ, formando o imunoproteassoma (Adaptada de McCarthy, Mary K., e Jason
B. Weinberg).

No IP, a atividade enzimática do tipo caspase exercida por β1i é reduzida em relação à

sua contraparte constitutiva, enquanto a atividade da quimotripsina é aumentada. Tal fato

 23

favorece a clivagem de peptídeos com resíduos hidrofóbicos básicos C-terminais, aumentando

a eficiência da apresentação em MHC-I por IP (Groettrup e Basler, 2010; McCarty e Weinberg,

2015). A maioria desses epítopos gerados por imunoproteassoma são descritos como

imunodominantes, desencadeando uma resposta por células T citotóxicas (CTL) mais robusta

em relação a epítopos gerados a partir das mesmas regiões de proteínas que sofreram

degradação a partir do proteassoma constitutivo, contribuindo para a imunidade adaptativa e

vigilância imunológica (Angeles, Fung e Luo, 2012). O estímulo por IFN-γ nas células induz,

além das subunidades do IP, genes de moléculas de MHC-I e II, genes TAP e o regulador 11S

(ou PA28 α/β), um complexo proteico formado por 3 subunidades α e 4 subunidades β

(Sugiyama et al., 2013). Assim como o regulador 19S, esse complexo se liga a 20S, e é capaz

de aumentar drasticamente a sua capacidade de degradação de peptídeos curtos para

apresentação antigênica de forma independente de ATP e ubiquitinação (Dubiel et al., 1992;

Raule et al., 2014). Além disso, o mecanismo regulatório envolvido na expressão das

subunidades de IP induzida por IFN-γ também está relacionado com a ativação de fatores de

transcrição como transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT-1) e fator regulador de

interferon 1 (IRF-1) (Nakimi et al., 2005; Angeles, Fung e Luo, 2012). O imunoproteassoma

também tem seus mecanismos associados à outras funções e patologias, como polarização de

macrófagos alveolares (Chen et al., 2016); doenças pulmonares (Keller et al., 2015);

neurodegenerativas e cognitivas (Mishto et al., 2016, Wagner et al., 2017; Bi et al., 2021);

inflamatórias crônicas (Koerner et al., 2017; De Freitas Chama et al., 2021; Du et al., 2021) e

autoimunes (Zais et al., 2011).

A indução do IP está associada à produção de citocinas pró-inflamatórias por células

imunes (Angeles, Fung e Luo, 2012). Em estudos com DCs derivadas da medula óssea de

camundongos β1i-/-, foi observada uma redução de IFN-α, IL-1β, IL-6 e TNF-α em comparação

aos do tipo selvagem (Hensley et al., 2010). Essa redução da capacidade de produzir citocinas
 24

também foi associada com uma sinalização comprometida de NF-κB (Hensley et al., 2010).

Um estudo utilizando um inibidor seletivo de β5i, ONX-0914, resulta na menor produção de

IL-23 em monócitos e de TNFα e IL-6 em células T em modelos experimentais de artrite

reumatóide (Muchamuel et al., 2009).

Além de aumentar a eficiência das respostas de CD8 + por apresentação de antígenos via

MHC-I, já foi demonstrado que IP também está envolvido na diferenciação e proliferação

dessas células. Em animais β2i -/-, houve uma redução de células T CD8 no baço e aumento da

razão CD4+/CD8+, destacando o papel da subunidade na maturação e desenvolvimento dessas

células (Basler et al., 2006; McCarty e Weinberg, 2015). Ademais, o IP também auxilia na

diferenciação de células T auxiliares pró-inflamatórias, uma vez que suprime a diferenciação

de Th1 e Th17 sob efeito do inibidor ONX-0914 (Kalim et al., 2012).

O imunoproteassoma tem papel fundamental no controle homeostático celular. Uma vez

que a oxidação proteica faz parte de um mecanismo metabólico, é fundamental que a célula

aumente a taxa de degradação proteica sob condições de estresse oxidativo (Aiken et al., 2011).

Nessas condições, o IP, principalmente quando ligado ao regulador PA28 atua removendo

proteínas poliubiquitinadas ou danificadas por oxidantes como peróxido de hidrogênio (H 2O2)

ou induzido por citocinas de forma seletiva e mais rápida em relação ao proteassoma

constitutivo, impedindo a formação de agregados proteicos (Seifert et al., 2010; Pickering e

Davies, 2012). Na ausência de subunidades do IP em experimentos realizados com

camundongos, foi destacado o acúmulo de proteínas oxidadas no fígado e no cérebro dos

animais, evidenciando a função do imunoproteassoma no controle do turnover proteico

(Pickering et al., 2010).

1.4.1 O papel do IP nas infecções virais

 25

Em doenças virais, a indução do IP está correlacionada com a eliminação das células

infectadas por CTL (Groettrup e Basler, 2010). Em um estudo realizado por Chen e

colaboradores em 2001, foi feita uma transferência adotiva de células T de camundongos

infectados com o vírus da influenza e knockout para as subunidades de IP para camundongos

selvagens (WT). Foi então observado um comprometimento da resposta celular ao vírus,

impactando na sobrevivência dos animais e na expansão de células CD8 + (Chen et al., 2001).

A deficiência das subunidades de IP também reduziu a ativação de células T CD8+ em infecções

pelo vírus da hepatite B (HBV) e da coriomeningite linfocítica (LCMV) (Robek et al., 2007;

Kincaid et al., 2012; Kimura et al., 2015). Tais dados evidenciam o papel do imunoproteassoma

na ativação e expansão de células T durante a resposta a uma infecção viral.

Um outro estudo desenvolvido por Josset e colaboradores em 2013, utilizando dados de

transcriptoma de células epiteliais do pulmão de indivíduos acometidos por MERS-CoV e

SARS-CoV em diferentes horas pós infecção (hpi). Foi visto que, na infecção por MERS-CoV,

os genes β5i e β1i foram regulados negativamente a partir de 12hpi. Já na infecção por SARS-

CoV, esses mesmos genes foram regulados positivamente a partir de 36hpi. Esses dados então

sugerem que MERS pode limitar a resposta imune adaptativa do hospedeiro, limitando a

apresentação de peptídeos via MHC-I, enquanto SARS-CoV favorece a apresentação antigênica

em fases mais tardias da infecção nas vias aéreas (Josset et al., 2013). Já no SARS-CoV-2, em

um estudo desenvolvido por Desterke e colaboradores, observaram que a apresentação de

antígeno por MHC-I foi intensamente ativada no pulmão de indivíduos infectados.

Um estudo com gammaherpesvirus-68 murino (MHV-8) in vivo destacou um que a

infecção pelo vírus, somada a um estímulo de IFN-γ, induziu a expressão do IP no pulmão

desses animais, atribuído a atividade aumentada de 20S e 26S em células alveolares. Com isso,

os autores correlacionaram a indução de IP estimulada por IFN-γ com uma resposta imune

eficiente à infecção nos pulmões (Keller et al., 2015). Quanto ao papel do IP na polarização de
 26

macrófagos, experimentos testaram em macrófagos alveolares murinos, tanto de linhagem

quanto primários, o impacto da inibição da subunidade na polarização. Assim, animais WT e

β1i-/- ou β5i-/- receberam estímulo por LPS ou IFN-γ para indução da polarização em M1 ou

estímulo com IL-4 para polarização em M2. Foi visto que a polarização em M1 era

independente de β1i e de β5i. Já em M2, observaram que a inibição de β1i era neutralizante da

polarização, enquanto β5i-/- aumentava a polarização. Esses resultados sugerem que a

imunidade inata no pulmão pode ser modelada pela inibição de subunidades de IP

individualmente (Chen et al., 2014).

2. JUSTIFICATIVA
O SARS-CoV-2 têm se espalhado rapidamente entre hospedeiros humanos e causado

milhões de casos de COVID-19 por todo o mundo, e não há tratamento eficaz descrito até o

momento. A patogênese desse vírus destaca-se pela sua entrada nas vias aéreas e disseminação

por diversos órgãos, acometendo tecidos-alvo como os pulmões, principalmente naqueles que

apresentam comorbidades prévias ou idade acima de 60 anos (Chan et al., 2020). Caso a

resposta imune do hospedeiro não seja eficiente para conter a replicação viral, a infecção aguda

pode levar ao comprometimento da capacidade respiratória (Harrison e Wang, 2020). Estudos

prévios descrevem que a forma grave da COVID-19 tem como característica principal a

produção excessiva de mediadores pró-inflamatórios nos pulmões (Liu et al., 2020; Walls et

al., 2020). Essa resposta inflamatória exacerbada também está associada ao recrutamento e

ativação de células imunes, causando infiltração dessas células e inflamação sistêmica

(Mangalmurti e Hunter, 2020). Contudo, as interações vírus-célula que promovem a replicação,

desbalanço da resposta imune e promoção da lesão tecidual durante a forma grave da COVID-

19 ainda não são totalmente conhecidas. (Harrison e Wang, 2020, Merad e Martin, 2020).

Durante uma infecção viral, já se sabe que a ativação do IP faz parte da resposta imune inata

e da resposta inflamatória, mediadas por linfócitos T CD8+ (McCarthy e Weinberg, 2015).

 27

Tendo em vista que a infecção pelo SARS-CoV-2 pode desencadear o recrutamento de células

imunes e quadros de inflamação aguda no pulmão, é de interesse avaliar se, diante desse

cenário, há indução do imunoproteassoma nessas células. Assim, nossa hipótese é de que a

ativação das subunidades do IP, diante do ambiente inflamatório induzido durante a infecção

pelo SARS-CoV-2, pode estar associada a uma ativação da resposta imunológica nos sítios-

alvo da infecção e em células circulantes e consequentemente, ao desfecho da COVID-19.

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral

Esse trabalho tem como objetivo estudar a ativação e o envolvimento do

imunoproteassoma na evolução clínica da COVID-19 através da análise de dados de

transcriptomas scRNA-seq disponíveis publicamente.

3.2 Objetivos específicos

• Traçar o perfil de células predominantes no fluido de lavado broncoalveolar (LBA) de

pacientes com COVID-19 moderada e grave através de bancos de dados de

transcriptoma;

• Avaliar o nível de expressão das subunidades do proteassoma e do IP na subpopulação

celular mais abundante no LBA dos grupos com COVID-19;

• Observar o nível de expressão de IP e de genes associados ao processamento e

apresentação de antígenos em APCs e monócitos nos diferentes quadros clínicos da

COVID-19;

• Avaliar se há correlação entre o nível de expressão das subunidades do IP e de genes

associados ao processamento antigênico com o desfecho da COVID-19 grave em APCs;

• Avaliar se há correlação entre o nível de expressão das subunidades do IP e de genes

associados com a ativação de células T CD8 + nos diferentes quadros clínicos e

desfechos da COVID-19;
 28

• Observar se há associação entre o perfil de clivagem proteassomal com a patogenicidade

de variantes circulantes do SARS-CoV-2.

• Avaliar o nível de expressão de IP e de genes associados ao processamento e

apresentação de antígenos em células do sangue periférico nos diferentes quadros

clínicos da COVID-19;

4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Análises de transcritos através de bancos de dados de scRNA-seq de fluido de
lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes com COVID-19

Para as análises de expressão dos genes de IP em fluido de lavado broncoalveolar (LBA)

de pacientes com COVID-19, foram utilizados dados de sequência de RNA de célula única (do

inglês, single cell RNA sequencing) (Tang et al., 2009). Os dados foram adquiridos através da

plataforma Gene Expression Omnibus (GEO) e disponibilizados publicamente por Liao e

colaboradores (ID: GSE145926) (Liao et al., 2020) e por Bost e colaboradores (ID:

GSE157344) (Bost et al., 2021). Agrupando os dados obtidos dos dois grupos, a coorte conta

com dados de 3 indivíduos de grupo controle, 3 pacientes com a forma moderada da COVID-

19 e 27 com a forma grave da doença. Foram considerados como pacientes moderados aqueles

que apresentavam sintomas respiratórios, febre e pneumonia diagnosticados por tomografia

computadorizada. Os pacientes foram considerados graves considerando desconforto

respiratório, saturação de oxigênio ≤ 93% em repouso, razão entre pressão parcial de oxigênio

arterial e fração inspirada de oxigênio (PaO2/FiO2) ≤ 300mmHg e progressão das lesões em até

48h por imagem pulmonar. Dos pacientes graves, 17 sobreviveram e 10 foram a óbito. Para as

análises de expressão gênica, os dados foram implementados através da biblioteca Seurat v3

(Stuart e Butler, 2019) da linguagem de programação R, onde foram criados os objetos para

cada paciente incluindo metadados de desfecho, grau de severidade, sexo e idade, seguido pela

normalização de dados, identificação de genes variáveis, redimensionamento dos dados através

de um modelo linear com o uso de componentes principais (PCA). Para parâmetros de

 29

viabilidade celular, foram consideradas as células que continham pelo menos 1.000 anotações

celulares (nCount_RNA), conteúdo de RNA derivado de DNA mitocondrial menor do que 10%

(Percent.MT) e pelo menos 200 e no máximo 6.000 genes expressos (nFeature_RNA).

Os dados foram normalizados e padronizados pela função ScaleData a partir do nCount_RNA

e Percent.MT. Foram utilizadas 50 dimensões (UMAP) – quantos eventos serão considerados

nas análises-. A divisão de grupos celulares foi obtida por clusters, identificados com uma

resolução de 1.2 (FindClusters). Os dados foram obtidos utilizando as bibliotecas ggplot2 e

dplyr. Em seguida, foram realizadas análises de expressão diferenciais para os genes das três

subunidades do imunoproteassoma (PSMB9, PSMB10 e PSMB8). A partir desses dados, foi

possível obter tabelas contendo os níveis de expressão de cada gene para cada subgrupo celular.

As análises estatísticas entre os grupos com diferentes quadros clínicos e desfechos para

COVID-19 foram realizadas no software GraphPad Prism®.

4.2 Predição de clivagem por proteassoma e imunoproteassoma

Para a predição de clivagem proteassomal, foram utilizadas sequências em formato

FASTA de proteínas do SARS-CoV-2 disponibilizadas publicamente e obtidas através

GenBank do National Library of Medicine (NIH- NCBI) (tabela 2). As sequências foram

analisadas através de uma ferramenta computacional, iPCPS, utilizada para prever locais de

clivagem por proteassoma (Gomez-Perosanz e Ras-Carmona e Reche, 2020). O servidor iPCPS

foi configurado para gerar modelos com maior sensibilidade (SE), com o intuito de aumentar a

confiança em resultados verdades-positivos. Foi utilizado o modelo 1 para imunoproteassoma,

com sensibilidade (SE) 0.906 e especificidade (SP) 0.545. Para proteassoma, foi utilizado o

mesmo modelo, com SE 0.855 e SP 0.603. Os resultados entre os perfis de clivagem foram

comparados manualmente. Tabela 2: Código de acesso para a sequência FASTA de cada uma

das variantes de SARS-CoV-2 analisadas.

 30

Variante GenBank (ID)

Wuhan P0DTC
Alpha MZ344997.1
Beta MW598419.1
Gamma MZ169911.1

Delta OL664045.1
Ômicron OL672836.1
Epsilon MW453103.1
Zeta MZ833438.1
Eta MZ362451.1
Theta MW896444.1
Iota MZ702450.1
Kappa OM366054.1
Lambda MZ275302.1

4.3 Análise de transcritos através de bancos de dados de scRNA-seq de células

mononucleares de sangue (PBMC) por scRNA-seq

Para as análises de expressão dos genes de IP em PBMC de pacientes com COVID-19,

serão utilizados dados de sc-RNA-seq (Tang et al., 2009). Os dados serão adquiridos através

da plataforma Gene Expression Omnibus (GEO) e disponibilizados publicamente por Bost e

colaboradores (ID: GSE157344) (Bost et al., 2021). A coorte conta com dados de 5 indivíduos

de grupo controle, 7 pacientes com a forma moderada da COVID-19 e 20 com a forma grave

da doença. Os pacientes moderados são aqueles que apresentaram sintomas respiratórios, febre

e pneumonia diagnosticados por tomografia computadorizada. Os pacientes graves

apresentaram desconforto respiratório, saturação de oxigênio ≤ 93% em repouso, razão entre

pressão parcial de oxigênio arterial e fração inspirada de oxigênio (PaO 2/FiO2) ≤ 300mmHg e

progressão das lesões em até 48h por imagem pulmonar. Dos pacientes graves, 8 sobreviveram

e 12 foram a óbito. Para as análises de expressão gênica, os dados serão implementados através

da biblioteca Seurat v3 (Stuart e Butler, 2019) da linguagem de programação R, onde serão

criados os objetos para cada paciente incluindo metadados de desfecho, grau de severidade,

sexo e idade, seguido pela normalização de dados, identificação de genes variáveis,

redimensionamento dos dados através de um modelo linear com o uso de componentes

 31

principais (PCA). Para parâmetros de viabilidade celular, serão consideradas as células que

contenham pelo menos 1.000 anotações celulares (nCount_RNA), conteúdo de RNA derivado

de DNA mitocondrial menor do que 10% (Percent.MT) e pelo menos 200 e no máximo 6.000

genes expressos (nFeature_RNA). Os dados serão normalizados e padronizados pela função

ScaleData a partir do nCount_RNA e Percent.MT. Utilizaremos 50 dimensões (UMAP) –

número de eventos que serão considerados nas análises. Pretendemos obter a divisão de grupos

celulares por clusters, identificados com uma resolução de 1.2 (FindClusters). Os dados serão

obtidos com auxílio das bibliotecas ggplot2 e dplyr. Em seguida, realizar análises de expressão

diferenciais para os genes das três subunidades do imunoproteassoma (PSMB9, PSMB10 e

PSMB8) e demais genes de interesse.

5. RESULTADOS PRELIMINARES
5.1 Predomínio de células mieloides CD14+ no LBA de pacientes com COVID-19

Para investigar a possível ativação do complexo IP nos diferentes quadros clínicos e

desfechos da COVID-19, nós compilamos dois bancos de dados de transcritos obtidos através

de scRNA-seq do fluido de lavado broncoalveolar (LBA) que foram disponibilizados

publicamente. A coorte de estudo integrada é composta por 3 pacientes com COVID-19

moderada - com quadros que não requeriam hospitalização-, 27 pacientes com COVID-19

grave que demandaram hospitalização e 3 controles (doadores negativos para SARS-CoV-2 e

assintomáticos).

Nosso primeiro passo foi caracterizar o perfil de células presentes nos LBA desses

pacientes, onde foram identificados 36 agrupamentos celulares (clusters) por meio de expressão

diferencial de genes, definidos pela biblioteca Seurat conforme exemplificado: subgrupos de

células mieloides CD14+ (com expressão diferencial de CD14+ e LYZ+), macrófagos alveolares

(CD14+, CD68+, MARCO+), monócitos (FCGR3A+, CD14+), células dendríticas convencionais

(DCs) (CST3+), células dendríticas plasmocitoides (pDCs) (ITMC2+, GZMB+), células T

 32

(CD3D+), células natural killers (NK) (GNLY+) e megacariócitos (PPBP+). A distribuição por

similaridade dessas populações pode ser observada utilizando o algoritmo UMAP, sendo cada

subpopulação indicado por uma cor (Figura 7). Através dessa análise, foi possível observar

que a maioria das células do LBA dos pacientes com COVID-19 expressam CD14+,

característico de células mieloides. Dentre a população mieloide, que também comporta

macrófagos e monócitos diferenciados, os macrófagos alveolares representavam a

subpopulação majoritária.
 33

Figura 7: Mapa dos agrupamentos celulares presentes no fluido de lavado broncoalveolar de pacientes com
COVID-19. Foram incluídos transcritos de pacientes com COVID-19 moderada (n=3), grave (n=27) e controles
(n=3). Foram identificados 36 subtipos celulares representados graficamente por UMAP, sendo células que
expressam CD14+ as mais abundantes.

5.2 Aumento da expressão das subunidades do IP em CD14 no LBA de pacientes

com COVID-19

Dada o aumento global de células mieloides CD14+ total no LBA dos pacientes com

COVID-19, avaliamos a expressão gênica das subunidades catalíticas do proteassoma

constitutivo (PSMB6, PSMB7 e PSMB5) e do IP (PSMB9, PSMB10 e PSMB8) presentes nessas

células, comparando o nível de expressão entre os três grupos. Observamos que as três

subunidades catalíticas do proteassoma estão mais expressas em indivíduos com a forma

moderada da doença, e que não há aumento em indivíduos graves em comparação ao grupo

controle (Figura 8a). Já no imunoproteassoma, observamos um aumento da expressão das

subunidades em ambos os grupos de pacientes com COVID-19. Porém, o grupo de pacientes

moderados apresenta maior nível de expressão de IP quando comparado ao grupo grave/crítico

(Figura 8b).
 34

Figura 8: Expressão das três subunidades do IP aumentadas em células CD14 + no LBA de pacientes com
COVID-19 moderada e grave em relação ao grupo controle. (a) Expressão dos genes do proteassoma
constitutivo PSMB6, PSMB7 e PSMB5 e (b) do imunoproteassoma PSMB9, PSMB10 e PSMB8 em CD14+ em
controles (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

5.3 A indução da expressão de IP em macrófagos alveolares e pDCs está associada

principalmente a quadros de COVID-19 moderada

Visto que o aumento da expressão do IP em células CD14 + de pacientes com COVID-

19 pode ter relação com o estímulo inflamatório durante a infecção, o próximo passo foi

observar se o mesmo ocorre em células apresentadoras de antígeno (APCs) e em monócitos.

Assim, comparamos a expressão de β1i, β2i e β5i nas APCs (macrófagos alveolares, DCs e

pDCs) e em monócitos nos transcritos de LBA dos três grupos. Nos macrófagos, observamos
 35

um aumento dos níveis de expressão de IP apenas no grupo com COVID-19 moderada e não

houve diferença significativa entre os grupos grave e o controle (Figura 9a). Nas DCs,

observamos o aumento de β1i, β2i e β5i em ambos os quadros clínicos quando comparados ao

controle (Figura 9b). Nas pDCs, assim como nos macrófagos, observamos a indução de IP

evidenciada apenas nos casos de COVID-19 moderada (Figura 9c). Nos monócitos, assim

como nas DCs, a indução de IP é vista em ambos os grupos infectados (Figura 9d). Nosso

dados sugerem que a ativação do IP em células apresentadoras, como macrófagos e pDCs, pode

estar contribuindo para uma resposta robusta na fase inicial de uma infecção, restringindo a

replicação do SARS-CoV-2 e conferindo uma proteção contra o agravamento da doença.

a
 36

d
 37

Figura 9: Expressão das três subunidades do IP células apresentadoras de antígeno (APCs) e monócitos no
LBA de pacientes com COVID-19 moderada e grave. Expressão dos genes PSMB9, PSMB10 e PSMB8
respectivamente em (a) macrófagos alveolares, (b) células dendríticas, (c) células dendríticas plasmocitóides e (d)
monócitos nos grupos controle (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P
<0,001.

5.4 O aumento da expressão de IP se correlaciona com a maior processamento e

apresentação antigênica em macrófagos alveolares em pacientes com COVID-19
moderada

Tendo em vista um aumento da expressão do IP em macrófagos e pDCs de pacientes

com quadros moderados da doença, o próximo passo foi observar se essa indução se

correlaciona com a expressão de genes associados ao processamento e apresentação de

antígenos nas APCs. De início, observamos o nível de expressão das proteínas transportadoras

para processamento de antígeno (TAP1 e TAP2) e do gene ativador e regulador de proteassoma

PA28α/β (codificado pelo gene PSME1) nas APCs. Nos macrófagos alveolares, observamos

que o regulador PSME1 foi induzido apenas no grupo moderado, enquanto TAP1 e TAP2

apesar de não apresentarem diferença significativa entre os grupos COVID-19 e o controle, foi

visto um aumento significativo no grupo moderado em relação ao grave (Figura 10a). Nas

DCs, observamos que há indução de PSME1 e TAP1 durante a infecção, sem diferença

significativa entre os quadros clínicos, enquanto TAP2 é induzido no grupo grave (Figura 10b).

Nas pDCs, PSME1 é induzido nos casos moderados, enquanto TAP1 aumenta nos grupos

infectados, sem diferença entre eles, e TAP2 não é induzido durante a infecção quando

comparados ao controle, mas é significativamente maior em quadros de COVID-19 moderada

quando comparada aos graves (Figura 10c).

 38

c
 39

Figura 10: Expressão de genes associados ao processamento e apresentação de antígenos nas APCs do LBA
de pacientes com COVID-19 moderada e grave. Expressão dos genes TAP1, TAP2 e PSME1 em (a) macrófagos
alveolares, (b) células dendríticas e (c) células dendríticas plasmocitóides nos grupos controle ( n=3), pacientes
com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

Em seguida, avaliamos os níveis de expressão de MHC-I nessas células (codificado pelo gene

HLA-A), associado a apresentação antigênica nos diferentes quadros clínicos. Assim, seguindo

um perfil similar ao observado nas subunidades do IP, o MHC-I também apresenta níveis de

expressão maior em macrófagos e pDCs de indivíduos com COVID-19 moderada, enquanto

DCs aumenta em ambos os quadros clínicos (Figura 11).

Figura 11: Expressão de MHC-I nas APCs do LBA de pacientes com COVID-19 moderada e grave.
Expressão de HLA-A em (a) macrófagos alveolares, (b) células dendríticas e (c) células dendríticas plasmocitóides
nos grupos controle (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

Através das presentes observações, é possível notar que o aumento do IP, do regulador

PA28 e de MHC-I em macrófagos alveolares e pDCs em pacientes com COVID-19 moderada,

em conjunto, podem estar associados a um processamento antigênico mais eficiente.

5.5 Maior indução de imunoproteassoma em APCs associada à sobrevivência nos

quadros de COVID-19 grave

Dado que o aumento da expressão das subunidades do imunoproteassoma em pacientes

com COVID-19 moderada pode estar impedindo a evolução da doença, o próximo passo é

observar se há correlação entre expressão de IP em APCs e os diferentes desfechos em casos

 40

graves. Para isso, utilizamos transcritos de LBA dos 27 pacientes graves, que foram

subdivididos entre os que sobreviveram (n=17) e os que foram a óbito (n=10). Assim,

observamos que há uma maior indução de IP nas APCs de pacientes que sobrevivem ao quadro

clínico de gravidade (Figura 12).

c
 41

Figura 12: Análise da expressão das três subunidades do IP células apresentadoras de antígeno (APCs) no
LBA de pacientes com COVID-19 grave. Foram incluídos dados de LBA de pacientes graves que sobreviveram
(n=17) e nos que foram a óbito (n=10). Teste t com C.I > 95%.

5.6 Processamento e apresentação antigênica via MHC-I mais eficiente em

macrófagos alveolares associados a um desfecho positivo nos casos de gravidade

Visto que as subunidades de IP são induzidas nas APCs daqueles que sobrevivem,

levantamos a hipótese de que esse fato também poderia estar associado a uma maior

apresentação e processamento antigênico nesse mesmo grupo. Assim, observamos que nos

macrófagos, a expressão de MHC-I é aumentada no grupo que obteve um desfecho positivo.

Enquanto nas subpopulações de células dendríticas, não houve diferença de expressão entre os

desfechos (Figura 13).

Figura 13: Análise da expressão de MHC-I em células apresentadoras de antígeno (APCs) no LBA de
pacientes com COVID-19 grave. Foram incluídos dados de LBA de pacientes graves que sobreviveram (n=17)
e nos que foram a óbito (n=10). Teste t com C.I > 95%.
 42

Uma vez que houve indução de IP e MHC-I nos macrófagos alveolares dos que

sobrevivem, também observamos que a expressão de outros reguladores associados ao

imunoproteassoma, PA28, TAPs 1 e 2, também estavam aumentados nesse mesmo grupo

(Figura 14). Logo, nossos resultados sugerem que, a indução de IP somada ao favorecimento

da apresentação antigênica nos macrófagos, também podem estar associados a um desfecho

positivo em casos graves de COVID-19.

Figura 14: Análise da expressão de genes associados a apresentação antigênica em macrófagos alveolares
no LBA de pacientes com COVID-19 grave. Foram incluídos dados de LBA de pacientes graves que
sobreviveram (n=17) e nos que foram a óbito (n=10). Teste t com C.I > 95%.

5.7 Aumento da expressão de IP e genes associados à função efetora células T CD8+

no LBA de pacientes graves

Estudos relacionados à infecção pelo SARS-CoV-2 sugerem que, apesar na redução do

número de linfócitos, a ativação e resposta das células T CD8+ estão associadas a proteção

contra as formas graves da COVID-19 (Rha e Shin, 2021). A partir disso, nosso próximo passo

foi avaliar a expressão de subunidades do IP e de genes associados à ativação de células T CD8 +

em diferentes quadros clínicos da COVID-19. Primeiramente, observamos que há indução do

IP em CD8+ tanto nos pacientes moderados quantos nos graves (Figura 15).
 43

Figura 15: Expressão das subunidades do imunoproteassoma em células T CD8 + do LBA de pacientes com
COVID-19 moderada e grave. Expressão de PSMB9, PSMB10 e PSMB8 respectivamente em células T CD8+
nos grupos controle (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

Com relação a funções efetoras de células CD8+ durante a COVID-19, nós inicialmente

avaliamos a expressão de três genes marcadores de função efetora e/ou citotoxicidade dessas

células. Primeiramente, observamos que o gene CD8A, encontrado em células T citotóxicas e

que reconhece antígenos apresentados por APCs via MHC-I, está aumentado em ambos os

grupos com COVID-19, principalmente nos moderados. Em seguida, a granzima Z (GZMK),

associada a atividade citotóxica de CD8 +, está mais expressa nas células de pacientes de

COVID-19 grave. Enquanto na granzima B (GZMB), não apresenta aumento significativo entre

os grupos (Figura 16). Contudo, nosso estudo tem como perspectiva futura uma análise mais

aprofundada e ampla dos genes associados à citotoxicidade em células T, correlacionando os

mesmos com a ativação de IP nos diferentes quadros clínicos e desfechos da COVID-19.

 44

Figura 16: Expressão de genes associados a função efetora de células T CD8 + do LBA de pacientes com
COVID-19 moderada e grave. Expressão de CD8A e das granzimas GZMK e GZMB em células T CD8+ nos
grupos controle (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

Em seguida, observamos também a expressão de mediadores inflamatórios associados à

ativação de células CD8+. Os resultados obtidos indicam que não há expressão significativa de

IFN-γ nos grupos infectados, enquanto TNF-α é mais expresso em CD8+ de pacientes graves

(Figura 17).
 45

Figura 17: Expressão de genes associados a mediadores inflamatórios em células T CD8 + do LBA de
pacientes com COVID-19 moderada e grave. Expressão dos genes IFNG e TNF em células T CD8+ nos
grupos controle (n=3), pacientes com COVID-19 moderada (n=3) e grave (n=27). ANOVA com P <0,001.

5.8 Indução do imunoproteassoma em células CD8+ associadas à desfecho positivo

Uma vez que nossos resultados indicaram que há maior expressão de IP em células

CD8+ em ambos os grupos infectados, o passo seguinte foi observar se a indução também

poderia estar correlacionada com o desfecho da COVID-19. Observamos que, nas células CD8+

daqueles que sobrevivem, também há uma maior expressão de IP em comparação aos que vão

a óbito (Figura 18).

Figura 18: Análise da expressão das três subunidades do IP em células T CD8+ no LBA de pacientes com
COVID-19 grave. Expressão de PSMB9, PSMB10 e PSMB8 respectivamente em células T CD8 + no LBA de
pacientes graves que sobreviveram (n=17) e nos que foram a óbito (n=10). Teste t com C.I > 95%.

5.9 Aumento de sítios clivagem por imunoproteassoma na proteína S da variante

Ômicron associadas a menor patogenicidade

Diante do possível papel protetor do imunoproteassoma nos quadros clínicos e

desfechos da COVID-19, próximo passo foi observar se a clivagem proteassomal poderia estar

associada com a patogenicidade de diferentes variantes do SARS-CoV-2 e sua respectiva

fixação na população. Para isso, comparamos a clivagem por imunoproteassoma através da

 46

sequência de aminoácidos das proteínas estruturais M, N, S e E de 13 variantes no formato

FASTA, sendo elas Wuhan, Alpha, Beta, Gamma, Delta, Ômicron, Epsilon, Zeta, Eta, Theta,

Iota, Kappa e Lambda. Com auxílio do algoritmo iPCPS, obtivemos o número de sítios de

clivagem por cada uma (Figura 19).

 47

Figura 19: Sítios de clivagem por proteassoma e imunoproteassoma de proteínas estruturais de variantes
do SARS-CoV-2. O número de sítios de clivagem na sequência FASTA de cada proteína estrutural foram
obtidos através do algoritmo iPCPS.

Observamos que, nas quatro proteínas estruturais de todas as variantes de SARS-CoV-

2 analisadas, o imunoproteassoma apresenta um número maior de sítios de clivagem em relação

ao proteassoma constitutivo. Além disso, o número de sítios de clivagem por IP na proteína S

 48

da variante Ômicron foi superior às demais variantes, inclusive na porção que corresponde ao

domínio RBD. Essa variante, apesar de uma grande dispersão na população mundial, está

associada a casos de menor gravidade da COVID-19.

Com isso, nossos dados preliminares sugerem que uma maior quantidade de sítios

clivagem na proteína de entrada na variante Ômicron, quando comparada às demais, pode estar

associada a uma seleção por apresentação antigênica e resposta por anticorpos neutralizantes.

PERSPECTIVAS FUTURAS
Os próximos passos do desenvolvimento deste estudo serão a análise da expressão de

genes associados ao IP e a ativação de células CD8 + nas células do BALF nos diferentes quadros

clínicos e desfechos da COVID-19.

Além disso, observar a expressão de IP em bancos de dados de scRNA-seq de células

mononucleares do sangue periférico (PBMC) em pacientes com COVID-19 moderada e grave,

bem como nos desfecho de sobrevivência e óbito. Em seguida, analisar se há correlação do

perfil de ativação de IP em células circulantes com os dados já obtidos na infecção em células

alvo do pulmão (BALF) e seus respectivos desfechos clínicos.

 49

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